TH2009_Joly_Laure (pdf - fr - 2954 ko) - ED 52

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N° d’ordre : 85-2009
Année 2009
THESE DE L‘UNIVERSITE DE LYON
Délivrée par
L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1
Ecole Doctorale de Physique et Astrophysique
pour l'obtention du
DIPLOME DE DOCTORAT
(arrêté du 7 août 2006)
présentée et soutenue publiquement le 29 juin 2009
par
Laure JOLY
Couplage spectroscopie optique / spectrométrie de masse :
Propriétés optiques et photofragmentation de biomolécules
Directeur de thèse : Philippe DUGOURD
JURY :
Mme Julia CHAMOT-ROOKE, rapporteur
M. Philippe DUGOURD, directeur de thèse
M. Jérôme LEMOINE, examinateur
M. Michel MONS, rapporteur
Mme Jeanine TORTAJADA, président du Jury
M. Yury TSYBIN, examinateur
N° d’ordre : 85-2009
Année 2009
THESE DE L‘UNIVERSITE DE LYON
Délivrée par
L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1
Ecole Doctorale de Physique et Astrophysique
pour l'obtention du
DIPLOME DE DOCTORAT
(arrêté du 7 août 2006)
présentée et soutenue publiquement le 29 juin 2009
par
Laure JOLY
Couplage spectroscopie optique / spectrométrie de masse :
Propriétés optiques et photofragmentation de biomolécules
Directeur de thèse : Philippe DUGOURD
JURY :
Mme Julia CHAMOT-ROOKE, rapporteur
M. Philippe DUGOURD, directeur de thèse
M. Jérôme LEMOINE, examinateur
M. Michel MONS, rapporteur
Mme Jeanine TORTAJADA, président du Jury
M. Yury TSYBIN, examinateur
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
Président de l’Université
M. le Professeur L. Collet
Vice-président du Conseil Scientifique
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Institut Universitaire de Technologie B
Directeur : M. le Professeur R. Lamartine
Institut de Science Financière et d'Assurance
Directeur : M. le Professeur J.C. Augros
Remerciements
Ce travail de thèse a été réalisé au Laboratoire de Spectrométrie Ionique et Moléculaire de
l’Université Claude Bernard de Lyon dirigé par Christian Bordas. Je le remercie de m'avoir
accueillie au laboratoire.
Je tiens à remercier Philippe Dugourd qui m'a ouvert les portes de son équipe. Je le remercie
de m'avoir fait profiter de son immense culture scientifique et de ses remarques pertinentes
tout au long de ces trois années. Mais je le remercie surtout pour ses qualités humaines, sa
disponibilité, sa gentillesse, son honnêteté.
Mes remerciements sont tout particulièrement adressés à Rodolphe Antoine qui a grandement
contribué à la réussite de ce travail. Je le remercie pour sa patience à m’expliquer la partie
obscure de l’expérience, ses excellents conseils mais aussi pour son enthousiasme lors des
manips. Ce fut un réel plaisir de travailler avec lui.
Toute ma gratitude va aux membres du jury pour leurs lectures critiques et pour leurs
remarques constructives lors de ma soutenance de thèse. Et tout particulièrement à Jeanine
Tortajada qui m’a fait l’honneur de présider ma soutenance de thèse ainsi qu’à Julia Chamot
Rooke et Michel Mons qui ont accepté de rapporter ce travail. Je tiens également à remercier
Yury Tsybin pour sa participation à mon jury de thèse et ses conseils.
J’aimerais remercier également tous les autres membres de l’équipe : Michel Broyer, Driss
Rayane, Isabelle Compagnon, Fabien Chirot pour leurs discussions et critiques utiles. Mais
aussi, tous les doctorants du groupe : Pierre, Thibault, Amandine, Renaud et Florian pour
leur soutien dans les moments difficiles et pour les bons moments partagés.
Je remercie Abdul Rahman Allouche qui a complété mon travail expérimental par des calculs
mais qui m’a aussi généreusement accordé son temps pour partager une partie de ses
connaissances avec moi.
Je remercie Jérôme Lemoine du Laboratoire des Sciences Analytiques pour la collaboration
très vivante entre nos deux équipes qui a permis de concrétiser ce travail de recherche.
Je suis aussi reconnaissante au Professeur Manfred Kappes de l’Université de Karlsruhe de
m’avoir accueillie dans son laboratoire et à Katja pour tous les moments partagés lors des
expériences de spectroscopie de photoélectron.
Je remercie chaleureusement tous les membres du laboratoire qui ont contribué à ce travail
par leurs diverses compétences. Je remercie plus particulièrement pour leur bonne humeur et
leurs encouragements en toutes circonstances : Francisco, Xavier, Sad, Christian, Jacques,
Jean, Estelle, Frank, Julien, Myriam, Nadia et Cyril.
Je dois aussi beaucoup à tous mes amis qui ont été d’un grand réconfort moral au cours de
ces trois années et plus particulièrement à Claire, Junior, Cédric, Nicos, Théo et Pierre pour
tous les bons moments passés ensemble et leur soutien inconditionnel lors des moments de
doute.
Un grand merci à ma famille d’avoir eu la gentillesse de venir assister à ma soutenance mais
aussi de m’avoir soutenue pendant ces trois années. Et plus particulièrement à ma mère pour
ses relectures des différents chapitres.
Je remercie par avance tous ceux qui liront une partie des deux cent autres pages de mon
mémoire.
Table des matières
INTRODUCTION.................................................................................................................... 3
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................................. 11
CHAPITRE 1 : TECHNIQUES INSTRUMENTALES ..................................................... 17
1.1 SPECTROMETRIE DE MASSE ......................................................................................................... 17
1.1.1 Appareils de l'équipe LCQ et LTQ ..................................................................................................... 18
1.1.2 Source electrospray ............................................................................................................................ 18
1.1.3 Piège ionique ...................................................................................................................................... 22
1.2 COUPLAGE LASER - SPECTROMETRIE DE MASSE ......................................................................... 28
1.2.1 Différents lasers utilisés ..................................................................................................................... 28
1.2.2 Couplage ............................................................................................................................................ 30
1.2.3 Différents types de mesure.................................................................................................................. 33
1.3 PREPARATION D'ECHANTILLONS ................................................................................................. 38
1.4 METHODES OPTIQUES EN SOLUTION ........................................................................................... 41
1.4.1 Spectrophotométrie d'absorption en solution ..................................................................................... 41
1.4.2 Dichroïsme circulaire......................................................................................................................... 42
1.5 METHODES THEORIQUES ............................................................................................................. 46
1.6 BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................... 47
CHAPITRE 2 : PHOTODETACHEMENT D'ELECTRON : PRINCIPE,
MECANISMES ET ENERGETIQUE.... ............................................................................. 51
2.1 PHOTODETACHEMENT D'ELECTRON ............................................................................................ 52
2.1.1 Principe du photodétachement d'électron sur des peptides anioniques ............................................. 52
2.1.2 Evolution de l'efficacité de photodétachement d'électron................................................................... 55
2.1.3 Mécanismes du photodétachement d'électron .................................................................................... 62
2.2 SPECTROSCOPIE DE PHOTOELECTRON ......................................................................................... 74
2.2.1 Montage expérimental ........................................................................................................................ 74
2.2.2 Informations obtenues à partir de spectre de PES ............................................................................. 77
2.2.3 Etude de la position des charges, estimation du point de départ de l’électron et déduction de la
distance entre les charges............................................................................................................................ 86
2.3 BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................... 91
1
CHAPITRE 3 : PHOTODETACHEMENT D'ELECTRON ET
PHOTODISSOCIATION UV ASPECTS CINETIQUE ET ANALYTIQUE.................. 95
3.1 DISSOCIATION PAR PHOTODÉTACHEMENT D'ÉLECTRON (EPD), ASPECT CINÉTIQUE .................. 96
3.1.1 Première étape A o B ..................................................................................................................... 97
3.1.2 Deuxième étape B o C ..................................................................................................................... 99
3.2 FRAGMENTATION DES RADICAUX PAR ACTIVATION COLLISIONNELLE ..................................... 105
3.2.1 Application à des peptides ................................................................................................................ 106
3.2.2 Fragmentation des radicaux............................................................................................................. 109
3.3 APPLICATION AUX PHOSPHOPEPTIDES ...................................................................................... 111
3.3.1 EPD sur des phosphopeptides .......................................................................................................... 111
3.3.2 UVPD sur des phosphopeptides ....................................................................................................... 113
3.4 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................... 120
CHAPITRE 4 : SPECTROSCOPIE UV DE PEPTIDES ET PROTEINES EN PHASE
GAZEUSE............................................................................................................................. 123
4.1 PRINCIPE DE LA SPECTROSCOPIE UV PAR SPECTROSCOPIE D'ACTION DE PHOTODETACHEMENT
D'ELECTRON .................................................................................................................................... 124
4.2 PEPTIDE SANS CHROMOPHORE .................................................................................................. 130
4.3 PEPTIDES CONTENANT UNE TYROSINE ...................................................................................... 131
4.3.1 Angiotensine ..................................................................................................................................... 131
4.3.2 Une protéine : Insuline ..................................................................................................................... 135
4.4 PEPTIDES CONTENANT UN TRYPTOPHANE ................................................................................. 140
4.4.1 WVVVV et VVVVW ........................................................................................................................... 140
4.4.2 Tryptophane radicalaire................................................................................................................... 144
4.5 CHANGEMENT DE LA CONFORMATION ...................................................................................... 152
4.6 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................... 159
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................... 163
ANNEXE A ........................................................................................................................... 165
ANNEXE B ........................................................................................................................... 173
ANNEXE C ........................................................................................................................... 183
2
Introduction
Les peptides et les protéines sont des polymères linéaires composés d'un enchaînement
d'acides aminés spécifiques parmi les 20 acides aminés naturels existants. Ce sont les
protéines qui assurent les différentes fonctions des organismes : elles ont par exemple des
rôles structurels, catalytiques, de régulateurs, de reconnaissance, de transport. Les protéines
sont synthétisées par les ribosomes à partir du code génétique porté par l'ADN. Elles subissent
aussi, après leurs synthèses, des modifications chimiques appelées modifications post
traductionnelles (comme la phosphorylation ou la glycosylation). Les expériences de
spectroscopie sur ces peptides et protéines sont réalisées grâce au couplage de lasers
accordables en longueur d'onde avec un spectromètre de masse de type piège à ions.
La spectrométrie de masse est une méthode analytique qui permet de déterminer le
rapport masse moléculaire / charge de l'ion. L'intérêt de cette technique réside dans sa
sensibilité (pico voir femto molaire), sa rapidité d’analyse (permettant le couplage avec des
techniques chromatographiques), la résolution des analyseurs (supérieure à un million pour
les FT-ICR (fourier transform ion cyclotron resonance [1]), mais surtout sa polyvalence. Le
développement des sources de spectrométrie de masse à ionisation douce (ESI, electrospray
source ionisation [2], MALDI, matrix assisted laser desorption ionisation [3,4]) dans les
années 80, a rendu possible la mise en phase gazeuse des systèmes de haut poids moléculaire
(ADN, protéines, complexes). Pour identifier ou déterminer la structure de ces molécules
biologiques une fois mises en phase gazeuse, la mesure de leur masse moléculaire ne suffit
pas et des techniques de fragmentation (MS/MS) ont été développées. Ces techniques
consistent notamment à fragmenter les peptides issus de la digestion peptidique (approche
"bottom up") ou les protéines entières (approche "top down") et de remonter, à partir des
fragments obtenus, à la séquence en acide aminé de la protéine, c'est-à-dire à sa structure
primaire.
De nombreuses méthodes de fragmentation sont utilisées à ce jour. Elles peuvent être
différenciées en deux groupes selon leur processus d'excitation : excitation vibrationnelle ou
excitation électronique.
3
La méthode d'activation vibrationnelle par chauffage la plus connue est la CID (collision
induced dissociation) : elle existe en routine sur la plupart des spectromètres de masse. Cette
technique utilise la collision entre le peptide et un gaz neutre pour chauffer et fragmenter le
peptide [5-7]. Avec cette méthode, l'excitation des ions est principalement de nature
vibrationnelle et l'énergie transférée pour un petit peptide est typiquement comprise entre un
et quelques dizaines d'eV. D'autres méthodes d'excitation vibrationnelle ont été développées,
notamment l'IRMPD (infrared multiphoton dissociation) [8-10] qui consiste à exciter
vibrationnellement les molécules avec un laser IR. Un des avantages de cette technique est
qu'elle ne nécessite pas d'injection de gaz et est donc particulièrement adaptée au FT-ICR qui
travaille sous vide poussé. Avec cette méthode, l'énergie d'un photon est faible ~ 0.1 eV et la
fragmentation est due à un processus fortement multiphotonique.
Les méthodes d'activation électronique se sont développées plus tard avec l'objectif de
résoudre le problème du peu de fragmentation de certains peptides lors de l’utilisation des
méthodes par chauffage. En effet, lorsqu’un canal de fragmentation est beaucoup plus bas en
énergie que les autres, la fragmentation par chauffage qui est un processus statistique conduit
principalement à l'observation de ce canal de fragmentation et donc à une fragmentation peu
informative du point de vue structurel. Deux méthodes de collision avec des électrons ont été
développées en mode positif, l’ECD (electron capture dissociation) par Mc Lafferty et ses
collaborateurs en 1998 [11] et l’ETD (electron transfer dissociation) par Hunt et ses
collaborateurs en 2004 [12,13]. Ces deux techniques très proches sont basées sur la capture
d'un électron par un ion positif multichargé par bombardement d'électron thermique pour
l'ECD et par transfert de charges entre deux ions pour l'ETD. La capture est exothermique et
est suivie d'une fragmentation non statistique permettant d’accéder à des fragments différents
de ceux obtenus en CID et d'augmenter la couverture de séquence de peptides, en particulier
de peptides contenant des modifications post-traductionnelles [14]. La CID haute énergie
(keV) peut aussi conduire à une fragmentation plus rapide que la redistribution d'énergie et
donc à l'observation de nouveaux fragments [15].
Les méthodes par activation électronique ont aussi été développées en mode négatif, là où
les méthodes par chauffage donnent les moins bons résultats. Le mode négatif est utile pour
les molécules pouvant porter facilement des charges négatives, c’est le cas des peptides acides
comme ceux ayant subi des modifications post-traductionnelles de type phosphorylation ou de
l’ADN. Le groupe de Zubarev a mis au point la dissociation par détachement d'électron (EDD
electron detachment dissociation) en 2001 [16,17] qui consiste à détacher un électron de
4
Introduction
l'anion grâce à un bombardement d'électron thermique de la molécule anionique. Des
expériences de "reverse ETD" ont aussi été réalisées sur des peptides anioniques [18].
Une autre voie qui permet d'exciter électroniquement des peptides et des protéines est
l’excitation optique. Les lasers UV sont particulièrement intéressants puisque l'UV lointain
(150 – 200 nm) permet d'exciter les liaisons amides du squelette peptidique et l'UV proche
(200 - 350 nm) permet d'exciter les sites aromatiques des acides aminés chromophores.
La photodissociation dans le VUV (vacuum ultraviolet) a surtout été réalisée en mode
positif avec les lasers excimer ArF (193 nm, 6.4 eV) [19-22] et F2 (157 nm, 7.9 eV) [23]. Le
groupe de Reilly a comparé la photodissociation obtenue sur des peptides avec ces deux lasers
et avec le mode CID. L'excitation UV (en particulier à 157 nm) donne accès à des fragments v
et w non observés en CID [24,25]. Concernant l'UV proche, la plupart des expériences ont été
réalisées avec des YAG triplés (355 nm) ou quadruplés (266 nm). La longueur d'onde 266 nm
permet une excitation des chromophores et peut conduire à la fragmentation des séquences
peptidiques [26,27]. Des études ont aussi été réalisées à 355 nm en marquant les peptides avec
un chromophore qui absorbe à cette longueur d'onde. Cette étape chimique supplémentaire
permet d'exciter des peptides sans acides aminés aromatiques sur la séquence peptidique [28].
Avec une démarche similaire, le groupe de Julian a mis au point une méthode pour connaître
précisément la position des résidus phosphorylés. Cette méthode comporte un marquage
chimique des résidus phosphorylés suivi d'une irradiation laser à 266 nm qui fragmente le
peptide spécifiquement au niveau de ces résidus [29].
C'est dans ce contexte qu'a été développé dans notre laboratoire, le couplage entre un
piège quadripolaire et un laser UV [30]. La particularité de notre équipe est d'utiliser un laser
accordable en énergie et donc de pouvoir faire varier le site et l'énergie d'excitation. Les
études réalisées lors de ce travail de thèse portent principalement sur des peptides
négativement chargés. Nous verrons que l'irradiation laser de molécules chargées
négativement conduit à une espèce radicalaire par photodétachement d'électron (EPD). La
fragmentation de cette espèce radicalaire apporte un bon recouvrement de séquences pour
différentes espèces : peptides et phosphopeptides, des protéines entières, des oligosaccharides,
de l’ADN ainsi que différents complexes.
5
La spectrométrie de masse est une technique qui permet de sonder efficacement la
structure primaire d'une protéine ou d'un peptide. Cependant, la fonction des protéines n'est
pas seulement déterminée par l'enchaînement d'acides aminés, la structure tridimensionnelle
joue un rôle fondamental. A titre d'exemple, dans les pathologies comme la maladie
d'Alzheimer ou de Creutzfeldt-Jacob, la forme pathogène est due à un réarrangement
tridimensionnel de la protéine prion : la protéine est présente sous sa forme saine et soluble
dans les organismes sains mais se réarrange spatialement pour devenir insoluble dans les
organismes atteints.
Différentes techniques existent pour étudier les structures tridimensionnelles des
protéines. La RMN en solution et la cristallographie par rayon X sont les techniques les plus
performantes actuellement. Une bibliothèque (PDB, protein data bank) regroupant toutes les
structures tridimensionnelles est accessible sur Internet (http://www.rcsb.org). Cependant, la
cristallographie nécessite la formation d'un cristal (ce qui n’est pas toujours possible avec les
protéines) et la RMN peut difficilement étudier des molécules de taille supérieure à 25 kDa.
De plus, ces techniques requièrent des quantités importantes d'échantillon pur et nécessitent
un temps d'analyse long. Ces techniques sont aussi limitées par la flexibilité de la
conformation des différents systèmes.
Les spectroscopies optiques en solution ont généralement une vitesse d'analyse beaucoup
plus rapide mais donnent accès à une information globale de la conformation ou bien au
contraire à l'environnement proche d'un groupe sondé et sont donc moins complètes que les
techniques de RMN ou de Rayon X. Citons comme exemple, la spectroscopie vibrationnelle
(infra rouge et Raman) qui permet d'obtenir des informations sur les groupes fonctionnels
présents dans des molécules ou le dichroïsme circulaire qui permet de connaître les
changements cumulatifs de la structure secondaire des protéines [31,32].
Parallèlement à ces approches en solution ou en cristal, la spectrométrie de masse permet
d'étudier des protéines qui proviennent de solutions diluées ou d'échantillon biologique. De
plus, l'étude des systèmes moléculaires biologiques en phase gazeuse permet de s'affranchir
des interactions avec le solvant, voire de contrôler l'environnement. La phase gazeuse permet
donc d'étudier les propriétés intrinsèques de la molécule, et a l'avantage de pouvoir être
comparée facilement avec les calculs théoriques. On assiste depuis plusieurs années au
développement de différentes méthodes, qui couplées à la spectrométrie de masse, permettent
d'aller au-delà de la simple mesure de masse et de la détermination de la structure.
6
Introduction
Les propriétés étudiées le plus couramment sont les structures secondaires et tertiaires, les
interactions non covalentes, la dynamique de repliement ou de fragmentation. Les méthodes
qui existent actuellement pour sonder les structures des biomolécules en phase gazeuse sont
notamment l'échange isotopique hydrogène/deutérium, la mobilité ionique, le BIRD
(blackbody infrared radiative dissociation) et la spectroscopie optique.
L’échange isotopique hydrogène/deutérium permet l’étude de la conformation et du
repliement des protéines. En effet, la vitesse d’échange hydrogène/deutérium est directement
liée à l’exposition des atomes d’hydrogènes au solvant deutéré, c'est-à-dire que la vitesse
d’échange est liée à l’accessibilité des atomes d’hydrogènes donc à la conformation de la
protéine. L'échange hydrogène/deutérium s'effectue généralement en solution [33,34] mais
peut aussi s'effectuer directement en phase gazeuse pour obtenir d'autres types d'informations
[35].
La mobilité ionique (IMS, ion-mobility spectrometry) [36-40] consiste à mesurer la
vitesse des ions entraînés par un champ électrique dans un tube de mobilité en présence d'un
gaz inerte. La vitesse de dérive des ions dans le tube va dépendre de leurs structures
géométriques. Le temps de dérive peut être relié à la section efficace de collision entre l'ion et
le gaz inerte. Cette technique permet, entre autres, de séparer les isomères et de déterminer
des structures par comparaison avec les études théoriques [41,42].
Le BIRD [43,44], est une technique remarquable pour étudier les énergies de seuil de
dissociation et les cinétiques de dissociation d'un ion. Cette technique repose sur la
dissociation unimoléculaire de l'ion suite à l'absorption de radiations infrarouges dues au
rayonnement de la cellule dans laquelle sont piégés les ions (corps noir). Pour cela, la pression
dans le piège doit être basse (<10-6 torr) et la fenêtre de temps d'observation longue (de l'ordre
de la seconde). La technique est donc particulièrement adaptée aux FT-ICR.
Les premiers résultats de diffraction électronique en phase gazeuse obtenus sur des
agrégats inorganiques ou de métaux sont extrêmement prometteurs [45-47].
Les méthodes spectroscopiques permettent d’étudier les interactions des systèmes
biologiques avec les photons : elles vont donner des informations sur les propriétés optiques
des protéines en phase gazeuse.
La difficulté d’étudier les molécules biologiques en phase gazeuse par spectroscopie
provient de leur faible densité dans ce milieu contrairement à la solution ou au solide. Excepté
pour de rares cas ([48,49]) où la pression de vapeur saturante d'un acide aminé dans une
cellule est suffisante, l’enregistrement de l’absorption d'un peptide ou d'une protéine en phase
7
gazeuse ne peut pas se faire directement. La solution consiste à détecter un phénomène
résultant de cette absorption de photon : la fluorescence en collectant les photons réémis, la
fragmentation par spectrométrie de masse, l’absorption d’un second photon conduisant à la
formation d’une espèce ionisée (plus facilement détectable) si on part d'un neutre par
exemple.
La spectroscopie résolue en fréquence permet d’enregistrer grâce aux lasers OPO (optical
parametric oscillator), le spectre optique de molécule dans une gamme de longueur d’onde.
Selon la gamme choisie, le spectre donnera des informations sur les transitions rotationnelles
et l'orientation du dipôle permanent (spectroscopie micro onde), sur les transitions
vibrationnelles (spectroscopie infra rouge) ou sur les transitions électroniques (spectroscopie
visible et ultraviolette) [50]. La spectroscopie résolue en temps enregistre le temps de réponse
à une excitation donnée et permet d’accéder aux dynamiques de formation, de relaxation ou
de réarrangement des molécules étudiées. Cette technique nécessite l’utilisation de deux lasers
(pompe et sonde) synchronisés. Enfin, signalons que la spectroscopie d'électron permet de
déterminer l'affinité électronique d’une molécule et de remonter aux barrières conduisant au
détachement d’un électron.
L'étude des transitions vibrationnelles sensibles à la conformation des biomolécules en
phase gazeuse nécessite l'utilisation de lasers puissants et accordables dans le domaine de
l'infra rouge. Les sources lumineuses les plus intenses sont les lasers à électrons libres (FEL,
free electron laser) utilisant le rayonnement synchrotron, comme ceux d'Orsay (CLIO [51]) et
des Pays Bas (FELIX) (gamme de fréquence 100 - 3000 cm-1). L'utilisation d'OPO infrarouge
est une alternative de plus en plus utilisée grâce aux progrès réalisés sur ces systèmes (2000 –
4000 cm-1). La spectroscopie IR couplée à des simulations permet de déterminer les
fréquences de vibrations des liaisons (liaison hydrogène, NH, OH,…) [52] et de remonter à la
structure des molécules en comparant le spectre expérimental aux spectres calculés pour
différentes structures moléculaires. La coexistence de plusieurs isomères est un réel problème
dans ce type d'expérience. Pour diminuer le nombre d'isomères, ces expériences sont réalisées
soit en jets supersoniques [53,54] qui créent des espèces neutres très froides soit en pièges
ioniques refroidis [55]. La spectroscopie IR est souvent couplée avec un laser UV : le laser
UV permettant de sélectionner une transition électronique spécifique d'un conformère donné
[56]. Ces expériences de type pompe sonde permettent de déterminer le nombre de
conformères formé en phase gazeuse ainsi que les spectres IR de ces différents conformères.
La plupart des résultats obtenus en spectroscopie IR et IR/UV l'ont été sur des petits systèmes
(bases de l'ADN [54], acides aminés [57], petits peptides [58,59], sucres [60]). Quelques
8
Introduction
résultats ont cependant été obtenus sur de plus grands systèmes, comme sur les différentes
formes de la gramicidine [61] ou de l'ubiquitine [62].
La spectroscopie visible et ultraviolet permet d'étudier les excitations électroniques des
molécules, et plus particulièrement celles des chromophores des acides aminés aromatiques
entre 220 et 400 nm. Malgré des premières expériences dans les années 1985-1995 par Levy
et ses collaborateurs sur des acides aminés neutres [63,64] et des petits peptides [65], peu de
résultats sont disponibles dans la littérature sur des polypeptides. En effet, ces techniques ont
été peu développées par la suite sur de gros systèmes pour lesquels il n'est pas possible
d'obtenir les spectres résolus vibrationnellement. Par contre, de nombreux résultats sur des
acides aminés [66-68] ou des peptides [69] sont disponibles dans la littérature. Les travaux
portent sur la spectroscopie infra rouge avec des molécules froides qui permet d'obtenir une
bonne résolution des raies vibrationnelles et donc d'obtenir des informations sur la structure
locale des molécules étudiées. De plus, les expériences de photofragmentation sont de plus en
plus difficiles lorsque la taille du système grandit. Durant mon travail de thèse, nous allons
montrer la possibilité de produire des spectres UV-visible de gros systèmes et de sonder les
propriétés électroniques globales de la molécule. Cela nous permettra d'obtenir des
informations sur la structure globale des molécules. Cette étude a été réalisée sur des
molécules à grand nombre de degrés de liberté comme des peptides, des protéines et des
complexes métal / peptide.
Une autre méthode utilisant la fluorescence induite par laser en piège est le FRET
(fluorescence resonant energy transfer). Des chromophores sont attachés de manière
chimique à la molécule. La distance entre deux chromophores et donc le changement
structural peuvent être suivis en temps réel [70,71]. Lorsque les chromophores sont proches,
un transfert radiatif résonant d'un chromophore donneur A préalablement excité vers un
chromophore accepteur B est observé. Lorsque les chromophores sont éloignés, l'énergie ne
peut plus être transférée d'un chromophore à l'autre, la fluorescence émise par le chromophore
A est alors observée.
9
En résumé, l'originalité de ce mémoire de thèse vient du couplage laser UV – Visible /
spectromètre de masse, mais vient aussi du fait qu'il a été réalisé sur des molécules chargées
négativement de haut poids moléculaire. L'irradiation laser de molécules chargées
négativement entraîne l'émission d'électron par photodétachement d'électron. Ce canal de
fragmentation principal a l'avantage de produire un anion radicalaire, dont la réactivité peut
être utilisée pour avoir accès à la fragmentation de l'espèce. La mesure du taux de
photodétachement en fonction de la longueur d'onde du laser permet de mesurer les spectres
optiques de ces systèmes.
Avant mon arrivée à Lyon, l’équipe avait modifié un spectromètre de masse de type piège
ionique quadripolaire de manière à introduire un faisceau laser au centre du piège. Durant ma
thèse, un deuxième spectromètre de masse a été modifié et l’équipe a aussi fait l’acquisition
de nouveaux lasers : un laser UV-visible accordable en longueur d’onde et un laser infra
rouge à CO2. La partie expérimentale concernant ces pièges, ces lasers et leurs couplages sera
développée dans le premier chapitre de mon mémoire de thèse.
Le deuxième chapitre de ce travail est consacré à l'étude de la relaxation de molécules
polyanioniques après excitation laser et notamment aux mécanismes conduisant à la perte
d'électron. Les expériences de photodétachement réalisées à Lyon ont été complétées par des
expériences de spectroscopie de photoélectron effectuées à Karlsruhe (Pr. Kappes). Ces
expériences ont permis notamment d'avoir un accès direct à l'énergie de la barrière
coulombienne. Ce sont les premières expériences de ce type réalisées sur des peptides.
La production d'anions radicalaires a un potentiel analytique important qui fera l'objet de
mon troisième chapitre. En effet, l'un des objectifs de ce travail de thèse a été d'étudier la
réactivité de ces ions radicalaires et de montrer l'intérêt de leur fragmentation pour l'analyse
structurelle de peptides. Cette étude a été réalisée sur des peptides et des phosphopeptides.
Une étude complémentaire réalisée en mode positif sur des peptides contenant une
phosphotyrosine complétera ce chapitre.
L'autre objectif était de sonder les propriétés électroniques de protéines et de peptides en
phase gazeuse. Pour cela, le taux de détachement d'électron a été enregistré en fonction de la
longueur d'onde du laser. Nous avons notamment pu déterminer des signatures optiques pour
des chromophores neutres, déprotonés ou radicalaires au sein des protéines. Ces résultats ont
10
Introduction
été comparés à des calculs théoriques (TD DFT). La sensibilité de la réponse optique au
changement de conformation d'une protéine sera présentée dans le chapitre quatre.
Enfin, trois articles en annexe viendront compléter ce mémoire de thèse. L'annexe A est
un article paru dans Journal of Mass Spectrometry qui concerne la photodissociation UV
spécifique des peptides contenant une tyrosine. L'article en annexe B concerne les propriétés
optiques et structurales du complexe oxytocine-cuivre dicationique en phase gazeuse. Il vient
d'être publié dans The Journal of physical chemistry B. Un troisième article en annexe C
(publié dans The Journal of physical chemistry A), rapporte les effets de l'ionisation, de la
réduction et de la complexation du cuivre sur les propriétés optiques de l'hormone oxytocine
chargée négativement.
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16
Chapitre 1 :
Techniques instrumentales
Sommaire
1.1 SPECTROMETRIE DE MASSE ......................................................................................................... 17
1.1.1 Appareils de l'équipe LCQ et LTQ ..................................................................................................... 18
1.1.2 Source electrospray ............................................................................................................................ 18
1.1.3 Piège ionique ...................................................................................................................................... 22
1.2 COUPLAGE LASER- SPECTROMETRIE DE MASSE .......................................................................... 28
1.2.1 Différents lasers utilisés ..................................................................................................................... 28
1.2.2 Couplage ............................................................................................................................................ 30
1.2.3 Différents types de mesure.................................................................................................................. 33
1.3 PREPARATION D'ECHANTILLONS ................................................................................................. 38
1.4 METHODES OPTIQUES EN SOLUTION ........................................................................................... 41
1.4.1 Spectrophotométrie d'absorption en solution ..................................................................................... 41
1.4.2 Dichroïsme circulaire......................................................................................................................... 42
1.5 METHODES THEORIQUES ............................................................................................................. 46
1.6 BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................... 47
Dans ce chapitre, nous décrirons dans un premier temps la technique expérimentale
principale utilisée lors de ce travail de thèse : la spectrométrie de masse. Puis nous
détaillerons son couplage avec les lasers utilisant différentes lignes optiques. Dans une
troisième partie, nous décrirons le mode opératoire utilisé lors de la préparation d'échantillons.
Enfin nous expliquerons les méthodes auxquelles nous avons comparé notre travail, les
méthodes optiques en solution dans la partie 4 et les méthodes théoriques dans la partie 5.
1.1 La spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse est une technique d'analyse des molécules ionisées par mesure
de leur masse (ou plus exactement de leur rapport m/z). L'échantillon est tout d'abord ionisé et
mis en phase gazeuse dans une source. Puis un analyseur sépare les ions ainsi produits en
fonction de leur rapport masse sur charge (m/z) et ensuite un détecteur compte les ions et
amplifie le signal. La capacité de ces appareils à étudier des molécules de haut poids
moléculaire, leurs résolutions, leurs sensibilités et leurs précisions en masse en font des outils
particulièrement adaptés à l'analyse des protéines.
17
1.1.1 Appareils de l'équipe
L'équipe possède un spectromètre de masse de type piège quadripolaire ionique 3D
LCQDuo (avec option MSn (Thermo Electron, San Jose, CA, USA). Ce piège est décrit sur la
Figure 1-1a. La collaboration de l'équipe avec celle de Jérôme Lemoine (Institut des Sciences
Analytiques) m'a permis d'effectuer une partie de mes expériences sur un autre piège, linéaire
celui-ci (LTQ Thermo Electron, San Jose, CA, USA), décrit sur la Figure 1-1b. Ces deux
spectromètres ont la particularité d'avoir une source electrospray et un analyseur de type piège
ionique quadripolaire 3D pour le LCQ et linéaire pour le LTQ dont nous allons expliquer
brièvement le fonctionnement. Nous verrons aussi les caractéristiques propres de chacun de
ces deux appareils.
Electrospray
Capillaire 1
Capillaire 2
de transfert
Lentilles
détection
piège
Octapôles
électrode électrode Détecteur
centrale chapeau Dynode, multiplicateur
+
a)
Guidage
tube
lens
_
skimmer
lentille
760 torr
1 torr
1.5 *10-3 torr
2 *10-5 torr
1.5 *10-3 torr
b)
Piège et
Electrospray
Capillaire 1
détection
Guidage
Capillaire 2
de transfert
Quadripôle
carré
Quadripôle
carré
Lentilles
Octapôle
Piège linéaire
(3 parties)
tube
lens
skimmer
760 torr 1 torr
50*10-3 torr
10-3 torr
2 *10-5 torr
Détecteurs radiaux
Dynodes de conversion
Figure 1-1. Schéma du piège 3D LCQ (a) et schéma du piège linéaire LTQ (b)
1.1.2 Source electrospray
Pour étudier des molécules par spectrométrie de masse, il faut d'abord les ioniser et les
mettre en phase gazeuse. Le premier spectromètre de masse commercialisé date de 1942 [1],
18
Chapitre 1 : Techniques instrumentales
mais il faut cependant attendre 1981 et le FAB (fast atom bombardment) [2] pour qu'une
source permette l'ionisation de molécules d'intérêt biologique (peptide). Puis, peu de temps
après deux nouvelles techniques dites "d'ionisation douce" ont vu le jour, l'ESI (electrospray
ionisation source) en 1984 [3] et le MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation) en
1987 [4]. J.B. Fenn et K. Tanaka obtiennent le prix Nobel de chimie en 2002 pour leurs
travaux sur ces sources. Dès 1988, des articles sur l'étude de molécules à haut poids
moléculaire d'intérêt biologique sont publiés (protéines [5,6], brins d'ADN, complexes non
covalents).
Avec ces deux techniques, l'énergie n'est plus directement absorbée par l'analyte mais
transmise à travers un partenaire d'ionisation : une matrice pour le MALDI et une gouttelette
de solvant pour l'ESI. Les molécules passent alors en phase gazeuse sans se fragmenter et
peuvent conserver aussi leurs liaisons non covalentes telles que les liaisons hydrogène
responsables de l'organisation spatiale et de l'appariement. Dans le cas d'une source
electrospray, les ions "M" obtenus sont fréquemment multichargés et de la forme [M+nH]n+
en ionisation positive et [M-nH]n- en ionisation négative. Le fonctionnement de l'ESI, qui a
été utilisée durant mon travail de thèse, est décrit en détail dans les paragraphes qui suivent.
¾ Principe d'une source electrospray
Dans la source electrospray, l'ionisation des molécules se déroule à pression
atmosphérique. Le composé à analyser est dissous dans un solvant puis injecté à vitesse
constante à l'aide d'une seringue de débit quelques µL.min-1 dans la source par l'intermédiaire
d'un capillaire d'environ 100 µm de diamètre, capillaire 1 sur la Figure 1-2. Le principe du
fonctionnement d'une source electrospray peut être décomposé en trois étapes : (i) production
de gouttelettes chargées, (ii) désolvatation et réduction des gouttelettes chargées, (iii)
formation d'ions en phase gazeuse [7].
¾ Production de gouttelettes chargées
L'application d'une différence de potentiel de quelques kV entre le capillaire 1 et la contre
électrode, formée par le capillaire 2 crée une accumulation de charges à la pointe du capillaire
1. A l'interface de la partie métallisée du capillaire 1 et du fluide, une réaction d'oxydation va
se produire, favorisant l'échange de charges et la formation d'ions. Sous l'effet du champ et de
la forte densité de charge, le ménisque va se déformer et optimiser sa surface en prenant la
forme du cône de Taylor [8]. Puis la pointe du cône de Taylor va elle aussi se déformer
jusqu'à rupture de l'équilibre entre les tensions de surface du fluide et les forces dues aux
19
répulsions de charges. De cette manière, de fines gouttelettes chargées de quelques µm de
diamètre vont être libérées.
électrons
capillaire 2
760 torr
+
N2
solution venant
de la seringue
vers
l’octapôle
1 torr
capillaire 1
Formation du spray :
Cône de Taylor
Réduction et
désolvatation des
gouttelettes
Formation des ions
en phase gazeuse
Figure 1-2. Schéma d'une source electrospray expliquant le mécanisme de formation des ions
¾ Désolvatation et réduction des gouttelettes chargées
Une fois que les gouttelettes chargées sont formées [9], elles vont migrer vers la contre
électrode sous l'effet du champ électrique mais aussi par aspiration au voisinage du capillaire
2. En effet, il y a un gradient de pression entre la partie electrospray qui est à pression
atmosphérique (760 torr) et la partie suivante qui est à une pression de l'ordre du torr. Pendant
ce déplacement, les charges présentes dans les gouttelettes vont se répartir à la surface
(répulsion électrostatique). Les gouttelettes de quelques micromètres de diamètre diminuent
progressivement de taille, par perte de molécules de solvant sous l'effet du chauffage (200250°C) et du contact avec le gaz séchant (N2). Lorsque la tension superficielle, qui maintient
la gouttelette en état, devient plus petite que la répulsion électrostatique (due à la présence des
charges), la limite de Rayleigh [8] est atteinte : il y a fission asymétrique de la gouttelette,
c'est l'explosion coulombienne. Cette fission produit une gouttelette principale et quelques
dizaines de gouttelettes secondaires qui se répartissent environ 15% de la charge initiale avec
environ 2% de la masse. La production de ces petites gouttelettes proche de la limite de
Rayleigh va accélérer le processus de fission. Ce processus d'évaporation et d'explosion se
répète plusieurs fois, il y a ainsi une réduction massive et rapide de la taille des gouttelettes.
20
¾ Formation d'ions en phase gazeuse
Cette dernière étape du processus est la plus polémique. Deux mécanismes tentent
d'expliquer à ce jour la formation d'ions. Dans le modèle de l’évaporation ionique (Figure
1-3a) (Iribarne et Thomson 1976) [10], les ions en phase gazeuse sont directement extraits à
partir de la surface de la gouttelette lorsque le diamètre de celle ci est suffisamment petit (<10
nm). Dans le modèle de la charge résiduelle (Dole 1968) [11] (Figure 1-3b), le schéma
évaporation-fission de la gouttelette se poursuit jusqu’à obtention d’une gouttelette fille
d'environ 1 nm ne contenant plus qu’un seul ion. La validité du modèle dépend également de
la nature de l'ion (ion atomique inorganique, molécule multiprotonée, etc..).
a)
Ion moléculaire
~10 nm
b)
Figure 1-3. Schéma des mécanismes expliquant la formation des ions en phase gazeuse
¾ Source microspray et nanospray
En microspray, le composé à analyser est dissous dans un solvant à une concentration de
l’ordre de 10-4 à 10-6 M puis injecté à la vitesse constante de quelques µL.min-1 dans le
capillaire. Le principal problème des études concernant les biomolécules est la faible quantité
d’échantillon disponible pour l’analyse. Cette difficulté a conduit à la miniaturisation des
sources : les sources nanospray qui permettent de réduire le débit à environ quelques dizaines
de nL.min-1 (aiguilles Proxéon réf. ES380). Cette source est constituée d’un capillaire en
quartz métallisé d’environ 1 mm de diamètre interne terminé par une pointe de diamètre
interne inférieur à 100 µm et dans lequel est introduit 5 à 10 µL d’échantillon. Avec cette
source, les différences de potentiel imposées entre le capillaire et la contre-électrode varient
de 800 à 1500 V.
21
Durant ce travail de thèse, la plupart des expériences ont été effectuées avec une source
microspray. Cependant lorsque la quantité d'échantillon était faible, une source nanospray
(d'utilisation plus délicate cependant) a été couplée au LTQ.
Après avoir produit les ions, il faut les séparer, c'est ce qui fera l'objet de la partie
suivante.
1.1.3 Piège ionique
Le principe général de ces pièges consiste à utiliser des potentiels quadripolaires
radiofréquences pour confiner la trajectoire des ions dans un volume fini et ainsi les piéger en
deux dimensions (piège linéaire) ou en trois dimensions (piège 3D).
¾ Description des pièges
Le piège 3D [12,13] est constitué d'une électrode centrale circulaire et de deux électrodes
chapeaux adjacentes quasi hyperboliques. Le piège linéaire [14-16] est constitué de quatre
barres d'un quadripôle fermées par des électrodes d'entrée et de sortie permettant de repousser
les ions vers l'intérieur du quadripôle (cf. Figure 1-4). Afin d'optimiser le piégeage des ions,
le quadripôle du LTQ est coupé en trois parties. Une partie centrale où les ions seront
confinés, éjectés et détectés et deux parties latérales plus courtes où le rebroussement des
trajectoires des ions a lieu.
a)
b)
éjection
des ions
Électrode annulaire
Partie centrale
injection
des ions
éjection
des ions
injection
des ions
Électrodes « chapeaux »
Partie de
derrière
Partie
de devant
Figure 1-4. Schéma des pièges 3D (a) et linéaire (b)
22
¾ L’injection des ions
Les ions créés par la source electrospray sont injectés à l’aide d’une optique de guidage
d’ions dans le piège. Dans les deux appareils, une lentille et un écorceur situés derrière le
capillaire 2 permettent l'injection des ions dans les deux octapôles pour le LCQ et dans une
série de quadripôles carrés et octapôles pour le LTQ. Ces systèmes de guide d'ions de type
multipôle permettent de transporter les ions de manière efficace dans une région de vide
médiocre (environ 10-1-10-2 torr). La dernière lentille située avant les pièges sert à contrôler la
quantité d'ions admis dans les pièges (cf. Figure 1-1) et à contrôler leur énergie.
Deux étages de pompage et les chambres intermédiaires permettent de passer d'une
pression de 760 torr dans la source à quelques 10-5 torr au niveau des détecteurs.
La pression d'hélium (gaz présent dans le piège sous quelques millitorrs) dans le piège est
importante. Outre son utilisation comme gaz de collision (en CID), les collisions avec
l’hélium réduisent l’énergie cinétique des ions incidents lors de l'injection. Leur trajectoire est
alors refocalisée au centre du piège ce qui augmente l’efficacité du piégeage. De plus cette
pression d'hélium permet une rethermalisation rapide des ions dans le piégeage (T~300K).
¾ Piégeage des ions
Dans le piège 3D, une tension radiofréquence de type U r V cos(Zt ) est appliquée sur
l'électrode centrale : elle assure le piégeage des ions en créant un champ quadripolaire
oscillant. La superposition de tensions alternatives et continues permet de garder les ions
captifs sur une trajectoire formant une sorte de huit en trois dimensions (figure de Lissajous).
Dans le piège linéaire, une tension radiofréquence est appliquée sur les barres des
quadripôles, les ions ont une trajectoire oscillante selon le plan xy et se meuvent librement
selon l'axe z (cf. Figure 1-5). Des tensions continues sont appliquées aux électrodes d'entrée
et de sortie et imposent aux ions de rester dans le quadripôle.
23
a)
b)
y
z
x
r
z
c)
4
r (unité arb.)
y
x
2
z
0
-2
-4
-6
-4
-2
0
2
4
6
z (unité arb.)
Figure 1-5. Simulations Simion des lignes de potentiels dans le LCQ (a) et le LTQ selon deux
plans (b), Mouvement des ions dans un piège quadripolaire trois dimensions (c)
Principe physique : pour piéger des ions, il faut construire un appareil électrostatique dont
la géométrie produirait un minimum de potentiel en un point. Mais l'équation de Laplace
( 'I
0 ) interdit un minimum de potentiel dans une zone vide de l'espace. Par exemple avec
un potentiel quadripolaire :
I
I0
2
0
r
(Or 2 Jz 2 ) avec r 2
x2 y 2 ,
[1-1]
on s'aperçoit que si les potentiels sont statiques, on aura un potentiel piégeant dans une
des deux directions et éjectant dans la direction perpendiculaire. 'I
0 impose Ȝ = -Ȗ à un
instant t donné le potentiel est par exemple minimum dans la direction r mais présente un
maximum sur la direction z : il piège donc sur la direction r mais est éjectant sur la direction z
(cf. Figure 1-6a). Si l'on retourne le potentiel lorsque l'ion s'éloigne sur la direction z, on le
ramène au centre : à t+Ȧ le potentiel piège sur la direction z mais devient éjectant sur la
direction r (cf. Figure 1-6b). On crée ainsi un pseudo puits de potentiel.
24
a)
b)
Figure 1-6. Potentiel piégeant suivant l'axe r à l'instant t (a) et suivant l'axe z à t+Ȧ (b) [17]
L’idée de W. Paul (Prix Nobel 1989) [18] fut d’utiliser des potentiels radiofréquences de
type I 0
U V cos(Zt ) .
Ainsi, les trajectoires des ions sous certaines conditions (U, V, Z et géométrie du piège)
seront stables et les ions pourront être piégés (cf. Figure 1-7). Ces trajectoires sont obtenues
en résolvant les équations de Mathieu [19]. Pour résoudre ces équations, on effectue le
changement de variable indiqué sur la Figure 1-7 . On montre ensuite qu'il y a des zones de
l'espace (az, qz) pour lesquelles les trajectoires des ions sont stables : ce sont des domaines
pour lesquels les ions sont piégés (zone hachurée de la Figure 1-7). En dehors de ces
domaines les trajectoires sont instables.
En pratique on travaille sur l'axe az = 0 (U = 0V) et à qz = 0.25. Pour le piège
quadripolaire 3D, les ions présentant un qz<0.908 ont une trajectoire stable c'est à dire que
tous les ions ayant une masse supérieure à 50 Da seront piégés.
Le principal inconvénient du piège tridimensionnel est sa faible capacité de stockage des
ions. En effet pour augmenter la sensibilité, il faut augmenter le nombre d'ions dans le piège.
Cela entraîne un effet de charge d'espace c'est-à-dire qu'il y a modification du champ ressenti
par un ion du fait des ions qui l'entourent. Ceci change les conditions de piégeage, modifie la
résolution et la calibration en masse de l'instrument. Le piège 3D a un fonctionnement AGC
(Automatic Gain Control) qui mesure le nombre d'ions produits et règle en conséquence,
grâce à la lentille entre les deux octapôles, le nombre d'ions injectés dans le piège. Les pièges
linéaires ont un volume de stockage des ions beaucoup plus important que les pièges 3D et la
focalisation des ions se fait suivant l'axe z et non autour d'un point central. Ils peuvent donc
accepter beaucoup plus d'ions que les pièges 3D avant de subir les limitations dues aux effets
de charge d'espace.
25
a)
az
b)
INSTABLE
0.2
INSTABLE
0.0
ST
qz
LE
AB
-0.2
1
STABLE
-0.4
-0.6
INSTABLE
-0.8
az
c)
I0
8eU
mr02Z2
U V cos ( Z t )
qz
4eV
mr02Z2
Figure 1-7. Diagramme de stabilité des ions dans le piège 3D (a) et linéaire (b), les
paramètres az et qz utilisés pour résoudre les équations de Mathieu (c)
¾ Isolation et activation
Pour les analyses de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS), l’isolation d’un ion
spécifique M de masse m et de charge z s’effectue en éjectant tous les autres ions du piège.
Deux techniques sont employées pour l'éjection. La première consiste à varier la valeur de V
afin de déstabiliser les ions ayant un m/z inférieur à celui de l'ion à isoler. Elle utilise le fait
qu'un ion dans un piège oscille à une fréquence RF propre à son rapport m/z (tension de
stockage). Mais une tension RF résonnante peut aussi être appliquée sur les électrodes
chapeaux de manière à éjecter les ions choisis. L’isolation sélective peut être suivie d’une
étape d’activation au cours de laquelle de l’énergie cinétique est communiquée aux ions
précurseurs. Pour cela les ions sont accélérés à l'aide d'une RF résonnante avec la RF des ions
précurseurs, et entrent en collision avec les atomes d’hélium présents dans le piège. Si les
collisions sont efficaces, elles induisent une augmentation de leur énergie interne et à terme la
dissociation des ions précurseurs en ions fragments appelés ions fils. Ce processus en deux
étapes (isolation et fragmentation) peut se répéter maintes fois (MS/MS/MS…/MS ou MSn) et
s’avère utile lors de l’élucidation structurale de composés. Notons que durant l’étape
d’activation, l’apport d’énergie aux ions piégés peut se faire par l’absorption de photons sous
l’effet d’irradiation d’un laser au centre du piège. On remarque que l'hélium a un rôle
important dans un piège, il sert à la fois à la focalisation et à la thermalisation des ions et peut
être utilisé comme un gaz de collision.
26
¾ Ejection et détection
Les ions sont éjectés sélectivement du piège 3D en appliquant une rampe de tension RF
sur la radiofréquence et sont détectés à l’aide d’une dynode de conversion couplée à un
multiplicateur d’électrons.
Pour le piège linéaire, l'éjection est radiale, à travers des fentes situées dans les barres du
quadripôle. L'utilisation de deux détecteurs permet d'exploiter tous les ions éjectés
(contrairement au LCQ où seulement 50 % sont utilisés). La transmission globale est de 50 à
70 % contre 5 % pour le piège 3D [1].
¾ Caractéristiques
Les principaux paramètres caractérisant un analyseur sont sa vitesse d'analyse (vitesse de
balayage), sa transmission (rapport entre le nombre d'ions arrivant au détecteur et celui entrant
dans l'analyseur), son exactitude en masse (précision), sa gamme de masse étudiée (valeurs
limites haute et basse en m/z) et sa résolution (M/ǻM).
LCQ (3D)
LTQ (linéaire)
vitesse d'analyse (uma/s)
NormalScan 5500
NormalScan 1000
transmission
5%
50-70%
exactitude en masse (Da)
0.2
0.1
gamme de masse
50-2000
50-4000
résolution (m/z = 1000)
4000
30000
Capacité piégeage
500
20000
Tableau 1-1. Caractéristiques principales des deux spectromètres de masse utilisés
Les pièges, notamment 3D, outre leur fonction d'analyseur, sont donc aussi capables de
confiner les ions dans un espace réduit de quelques millimètres pendant plusieurs secondes,
fonction qui va se révéler très utile lors d'analyse couplant la spectrométrie de masse avec un
laser.
27
1.2 Couplage laser- spectrométrie de masse
1.2.1 Différents lasers utilisés
Nous avons utilisé trois lasers UV-visible et un laser infra rouge.
¾ OPO, Continuum, 2001 et 2008
Les deux lasers principalement utilisés lors de ce travail de thèse, sont des lasers
accordables en longueur d'onde, composés d'un oscillateur paramétrique optique (OPO)
pompé par un laser Nd3+ : YAG (grenat d'yttrium aluminium dopé au néodyme Y3Al5O12).
Celui disponible depuis 2001 est pompé par un laser PowerLiteTM 8000 de fréquence 20
Hz, celui de 2008 est pompé par un laser Surelite II de fréquence 10 Hz. Ces lasers pompes
sont composés d'un oscillateur et d'un amplificateur, chacun comportant un cristal et une
lampe flash fournissant des impulsions laser à 1064 nm de 5 ns. Le faisceau passe ensuite
dans un doubleur et un tripleur, composés de cristaux BBO (bêta borate de baryum) et l'on
obtient un faisceau à 355 nm, d'une énergie par impulsion de 150 mJ (160 mJ pour le laser de
2008) et d'une largeur d'impulsion de 5 ns (cf. Figure 1-8).
miroir
fond de cavité
miroir
dichroïque
1064
cellule de
Pockels
flash
Oscillateur
cristal YAG
flash
532
OPO
cristal YAG
1064
355
doubleur tripleur
Amplificateur
cristal BBO
Figure 1-8. Laser de pompe : cristal YAG pompé par flash
Ce faisceau à 355 nm (Ȝpompe) est ensuite injecté dans l'OPO PantherTM pour le laser de
2001 et dans l'OPO PantherTMEx pour celui de 2008. Dans ces OPO, un premier cristal BBO
28
permet de balayer les longueurs d'onde de 410 à 710 nm pour Ȝsignal et de 710 à 2200 nm pour
Ȝidler, par la conversion d'un photon en deux photons :
1
1
O pompe
O signal
1
[1-2]
Oidler
Un deuxième cristal BBO placé sur le chemin optique permet d'obtenir en doublant Ȝsignal
les longueurs d'onde de 215 à 355 nm et en doublant Ȝidler celles de 355 à 410 nm. Les
rendements de conversion et les trajets optiques étant différents selon la longueur d'onde
utilisée, l'énergie par impulsion variera elle aussi en fonction de la longueur d'onde (cf.
Figure 1-9c).
a)
Opompe =
355 nm
BBO doubleur
25
c)
Nd3+ YAG
photon IR
photon
visible
energie / mJ
20
b) BBO accord de phase
photon
355 nm
O signal doublé =
215 -355 nm
O Idler =
710 -2200 nm
BBO accord de phase
prisme
O signal =
410 -710 nm
-
O signal =
410 -710 nm
BBO Doubleur
photon
visible
photon
visible
15
10
5
photon UV
0
300
600
900
2450
Longueur d'onde / nm
Figure 1-9. OPO : production du faisceau UV (a), conversion de fréquence des BBO (b),
énergie des différentes longueurs d'ondes en sortie d'OPO (c)
Le nouveau laser Continuum possède aussi un quadrupleur PantherTM sur un trajet issu du
doubleur du laser de pompe qui fournit la longueur d'onde 266 nm avec une puissance
beaucoup plus importante (80 mJ) que celle provenant du chemin passant à travers les deux
cristaux BBO (8 - 10 mJ).
Les caractéristiques du faisceau laser produit sont une largeur d'impulsion d'environ 5 à
10 ns au niveau du 355 nm et un diamètre de faisceau de 7 mm avec une divergence inférieure
à 2 mrad pour les deux lasers OPO.
Notons que les formes des faisceaux lasers OPO sont également différentes :
rectangulaire (2001), quasi circulaire (2008). Le faisceau de l'OPO de 2001 est divergent dans
29
une seule direction, à 1 m, il fait une tache ellipsoïdale de 8 mm sur le grand axe et de 3 mm
sur le petit axe. Le faisceau de l'OPO de 2008 est encore quasisphérique à 1m où il fait une
tache de 5 – 6 mm.
¾ Brillant B, Quantel
Ce laser, acquis en 1998, est un oscillateur Nd : YAG pulsé de haute énergie ayant des
modules pouvant générer des harmoniques jusqu'à 5 Ȧ.
A partir de la cavité YAG, des impulsions laser à 1064 nm d'une durée de 6.3 ns sont
produits à une fréquence de 20 Hz. Ensuite un doubleur (2 Ȧ) et quadrupleur (4 Ȧ) de
fréquence permettent d'obtenir respectivement les faisceaux à 532 nm et 266 nm. Ce faisceau
à 266 nm de fréquence 20 Hz a été utilisé pour faire les expériences pompe sonde. Son
énergie en sortie de laser est de 60 mJ/impulsion, sa largeur de raie de 0.8 cm-1 et le diamètre
du faisceau est d'environ 9 mm.
¾ Laser IR, série48, Synrad
Ce laser à CO2, acheté en 2008, a une puissance de 25 W. Le diamètre du faisceau est de
3.5 mm avec une divergence de faisceau de 4 mrad et sa longueur d'onde se situe entre 10.57
et 10.63 µm. C'est un laser pseudo continu.
Trois paramètres sont importants et peuvent être réglés à l'aide de la commande de
contrôle : l'amplitude du signal, la fréquence de base et la largeur de modulation de
l'impulsion. L'amplitude du courant continu peut varier entre 3.5 et 10 V avec un optimum
d'utilisation à 5 V. La gamme de fréquence s'étend de 0 à 20 kHz, la position standard se
situant à 5 kHz, ce qui correspond à une période de 200 µs. La durée de l'impulsion laser est
comprise entre 0 µs (0% du cycle) et 200 µs (100% du cycle). La période utilisée est 190 µs
soit 95% du cycle.
1.2.2 Couplage
¾ Avec le LCQ
Le piège ionique a été modifié [20] de manière à pouvoir réaliser de la photodissociation
sur les ions piégés. Pour cela, l’électrode annulaire a été percée pour permettre l’introduction
du rayon laser. Cette modification apportée au piège ne modifie en rien les spécifications de
mesure de masse et de piégeage de l’appareil. En effet les trous réalisés sur l’électrode
centrale sont de faible diamètre (3 mm) et modifient peu en première approximation le champ
30
quadripolaire au centre du piège. De plus, ces trous sont scellés par des fenêtres en saphir ce
qui permet de préserver l’étanchéité du piège et de maintenir la pression à 5 mtorr à l’intérieur
du piège.
Une lentille cylindrique convergente de 500 mm, placée sur le chemin optique, permet de
corriger la forme rectangulaire déformée (1 m après l'OPO) du faisceau et de le focaliser
(dans une dimension) au centre du piège. Une procédure d’alignement utilisant un laser
Hélium/Néon couplé à des fibres optiques permet de régler la position du laser UV au centre
du piège, le réglage fin se fait de manière qualitative à l'aide d'un calibrant. Le faisceau d'ion
(volume d'environ 3 mm3) et le faisceau laser (diamètre de 1 mm) ont des tailles peu
importante, leur recouvrement est très facilement reproductible.
La fenêtre en quartz à l'entrée du piège laisse passer 90 % de l'intensité lumineuse et en
réfléchit 10 % sur un mesureur de puissance.
Obturateur
électromécanique
OPO Laser
Laser HeNe
Lentille
cylindrique
+500mm
Fibre
optique
Mesureur de
puissance
Fenêtre de
quartz
Synchronisation RF
Générateur de
délais
Fenêtre en
saphir
Détecteur
d’ion
Source
ESI
Piège
ionique
Figure 1-10. Couplage LCQ-laser
¾ Avec LTQ
Ici, le rayon laser est introduit par l’arrière de l’appareil directement sur l’axe central du
piège linéaire (cf. Figure 1-1b) [21]. Une fenêtre en quartz aménagée sur la plaque arrière
scellée du LTQ permet également de préserver l’étanchéité du spectromètre.
31
Avant l'arrivée du faisceau dans le piège, celui-ci passe à travers une série de lentilles (cf.
Figure 1-11) et des diaphragmes.
+200mm
-100mm
+500mm
LTQ
8cm
16cm
Figure 1-11. Association de lentilles permettant une injection optimale du faisceau laser dans
le LTQ
L’axe du laser n’étant pas le même que l’axe d'injection du spray, le réglage du
positionnement du laser est délicat et directement optimisé à l’aide d’un calibrant. La
longueur de recouvrement entre le faisceau d'ions et le laser est ici plus importante que pour le
LCQ. La fragmentation, lorsque le réglage optimal est obtenu, sera donc meilleure. Mais
comme le piège est linéaire, le faisceau d'ions a une forme allongée, et le recouvrement de
toute la surface avec le rayon laser est donc plus complexe, les deux faisceaux devant être
pour cela bien parallèles.
En IRMPD (couplage du spectromètre de masse avec le laser infra rouge), il n'y pas de
lentille ni de diaphragme sur le chemin optique, le faisceau est directement injecté dans le
piège à l'aide de deux miroirs à CO2 et de diaphragmes d'alignement.
¾ Synchronisation
Dans ces montages, un obturateur électromécanique est placé sur le trajet du laser. Il est
commandé par un générateur de délais qui permet la synchronisation entre l'arrivée du
faisceau laser et l'arrivée des ions dans le spectromètre de masse. L’irradiation a lieu pendant
la période d’activation, moment où l’espèce à étudier a été isolée dans le piège et dure de 50 à
2000 ms. Le temps de déclenchement de l'obturateur est de l'ordre de la milliseconde, ce qui
est suffisamment rapide devant les différents temps de l'expérience. La durée d'ouverture de
l'obturateur est choisie de manière à sélectionner un nombre d'impulsions laser données (par
exemple, pour le laser à 20 Hz, 250 ms correspondent à 5 impulsions laser). La commande de
l'obturateur est obtenue à partir du spectromètre de masse ajoutant une séquence de CID avec
une énergie de collision nulle.
32
¾ Contrôle de la puissance laser
Pour étudier les propriétés optiques linéaires d'un ion, il faut que l'absorption soit
monophotonique. Nous vérifions cela en prenant différents spectres à une même longueur
d'onde tout en faisant varier la puissance du laser comme montré sur le dispositif de la Figure
1-12. Une lame demi onde et un cube polariseur sont placés sur le chemin optique entre la
sortie de l'OPO et l'entrée du piège.
La lumière produite par le laser est cohérente, monochromatique, rectiligne et polarisée
linéairement (verticalement ou horizontalement). Son passage à travers une lame demi-onde
provoque le changement de la direction de polarisation de façon symétrique par rapport à son
axe rapide : la composante selon l'axe lent a changé de sens. Lors du passage de cette onde
dans le cube polariseur, celui ci sépare le faisceau en deux faisceaux de polarisations
différentes perpendiculaires entre elles. En faisant varier l'angle ș que fait l'onde laser avec
l'axe de polarisation de la lame demi onde, nous pouvons atténuer progressivement l'intensité
de l'onde sortant du polariseur. Cette intensité varie selon la loi de Malus (cf Figure 1-12) :
I
Ȝ/220°
I 0 cos 2 T
[1-3]
Cube polariseur
I / I0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
Ȝ/245°
20
40
60
80
ș°
Figure 1-12. Atténuation de l'intensité par le dispositif Ȝ /2 + cube polariseur (gauche).
Courbe d'évolution de l'intensité transmise en fonction de l'angle de polarisation (droite)
1.2.3 Différents types de mesure
¾ Mesures de spectre de photofragmentation
Ces mesures consistent à irradier avec un laser les ions piégés puis à étudier la
fragmentation obtenue. On cherche donc à avoir une fragmentation maximale, pour cela le
recouvrement entre le faisceau laser et le nuage d'ions doit être le plus important possible.
33
Nous cherchons aussi à avoir un gain de temps en diminuant les temps d'activation tout en
gardant une bonne fragmentation.
Entre les deux appareils à notre disposition, le LTQ est plus intéressant pour ce type
d'expérience. Le piège linéaire contient plus d'ions que le piège 3D et de plus la longueur de
recouvrement du faisceau laser et du nuage d'ions est plus importante pour le LTQ. Ce qui fait
du LTQ le candidat idéal pour ce type d'analyse.
¾ Mesures de spectres optiques
Lors de ce type d'expériences, nous sondons la réponse des molécules soumises à chaque
longueur d'onde d'une gamme d'énergie UV et/ou visible par pas de 2 à 10 nm. Nous
regardons leur fragmentation due à l'absorption de la lumière pour cette gamme de longueur
d'onde, nous réalisons des spectres d'action.
La somme de toutes les intensités d'un spectre de masse est notée I0 (cf. Figure 1-13), elle
correspond à la somme de l'intensité du pic parent (I = Iparent) et de celles de tous les pics
fragments ( ¦ I fragments ) :
I parent ¦ I fragments
I0
[1-4]
¦I
b)
I0 ¦ I
I0
" parent ¦ fragments"
fragments
" parent "
i
fragments
I parent
100
Intensité relative %
a)
50
0
300
" ¦ fragments"
600
900
m/z
I0
i
Figure 1-13. Schéma des différentes intensités (a), spectre de masse (peptide YLGEEYVK)
représentant aussi ces intensités
De plus, la loi de Beer Lambert, qui s'applique aux molécules en solution diluée, peut
aussi s'appliquer en phase gazeuse :
I
I0
e
V f I
[1-5]
donc :
ln
I0
I
VfI
[1-6]
34
et ıf la section efficace peut être donnée sous la forme suivante :
1
Vf
I
ln
I0
I
[1-7]
avec I le flux laser qui peut s'écrire sous la forme
I
Pl
X
l
u
1
EhQ
Pl
X
u
l
Ol
[1-8]
hc
avec Pl, la puissance laser, ȣl, la fréquence du laser et Ȝl, la longueur d'onde du laser. La
fréquence du laser, h et c sont des constantes donc :
I v P l u Ol
[1-9]
et l'expression de la section efficace de fragmentation ı devient :
Vf
ªI º
ln « 0 »
¬I ¼
Pl u Ol
ª I parent ¦ I fragments º
ln «
»
I parent
«¬
»¼
Pl u Ol
[1-10]
Lors du tracé de spectre optique, la reproductibilité des mesures lorsque l'on change de
longueur d'onde est le facteur le plus important. Le LCQ donne des meilleurs résultats,
l'injection du laser et le recouvrement du faisceau laser avec le nuage d'ions étant plus facile à
contrôler que dans le LTQ.
¾ Mesures pompe sonde
Le dernier type de mesures réalisées consiste en des expériences pompe sonde. Dans ces
expériences, un premier laser permet d'exciter les ions A présents dans le piège. Après
relaxation, il y a création de nouveaux ions B. Un deuxième laser va sonder les propriétés
optiques des ions B obtenus, selon le schéma suivant :
Ions A
hX1
Ions B
hX2
Fragments
Ces expériences permettent d'obtenir des informations sur le temps d'une réaction et
d'étudier les propriétés optiques des ions B produits par le premier laser. Nous avons accès au
temps de formation des ions B en faisant varier le délai entre les deux lasers.
Dispositif expérimental
Il faut donc créer un dispositif expérimental où les impulsions optiques se recouvreront
spatialement et temporellement. Pour le recouvrement temporel, les lasers sont synchronisés
35
(cf. Synchronisation), pour le recouvrement spatial, une lame séparatrice est utilisée (cf.
Figure 1-14 ci-dessous).
Comme dans les montages précédents, une lentille cylindrique convergente permet de
rectifier la forme du faisceau laser issu de l'OPO, un obturateur électromécanique permet la
synchronisation de l'injection avec le temps d'activation du piège (cf. Synchronisation) et un
mesureur de puissance (non représenté sur le schéma) est utilisé.
Enfin, un cube polariseur et une lame demi onde (Ȝ/2) sont utilisés pour ajuster l'intensité
lumineuse du laser Brillant B.
Photodiode rapide
490nm
PR1
Laser OPO
Continuum
Visible 490nm
Lame séparatrice
à 266nm
oscilloscope
Lentille cylindrique
convergente 500mm
Obturateur
électromécanique
Piège
ionique
LCQ
Diaphragme
Cube polariseur
à 266nm
Ȝ/2 à 266nm
Laser Quantel Brillant B
4Ȧĺ266nm
PR1
Photodiode rapide
266nm
Lame séparatrice
PR2
PR2
oscilloscope
temps
oscilloscope
Figure 1-14. Dispositif expérimental de l'expérience pompe sonde
Synchronisation
Lors d'expériences pompe sonde, les deux lasers utilisés doivent se déclencher de
manière à être synchronisés au moment de leur arrivée dans le piège. Le délai entre les lampes
flash et le Q-switch du laser Brillant B est de 240 µs, celui entre les lampes flash et le Qswitch du laser OPO est de 216 µs. Ici le déclenchement des lampes Flash du laser Brillant B
a été choisi comme temps de départ.
Le déclenchement du Q-switch du Brillant B se fait en interne alors que le déclenchement
des lampes flash et du Q-switch de l'OPO se fait en externe à partir du temps de
déclenchement des lampes flash du Brillant B.(cf. Figure 1-15 et Figure 1-16).
36
Flash Lamp 1
Q-Switch 1
240μs
Brillant B
Déclenchement
interne
Laser 1
240μs ± ǻt
OPO continuum
24μs± ǻt
Déclenchement
externe
216μs
Laser 2
Flash Lamp 2
Q-Switch 2
Figure 1-15.Schéma des délais de synchronisation entre les deux lasers, ǻt correspond à un
délai temporel ajustable entre le laser pompe (Brillant B) et le laser sonde (OPO)
Flash Lamp synchro
Horloge, 20 Hz
in
out
YAG Brillant B
TTL
Carte de délais
numériques
MI660
Retard variable
Entrées
Sorties
1
Trigg
2
Sorties trigg externes
Boîte de
Q-Switch
TTL
OPO Continuum
Boîte CU601
Q-Switch in
External Flash Lamp
Figure 1-16 Schéma électronique de l'expérience pompe sonde (TTL : transistor-transistorlogic)
Délai pompe sonde
Le délai entre les deux lasers peut être ajusté pour faire des expériences pompe sonde et
peut varier entre 240-1 µs et 240+1 µs par pas de 25 ns. Le contrôle du délai entre les lasers
est effectué à l'aide de deux photodiodes. La fluctuation temporelle (ou jitter) du signal est de
±20 ns.
37
1.3 Préparation des échantillons
La plupart des études réalisées lors de cette thèse ont été faites à partir de peptides et
protéines achetés sous forme de poudre. La quantité d'échantillon n'a donc pas été un frein à la
qualité des mesures effectuées. Pour injecter ces échantillons dans la source electrospray, il
faut tout d'abord les solubiliser, ce qui fera l'objet de cette partie.
L'intensité du signal mais aussi la distribution en état de charge obtenues sont directement
influencées par les conditions opératoires de la source electrospray comme le débit de la
solution, la température du capillaire, le pourcentage de gaz séchant (cf. Source electrospray)
mais aussi par la qualité du transfert des ions en phase gazeuse qui dépend des caractéristiques
de la solution.
Nous constatons que l'efficacité du spray formé par le cône de Taylor dépend de la taille
du capillaire 1 (plus le rayon du capillaire est petit, plus le potentiel nécessaire pour le spray
est faible). La nature du solvant influence aussi les caractéristiques du spray : une tension de
surface importante augmente le voltage à appliquer pour former le cône de Taylor, une
viscosité importante augmente la taille des gouttelettes émises à la pointe du cône de Taylor et
les solvants les plus polaires stabilisent les charges élevées. La tension superficielle à
l'interface solvant/air du méthanol (Ȗ=22.1 mN.m-1 à 25°C) ou de l'acétonitrile (Ȗ=28.7 mN.m1
), est beaucoup plus faible que celle de l'eau (Ȗ H O =72.0 mN.m-1 toujours à 25°C).
2
Les particules chargées sont sous forme de gouttelettes et se déplacent d'une électrode à
une autre sous l'action du champ électrique. De la Mora [22] a réussi à déterminer à partir de
résultats expérimentaux des formules permettant d'avoir le courant, le rayon et la charge des
gouttelettes les plus appropriés, cependant le choix du mélange de solvant est souvent
déterminé de manière empirique. Il faut en effet trouver le meilleur compromis entre solvant
volatil et solvant dans lequel le soluté est soluble (solvant polaire).
¾ Solutions pour le mode négatif
La plupart des études effectuées, ont été réalisées en mode négatif puisque le phénomène
généralement étudié ici (le photodétachement d'électron) n'est pas observé en mode positif, où
seule la fragmentation est visible. Pour voir cet événement, il faut produire des polyanions. Le
détachement à partir d'un monoanion conduisant à une espèce n'est pas observé. Les peptides
sont dissous dans des solutions où ils sont solubles et avec lesquelles la production d'ions
négatifs multidéprotonés est possible. Les études de peptides en mode négatif sont plus rares
38
qu'en mode positif. En effet la plupart des peptides s'ionisent un peu mieux en mode positif
qu'en mode négatif mais l'on obtient surtout une fragmentation souvent plus informative en
mode positif [23].
Lors de ces travaux, le solvant utilisé est en général un mélange 1/1 eau/acétonitrile,
mélange utilisé dans la plupart des articles de spectrométrie de masse en mode négatif. Le
méthanol, solvant polaire lui aussi, très utilisé en mode positif l'est beaucoup moins en mode
négatif (cependant, les différences de spectres obtenus par l'utilisation d'un de ces deux
solvants ne sont pas flagrantes).
1% d'une base est ensuite ajoutée à la solution de manière à obtenir un pH de la solution
de 8-9. Dans la littérature NH4OH, NaOH et KOH sont utilisées indifféremment. Cet ajout
permet d'augmenter le signal de manière conséquente. Peng Pan et ses collaborateurs [24] ont
montré que le pH optimum était d'environ cinq unités de plus que le point isoélectrique (pI) de
la protéine. Les tampons généralement utilisés pour solubiliser les protéines comme le tampon
tris, diminuent fortement le signal electrospray. C'est pour cela qu'ils sont en général
remplacés par des sels d'ammonium plus volatils comme l'acétate d'ammonium ou le
bicarbonate d'ammonium.
¾ Solutions pour le mode positif
Les seules expériences qui ont été réalisées en mode positif durant ce travail concernent
les complexes métaux/protéines. Les conditions expérimentales optimales sont un mélange
méthanol/eau 1/1 avec 1% d'acide acétique. L'acide sert à augmenter la production des ions.
L'acide acétique et l'acide formique sont généralement préférés aux autres acides car ils n'ont
pas de contre-ions gênants (contrairement à HCl, H2SO4) et ce sont des acides faibles (risque
de surtension dans la source si le pH de la solution est très faible).
mode négatif
Eau/Acétonitrile 1/1
base : KOH, NH4OH 1%
pH=8-9
mode positif
Eau/Méthanol 1/1
acide acétique 1%
pH=2-3
Tableau 1-2. Les solutions types en mode négatif et en mode positif
Des concentrations de 50 à 100 µM ont permis de bonnes conditions de travail. Ces
concentrations peuvent sembler élevées. Mais elles sont nécessaires puisque la plupart des
spectres sont faits en mode MSn et qu'une partie des ions est perdue lors des différentes étapes
d'éjection/isolation de ce mode. De plus, les spectres optiques sont obtenus en comparant des
39
rapports d'intensité. Donc plus le rapport intensité sur bruit de fond est grand, plus les
résultats seront précis.
¾ Réduction des ponts disulfures
La chaîne latérale des acides aminés cystéines se termine par un groupement SH dont le
pKa est environ 9.0-9.5. Des ponts reliant deux groupements thiols au sein de la même
protéine se forment lors de la maturation de celle-ci. Ces ponts reliant les deux atomes de
soufre sont des liaisons covalentes relativement stables qui maintiennent la protéine repliée
sur elle-même dans une conformation donnée. La formation de cette liaison se fait
spontanément en condition oxydante en présence d'O2. Cette liaison peut cependant être
réduite en utilisant du B-mercaptoéthanol ou du dithiothréitol (DTT) [25], son isomère le
dithioérythritol donnant de moins bons résultats.
Au cours de ce travail nous avons utilisé le DTT pour réduire les ponts disulfures. Pour
cela, il faut placer les protéines en solution à pH~7 (tampon acétate d'ammonium) et en excès
de DTT pendant 12 heures. Nous n'avons pas utilisé de condition dénaturante (addition d'urée,
etc…) car le site à réduire était accessible (petit peptide de masse molaire égale à 1000).
40
1.4 Méthodes optiques en solution
Nos expériences en phase gazeuse peuvent être comparées à des expériences en solution.
En effet, les spectres d'absorption en solution permettent d'avoir des informations sur
l'absorbance des espèces présentes et ceux de dichroïsme circulaire sur la conformation des
protéines.
1.4.1 Spectrophotométrie d'absorption en solution
L'absorption en solution peut être utilisée comme une méthode d'identification de
composé ou comme une méthode de dosage.
¾ Principe
Cette
méthode
repose
sur
l’absorption
de
lumière
par
l'échantillon.
Les
spectrophotomètres les plus généralement utilisés recouvrent la gamme de longueur d'onde de
l'UV et du visible, ces longueurs d'ondes correspondent aux transitions électroniques des
molécules. Le nombre de photons absorbés entraine une diminution de l'intensité du
rayonnement transmis. Cette diminution se traduit par la loi de Beer-Lambert :
AO
I 0O
log
IO
HO l C
[1-11]
L'absorbance mesurée AȜ est définie comme le logarithme du rapport de la quantité de
lumière incidente I°Ȝ par rapport à celle sortante de l'échantillon IȜ.
Solution de concentration C
Intensité du faisceau
incident IoȜ
Intensité du faisceau
transmis IȜ
Lampe
Longueur de la cuve l
Figure 1-17. Schéma de l'absorption en solution
41
Détecteur
L'absorbance AȜ donne accès à la concentration de la molécule C si celle ci est seule en
solution à Ȝ donnée. En effet connaissant İ, le coefficient d'absorption propre à chaque
molécule et l la longueur du trajet optique, la concentration C peut être déduite.
¾ Analyse de spectre d'absorbance de protéine
Lors de ce travail, nous avons surtout utilisé les spectres d'absorbance en solution pour
les comparer aux spectres optiques obtenus en phase gazeuse. En effet, dans les deux
dispositifs, les informations sont obtenues à partir des transitions électroniques dues à
l'absorption de photons par la molécule.
Dans une protéine, ce sont principalement les chaînes latérales des acides aminés
chromophores et les liaisons peptidiques qui absorbent dans l' UV (cf. Tableau 1-3).
Ȝmax
Absorbance molaire
/ nm
/ mol.L-1.cm-1
Phénylalanine
257.4
197
Tyrosine
274.6
1420
Tryptophane
279.8
5600
Tableau 1-3. Propriétés spectroscopiques des acides aminés aromatiques à pH neutre [26]
¾ Matériel utilisé
Les spectres d'absorption ont été obtenus avec un spectrophotomètre AvaSpec2048
(Avantes) couplé à une lampe deutérium deep-UV et une lampe halogène. Cet appareil permet
d'obtenir des spectres de 230 à 800 nm en utilisant des cuves en quartz adaptées pour le
rayonnement UV.
1.4.2 Dichroïsme circulaire
Le dichroïsme circulaire permet d'étudier la structure secondaire des protéines. Avec cette
méthode, on peut observer les changements structuraux induits par les variations de milieu
(pH, température, solvants…) mais aussi étudier le repliement des protéines.
¾ Principe
En dichroïsme circulaire, on mesure la différence d'absorbance d'un échantillon chiral
soumis à un faisceau polarisé circulairement à droite et à gauche.
42
Avant le passage dans l'échantillon, les deux vecteurs d'onde polarisée circulairement
dans un sens et dans l'autre sens, ED et EG, sont en phase et de même amplitude E. Leur
résultante est polarisée linéairement. Lorsqu'un échantillon chiral absorbe une onde polarisée
circulaire, cette absorption est différente pour une onde polarisée circulaire droite ou
circulaire gauche. Après le passage de l'onde dans un échantillon optiquement actif, les deux
vecteurs d'onde polarisée circulairement ED et EG, ont des amplitudes différentes et sont
déphasés. Leur résultante est donc une onde polarisée elliptiquement. L'ellipticité ș mesurée
par les spectromètres de dichroïsme circulaire est de la forme :
tan(T )
( E D EG ) /( E D EG )
[1-12]
Solution de concentration C
EG
ED
EG
ED
Longueur de la cuve l
Figure 1-18. Principe des mesures par dichroïsme circulaire
¾ Mesure du dichroïsme circulaire de protéines
En dichroïsme circulaire, on mesure la différence d'absorption ǻA d'un échantillon chiral
entre une lumière polarisée circulairement à gauche et à droite. Cette différence est inférieure
à moins de 1% de l'absorbance totale de l'échantillon.
'A
AG AD
[1-13]
A partir de cette valeur, si l'on connaît la concentration C en mol.L-1de l'échantillon et la
longueur du trajet optique l en cm, on peut remonter au pouvoir dichroïque molaire İ en
mol.L-1.cm-1 :
'H
HG H D
'A
lC
[1-14]
Historiquement, les spectres de dichroïsme circulaire étaient mesurés en ellipticité ș :
43
T
33'A
[1-15]
La mesure du dichroïsme circulaire de protéine est basée sur l'absorption du groupement
amide de la liaison peptidique en dessous de 250 nm, dans l'environnement asymétrique du
carbone Į. Comme les angles des liaisons formant le squelette peptidique dépendent de la
structure secondaire, on peut avoir accès à celle-ci grâce au dichroïsme circulaire.
Dans l'UV lointain, 180 - 250 nm, les groupements amides ont deux transitions : la
transition ʌĺʌ* des électrons du groupe carbonyle (C=O) est centrée à 190 nm et celle nĺʌ*
des électrons libres de l'oxygène (_O_) est observée à 210 – 220 nm.
Dans l'UV proche, 250 – 300 nm, les électrons ʌ des acides aminés aromatiques (Phe, Tyr
et Trp) ont des transitions ʌĺʌ* qui sont sensibles à l'environnement des chaînes latérales et
donc à la structure tertiaire mais les intensités sont très faibles [27]. C'est pourquoi, ces
transitions sont très peu utilisées en dichroïsme circulaire.
¾ Analyse de spectre de dichroïsme circulaire de protéine
Les profils des spectres de dichroïsme circulaire obtenus sont caractéristiques de
structures secondaires [28]:
- Hélice Į : bande positive à 192 nm (transition ʌĺʌ* des C=O), bande négative à
208 nm (transition nĺʌ* des _O_) et bande négative à 222 nm (transition nĺʌ* des
_
O_).
- Feuillet ȕ : bande positive à 198 nm (transition ʌĺʌ* des C=O), bande négative à
175 nm (transition ʌĺʌ* des C=O) et bande négative à 215 nm (transition nĺʌ* des
_
O_).
- Apériodique : bande négative à 195 nm (transition ʌĺʌ* des C=O) et bande positive à
212 nm (transition nĺʌ* des _O_).
Grâce aux spectres de dichroïsme circulaire, une approximation rapide du pourcentage Ĳ
en hélice Į d'une protéine peut être faite :
W%
[T ] 222 nm
u 100
39000 u (1 2.57 / n)
avec [ș] l'ellipticité par résidu et n le nombre de résidus.
44
[1-16]
hélice D
feuillet E
aléatoire
Figure 1-19. Profils de dichroïsme circulaire pour différentes structures secondaires : hélice
Į, feuillet ȕ et aléatoire [29]
Pour passer du spectre de dichroïsme circulaire à la structure secondaire, il faut passer par
des méthodes empiriques où le spectre de dichroïsme circulaire d'une protéine est pris comme
étant une combinaison linéaire des spectres élémentaires décrits ci-dessus (hélice, feuillet,
apériodique). Lors de l'utilisation de ces méthodes de déconvolution, la concentration doit
préalablement être connue avec précision.
¾ Matériel utilisé
Les spectres de dichroïsme circulaire ont été réalisés à l'Institut de Biologie et Chimie des
Protéines de Lyon (responsable R. Montserret) avec l'appareil Chirascan (Applied
Photophysics Ltd). Cet appareil a été utilisé pour étudier le repliement de l'ubiquitine dans des
mélanges de solvants de différentes proportions.
45
1.5 Méthodes théoriques
Les calculs fait au cours de ce travail de thèse ont permis la détermination de structures
des systèmes mais aussi de leur réponse optique.
Lorsque l'on détermine la structure d'un système, on cherche tout d'abord à calculer
l'énergie potentielle associée aux différentes conformations possibles. Puis on détermine la
conformation la plus stable, c'est-à-dire celle de plus basse énergie. Pour cela plusieurs
méthodes sont envisageables, elles ne sont pas équivalentes en temps de calcul, ni en
approximations préalables. Ici nous avons utilisé selon la taille des systèmes, la méthode par
champs de force [30], la méthode DFT [31] ou des méthodes hybrides de type QM/MM [32].
Certains types de calcul donnent accès en plus de la structure, aux spectres d'absorption et
aux transitions caractéristiques associées. Durant ce travail nous avons utilisé la méthode TDDFT [33] pour obtenir ce type d'information.
Ces calculs ont été réalisés dans leur majorité par Abdul-Rahman Allouche (équipe
physico chimie théorique du laboratoire). Les calculs de dynamique moléculaire ont été fait
par Rodolphe Antoine et une partie de ceux sur le complexe oxytocine / cuivre par le groupe
du Professeur Bonacic Koutecky à Berlin.
Molécules
Tyrosine
Tyrosinate
méthodes
fonctionnelle B3LYP
TD-DFT
base aug-cc-pvdz
Tryptophane
tryptophane déprotoné
fonctionnelle B3LYP
TD-DFT
base aug-cc-pvdz
radical indolyl
N-méthylacétamide
DFT
B3LYP / base aug-cc-pvdz
2-aminoéthanol
Ab initio
MP2 / base aug-cc-pvdz
Dynamique
programme TINKER
moléculaire
champ de force Amber avec parm99
Ubiquitine
QM/MM
résidu tyrosine QM / protéine MM
Oxytocin/ Cuivre
TD-DFT
SDRGDGG
DRVYVHPF
EGVNDNEEGFFSAR
fonctionnelle B3LYP
base aug-cc-pvdz
Tableau 1-4. Systèmes et méthodes théoriques utilisés
46
1.6 Bibliographie
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(2005)
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Mass-Spectrometry of Large Biomolecules. Science 1989, 246, 64.
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47
[17] Wong PS, Cooks RG, Ion trap mass spectrometry. Current Separations 1997, 16, 85.
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[32] Gao J, Methods and applications of combined quantum mechanical and molecular
mechanical potentials. Reviews in Computational Chemistry 1996, 7, 119.
48
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International Journal of Quantum Chemistry 1998, 70, 933.
49
Chapitre 2 :
Photodétachement d'électron :
principe, mécanismes et énergétique
Sommaire
2.1 PHOTODETACHEMENT D'ELECTRON ............................................................................................ 52
2.1.1 Principe du photodétachement d'électron sur des peptides anioniques ............................................. 52
2.1.2 Evolution de l'efficacité de photodétachement d'électron................................................................... 55
2.1.3 Mécanismes du photodétachement d'électron .................................................................................... 62
2.2 SPECTROSCOPIE DE PHOTOELECTRON ......................................................................................... 74
2.2.1 Montage expérimental ........................................................................................................................ 74
2.2.2 Informations obtenues à partir de spectre de PES ............................................................................. 77
2.2.3 Etude de la position des charges, estimation du point de départ de l’électron et déduction de la
distance entre les charges............................................................................................................................ 86
2.3 BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................... 91
Le couplage spectrométrie de masse / spectroscopie laser, montage décrit dans le chapitre
précédent, a été principalement utilisé durant ma thèse pour étudier des peptides chargés
négativement. Lorsqu'un peptide (ou une protéine) multidéprotoné est irradié avec un laser,
cela entraîne le détachement d'un ou plusieurs électrons.
L'objectif du travail décrit dans ce chapitre est de mieux comprendre les mécanismes
donnant lieu à ce détachement d'électron. Pour cela nous aurons plusieurs approches. Dans un
premier temps, nous nous intéresserons à la formation de l'espèce radicalaire obtenue par
photodétachement d'électron. Nous discuterons notamment de l'intensité du signal de ce
radical photogénéré en fonction de différents paramètres et aussi du mécanisme donnant lieu à
ce radical. Dans un deuxième temps, nous regarderons les propriétés de l'électron émis. Pour
cela, nous avons complété nos études spectroscopiques avec de la spectroscopie de
photoélectron réalisée dans le groupe du Professeur M. Kappes (Université de Karlsruhe).
Cette dernière approche nous a notamment renseigné sur l'énergétique mise en jeu dans le
photodétachement d'électron.
51
2.1 Le photodétachement d'électron
2.1.1 Principe du photodétachement d'électron sur des peptides anioniques
Aux énergies que nous utilisons, le photodétachement d'électron est un mode de
fragmentation particulier aux molécules chargées négativement. Ce processus est observé de
manière générale avec toutes les biomolécules polyanioniques : peptides, protéines, ADN. Ici
nous détaillerons les résultats obtenus avec des dianions de peptides (peptides doublement
déprotonés).
¾ Propriétés des acides aminés
Les systèmes étudiés lors de ce travail sont des peptides et des protéines. Ces éléments
sont constitués d'un enchaînement linéaire d'acides aminés liés entre eux par des liaisons
peptidiques. Les fonctions dépendent bien sûr de l'enchaînement des acides aminés (structure
primaire) mais aussi de leur agencement dans l'espace (structures secondaire, tertiaire et
quaternaire).
Propriétés ioniques
Comme nous l'avons vu dans le premier chapitre, les mesures par spectrométrie de masse
ne peuvent se faire que sur des systèmes chargés. Dans un peptide, l'amine (NH2) du côté Nterminal peut se charger positivement (cf. pKa2 dans le Tableau 2-1) et l'acide (COOH) du
côté C-terminal négativement (cf. pKa1 dans le Tableau 2-1). De plus, les vingt acides
aminés naturels ont des chaînes latérales possédant des groupes fonctionnels qui les
différencient. Celles-ci, selon le groupe fonctionnel qui les compose, peuvent aussi se
protonner (lysine, arginine mais aussi histidine) ou se déprotonner (aspartate, glutamate mais
aussi tyrosine et cystéine), cf. pKa R dans le Tableau 2-1. A partir de ces données, les sites
préférentiels pour la position des charges peuvent être prévus, en solution, selon le pH
observé. Ces sites préférentiels peuvent être extrapolés à la phase gazeuse.
52
1(
C
O
OH
)
co
d
eà
1
l
ett
re
co
d
eà
3
l
ett
res
Ma
ss
e
(g. mola
m
ol- ire
1)
p
iso oin
t
é
l
e
ctr
i
(pI que
)
pK
a
H2
)
pK
a
2(
N
Tableau 2-1. Les propriétés des 20 acides aminés [1]
53
A
Ala
89.09
6.11
2.35
9.87
7.86
R
Arg
174.2
10.76
1.82
8.99
12.48
5.39
N
Asn
132.12
5.41
2.14
8.72
4.15
D
Asp
133.1
2.85
1.99
9.9
3.9
5.34
C
Cys
121.16
5.05
1.92
10.7
8.2-9.5
1.51
E
Glu
147.13
3.15
2.1
9.47
4.07
6.66
Q
Gln
146.15
5.65
2.17
9.13
3.95
G
Gly
75.07
6.06
2.35
9.78
6.94
H
His
155.16
7.6
1.8
9.33
6.04
2.29
I
Ile
131.17
6.05
2.32
9.76
5.91
L
Leu
131.17
6.01
2.33
9.74
9.64
K
Lys
146.19
9.6
2.16
9.06
10.54
5.93
M
Met
149.21
5.74
2.13
9.28
2.37
F
Phe
165.19
5.49
2.2
9.31
3.97
P
Pro
115.13
6.3
1.95
10.64
4.81
S
Ser
105.09
5.68
2.19
9.21
6.83
T
Thr
119.12
5.6
2.09
9.1
5.41
W
Trp
204.23
5.89
2.46
9.41
1.14
Y
Tyr
181.19
5.64
2.2
9.21
10.46
3.04
V
Val
117.15
6
2.39
9.74
6.73
Ƅ possibilité formation pont disulfure entre deux cystéines Ƈ aromatique ƅ contrainte conformationnelle
Alanine
Arginine
Asparagine
Aspartate
Cystéine
Glutamate
Glutamine
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Méthionine
Phénylalanine
Proline
Sérine
Thréonine
Tryptophane
Tyrosine
Valine
Nom
1.8
-4.5
-3.5
-3.5
2.5
-3.5
-3.5
-0.4
-3.2
4.5
3.8
-3.9
1.9
2.8
-1.6
-0.8
-0.7
-0.9
-1.3
4.2
alkyle
amino
amino
carboxyle
thiol
carboxyle
amino
alkyle
amino
alkyle
alkyle
amino
thiol
alkyle
amino
hydroxyle
hydroxyle
amino
hydroxyle
alkyle
Ƈ
Ƈ
Ƈ
ƅ
Ƈ
Ƅ
pK
a
R
(R
)
Ab
on
r
d
e
l
at anc
e
le iv e
s
pr dan
ot
s
é
i
ne
s
hy Inde
d
r
op x
h
o
bic
ité
gr
fon oupe
cti
o
n
ne
l
inf
o
ad rma
d
itio tion
n
n
ell
e
Propriétés optiques
Certains acides aminés, ayant des groupes fonctionnels aromatiques (tryptophane,
tyrosine, phénylalanine), possèdent aussi des propriétés optiques. Ils peuvent absorber des
photons par l'excitation des liaisons ʌ possédant des électrons fortement délocalisés. La
liaison amide du squelette peptidique peut aussi absorber des photons mais à plus courte
énergie (cf. Tableau 2-2). Il faut noter que deux cystéines peuvent former des ponts disulfures
entre elles et que ceux-ci ont une absorption non négligeable à 250 nm [2].
Résidus
İ (L.mol-1.cm-1) à 260 nm
İ (L.mol-1.cm-1) à 220 nm
Phénylalanine
144
710
Tyrosine (OH)
612
4312
Tyrosinate (O-)
1750
4850
Tryptophane
3765
12872
Liaison peptidique
0
425
Tableau 2-2. Coefficient d'extinction molaire en solution (İ) à 260 et 220 nm [3-5]
¾ Principe du photodétachement
Le piège à ions permet d'isoler un peptide en phase gazeuse. Ensuite, lorsque le laser UV
ou visible irradie le peptide, celui-ci absorbe un photon ce qui conduit à une excitation
électronique des électrons ʌ du peptide. Cet apport d'énergie est suivi d'une désexcitation.
Plusieurs voies sont possibles : la fluorescence, la conversion interne puis la redistribution
interne de l'énergie vibrationnelle (CI + IVR) ou/et la fragmentation. La fluorescence ne peut
pas être détectée dans notre piège. Par contre, la spectrométrie de masse permet d'étudier la
fragmentation résultant de cette irradiation laser. Dans le cas de dianions, la "fragmentation"
suit un canal majoritaire, le photodétachement d'électron comme montré dans le schéma
suivant :
[ M – 2H ]2-
hQ
[ M – 2H ]1-
.
+
e-
Pour illustrer ce phénomène, les spectres de masse du peptide angiotensine
(NRVYVHPF) ont été enregistrés avec et sans irradiation laser. Sur la Figure 2-1a, on
observe le spectre de masse de l'angiotensine lorsque l'on isole, pendant 500 ms, cette espèce
chargée deux fois négativement dans le piège. Le spectre de masse de la même espèce après
54
Chapitre 2 :Photodétachement d'électron : principe, mécanismes et énergétique
une irradiation laser à 260 nm pendant 500 ms soit 10 impulsions laser est montré sur la
Figure 2-1b. L'irradiation laser de l'espèce [M-2H]2- (m/z = 514) génère principalement et en
grande quantité l'espèce [M-2H]1-ƒ (m/z = 1028) par photodétachement d'un électron. Ce
phénomène, intense en comparaison des fragmentations dues au laser en mode positif, a été
observé pour tous les peptides étudiés mais aussi de façon plus générale pour tous les
polyanions (ADN [6], protéines [7], sucres).
100
a)
NRVYVHPF
Laser off
[M-2H]2-
Intensité
50
0
100
b)
NRVYVHPF
Laser on
[M-2H]2-
[M-2H]-.
50
-44
0
300
600
m/z
900
1200
Figure 2-1. Spectres de masse de l'angiotensine doublement déprotonée isolée et piégée
pendant 500 ms (a) et après une irradiation laser de 10 impulsions (500 ms) avec le laser
OPO à 20Hz (b)
On remarque ici la présence d'un deuxième fragment à m/z = 984 correspondant à la perte
de 44 Da à partir du pic [M-2H]-ƒ : le mécanisme conduisant à ce type de fragment résulte
d'une recombinaison radicalaire et sera discuté dans le chapitre suivant.
2.1.2 Evolution de l'efficacité de photodétachement d'électron
Nous avons vu précédemment que le détachement de l'électron du peptide est le canal de
relaxation majoritairement observé en mode négatif pour des polyanions. Quelles sont les
conditions expérimentales qui influencent le détachement d'électron et de quelles manières
font elles varier son intensité?
55
Pour répondre à ces questions nous avons choisi d'étudier l'influence de la puissance du
laser, des acides aminés présents dans les séquences peptidiques et de la longueur d'onde du
laser sur l'efficacité de photodétachement d'électron d'un échantillon de peptides.
¾ Influence de la puissance du laser
Nous avons regardé l'influence de la puissance du laser sur l'efficacité de détachement
d'électron. Pour cela, on peut soit varier directement la puissance du laser à nombre
d'impulsions constantes (Figure 2-2), soit varier le nombre d'impulsion laser arrivant dans le
piège, en variant le temps d'irradiation (Figure 2-3).
Variation de la puissance du laser à nombre d'impulsions constantes
L'efficacité de détachement d'électron en fonction de la puissance du laser est tracée sur
la Figure 2-2 pour le peptide angiotensine (DRVYVHPF, peptide P8 dans le Tableau 2-3).
efficacité de détachement d'électron
(unité arbitraire)
Ce spectre est obtenu à 260 nm avec un temps d'irradiation de 500 ms soit 10 coups laser.
0.3
0.2
0.1
0.0
0
50
100
150
200
250
300
puissance du laser (PW)
Figure 2-2. Efficacité de détachement d'électron (Iphotodétaché / Iparent) en fonction de la
puissance laser pour le peptide angiotensine à 260 nm
L'efficacité de détachement d'électron évolue linéairement lorsque la puissance du laser
augmente (dans la limite des faibles puissances lasers), le processus de photodétachement
d'électron est donc un processus à un photon. Un processus multiphotonique conduirait à une
croissance non linéaire du taux de photodétachement en fonction de la puissance laser [8]. La
linéarité au photodétachement a été vérifiée pour l'ensemble des peptides et protéines étudiés
durant ma thèse.
56
Variation du temps d'irradiation
L'efficacité de détachement d'électron est maintenant tracée en fonction du temps
d'irradiation du laser, c'est-à-dire en fonction du nombre de coups laser, ici entre 1 et 20. Cette
expérience est menée à 220 nm (8.5 mW) et 260 nm (11.5 mW) sur trois peptides :
DYKDDDDK, angiotensine et oxytocine respectivement nommés P7, P8 et P10 dans le
Tableau 2-3.
a)
(unité arbitraire)
(unité arbitraire)
b)
P7: DYKDDDDK
P8: angiotensine
P10: oxytocine
0.5
0.0
0
5
10
15
P7: DYKDDDDK
P8: angiotensine
P10: oxytocine
1.0
0.5
0.0
20
0
nombre
de coups
laserlaser
nombre
de coup
5
10
15
20
nombre
de de
coup
laserlaser
nombre
coups
Figure 2-3. Efficacité de détachement d'électron (Iphotodétaché / Iparent) en fonction du nombre
d'impulsions laser pour P7, P8, P10 à 220 nm (a) et à 260 nm (b), les peptides sont définis
dans le tableau de la page suivante
Cette expérience est en faveur d'un processus de photodétachement d'électron à un
photon. Durant le temps passé par les peptides dans le piège entre deux impulsions lasers, il
peut y avoir de la désexcitation par relaxation lumineuse (fluorescence) ou par collision avec
l'hélium. Ce résultat montre aussi que les processus induits par des impulsions successives
sont indépendants. Par la suite, afin d'augmenter le taux de fragmentation, nous allons
travailler avec des impulsions successives plutôt qu'avec une seule impulsion.
¾ Influence de la séquence peptidique à 260 et 220 nm
Echantillon de peptide
Pour faire cette étude, nous avons pris un ensemble de peptides contenant de 5 à 15
acides aminés. Ceux-ci sont listés dans le tableau ci-dessous. Certains de ces peptides comme
P1, P2, P3 (cf. Tableau 2-3) ne contiennent pas d'acides aminés chromophores, les autres en
contiennent de 1 à 4 (P13). Notons que les deux cystéines de l'oxytocine (P10) forment un
pont disulfure.
57
notation
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
Séquence
SDRGDGG
RRRADDSDDDDD
RGDSPASSKP
EGVNDNEEGFFSAR
RPPGFSPFR
RPKPQQFFGLM-NH2
DYKDDDDK
DRVYVHPF
pyro-ELYENKPRRPYIL (q = pyro)
CYIQNCPLG-NH2
P10
Boc-b-AWMDF-NH2
WYGGWYGGWY
formyl-VGALAVVVWLWLWLW-ethanolamine
(u = formyl et v = ethanolamine)
P11
P12
P13
Nom
Taxinomie
fibrinopeptide B
humain
substance P
angiotensine II [val5]
neurotensin
humain
oxytocine
pentagastrine
gramicidine A
Bacillis
brevis
Tableau 2-3. Séquence des peptides étudiés
Principe de l'étude
Dans ce paragraphe, nous allons comparer l'absorption d'un photon en phase gazeuse et le
photodétachement d'électron pour la série de peptide du Tableau 2-3 à 220 et 260 nm. Nous
allons observer comment la séquence peptidique influence l'efficacité de photodétachement
d'électron.
Le photodétachement d'électron, qui correspond ici au taux de fragmentation, est défini à
une longueur d'onde donnée (cf. Chapitre 1) comme étant :
EPD
avec
¦I
fragments
ª I parent ¦ I fragments º
ln «
»
I parent
¬«
¼»
[2-1]
correspondant à la somme de tous les fragments visibles sur le spectre
MS2, cf. Figure 2-1b. En phase gazeuse, le détachement d'électron fait suite à l'absorption
i
, le coefficient
d'un photon par le peptide. Cette absorbance peut être approchée par H Opeptide
d'extinction du peptide à la longueur d'onde Ȝi.
A 260 nm, l'absorption optique d'un peptide est donnée principalement par l'absorption
des acides aminés aromatiques et le coefficient d'extinction du peptide peut être approximé
par :
260 nm
H peptide
Trp , Tyr , Phe
260 nm
i
i
¦H
58
[2-2]
Sur la Figure 2-4, le taux de photodétachement d'électron (EPD) est comparé avec les
260 nm
(listées dans le Tableau 2-2). Dans
propriétés d'absorbance estimées des peptides H peptide
l'ensemble, un bon accord est observé entre les deux (excepté pour l'oxytocine P10). Les
peptides sans chromophore ne détachent pas ou presque pas et lorsque le nombre de
0.8
Absorbance
(Unité
arb.)
Absorbance
1-expV
(arb.
I) Unit)
abs
Taux
EPD EPD
yield
0.6
absorbance
0.4
0.2
0.0
R
R SD
R
AD RG
D DG
S
EG RG DD G
D
VN S DD
D PA D
N
EE SS
G KP
R FF
PP S
R
PK GF AR
P Q SP
Q FR
F
DY FG
KD L M
D
qL DR DD
YE VY K
V
N
KP HP
F
R
R
C
YI PY
Q
uv N IL
uV
W CP
W
G
AL YG MD LG
AV G F-N
VV W Y H
W GG 2
LW W
LW Y
LW
v
Photodetachment
Yield (Unité
(arb. unit)
Taux de
photodétachement
arb.)
chromophores augmente, l'efficacité de photodétachement aussi.
Figure 2-4. Comparaison du taux de photodétachement (colonne) avec l'absorbance (Ŷ)
donnée par la formule [2-2] pour les treizes peptides à 260 nm
Le pont disulfure entre les deux cystéines de l'oxytocine a une absorption non négligeable
à 260 nm [2] qui n'est pas prise en compte dans l'équation précédente et qui pourrait expliquer
en partie le fort désaccord entre l'absorbance et l'EPD.
A 220 nm, l'absorption optique des peptides est due aux transitions ʌ-ʌ* des acides
aminés aromatiques (comme observé précédemment) mais aussi aux transitions n-ʌ* et ʌ-ʌ*
du squelette peptidique :
220 nm
H peptide
220 nm
nH liaison
peptidique où n est le nombre de liaison peptidique.
59
Trp , Tyr , Phe
220 nm
i
i
¦H
[2-3]
Sur la Figure 2-5, le taux de photodétachement EPD est comparé avec les propriétés
220 nm
(listés dans le Tableau 2-2). A cette longueur
d'absorption estimées des peptides H peptide
absorbance
Absorbance
Absorbance
(Unité
(arb.IUnit)
1-expV
)arb.)
abs
Taux
EPD EPD
yield
SD
uv RG
W
D
M G
G
D
F
D
R -NH
VY 2
V
D
YK HP
R DD F
PP D
R GF DK
G
W DS SP
YG P FR
G ASS
W
Y KP
C GG
Y
R
PK IQN W Y
C
P
R
R QQ PL
R
AD FF G
qL D G
L
Y S
uV EG EN DD M
G VN KP DD
AL D
D
AV NE RR
P
E
VV
G Y
W FF IL
LW S
A
LW R
LW
v
Taux de
photodétachement
arb.)
Photodetachment
Yield (Unité
(arb. unit)
d'onde, nous n'observons pas de relation directe entre l'EPD et l'absorbance.
Figure 2-5. Comparaison du taux de photodétachement (colonne) avec l'absorbance (Ŷ)
donnée par la formule [2-3] pour les treizes peptides à 220 nm
Plusieurs facteurs peuvent expliquer ce désaccord entre les courbes. Ce désaccord peut
être dû soit à la mauvaise estimation de l'absorbance des peptides et/ou soit à la différence
entre l'absorbance et le photodétachement d'électron autour de 220 nm. Un premier point est
que le coefficient d'extinction dépend fortement des structures secondaires en solution [9].
Cette fluctuation n'a pas été prise en compte dans la relation de l'estimation de l'absorbance.
Un deuxième point est que les courbes d'absorbance en solution et de photodétachement en
phase gazeuse sont légèrement décalées (cf. Figure 2-6) et à 220 nm un petit décalage peut
entraîner une forte variation de l'absorption. Enfin à haute énergie (220 nm), comme on le
verra dans ce chapitre, il existe une ionisation directe qui n'a aucun lien avec le coefficient
d'absorption du peptide.
En résumé, à 260 nm, la présence d'acides aminés aromatiques dans la séquence
peptidique influence l'efficacité de photodétachement d'électron : le taux de photodétachement
suit l'efficacité d'absorption donnée par les coefficients d'extinction (déduits des données en
60
solution). Le photodétachement est dû aux excitations ʌ-ʌ* des acides aminés aromatiques.
Tandis qu'à 220 nm, l'efficacité de photodétachement d'électron l'influence ne dépend pas des
seuls acides aminés présents dans la séquence peptidique.
¾ Influence de la longueur d'onde du laser
Comparaison avec l'absorbance en solution
Dans un troisième temps, nous avons regardé l'influence de la longueur d'onde du laser
entre 220 et 320 nm. Sur la figure ci-dessous, sont représentés le détachement d'électron de
trois peptides (P13, P7 et P2) à différentes longueurs d'onde (Ŷ et traits pointillés) mais aussi
l'absorbance en solution de ces trois peptides en traits pleins. On remarque que ces deux types
de courbe ont des comportements similaires pour les trois peptides. Le léger décalage observé
entre les deux courbes est dû à l'environnement différent des peptides en phase gazeuse et en
0.8
P13
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
220
240
260
280
300
O (nm) (nm)
Wawelength
320
1.0
0.0
340
1.0
DYKDDDDK
0.8
0.8
P7
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
c)
1.0
1.0
0.8
RRRADDSDDDDD
0.8
0.6
P2
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
Absorbance
1.0
Electron
detachement
yield
Taux
de détachement
d’électron
gramicidin
absorbance
1.0
Absorbance
b)
detachement
yield
Taux Electron
de détachement
d’électron
a)
Taux
de détachement
d’électron
Electron
detachement
yield
solution (solvatochromisme).
0.0
220
240
260
280
300
320
340
Wawelength
(nm)
O (nm)
0.0
220
240
260
280
300
320
Wawelength
O (nm) (nm)
Figure 2-6. Taux de détachement d'électron en fonction de la longueur d'onde en phase
gazeuse (Ŷ) pour les peptides doublement déprotonés P13 (a), P7 (b) et P2 (c) avec un temps
d'irradiation de 500 ms. L'absorption en solution de ces peptides est représentée en ligne
pleine. L'absorbance et le taux de détachement d'électron sont en unités arbitraires sur les 3
graphiques
61
Importance des acides aminés aromatiques
Pour les trois peptides, le détachement d'électron varie de manière importante selon la
longueur d'onde. Lorsque le peptide contient des acides aminés aromatiques, l'efficacité de
détachement d'électron est importante dans la région 260 - 310 nm (P7 et P13). Lorsque le
peptide ne contient aucun acide aminé aromatique, il n'y a pas d'absorbance dans cette région
(P2). On peut en déduire que, de la même manière qu'en solution, cette zone correspond aux
transitions ʌ-ʌ* des acides aminés aromatiques [1].
Le peptide P2 ne contient pas d'acide aminé aromatique et pourtant on observe sur la
Figure 2-6c, un fort taux de détachement d'électron pour les longueurs d'onde inférieure à
240 nm. Le détachement dans cette zone est d'ailleurs intense pour les trois peptides. Le
détachement d'électron correspond ici entre autres aux transitions n-ʌ* et ʌ-ʌ* du squelette
peptidique [9].
Les résultats obtenus dans cette partie ont permis de comprendre les paramètres auxquels
le détachement d'électron était sensible. En particulier la présence d'acides aminés
aromatiques dans la séquence peptidique et la caractéristique monophotonique du
détachement. Dans la partie suivante, nous allons utiliser ces résultats pour élucider le
mécanisme du photodétachement d'électron.
2.1.3 Mécanismes du photodétachement d'électron
¾ 1er étape excitation électronique résonnante du chromophore
Nous avons vu précédemment que l'on peut corréler les spectres de détachement en phase
gazeuse avec ceux de l'absorption en solution (cf. Figure 2-6). Les bandes observées en
absorption en solution correspondent aux transitions ʌʌ* des cycles aromatiques et cela
suggère que celles observées en phase gazeuse correspondent aux mêmes excitations. Le
mécanisme du photodétachement d'électron passe par une première étape impliquant une
excitation électronique résonnante (1) sur la Figure 2-7 et où :
hQ
EA EX
[2-4]
avec EA, l'énergie de l'état électronique A et EX, l'énergie de l'état fondamental X.
Si le détachement était un processus direct (2), il n'y aurait pas de passage par des états
électroniques excités et le taux de photodétachement d'électron ne ferait qu'augmenter lorsque
62
la quantité d'énergie fournie au système augmente (cf insert de la Figure 2-7). En effet,
l'augmentation de l'énergie du laser induit une augmentation du nombre de transitions
possibles et l'énergie en excès peut toujours être emportée par l'électron (Ecinétique de l'électron).
Cependant, le fait qu'une partie de l'excitation se dissipe par un mécanisme d'éjection direct
n'est pas à exclure (surtout à haute énergie).
1 Excitation vers états électroniques excités
Taux de
détachement
B
A
Energie
Taux de
détachement
2 Excitation directe vers le continuum
États
électroniques
excités
Energie
1
[M-2H]2-*
continuum [M-2H] -ƒ + e1
2
État
fondamental
X
[M-2H]2-
Figure 2-7. Transitions possibles des électrons dans un dianion lors de l'excitation : (1)
détachement par excitation résonnante de l'ion précurseur, (2) détachement par ionisation de
l'ion précurseur (transition vers le continuum de l'ion [M-2H]-ƒ+e¾ 2eme étape croisement d'un état autoionisant et détachement d'un électron
Lorsque le système a atteint un des états électroniques excités, plusieurs voies de
désexcitation sont possibles : la fluorescence (processus radiatif), la conversion interne (non
radiative) ou le croisement avec des états dissociatifs (processus non radiatif) (cf. Figure 2-8).
Lors de la fluorescence (a), les molécules réémettent un photon pour redescendre à l'état
fondamental. Ce mode de désexcitation n'est pas quantifiable avec notre montage.
Lorsque des molécules sont dans l'état électronique excité, leurs électrons ont cependant
une probabilité forte de subir une réorganisation conduisant à une conversion interne en un
autre état si celui-ci croise le premier : cette conversion interne se produit spontanément au
point d'intersection de deux états (intersection conique). Si le deuxième état est un état
63
dissociatif (b), (c) alors il y a rupture de la liaison, sauf si cet état dissociatif recroise l'état
fondamental. On parlera ici d'intersection conique entre l'état dissociatif et l'état fondamental.
Il y a conversion interne de l'énergie électronique en énergie vibrationnelle (e). Cette énergie
peut ensuite être redistribuée sur les 3n-6 modes de vibration (n=nombre d'atomes) de l'état
fondamental (IVR : intramolecular vibrational relaxation) et peut donner lieu à diverses voies
de fragmentation. Les temps caractéristiques associés à cette dissociation statistique
dépendant de la taille des peptides et peuvent être long (> 100 ms).
B
1 Excitation vers états électroniques excités
a Fluorescence
A
b État dissociatif croisant l’état fondamental
États
électroniques
excités
c État dissociatif
d État autoionisant
[M-2H]2-*
c
e Conversion interne et IVR dans l’état
fondamental
d
a
continuum
b
[M-2H] -ƒ +e-
1
État
fondamental
X
e
[M-2H]2-
Figure 2-8. Les différentes voies de désexcitation possible
Dans le cas (c), il y a une fragmentation directe à partir de l'état excité, ce mode de
désexcitation est parfois observé avec notre montage en mode négatif et en mode positif. Par
exemple, en mode positif, on observe des pertes d'hydrogène et de chaîne latérales [10].
64
Dans le cas (d), il y a détachement d'un électron, l'état électronique excité croise un état
autoionisant qui va vers le continuum constitué de l'ion [M-2H]-ƒ et d'un électron. Le
continuum correspond à une infinité d'états où l'électron n'est pas lié. L'énergie est égale à :
hQ
E[ M 2 H ]x E X E Cinétique
[2-5]
de l 'électron
avec E[M-2H]-ƒ, l'énergie de l'ion produit (énergie électronique + énergie vibrationnelle).
L'énergie cinétique de l'électron peut prendre toutes les valeurs entre 0 et hQ E[ M 2 H ]x E X
cela signifie que l'excès d'énergie est laissé dans l'énergie cinétique de l'électron.
Il faut au minimum pour que ce processus ait lieu que hȞ > BE où BE est l'énergie de
liaison de l'électron le moins lié sur [M-2H]2-. Il faut remarquer que pour les anions, cet état
du continuum est beaucoup plus bas en énergie donc beaucoup plus favorable que pour une
molécule protonée ou neutre (cf. Figure 2-9). En effet, généralement pour les peptides,
l'énergie de liaison d'un système chargé négativement est très inférieure au potentiel
d'ionisation (IP) (énergie qu'il convient de fournir à un peptide pour lui arracher un électron).
Anions
Neutre (et Cations)
2
[M-2H]2-*
[M-2H] -ƒ + e-
2
continuum
1
1’
X
1
X
[M-2H]2-
[M]*
A
BE :
-énergie de liaison
A
IP : potentiel d’ionisation
[M]+ + e-
[M]
Figure 2-9. Comparaison de l'énergie à fournir pour atteindre le continuum dans le cas de
molécules anioniques et neutres
65
¾ Estimation de l'énergie minimum à fournir au peptide pour observer de l'EPD
Dans le cas d'un monoanion, l'énergie nécessaire pour détacher un électron est l'énergie
de liaison de l'électron (BE), comme indiqué dans le schéma ci-dessous :
M
BE
M-
Figure 2-10. L'énergie nécessaire pour détacher un électron d'un monoanion est l'énergie de
liaison de l'électron (BE)
Dans le cas d'un multianion, il existe une interaction répulsive entre l'électron (e-) émis et
l'ion fils ([M-nH](n-1)-) comme montré dans le schéma ci-dessous :
RCB
M(n-1)BE
Mnd (Mn-1, e-)
Figure 2-11. L'énergie nécessaire pour détacher un électron d'un multianion correspond à la
somme de l'énergie de liaison de l'électron (BE) et de la barrière de répulsion coulombienne
(RCB)
Cette interaction à longue distance (égale à e2/r) crée une barrière à l'émission d'un
électron [11]. Cette barrière est appelée barrière de répulsion coulombienne (Repulsive
coulomb Barrier, RCB). Si l'on néglige le passage par effet tunnel à travers cette barrière,
l'énergie nécessaire pour détacher un électron d'un multianion est :
E
BE RCB
[2-6]
Dans les paragraphes suivants, nous allons estimer la quantité minimum d'énergie à
fournir à un polypeptide pour observer le détachement d'électron. Pour cela, il suffit de
déterminer l'énergie minimum que doit apporter le laser dans l'étape (1), celle de l'excitation
66
électronique du chromophore. Cette énergie doit être supérieure à la somme de l'énergie de
liaison de l'électron (BE) et de la barrière de Coulomb (RCB) qui résulte de la répulsion entre
les charges, Figure 2-12. Nous allons donc dans ce paragraphe essayer d'estimer la somme de
ces deux paramètres. Dans le cas des dianions, lorsqu'il y a éjection d'un électron, l'énergie de
liaison de l'électron est aussi appelée seconde affinité électronique (EA2).
B
2
A
RCB
1
[M-2H]-ƒ + e-
hȞ
BE2
X
[M-2H]2-
Figure 2-12. Résumé du mécanisme de photodétachement d'électron (étapes (1) et (2)) et
estimation de l'énergie à fournir pour détacher un électron (BE+RCB)
Dans les peptides anioniques, les charges négatives sont localisées sur les sites ayant le
pKa le plus faible, cf. Tableau 2-1. Leur positionnement sur les groupements carboxylates (COO-) du C-terminal et des chaînes latérales des acides aspartiques et glutamiques est donc
favorisé. Avant d'estimer la somme de l'énergie de liaison et de la barrière de Coulomb dans
les peptides, nous allons d'abord introduire ces concepts sur des carboxylates dans des chaînes
carbonées.
Energie de liaison (BE1) pour un carboxylate mono chargé
L'énergie de liaison de l'électron sur un groupement carboxylique a été mesurée par
spectroscopie de photoélectron par Wang et ses collaborateurs [12]. Cette énergie de liaison
sur le monoanion CH 3 COO est évaluée à 3.49 eV. L'énergie de liaison de l'électron ou
affinité électronique a aussi été mesurée sur HCOO par Neumark et ses collaborateurs [13]
par spectroscopie de photoélectron, la valeur obtenue est de 3.498 ± 0.015 eV.
67
Energie de liaison BE2 pour un carboxylate dichargé
L'énergie de liaison de l'électron du site anionique du carboxylate est modifiée d'une
manière prédictible par la présence du second électron (anions multichargés). Pour le dianion
OOC (CH 2 )10 COO , Wang et ses collaborateurs ont mesuré une énergie de liaison de
l'électron (BE2) de 2.1 eV [12] (cf. Figure 2-13b), ce qui est beaucoup moins important que la
valeur obtenue pour CH 3 COO .
Origine de la différence de stabilité entre le mono et le dicarboxylate
Pour comprendre l'origine du changement dans la stabilité électronique entre le
monoanion et le dianion, nous allons utiliser un modèle simple de charges localisées [14].
Pour le monoanion, l'état fondamental est un état lié d'une profondeur de 3.49 eV en dessous
de CH 3 COO x e . Ce potentiel reflète ce qui est appelé l'énergie "intrinsèque" de liaison
de l'électron au groupement COOƒ.
a)
b)
RCB1
BE1 = 3.49 eV
3.49eV
CH 3 COO x +e-
r
OOC (CH 2 )10 COO x +e-
BE2 = 2.1 eV
CH 3 COO r
OOC (CH 2 )10 COO Figure 2-13. Potentiel de liaison de l'électron pour un monoanion (a) et un dianion (b) entre
la molécule et l'électron, r étant la distance entre les deux
Par opposition, le potentiel associé avec le dianion OOC (CH 2 )10 COO provient de
deux contributions, l'une attractive, l'affinité électronique de l'électron, exactement comme
dans le monoanion, et l'autre purement répulsive provenant de la répulsion coulombienne
causée par le second site chargé négativement dans le dianion. La combinaison de ces deux
parties produit un potentiel total de la forme montrée dans la Figure 2-13b.
Il est important de voir que la répulsion coulombienne exercée par le second site négatif a
deux effets :
68
- l'énergie de liaison de l'électron dans le dianion OOC (CH 2 )10 COO va diminuer
par rapport à CH 3 COO . Cela est dû à la répulsion qui existe entre les deux charges qui va
favoriser le départ de l'électron. Cette énergie du dianion va être diminuée par rapport au
monoanion d'une valeur qui peut être estimée en terme de distance entre les deux sites
anioniques (r):
e2 r
(qq' eV ) * 1 4SH 0 [r (Å)]
(14.4 eV ) [r (Å)]
[2-7]
- mais la répulsion coulombienne entre les deux charges produit aussi une barrière au
départ de l'électron dont la hauteur est en première approximation d'exactement cette même
valeur e 2 r .
Dans le cas de OOC (CH 2 ) 10 COO , cela signifie que même si ce dianion a une
énergie de liaison inférieure à celle du monoanion, il doit quand même recevoir le même
apport d'énergie pour détacher un électron (cf. Figure 2-14), en d'autres termes,
RCB1 BE 2 .
BE1
Influence de la distance entre les deux sites négativement chargés (Wang et ses
collaborateurs [12,15,16])
Ces auteurs ont aussi obtenu des spectres de spectroscopie de photoélectron sur des
dicarboxylates de type : OOC (CH 2 ) n COO avec n= 3-10. Et ils ont remarqué que
RCB1 BE 2
cste quelle que soit la longueur de la chaîne carbonée entre les deux
groupements carboxyliques. Ils ont aussi remarqué que RCB1 BE 2
cste était proche de
l'énergie de liaison de CH 3 COO , soit ~3.5 eV. Ces résultats vérifient l'équation [2-5] et
valident donc les approximations ci-dessus.
Influence du nombre de sites négativement chargés sur la hauteur de la barrière
Plus généralement, il est admis que l'énergie de liaison de l'électron va être réduit
x
de ¦
i 2
e2
, x correspondant au nombre de charges de la molécule [14,15,17]. Par exemple, sur
ri ,1
la Figure 2-14, on observe que l'énergie de liaison de l'électron à la molécule diminue lorsque
le nombre de charges de la molécule augmente :
BE1 ! BE 2 ! BE 3
[2-8]
Mais dans un même temps, la barrière coulombienne (RCB) va augmenter quand le
nombre de charges présentes sur la molécule augmente, cette augmentation va être égale
69
e2
à¦
. La RCB varie donc dans le sens opposé à BE, on observe sur la Figure 2-14 que
i 2 ri ,1
x
RCB1<RCB2. L'énergie à fournir pour détacher un électron est en première approximation la
même pour les trois systèmes de la Figure 2-14. Il est également possible de trouver des
systèmes pour lesquels RCBn ! BE1 , dans ce cas BE n 0 [18], c'est-à-dire que l'énergie de
liaison des polyanions devient négative et que ces polyanions sont métastables.
a)
b)
c)
[M-H]ƒ + eRCB1
RCB2
BE1
[M-2H]-ƒ +
BECOO-~3.5eV
e-
BE2
BE3
[M-H]-
[M-2H]2-
[M-3H]3r/2
r
-
[M-3H]2-ƒ + e-
r/2
-
-
-
-
RCB1 § e2/r
RCB2 § e2/r/2 + e2/r
BE2 § 3.5 - e2/r
BE2 § 3.5 - 2e2/r - e2/r
Figure 2-14. Diagramme d'énergie dans le cas d'un peptide monoanionique (a), dianionique
(b), trianionique (c) [19]
Extrapolation de ces résultats à des peptides
Pour détacher un électron d'un peptide déprotoné en C-terminal ou sur un groupe
carboxylate (Asp, Glu), l'énergie à fournir sera en première approximation la même que pour
décrocher un électron d'un carboxylate d'une chaîne carbonée et ne dépendra pas du nombre
de charge sur la molécule puisque la somme de RCB et de BE sera toujours environ
équivalente à l'énergie de liaison de l'électron sur le monoanion. Finalement l'énergie
nécessaire pour détacher un électron d'un carboxylate sera donnée par BE + RCB § 3.5 eV.
70
¾ Estimation de BE et RCB
Pour obtenir une estimation énergétique de BE et de RCB, des calculs de dynamique
moléculaire (RCB) et de chimie quantique (BE) ont été réalisés par l'équipe.
Simulation de dynamique moléculaire
Ces calculs vont permettre d'estimer la distance entre les charges mais aussi les
interactions de Coulomb entre les deux charges. Ils ont été effectués avec le programme
DYNAMICS du logiciel TINKER en utilisant le champ de force Amber avec parm99 [20] et
la méthode Berendsen de faible couplage [21].
Ils ont été réalisés entre autres sur le peptide P1 S D RGDGG . Les charges négatives
ont été localisées sur le peptide sur les groupes carboxyles du C-terminal et de Asp2 (selon les
valeurs des pKa, cf.Tableau 2-1). Ces simulations ont été réalisées avec différentes structures
étendues initiales qui conduisent toutes à des résultats sensiblement similaires.
Les simulations sont effectuées dans le vide avec une constante diélectrique de 2 [22] et
une température de 350 K. Les structures initiales sont soumises à une courte minimisation
pour enlever les contacts stériques incorrects et sont ensuite thermalisées pendant 50 ps. La
durée de la simulation est de 1500 ps par pas de 1 fs. L'énergie de répulsion coulombienne
( e 2 r ) est enregistrée tous les 0.1 ps (100 pas). Un histogramme des valeurs de répulsion de
Coulomb entre les charges prises par le système au cours de la simulation est obtenu.
Estimation de RCB
On observe sur la Figure 2-15, que l'exploration conformationelle du peptide à 300 K
donne lieu à une fluctuation étendue de RCB. On observe que la distribution de l'énergie de
répulsion coulombienne est comprise entre 1.0 et 2.2 eV avec un maximum à environ 1.8 eV
pour ce peptide. Cette fluctuation de la distribution de l'énergie résulte du changement de la
distance entre les deux sites porteurs des charges provenant des changements de
conformation.
71
peptide P1
nombre de coups
500
250
0
1
2
Energie (eV)
3
Figure 2-15. Distribution de l'énergie de répulsion coulombienne entre les deux sites
déprotonés pour le peptide P1 (SDRGDGG)
Estimation énergétique de BE
Ces fluctuations de RCB suggèrent que l'énergie de liaison dépend de la conformation du
peptide puisque
BE1 | RCB BE 2
BE1 RCBmax BE 2 BE1 RCBmin
3.5 2.2 BE 2 3.5 1.0
[2-9]
1.3 BE 2 2.5
On peut aussi remarquer que la probabilité pour que l'énergie de la barrière coulombienne
soit au dessus de 3.5 eV (énergie de liaison du monoanion) est très faible :
BE1 | RCB BE 2 BE 2 | BE1 RCBmax | 3.5 2.2 ! 0
[2-10]
Ce qui signifie que les peptides dichargés possèdent une énergie de liaison positive et
sont donc stables.
Effet tunnel
L'excitation UV dans la gamme 220 - 330 nm correspond à une gamme d'énergie de 3.76-
5.64 eV. Cette gamme est au dessus de BE2 + RCB :
[3.76 5.64] eV t RCB BE 2 | BE1 | 3.5 eV
[2-11]
Donc le détachement d'électron ne devrait pas impliquer de passage par effet tunnel à
travers la RCB et les fluctuations de conformation devraient avoir une faible influence sur le
72
détachement d'électron. Il faut cependant rester prudent sur cette conclusion puisque le
détachement d'électron dans les peptides se fait suite à une redescente en énergie dans les états
autoionisants. L'énergie dans ces états ionisants est inférieure à celle du laser et l'on pourrait
avoir dans certains cas ionisation par effet tunnel à travers la barrière de répulsion
coulombienne.
Conclusion
Nous avons vu dans cette partie que le photodétachement d'un électron d'un peptide est
un processus qui dépend de la puissance du laser, de la longueur d'onde du laser mais aussi de
la séquence peptidique [23]. Ce processus est monophotonique et résulte de deux étapes : la
première est l'excitation électronique résonnante du chromophore et la seconde est le
croisement de l'état électronique excité avec un état ionisant suivi du détachement d'un
électron. Nous avons aussi pu estimer la valeur de liaison de cet électron au peptide ainsi que
les barrières coulombiennes correspondantes. Ces résultats ont été obtenus à partir de données
d'autres groupes qui ont réalisé des expériences de spectroscopie de photoélectron sur des
chaînes aliphatiques.
Obtenir des valeurs de BE et RCB directement sur un peptide chargé négativement
pourrait confirmer ces approximations et donner des informations sur sa stabilité. Nous avons
pu faire de la spectroscopie de photoélectron sur un peptide entier dans le groupe du Pr. M.
Kappes à Karlsruhe et obtenir des valeurs de BE et RCB directement à partir des énergies
cinétiques des électrons d'un peptide. Ces expériences font l'objet de la partie suivante.
73
2.2 Spectroscopie de photoélectron
Dans cette partie, nous présenterons les expériences de spectroscopie de photoélectron.
Elles ont été conduites à Karlsruhe en collaboration avec l'équipe du Pr. M. Kappes, plus
étroitement avec Katerina Matheis et Oli Ehrler. Ces expériences ont été réalisées sur un
peptide : la gramicidine A.
Dans une première partie, nous décrirons le montage expérimental. Dans une deuxième,
nous montrerons les spectres de photoélectron obtenus. Ces spectres nous permettront
d'obtenir des informations sur les valeurs de l'affinité électronique de l'électron et la barrière
coulombienne. Nous verrons que la forme des courbes nous renseignera également sur le
processus d'émission de l'électron. Enfin dans la troisième partie, nous comparerons les
valeurs expérimentales de l'énergie de détachement d'électron avec celles obtenues à l'aide de
calculs théoriques. Dans ce dernier paragraphe, nous examinerons aussi la position des
charges sur le peptide, ce qui permettra ensuite d'estimer la distance entre les charges en phase
gazeuse.
2.2.1 Montage expérimental
On peut décomposer l'expérience de spectroscopie de photoélectron couplée à une source
d'ionisation en trois parties [24]:
- une source electrospray et un spectromètre de masse pour produire les ions et mesurer
leur masse,
- un laser produisant différentes longueurs d'ondes pour irradier les ions et détacher les
électrons,
- une bouteille magnétique pour collecter les électrons et mesurer leur énergie cinétique.
Nous allons voir ces différentes composantes les une après les autres.
¾ Spectromètre de masse
Tout d’abord, la gramicidine est dissoute à une concentration de 250 µM dans un
mélange eau / méthanol 20/80 auquel a été ajouté 0.1 M de KOH. Cette solution est ensuite
introduite à l’aide d’une seringue de débit d'environ 2 µL/mn dans la source electrospray
(Analytica of Branford). Les paramètres de la source sont réglés de manière à obtenir des
anions multichargés, un flux de gaz séchant (N2) à une température de 100°C permet
74
d'améliorer l'évaporation des solvants. Puis, ces anions sont transmis à travers un funnel d'ions
électrodynamiques [25] afin d'être refocalisés et sont ensuite accumulés dans un piège à ions
hexapolaire pendant 33 ms (1/30 s). Les paquets d'ions formés dans le piège sont extraits et
focalisés dans la région d'injection de l'analyseur par un système de lentilles électrostatiques.
Cet analyseur pulsé est un temps de vol avec réflectron (RE-TOF) placé perpendiculairement
au système d'ionisation cf. Figure 2-16b.
Après le passage à travers le réflectron, les ions de masse sélectionnés sont décélérés
avant d'entrer dans la région perpendiculaire à la bouteille magnétique. Pour cela, les ions sont
d'abord accélérés dans le RE-TOF avec un potentiel de départ de 485 V dans un temps
approprié après l'extraction par impulsion du piège, puis décélérés à ~ 30 eV.
Détecteur de
photoélectrons
a)
Bobine magnétique
z
y
Tube en cuivre
drift tube
Avec un champ
magnétique
de guidage
Ions
Aimants en
SmCo
Optiques de
décélération
ions
hȞ
b)
x
acceleration
region
Détecteur
MCPMCP
hv
y
magnetic
(PES)
Bouteille bottle
magnétique
Optiques
ion opticsde
guidage d’ions
hexapole
trap
Piège
à ion ion
hexapolaire
ion funnel
Funnel
d’ions
reflectron
réflectron
Temps
de vol
flight tube
Source ESI
électrospray
Ion source
Figure 2-16. Schéma du spectromètre de photoélectron, vue selon l'axe yz (a) et selon l'axe xy
(b)
75
¾ Laser
Les ions décélérés sont irradiés avec les différentes harmoniques d'un laser Nd:YAG
(Spectra Physics, Quanta RAY series, LAB 150-30) cadencé à 30 Hz. Les énergies de ces
différentes harmoniques sont 3.49 eV pour la troisième (355 nm), 4.66 eV pour la quatrième
(266 nm) et 5.83 eV pour la cinquième (213 nm). La durée d'une impulsion laser est de 5-6 ns
avec une densité d'énergie de 30, 15 et 1 mJ/cm2 pour respectivement les énergies de photons
3.49, 4.66 et 5.83 eV.
¾ Bouteille magnétique
Les photoélectrons sont collectés avec une efficacité proche de 100% grâce à des miroirs
magnétiques appliquant un champ magnétique inhomogène. Ce champ permet de faire passer
les électrons selon leur énergie cinétique dans le drift tube de 1,68 m avec un guidage par un
faible champ magnétique. Les distributions des temps d'arrivée des électrons émis sont
mesurées sur un détecteur de galettes à microcanaux. Le temps d'arrivée est converti en
énergie cinétique afin d'obtenir la distribution d'énergie cinétique des électrons émis. La
résolution des mesures d'énergie cinétique est de 'E cin E cin 5% pour une énergie cinétique
de 1 eV. L'axe des énergies est calibré avec le spectre de photoélectron de I- à 355 et 266 nm.
b) 15 Hz on
ln (nombre d’électron)
ln (nombre d’électron)
a) 15 Hz off
KE
KE
Figure 2-17. Les mesures effectuées en spectroscopie de photoélectron sont la soustraction
du spectre off (a) au spectre on (b)
La distribution en énergie cinétique (KE) peut être transformée en distribution d'énergie
de liaison (BE) à partir de l'équation suivante :
hQ
BE KE
[2-12]
76
Les spectres sont accumulés pendant 105 impulsions car, comme on peut le voir sur la
Figure 2-17, les spectres obtenus en spectroscopie de photoélectron sont enregistrés en mode
cadencé on/off pour s'affranchir des électrons émis par des processus différents de celui de
détachement des peptides particulièrement important dans l'UV (hȞ > 4 eV). C'est en
soustrayant le spectre off (a) au spectre on (b) que ces spectres sont corrigés du bruit de fond
dû aux interactions laser/plaques, au vide résiduel, aux fenêtres, à l'ionisation multiphotonique
du gaz, du bruit électronique, etc. La plupart des électrons collectés font partie du bruit et l'on
remarque qu'un léger écart du nombre d'électrons détectés entre les spectres on et off va
entraîner une bande importante sur la partie gauche des spectres (électrons de faible énergie
cinétique).
¾ Echantillons
Nous avons voulu faire de la spectroscopie de photoélectron avec différents peptides et
protéines déjà testés avec notre montage à Lyon, mais la production d’anions multichargés
s’est révélée délicate avec la source electrospray Analytica of Branford. De plus, le
photodétachement d’électron à partir de peptides est faible et donne un signal très peu intense,
plus particulièrement avec les peptides dont le chromophore est la tyrosine.
Le choix le plus judicieux pour faire de la spectroscopie de photoélectron sur des peptides
[26] s’est révélé être celui de peptides contenant des tryptophanes. La gramicidine A chargée
deux fois (gramicidine 2-) et trois fois (gramicidine 3-) négativement, dont la séquence est la
suivante : formyl-VGALAVVVWLWLWLW-éthanolamine, a donc été choisie comme
peptide d'étude.
2.2.2 Informations obtenues à partir de spectre de PES
Les spectres de photoélectron ont été obtenus avec différentes longueurs d'onde : 355,
266 et 213 nm.
¾ Cas de la gramicidine 2-
Détermination de BE et RCB
Sur la Figure 2-18 sont représentés les spectres de photoélectron obtenus pour ces
différentes longueurs d'ondes pour la gramicidine 2-. Ces spectres sont tracés en fonction de
l'énergie de liaison de l'électron.
77
On peut remarquer sur les spectres à 355 nm (a) et 266 nm (b) la présence d'un pic à EBE
égale respectivement à 2.82 et à 4.04 eV. Sur le spectre à 213 nm (c), on observe une large
bande entre 4 et 5 eV. L'extrapolation linéaire de la pente gauche de ces pics permet d'estimer
Rendement de photoélectron (Unit. Arb.)
la valeur de la BE2 à 2.35 ± 0.15 eV pour la gramicidine 2-.
4000
a) 355 nm
BE2
2000
0
10000
b) 266 nm
5000
x 20
0
6000
4000
c) 213 nm
2000
x 20
0
0
1
2
3
EBE (eV)
4
5
6
Figure 2-18. Spectre de photoélectron de la gramicidine 2- en fonction de l'énergie de liaison
de l'électron à 355 (a), 266 (b), 213 (c) nm
On peut aussi regarder les spectres en fonction de l'énergie cinétique de l'électron (cf.
Figure 2-20).
Sur les spectres de PES tracés en fonction de l'énergie cinétique, les bandes observées
précédemment pour les longueurs d'onde 355 et 266 nm apparaissent maintenant presque à la
même position. Les extinctions de ces courbes aux basses énergies cinétiques (partie gauche
du spectre) sont donc indépendantes de l'énergie du photon utilisé pour extraire l'électron.
Contrairement au cas d'un monoanion, on ne détecte "pas" d'électron d'énergie cinétique nulle.
L'énergie minimum (~ 0.50 ± 0.15 eV) des électrons détectés est égale à la barrière de
78
répulsion coulombienne, cf. Figure 2-19. C'est l'énergie coulombienne regagnée par l'électron
lorsqu'il s'éloigne de l'ion produit.
RCB
KE minimum
M(n-1)-
hQ
BE
Mnd (Mn-1, e-)
Rendement
de photoélectron
Arb.)
Photoelectron
Yield /(Unit.
A.Units
Figure 2-19. L'énergie cinétique minimum des électrons est égale à la barrière de répulsion
coulombienne
RCB
a) hQ=3.49 eV
RCB
b) hQ=4.66 eV
RCB
0
c) hQ=5.83 eV
1
2
3
4
5
EKE / eV
Figure 2-20. Spectre de photoélectron de la gramicidine 2- en fonction de l'énergie cinétique
Cependant, pour pouvoir extraire des valeurs de ces spectres, il faut qu'ils soient
monophotoniques. Nous avons vérifié cela par des expériences en fonction de la puissance
79
laser à 266 et 355 nm (cf. Figure 2-21). On observe sur cette figure que le rendement de
photoélectron est linéaire en fonction de la puissance laser. Par conséquent, ce processus est
25000
20000
a) 266 nm
15000
10000
5000
0
0
50
100
150
200
250
Puissance laser (mW)
bien monophotonique.
12000
b) 355 nm
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
200
400
600
Puissance laser (mW)
Figure 2-21. Rendement de photoélectron en fonction de la puissance laser pour la
gramicidine 2- à 266 (a) et 355 (b) nm
Déduction à partir de la forme de la courbe du processus d'émission de l'électron
Pour la gramicidine 2-, on observe que la position des bandes n’est pas commune sur les
spectres de la Figure 2-18 c'est-à-dire lorsque le rendement de photoélectron est tracé en
fonction de l’énergie de liaison de l’électron (EBE). Ces observations laissent penser que ces
bandes peuvent difficilement être reliées à une transition donnée du système. Si ces bandes
correspondent à des transitions d'un état électronique A de l'ion précurseur vers un état
électronique A' de l'ion produit, elles devraient se trouver sur la même position quelle que soit
l'énergie du photon, cf. Figure 2-22 [11].
80
KE1
hȞ1
KE2
hȞ2
A’
[M-2H]-ƒ + e-
A’
[M-2H]-ƒ + e-
BEA ĺ A’
BEA ĺ A’
A
A
[M-2H]2-
[M-2H]2-
BEA ĺ A’ = hQ1 – KE1
= hQ2 – KE2
= hQ3 – KE3
=…
hȞ3
hȞ2
hȞ1
EBE
Figure 2-22.Les bandes correspondent à des transitions d'un état électronique A de l'ion
précurseur vers un état électronique A' de l'ion produit. Elles se trouvent toutes sur la même
position quelle que soit l'énergie du photon.
En revanche, lorsque l'on trace le rendement de photoélectron en fonction de l’énergie
cinétique de l’électron (EKE), les bandes apparaissent à la même énergie pour les spectres à
355 et 266 nm, (cf. Figure 2-20) à l'exception des spectres à 213 nm. La forme de ces bandes
avec une décroissance exponentielle aux hautes énergies cinétiques et l'observation de la
même bande à la même EKE pour différentes énergies de photon, suggèrent l'observation
d'émission retardée (ou émission thermoionique), bien que ce type d’émission n’ait jamais été
mesuré sur des polyanions. Ces observations d’émission retardée peuvent être reproduites à
partir de simulations faites à partir de la loi statistique de Weisskopf modifiée :
P (H )
A(H RCB )e
º
ª« H RCB k BT »¼
¬
[2-13]
A étant une constante. Cette loi statistique de Weisskopf modifiée est représentée par les
courbes en rouge sur les spectres de la Figure 2-20 [27]. Ces simulations reproduisent
parfaitement les spectres obtenus à 266 et 355 nm.
81
Sur le spectre à 213 nm de la Figure 2-20, la forme de la bande ainsi que les structures
observées sur cette bande montrent que l'émission retardée n'est pas le seul mécanisme
responsable de l'émission d'électron. D'ailleurs, la loi de Weisskopf ne peut pas reproduire la
forme du spectre observé. A cette haute énergie du photon, la multitude d’états excités sur le
monoanion devient accessible, augmentant la section efficace du détachement direct. Nous
pensons donc que, à cette énergie de photon, il y a compétition entre l'émission d'électron
résonnante et l'émission directe.
Nous avons donc montré que l'émission retardée était en compétition avec un processus
direct de détachement d'électron dans les polypeptides. Cette théorie est appuyée par le fait
que dans le cas des clusters de carbone négativement chargés, un spectre contenant un
mélange très similaire composé d'émission directe et retardée a déjà été observé [28]. La
compétition entre ces différents processus serait intéressante à explorer de manière à
approfondir la connaissance sur la dynamique de l'émission d'électron. La spectrométrie
d'imagerie résolue en temps devrait nous aider à démêler la part de chacun de ces
mécanismes. Une telle expérience couplée d'une source electrospray est en cours de test dans
notre laboratoire.
Correspondance entre les taux de photodétachement d'électron et de photoélectron
La Figure 2-23 compare les taux de détachement d'électron mesurés à Lyon à partir de la
mesure de l'intensité des ions produits et le taux de détachement mesuré à Karlsruhe à partir
de la mesure du nombre d'électrons émis. On vérifie ici que ces deux mesures
complémentaires sont en bon accord. En utilisant notre montage décrit dans le premier
chapitre (piège quadripolaire couplé à un laser accordable en longueur d'onde), nous avons
aussi enregistré le rendement de détachement total en fonction de la longueur d'onde entre 210
et 330 nm pour la gramicidine (comme expliqué dans la première partie de ce chapitre) (cf.
Figure 2-23). Comme nous l’avons vu précédemment dans le paragraphe 2.1.2, le
détachement d'électron est majoritairement un processus en deux étapes, le rendement de
détachement d'électron dépendant de l'absorption de l'ion précurseur. L'émission retardée
confirme ce processus en deux étapes. Notons que l’électron peut partir soit d'un état excité à
longue durée de vie [16] ou soit après conversion interne conduisant à l'émission dans l'état
fondamental [27]. Dans le deuxième cas, une partie de la quantité d'énergie est redistribuée
dans les degrés de liberté vibrationnels de la molécule. Mais cela peut aussi conduire à une
82
forte augmentation locale de la température qui est alors suivie partiellement par le
200
Rendement total de photoélectron
(Unit. Arb.)
Taux de photodetachement d'électron
(Unit. Arb.)
détachement d'un électron. Il est difficile de trancher entre ces deux mécanismes.
250
300
350
Longueur d'onde du laser (nm)
Figure 2-23. Spectre d’absorption en solution de la gramicidine (ligne noire), spectre du taux
de photodétachement d’électron en phase gazeuse pour la gramicidine 2- (ligne bleue) et
points à 213, 266 et 355 nm de rendement de photoélectron pour la gramicidine 2- (rond
rouge), le spectre de rendement de photoélectron a été mis à la même échelle à 260 nm que
celui du taux de photodétachement d'électron pour la gramicidine 2¾ Cas de la gramicidine 3Nous avons ensuite réalisé le même type d'expérience sur la gramicidine 3-, cf. Figure
2-24. Des spectres diffus mais structurés sont observés pour toutes les puissances lasers. BE3
pour la gramicidine 3- est trouvé approximativement à 1.45 ± 0.30 eV. Cette valeur est plus
faible que pour le dianion, ce qui est en accord avec la partie 2.1 de ce chapitre : lorsque le
nombre de charges augmente, l'énergie de liaison de l'électron diminue.
83
c)
213 nm
BE3
b)
266 nm
a)
355 nm
0
1
2
3
4
EBE (eV)
Figure 2-24. Spectre de photoélectron de la gramicidine 3- en fonction de l'énergie de liaison
Pour la gramicidine 3-, nous avons aussi tracé le rendement de photoélectron en fonction
de l'énergie cinétique Figure 2-25 : nous obtenons une valeur de RCB de 1.35 ± 0.30 eV.
Cette valeur est aussi en accord avec la partie 2.1.2. puisque RCBGramicidine 3 ! RCBGramicidine 2 .
Sur les différents spectres de la gramicidine 3-, on observe sur la gauche du spectre (tracé
en fonction de l’énergie cinétique, Figure 2-25) que la pente des bandes est moins raide que
pour la gramicidine 2-. Ces profils légèrement différents suggèrent un détachement d’électron
par passage par effet tunnel, un mécanisme multiphotonique ou le départ de l'électron de
différents sites. Les spectres mesurés en PES ne permettent pas d'aller plus loin dans
l'interprétation des processus.
84
c)
213 nm
RCB
0
1
2
b)
266 nm
a)
355 nm
3
4
EKE (eV)
Figure 2-25. Spectre de photoélectron de la gramicidine 3- en fonction de l'énergie cinétique
de l'électron à 532 (a), 355 (b), 266 (c), 213 (d) nm (avec les FIT?)
Si comme nous l'avons montré dans le paragraphe 2.1.3., les énergies des barrières à
franchir pour arracher un électron sont égales à l'énergie de liaison de l'électron du
monoanion, quelque soit le nombre de charges de l'anion de départ, le résultat suivant devrait
être vérifié :
BE 2 Gramicidine 2 RCBGramicidine 2 | BE3
2.35
0.5
|
|
2.85
Gramicidine 3
1.45
RCBGramicidine 3
1.35
[2-14]
2.80
Notons que les valeurs de RCB et BE sur la gramicidine 3- sont extraites avec des
incertitudes plus importante que celles de la gramicidine 2-. Ces valeurs sont discutées dans le
paragraphe suivant.
85
2.2.3 Etude de la position des charges, estimation du point de départ de
l’électron et déduction de la distance entre les charges
Dans le paragraphe précédent nous nous sommes intéressés aux spectres de photoélectron
et aux différents modes d’émission de l’électron. Maintenant nous allons essayer d’aller plus
loin dans l’interprétation de ces spectres. Pour cela nous allons dans un premier temps,
localiser les sites qui portent les charges sur le peptide, puis ensuite faire des calculs
théoriques sur l’énergie de l’électron lorsqu’il part de ces différents sites et enfin nous
comparerons ces résultats avec ceux déduits des spectres expérimentaux. La dernière partie
sera consacrée à l’estimation de la distance entre les charges, ce qui permettra aussi d’évaluer
la longueur du peptide et sa conformation en phase gazeuse et de comparer ces résultats avec
ceux qui ont été obtenus par d’autres groupes en solution.
¾ Sites porteurs de charges sur le peptide
Positionnement des charges à l’aide des pKa
Lorsque nous regardons la séquence peptidique de la gramicidine A, le positionnement de
charges négatives peut sembler difficile, cependant ce peptide a bien été observé déprotoné
deux ou trois fois en phase gazeuse. La gramicidine A possède une fonction alcool du coté Cterminal, nous pouvons localiser une charge négative sur ce site (pKa ~ 16). Plusieurs autres
sites peuvent potentiellement être, bien que difficilement, déprotonés : l'atome d'azote sur la
chaîne latérale du tryptophane (pKa ~ 22 (DMSO)) mais aussi les fonctions amide du
squelette peptidique (pKa ~ 23 (DMSO)). La différence entre ces deux pKa étant trop faible,
elle ne nous permet pas de choisir entre ces deux sites.
Positionnement des charges à l’aide de la spectroscopie UV en phase gazeuse
Pour savoir si l’atome d’azote déprotoné se situe sur la chaîne latérale d’un tryptophane
ou sur une fonction amide du squelette peptidique, nous avons enregistré le spectre d'action de
[M-2H]2- et [M-3H]3-, c'est-à-dire le spectre du taux de détachement d’électron en fonction de
la longueur d’onde, cf. Figure 2-26a. Comme montré dans la première partie avec
l’angiotensine, le principal fragment observé sur le spectre de masse après irradiation laser
correspond aux espèces oxydées : [M-2H]-ƒ et [M-3H]2-ƒ résultant de la perte d'un électron
(non montré ici).
86
-
gramicidine 2
gramicidine 3
250
300
b)
350
Force d'oscillateur (Unit. Arb.)
a)
Taux de photodetachement d'électron
(Unit. Arb.)
[Trp]
-
[Trp-H]
250
300
350
400
Figure 2-26. Spectres d’actions de la gramicidine 2- (Ŷ) et 3- (Ɣ) (a) et spectres de TD-DFT
du tryptophane neutre (en haut) et déprotoné (en bas) (b)
Sur la Figure 2-26a, on observe une large bande centrée à 290 nm pour les spectres
d'action de la gramicidine 2- et 3-. Ces bandes sont dues à l'excitation des liaisons ʌʌ* de
l'indole des tryptophanes (cf. paragraphe 2.1.2). Cette position de la bande montre que les
cycles indoliques des différents tryptophanes ne sont pas déprotonés. Effectivement, lorsque
l’on compare ces deux spectres obtenus à ceux réalisés avec un calcul par TD-DFT sur le
tryptophane neutre ou déprotoné, on voit que ces deux spectres ont la même forme que celui
du tryptophane neutre, cf. Figure 2-26b. La déprotonation de l'indole induirait un
déplacement des bandes vers les plus grandes longueurs d'onde (bathochromisme). Pour plus
d’explication et de détails à ce sujet, se reporter au chapitre 4 qui traite spécifiquement de ces
effets de bathochromisme. Ici, on retiendra que la seconde et la troisième déprotonation se
trouvent être sur un azote d’un amide du squelette peptidique. Pour la gramicidine 2-, le
deuxième site de déprotonation utilisé pour tous les résultats qui suivront sera celui qui est le
plus éloigné de la fonction alcool qui porte la première charge (répulsion entre les charges).
On remarque cependant pour la gramicidine 3-, que l'absorption est non nulle dans la zone
supérieure à 300 nm donc que la présence de conformations pour lesquelles un tryptophane
est déprotoné sur la gramicidine 3- n'est pas à exclure. Pour la gramicidine 3-, nous n’irons pas
plus loin dans les explications puisque le positionnement des charges rencontre déjà beaucoup
d'incertitudes.
87
¾ Estimation de l'énergie de détachement d'un électron à partir de ces différents sites
Calcul théoriques de VDE et ADE
Pour estimer l'énergie de détachement d'un électron de ces différents sites, A.R. Allouche
a calculé l'énergie de détachement vertical (VDE) et l’énergie de détachement adiabatique
(ADE) pour chacune des deux molécules mimiques : CH3CONHCH3 (amide du squelette
peptidique) et éthanolamine NH2CH2CH2O, cf. Tableau 2-4.
La géométrie des molécules est optimisée pour les molécules chargées négativement.
L’énergie de détachement verticale d’un électron correspond à la différence d’énergie entre le
plus bas niveau de l’état fondamental et celui lui correspondant à la même géométrie sur la
surface de potentiel de la molécule neutre. Puis la géométrie est optimisée pour les molécules
neutres. L’énergie de détachement adiabatique d’un électron correspond à la différence
d’énergie entre le plus bas niveau de l’état fondamental et celui de plus bas niveau dans l’état
fondamental correspondant à géométrie optimisée de la molécule neutre.
État
fondamental
neutre
E
M
Optimisation de la géométrie de M
Ea
VDE = E – E-
Calcul de Ea
ADE = Ea – E-
MÉtat
fondamental
anion
Optimisation de la géométrie de MCalcul de ECalcul de E
E-
Figure 2-27. Energie de détachement vertical (VDE) et énergie de détachement adiabatique
(ADE)
Les géométries de ces deux mimiques sont optimisées pour les molécules anioniques et
neutres par des calculs de DFT hybrides de type B3LYP/aug-cc-pvdz [29]. Les affinités
88
électroniques calculées sur l'amide déprotoné isolé et sur la fonction éthanolamine sont
respectivement 2.48 et 1.90 eV. Cependant il est connu que l’optimisation B3LYP donne
généralement des géométries précises, mais que cette méthode est moins optimale du point de
vue énergétique [30]. Pour cette raison, A.R. Allouche a aussi calculé, à partir des géométries
optimisées par B3LYP, les énergies en utilisant cette fois la méthode post Hartree-Fock
MP2/aug-cc-pvdz [31,32]. Les valeurs de l'ADE obtenues pour ces deux mimiques sont cette
fois de respectivement 2.67 et 2.11 eV pour l'amide déprotoné isolé et pour la fonction
éthanolamine. Les résultats obtenus avec les deux méthodes de calcul différentes sont en bon
accord.
Molécules
Structures
déprotonnées
N-methylacetamide
2-aminoethanol
B3LYP
MP2
VDE (eV)
2.81
2.98
ADE (eV)
2.48
2.67
VDE (eV)
2.15
2.38
ADE (eV)
1.90
2.11
BE +RCB (eV)
Gramicidine 2-
2.85 ± 0.3
expérimental
Tableau 2-4. Energie de détachement vertical (VDE) et énergie de détachement adiabatique
(ADE) pour chacune des deux molécules mimiques : CH3CONHCH3 (amide du squelette
peptidique) et éthanolamine NH2CH2CH2O
Comparaison entre les valeurs théoriques et les valeurs expérimentales
Ces différents calculs de la valeur de l'énergie de liaison de l’électron ne doivent pas être
comparés directement à la valeur de la seconde affinité électronique (2.35 eV) mais doivent
être comparés à la somme de la seconde affinité électronique et de la barrière coulombienne,
c'est-à-dire à 2.85 (2.35 + 0.5) eV. Les valeurs de VDE (2.98 eV) et ADE (2.67 eV) calculées
avec la mimique de l’amide déprotoné encadrent la valeur expérimentale (2.85 eV) tandis que
les valeurs de VDE (2.38 eV) et ADE (2.11 eV) calculées avec la mimique de l’éthanolamine
89
ne l’encadrent pas. Ces calculs théoriques sont donc en faveur d'un électron émis
principalement à partir de l'amide déprotoné du squelette peptidique.
¾ Estimation de la distance entre les charges et déduction de la structure
Distance entre les charges
La distance entre les charges est estimée à partir de l'estimation de la valeur de la RCB
(0.5 eV) et en utilisant cette formule (cf. paragraphe 2.1.2) e2/İr avec İ = 2. Pour une
simulation dans le vide, il faudrait logiquement prendre İ0 comme constante diélectrique (İ0 =
1). Cependant, la gramicidine est une molécule organique de taille conséquente et les
interactions entre les deux charges sont partiellement écrantées par les atomes du peptide. On
prend donc usuellement des valeurs comprises entre 2 et 5 pour la constante diélectrique [22].
Ce procédé permet de prendre en compte de manière "ad hoc" la polarisabilité des atomes
dans les peptides et les protéines. On peut en déduire que la distance r entre les deux charges
qui se trouvent à chaque extrémité du peptide est d'environ 14 Å en phase gazeuse pour la
gramicidine chargée 2-.
Comparaison avec les valeurs de RMN en solution
En solution, la valeur trouvée pour la distance entre le premier atome d'azote et la
fonction alcool du C-terminal est 12.6 Å pour la gramicidine en hélice Į [33]. Cela suggère
donc que la structure de [M-2H]2- est plus allongée en phase gazeuse qu'en solution. Une
structure possible pourrait être une hélice Į avec une partie dépliée sur la fin qui serait induite
par la répulsion entre les deux charges. Le dépliement partiel dû à la répulsion entre les
charges a, par exemple, déjà été observé sur des oligonucléotides multidéprotonés [34].
Notons cependant que ces calculs sont réalisés en prenant arbitrairement deux charges aux
extrémités du polypeptide.
Conclusion
Dans cette partie, nous avons utilisé la spectroscopie de photoélectron sur des peptides
pour notre compréhension sur le mécanisme de détachement d’électron expliqué dans la partie
précédente. Mais nous avons aussi pu estimer la distance entre les charges sur la gramicidine
puisque nous avions un accès direct à la RCB avec cette méthode. Les mesures mettent
également en évidence une émission retardée des électrons ce qui est en accord avec notre
modèle d'émission électronique en deux étapes : excitation résonnante puis autoionisation.
Dans ce chapitre, nous nous sommes intéressés au mécanisme de détachement de
l'électron, ainsi qu'à son énergie à l'aide de deux montages expérimentaux. Celui de Lyon
90
permet d'obtenir des informations sur la localisation de la charge et sur l'énergie globale qu'il
faut fournir pour obtenir cette perte d'électron et celui de Karlsruhe permet d'avoir des
informations plus précises sur la barrière énergétique ainsi que sur le mode d'émission de
l'électron.
Dans le chapitre suivant nous allons nous intéresser à l’espèce radicalaire oxydée
produite par ce détachement d'électron et utiliser les propriétés réactives de cette espèce pour
accéder à la séquence peptidique.
2.3 Bibliographie
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93
Chapitre 3 :
Photodétachement d'électron et
photodissociation UV
Aspects cinétique et analytique
Sommaire
3.1 DISSOCIATION PAR PHOTODÉTACHEMENT D'ÉLECTRON (EPD), ASPECT CINÉTIQUE .................. 96
3.1.1 Première étape A o B ..................................................................................................................... 97
3.1.2 Deuxième étape B o C ..................................................................................................................... 99
3.2 FRAGMENTATION DES RADICAUX PAR ACTIVATION COLLISIONNELLE ..................................... 105
3.2.1 Application à des peptides ................................................................................................................ 106
3.2.2 Fragmentation des radicaux............................................................................................................. 109
3.3 APPLICATION AUX PHOSPHOPEPTIDES ...................................................................................... 111
3.3.1 EPD sur des phosphopeptides .......................................................................................................... 111
3.3.2 UVPD sur des phosphopeptides ....................................................................................................... 113
3.4 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................... 120
La spectrométrie de masse est devenue un outil incontournable d'analyse pour les
applications en protéomique [1]. Celle-ci a pour vocation d'identifier les protéines extraites
d'une culture cellulaire, d'un tissu biologique ou bien de connaître leurs localisations, leurs
maturations, ainsi que leurs concentrations. Des stratégies ont été mises au point pour
identifier un toujours plus grand nombre de protéines dans un mélange complexe contenant
des concentrations extrêmement variables de protéines [2]. A cet effet, le couplage avec des
méthodes séparatives, l'analyse en mode MS2 par dissociation induite par collision (CID) et la
spectrométrie de masse haute résolution avec les FT-ICR sont des outils essentiels.
Cependant, de nombreuses limitations existent : intégration, sensibilité, gamme de masse des
spectromètres de masse, rapport de la quantité d'information / quantité de fragmentation. Ces
limitations ont ouvert la voie au développement de multiples stratégies d'analyse, et
notamment à des techniques de fragmentation complémentaires.
Récemment, de nouvelles méthodes de dissociation ont émergés, en particulier celles
liées à la formation de radicaux comme l'ECD (electron capture dissociation) [3,4], l'EDD
95
(electron detachment dissociation) [4-7] ou l'ETD (electron transfer dissociation) [8,9]. Dans
ce chapitre nous allons montrer que l'utilisation d'un laser permet aussi de former des
radicaux. En effet, l'irradiation laser est généralement suivie de l'émission d'un électron. Nous
montrerons le développement d'une nouvelle méthode l'EPD (electron photodetachment) et
son intérêt analytique [10,11].
Dans une première partie de ce chapitre 3, nous allons détailler un modèle cinétique pour
décrire la formation de certains fragments observés par EPD (espèce oxydée et perte de CO2).
Dans une deuxième partie, nous allons nous intéresser à la fragmentation de ces peptides
radicalaires après réexcitation collisionnelle. Dans une troisième partie, nous allons appliquer
cette approche à des phosphopeptides. Une autre stratégie utilisant la photodissociation UV
(UVPD) en mode positif sera discutée et permettra entre autre d'identifier les
phosphotyrosines.
Tous les spectres réalisés dans ce chapitre ont été obtenus avec le LTQ.
3.1 Dissociation par photodétachement d'électron (EPD), aspect
cinétique
Comme nous l'avons vu dans le chapitre précédent, l'irradiation laser d'un peptide isolé en
phase gazeuse peut conduire à la formation d'une espèce oxydée par photodétachement d'un
électron. Dans le cas de dianions, la désexcitation observée suit un canal principal, le
photodétachement d'électron. Cette espèce n'est cependant pas la seule visible dans un spectre
MS2, d'autres types de fragments peuvent aussi apparaître. Dans cette première partie, nous
allons nous intéresser à la cinétique du détachement d'électron et à l'apparition des fragments
visibles sur le spectre autres que l'espèce oxydée [M-2H]-ƒ.
Peptides modèles
Pour illustrer ce phénomène, nous avons choisi d'étudier deux variants de l'angiotensine
II : [Asp1, Val5]-Angio et [Asn1, Val5]-Angio (cf. Figure 3-1).
96
Chapitre 3 : Photodétachement d'électron et photodissociation UV
a) [asp1, val5]-angio
b) [asn1, val5]-angio
Figure 3-1. En haut le variant [Asp1, Val5]-Angio et en bas le variant [Asn1, Val5]-Angio
Dans [Asp1, Val5]-Angio, les charges sont portées par l'acide carboxylique terminal et
celui de la chaîne latérale de l'acide aspartique. Mais dans [Asn1, Val5]-Angio, l'acide
aspartique est remplacé par une asparagine (fonction amide sur la chaîne latérale), les charges
sont donc portées par l'acide carboxylique terminal et la chaîne latérale de la tyrosine.
3.1.1 Première étape A o B
Les spectres de masse de ces deux peptides angiotensine chargés deux fois négativement
ont été enregistrés après irradiation laser à 260 nm pendant 500 ms soit 10 impulsions laser,
cf. Figure 3-2. Sur la Figure 3-2a, l'irradiation laser de l'espèce [M-2H]2- (m/z = 514.5 pour
[Asp1, Val5]-Angio et m/z = 514 pour [Asn1, Val5]-Angio) génère principalement et en grande
quantité l'espèce [M-2H]-ƒ (m/z = 1029 pour [Asp1, Val5]-Angio et m/z = 1028 pour [Asn1,
Val5]-Angio) par photodétachement d'un électron. On remarque ici la présence d'un deuxième
fragment à respectivement m/z = 984 et m/z = 985 correspondant à la perte de 44 Da à partir
du pic [M-2H]-ƒ.
97
b)
a)
[M-2H]2-
[Asn1, Val5]-Angiotensin II
2[M-2H]2-
[Val5]-Angiotensin II
80
[asp1, val5]-angio
>B@ >A@
40
.
--
[M-2H] Ɣ
[M-2H]
Relative
Intensité Intensity
relative
Relative Intensity
Intensité
relative
[M-2H]
[asn1, val5]-angio
80
[M-2H]-Ɣ
40
-44
-44
0
300
600
900
0
300
1200
600
900
m/z
1200
m/z
Figure 3-2. Spectres de masse obtenus après irradiation laser (Ȝ = 260 nm, 500 ms) de [Asp1,
Val5]-Angio (a) et de [Asn1, Val5]-Angio (b)
En résumé, les canaux de fragmentation obtenus après irradiation laser de l'ion précurseur
([M-2H]2- (A) sont les mêmes pour les 2 espèces : photodétaché ([M-2H]-ƒ (B) et perte de CO2
à partir de l'espèce oxydée (C). Nous voulons discuter ici du mécanisme conduisant à ces
différents types de fragment.
[ M – 2H ]1-. +
[ M – 2H ]2-
(A)
Autres fragments dont
[M-2H-CO2]-ƒ
e-
(B)
La première étape
Ao B
(C)
a longuement été discutée dans le chapitre précédent.
Comme nous pouvons le voir sur la Figure 3-3 (ainsi que sur les figures de la partie 2.1.2 du
chapitre précédent), l'évolution de >B @ > A@ est linéaire en fonction de la puissance laser pour
les deux peptides. Nous allons confirmer que cette évolution linéaire est reliée à l'aspect
monophotonique de l'irradiation.
a)
>B@>A@
>B@>A@
0.04
5]-Angio
1
5
[asp[Val
, val
]-angio
0.00
0
500
b)
0.6
0.08
1000
1500
2000
0.4
0.2
0.0
2500
]-Angio
[Asn
[asn11, ,Val
val5]-angio
0
500
1000
1500
2000
2500
laser
power
(PW)
Puissance
laser
(μW)
laser power
(P(μW)
W)
Puissance
laser
Figure 3-3. Intensité du détachement d'électron (rapport [B]/[A] = I[M-2H]-ƒ / I[M-2H]2-) en
fonction de la puissance laser pour [Asp1, Val5]-Angio (a) et [Asn1, Val5]-Angio (b)
98
3.1.2 Deuxième étape B o C
¾ Deux chemins possibles
La première question que l'on peut se poser est : cette deuxième fragmentation est-elle
due à l'absorption d'un deuxième photon par la molécule ou est-elle due à la dissociation
thermique? Pour cela il faut répondre à la question : est ce que le processus est
monophotonique (chemin II) ou multiphotonique (chemin I)?
V
I
2
1 I
A V
o B
o C
V1 I
"hot "
A o B
o C
Chemin I, processus 2 photons
Chemin II, processus "hot"
Avec ici, A l'ion précurseur [M-2H]2-, B le photodétaché [M-2H]-ƒ, C les fragments
représentés par la perte de CO2, ı la section efficace de photodissociation et I le flux laser (le
nombre de photons v P u O ).
Chemin I, processus 2 photons
V
I
2
1 I
A V
o B
o C
[3-1]
S'il n' y pas d'autres fragments que A, B et C, alors :
>A@ >B@ >C @
A0
[3-2]
(avec A0 la concentration initiale de l'ion précurseur A). La variation des concentrations
des différents réactifs d >A@ , d >B @ et d >C @ pour le chemin I peut être exprimée en fonction de
la variation du flux du laser dI (équations cinétiques de réactions successives) :
d > A@ V 1 > A@dI
d >B @ V 1 > A@dI V 2 >B @dI
d >C @ V 2 >B @dI
[3-3]
[3-4]
[3-5]
L'intégration de ces équations permet de tracer l'intensité des différents ions en fonction
de la densité de flux du laser :
>A@
A0
>B@
A0
>C @
A0
e V 1I
[3-6]
>
V1
e V 2 I e V 1I
V1 V 2
>
@
[3-7]
@
ª
º
V1
V1I
e V 2I e V1I »
«1 e
V1 V 2
¬
¼
99
[3-8]
Dans un régime à basse densité de flux laser ( V 1I 1 et V 2 I 1 ), ce qui est notre cas,
on peut faire un développement limité à l'ordre 1 :
e VI | 1 VI
[3-9]
les différents taux de fragmentation sont alors donnés par :
>B@ | V I
>A@ 1
>C @ | V1 >2V V @I 2
>A@ 2 1 2
>C @ | 1 >2V V @I
>B@ 2 1 2
[3-10]
[3-11]
[3-12]
En d'autres termes, les rapports [ B ] [ A] et [C ] [ B ] évoluent linéairement en fonction du
flux laser, tandis que le rapport [C ] [ A] évolue de manière quadratique en fonction du flux
laser.
Chemin II, processus "hot"
hot "
1 I
A V
o B "
o C
[3-13]
L'équation cinétique du chemin II est différente. Le fragment C est supposé être généré
directement à partir du fragment B chaud sans avoir besoin de passer par l'absorption d'un
second photon. Nous supposons donc qu'une proportion Ȝ d'ions B qui se forme, dissocie
spontanément en fragments C.
La variation des concentrations des différents réactifs d >A@ , d >B @ et d >C @ pour le chemin
II exprimée en fonction de la variation du flux du laser dI évolue selon les équations
suivantes (équations cinétiques de réactions compétitives) :
d > A@ V 1 > A@dI
[3-14]
d >B@ (1 O )V1 >A@dI
[3-15]
d >C @ OV1 >A@dI
[3-16]
L'intégration de ces équations permet de tracer l'intensité des différents ions en fonction
de la densité de flux du laser :
>A@
A0
>B@
A0
e V 1I
[3-17]
>
(1 O )1 e V 1I
100
@
[3-18]
>C @
A0
>
O 1 e V 1I
@
[3-19]
Avec les mêmes approximations aux faibles flux que précédemment, on peut déterminer
l'évolution des taux de fragmentation de la manière suivante :
>B@ | (1 O )V I
1
>A@
>C @ | OV I
1
>A@
>C @ | O
>B@ (1 O )
[3-20]
[3-21]
[3-22]
En d'autres termes, avec le chemin II, les rapports [ B ] [ A] et [C ] [ A] évoluent
linéairement en fonction du flux laser, tandis qu'il est constant pour [C ] [ B ] .
Nous voulons insister sur le fait que la différence de production du fragment C entre les
deux chemins se traduit par :
-
un ratio [C ] [ A] qui augmente linéairement pour le chemin II (processus 2
photons), tandis qu'il augmente quadratiquement avec la puissance laser dans le
chemin I (processus "hot"),
-
un ratio [C ] [ B ] constant pour le chemin II, tandis qu'il augmente linéairement
avec la puissance laser dans le chemin I.
¾ Les deux variants de l'angiotensine
Nous voulons savoir quel type de chemin suit la fragmentation de [Asp1, Val5]-Angio et
[Asn1, Val5]-Angio. Pour cela, nous avons tracé le taux de fragmentation de l'intensité de la
perte de CO2 ([M-2H-CO2]-ƒ) sur l'intensité du parent [M-2H]2- en fonction de la puissance
laser à 260 nm pendant 500 ms. C'est-à-dire le rapport [C ] [ A] .
101
c)
d)
>C@>A@
0.02
>C@>A@
0.02
0.00
0
500
1000
1500
2000
0.00
2500
0
laser power
(P(μW)
W)
Puissance
laser
500
1000
1500
2000
2500
laser
power
(PW)
Puissance
laser
(μW)
Figure 3-4. Intensité de la perte de CO2 (rapport [C]/[A] = I[M-2H-CO2]-ƒ / I[M-2H]2-) en fonction
de la puissance laser pour [Asp1, Val5]-Angio (a) et [Asn1, Val5]-Angio (b)
Sur la Figure 3-4, les courbes en rouge représentent la loi de puissance y
D x E avec
laquelle les courbes ont été ajustées. On voit que le rapport >C @ >A@ est quasiment linéaire
pour [Asp1, Val5]-Angio (ȕ = 1.2) alors que l'augmentation est pratiquement quadratique pour
[Asn1, Val5]-Angio (ȕ = 1.8). Cette différence entre les peptides indique que la perte de la
molécule de CO2 est un processus différent pour les deux peptides. Pour [Asp1, Val5]-Angio,
le rapport >C @ >A@ est quasiment linéaire, ce qui indique majoritairement un processus
monophotonique, selon l'équation 3-21 du chemin II. Alors que pour [Asn1, Val5]-Angio, le
rapport >C @ > A@ est pratiquement quadratique, ce qui laisse penser essentiellement à un
processus à deux photons, du type de celui observé dans l'équation 3-11 du chemin I. En
d’autres termes, la perte de CO2 est due à une dissociation thermique à partir de la forme
oxydée [M-2H]-ƒ pour [Asp1, Val5]-Angio tandis qu'elle requiert l'absorption d'un deuxième
photon à partir de la forme oxydée pour [Asn1, Val5]-Angio.
Une autre manière de sonder le caractère multiphotonique d'un processus est de regarder
le ratio >B @ >C @ en fonction de la puissance laser, cf. Figure 3-5. Le rapport >B @ >C @ est
quasiment constant en fonction de la puissance laser pour [Asp1, Val5]-Angio tandis qu'il
augmente de manière linéaire pour [Asn1, Val5]-Angio. Cette évolution du ratio >B @ >C @
confirme un processus à deux photons pour la perte de CO2 dans le peptide [Asn1, Val5]Angio (cf. équation 3-22 du chemin II) et un processus à un photon dans le peptide [Asp1,
Val5]-Angio (cf. équation 3-12 du chemin I).
102
1
, val5]-angio
a) [asp
e)
0.03
>C@>B@
>C@>B@
0.30
0.15
0.00
f)
0
500
1000 1500 2000
laser
power
(PW)
Puissance
laser
(μW)
0.01
0.00
2500
0
500
1000
1500
2000
2500
laser
powerlaser
(PW)(μW)
Puissance
Figure 3-5. Intensité de la perte de CO2 (rapport [C]/[B] = I[M-2H-CO2]-ƒ / I[M-2H]-ƒ) en fonction
de la puissance laser pour [Asp1, Val5]-Angio (a) et [Asn1, Val5]-Angio (b)
Cette différence observée dans la perte de CO2 entre les deux peptides peut être corrélée à
la position initiale du radical. En effet, si l'électron est éjecté à partir du groupement acide
carboxylique de [Asp1, Val5]-Angio (lequel correspond à la plus faible liaison électronique),
le radical devrait être créé sur l'atome d'oxygène du groupement CO2. Dans ce cas, la
recombinaison du radical est suivie de la perte de la molécule de CO2 et peut directement se
produire sans migration du radical. L'énergie interne de l'ion radicalaire est suffisante pour
déclencher la recombinaison sans absorption d'un second photon (processus "hot").
D'un autre coté, pour [Asn1, Val5]-Angio, si l'électron est éjecté à partir du groupe
tyrosylate (électron le plus faiblement lié dans ce variant), le radical est créé sur l'atome
d'oxygène du groupement phénoxy de la tyrosine. La perte de CO2 requiert dans un premier
temps le mouvement du radical du groupement phénoxy de la tyrosine au groupement
carboxylique en position C-terminal. L'absorption d'un second photon semble être requise
pour passer au dessus de la barrière correspondant à ce mouvement (processus 2 photons).
Les différences observées dans les représentations de la perte de CO2 en fonction de la
puissance laser sur les Figure 3-4 et Figure 3-5 sont donc des sondes indirectes de la
localisation de l'éjection de l'électron [12]. Cependant, il existe sûrement une compétition
partielle entre les deux chemins dans les deux peptides. Ces mesures cinétiques de
fragmentation permettent de sonder de manière indirecte la recombinaison radicalaire et pour
aller plus loin des mesures d'expériences résolues en temps ou modèles théoriques sont
nécessaires.
Un récent article paru dans Physical Review E s'est intéressé aux chemins de dissociation
des deux variants étudiés avec l'expérience ELISA d'Aahrus [13]. Les expériences décrites
103
consistent à étudier la dynamique de photodissociation, en particulier les temps de
dissociation. Le montage expérimental exposé comprend, outre un anneau de stockage
électrostatique, un empilement d'électrodes créant une région comprenant un champ
électrique dans lequel les anions sont décélérés. Suite à une excitation laser, la position et
donc le temps de dissociation sont ensuite récoltés par un spectromètre à temps de vol. Les
mêmes peptides ont été utilisés et cet article confirme ces résultats : processus à deux photons
pour [Asn1, Val5]-Angio et à un photon pour [Asp1, Val5]-Angio. L'analyse des profils des
temps d'arrivées (TOF) des fragments neutres semble indiquer des processus de dissociation
rapide (< 100 ns).
104
3.2 Fragmentation des radicaux par activation collisionnelle
La fragmentation que nous observons directement après irradiation d'un peptide [M-2H]2avec un laser UV (à faible puissance) est faible avec principalement deux fragments [M-2H]-ƒ
et [M-2H-CO2]-ƒ. En fait, l'énergie en excès restant sur le radical après photodétachement est
faible ( hQ BE ~ 1eV ).
Afin d'obtenir une fragmentation plus importante, l'espèce radicalaire peut être réactivée
par activation collisionnelle avec le gaz tampon. Dans cette partie, nous allons voir deux
exemples de fragmentation obtenue par réactivation de cette espèce oxydée : le premier sur un
peptide et le deuxième sur un phosphopeptide. Ensuite, nous comparerons le type de
fragments obtenus avec d'autres méthodes de fragmentation de peptides en mode négatif.
Nomenclature
La fragmentation des peptides peut se produire au niveau du squelette peptidique ou au
niveau des chaînes latérales. Les fragmentations les plus informatives au niveau structurel
sont celles de la chaîne peptidique et sont définies par la nomenclature suivante : a, b et c du
coté N-terminal et x, y et z du coté C-terminal [14,15]. La fragmentation des chaînes latérales
des acides aminés conduit le plus souvent à des pertes de molécules neutres comme H2O, NH3
ou CO2, par exemple. En spectrométrie de masse, on ne détecte bien sûr que les fragments
chargés (positivement ou négativement).
Figure 3-6. Nomenclature de la fragmentation d'un squelette peptidique [14,15]
105
3.2.1 Application à des peptides
Dans cette partie, nous allons montrer les résultats obtenus avec [Asn1, Val5]-Angio
(NRVYVHPF). Nous avons, dans un premier temps, isolé le peptide [M-2H]2-, puis nous
l'avons irradié avec le laser à 260 nm pendant 2 s. De cette manière, nous avons obtenu
l'espèce radicalaire [M-2H]-ƒ que nous avons isolée puis activée par collision avec le gaz
tampon, comme résumé dans le schéma (a) suivant. Le spectre obtenu après ces deux étapes
est montré sur la Figure 3-7a.
Nous avons aussi isolé l'espèce monochargée [M-H]- que nous avons directement activée
par CID comme montré dans le schéma (b) ci dessous. Le spectre obtenu par dissociation
induite par collision de l'espèce [M-H]- est montré sur la Figure 3-7b.
a)
hȞ
[ M – 2H ]2-
ESI
[ M – 2H ]1-. + e -
isolation
CID
[ M – 2H ]1-.
hȞ = 260 nm
MS2
b)
Fragments neutres,
y, a-ƒ et x-
Energie collision = 30 %
MS3
CID
[ M – H ] 1-
ESI
Fragments neutres, y
Energie collision = 30 %
MS2
a) [M-2H] -ƒ
b) [M-H] 4 5 6 7 a
-17
N7R V Y V H P F x
7
NRVYVHPF
4
N 7R V Y V H P F
4 5 6
a
7
y7
40
-106
-17
x4
0
a4
400
a5
a6
600
-106
-44
a7
800
x7
.
[M-2H]-
Relative intensity
Relative intensity
x
y
80
-44
y
7
80
m/z
6
y
5
40
-34
-42
[M-H]-
y7
0
1000
7
y5
400
y6
600
800
1000
m/z
Figure 3-7. Spectre de [Asn1, Val5]-Angio : spectre MS3 de [M-2H]-ƒ, avec CID pendant 30
ms et énergie de collision de 30 %, ([M-2H]-ƒ est obtenu par irradiation laser pendant 2 s à
260 nm) (a), spectre MS2 de [M-H]-avec CID pendant 30 ms et énergie de collision de 30 %
(b)
106
Sur la Figure 3-7a, lors de la dissociation de l'espèce radicalaire de [Asn1, Val5]-Angio,
on remarque deux intenses pertes de neutre de 106 et 44 Daltons. Sur la Figure 3-7b, bien
qu'il y ait des pertes de neutre (-17, -34, -42), les pertes de 44 et 106 Da de la Figure 3-7a ne
sont pas observées. Les pertes de -44 (b) et -106 (a) sont liées à la recombinaison radicalaire
comme proposé dans les schémas suivants :
...
a)
...
...
O
...
C
CH
C
R
+
O
O
O
NH
H2C
...
O
b)
.
CH
...
C
NH
CH
. +
O
C
O
R
O
La fragmentation de la chaîne peptidique par CID de l'anion [M-H]- est peu efficace dans
ce cas, comme on peut le remarquer sur la Figure 3-7b, où seulement trois fragments "y"
correspondant à la rupture de la chaîne carbonée sont visibles. En revanche, on observe des
pertes de neutre intenses : -17 (NH3), -34 (2*NH3), -42 (non attribuée).
Sur la Figure 3-7a, on observe pour l'espèce radicalaire [M-2H]-ƒ une série de fragments
de type x, a et y qui correspondent à la rupture du squelette peptidique. Les fragmentations de
type a et x correspondent plus particulièrement à la rupture de la liaison CĮ-C. Notons que ce
schéma de fragmentation avec des pertes de a et x a semble général et que nous l'avons
observé dans d'autres peptides lors du même type d'activation [10]. La richesse des
fragmentations observées suggère une migration rapide des radicaux sur la séquence. Le
chemin de fragmentation principal avec l'obtention de fragments aƒ- et x- (les ions non
radicalaires sont majoritaires mais des espèces avec différents atomes d'hydrogène sont aussi
présentes) peut être expliqué par une recombinaison radicalaire comme proposé dans le
schéma sur la page suivante [10].
107
O
O
H
Rn
N
H
O
O
N
O
O
Photodétachement
d'électron
O
CH3
H
Rn
N
H
O
O
migration
O
N
OH
O
Rn
O
N
H
CH3
N
.
O
CH3
O
fragmentation
O
O
O
Rn
N
H
a
.
CH
.
ou
+
O
C
N
O
CH3
x
Ces résultats montrent que l'utilisation du radical et la réactivation de celui-ci permettent
d’avoir une meilleure fragmentation le long de la chaîne peptidique. L’intérêt est aussi d’avoir
une fragmentation différente de celle observée en CID. En effet, si on additionne les deux
types de fragments obtenus cela permet d’être plus informatif sur la séquence peptidique.
Pour augmenter la fragmentation des radicaux obtenus, une autre méthode est
d'augmenter le temps d'irradiation des peptides dans le piège. Un exemple de fragmentation
obtenue en variant le temps d'irradiation est montré sur la Figure 3-8 avec le peptide
DYKDDDDK. Les spectres correspondent à des temps d'irradiation de 50, 100, 500, 1000 et
3000 ms. On remarque que la fragmentation du peptide augmente lorsque le temps
d'irradiation augmente. C'est l'augmentation de l'énergie interne du radical par réabsorption de
photons (hȞ = 4.6 eV) qui entraîne la fragmentation. La fragmentation du peptide correspond
essentiellement à des pertes d'H2O et de CO2 successives, cela est dû à la très grande acidité
du peptide.
108
Intensité relative
3000 ms
1000 ms
500 ms
100 ms
50 ms
[M-2H]2-
[M-2H]-ƒ
(e)
(d)
(c)
(b)
0
(a)
200
400
600
800
1000
m/z
Figure 3-8. Spectres de fragmentation obtenus après une irradiation laser à 262 nm pour le
peptide DYKDDDDK avec des temps d'irradiation de 50 (a), 100 (b), 500 (c), 1000 (d) et
3000 (e) ms
3.2.2 Fragmentation des radicaux
Le type de fragmentation observé en EPD est similaire à celui observé avec d'autres
méthodes comme l'EDD (electron detachment dissociation) ou le "reverse ETD" (electron
transfer dissociation). Toutes ces méthodes de fragmentation sont en mode négatif et sont
initiées par la formation d'un radical.
En EDD [4-7], le radical est produit par un faisceau d'électron d'énergie supérieur à
10 eV. La collision de l'électron avec l'anion entraîne la perte d'un électron et laisse à l'ion
produit suffisamment d'énergie pour qu'il se dissocie spontanément selon le schéma suivant :
[M-nH]n- + e[M-nH] ( n – 1 ) -ƒ * + 2 efragments + 2 eLes fragments produits proviennent du clivage de la liaison CĮ-C et sont donc des
fragments aƒ- et x-. L'énergie laissée par EDD sur la molécule est estimée à environ 5 eV [5]
( IPpeptide EACOO ~ 8 3.5 ~ 5 eV ).
109
En "reverse ETD"[8,9], le radical est créé par réaction entre l'anion étudié et un cation
Pn+, souvent Xe+. La réaction observée dans ce cas est :
[M-nH]n- + Pn+
[M-nH] ( n – 1 ) -ƒ + P(n-1)+
ƒ-
fragments
-
Avec ce type de réaction ion / ion, les fragments a et x sont prédominants sur les
spectres, quelques fragments c et z peuvent aussi être observés. L'énergie laissée par "Reverse
ETD"sur la molécule est estimée à environ 6 eV [9], rappelons que en EPD (cf. Chapitre 2),
l'énergie laissé sur le peptide est d'environ 1.1 eV (Elaser - ECOO- = 4.6 eV – 3.5 eV).
Le clivage de type a et x n'a pour l'instant été observé qu'avec ces trois modes de
fragmentation (EDD, "Reverse ETD"et EPD). Dans les trois modes, les pertes de neutres sont
dominées par la perte de 44 (CO2). Cependant d'autres voies de fragmentation de type c et z
ne sont pas à exclure.
En conclusion, la fragmentation des radicaux est spécifique avec des fragments de type a
et x. De plus, le type de fragmentation ne semble pas dépendre de la méthode de production
des radicaux.
110
3.3 Application aux phosphopeptides
Des expériences similaires ont été conduites sur un peptide contenant un groupement
phosphate. La phosphorylation des acides aminés contenant un groupement alcool (Ser, Tyr,
Thr) fait partie des modifications post traductionnelles les plus courantes sur les deux
centaines décrites à ce jour [16]. Ce type de modification joue un rôle important dans de
nombreux événements essentiels en biologie, comme la transcription, la transduction du
signal ou l'apoptose [17]. Il a été montré que la phosphorylation peut être induite par des
facteurs de croissance [18] et que la mise en évidence des voies de signalisation des facteurs
de croissance constitue une piste pour montrer de nouvelles cibles thérapeutiques dans la
recherche contre les cancers par exemple [19].
Des méthodes pour enrichir un échantillon en protéines ou en peptides phosphorylés
tirent partie des propriétés particulières du phosphate (immunoréactivité, charge et réactivité
chimique). Les anticorps anti-phosphotyrosine sont très efficaces pour enrichir les peptides en
phosphotyrosine. Cette approche a permis par exemple l'identification de cibles de la
signalisation de l'insuline [20] et de la thrombine [21]. Les anticorps spécifiques des sérines et
des thréonines phosphorylés seules ne sont pas, quant à eux, faciles à produire.
Le problème est que la phosphorylation rend les peptides plus acides et donc plus
difficilement protonables. La phosphorylation les rend donc, comme beaucoup de
modifications post traductionnelles, plus difficiles à identifier de manière classique (CID en
mode positif). Des spectres CID en mode négatif de peptides déprotonés ont été réalisés mais
sont souvent difficiles à interpréter car ils sont dominés par des clivages internes, des pertes
de chaînes latérales ainsi que des pertes de neutres successives (H3PO4, par exemple) [22,23].
3.3.1 EPD sur des phosphopeptides
Nous avons étudié à titre d'exemple le phosphopeptide (de masse 1862 Da) suivant :
Ac V Y K pS P V V S G D T S P R H L NH 2
Le spectre obtenu après irradiation laser à 262 nm pendant 2 s de ce peptide chargé deux
fois négativement [M-2H]2- est montré sur la Figure 3-9a. Les fragments obtenus sont
l’espèce radicalaire oxydée [M-2H]-ƒ mais aussi des pertes de neutre et des fragments de type
a et x (non marqué sur le spectre). Ces fragments sont obtenus suite à l'absorption d'un second
photon par le radical, mécanisme observé ici en raison du long temps d'irradiation (2 s).
111
L’espèce radicalaire oxydée est ensuite isolée et réactivée par CID avec une énergie de
collision à 20 %, le spectre obtenu est celui de la Figure 3-9b. Les deux principales pertes de
neutre observées sont une perte de 44 (CO2) et une perte d’acide phosphorique (-98, H3PO4).
Des fragments de type a-ƒ (9 fragments) et de type x- (3 fragments) sont aussi visibles sur
ce spectre. Nous pouvons remarquer que tous ces fragments ont gardé le groupement
phosphate, ce qui permet dans ce cas de le localiser sur la sérine 4.
[M-2H]2-
a)
Intensité relative
[M-2H]-.
0
14 13
11
x
a15-.
Ac-V Y K pS P V V S G D T S P R H L-NH2
a
b)
6
a6-.
7
a7-.
8
10 11 12 13 14 15
a8-.
-.
a10-. a11
a12-.
x11-
a13-.
x13-
-98
[M-2H]-.
-44
a14-.
x14-
a15-.-98
500
750
1000
1250
1500
1750
m/z
Figure 3-9. Spectre de masse du phosphopeptide ( Ac VYKpSPVVSGDTSPRHL NH 2 )
après irradiation laser de 2s à 262 nm de [M-2H]2- (a) l'espèce [M-2H]-ƒ produite dans le
spectre (a) est ensuite réactivée par CID à 20 % d'énergie de collision pendant 30 ms (b)
Le spectre CID obtenu du même phosphopeptide chargé une fois [M-H]- est montré sur la
Figure 3-10. Dans ce spectre CID, quatre fragments de type a sont détectés mais les autres
fragments visibles sur le spectre ne sont pas des fragments de type a, b,c ,x, y ou z. Ces
fragments peuvent être des fragments internes ou des pertes de neutres. Ce spectre qui est
riche en fragments générés ne permet pas d'identifier les acides aminés du phosphopeptide, ni
de localiser la modification post traductionnelle.
112
-49
Intensité relative
-H2O
-HPO3
-63
-31
-H3PO4
a7
-37
a8
a12
a13
[M-H]-
0
600
900
1200
1500
1800
m/z
Figure 3-10. Spectre de masse du phosphopeptide ( Ac VYKpSPVVSGDTSPRHL NH 2 )
après CID avec une énergie de collision de 25 % pendant 30 ms
Conclusion
La réactivation par CID des radicaux obtenus par EPD présente un potentiel certain du
point de vue analytique. Son intérêt réside surtout dans l’amélioration du séquençage de
peptide contenant des modifications post traductionnelles acides. En effet la CID en mode
positif sur des peptides n'ayant pas subi de modification est très efficace. Nous avons
commencé une étude plus systématique de ces effets avec des expériences sur des peptides
contenant des modifications post traductionnelles sur d’autres acides aminés.
3.3.2 UVPD sur des phosphopeptides
En complément des expériences réalisées sur les ions négativement chargés, nous avons
évalué les potentialités de l'UVPD pour identifier la présence de phosphorylation, en
particulier des phosphotyrosines. Nous voulons mettre en évidence la présence ou l'absence
de phosphorylation sur les tyrosines d'un peptide par un moyen simple. C'est pourquoi nous
avons réalisé une étude comparative en mode positif de différents phosphopeptides et peptides
non phosphorylés. Le but de cette étude est dans un premier temps d'explorer la fragmentation
113
des phosphopeptides par laser et dans un deuxième temps de mettre en place une méthode
pour différencier les peptides phosphorylés des peptides non phosphorylés.
Pour faire cette étude, nous avons choisi la série de peptides A1, B3, B5, C3, et C6 et
leurs phosphopeptides (phosphorylé sur la tyrosine) respectifs A2, B4, B6, C4 et C6 :
A1:TTAVEIDYDSLK
B3:TTAVAIDYDSLK
B5:TTAVAIAYASLK
C 3:TTAVRIRYDSLK
A2 :TTAVEIDpYDSLK
B 4 :TTAVAIDpYDSLK
B6 :TTAVAIApYASLK
C 4 :TTAVRIRpYDSLK
C 5:TTAVRIRYRSLK
C 6 :TTAVRIRpYRSLK
¾ Voies de fragmentation des phosphopeptides en mode positif
Des tests préliminaires ont permis de déterminer que la longueur d'onde la plus efficace
pour fragmenter ces peptides est 220 nm et que la fragmentation était plus informative sur les
peptides chargés deux fois positivement. Les spectres ont été enregistrés avec le LTQ pour les
5 phosphopeptides avec des temps d'irradiation de 200 ms et 500 ms (2 et 5 coups laser). Le
spectre du phosphopeptide A2 après irradiation laser pendant 500 ms de [M+2H]2+ est
présenté sur la Figure 3-11a. Le spectre CID avec une énergie de collision de 11 % pendant
30 ms est présenté en comparaison sur la Figure 3-11b. Sur ces deux spectres, les pertes de
neutre successives à un clivage du squelette peptidique ne sont pas annotées pour ne pas
surcharger les spectres bien qu'elles aient été attribuées. Les stratégies de fragmentation sont
expliquées sur le schéma suivant, nous voulons savoir si ces deux méthodes apportent des
informations et si elles sont complémentaires.
[M+2H]2+
[M+2H]2+
CID
fragments
UVPD
fragments
114
1.0
a)
UVPD 220 nm 500 ms
parent(2+)
b3
EI-CO
intensité relative
0.5
-H2O(2+)
b3-H2O
b4/x3
y3
a5
y4
b5
y11(2+)/-H3PO4
y5
-CO2(2+)
b7
a6 b6
a7
y8
b10
y6
y7
x8/b9 y9
a8
b8
c9
0.0
y11
b11
parent(2+)
-H2O(2+)
1.0
y10
x9
b)
CID 11 % 30 ms
b11
y5
0.5
y7
b7
b5
b4
b3
y4
y8
y6
b6
y10
-2*H2O(2+)
y9
y3
b9
b10
0.0
200
400
600
800
1000
1200
1400
m/z
Figure 3-11. Spectre UVPD du phosphopeptide A22+ à 220 nm pendant 500 ms d'irradiation
(a) et spectre CID du phosphopeptide A22+ avec une énergie de collision de 11 % pendant 30
ms (b)
Les fragments attribués sur le spectre UVPD (Figure 3-11a), sont majoritairement de
type b et y mais quelques fragments a, c et x sont aussi présents. Par contre, sur le spectre
CID, tous les fragments sont de type b et y. Les deux méthodes d'activation (CID et UVPD)
permettent de remonter à la séquence du phosphopeptide A2.
La première ligne de la Figure 3-12 résume les fragments obtenus avec les deux
méthodes d'activation pour le phosphopeptide A2. Les résultats obtenus avec les autres
phosphopeptides sont aussi présentés pour les deux méthodes d'activation (CID, colonne de
gauche et UVPD, colonne de droite).
115
CID
10
9
8
7
UVPD 220nm
6
5
4
b
3
4
5
112 102
6
7
7
6
9
b
a
c
10 11
y
5
b
a
c
4
5
6
7
5
8
8
112
7
7
6
4
4
5
3
3
b
a
b
3
4
112
5
6
7
8
9
y
b
a
c
C6
6
6
7
3
4
9
5
7
7
6
6
6
7
7
8
2
3
4
4
5
x
y
3
3
4
8
8
5
9
10 11
9
4
y
3
11
7
6
5
3
3
4
6
6
7
8
9
8
2
x
y
10 11
x
y
3
3
3
4
4
5
5
y
92
5
T T A V R I R pY D S L K
91,2 102 111,2
b
5
5
8
112
T T A V R I R pY D S L K
C4
6
T T A V A I A pY A S L K
b
a
10 11
3
4
9
10
T T A V A I A pY A S L K
B6
2
x
y
2
7
T T A V A I D pY D S L K
11
9
7
3
112 10
T T A V A I D pY D S L K
B4
8
8
T T A V E I D pY D S L K
T T A V E I D pY D S L K
A2
9
9
111,210
y
3
6
6
6
7
T T A V R I R pY R S L K
72
7
91,2
111,2
8
4
4
x
y
T T A V R I R pY R S L K
b
c
3
5
6
Figure 3-12. Résumé des fragments obtenus avec les phosphopeptides A2, B4, B6, C4 et C6
par CID (colonne de droite) et UVPD (colonne de gauche). Les exposants correspondent à
l'état de charge du fragment, lorsqu'il n'y pas d'état de charge indiqué, il est de 1
On remarque que les fragments obtenus en CID sont majoritairement de type y et b, avec
de rares fragments a, c et x (colonne de gauche de la Figure 3-12). Avec la photodissociation
UV, les principaux fragments obtenus sont majoritairement de type y et b mais on trouve
aussi un nombre conséquent de fragments de type a, c, x. L'UVPD est plus informative que la
CID, en particulier pour le phosphopeptide C4. On constate aussi que les phosphopeptides les
plus acides (A2 : trois acides aminés acides, B4 : deux acides aminés acides) fragmentent
généralement mieux que les phosphopeptides les plus basiques (C4 : deux acides aminés
basiques et un acide aminé acide, C6 : trois acides aminés basiques). La fragmentation est
moins efficace lorsque le proton est très localisé (peptide basique).
¾ Mise en évidence des tyrosines phosphorylées dans des peptides
Pour différencier les peptides phosphorylés des peptides non phosphorylés, une solution
possible est de connaître un fragment spécifique qui n'apparaît soit que sur les spectres des
peptides phosphorylés soit que sur ceux des peptides non phosphorylés. Il semble logique que
116
ce ou ces fragments soit(ent) un fragment provenant d'une perte de neutre plutôt que du
squelette peptidique.
Nous nous sommes intéressés aux différentes pertes pouvant provenir de la
phosphorylation : pertes de H3PO4 (-98 Da), HPO3 (-80 Da), chaîne latérale de la tyrosine
phosphorylée (-187 Da). La perte de la chaîne latérale de la tyrosine (-106 Da) est quant à elle
présente sur les spectres des peptides non phosphorylés.
a) A1
b) A2
A12+
A22+
0.6
Intensité
Intensité
0.6
-Y-2H2O
-Y-H2O
0.3
0.3
-Y (106/2)
0.0
580
600
620
640
m/z
-[H3PO4+Y+H2O]
660
680
700
m/z
0.0
600
-[H3PO4+Y] (187/2)
-H3PO4 (98/2)
620
640
660
680
700
720
740
m/z
m/z
Figure 3-13. Spectre du peptide A12+ (a) et du phosphopeptide A22+ (b) après irradiation
laser à 220 nm pendant 500 ms soit 5 coups laser (Y, correspond à la chaîne latérale de la
tyrosine)
Sur le spectre (a) de la Figure 3-13, la perte de la chaîne latérale de la tyrosine (-106/2)
est visible pour le peptide A12+. Sur le spectre (b), des pertes de H3PO4 (-98/2) et de la chaîne
latérale de la tyrosine phosphorylée (-187/2) sont observées pour le phosphopeptide A22+.
Nous allons maintenant comparer l'intensité de la perte de 98 et de celle de 106 pour les
10 peptides. L'aire sous la courbe des fragments -98 et -106 divisée par celle du parent est
tracée avec une largeur d'isolation des pics de 1 Da. Ces expériences ont été réalisées avec
une irradiation laser de 200 ms, cf. Figure 3-14. On remarque que la perte de 98 (H3PO4) est
intense pour les phosphopeptides (A2, B4, B6, C4, C6) et proche de zéro pour les peptides
non phosphorylés (A1, B3, B5, C3, C5). Le fragment y11 correspond à une perte de 98 Da par
rapport à la masse du parent pour ces différents peptides. Inversement, la perte de 106 (Chaîne
latérale de la tyrosine) est importante pour les peptides non phosphorylés (A1, B3, B5, C3,
C5) et pratiquement nulle pour les phosphopeptides (A2, B4, B6, C4, C6).
117
0.06
a) Perte 98
0.06
Ifragment / Iparent
Ifragment / Iparent
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
b) Perte 106
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
0.00
A1 A2 B3 B4 B5 B6 C3 C4 C5 C6
A1 A2 B3 B4 B5 B6 C3 C4 C5 C6
peptides
peptides
Figure 3-14. Le rapport Ifragment/Iparent est tracé pour les 10 peptides étudiés avec une
irradiation laser de 200 ms et une largeur d'isolation des pics de 1 Da, avec Ifragment = perte
de 98, H3PO4 (a) et Ifragment = perte de 106, chaîne latérale de la tyrosine (b)
La séparation entre les peptides (chiffres impairs) et les phosphopeptides (chiffres pairs)
semble être bonne avec les deux méthodes. On remarque en effet que le rapport Ifragment/Iparent
pour les peptides est négligeable pour la perte de 98 Da (A1, B3, B5, C3, C5) et de la même
manière, le rapport Ifragment/Iparent pour les phosphopeptides est négligeable pour la perte de 106
Da (A2, B4, B6, C4, C6).
Les mêmes graphiques ont été tracés en activant les peptides par CID, cf. Figure 3-15.
Les points obtenus sur la Figure 3-15 (a) et (b) ne permettent pas de savoir si le peptide
contient ou non une tyrosine phosphorylée. La connaissance de la présence d'une
phoshotyrosine ne peut pas se faire avec cette méthode d'activation.
Ifragment / Iparent
Ifragment / Iparent
4
3.0
a) Perte 98
3
2
1
b) Perte 106
2.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.0
A1 A2 B3 B4 B5 B6 C3 C4 C5 C6
peptides
A1 A2 B3 B4 B5 B6 C3 C4 C5 C6
peptides
Figure 3-15. Le rapport Ifragment/Iparent est tracé pour les 10 peptides étudiés avec une énergie
de collision de 11 % et une largeur d'isolation des pics de 1 Da, avec Ifragment = perte de 98,
H3PO4 (a) et Ifragment = perte de 106, chaîne latérale de la tyrosine (b)
118
Les résultats obtenus en irradiant les peptides dichargés avec le laser pendant 200 ms soit
deux coups laser sont prometteurs. Des résultats semblables ont été obtenus avec un temps
d'irradiation de 500 ms ainsi que sur les monochargés.
Une autre façon de présenter les résultats est de tracer Ip98/Ip106, cf. Figure 3-16. Pour les
phosphopeptides, Ip98/Ip106 est supérieur à 1 (A2, B4, B6, C4, C6) et pour les peptides non
phosphorylés, Ip98/Ip106 est inférieur à 1 (A1, B3, B5, C3, C5). Un seuil égal à 1 peut être fixé
perte H PO (98) / perte Y (-106)
3 4
et permet de séparer les peptides non phosphorylés (seuil<1) des phosphopeptides (seuil>1).
25
A2
20
15
C4
C6
C3
C5
10
B6
5
B4
0
1
B5
B3
A1
2
3
4
5
Figure 3-16. Ip98/Ip106 est tracé pour les différents peptides. La ligne en pointillée correspond
au seuil = 1.
Ouverture : échantillon biologique
L'étape suivante serait de transposer la stratégie à l’étude de la régulation de la
phosphorylation des tyrosines associée à l’activation mitogénique (mécanisme qui aboutit à la
division d’une cellule) par les facteurs de croissance. Cette phosphorylation des résidus
tyrosyl du récepteur membranaire intervient immédiatement après la fixation du facteur de
croissance à son récepteur et constitue l’effecteur principal des voies de signalisation aval à
cette stimulation. Cette modification post-traductionnelle des protéines qui contrôle de
manière très fine la prolifération des cellules est fortement perturbée dans le cas de la
transformation tumorale des cellules. Connaître le répertoire de l’ensemble des protéines
régulées par cette modification est donc essentiel à une meilleure compréhension des
mécanismes qui aboutissent au phénotype cancéreux.
119
L’objectif serait de mener une étude différentielle de l’état de phosphorylation de cellules
tumorales humaines selon qu’elles sont stimulées ou non par les facteurs de croissance. Pour
réaliser cela, un des lots de cellules subit au préalable un marquage métabolique des protéines
en introduisant dans le milieu de culture cellulaire de la tyrosine 13C [20]. Il est alors possible
de détecter simultanément l’état de phosphorylation d’une même protéine selon qu’elle est
issue du pool de cellules stimulées ou non stimulées.
Conclusion
Nous avons détaillé un modèle cinétique permettant de décrire la formation de certains
fragments observés par EPD (espèce oxydée et perte de CO2) et nous avons vu que ces
mesures cinétiques sont des sondes indirectes de la localisation de l'éjection de l'électron.
Nous nous sommes aussi intéressés à la fragmentation des peptides radicalaires créée par
photodétachement d'électron. Pour cela nous avons activé les radicaux par excitation
collisionnelle. Le clivage obtenu en EPD, de type a et x, est semblable à celui des autres
méthodes ayant un intermédiaire radicalaire (EDD, ETD).
Du point de vue analytique, nous avons utilisé cette méthode de dissociation sur des
phosphopeptides. Et nous avons aussi mis en place une stratégie utilisant la photodissociation
UV (UVPD) en mode positif pour identifier les phosphotyrosines dans des peptides.
3.4 Bibliographie
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[11] Gabelica V, Tabarin T, Antoine R, et al, Electron Photodetachment Dissociation of DNA
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6564.
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Dissociation and 193-Nm Photodissociation of Peptide Ions in Fourier-Transform MassSpectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 1990, 1, 288.
122
Chapitre 4 : Spectroscopie UV de
peptides et protéines en phase gazeuse
Sommaire
4.1 PRINCIPE DE LA SPECTROSCOPIE UV PAR SPECTROSCOPIE D'ACTION DE PHOTODETACHEMENT
D'ELECTRON .................................................................................................................................... 124
4.2 PEPTIDE SANS CHROMOPHORE .................................................................................................. 130
4.3 PEPTIDES CONTENANT UNE TYROSINE ...................................................................................... 131
4.3.1 Angiotensine ..................................................................................................................................... 131
4.3.2 Une protéine : Insuline ..................................................................................................................... 135
4.4 PEPTIDES CONTENANT UN TRYPTOPHANE ................................................................................. 140
4.4.1 WVVVV et VVVVW ........................................................................................................................... 140
4.4.2 Tryptophane radicalaire................................................................................................................... 144
4.5 CHANGEMENT DE LA CONFORMATION ...................................................................................... 152
4.6 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................... 159
Dans le chapitre 2, nous avons montré que l'excitation UV de polypeptides anioniques
induit une excitation électronique des ions qui est suivie par un détachement d'électron. Le
taux de détachement électronique dépend directement de l'absorption de l'ion précurseur et
peut donc être utilisé pour réaliser une spectroscopie d'action et ainsi sonder les propriétés
optiques de biomolécules isolées.
La région UV correspond aux excitations électroniques et notamment à l'excitation des
électrons de valence des acides aminés aromatiques. En excitant ces molécules avec un laser
UV, nous allons donc sonder les propriétés électroniques des acides aminés chromophores
(tryptophane, tyrosine, phénylalanine) contenus dans les peptides étudiés. Nous allons obtenir
des informations sur la position des états électroniques excités de ces molécules et, en
particulier sur la transition HOMO-LUMO. Ces états électroniques sont extrêmement
sensibles à l'état de charge du chromophore (neutre, déprotoné, radicalaire). L'un des
principaux résultats de ma thèse est l'obtention de signature optique pour ces différents états
de charge [1,2]. D'autres systèmes auxquels je me suis intéressée et qui constituent un des
axes forts de l'équipe sont les systèmes hybrides métal-peptide. Dans ces systèmes, la
spectroscopie UV permet de mettre en évidence des excitations de type transfert de charges
entre les deux parties [3,4]. Les résultats concernant les transferts de charge et l'état
123
d'ionisation de la tyrosine dans le complexe oxytocine-cuivre seront montrés sous forme de
deux articles en annexe de cette thèse.
Dans une première partie, nous allons expliquer le principe de la spectroscopie UV en
abordant notamment les différents paramètres pouvant influencer les résultats obtenus.
Dans la deuxième partie, le peptide ne contiendra pas de chromophore. Dans la troisième
partie, les peptides et la protéine étudiés contiendront au moins une tyrosine qui pourra être
neutre ou déprotonée. Dans la quatrième partie les peptides contiendront au moins un
tryptophane qui pourra être neutre, déprotoné ou radicalaire.
Dans la cinquième et dernière partie de ce chapitre, nous allons essayer d'évaluer la
potentialité de la spectroscopie pour étudier le changement de conformation d'une protéine en
phase gazeuse. Nous comparerons les spectres optiques obtenus pour la protéine ubiquitine en
solution native et dénaturante.
Les spectres réalisés dans ce chapitre, ont été obtenus avec le LCQ mais des spectres
similaires ont été obtenus récemment avec le LTQ.
4.1 Principe de la spectroscopie UV par spectroscopie d'action de
photodétachement d'électron
En solution, l'absorption d'un échantillon peut être mesurée directement en mesurant
l'intensité lumineuse avant et après échantillon (spectroscopie d'absorption). De la même
manière que la spectroscopie UV-visible en solution permet de déterminer l'absorbance d'un
peptide, nous allons montrer que la spectroscopie UV en phase gazeuse va permettre de
déterminer les propriétés d'absorption d'un peptide. Comme déjà mentionné, en phase
gazeuse, l'extinction lumineuse ne peut pas être mesurée directement, le nombre d'ions dans le
piège étant trop faible. Néanmoins, à l'aide d'un spectromètre de masse, nous pouvons
mesurer la fragmentation due à l'absorption de lumière par la molécule et réaliser un spectre
d'action.
Le principe de la spectroscopie d'action consiste à isoler un ion dans le piège, l'irradier
avec le laser et mesurer le taux de fragmentation obtenu. Cette technique est développée avec
succès depuis des années sur des ions moléculaires et de petites molécules biomimétiques
neutres ou chargées positivement [5,6].
Toutefois, lorsque la taille du système grandit, les taux de fragmentation deviennent très
faibles. En effet, dans un système complexe après excitation électronique, la conversion
interne vers l'état fondamental est l'une des voies de relaxation principale. Or pour un système
124
Chapitre 4 : Spectroscopie UV de peptides et protéines en phase gazeuse
à grand nombre de degrés de liberté, l'absorption d'un photon conduit, après conversion
interne et redistribution vibrationnelle, à une très faible élévation de la température et donc à
une fragmentation quasi nulle dans la fenêtre de temps d'isolation du spectromètre, cf.
Tableau 4-1.
Angiotensine
Tryptophane
Insuline
Ubiquitine
NRVYVHPF
n (nombre
d'atome)
27
144
783
1234
hȞ
4.6 eV
4.6 eV
4.6 eV
4.6 eV
ǻT = hȞ / (3n-6)
711.8 K
125.3 K
22.8 K
14.4 K
Tableau 4-1. Tableau regroupant le nombre d'atome (n), l'énergie du photon (hȞ) et
l'augmentation de température (ǻT = hȞ / (3n-6)) associés lors de l'absorption d'un photon
pour différents systèmes
Pour augmenter la fragmentation sur un spectre il est possible d'augmenter la puissance
afin de réaliser une excitation multiphotonique, comme en infra rouge (spectroscopie IRMPD)
[7]. Mais ici, nous nous intéressons aux propriétés optiques linéaires (déjà difficilement
modélisables) et ne pouvons donc pas utiliser cette approche.
L'utilisation d'un messager faiblement lié à la molécule est une autre technique qui a été
utilisée avec succès en infra rouge [8]. Les inconvénients sont ici la possible modification des
propriétés de la molécule par le messager. De plus sur un très gros système, l'énergie d'un
photon UV conduit à une élévation de la température ǻT plus faible que l'énergie thermique,
cf. Tableau 4-1. Un messager trop faiblement lié ne tiendra pas à la molécule alors qu"un
messager lié ne partira pas après absorption d'un seul photon.
La méthode mise au point durant ma thèse consiste à travailler sur des peptides et des
protéines chargés négativement et à obtenir un spectre d'action en mesurant le taux de
détachement d'électron en fonction de la longueur d'onde. Le détachement d'électron est un
phénomène plus rapide que la redistribution de l'énergie vibrationnelle et, comme montré
dans le chapitre 3, c'est un processus monophotonique extrêmement efficace, même sur des
très gros systèmes. Nous avons montré que ce détachement était un processus en deux étapes
dont l'efficacité dépend principalement de l'absorption de l'ion précurseur (cf. chapitre 2).
Nous admettons que la mesure du taux de détachement d'électron est proportionnelle à la
mesure de l'absorption de la lumière par le peptide en phase gazeuse.
125
¾ Spectres optiques et fragments pris en compte dans la formule du taux de
photodétachement
Nous allons donc mesurer en fonction de la longueur d'onde du laser pour différentes
longueurs d'onde comprises entre 220 et 330 nm le taux de détachement d'électron. Le spectre
d'action obtenu donnant le détachement d'électron obtenu pour chaque longueur d'onde
sondée sera nommé spectre optique.
La Figure 4-1 montre un spectre obtenu sur l'angiotensine après une excitation à 260 nm,
(spectre identique à la Figure 3-2b).
Relative
Intensité Intensity
relative
b)
[M-2H]2-
[Asn1, Val5]-Angiotensin II
80
[M-2H]-Ɣ
40
-44
0
300
600
900
1200
m/z
Figure 4-1. Spectre de masse obtenu après irradiation laser (Ȝ = 260 nm, 500 ms) du peptide
[Asn1, Val5]-Angio (NRVYVHPF)
Comme nous l'avons vu dans le chapitre précédent, le parent [M-2H]2- et l'espèce oxydée
[M-2H]-ƒ ne sont pas les seules espèces visibles sur le spectre MS2 obtenu après irradiation
laser, cf. Figure 4-1. D'autres fragments, en particulier les pertes de CO2 et de la chaîne
latérale de la tyrosine peuvent être visibles. Le spectre d'action peut être obtenu par le taux de
détachement d'électron seul :
>ln> parent espèce oxydée
parent @@ / O * Pl [4-1]
soit par le taux de fragmentation totale observé :
>ln> parent total
fragments parent @@ / O * Pl avec Ȝ, la longueur d'onde et Pl la puissance laser.
126
[4-2]
Nous avons tracé sur la Figure 4-2 ces deux taux pour le peptide [Asn1, Val5]-angio
(NRVYVHPF) après une irradiation longue de 2000 ms. Une irradiation longue va augmenter
la quantité des fragments (autre que l'espèce oxydée) présents sur le spectre, (cf. partie 3.2.1
du chapitre 3). Dans la suite de ce chapitre, l'irradiation laser sera de 500 ms soit dix coups
laser sur tous les spectres optiques montrés sauf indication contraire.
Taux de détachement (unité arb.)
>ln> parent total fragments parent @@ / O * Pl >ln> parent espèce oxydée parent @@/ O * Pl 0.00000
220
240
260
280
300
320
340
O (nm)
Figure 4-2. Taux de photodétachement en fonction de la longueur d'onde pour [Asn1, Val5]angio avec une irradiation laser de 2000 ms, les taux de fragmentation reportés sur le
graphique
correspondent
à
(ǻ)
et
à
>ln> parent espèce oxydée parent @@ / O * Pl >ln> parent total fragments parent @@ / O * Pl ( )
Nous remarquons que les deux spectres optiques se superposent, en particulier sur la
plage 235 – 310 nm. Le léger décalage observé dans la zone 220 – 235 nm peut être expliqué
par une augmentation de la fragmentation dans cette zone avec l'ouverture potentielle de
nouveaux canaux de dissociation. Cette zone est aussi celle où la puissance laser est faible et
où les fluctuations de puissance sont les plus importantes. Nous pouvons conclure que tracer
le taux de détachement d'électron ou le taux de fragmentation total n'entraînera pas de
variation sur la position des bandes observées en spectroscopie UV.
127
¾ Répétabilité
Nous avons tracé le spectre optique du peptide [Asp1, Val5]-angio tous les 5 nm le 16
février 2007 et tous les 2.5 nm le 22 février 2007, cf. Figure 4-3. Ces deux spectres obtenus à
une semaine d'intervalle montrent une très bonne répétabilité de la mesure. En effet, on
remarque un parfait recouvrement entre les deux courbes entre 235 et 330 nm. De légères
variations existent cependant dans la région entre 220 et 235 nm. Ces variations sont dues aux
oscillations du faisceau laser aux faibles puissances et aux fluctuations du laser encore une
Taux de photodétachement (unité arb.)
Puissance sur le détecteur (~10 % de
l'intensité du laser au centre du piège) (μW)
fois.
450
le 16 février 2007
le 22 février 2007
400
350
300
250
200
150
100
50
0
220
240
260
280
300
320
340
O (nm)
16 fevrier 2007
22 février 2007
0.0000000
220
240
260
280
300
320
340
O (nm)
Figure 4-3. Taux de photodétachement en fonction de la longueur d'onde pour [asp1, Val5]angio, spectres du 16 février (Ŷ) et du 22 février (ǻ) 2007. Insert : courbe de puissance du
laser OPO en fonction de la longueur d'onde pour les deux jours : le 16 et le 22 février 2007
¾ Variation du temps d'irradiation
Nous avons aussi fait varier le temps d'irradiation du peptide [M-2H]2- de 500 à 2000 ms.
Les spectres de la Figure 4-4 montrent les résultats obtenus avec les peptides [Asp1, Val5]angio. Sur cette figure, le taux de photodétachement pour un temps d'irradiation de 500 ms a
été multiplié par 4. On remarque qu'aux faibles puissances lasers, le taux de
photodétachement est proportionnel au temps d'irradiation pour toutes les longueurs d'onde.
128
taux de photodétachement
avec 2000 ms d'irradiation
(taux de photodétachement
avec 500 ms d'irradiation) * 4
0.0000000
220
240
260
280
300
320
340
O(nm)
Figure 4-4. Taux de photodétachement en fonction de la longueur d'onde pour [Asp1, Val5]angio à 2000 ms (Ŷ) et 500 ms (ǻ). Le taux de photodétachement pour le temps d'irradiation
de 500 ms a été multiplié par 4
129
4.2 Peptide sans chromophore
Un spectre optique a été enregistré sur un peptide ne contenant pas de chromophore : le
peptide RRADDSDDDDD (peptide P2 dans le tableau 2-3 du chapitre 2), cf. Figure 4-5. Ce
peptide qui ne contient aucun acide aminé aromatique, n'absorbe pas dans la région 260 - 310
nm. On peut en déduire que, de la même manière qu'en solution, cette zone ne contient
aucune transition optique pour ce peptide. Par contre, on observe un détachement dans la
région inférieure à 240 nm. Le détachement d'électron correspond ici à l'émergence des
Taux de détachement (unité arb.)
transitions nʌ* et ʌʌ* du squelette peptidique.
0.000
220
240
260
280
300
320
O (nm)
Figure 4-5. Taux de photodétachement en fonction de la longueur d'onde en phase gazeuse
pour l'état de charge 2- du peptide RRADDSDDDDD
130
4.3 Peptides contenant une tyrosine
Nous allons exposer dans cette partie les résultats obtenus avec des peptides contenant
une tyrosine. Dans un premier temps, les résultats avec les deux variants de l'angiotensine
[Asp1, Val5]-angio et [Asn1, Val5]-angio seront présentés. Ces peptides diffèrent par l'acide
aminé N-terminal. Puis nous montrerons les résultats obtenus pour différents états de charge
de l'insuline.
4.3.1 Angiotensine
Dans le chapitre précédent, nous avons localisé les charges par extrapolation des pKa
connus en solution à la phase gazeuse. Avec cette méthode, on en déduit que [Asp1, Val5]angio est déprotoné sur le groupement carboxylique en C-terminal et sur la chaîne latérale du
résidu Asp1, cf. Figure 4-6. Le remplacement de l'acide aspartique Asp1 dans [Asp1, Val5]angio par l'asparagine Asn1 dans [Asn1, Val5]-angio induit un changement de la localisation
de la charge dans [Asn1, Val5]-angio. La seconde déprotonation dans [Asn1, Val5]-angio est
localisée sur la chaîne latérale de la Tyr4, plus exactement sur le groupement tyrosilate,
Figure 4-6.
Figure 4-6. Localisation des charges pour [Asp1, Val5]-angio (a) et [Asn1, Val5]-angio (b)
¾ Spectroscopie UV de 2 variants
Nous avons enregistré les spectres optiques pour ces deux variants de l'angiotensine, cf.
Figure 4-7. Nous obtenons des spectres optiques totalement différents pour ces deux peptides.
Pour [Asp1, Val5]-angio, l'absorption se produit en dessous de 300 nm, avec une bande entre
260 et 300 nm due aux excitations ʌ de la tyrosine (chromophore). Pour [Asn1, Val5]-angio,
une modification du spectre optique est observée avec une première bande entre 290 et 330
nm et une deuxième entre 250 et 280 nm. La bande entre 290 et 330 nm est attribuée au résidu
131
tyrosine ionisé. On observe donc un bathochromisme des deux bandes entre ces deux spectres
dû à l'ionisation de la tyrosine dans le variant [Asn1, Val5]-angio [1].
[[asn1, val5]-angio]2[[asp1, val5]-angio]2-
0
225
250
275
300
325
O (nm)
Figure 4-7. Taux de photodétachement en fonction de la longueur d'onde pour [Asp1, Val5]angio (Ƒ) et pour [Asn1, Val5]-angio ( )
Le bathochromisme dû à l'ionisation du groupement phénolate des tyrosines est connu
depuis longtemps en solution [9]. Les premières valeurs de pKa des tyrosines ont été calculées
avec cette méthode (pKa ~ 9.90) [9]. De plus, des déplacements de bande ont déjà été
observés en solution pour différents solvants [10,11].
¾ Comparaison avec l'absorbance en solution
Nous avons donc enregistré des spectres d'absorption en solution de ces deux variants à
pH 5.3 et pH 13, cf. Figure 4-8. Le but était de comparer les résultats obtenus en phase
gazeuse avec ceux obtenus en solution. A pH 5.3, le groupe tyrosyl est neutre pour les deux
variants, l'absorption en solution des deux variants est représentée en trait pointillé sur la
Figure 4-8. A pH 13, le groupement tyrosyl est déprotoné pour les deux variants, l'absorption
en solution des deux variants est représentée en trait plein sur la Figure 4-8.
132
Absorbance (unité arb.)
0.6
1
5
[asn , val ]-angio, pH = 13
1
5
[asn , val ]-angio, pH = 5.3
1
5
[asp , val ]-angio, pH = 5.3
1
5
[asp , val ]-angio, pH = 13
0.4
0.2
0.0
225
250
275
300
325
O (nm)
Figure 4-8. Spectres d'absorption en solution des deux variants angiotensine ([Asn1, Val5]angio et [Asp1, Val5]-angio) à pH 5.3 et pH 13
Lorsque le groupement tyrosyl est neutre (pH 5.3), on observe une seule bande entre 260
et 290 nm. Lorsque le groupement tyrosyl est déprotoné (pH 13), on observe deux bandes,
une entre 225 et 260 nm et l'autre entre 275 et 315 nm. Pour conclure, on observe un
déplacement vers le rouge des spectres d'absorption en solution des deux variants lorsque l'on
passe de pH 5.3 à pH 13, c'est-à-dire lorsque la tyrosine passe de l'état neutre à l'état
déprotoné.
Les résultats obtenus en solution sont en bon accord avec ceux obtenus en phase gazeuse.
Ces résultats en solution confirment que le déplacement des bandes vers le rouge est dû à la
déprotonation de la chaîne latérale de la tyrosine. Le léger décalage entre la phase gazeuse et
la solution peut s'expliquer par l'influence de l'environnement de la tyrosine, en particulier, la
présence de solvant en solution (solvatochromisme).
¾ Comparaison avec des calculs de TD DFT
Pour permettre d'étayer nos résultats expérimentaux, Abdul-Rahman Allouche a fait des
calculs de TD-DFT (time-dependent density-functional theory). Ces calculs ont été réalisés
sur l'acide aminé tyrosine. Cette approche théorique n'a pas pu être accomplie sur le peptide
entier puisque des calculs TD - DFT avec une grande base sur environ 150 atomes ne serait
133
pas réalisables dans notre laboratoire. Même si l'environnement peptidique n'est pas reproduit,
nous espérons voir les principaux effets de la déprotonation.
A. R. Allouche a dans un premier temps déterminé les propriétés structurales des formes
neutre et déprotonée de l'acide aminé tyrosine en utilisant la DFT (density functional theory)
avec la fonctionnelle hybride B3LYP et la base aug-cc-pvdz. Puis il a ensuite obtenu les
spectres d'absorption par TD-DFT en utilisant aussi la fonctionnelle hybride B3LYP et la base
aug-cc-pvdz. Les spectres obtenus sont montrés sur la Figure 4-9. Le nombre d'états inclus
dans les calculs est de 30 pour la forme neutre et 40 pour la forme déprotonée de la tyrosine.
b)
0.1
Force d’oscillateur
0.50
Oscillator stregnth (fe)
Force d’oscillateur
Oscillator
stregnth (fe)
a)
0.25
-
0.0
0.00
200 250 300 350 400 450 500 550 600
200 250 300 350 400 450 500 550 600
(nm)
OO(nm)
(nm)
OO(nm)
Figure 4-9. Calculs de TD-DFT des transitions optiques permises et des forces d'oscillateur
associées pour la tyrosine neutre (a) et la tyrosine déprotonée (b). Ces calculs sont effectués
avec la fonctionnelle hybride B3LYP et la base aug-cc-pvdz. L'élargissement des bandes est
simulé par une fonction lorentzienne avec une largeur de 9 nm.
Les principales différences entre les deux spectres UV expérimentaux des peptides sont
reproduites par les calculs de TD-TFT sur les espèces isolées de la tyrosine et du tyrosinate.
L'absence de photodétachement après 300 nm pour [Asp1, Val5]-angio, et les bandes entre 225
et 260 nm et entre 275 et 315 nm pour [Asn1, Val5]-angio, en particulier, sont bien
reproduites.
134
a)
b)
Figure 4-10. Dessins des orbitales impliquées dans la transition à 327 nm du tyrosinate
(excitation ʌ (a) ĺʌ* (b))
Pour le tyrosinate, la principale transition à 269 nm est due à une transition ʌʌ* provenant
de la liaison carbonyle vers la chaîne latérale de la tyrosine. L'autre transition à 327 nm est
due à une transition ʌʌ*, cf. Figure 4-10, provenant du cycle benzyl. Ce déplacement vers le
rouge reflète la déstabilisation des orbitales due à la présence de la charge négative sur
l’oxygène du groupe tyrosylate conduisant à la diminution de l’écart entre les HOMOs et
LUMOs dans la tyrosine déprotonée comparé à la tyrosine neutre [12].
Les principaux effets visibles sur les spectres expérimentaux des peptides sont donc
reproduits par les calculs de TD-DFT effectués sur les tyrosines neutre et déprotonée bien que
l'environnement protéique ne soit pas reproduit. Cela montre que les effets visibles sur les
peptides sont bien dus au changement d'ionisation de la tyrosine et non pas à un changement
de la conformation du peptide. Les deux bandes observées entre 225 et 260 nm et entre 275 et
315 nm sont une signature optique de la déprotonation de l'acide aminé tyrosine.
Depuis, L. H. Andersen et ses collaborateurs ont étudié à Aahrus les deux même variants
de l'angiotensine en phase gazeuse. Les expériences réalisées avec l'anneau de stockage
électrostatique ELISA (décrites dans la partie 3.1 du chapitre 3) ont permis de compléter les
propriétés d'absorption dans l'UV de ces peptides [13].
4.3.2 Une protéine : Insuline
Dans cette partie, nous allons comparer la réponse optique de différents états de charge de
l'insuline du pancreas bovin.
135
L'insuline est une protéine de poids moléculaire 5729.5 Da, composée de 51 acides
aminés, avec une chaîne A (21 acides aminés) et une chaîne B (30 acides aminés) reliées par 2
ponts disulfures. Un troisième pont disulfure relie entre elles deux cystéines de la chaîne A.
Elle contient quatre résidus acide glutamique (pKa ~ 4.1) et deux acides carboxyliques en
position C-terminal (pKa ~ 2.0) donc six positions préférentielles pour la charge négative, cf.
Figure 4-11. Cette protéine contient quatre tyrosines (pKa ~ 10.1), cf. Figure 4-11.
NH2
glu
val
phe
asn
val
ala
Site de déprotonation
pKa en
solution
COO- terminal
2.1
Chaîne latérale Glu (COO-)
4.1
gln
leu
arg
glu
gly
cys
val
leu
tyr
leu
O
phe
-O
C
asn
cys
NH2
gly
ser
gly
cys
glu
gln
cys
cys
leu
ser
leu
ile
val
tyr
phe
his
his
gly
ala
asn
glu
tyr
thr
pro
lys
thr
C
Chaîne latérale Tyr (COO-)
ser
leu
gln
tyr
cys
val
10.1
O
O-
Figure 4-11. Séquence de l'insuline
Le spectre de masse de cette protéine en mode négatif est montré sur la Figure 4-12. Les
états 3, 4, 5, 6 et 7 fois chargés négativement sont visibles sur ce spectre.
[M-4H]4-
Intensité relative
100
[M-5H]580
60
[M-6H]640
[M-3H]3-
20
[M-7H]70
750
1000
1250
1500
1750
2000
m/z
Figure 4-12. Spectre de masse de l'insuline en mode négatif (full MS) dans des conditions
dénaturantes
136
¾ Spectroscopie UV de 2 états de charge
Nous avons enregistré les spectres optiques pour les états de charge 4- ([M-4H]4-) et 6([M-6H]6-), cf. Figure 4-13. Comme pour les deux variants de l'angiotensine, nous obtenons
deux spectres différents. Pour l'espèce [M-4H]4-, on observe une seule bande entre 260 et 300
nm et pas d'absorption pour la région supérieure à 300 nm. Cette unique bande indique que les
Taux de photodetachement (unité arb.)
tyrosines de l'espèce [M-4H]4- sont toutes sous forme neutre.
>0+@
>0+@ 0
250
275
300
325
O (nm)
pour les états de charge 4 et 6 de l'insuline : [M-4H]4- (Ƒ) et [M-6H]6-(Ÿ)
Pour l'espèce [M-6H]6-, on observe deux bandes, l'une centrée à 265 nm et l'autre entre
300 et 330 nm. Ces deux bandes révèlent l'ionisation d'au moins une tyrosine sur l'espèce [M6H]6-. Une tyrosine se déprotonne donc avant un acide carboxylique. La structure pdb 3D de
l'insuline (Figure 4-14) montre qu'une tyrosine (Tyr16 de la chaîne B, en jaune sur la Figure
4-14) est à proximité des résidus acides Glu13 et Glu21 de la chaîne B. On peut penser que la
déprotonation des résidus Glu13 et Glu21 est en compétition avec celle de Tyr16.
On remarque cependant que sur les spectres optiques de l'insuline [M-6H]6- et du variant
de l'angiotensine [[Asn1, Val5]-angio]2-, les intensités des deux bandes observées aux me^me
positions sont différentes. L'insuline chargée six fois négativement contient une tyrosine
déprotonée mais aussi trois tyrosines neutres tandis que [Asn1, Val5]-angio chargé deux fois
négativement ne contient qu'une seule tyrosine qui est déprotonée [1]. De plus,
137
l'environnement protéique proche de la tyrosine déprotonée peut aussi modifier la position et
l'intensité des transitions optiques dans la partie rouge du spectre.
Figure 4-14. Structure pdb de l'insuline, en jaune Tyr16, les acides Glu13 et Glu21 sont
entourés en rouge
¾ Spectroscopie à 305 nm
Sur le spectre obtenu précédemment contenant seulement des tyrosines neutres, il n'y
avait pas d'absorption dans la région supérieure à 300 nm. Par contre, dès que la protéine
contient une tyrosine déprotonée, l'absorption était visible dans cette région. La Figure 4-15
montre l'évolution du taux de détachement d'électron selon l'état de charge de l'insuline à 305
nm. Le taux de photodétachement est proche de zéro pour les états de charges 4- et 5-. Pour
ces deux espèces, la déprotonation se produit seulement sur les groupements carboxyliques
des chaînes latérales des résidus acides et sur ceux en C-terminal. Pour les états de charges 6-,
7- et 8-, un détachement est observé à 305 nm et ce taux augmente lorsque l'état de charge
augmente. Cette augmentation du taux de photodétachement à 305 nm peut être interprétée
comme la conséquence de l'ionisation d'un nombre croissant de résidus tyrosine.
138
3.00
2.25
1.50
0.75
0.00
4
5
6
7
8
nEtat de charge >0n+@
Figure 4-15. Taux de photodétachement mesuré à 305 nm en fonction de l'état de charge n de
l'insuline [M-nH]n-
Grâce au détachement d'électron, on peut donc effectuer de la spectroscopie optique sur
des peptides et des protéines et cela quellle que soit leur taille. C'est le premier exemple de
spectre optique UV mesuré pour une protéine en phase gazeuse.
Pour finir, notons qu'un spectre optique similaire à celui de [Asp1, Val5]-angio a été
obtenu pour le peptide P7 (DYKDDDDK) qui contient aussi une tyrosine sous forme neutre.
139
4.4 Peptides contenant un tryptophane
Le tryptophane est l'acide aminé qui absorbe le plus en solution [14]. Le tryptophane est
un acide aminé dont le cycle indolique est difficilement déprotonable en solution (pKa ~ 21
dans le DMSO [15]). Nous avons cependant réussi à déprotonner l'azote du cycle indolique en
étudiant l'espèce doublement déprotonée du peptide WVVVV. Dans un premier temps, nous
allons regarder l'influence de la déprotonation du tryptophane sur la position des bandes
observées dans un spectre optique. Pour cela, nous comparerons les résultats obtenus pour
deux peptides WVVVV et VVVVW.
4.4.1 WVVVV et VVVVW
Les peptides WVVVV et VVVVW semblent difficilement doublement déprotonables,
pourtant les espèces [WVVVV]2- et [VVVVW]2- ont été observées par spectrométrie de
masse. Les spectres de masse obtenus après une irradiation laser à 262 nm des espèces
[WVVVV]2- et [VVVVW]2- sont montrés respectivement sur la Figure 4-16a et b.
a) WVVVV
[M-2H] -ƒ
100
100
[M-2H]2Intensité relative
Intenisité relative
b) VVVVW
80
60
40
-44
20
[M-2H]2-
80
60
[M-2H] -ƒ
40
-44
20
-129
0
0
100
200
300
400
500
600
100
200
300
400
500
600
m/z
m/z
Figure 4-16. Spectre de masse MS2 après irradiation laser à 262 nm pendant 500 ms des
peptides [WVVVV]2- (a) et [VVVVW]2- (b)
Dans les deux spectres de la Figure 4-16, le principal fragment observé correspond à
l'espèce [M-2H]-ƒ. Cette espèce est générée par détachement d'électron à partir de l'ion
précurseur [M-2H]2-. Des pertes de neutre sont aussi observées, pertes de CO2 (-44) et de la
chaîne latérale du tryptophane (-129) pour [WVVVV]2- et perte de CO2 (-44) pour
[VVVVW]2-.
140
Nous allons maintenant déterminer les sites de déprotonation de ces espèces. Le premier
site de déprotonation de ces deux espèces est sans ambiguïté le groupement carboxylique du
C-terminal (pKa ~ 2.3). Le deuxième site de déprotonation est plus difficile à déterminer
puisqu'il n'y a pas d'autres résidus acides. En effet, la seconde déprotonation peut avoir lieu
soit sur les amides du squelette peptidique (pKa ~ 26 dans le DMSO pour CH3-CO-NH-CH3
[16]) soit sur l'azote du cycle indolique(pKa ~ 21 dans le DMSO [15]). La déprotonation d'un
amide du squelette peptidique est possible puisque l'espèce VVVVV a aussi été observée
chargée deux fois négativement (spectre non montré).
Pour le peptide VVVVW, la deuxième déprotonation semble être plus probable sur le
squelette peptidique que sur la chaîne latérale du tryptophane qui est proche de la charge en
C-terminal. Par opposition, pour le peptide WVVVV, la deuxième déprotonation peut être
envisagée sur l'azote du cycle indolique. La perte de la chaîne latérale du tryptophane
déprotonée (-129), qui est observée sur le spectre MS2 de [WVVVV]2- et pas sur celui de
[VVVVW]2- étaye cette hypothèse.
Pour trancher entre ces deux hypothèses pour chacun des peptides, nous avons enregistré
le spectre du taux de détachement de [M-2H]2- en fonction de la longueur d'onde du laser
entre 220 et 330 nm.
¾ Signature de l'état de charge du tryptophane
Nous avons tracé le spectre du taux de détachement de [WVVVV]2- et [VVVVW]2- en
fonction de la longueur d'onde du laser entre 220 et 330 nm avec un temps d'irradiation de
500 ms.
141
WVVVV
VVVVW
0
200
225
250
275
300
325
350
O (nm)
pour les peptides WVVVV ( ) et VVVVW (Ŷ)
Les spectres obtenus pour les deux peptides sont différents. Sur le spectre de WVVVV on
observe deux bandes, l'une centrée à 240 nm et l'autre entre 275 et 325 nm. Pour le peptide
VVVVW, une bande entre 260 et 310 nm est observée ainsi qu'une remontée pour les
longueurs d'onde inférieures à 240 nm. Nous allons maintenant comparer ces spectres avec les
calculs théoriques pour connaître l'état d'ionisation du tryptophane dans les deux peptides.
¾ Comparaison avec des calculs de TD DFT
Abdul-Rahman Allouche a fait des calculs de TD DFT sur le tryptophane neutre et sur le
tryptophane déprotoné. Comme précédemment, il a dans un premier temps déterminé les
propriétés structurales des formes neutre et déprotonée de l'acide aminé tryptophane en
utilisant la DFT avec la fonctionnelle hybride B3LYP et la base aug-cc-pvdz. Puis il a ensuite
obtenu les spectres d'absorption par TD-DFT en utilisant aussi la fonctionnelle hybride
B3LYP et la base aug-cc-pvdz. Le nombre d'états inclus dans les calculs est de 40 pour les
deux formes. Les spectres théoriques obtenus sont montrés sur la Figure 4-18.
142
Force d'oscillateur (unité arb.)
0.5
a) [Trp]
0.4
0.3
0.2
0.1
b) [Trp-H]
0.0
0.08
-
0.06
-
0.04
0.02
0.00
225
250
275
300
325
350
O(nm)
Figure 4-18. Calculs de TD-DFT des transitions optiques permises et les forces d'oscillateur
associées pour le tryptophane neutre (a) et le tryptophane déprotoné (b). Ces calculs sont
effectués avec la fonctionnelle hybride B3LYP et la base aug-cc-pvdz. L'élargissement des
bandes est simulé par une fonction lorentzienne avec une largeur de 9 nm
Les spectres théoriques obtenus pour le tryptophane neutre et le tryptophane déprotoné
sont aussi très différents. Sur le spectre du [Trp], une seule bande centrée à 280 nm est
observée tandis que sur le spectre du [Trp-H]-, deux bandes sont observées, l'une centrée à
260 nm et l'autre entre 310 et 350 nm. La redescente de la courbe sur la gauche du spectre (b)
est seulement due à un manque d'état initial dans le calcul et n'a pas de sens physique. La
comparaison des spectres théoriques de la Figure 4-18 et des spectres expérimentaux de la
Figure 4-17 montre que le cycle indolique du tryptophane est déprotoné dans [WVVVV]2-, et
qu'il est neutre dans [VVVVW]2-. La deuxième charge négative dans le peptide [VVVVW]2est sûrement localisée sur un azote d'une amide du squelette peptidique. Un mélange de
plusieurs localisations de la charge dans les deux peptides étudiés n'est cependant pas à
exclure.
Nous avons réalisé des spectres sur d'autres peptides. Un spectre similaire à celui de
[VVVVW]2- a été obtenu avec la pentagastrine, peptide P11 (Boc-ȕ-AWMDF-NH2). Les
spectres de la gramicidine 2- et 3- montrés dans le chapitre 2 (2.2.3) sont aussi semblables à
143
celui de [VVVVW]2- [17]. Le (ou les) tryptophane(s) ne semblent donc pas déprotonés sur ces
peptides.
4.4.2 Tryptophane radicalaire
Dans cette partie, nous allons montrer les résultats obtenus avec le tryptophane
radicalaire. Tout d'abord, nous expliquerons comment nous avons formé cette espèce. Ensuite,
nous regarderons le temps de vie de l'espèce radicalaire. Puis, nous nous intéresserons à la
spectroscopie visible de ce radical. Et, pour finir, nous comparerons nos résultats avec des
calculs théoriques et des expériences réalisées en solution.
¾ Formation du radical
L'irradiation laser de l'espèce isolée [WVVVV]2- avec un laser à 266 nm (laser pompe)
entraîne la formation d'une espèce avec un indole radicalaire, cf. Figure 4-19a par
détachement d'un électron. Lorsque l'on irradie cette espèce [M-2H]-ƒ avec un deuxième laser
(laser sonde) à Ȝ = 490 nm (le tryptophane absorbant en solution dans le visible), on obtient le
spectre de masse de la Figure 4-19b, selon le schéma suivant :
O = 266 nm
[M-2H]2-
't = 616 ns
[M-2H] -ƒ
144
O = 490 nm
[M-129]-
a) MS2, 266 nm (
Intensité
1.0
)
2-
[M-2H]
0.5
.
-
[M-2H]
0.0
200
300
400
b) MS2, 266 nm + 490 nm
500
600
( +
)
x4
Intensité
1.0
2-
[M-2H]
.
-
[M-2H]
0.5
-129 Da
0.0
200
300
400
500
600
m/z
Figure 4-19. Spectre MS2 de [WVVVV]2-, obtenu après irradiation laser à 266 nm (a) et
après irradiation laser à 266 + 490 nm avec ǻt = 616 ns (b), temps d'irradiation un coup
laser (50 ms)
Sur les spectres de la Figure 4-19, l'irradiation correspond à deux impulsions pompe et
sonde synchronisées (1 coup à 266 nm + 1 coup à 490 nm). On observe la formation du
photodétaché ([M-2H]-ƒ) et de la perte successive de 129 Da (chaîne latérale du tryptophane).
Cette perte de 129 est beaucoup plus faible lorsque [WVVVV]2-est irradié par le laser pompe
seul (Figure 4-19a) que lorsque [WVVVV]2-est irradié par le laser pompe et le laser sonde
(266 + 490 nm), cf. Figure 4-19b.
Cette perte de 129 Da est donc une sonde de l'absorption du photon à 490 nm par la
molécule, comme montré sur la Figure 4-20.
145
-
N
N
a)
hQ = 260 nm, MS2
NH
...
+
NH
O = 266 nm
...
... OC
e-
...
OC
N
... OC
b)
CH
NH
hQ = 490 nm, MS3
NH
...
...
O = 490 nm
N
...
+
H2C
129 Da
OC
Figure 4-20. Mécanisme du détachement d'électron lors de l'irradiation laser à 266 nm (a) et
mécanisme de fragmentation conduisant à la perte de la perte de 129 après une irradiation
laser à 490 nm de l'espèce radicalaire produite en (a) (b)
¾ Temps de formation et durée de vie du radical
Nous allons maintenant nous intéresser au temps de formation et à la durée de vie du
radical. Pour cela, nous allons mesurer le taux de la perte de 129 Da en fonction du délai entre
le laser pompe et le laser sonde. Nous allons mesurer I[M-129]-/(I[M-129]- + I[M-2H]2- + I[M-2H]-ƒ),
c'est-à-dire l'intensité de la perte de 129 Da sur l'intensité totale du spectre. Le résultat est
montré sur la Figure 4-21. L'erreur sur l'axe des abscisses est estimée à ± 20 ns, cette erreur
correspond à la fluctuation temporelle (jitter) de la synchronisation entre les deux lasers.
L'erreur sur l'axe des ordonnées correspond à deux fois l'écart type mesuré sur les intensités.
Le mode opératoire mis en œuvre pour faire cette expérience fait l'objet de la partie pompe
sonde du chapitre expérimental (partie 1.2.3 dans le chapitre 1).
146
Perte de 129 normalisée (unité arb.)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
-500
0
500 1000
20000
40000
't (ns)
Figure 4-21. Perte de 129 Da (I[M-129]-/(I[M-129]- + I[M-2H]2- + I[M-2H]-ƒ)) mesurée après
irradiation laser à 266 nm (laser pompe) + 490 nm (laser sonde). La droite en pointillé
correspond à la perte de 129 Da observée avec le laser pompe seulement (266 nm)
Sur la Figure 4-21, la droite en pointillé correspond au taux de perte de 129 Da observée
en irradiant la molécule avec le laser pompe seulement (266 nm). Pour les délais négatifs,
quand le laser sonde (490nm) est injecté avant le laser pompe (266 nm), aucun effet de ce
laser n'est observé. Ce laser n'est pas absorbé par l'ion précurseur (ion non radicalaire). Pour
les délais positifs, une augmentation de la perte de 129 Da est observée. Cela est dû à
l'absorption de la lumière visible du laser sonde par l'espèce radicalaire produite par le laser
pompe (266 nm).
La dynamique observée sur cette figure montre que la perte d'un électron conduisant à la
formation du radical est rapide. Elle est inférieure à 50 ns qui est la limite de résolution
temporelle de notre expérience [2].
On remarque aussi que le radical photogénéré est stable pendant une longue période : au
moins 40 µs. En fait ce radical peut être isolé pendant plusieurs dizaines de millisecondes, des
spectres MS3 en réisolant ce radical peuvent donc être effectués. Le spectre obtenu dans la
partie suivante a été effectué en réisolant le radical avant l'excitation par le laser visible
(deuxième laser).
147
¾ Signature de l'état radicalaire du tryptophane, spectroscopie visible du radical
Dans cette seconde série d'expériences, comme précédemment, l'irradiation laser de
l'espèce isolée [WVVVV]2- avec un laser à 266 nm (laser pompe) entraîne la formation d'une
espèce comportant le cycle indolique radicalaire. Puis, ce radical à long temps de vie est
réisolé et après isolation, irradié avec le laser OPO accordable en longueur d'onde entre 430 et
590 nm (expérience MS3), comme montré sur la Figure 4-22 et dans le schéma suivant :
ESI
isolation
[ M – 2H ]2-
hȞ
hȞ = 260 nm
Intensité relative
MS2
1.0
isolation
[ M – 2H ]1-. + e -
[ M – 2H ]1-.
hȞ
[M-129]-
hȞ = 430-590 nm
MS3
a MS2, 266 nm (1. )
2-
[M-2H]
0.5
-.
[M-2H]
0.0
200
Intensité relative
1.0
400
b MS3, 490 nm
600
-.
[M-2H]
(1. ,2. )
0.5
-129 Da
0.0
200
400
600
m/z
Figure 4-22. Spectre MS2 de [WVVVV]2-, obtenu après irradiation laser à 266 nm pendant 5
coups laser 250 ms (a) et spectre MS3 obtenu après isolation de l'espèce [WVVVV]-ƒ (crée
par le laser à 266 nm) et irradiation laser à une longueur d'onde comprise entre 430 et 590
nm pendant 3 coups laser soit 150 ms (b)
148
Le spectre de fragmentation de ce radical [WVVVV]-ƒ a été enregistré en fonction de la
longueur d'onde du second laser, c'est à dire entre 430 et 590 nm. Le spectre de
photofragmentation de ce radical est montré sur la Figure 4-23. Sur ce spectre, une seule
bande d'absorption est visible avec un maximum à 473 nm et une largeur à mi hauteur de 82
nm.
425 450 475 500 525 550 575 600
O (nm)
Figure 4-23. Taux de photodétachement du pentapeptide radicalaire [WVVVV-2H]-ƒ entre
430 et 590 nm
¾ Comparaison avec des calculs de TD-DFT et la solution
Nous avons comparé le spectre expérimental obtenu (Figure 4-23) avec le spectre
d'absorption calculé pour le radical indolyl neutre (Figure 4-25). Le spectre calculé révèle une
transition à 474.4 nm. Le calcul théorique est donc en bon accord avec le spectre expérimental
de photodissociation (bande avec un maximum à 473 nm).
149
a)
b)
Figure 4-24. Dessins des orbitales impliquées dans la transition visible du radical indolyl
neutre (excitation ʌ-3 (a)ĺʌ0 (b))
Cette bande correspond à la transition d'une orbitale ʌ interne vers l'orbitale ʌ HOMO
occupée par un électron célibataire [18], cf. Figure 4-24. Le bon accord entre le spectre de
photofragmentation expérimental et le spectre d'absorption calculé indique que le reste du
Force d'oscillateur (unité arb.)
peptide a une faible influence sur les propriétés optiques du radical.
0.04
0.02
0.00
400 425 450 475 500 525 550 575 600
O (nm)
Figure 4-25. Calculs de TD-DFT des transitions optiques permises et les forces d'oscillateur
associées pour l'indole radicalaire. Ces calculs sont effectués avec la fonctionnelle hybride
B3LYP et la base aug-cc-pvdz. L'élargissement des bandes est simulé par une fonction
Lorentzian avec une largeur de 9 nm
Le spectre optique du tryptophane radicalaire en phase gazeuse est déplacé de 25 nm vers
le bleu en comparaison du spectre obtenu pour le tryptophane radicalaire et le radical indolyl
150
en solution dans l'eau [19,20]. Pour le tryptophane, les spectres du radical concernant les
formes protonées ou déprotonées en solution sont obtenus avec des expériences de radiolyse
[19-21]. Ces spectres sont généralement utilisés comme spectre de référence pour caractériser
les tryptophanes radicalaires dans les protéines [22,23].
De tels écarts entre la solution et la phase gazeuse peuvent s'expliquer par le changement
relatif de la densité de charge négative sur l'azote radicalaire lors de l'hydratation comme
observé pour les phénols et les molécules octopolaires [24,25]. De plus, le spectre
d'absorption du tryptophane radicalaire photogénéré dans un environnement structurellement
défini par une protéine présente un motif avec une double bande avec des maximums à 512 et
536 nm [26] tandis qu'une seule bande est observée ici. Cela confirme la grande sensibilité
des transitions du tryptophane radicalaire à son environnement local.
Dans les premières parties de ce chapitre, nous avons utilisé le taux de détachement
d'électron pour tracer des spectres d'actions. Les spectres électroniques des peptides et des
protéines donnent accès aux structures électroniques des chromophores. Avec cette méthode,
nous avons obtenu une signature de l'état d'ionisation des chromophores (neutre, radicalaire
ou déprotoné).
Dans la partie suivante, nous allons étudier la sensibilité de ces spectres vis-à-vis du
changement de conformation d'une protéine en sondant la réponse optique d'un chromophore
naturel présent dans la protéine.
151
4.5 Changement de la conformation
Dans cette partie, nous allons nous intéresser à l'ubiquitine équine, une molécule de 8565
Da comportant 76 acides aminés. Nous avons choisi d'étudier cette protéine car elle ne
contient qu'un seul acide aminé chromophore : une tyrosine en position 59. La structure de
cette protéine est partiellement en hélice Į (des acides aminés de 23 à 34, de 38 à 40 et de 57 à
59) et en feuillet ȕ (des acides aminés de 2 à 6, de 12 à 16, de 42 à 45 et de 66 à 70) [27] dans
son état natif.
a)
b)
MQIFVKTLTG
KTITLEVEPS
DTIENVKAKI
QDKEGIPPDQ
QRLIFAGKQL
EDGRTLSDYN
IQKESTLHLV
LRLRGG
Figure 4-26. Structure tridimensionnelle de l'ubiquitine, la flèche indique la position de la
tyrosine (a) et séquence de l'ubiquitine, les acides aminés comportant un groupement
carboxylique sont soulignés (b)
La structure native de cette protéine est stable même dans des conditions de pH extrême
ou lors d'ajout de solvant organique comme le méthanol [28]. Pour déplier cette protéine, il
faut combiner les effets du méthanol et d'un pH acide. Par exemple, les spectres de
dichroïsme circulaire obtenus par Katta et Chait montrent que l'ubiquitine est sous forme
native pour les conditions suivantes : H2O (pH 2.3, ajout HCl), H2O (pH 4.8, ajout HCl),
H2O/MeOH 1/1 (pH 4.8, ajout HCl) mais qu'elle est sous forme dénaturée avec H2O/MeOH
1/1 (pH 2.3, ajout HCl) [28]. Ces résultats sont confirmés par des expériences d'échange
hydrogène / deutérium [28].
152
Un autre état bien connu de cette protéine est "l'état A" correspondant à un dépliement
partiel de la protéine. Cet état est riche en structures secondaires en particulier en hélice Į
(acides aminés de 23 à 34 et de 39 à 72) mais aussi en feuillet ȕ (acides aminés de1 à 7 et de
10 à 17), cf. Figure 4-27. Cet état est obtenu en solution dans un mélange H2O/MeOH 40/60
(pH 2, ajout d'acide acétique) [29-31].
Figure 4-27. Structure tridimensionnelle de "l'état A" de l'ubiquitine [29]
Des spectres de dichroïsme circulaire réalisés à pH 2.0 par Jourdan et Searle confirment
qu'à partir de 40 % de méthanol dans la solution, l'ubiquitine passe de l'état natif à "l'état A".
En effet, à partir de cette limite, la quantité d'hélice Į ne fait qu'augmenter lors de
l'augmentation de la concentration de méthanol (jusqu'à 100 %) [30].
¾ Spectrométrie de masse
En spectrométrie de masse, en mode positif, lorsqu'une protéine est "repliée", peu d'états
de charge sont visibles sur le spectre de masse, de plus ces états de charge sont faibles. Par
contre, lorsqu'une protéine est "dépliée" beaucoup d'états de charge sont visibles sur le spectre
de masse (plus de sites protonables sont accessibles) et ces états de charge sont généralement
élevés [28,32,33].
153
Par exemple, Babu et ses collaborateurs ont montré que dans une solution aqueuse à pH
2.0 (acide acétique), les états de charge prédominants pour l'ubiquitine sont [M+5H]5+ et
[M+6H]6+ avec H2O = 100 %, et sont [M+7H]7+ à [M+11H]11+ pour H2O/MeOH 40/60 [34].
Konermann et Douglas ont quant à eux décrit leurs résultats obtenus avec une solution
(H2O/MeOH 40/60), à partir de laquelle, ils ont fait varier les conditions de pH par addition
de NH4OH (pH 11.7), HCl (pH 2.0) et CH3COONH4 (pH 7.2) [35]. Les spectres de
dichroïsme circulaire obtenus montrent que la solution à pH 7.2 est sous forme native, celle à
pH 2.0 est sous forme "dépliée" hélice Į ("état A") et celle à pH 11.7 est sous une forme
intermédiaire des deux précédentes. Les spectres de masse en mode positif sont :
-
pour la solution à pH 7.2 : peu d'états de charge avec un maximum d'intensité pour
le [M+6H]6+,
-
pour la solution à pH 11.7 : beaucoup d'états de charge avec un maximum
d'intensité pour le [M+8H]8+ et
-
pour la solution à pH 2.0 : beaucoup d'états de charge avec un maximum d'intensité
pour le [M+11H]11+.
Cependant les spectres qui sont obtenus à ces trois pH différents en mode négatif sont
similaires : un seul état de charge : [M-5H]5-.
¾ Préparation des solutions
Nous avons préparé deux solutions différentes d'ubiquitine afin d'obtenir dans une
solution l'ubiquitine "repliée" (ou native) et dans l'autre solution l'ubiquitine "dépliée" (ou
dénaturée ou dans "l'état A"). Dans ces deux solutions, l'ubiquitine est dissoute dans un
mélange 60/40 méthanol/eau. Dans la solution contenant l'ubiquitine dite "repliée", la phase
aqueuse est composée de tampon acétate d'ammonium 10 mM à pH 6.5. Dans la solution
contenant l'ubiquitine dite "dépliée", la phase aqueuse est composée d'acide chlorhydrique 6
mM portant le pH de cette phase à 2.5.
Dans un premier temps, nous avons vérifié par dichroïsme circulaire que nous obtenions
pour l'ubiquitine contenue dans les deux solutions, des proportions différentes d'hélice Į. Les
spectres de dichroïsme circulaire obtenus à 20 °C pour l'ubiquitine à une concentration de 10
µM sont présentés sur la Figure 4-28.
154
8
Ubiquitine "dépliée"
Ubiquitine "repliée"
6
4
-3
2
-1
Ellipticité molaire (*10 deg.cm .dmol )
2
0
-2
-4
190
200
210
220
230
240
250
O (nm)
Figure 4-28. Spectre de dichroïsme circulaire de l'ubiquitine "dépliée" (trait noir, mélange
60 / 40 eau / méthanol, pH 2.5) et de l'ubiquitine "repliée" (trait rouge, mélange 60 / 40 eau /
méthanol, pH 6.5)
Les spectres de dichroïsme circulaire obtenus sont en bon accord avec la littérature [35] :
nous observons que notre solution d'ubiquitine à pH 2.5 a une quantité beaucoup plus
importante d'hélice Į que celle à pH 6.5. L'ubiquitine dans la solution à pH 2.5 semble donc
bien dans "l'état A" et celle dans la solution à pH 6.5 dans l'état natif.
Nous avons aussi réalisé les spectres de masse de l'ubiquitine en mode positif et en mode
négatif pour les deux solutions, cf. Figure 4-29. En mode positif, pour la solution à pH 6.5,
peu d'états de charge sont visibles sur le spectre et le pic [M+6H]6+ est le plus intense (c).
Pour la solution à pH 2.0, beaucoup d'états de charge sont visibles et le pic [M+11H]11+ est le
plus intense (d). Ces spectres de masse correspondent bien aux spectres de masse attendus
pour une protéine native et "dépliée".
En mode négatif, le pic de l'état de charge [M-5H]5- est le plus intense, on observe
cependant un autre pic [M-6H]6-(a,b). Nos spectres de masse sont là aussi en bon accord avec
la littérature [30,35]. Nous n'avons pas d'explication claire pour la différence observée entre
les modes positifs et négatifs. Une explication possible est la plus forte mobilité des porteurs
de charge (proton) dans le cas du mode positif que du mode négatif. Il se peut aussi que les
conformations obtenues en mode positif et négatif soient différentes ou bien qu'une
réorganisation conformationelle ait lieu en mode négatif de la forme "dépliée" vers la forme
"repliée".
155
100
5-
[M-5H]
a)
5-
[M-5H]
b)
80
intensité relative
60
40
6-
[M-6H]
6-
[M-6H]
20
0
100
c)
d)
6+
[M+6H]
11+
[M+11H]
80
5+
[M+5H]
60
6+
40
[M+6H]
20
0
500
750 1000 1250 1500 1750 2000 500
m/z
750 1000 1250 1500 1750 2000
m/z
Figure 4-29. Spectres de masse de l'ubiquitine "repliée" (pH 6.5) en mode négatif (a),
"dépliée" (pH 2.5) en mode négatif (b), "repliée" (pH 6.5) en mode positif (c) et "dépliée" (pH
2.5) en mode positif (d)
¾ Spectroscopie UV
Les spectres optiques de l'ubiquitine enregistrés à partir des deux solution ont été tracés.
Pour cela, les états de charge [M-6H]6- ont été isolés et irradiés pendant 500 ms par le laser
UV entre 220 et 320 nm. Le photodétaché correspond donc au pic [M-6H]5-ƒ. Les spectres
optiques obtenus sont montrés sur la Figure 4-30.
156
Taux de photodétachement (Unité arb.)
Ubiquitine "repliée"
Ubiquitine "dépliée"
0.00
220
240
260
280
300
320
O (nm)
Figure 4-30. Spectres optiques de l'ubiquitine "repliée", pH 6.5 ( ) et "dépliée", pH 2.5 (Ƒ)
On remarque que les deux spectres optiques correspondent à ceux de protéines ayant une
tyrosine neutre (cf. partie 4.3). Le décalage attendu pour un changement de conformation est
beaucoup moins important que pour un changement d'état d'ionisation. Les spectres obtenus
sont en effet très similaires. Néanmoins, des différences semblent avoir lieu dans deux
régions, celle entre 215 et 230 nm et celle entre 250 et 305 nm. Nous avons refait des spectres
pour ces deux régions particulières, Figure 4-31, en effectuant successivement à chaque
longueur d'onde les mesures pour les deux solutions. Ceci permet de s'affranchir au maximum
b)
0.0000
a)
des fluctuations du laser.
0.000
216
218
220
222
224
226
228
250
260
270
280
290
300
310
O (nm)
O (nm)
Figure 4-31. Spectres optiques de l'ubiquitine "repliée", pH 6.5 ( ) et "dépliée", pH 2.5 (Ƒ)
entre 215 et 230 nm (a) et entre 250 et 305 nm (b)
157
Sur la Figure 4-31, les spectres optiques de l'ubiquitine "repliée" et "dépliée" sont
superposables pour les deux régions, aucun déplacement de bande n'est observé entre les deux
conformations de l'ubiquitine.
Plusieurs pistes peuvent expliquer cette absence de déplacement de bande. La première
explication est que les déplacements de bande des spectres optiques pour les changements de
conformations sont inférieurs à la résolution expérimentale (< 10 nm).
Toutefois, des calculs de type ONIOM (Our owN n-layered Integrated molecular Orbital
+ molecular mechanics Method) ont été effectués par A.R. Allouche sur la structure native de
l'ubiquitine (Figure 4-32a) et aussi sur une structure "dépliée" (Figure 4-32b). Cette structure
dépliée a été obtenue par dynamique moléculaire avec le champ de force Amber 99. La
méthode ONIOM consiste à calculer le spectre optique du chromophore par une méthode de
TD DFT dans un environnement protéique dont la conformation et la distribution de charge
sont obtenues avec le champ de force Amber 99. Les résultats obtenus montrent que des
changements de spectres seront difficilement détectables avec la résolution de nos
expériences. Notons cependant que ce type de calcul n'a pas été réalisé sur "l'état A" de
l'ubiquitine puisque la structure tridimensionnelle de cet état n'est pas dans PDB (protein data
bank).
intensité
a)
244 nm
O (nm)
intensité
b)
248 nm
O (nm)
Figure 4-32. Calculs ONIOM des transitions optiques permises pour la conformation de
l'ubiquitine native (a) et pour une conformation "dépliée" de l'ubiquitine (b)
158
Une autre explication serait que la tyrosine soit dans un environnement semblable dans
les deux conformations et notamment à l'extérieur du squelette peptidique (cf. structures de
l'état natif et de "l'état A"). La tyrosine serait donc peu sensible aux changements de
conformations. En effet, un réarrangement peut, peut être, avoir lieu pendant le passage de la
protéine en phase gazeuse en mode négatif. Effectivement, en mode négatif, les mêmes états
de charges sont observés pour des solutions à différents pH.
Conclusion et perspectives
Dans ce chapitre, nous avons utilisé le taux de détachement d'électron pour sonder les
propriétés électroniques de peptides et de protéines en phase gazeuse. Nous avons montré que
la réponse optique des peptides est modifiée par l'état de charge du chromophore (neutre,
déprotoné ou radicalaire). Par contre, nous n'avons pas réussi à sonder l'effet du changement
de conformation d'une protéine en sondant sa réponse optique. Cependant, différents projets
sont en cours de réalisation afin d'interpréter ces expériences et de conclure sur la sensibilité
des spectres optiques vis-à-vis de la conformation.
En perspective, des expériences sont en cours pour savoir si les spectres optiques de
peptide contenant un chromophore sont sensibles à l'environnement. Nous allons augmenter la
taille d'un peptide acide aminé par acide aminé, en commençant par un acide aminé
tryptophane sur lequel on greffera des alanines. Nous tracerons les spectres optiques de ces
différents peptides. Et nous verrons de cette manière, si un changement de spectre optique dû
à l'environnement peptidique du tryptophane est visible.
Des expériences de mobilité ionique en mode positif et en mode négatif permettront de
voir si des différences de repliement existent entre ces deux formes en phase gazeuse. Des
expériences de mobilité sur l'ubiquitine en mode positif montrent que plusieurs conformères
existent en phase gazeuse [36,37].
4.6 Bibliographie
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162
Conclusion et perspectives
Ce mémoire de thèse présente une étude des propriétés optiques et de la
photofragmentation de biomolécules en phase gazeuse avec, pour la première fois, un focus
sur des molécules polyanioniques. Le couplage spectroscopie optique / spectrométrie de
masse a été développé entre des lasers OPO UV visible et deux spectromètres de masse : un
piège linéaire et un piège 3D. Dans les expériences présentées dans ce manuscrit, les
molécules sont isolées en phase gazeuse au centre du piège puis irradiées par le faisceau laser.
Pour les molécules polyanioniques, le canal de relaxation principal après excitation laser est
l'émission d'électron. Cette perte d'un électron conduit à la formation d'un ion radicalaire.
Une partie de ce travail a été consacrée à l'étude de la relaxation des molécules
polyanioniques après excitation laser et notamment aux mécanismes conduisant à la perte
d'électron. Ces expériences montrent un processus monophotonique en deux étapes. La
première est une excitation électronique résonnante et la deuxième est le croisement de l'état
électronique excité avec un état ionisant suivi du détachement d'électron. Ces expériences de
photodétachement réalisées à Lyon ont été complétées par des expériences de spectroscopie
de photoélectron effectuées à Karlsruhe (Pr. Kappes) qui permettent notamment une mesure
de l'énergie de liaison des électrons.
Des expériences sur des protéines très chargées devraient être réalisées prochainement à
Karlsruhe. Ces expériences permettraient de comprendre l'évolution des énergies de liaisons
et des barrières coulombiennes avec l'état de charge dans un système fortement chargé et donc
de comprendre la relation entre l'état de charge de la molécule et sa conformation.
L'un des objectifs de ce travail de thèse a été d'étudier la réactivité des ions radicalaires
formés par photodétachement d'électron. Nous avons vu que les mesures cinétiques peuvent
être des sondes indirectes de la localisation de l'éjection de l'électron. Nous avons aussi
montré que la fragmentation des radicaux est spécifique avec des fragments de type a et x et
que d'un point de vue structurale, elle est souvent plus informative que la CID. Cette méthode
de dissociation a été utilisée sur des phosphopeptides avec succès et des expériences sont en
163
cours sur des peptides contenant des modifications post traductionnelles sur d’autres acides
aminés que la tyrosine. Une des perspectives de ce travail est également l'analyse top-down de
protéines par EPD.
En parallèle, nous avons aussi mis en place une stratégie utilisant la photodissociation
UV (UVPD) en mode positif pour identifier les phosphotyrosines dans des peptides. Ici,
l’objectif à plus long terme, serait de mener une étude différentielle de l’état de
phosphorylation de cellules tumorales humaines selon qu’elles seraient stimulées ou non par
des facteurs de croissance.
Un autre objectif de mon travail de thèse était d'évaluer la possibilité de réaliser des
expériences de spectroscopie sur des systèmes de grande taille en phase gazeuse. Nous avons
montré que les spectres obtenus pouvaient, malgré l'absence de résolution rotationnelle et
vibrationnelle, être informatif d'un point de vue de la structure et des propriétés électroniques
des ions piégés. Pour cela, nous avons travaillé sur des polyanions et le taux de détachement
d'électron a été enregistré en fonction de la longueur d'onde du laser. De cette manière, nous
avons réussi à enregistrer des spectres sur des peptides et des protéines et obtenu des
signatures optiques de l'état de charge des chromophore présent dans la séquence (neutre,
déprotoné ou radicalaire). Ces résultats ont été comparés à des calculs théoriques (TD DFT).
Par contre, nous n'avons pas réussi à étudier le changement de conformation d'une
protéine en sondant sa réponse optique. Les expériences de spectroscopie devront être
réalisées en parallèle avec des mesures de mobilité. De plus, nous sommes en train de réaliser
des expériences de spectroscopie sur des peptides TrpAlan.
164
Annexe A
Specific UV photodissociation of tyrosyl-containing
peptides in multistage mass spectrometry
Laure Jolya, Rodolphe Antoinea, Michel Broyera, Philippe Dugourda, and Jérôme Lemoineb
aUniversité de Lyon, F-69622, Lyon, France; Université Lyon 1, Villeurbanne; CNRS,
UMR5579, LASIM ; bUMR 5180, Sciences Analytiques;
165
JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY
J. Mass Spectrom. 2007; 42: 818–824
Published online 18 May 2007 in Wiley InterScience
(www.interscience.wiley.com) DOI: 10.1002/jms.1222
Specific UV photodissociation of tyrosyl-containing
peptides in multistage mass spectrometry
Laure Joly,1 Rodolphe Antoine,1∗ Michel Broyer,1 Philippe Dugourd1 and Jérôme Lemoine2
1
2
Université Lyon 1; CNRS; LASIM, UMR 5579, bât. A. Kastler, 69622 Villeurbanne cedex, France
Université Lyon 1; CNRS; Sciences Analytiques, UMR 5180, 69622 Villeurbanne cedex, France
Received 24 November 2006; Accepted 29 March 2007
UV photodissociation (UVPD) at 262 nm has been carried out on protonated tyrosyl-containing peptides
formed by trypsin digestion of apo-transferrin. Under UVPD, the main event is the fragmentation of
the Ca –Cb bond of the tyrosyl residues leading to a radical ion 107 Da below the precursor ion. The
dissociation rate of this specific cleavage appears to be strongly dependent on the peptide sequence and is
more prominent on the singly protonated species than on the doubly protonated state. The fragmentation
spectra resulting from collisional activation of the protonated even-electron native peptides and of the oddelectron radical species prepared by UVPD are dominated by y-type backbone cleavages. A comparison
of their respective y-ion pattern shows complementarities since the combination of both increases the
sequence coverage of the peptide sequence. The specific detection of the neutral loss of 107 Da from
peptides witnesses the content of at least one tyrosyl residue and, though preliminary, is proposed as a
potential new filtering strategy during protein database searching. Copyright © 2007 John Wiley & Sons,
Ltd.
KEYWORDS: UV photodissociation; multistage mass spectrometry; tryptic digest; protein database searching; quadrupole
ion trap
INTRODUCTION
Fragmentation of peptides by mass spectrometry, with the
aim of determining their amino acid sequence, plays a crucial
role in protein identification.1 Most often, the fragmentation
technique uses vibrational excitation through collision activation with a gas (i.e. CAD). In this case, the peptide ion
is excited in a multistep process and dissociates into fragments by cleavage of the weakest bonds, i.e. beside the
C(O)–N peptide bond.2 Other fragmentation techniques use
electronic excitation, and are thought to induce nonergodic
cleavages which are not observed by CAD. For example, electron capture dissociation (ECD)3 generally induces cleavage
of the C˛ –N backbone bond leading to c- and z-type fragment ions. These fragments can alternatively be produced
in a quadripole ion trap device by the electron transfer
dissociation (ETD)4,5 technique. Recently, electron detachment dissociation (EDD)6,7 has also emerged as a powerful
technique to dissociate negatively charged peptides. The
use of these complementary fragmentation techniques can
therefore improve the sequence coverage as well as protein
identification scores.8,9 Similarly, UV-laser-induced dissociation of either protonated or deprotonated peptide ions
involves electronic excitation of the peptides and provides
Ł Correspondence to: Rodolphe Antoine, Laboratoire de
Spectrométrie Ionique et Moléculaire, UMR 5579 Université de
Lyon 1 et CNRS, 43 Bd. du 11 Novembre 1918, 69622 Villeurbanne
cedex, France. E-mail: [email protected]
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd.
fragmentation patterns different from those obtained by
CAD experiments.10 – 16
Irradiation around 260 nm leads to an excitation of
the –electrons of the aromatic residues. Following this
excitation, specific fragmentations, i.e. H atom losses and
C˛ –Cˇ side-chain cleavage of the aromatic amino acid
residues (i.e. Phe, Tyr and Trp), were observed.15 These
fragmentations lead to the formation of radical cations that
can be further activated (UVPD/CAD MS3 ).15,17
In the present work, a more systematic comparison of the
sequence coverage deduced either from CAD-MS2 or from
UVPD/CAD-MS3 experiments was carried out on a mixture
of apo-transferin (TRFE) tryptic peptides. For this purpose,
the gas-phase fragmentation patterns of even-electron [M C
H]C and [M C 2H]2C ions and their odd-electron [M 107 C H]CÐ and [M 107 C 2H]2CÐ counterparts coming from
UVPD-induced tyrosine side-chain loss were compared.
Moreover, the interest of the specific loss of 107 Da as
a discriminating factor during database search was also
evaluated.
EXPERIMENTAL
Chemicals
Apo-transferrin human (TRFE) protein (½97%), salts, buffers,
dithiothreitol (DTT), guanidine hydrochloride and trishydrochloride were obtained from Sigma-Aldrich (SaintQuentin Fallavier, France). Sequencing-grade trypsin was
purchased from Promega (Madison, WI). A mixture of
UVPD of tyrosyl-containing peptides
Figure 1. Schematic diagram of the experimental set up used for UVPD in a linear quadrupole ion trap.
tryptic digest peptides from TRFE was prepared in solution
using the Promega-supplied protocol. Briefly, 10 μg of TRFE
was dissolved in 6 M guanidine HCl, 50 mM Tris-HCl and
2.5 mM DTT. The pH was adjusted to 8 with 1 M HCl.
Protein denaturation was carried out at 60 ° C for 60 min, and
then the guanidine HCl concentration was reduced to 1M by
addition of 50 mM NH4 HCO3 buffer. After addition of 200 ng
of trypsin, the digestion was allowed at 37 ° C overnight and
then stopped by lowering the pH to 4 with formic acid. The
peptides were finally purified on a C18 cartridge and the
fraction eluted by H2 O/CH3 CN/HCOOH 7 : 3:0.1 directly
was submitted to nanospray mass spectrometry analysis.
at least one tyrosyl residues’ (see below), the line ‘comp
(Ł [Y])’ was added to the Mascot sequence query.
RESULTS AND DISCUSSION
Figure 2 displays the full nanospray MS spectrum of the
peptide digest of apo-transferrin human (TRFE) protein
Apparatus
The experimental setup is presented in Fig. 1. CAD
and UVPD experiments were performed using a linear
quadrupole ion trap mass spectrometer (LTQ, Thermo Electron, San Jose, CA, USA) equipped with a nanospray source.
A quartz window was fitted on the rear of the LTQ chamber to
allow the introduction of a UV laser beam. We used the fourth
harmonic ( D 262 nm) of a diode-pumped Q-switched
Nd : YLF laser (CrystaLaser, Reno, NV). The dimensions of
the laser head were 5 ð 18.5 ð 3.6 cm and the output power
at 262 nm was ¾10 mW at a repetition rate of 3 kHz. The
laser was located ¾20 cm at the rear of the LTQ and directly
injected on the axis of the linear trap. For UVPD experiments,
a transistor–transistor logic voltage from the LTQ electronic
board was used to synchronize the laser injection and the
trapping of the ions.
Mascot queries of the experimental peptide mass
fingerprint
Mascot18,19 search using the peptide mass fingerprint of
apo-transferrin human was performed with the following
parameters: one maximum allowed miscleavage; possible
oxidation of methionine as variable modification; no fixed
modification; and a peptide mass tolerance of š0.2 Da
(experimental mass accuracy of the ion trap); taxonomy
mammalians. The search was done on singly charged
monoistopic peptide ions and was performed against the
Swiss-Prot database.20 For peptides identified as ‘containing
Figure 2. Nanospray MS spectrum of the peptides mixture
formed by apo-transferrin digestion by trypsine. Instrumental
settings were optimized to produce mainly singly charged
(a) or doubly charged (b) ions. The squares (triangles) label the
singly (doubly) charged tyrosyl-containing peptides.
J. Mass Spectrom. 2007; 42: 818–824
DOI: 10.1002/jms
819
820
L. Joly et al.
obtained with the source parameters optimized for singly
(Fig. 2(a)) and multiply protonated (Fig. 2(b)) ions. In
Fig. 2(a), among the peaks attributed to TRFE, seven contain
at least one tyrosyl residue ( labeled peaks). The spectrum
in Fig. 2(b) exhibits mainly doubly protonated peptide ions
together with a few singly protonated species. In this
latter condition, the seven peptides containing the tyrosyl
residues are observed concomitantly as singly ( labeled
peaks) and doubly charged (1 labeled peaks) species. We
then systematically recorded UVPD spectra for the seven
tyrosyl-containing peptides for both the singly and doubly
protonated species. As an example, Fig. 3 presents the UVPD
spectrum obtained for the singly protonated tryptic peptide
at m/z 1284 (EGYYGYTGAFR). The UVPD spectrum is
dominated by a loss of 107 Da which originates from the
specific fragmentation of the C˛ –Cˇ bond of the tyrosyl
residues according to Scheme 1.
Hence, the UVPD gives rise to a fragment ion corresponding to an odd-electron species noted [My C nH]nC .
Rate of Ca –Cb tyrosyl side-chain cleavage towards
charge state
the dynamics of proton transfer that occurs just after the
excitation of the peptide and by differences in the secondary
structure between differentially charges peptides.21
UVPD/CAD MS3 vs CAD MS2 spectra
All the radical ions (singly charged [My C H]CÐ and doubly charged [My C 2H]2CÐ ) formed by the tyrosyl sidechain cleavage under UVPD at 262 nm were isolated and
then fragmented by collisional activation (UVPD/CAD-MS3
experiment). The fragmentation patterns were compared to
those obtained by CAD carried out on the even-electron
protonated precursor ion. Figure 5 displays the CAD-MS2
spectra of singly (m/z 1578) and doubly protonated (m/z
789.5) MYLGYEYVTAIR peptide (Fig. 5(b) and (d)) and
UVPD/CAD-MS3 spectra of their corresponding radical
species at m/z 1471 and m/z 736 (Fig. 5(a) and (c)). As
expected, the CAD-MS2 spectra are dominated by y-type
fragment ions,22 which is correlated to the preferred localization of a proton at the arginine at lysine residues, leading
mainly to C-terminal fragment ions. A similar behavior is
observed in the fragmentation pattern of both radical species
([My C H]CÐ or [My C 2H]2CÐ ). This feature was observed for
Figure 4 displays the dissociation rate of the tyrosyl side
chain calculated for the seven tyrosyl-containing peptide
ions after isolation of their singly and doubly protonated
precursor ions. The dissociation rate is strongly chargeand sequence-dependent. For singly protonated peptides,
it tends to decrease as the size of the peptide increases.
The addition of a second proton globally lowers the rate
of tyrosyl side-chain cleavage. This was already observed
for a model pentapeptide (AGWLK) and was explained by
Figure 3. UVPD mass spectrum ( D 262 nm) of isolated singly
protonated peptide 2 using an irradiation time of 3500 ms.
Figure 4. Yield of the tyrosyl side-chain loss induced by UVPD
( D 262 nm) as a function of the charge state for the seven
tyrosyl-containing peptides formed by apo-transferrin
digestion by trypsine. The intensity of the UVPD radical
fragment ion originating from the neutral loss of 107 Da was
normalized relative to the signal intensity of the molecular ion.
The irradiation time for UVPD at D 262 nm was 3500 ms.
Scheme 1. Specific fragmentation of the C˛ –Cˇ bond of the tyrosyl residues.
J. Mass Spectrom. 2007; 42: 818–824
DOI: 10.1002/jms
(a)
(b)
(c)
(d)
Figure 5. Comparison of the dissociation spectra acquired in UVPD/CAD-MS3 and in CAD-MS2 mode on peptide 3. (a) CAD on the
singly protonated odd-electron [My C H]CÐ vs (b) CAD on the even-electron [M C H]C precursor ions. (c) CAD on the doubly
protonated odd-electron [My C 2H]2CÐ vs (d) CAD on the even-electron [M C 2H]2C precursor ions. The irradiation time for UVPD at
D 262 nm was 3500 ms.
the seven tyrosyl-containing peptides as presented in Table 1.
Note that the fragment ions labeled yy correspond to species
whose sequence includes the site where the tyrosyl side
chain has been cleaved. For peptide 3, the y-fragment ion
series restricts unambiguously the UVPD of tyrosyl side
chain at position 2. In contrast, the study of peptide 1 dissociation pathway indicates that the two tyrosyl residues
are subjected to laser fragmentation. A striking difference in
the dissociation behavior is noticed when peptides contain
one missed cleavage (i.e. YLGEEYVKAVGNLR and MDAKMYLGYEYVTAIR). Neutral losses (i.e. H2 O and NH3 ) but
few informative y-fragments are observed in CAD-MS2 , as
illustrated in Fig. 6(b)). This is likely due to the preferential localization of the protons at the arginine and lysine
residues.23,24 On the other hand, CAD of the doubly charged
radical cation [My C 2H]2CÐ generates a more complete pattern of y-ions. This feature might be the consequence of a
decrease in the activation energy barriers associated with ytype cleavages induced by the presence of a reactive radical
site on the peptide backbone.
The sequence coverage deduced from the pattern of ytype ions was calculated for the seven peptides containing
a tyrosyl residue for both dissociation techniques (Fig. 7).
On average, the sequence coverages reach respectively
59 and 61% for the singly and doubly charged ions in
CAD-MS2 conditions, while UVPD/CAD-MS3 leads to 52
and 60%. Interestingly, a complementarity between the
two dissociation techniques has to be noted since some yfragment ions are specific to each of them. Thus, combining
the two patterns of the y-type ion, the sequence coverages
increase to respectively 65 and 74%.
Tyrosine content filter for protein database search
The specific 107 neutral losses from peptides due to
fragmentation of the C˛ –Cˇ bond of the tyrosyl residues
(Scheme 1) might also be used as complementary information
when the peptide sequence deduced from the previous
dissociation is aimed at protein identification by database
search. A total of 32 ion peaks was extracted from the
full-scan MS shown in Fig. 2(a) and served as the input
data for protein database search based on the peptide mass
fingerprint approach using the Mascot search. TRFE is found
at the first rank with a score of 165 using the Mascot search
engine (Fig. 8(a)). When the search is driven considering only
the seven peptides that contain at least one tyrosyl residue
(in this case, all the tyrosyl-containing peptides present in
the peptide mass fingerprint were annotated ‘comp(*[Y])’ in
the Mascot sequence query), a significant high score of 132
is obtained with TRFE still at the first rank (Fig. 8(b)). This
result shows that the specific detection of a tyrosyl residue
within a peptide might be used as a complementary and
useful constraint when the protein database search is based
on peptide sequence information.
CONCLUSIONS
In this work, specific cleavage of the C˛ –Cˇ bond of tyrosyl
residue under UV photodissociation was obtained on a
linear quadrupole ion trap. The rate of this dissociation was
measured on a peptide digest, which showed dependence
on both the peptide sequence and the protonation state of
the ions. Complementary y-type ion series were obtained
between the CAD spectra recorded either on the native
peptide ions or on the radical species created by UVPD.
The crossing over of the two y-fragment patterns resulted
in an increase of the peptide sequence coverage, on average,
of 14%. Interestingly, a preliminary test indicated that the
specific detection of peptides containing at least one tyrosyl
residue among a peptide mixture might constitute an efficient
J. Mass Spectrom. 2007; 42: 818–824
DOI: 10.1002/jms
821
Peptide
number
1
2
3
4
5
6
7
Peptide sequence
YLGEEYVK
EGYYGYTGAFR
MYLGYEYVTAIR
TAGWNIPMGLLYNK
YLGEEYVKAVGNLR
EDPQTFYYAVAVVK
MDAKMYLGYEYVTAIR
y15 ; y12
y13 ; y12 ; y11 ; y10 ; y9 ; y8 ; y7 ; y6 ;
y5 ; y4
y13 ; y8
y13 ; y12 ; y9 ; y8 ; y7 ; y6 ; y5
y11 ; y10 ; y9 ; y8 ; y6
y7 ; y6 ; y5 ; y4 ; y3
y10 ; y9 ; y8 ; y7 ; y6 ; y5 ; y4 ; y3
1C
2C
y12 ; y11 ; y10 ; y9 ; y8 ; y7 ; y6 ; y5 ; y4 ;
y3 ; y2
–
y12 ; y10 ; y9 ; y8 ; y7 ; y6 ; y5 ; y4 ; y3 ;
y2
–
y10 ; y9 ; y8 ; y7 ; y6 ; y5 ; y4 ; y3 ; y2
y7 ; y6 ; y5 ; y4 ; y3 ; y2 ; y1
y9 ; y8 ; y7 ; y6 ; y5 ; y4 ; y3 ; y2
CAD (MS2 )
y
1C
y
y
y
y15 y ; y11 y ; y9 y
y13 ; y12 y
y13 y ; y12 y ; y11 y ; y9 y ; y7 ; y6
y13 y ; y12 y ; y11 y ; y8 y ; y7 y ; y6 y
y7 ; y7 ; y6 , y6 ; y5 ; y4 ; y4 ; y3
y10 y ; y9 y ; y8 y , y7 y ; y7 ; y6 y ; y5 ; y4 ;
y3
y11 y ; y10 ; y8 , y6 ; y5 ; y4
y
y
2C
y12 ; y11 ; y8 ; y6 ; y4 ; y3
y12 y ; y11 y ; y10 y ; y9 y ; y8 y ; y7 y ; y6 ;
y5 ; y4 ; y3 ; y2
y10 ; y10 y ; y9 y ; y7 y ; y7 ; y6
y11 y ; y10 ; y9 ; y8 ; y7 ; y6 ; y5 ; y4 ; y3 ;
y2
y12 y ; y11 y ; y10 y ; y9 y ; y8 y ; y6 y
y
y7 ; y6 ; y6 ; y5 ; y4 y ; y3 ; y2 ; y1
y10 y ; y10 y
y
UVPD/CAD (MS3 )
Table 1. Patterns of y-type fragment ions observed on the CAD-MS2 and UVPD/CAD-MS3 fragmentation spectra recorded on the singly and doubly protonated ions of the seven
tyrosyl-containing peptides formed by apo-transferrin digestion by trypsine. For UVPD/CAD-MS3 fragmentation spectra, the fragment ions labelled yy correspond to species whose
sequence includes the site where the tyrosyl side chain has been cleaved
822
L. Joly et al.
J. Mass Spectrom. 2007; 42: 818–824
DOI: 10.1002/jms
Figure 6. Comparison of the dissociation spectra acquired in
UVPD/CAD-MS3 and in CAD-MS2 mode on peptide 5 which
contains one missed cleavage. (a) CAD on the singly
protonated odd-electron [My C H]CÐ vs (b) CAD on the
even-electron [M C H]C precursor ions. The irradiation time for
UVPD at D 262 nm was 3500 ms.
Figure 7. Pie charts of the average peptide sequence covered
by the y-type fragment ions deduced from the CAD-MS2 ,
UVPD/CAD-MS3 or combination of both experiments,
recorded on (a) singly protonated or (b) doubly protonated
precursor ions.
filter to identify the protein by a database search. The
question arises now whether UVPD and UVPD/CAD-MS3
might be implemented during the coupling of liquid
chromatography to mass spectrometry with a range of
sensitivity that would makes this strategy an alternative for
proteomic analysis. The irradiation time used for the present
study was 3500 ms. With this duration, the characteristic
neutral loss of 107 Da is observed for every tyrosyl-containing
peptide with dissociation rates significantly well above
the background noise. This irradiation time is, however,
obviously still too long for on-line analysis of complex
peptide mixtures. However, it may be shortened by using
a higher power UV laser to enhance the dissociation
rates. Hence, single-shot irradiation and activation times
shorter than to microseconds may be achieved. Finally,
the seven peptides containing at least one tyrosyl residue
were isolated and fragmented starting from a solution
concentration of about 50 fmoles/μl. This range of sensitivity
is intrinsically sufficient for on-line analysis of peptides
provided a higher power UV laser is available. As a
consequence, the UVPD/CAD-MS3 experiment might be
applied to gel-free proteomic analysis. The advantage of
MS3 driven only on the tyrosyl-containing peptides lies in
its efficient database-filtering together with the dramatic
decrease of CAD-MS2 fragmentation spectra to compute
during the classical approach.
Figure 8. Mascot search scores obtained using (a) the peptide mass fingerprint (32 monoisotopic masses) extracted from the
spectrum in Fig. 2(a) or (b) considering only the masses of the seven peptides that contain at least one tyrosyl residue.
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DOI: 10.1002/jms
823
824
L. Joly et al.
Acknowledgements
The authors wish to thank CNRS, Université Lyon 1 and EZUS-Lyon
1 for financial support.
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J. Mass Spectrom. 2007; 42: 818–824
DOI: 10.1002/jms
Annexe B
Optical and structural properties of copper-oxytocin
dications in the gas phase
Laure Jolya, Rodolphe Antoinea, Florian Albrieuxa, Renaud Balliviana, Michel Broyera, Fabien
Chirotb, Jérôme Lemoineb, and Philippe Dugourda
Claudio Grecoc, Roland Mitricd, and Vlasta Bonacic-Kouteckyc
a
Université de Lyon, F-69622, Lyon, France; Université Lyon 1, Villeurbanne; CNRS,
UMR5579, LASIM ; bUMR 5180, Sciences Analytiques;
c
Insitut für Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin, Brook-Taylor-Straße 2, 12489 Berlin,
Germany;
d
Fachbereich Physik, Freie Universität Berlin, Arnimallee, 14, D-14195 Berlin ,Germany
173
J. Phys. Chem. B 2009, 113, 11293–11300
11293
Optical and Structural Properties of Copper-Oxytocin Dications in the Gas Phase
Laure Joly,† Rodolphe Antoine,*,† Florian Albrieux,† Renaud Ballivian,‡ Michel Broyer,†
Fabien Chirot,‡ Jérôme Lemoine,‡ Philippe Dugourd,† Claudio Greco,§ Roland Mitrić,| and
Vlasta Bonačić-Koutecký§
UniVersité de Lyon, F-69622, Lyon, France, Laboratoire de Spectrométrie Ionique et Moléculaire (UMR 5579)
and Sciences Analytiques (UMR 5180), CNRS, UniVersité Lyon 1, F-69622 Villeurbanne, France, Insitut für
Chemie, Humboldt-UniVersität zu Berlin, Brook-Taylor-Strasse 2, 12489 Berlin, Germany, and Fachbereich
Physik, Freie UniVersität Berlin, Arnimallee, 14, D-14195 Berlin, Germany
Downloaded by UNIV CLAUDE BERNARD LYON 1 on September 18, 2009 | http://pubs.acs.org
Publication Date (Web): July 21, 2009 | doi: 10.1021/jp9037478
ReceiVed: April 23, 2009; ReVised Manuscript ReceiVed: June 16, 2009
We present a joint experimental and theoretical investigation of the structural and optical properties of
copper-oxytocin dications in the gas phase. Ion mobility and UV photodissociation experiments were
performed, allowing the investigation of the influence of the Cu2+ ion on the structural and optical properties
of oxytocin. Density functional theory calculations were performed to find low energy structures for the bare
and complexed peptide and to characterize optical spectral features. Copper complexation induces a drastic
change in the structure of the oxytocin peptide. In particular, we predict a 4N chelation of the copper cation
which leads to a contraction of the oxytocin ring. The gas phase lowest-energy structures are compared with
the X-ray crystal structure of the oxytocin molecule bound to its receptor protein. The optical spectrum of
oxytocin complexed with the copper cation displays a global enhancement of the photofragmentation yield
as compared to the one recorded for the doubly protonated oxytocin. Moreover, experimental and calculated
optical spectra of protonated tyrosine have also been determined, since its leading features are present in
oxytocin as well.
I. Introduction
The complexation of metal ions with proteins plays crucial
physiological roles.1,2 In particular, metal ions can enhance the
structural stability of a protein in the conformation required for
biological activity. They take part in catalytic processes of
enzymes and can also influence optical properties of proteins.3,4
The structure, optical properties, and biological function of the
complex are directly related to the binding between the metal
and the protein and may also involve electronic excited states
of the embedded metal.
Metal-oxytocin (OT) complexes have been investigated
intensively as suitable model systems for studying the influence
of metal ions on a peptide conformation. The biological activity
of peptide hormones depends on their structural and conformational properties.5-9 The crystal structure of the OT hormone
complexed with its receptor protein neurophysin has been
determined,10 which has permitted the elucidation of the key
residues that are involved in the hormone-receptor recognition.
Moreover, it was shown that the presence of a divalent transition
metal ion dramatically enhances the binding properties of OT
to its cellular receptor.11 Following this observation, numerous
investigations, in particular potentiometric and photospectrometric studies, were performed on the metal-OT complexes.12-16
The drawback of these experiments is that it is difficult to
characterize the structure, in particular the stoichiometry, of the
complexes which properties are measured and to evaluate the
role of surrounding ions and solvent molecules.
* E-mail: [email protected].
†
Université de Lyon; LASIM (UMR 5579), CNRS.
‡
Université de Lyon; Sciences Analytiques (UMR 5180), CNRS.
§
Humboldt-Universität zu Berlin.
|
Freie Universität Berlin.
Intrinsic chemical interactions can be investigated either
theoretically by using first principle calculations or experimentally by using gas-phase approaches. Mass spectrometry based
techniques have been successively used to transfer transition
metal-OT complexes to the gas phase.17-19 A fundamental
understanding of the structural changes induced in OT by
divalent metal ion coordination has been obtained by coupling
mass spectrometry and ion mobility techniques.20,21 Recently,
we used gas phase UV spectroscopy to evaluate the influence
of copper complexation on the optical spectra of OT peptide
dianions.22 In particular, UV spectra provided a direct diagnostic
of the ionization state of the tyrosine residue in the complex.23
In recent years, density functional theory (DFT) calculations
have provided a reliable description of structural and dynamical
properties of the ground state of different complexes of copper
ions and proteins.24-26 Implementation of the time-dependent
density functional theory (TDDFT) enabled the determination
of absorption properties for fairly large molecules. Alternative
approaches for calculating the ground state electronic structure
and the optical response for metal-protein systems include
semiempirical approaches and the hybrid quantum mechanics/
molecular mechanics (QM/MM) method, with TDDFT for the
QM part.3,27
In the present work, we have performed a joint experimental
and theoretical investigation of both structural and optical
properties of doubly protonated OT and OT complexed with
Cu(II) ions. We used ion mobility measurements and UV
photodissociation experiments. These experimental approaches
permit the investigation of the influence of the Cu2+ ion on the
structural and optical properties of OT. DFT calculations were
performed to find how metal ions affect the peptide conformation. In the example of TyrH+, which is the aromatic amino
acid present in OT, we compared three different theoretical
10.1021/jp9037478 CCC: $40.75 © 2009 American Chemical Society
Published on Web 07/21/2009
11294
J. Phys. Chem. B, Vol. 113, No. 32, 2009
Joly et al.
SCHEME 1: Chemical Structure of OT (Amino Acid Sequence Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH2)
approaches for the determination of absorption spectra: the ab
initio approximate resolution-of-the-identity second order coupled
cluster (RI-CC2),28,29 the Semiempirical ab initio Model 1
(SAM1),30,31 and the density functional linear response TDDFT
approach.32
II. Methods
Sample Preparation. OT, which sequence is given in
Scheme 1, was purchased from Sigma-Aldrich (St. Quentin
Fallavier, France). Copper chloride (CuCl2) is high-purity crystal
grade, and solvents are HPLC grade. The electrospray solution
was prepared by dissolving the peptides (50 μM) and the copper
chloride (200 μM) in a 1:1 mixture of water and acetonitrile.
The addition of 1.5% acetic acid yielded a pH of 3-4. With
these conditions, the [OT + H]+ and [OT - H + Cu]+
monocations and the [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+ dications
were observed in the positive ion electrospray mass spectrum.
Mass Spectrometry and Laser Irradiation of Trapped
Ions. The experimental setup33 consists of a commercial LCQ
Duo quadrupole ion trap mass spectrometer (Thermo Scientific,
San Jose, CA) coupled to a PantherTM optical parametric
oscillator laser pumped by a 355 nm Nd:YAG PowerLiteTM
8000 (5 ns pulse width, 20 Hz repetition rate). Scanning was
performed in the 230-315 nm UV range after frequency
doubling. The vacuum chamber and the central ring electrode
of the mass spectrometer were modified to allow the injection
of the light at the center of the trap. An electromechanical shutter
triggered on the radio frequency (RF) signal of the ion trap
synchronizes the laser irradiation with the trapping of the ions.
The ions are injected into the trap, mass selected, and then laser
irradiated for 60 laser shots. Fragmentation spectra are systematically recorded as a function of the laser wavelength. The
photofragmentation yield is given by ln((parent + fragment)/
parent)/λ/Pl where λ is the laser wavelength and Pl is the laser
power.
Ion Mobility Experiments. We used a custom-built ion
mobility mass spectrometer to measure collision cross sections.
Briefly, ions are formed by electrospray ionization (ESI) and
transferred to the drift tube through an ion funnel and a RF
cylindrical ion trap (CIT). The CIT is used to convert the
continuous beam of ions provided by the source into short pulses
of bunched ions. The ion packets are periodically injected into
a 1 m long drift cell filled with 11.6 Torr of helium and
maintained at 293 K. Ions are pulled through the cell under the
influence of a weak direct current (DC) electric field. A second
ion funnel is used to focus the diffuse ion packet at the exit of
the drift tube. Ions exit this second ion funnel into a vacuum
chamber through a 0.7 mm diameter aperture and are conveyed
into the quadrupole time-of-flight mass spectrometer (micrOTOFQ, Bruker) by a series of two ion funnels and detected
as a function of their arrival time. The ion mobility and
ion-helium collision cross section are deduced from the ion
arrival time distributions (ATDs) recorded at different drift cell
voltages. Experiments were calibrated using the published cross
section value for bradykinin ions.34 The experimental precision
on the cross section is estimated to ∼2%. The width of ATDs
was in agreement with the width expected for a single averaged
ion structure35 and led to a resolving power of t/Δt ) 25 (where
t is the drift time and Δt is the width of the peak at half height).
Experimental drift time was in the order of 44 ms for a drift
voltage of 820 V.
Computational Methods. The search for geometries of
doubly protonated OT [OT + 2H]2+ and its complex with copper
[OT + Cu]2+ has been carried out using simulated annealing
in the framework of semiempirical molecular dynamics (MD)
simulations. The standard AM1 parametrization36 has been used
for the organic part, while for copper the AM1d set of
parameters has been employed.37 The annealing procedure has
been carried out starting at T ) 1500 K and gradually cooling
the system down to T ) 300 K. The structures obtained in this
way were subsequently reoptimized at the DFT level using the
BP86 functional38,39 and TZVP atomic basis sets.40 The character
of stationary points has been checked by the analytic frequency
calculations. The absorption spectra have been calculated using
TDDFT employing the 6-31G** basis set and the hybrid B3LYP exchange-correlation functional.41,42 Since TyrH+, [OT +
2H]2+, and [OT + Cu]2+ are extended systems in which longrange charge transfer (CT) excitations can take place, we have
checked the reliability of the TDDFT results by calculating the
Λ-index introduced by Helgaker et al.43 This parameter probes
the modulus of the spatial overlap between occupied and virtual
orbitals involved in the given electronic transition. Small
Λ-values indicate a low overlap and therefore large long-range
CT character. According to the test calculations, in these cases
the transition energies are significantly underestimated indicating
the failure of the TDDFT. To illustrate this, we calculated
absorption patterns for TyrH+ using the RI-CC2 and SAM1
methods and compared them with the TDDFT results.
III. Results
A. Structural Properties. We present in Figure 1 the three
lowest energy structures for (a) [OT + 2H]2+ and (b) [OT +
Cu]2+ obtained from DFT calculations together with a schematic
presentation allowing for the discussion of structural properties.
The dihedral angles diagram of the peptide backbone for all
three structures of [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+ shown in
Figure 2 permits the identification of the relative structural
differences between the structures of both species as well as
differences introduced by copper complexation. For [OT +
2H]2+, the three structures differ mainly by the relative
orientations of residue side chains such as Tyr2, Ile3, and Asn5
as well as by the position of CONH2 group in the Gly9 residue,
as can be depicted from Figure 1a. The changes of the backbone
in different structures of [OT + 2H]2+ can be seen from the
left side of Figure 2. For example, differences in the dihedral
angles of Pro7 and Asn5 are more pronounced than for the other
J. Phys. Chem. B, Vol. 113, No. 32, 2009 11295
Copper-Oxytocin Dications
Figure 1. Lowest energy structures obtained from DFT calculations (upper half) and schematic structural presentation (lower half) for (a) [OT +
2H]2+ and (b) [OT + Cu]2+. The relative stabilities of the structures are given in eV in brackets. In the schematic presentation, the legend with color
codes for the residues is given. Bonds defining the 20 member OT ring are represented by thicker lines. Dashed red lines label hydrogen bonds in
(a). Blue dashed lines label the coordination with the copper atom in (b).
residues. The hydrogen bonding patterns of [OT + 2H]2+
structures are very similar since the binding to the same residues
in the OT ring occurs (compare Figure 1a). In fact, three
conserved hydrogen bonds arise among Tyr2, Ile3, Asn5, and
Cys6. Notice that the second and third structures of [OT + 2H]2+
contain an additional hydrogen bond between the protonated
amine group of Pro7 and the amidated C-terminus of the peptide.
For all of the three structures, the side chain of Tyr2 points
away from the hormone ring.
Dramatic change in the conformation of OT occurs by
coordination to Cu(II), as can be seen from Figure 1b. For the
three lowest energy structures, the Cu2+ ion is found to be
chelated by the backbone carbonyl oxygen of the OT ring. For
structure I, the Cu2+ is found to be chelated by three carbonyl
oxygens, while in two other structures (II and III) it is chelated
by four carbonyl oxygens. In structure II, the Cu2+ ion forms a
distorted trigonal bypiramidal complex with four oxygens of
the backbone carbonyls which belong to Tyr2, Ile3, Cys6, and
11296
Joly et al.
Figure 2. Superimposed plot of backbone dihedral angles Φ and Ψ for three structures of [OT + 2H]2+ (left) and for the [OT + Cu]2+ complex
(right). The areas connecting the three structures for each residue are shown using the color code of the legend.
Gly9 and with the N-atom of Cys6 at the distance of 2.43 Å,
indicating weaker interaction. The average of the Cu-O distance
is 2.07 Å which compares well with the sum of copper and
oxygen ionic radii, which is 2.14 Å. The “five-fold” coordination
of Cu2+ with OT in structure II induces closer vicinity of side
chains of Ile3, Gln4, and Asn5 to form a cohesive, contracted
20-member disulfide-containing ring, as can be depicted from
Figure 1b. Because of the key position of Tyr2,10 special
attention has been paid to its side chain orientation relative to
the OT ring. For structures I and III, the side chain of Tyr2
points away from the hormone ring, while for structure II, the
aromatic ring of Tyr2 moves closer toward the top of the OT
ring. Furthermore, for structures II and III the acylic CONH2terminal tripeptide moiety points toward the Cu2+ chelated ring.
This enhances the structural compactness of Cu complexes with
respect to diprotonated OT. The differences in structural
properties of three OT-Cu complexes can be easily seen from
the dihedral angles diagram on the right side of Figure 2. The
main differences are found for Tyr2 and Asn5, while smaller
deviations occur for Gln4. Comparison of the dihedral angle
plots of [OT + 2H]2+ with [OT + Cu]2+ shows that only the
conformations of the Cys6, Pro7, and Ile3 residues do not
undergo considerable changes due to complexation with copper.
In contrast to [OT + Cu]2+ structures, the previously reported
[OT + Zn]2+ structures21 contain octahedrally coordinated Zn2+
ions. Moreover, in [OT + Zn]2+ the N-terminal amine group
behaves as a competitive ligand, while in [OT + Cu]2+ this
group is never coordinated to the copper center. However,
nitrogen-metal bonding interaction also takes place in structure
II of [OT + Cu]2+, but in this case the nitrogen atom of Cys6
is involved in the copper coordination by a weak interaction as
described above.
We calculated the average value of the collision cross sections
for the series of structures obtained during MD runs at 300 K
starting from the lowest-energy structures of [OT + 2H]2+ and
[OT + Cu]2+. Structures were extracted every 100 steps. The
average values correspond to panels of 100 (50) structures for
[OT + 2H]2+ ([OT + Cu]2) along the MD trajectory. For the
cross-section calculation, we used the projection approximation
(PA)44 which treats the atoms as hard spheres. We used 3.5 Å
for the Cu2+ collision radius. Experimental and calculated cross
TABLE 1: Comparison of Experimental and Calculated
Cross Sectionsa
peptide
exp. cross section Ωexp (Å2)
calc. cross section
Ωcalc (Å2)
[OT + 2H]2+
[OT + Cu]2+
246 ( 5
235 ( 5
251.7
234.3
a
See text for details.
sections for [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+ ions are given in
Table 1. A good agreement between experimental and calculated
values is observed. It can be seen that the cross section of [OT
+ Cu]2+ is lower than the one measured for [OT + 2H]2+. This
decrease in the cross section, well-reproduced by the calculations, arises mainly from the contracted structure induced by
the chelation of the copper by the OT ring in OT. Notice also
that the experimental cross section for [OT + Cu]2+ is very
close to the one measured for [OT + Zn]2+ (232 ( 3 Å2),21
indicating that, in the gas phase, both complexes adopt compact
structures with a high coordination of the OT ring.
B. Optical Properties. As already mentioned, OT is a nonapeptide that possesses a tyrosine residue. Tyrosine is an aromatic
amino acid with optical absorption in the near UV range. The
optical properties of [OT + Cu]2+ are the result of several
contributions including transitions localized on the tyrosine residue,
on the “embedded” copper, and of CT excitations among copper,
the peptide backbone, and the tyrosine. Thus, before addressing
the optical properties of the OT peptide with or without complexation with copper, we wish to present the experimental and
theoretical investigations of the optical properties of protonated
tyrosine [TyrH]+. This permits the testing of the robustness of
different theoretical approaches such as ab initio and semiempirical
wave function based methods (RI-CC2 and SAM1) as well as
TDDFT calculations to describe the electronic transitions in the
aromatic amino acid.
a. Optical Properties of [TyrH]+. We first recorded the
photofragmentation yields of protonated tyrosine [TyrH]+ as a
function of the laser wavelength (see Figure 3). The spectrum
for [TyrH]+ is dominated by one band at 275 nm and the
emergence of a second band below 250 nm. The present gas
phase spectrum is very similar to the one recorded in solution45
and in the gas phase for cold protonated tyrosine molecules.46
Figure 3. Calculated absorption spectra for TyrH+ using (a) RI-CC2, (b) TDDFT, and (c) SAM1 methods. The structure is given in insert of (a).
The molecular orbitals involved in leading excitations for transitions at a given wavelength are plotted. The broadening of the lines is simulated by
a Lorentzian function with the width of 10 nm (blue lines).
The experimentally recorded photodissociation spectrum of
[TyrH]+ is compared with the calculated absorption spectra at
the RI-CC2, TDDFT, and SAM1 levels of theory (Figure 3a-c).
For calculations, the tyrosine molecule was protonated on the
NH2 group. The three methods give rise to a transition around
258 nm (RI-CC2), 253 nm (TDDFT), and 251 nm (SAM1),
respectively, characterized by π-π* excitations and short-range
CT. The deviation from the experiment is in all three cases ∼20
nm. For the transition at 253 nm obtained from TDDFT the
calculated Λ-index is 0.6, indicating that the overlap between
the occupied and the virtual orbitals involved in excitations is
reasonably large, and thus only a short-range CT contribution
is present. The TDDFT transition at 271 nm is in agreement
with the wavelength of the experimental band. However, the
Λ-index for this transition is 0.38, indicating a weak overlap
and CT transfer with long-range character (which we have drawn
in the middle part of Figure 3b). Thus, regarding Λ-index value,
a significant underestimation of the transition energy is expected
11298
Figure 4. Experimental fragmentation yields of [OT + 2H]2+ and [OT
+ Cu]2+ ions measured as a function of the laser wavelength.
to occur for this excitation. RI-CC2 should give most reliable
results and is in close agreement with the recent theoretical work
performed for the protonated tyrosine47 but fails to reproduce
accurately the experimental spectra. The semiempirical SAM1
method is obviously missing some states between 200 and 240
nm and fails to reproduce the experimental spectrum, in
particular the emergence of the second band below 250 nm.
b. Optical Properties of [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+.
The experimental photofragmentation yields of [OT + 2H]2+
and [OT + Cu]2+ as a function of the wavelength are presented
in Figure 4. The experimental spectrum for [OT + 2H]2+ is
dominated by one band at 275 nm and the emergence of a
second band below 250 nm. The experimental spectrum for [OT
+ 2H]2+ is very similar to the one observed for the protonated
tyrosine (see Figure 3). This similarity in optical spectra
indicates that the optical properties of [OT + 2H]2+ are mainly
driven by the aromatic tyrosine side chain in the nonapeptide
and that the phenol optical properties in OT are weakly
influenced by the peptide backbone. The fact that the tyrosine
side chain in [OT + 2H]2+ points away from the hormone ring
may prevent strong coupling with the peptide backbone.
The experimental spectrum for [OT + Cu]2+ is dominated
by a monotone increase in the photofragmentation yield below
300 nm. In the 230-300 nm range, the photofragmentation yield
of [OT + Cu]2+ is higher than the one recorded for [OT +
2H]2+. The theoretical spectra of [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+
Joly et al.
obtained from TDDFT suffer from low lying long-range CT
transitions. In the case of [OT + 2H]2+, since the structure is
less compact than in the complex with copper, the long-range
CT character of transitions is expected to be more pronounced.
Therefore, a reliable comparison of the TDDFT results with
the experiment is not possible. This has been confirmed by an
extensive analysis of electronic transitions (not shown) for which
the calculated Λ-index values are not in the validity range of
the TDDFT calculations. On the other hand, the semiempirical
SAM1 method also does not give rise to the appropriate
description due to the minimal basis set used and the significantly reduced number of transitions in the region of interest.
Notice that unfortunately the calculation of optical properties
of [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+ is presently beyond the reach
of the RI-CC2 method.
IV. Discussion
The present results show that the structural properties of OT
are strongly affected by the presence of copper. An important
issue concerns the relevance of the structural changes induced
by Cu2+ on the biological activity of OT and in particular on
its binding properties to its receptor protein. To obtain better
insight into this biological relevance, we have compared the
structures obtained for the [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+ with
the X-ray crystal structure of the neurophysin-OT complex,
called bound OT (PDB code: 1NPO).10 Figure 5 presents the
superposition of the [OT + 2H]2+ structure I (left) and [OT +
Cu]2+ structure II (right) with those of the OT bound to
neurophysin. The superposition gives root-mean-square (rms)
deviations ranging from 2.00 to 2.19 Å for [OT + 2H]2+ and
from 3.17 to 3.72 Å for [OT + Cu]2+, thus showing much larger
deviation due to copper complexation. In Figure 6, we plotted
the dihedral angles diagram of the peptide backbone for the
X-ray 1NPO OT structure. From the rms values and the
comparison of the dihedral angles diagram between bound OT
(Figure 6) and [OT + 2H]2+ and [OT + Cu]2+ (left and right
side of Figure 2, respectively), it is evident that the dihedral
angles of the OT ring are closer to the OT structure for the
[OT + 2H]2+ than for the [OT + Cu]2+ structure. However,
the complexation with the copper induces changes in the
Figure 5. CR-based superposition of the OT X-ray structure (green, PDB code: 1NPO) with the calculated structure I of [OT + 2H]2+ (left) and
structure II of [OT + Cu]2+ (right), in which standard colors for atoms have been used (N, blue; O, red; S, yellow; C, white). Thicker lines label
bonds building the 20-member OT ring.
oscillator strength. The copper dication may also induce shifts
in the electronic transitions, leading to the increase in
absorption in the 230-310 nm range.
V. Concluding Remarks
Copper complexation induces a drastic change in the structure
of the OT peptide. In particular, we predict that Cu2+ ion is
chelated by the carbonyl oxygen of the OT ring, which leads
to a contraction of the OT ring. Furthermore, the Tyr2 side chain
residue points away from the ring, and thus tyrosine orientation
is little affected by the presence of the copper. These structural
changes are well-characterized by the combination of ion
mobility experiments and DFT calculations.
Acknowledgment. We acknowledge the financial support
from the Région Rhône-Alpes (CIBLE 07 016857 01) and the
Humboldt foundation. One of us (M.B.) is a senior professor at
the Institut Universitaire de France.
Figure 6. Plot of backbone dihedral angles Φ and Ψ for the bound
OT X-ray structure together with the color code legend for the seven
residues.
dihedral angles for Asn5 and Tyr2 residues, which are related
to a modification of the orientation of the side chain of these
residues. These two residues also undergo drastic dihedral angles
and side chain changes between free OT and OT bound to
neurophysin.10 In conclusion, copper induces a reorientation of
the Tyr2 and Asn5 side chains. These two residues are key
residues involved in the neurophysin-hormone recognition. This
type of reorientation might explain the increase in the binding
properties in presence of metal dications.
Concerning optical properties (Figure 4), the position of
the bands in the action spectra is weakly affected by the
complexation with the copper cation. A global enhancement
of the photofragmentation yield is the main change upon
complexation with Cu(ΙΙ). A direct interaction between the
metal cation and the chromophore would induce a strong shift
in the absorption spectrum as recently observed for silver
peptide complexes48 and as predicted by calculations (not
shown). This confirms that the tyrosine side chain in OT is
almost always away from the ring (see Figure 1) and thus is
not very sensitive to the presence of copper. The global
enhancement observed for the fragmentation yield of [OT +
Cu]2+ is not completely understood because of the lack of
quantitative theoretical description of the optical absorption.
Several different processes may explain this enhancement.
First, we wish to emphasize that, in the gas phase, we record
photofragmentation spectra and not absorption spectra. A first
explanation may be a different relation between absorption
and fragmentation in the two systems. The rigidity imposed
by the presence of the copper cation to the global structure
of OT and the nature of charges (metal cation versus protons)
may affect the position of and the intersection between the
potential surfaces of the different electronic states and the
dynamics of relaxation. The analysis of the photofragment
peaks in mass spectra shows that the fragments corresponding
to the peptide bond cleavage between Tyr2 and Ile3 (y7 and
y7-17 fragments) are intense and only observed for [OT +
Cu]2+. This difference in relaxation pathways may explain
the different fragmentation yields. The second possible
explanation is a modification of the optical absorption of OT
due to the presence of a chelated divalent metal ion. Indeed,
the presence of the Cu(II) cation increases the overall
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JP9037478
Annexe C
Optical properties of isolated hormone oxytocin dianions.
Ionization, reduction and copper complexation effects
Laure Joly1, Rodolphe Antoine1, Abdul-Rahman Allouche,1 Michel Broyer1, Jérôme Lemoine2, and
Philippe Dugourd1
(1) Université de Lyon, F-69622, Lyon, France; Université Lyon 1, Villeurbanne; CNRS,
UMR5579, LASIM
(2) Université de Lyon, F-69622, Lyon, France; Université Lyon 1, Villeurbanne; CNRS, UMR
5180, Sciences Analytiques
183
J. Phys. Chem. A 2009, 113, 6607–6611
6607
Optical Properties of Isolated Hormone Oxytocin Dianions: Ionization, Reduction, and
Copper Complexation Effects
Laure Joly,† Rodolphe Antoine,*,† Abdul-Rahman Allouche,† Michel Broyer,† Jérôme Lemoine,‡
and Philippe Dugourd†
LASIM, UMR 5579, and Sciences Analytiques, UMR 5180, CNRS et UniVersité Lyon 1, UniVersité de Lyon,
Villeurbanne, F-69622 Lyon, France
Publication Date (Web): May 21, 2009 | doi: 10.1021/jp810342s
ReceiVed: NoVember 25, 2008; ReVised Manuscript ReceiVed: April 23, 2009
Trapped oxytocin (OT) peptide dianions and copper-oxytocin complex dianions are subjected to electron
detachment when irradiated by a UV light. Electron photodetachment experiments as a function of the laser
wavelength were performed on the native disulfide-containing ring oxytocin, the reduced dithiol oxytocin,
and the CuII-oxytocin complex. The electron detachment yield was used to monitor the excited electronic
spectrum of the trapped ions. The spectra can be used as a fingerprint of the ionization state of the tyrosine
chromophore under different structural environments. In gas-phase oxytocin dianion [OT-2H]2-, the tyrosine
is deprotonated while it is neutral for the reduced form of oxytocin [OTSH-2H]2-. Optical spectra for the
copper complex dianion [OT-4H+Cu]2- are in favor of a neutral tyrosine in the complex. A structure with
the metal cation chelated to four deprotonated amide groups is proposed for this complex.
I. Introduction
Oxytocin (OT) is an important peptide hormone involved in
reproductive functions, the primary physiological action of
which is to elicit smooth muscle contraction, and thereby milk
ejection and uterine contraction in mammals.1 It has interesting
structural features including a 20-member disulfide-containing
ring and an acylic CONH2-terminal tripeptide moiety (see
Scheme 1).
The biological activity of peptide hormones depends on their
structural and conformational properties.1-5 In the case of
oxytocin, conformational studies have been combined with
activity studies to obtain better insight into the relationship
between structure and activity.6 The crystal structure of the
oxytocin hormone complexed with its receptor neurophysin
protein has been determined, which has permitted elucidation
of the key residues that are involved in hormone-receptor
recognition.7 Moreover, it was shown that the presence of a
divalent transition-metal ion (usually Zn2+, Ni2+, and Co2+)
dramatically enhances the binding properties of oxytocin to its
cellular receptor.8 Following this observation, numerous studies,
in particular, potentiometric and photospectrometric studies,
were performed on metal-OT complexes.9-13 The drawback
of these experiments is that it is difficult to characterize the
exact structure, in particular, the stoichiometry of the complexes
whose properties are measured.
By bringing such complexes to the gas phase, it is possible
to study complexes with a defined stoichiometry. Electrospray
ionization mass spectrometry has been successfully used for
transfer to the gas-phase transition-metal ions with oxytocin
complexes.14-16 A deep understanding of the structural changes
induced in OT by divalent metal ion coordination has recently
been obtained by coupling mass spectrometry and ion mobility
techniques.17,18 The formation of a square-planar complex in
* To whom correspondence should be addressed. E-mail: rantoine@
lasim.univ-lyon1.fr.
†
LASIM, UMR 5579.
‡
Sciences Analytiques, UMR 5180.
which the transition-metal ion is bound to the neutral N-terminal
amino group and to three deprotonated amide groups (4N
chelation) was proposed.
In this contribution, we use gas-phase optical spectroscopy
to evaluate the influence of the sulfide reduction and of the
copper complexation on the structure of oxytocin peptide
dianions. Trapped oxytocin peptide dianions and copper-oxytocin
complex dianions are subjected to electron detachment when
irradiated by a UV light. The electron detachment yield was
used to monitor the excited electronic spectrum of the trapped
ions. The UV spectra provide a direct diagnostic of the ionization
state of chromophores,19,20 in particular, of the tyrosine residue.21
II. Methods
Sample Preparation. Oxytocin was purchased from SigmaAldrich (St. Quentin Fallavier, France). Copper salt (CuCl2) is
high-purity crystal grade and solvents are high-performance
liquid chromatography grade.
Reduced and Nonreduced OT Solutions. The electrospray
solution for OT was prepared by dissolving the peptide (100
μM) in a 1:1 mixture of water and acetonitrile. The reduction
of the disulfide bridge of OT, leading to the formation of a
dithiol (OT dithiol), was obtained by adding 10 mM dithiothreitol to OT (2 mM) aqueous solution and keeping at room
temperature for 12 h. The electrospray solution for the reduced
form of oxytocin (OTSH) was then prepared by dissolving the
OTSH peptides (100 μM) in a 1:1 mixture of water and
acetonitrile. KOH was added to obtain a final solution at pH
5-6. With these conditions, dianions of the form [OT-2H]2or [OTSH-2H]2- were observed in the negative ion electrospray
mass spectrum.
Copper-OT Complexes. The electrospray solution was
prepared following ref 17 by dissolving the peptides (50 μM)
and the copper salt (50 μM) in a 1:1 mixture of water and
acetonitrile. The addition of 1% NH4OH yielded a pH of 9-10.
With these conditions, both the monoanion [OT-3H+Cu]- and
the dianion [OT-4H+Cu]2- were observed in the negative ion
electrospray mass spectrum.
10.1021/jp810342s CCC: $40.75 © 2009 American Chemical Society
Published on Web 05/21/2009
6608
J. Phys. Chem. A, Vol. 113, No. 24, 2009
Joly et al.
SCHEME 1: Chemical Structure of Oxytocin (amino-acid sequence Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH2)
Mass Spectrometry, Laser Irradiation of Trapped Ions.
The experimental setup22 consists of a commercial LCQ Duo
quadrupole ion trap mass spectrometer (ThermoFinnigan, San Jose,
CA) coupled to a Panther OPO laser pumped by a 355 nm Nd:
YAG PowerLite 8000 (5 ns pulse width, 20 Hz repetition rate).
Frequency doubling allows scanning in the 215-330 nm range.
The vacuum chamber and the central ring electrode of the mass
spectrometer were modified to allow the injection at the center of
the trap of UV and visible lights. An electromechanical shutter
triggered on the RF signal of the ion trap synchronizes the laser
irradiation with the trapping of the ions. The ions are injected into
the trap, mass-selected, and then laser-irradiated for 10 laser shots.
Fragmentation spectra are systematically recorded as a function
of the laser wavelength. The photodetachment yield is given by
ln((parent + fragment)/parent)/λ/Pl where λ is the laser wavelength
and Pl is the laser power.
However, we want to emphasize that the characteristic loss
of 106 Da, which is a signature of the presence of a tyrosil
radical,29 is inhibited when the oxytocin disulfide bridge is
reduced. These differences in neutral loss channels, between
OT and OTSH, may reflect the initial position of the radical that
is obtained after electron loss and may thus be related to different
initial charge location in the peptide (as discussed below).
For OTCu, no additional fragment corresponding to neutral
losses is observed. This inhibition of fragmentation following
electron photodetachment is probably due to an increase in the
dissociation energies caused by a strong coordination of the
copper cation to the peptide.
Electron Photodetachment Yields of the Reduced and
Nonreduced Forms of Oxytocin. Signature of the Ionization
State of Tyrosine. The electron detachment yields measured
for the [OT-2H]2- and [OTSH-2H]2- dianions as a function of
III. Results and Discussion
Photofragmentation Mass Spectra: Electron Photodetachment and Neutral Losses. The mass spectra obtained following
the laser irradiation at 255 nm of the oxytocin dianions in the
nonreduced form [OT-2H]2-, the reduced form [OTSH-2H]2-, and
that complexed with copper [OT-4H+Cu]2- are displayed in Figure
1. The main fragment observed corresponds to the radical oxidized
ion generated by electron detachment from the precursor ion. This
photoinduced charge reduction from the precursor ion is the main
fragment channel observed for the three dianions. Electron loss
was already observed as the main fragmentation channel after UV
excitation in polypeptides and DNA polyanions mass spectra.23-25
In the near UV, the main electron detachment mechanism is a twostep mechanism. The first step is a resonant electronic excitation
of the precursor ion,25-27 which is followed by a delayed electron
emission.28 At 255 nm, the electronic excitation is mainly due to
the ππ* excitations in oxytocin.
For OT and OTSH dianions, some minor fragments are also
observed in the mass spectra (in the m/z range 850-1000 Da).
These fragments correspond to neutral losses arising from the
fragmentation of the oxidized anion. Neutral losses are due to
bond rearrangement processes that follow the photogeneration
of the radical oxidized ion.29 The nature of the neutral losses
depends on the state of reduction of oxytocin. For OT, losses
of 33, 65, and 106 Da are observed, whereas losses of 44 and
70 Da are observed for the reduced form of oxytocin OTSH.
The loss of 106 Da arises from the recombination of the radical
oxygen of the tyrosine side chain residue. The losses of 33 and
65 Da might correspond to the losses of SH• and SSH• radicals,
as also observed in electron capture dissociation experiments.14
We have no clear interpretation for the losses observed for the
reduced form OTSH. The loss of 44 Da might correspond to the
elimination of a •CONH2 radical, for example, by involving in
a first step a hydrogen transfer between the CR5 and a radical
site initially located on the S atom of Cys6, and followed by a
β-γ cleavage of an Asn5 side chain.
Figure 1. Mass spectra obtained after laser irradiation (λ ) 255 nm)
of (a) the doubly deprotonated oxytocin (OT) peptide, (b) the doubly
deprotonated reduced dithiol oxytocin (OTSH) peptide, and (c) the
copper-oxytocin [M-4H+Cu]2- complex (OTCu). The irradiation time
was 500 ms (10 laser shots), and the laser power was (a) 6.2 mW, (b)
3 mW, and (c) 3.3 mW.
Optical Properties of Gas-Phase Oxytocin
Figure 2. Photodetachment yield measured as a function of the laser
wavelength for the doubly deprotonated oxytocin (OT) peptide and the
doubly deprotonated reduced dithiol oxytocin (OTSH) peptide. Dashed
curves are smoothed curves of the experimental data. The irradiation
time was 500 ms (10 laser shots).
the laser wavelength in the 220-325 nm range are shown in
Figure 2. For OTSH, the spectrum displays a monotone increase
in the absorption from around 315-220 nm, with a shoulder
centered around 284 nm. For OT, a different optical spectrum
is obtained. A bathochromic shift is observed with an onset of
the electron detachment yield occurring at 325 nm. Two bands
centered at around 310 and 258 nm are observed. The bathochromic shift, observed between OTSH and OT spectra, is
characteristic of the phenolic-OH deprotonation of the tyrosine
residue in [OT-2H]2- dianions, as already observed for angiotensin dianions21 and as confirmed by time-dependent density
functional theory (TDDFT) calculations.21 The strong bathochromism is due to the destabilization of tyrosine π molecular
orbitals caused by the negative charge on the hydroxyl oxygen.
According to TDDFT calculations, the band at 258 nm is mainly
due to a π-π* excitation of the carbonyl bond and the one at
310 nm is mainly due to a π-π* excitation of the benzyl ring.
The disulfide bridge also contributes to the absorption around
280 and 240 nm.30 For the reduced form of oxytocin, the
resonant electronic excitation above 220 nm is mainly due to a
π-π* excitation of the benzyl ring.
Oxytocin is a peptide without carboxyl groups. The most
acidic group in OT is the Tyr2 side chain.11 The first deprotonation site is then expected to be the OH group of Tyr2. As
discussed above, this is in agreement with the optical spectrum
displayed in Figure 2. The other potential proton donor groups,
the -CONH- backbone amides, the -CONH2 amides of Gln4,
Asn5, and Gly9, and the N-terminal -NH2 amino group, have
significantly higher pKa values. The pKa value of the terminal
amino group is significantly lowered as compared to those of
the other groups31 because of the close vicinity of the disulfide
group. The second deprotonation may then occur at the terminal
amino group. Concerning the reduced form of oxytocin, the
presence of the dithiol renders the OTSH peptide more acidic.
Indeed, pKa values for thiols in peptides range from 9.0 to 9.5.32
Thus, deprotonation of the thiol groups in OTSH comes into
competition with the deprotonation of the phenolic-OH group.
The optical spectrum (see Figure 2) shows that the tyrosine is
neutral in OTSH. The depronations may thus occur on the two
thiol groups, as shown in the following schemes (Schemes 2
and 3). To summarize, the deprotonations in [OT-2H]2- occur
on the phenolic-OH and probably on the terminal amino group,
whereas for [OTSH-2H]2- they occur on the two thiol groups.
Electron Photodetachment Yield of the Copper MetalOxytocin Dianion. The electron detachment yields measured
for the [OT-4H+Cu]2- dianions as a function of the laser
J. Phys. Chem. A, Vol. 113, No. 24, 2009 6609
wavelength in the 220-325 nm range is shown in Figure 3.
The spectrum displays a monotone increase in the absorption
from around 310 to 220 nm, with shoulder patterns centered
around 280 nm and to a lesser extent around 300 nm. The optical
spectrum of the copper-oxytocin complex is very similar to
the one reported for OTSH dianions (see Figure 2). This similarity
may indicate that the tyrosine residue in the [OT-4H+Cu]2dianions is neutral (see next section).
The conformation of the disulfide bridged peptide hormone
oxytocin is ideally suited for metal ion coordination via
deprotonated amide nitrogens.10 It was presently reported that
CuII and NiII form unusually stable square planar complexes
with oxytocin and analogues, with four N coordination (4N
complexes) at pH greater than 6.9,11,12 In these complexes the
metal ion is bound to the neutral N-terminal amino group and
to the nitrogen atoms of three deprotonated amide groups (4N
chelation). A combination of ion mobility and collision induced
dissociation experiments has recently confirmed the formation
of 4N complexes in the gas phase.17 For [OT-3H+Cu]-,
structures with a quasi-square planar Cu2+ center and a
tetradentate ligand (deprotonated amide nitrogen atoms of the
C-terminal residues Cys6, Leu8, and Gly9 along with the
N-terminal amino group) has been proposed. For [OT4H+Cu]2- dianions, a similar 4N chelation structure with a
deprotonated tyrosine would be a possible structure. However,
the present reported optical spectrum for this complex seems
to be in favor of a neutral tyrosine. This suggests an alternative
structure with the metal cations bound to four deprotonated
amide groups as shown in Scheme 4. This type of structure has
already been observed in the bis-biuret complex.33,34 It is
stabilized by electrostatic forces between the cations and
deprotonated amide groups and by the delocalization of the
negative charges on the peptide bonds over the disulfidecontaining ring.
Theoretical Investigation of the Optical Properties of
GlyTyrGlyGlyGly Pentapeptide Complexed with Cu2+. Obviously, not only deprotonation of the tyrosine residue but also
the presence of the copper cation and of the four negative
charges may affect the optical properties of the oxytocin peptide.
Unfortunately, computation of copper oxytocin complex excited
states is still out of reach. To probe these effects at a high level
of theory (TDDFT), we chose a simplified 4N chelation complex
composed of a mimic peptide (GlyTyrGlyGlyGly pentapeptide)
complexed with Cu2+. In the GYGGGCu_A complex, the
tyrosine is deprotonated and three amide nitrogen atoms are
deprotonated. In the GYGGGCu_B complex, the tyrosine is
neutral and four amide nitrogen atoms are deprotonated. The
structures of these two complexes are displayed as insets in
Figure 4. Trial 4N chelation structures were first optimized for
both complexes, at the MM+ force field level. The lowest
energy structures were then reoptimized using the semiempirical
PM6 calculations.35 Single-point calculations were then performed for the GYGGGCu_A and GYGGGCu_B complexes,
at the density functional method (DFT) with the B3LYP hybrid
functional and the 6-31++G** basis set. The GYGGGCu_A
complex is found to be slightly more stable by 44 meV
compared to the GYGGGCu_B complex. Absorption spectra
were obtained from the TDDFT method using B3LYP with
6-31++G** basis set. Although of moderate size, the 6-31++G**
basis set contains diffuse functions and usually enables an
appropriate description of excited states. For the two complexes,
numerous bands with non-negligible oscillator strength are
present in the 240-500 nm range. In fact, the presence of both
the copper cation and the four deprotonations add some
6610
J. Phys. Chem. A, Vol. 113, No. 24, 2009
Joly et al.
SCHEME 2: Proposed Structure for [OT-2H]2-
SCHEME 3: Proposed Structure for [OTSH-2H]2-
contributions to the optical spectra. In particular, the analysis
of orbitals responsible for the transition in the 300-400 nm
range indicates that the calculated transitions are mainly due to
the 4N chelation ring structure and involve orbitals localized
on the copper atom. The analysis of the leading excitations
between occupied and virtual Kohn-Sham orbitals participating
in the intense transition at 367 nm show that excitation occurs
within the 4N chelation structures for the GYGGGCu_B
complex. On the other hand, for the GYGGGCu_A complex, the
analysis of the intense transition at 349 nm shows that the excitation
is mainly due to a charge transfer between the deprotonated tyrosine
and the 4N chelation complex. The GYGGGCu_A complex with
the deprotonated tyrosine displays stronger oscillator strengths in
the 300-400 nm range than the GYGGGCu_B complex with the
neutral tyrosine. In particular, for the GYGGGCu_A mimic
complex, no decrease in the absorption is expected between 300
and 350 nm. Experimentally, we do not observe a significant
absorption in the 300-325 nm range (see Figure 3) with almost
no fragmentation above 310 nm. However, it is difficult to directly
compare the calculated spectra of the mimic peptide copper
complexes with the experimental spectrum of the OTCu complex.
It should also be pointed out that the transition energies for the
states with a long-range charge-transfer character are systematically
too low in the framework of the TDDFT approach.36 Furthermore,
calculations were performed by including only 400 transitions. This
Figure 3. Photodetachment yield measured as a function of the laser
wavelength for the copper-oxytocin [M-4H+Cu]2- complex (OTCu).
The dashed curve is a smoothed curve of the experimental data. The
irradiation time was 500 ms (10 laser shots).
SCHEME 4: Proposed Structure for the OTCu Complex
Figure 4. TDDFT calculation of the optically allowed transitions λ
(in nanometers) and oscillator strengths (fe) for the GYGGGCu_A (a)
and the GYGGGCu_B (b) complexes. The number of transitions
(doublet states) included in the calculation is 400. Broadening of the
lines is simulated by Lorentzian functions with a width of 7 nm. The
lowest energy structures at the DFT level of theory are displayed in
the insets.
Optical Properties of Gas-Phase Oxytocin
truncation leads to an underestimation of the total oscillator strength
below 250 nm. With these reserves, the calculated spectra confirm
that the weak absorption observed for the complex above 300 nm
is in favor of a neutral tyrosine residue in the copper-oxytocin
complex.
IV. Conclusion
We used electron detachment to report the gas-phase electronic excitation spectra of oxytocin dianions under different
structural environments. Experiments provide a clear signature
of the ionization state of the tyrosyl group. For the native
disulfide-containing ring oxytocin, the phenolic-OH group of
tyrosine is deprotonated whereas for the reduced dithiol oxytocin, this group is neutral. The optical spectrum for the
CuII-oxytocin complex dianion is in favor of a neutral tyrosine.
A structure, different from the 4N solution structure, with four
deprotonated amide groups might be adopted by this complex.
This last result highlights the specificity and richness of the
chemistry in the gas phase for metal-ligand systems.37,38 This
new type of chelated structures should now be confirmed by
calculations or further experiments.
References and Notes
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JP810342S
___________________________________________________________________________
TITRE
COUPLAGE SPECTROSCOPIE OPTIQUE / SPECTROMETRIE DE MASSE : PROPRIETES OPTIQUES ET
PHOTOFRAGMENTATION DE BIOMOLECULES
RESUME
Cette thèse présente une étude des propriétés optiques et de la photofragmentation de biomolécules en phase
gazeuse. Les expériences sont effectuées sur un piège ionique quadripolaire couplé avec des lasers UV-Visible
accordables en longueur d'onde. Les molécules sont isolées en phase gazeuse au centre du piège puis irradiées
par le faisceau laser. Pour les molécules polyanioniques, le canal de relaxation principal après excitation laser est
l'émission d'électron. Cette perte d'un électron conduit à la formation d'un ion radicalaire.
Une partie de ce travail est consacrée à l'étude de la relaxation de molécules polyanioniques après excitation
laser et notamment aux mécanismes conduisant à la perte d'électron. Les expériences de photodétachement
réalisées à Lyon ont été complétées par des expériences de spectroscopie de photoélectron effectuées à Karlsruhe
(Pr. Kappes).
La production d'anions radicalaires a un potentiel analytique important. L'un des objectifs de ce travail de thèse a
été d'étudier la réactivité de ces ions radicalaires et de montrer l'intérêt de leur fragmentation pour l'analyse
structurelle de peptides.
L'autre objectif était de sonder les propriétés électroniques de protéines et de peptides en phase gazeuse. Pour
cela, le taux de détachement d'électron a été enregistré en fonction de la longueur d'onde du laser. Nous avons
notamment pu déterminer des signatures optiques pour des chromophores neutres, déprotonnés ou radicalaires au
sein des protéines. Ces résultats ont été comparés à des calculs théoriques (TD DFT).
MOTS-CLES
Spectrométrie de masse, photofragmentation, photodétachement d'électrons, spectroscopie optique, laser UV,
protéine, peptide, TDDFT
___________________________________________________________________________
TITLE
OPTICAL SPECTROSCOPY / MASS SPECTROMETRY COUPLING: OPTICAL PROPERTIES AND
PHOTOFRAGMENTATION OF BIOMOLECULES
ABSTRACT
This manuscript discusses optical properties and photofragmentation of gas phase biomolecules. These
experiments are performed with a quadrupolar ion trap coupled to a UV-visible tunable laser. Molecules are
isolated at the center of the trap, and irradiated by the laser beam. The most intense relaxation channel observed
for multiply negatively charged ions is electron emission. This loss of one electron leads to radical anion
formation.
The first part of this manuscript is dedicated to the study of the mechanisms leading to the electron loss.
Photodetachment experiments performed in Lyon were completed by photoelectron spectroscopy experiments
performed in Karlsruhe (Pr. Kappes).
The radical anion production has an important analytical potential. One of the main objectives of this work was
to study the reactivity of this radical anion and to show the interest of radical fragmentation for the structural
analysis of peptides.
An other objective was to probe electronical properties of gas phase peptides and proteins. The electron
detachment yield is recorded as a function of laser wavelength. We have determinated optical fingerprints for
neutral, deprotonated and radical chromophores localized in the heart of proteins. These results are compared to
computational methods (TD DFT).
___________________________________________________________________________
DISCIPLINE
Physique moléculaire
__________________________________________________________________________
ADRESSE DU LABORATOIRE
Laboratoire de Spectrométrie Ionique et Moléculaire
Unité Mixte de Recherche (UMR 5579) CNRS / UCBL
Domaine Scientifique de la Doua – Université Claude Bernard Lyon1
Bâtiment Alfred Kastler,
43, Bd du 11 Novembre 1918
69622 Villeurbanne, FRANCE

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