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INTRODUCTION Depuis leur découverte par Pfeiffer au siècle dernier (32 )sous le nom d'endotoxines, les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries à Gram négatif n'ont cessé d'être l'objet de recherches pointues. Les LPS contribuent hautement à la virulence de ces germes, ils constituent un facteur primordial dans le déclenchement du processus inflammatoire (32). Ils induisent la libération de cytokines (IL1, TNF) et d'autres médiateurs de la réponse immune par action directe sur les cellules de l'immunité telles que les monocytes-macrophages et les polynucléaires neutrophiles. D'autre part, les endotoxines sont des activateurs polyclônaux des lymphocytes B et peuvent ainsi induire la production d'anticorps anti-LPS qui peuvent être protecteurs. (46) Constituants majeurs de la membrane externe, les LPS sont incriminés dans le choc septique à bactérie à Gram négatif et dans la résistance de ces germes aux agents thérapeutiques courants principalement quand ils proviennent d'infections nosocomiales. C'est dans ce contexte que nous nous sommes proposé d'étudier les LPS de plusieurs souches bactériennes. Par ailleurs, il existe des différences dans la structure du LPS selon le type de colonie (lisse ou rugueuse) formé par la bactérie. Les souches rugueuses , de LPS plus simple sont généralement moins virulentes (7,21) et ont un comportement vis à vis des antibiotiques , différent de celui des souches lisses parentales (55). Notre étude consistera donc à : - réisoler des souches bactériennes de profils d'antibiorésistance et ou de virulence connus, - transformer les formes lisses d'origine en forme rugueuses, - extraire les LPS des deux types de souches (LPSS et LPSR), - caractériser ces LPS par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE), - tenter d'établir une corrélation entre la structure de l'endotoxine et la virulence et ou l'antibiorésistance des souches. 2 I- STRUCTURE EXTERNE DE LA BACTERIE. Au delà de la membrane cytoplasmique, les enveloppes bactériennes sont indispensables à la vie. Elles consistent en : - une paroi rigide nécessaire au maintien de l’importante pression osmotique intracellulaire générée par les fortes concentrations en ions, métabolites et autres macromolécules. - une membrane externe qui surplombe la paroi. La paroi, de par sa rigidité confère sa forme à la bactérie et assure avec l’enveloppe externe, la protection (physique, chimique et immunologique) de la cellule (36). La plupart des bactéries d’intérêt médical sont classées selon l’architecture de leur paroi. La différence dans la structure de cette paroi est révélée par la coloration de Gram (63) - les bactéries à Gram positif apparaissent bleu-violet. - les bactéries à Gram négatif apparaissent rose-rouge. Le mécanisme de coloration de Gram semble lié à l'épaisseur de la paroi et à sa perméabilité. La seule composition chimique de la paroi ne permet pas à priori d'expliquer cette différence de coloration. En effet les champignons levuriformes de structure différente des bactéries à Gram positif se révèlent également Gram positif. L'enveloppe des bactéries à Gram négatif est plus fine que celles des bactéries à Gram positif et est caractérisée par une membrane externe de structure complexe, support de la pathogénie de ces bactéries. 3 I.1. Constituants de l’enveloppe des bactéries à Gram négatif (Figure 1) De l'intérieur vers l'extérieur on distingue : I.1.1. La membrane cytoplasmique (4). - La membrane cytoplasmique est constituée d'une bicouche phospholipidique, dont la perméabilité, très limitée pour les molécules pôlaires, est influencée par la longueur des chaînes et le degré de saturation des acides gras qui la composent - il existe des protéines appelées "perméases" qui sont insérées dans cette double couche hydrophobe et qui facilitent le passage à travers la membrane. - le feuillet externe de la membrane cytoplasmique porte les protéines liant les pénicillines (PBP= penicillin binding protein), protéines cibles de l'action antibiotique des bêta lactamines. L'accés aux PBP est limité chez les bactéries à Gram négatif, du fait de la difficulté de pénétration de leur paroi par les bêta lactamines. I.1.2. L'espace périplasmique (4). L'espace périplasmique est la zone se trouvant immédiatement après le membrane cytoplasmique. Il renferme entre autres substances, les bêta lactamases qui sont des enzymes capables d'hydrolyser les bêta lactamines. Les bêta lactamases, situées stratégiquement sur le passage obligé des bêta lactamines, constituent le mécanisme principal de résistance des bactéries à ces antibiotiques. I.1.3. La paroi. Elle est essentiellement constituée du peptidoglycane ou muréine (52). Il est spécifiquement responsable de la forme et de la rigidité structurale de la bactérie. 4 - C'est un énorme polymère composé de longues chaînes polysaccharidiques constituées de N- acétyl glucosamine et d'acide N- acétyl muramique reliées entre elles par des ponts peptidiques. - Plusieurs enzymes interviennent dans la synthèse du peptidoglycane.Les principales sont : - la transglycosylase, responsable de la formation des chaînes polysaccharidiques. - la transpeptidase, qui permet l'union des chaînes polysaccharidiques entre elles. - la carboxypeptidase qui inhibe l'action de la transpeptidase déterminant ainsi une régulation dans la synthèse du peptidoglycane et donc de son épaisseur (4). - les bêta lactamines agissent en inhibant les transpeptidases : elles se fixent sur ces enzymes cibles (ou PBP) et bloquent la synthèse du peptidogycane. Ceci aboutit à l'arrêt de la croissance puis à la mort de la bactérie. I.1.4. La membrane externe (64). La membrane externe est une structure complexe, plissée, crevassée et ondulée, d'une épaisseur de 75 Å. Comme la membrane cytoplasmique elle est formée d'une bicouche hydrophobe, à la seule différence que la dite bicouche est asymétrique ; les lipides constituant les feuillets internes et externes; étant différents. La membrane externe agit donc comme une barrière de perméabilité sélective, qui empêche l'entrée de substances aussi bien hydrophobes qu'hydrophiles au delà d'une certaine taille. Elle retient en outre les protéines périplasmiques à l'intérieur (4). Du point de vue physiologique, la membrane externe permet à la bactérie de résister aux facteurs de défense de l'hôte tels que le lysozyme ou des protéines leucocytaires très toxiques pour les bactéries à Gram positif. Elle assure la protection des entérobactéries germes commensaux du tractus digestif, contre la dégradation par les sels bilaires ou les enzymes digestives. 5 6 La membrane externe comprend : I.1.4.1. Les phospholipides (64) Les phospholipides sont situés sur le feuillet interne et sont essentiellement constitués de phosphatidyl éthanolamine. Ils sont constitués d'acides gras peu saturés, d'où leur fluidité (1). I.1.4.2. Les lipopolysaccharides (LPS) (52) Les LPS ou endotoxines sont situés sur le feuillet externe de la membrane externe. Comme leur nom l'indique, ils sont constitués d'une partie lipidique et d'une partie polyosidique. A l'opposé des phospholipides, ils constituent la partie externe de la bicouche hydrophobe. Ils forment une couche moins fluide que les phospholipides : d'une part parce que leurs acides gras constitutifs ont un degré de saturation plus important, d'autre part, parce que les chaînes de LPS sont reliées entre elles par des ions Mg2+ ou Ca2+, assurant la stabilité de l'ensemble. I.1.4.3. Les protéines (4) Elles représentent près de la moitié du poids total de la membrane externe. Les principales sont : * Les porines - ce sont des canaux protéiques remplis d'eau permettant le passage de petites molécules hydrophiles à travers la couche phospholipidique et la membrane externe. - Les porines sont indispensables à la survie de la bactérie : elles permettent la diffusion de nutriments essentiels. Il existe une interaction entre porines et LPS. En effet, ces derniers déterminent leurs orientation et exposition à la surface bactérienne. 7 * La muréine - lipoprotéine Elle assure la stabilité de l'ensemble de la membrane externe : elle a pour rôle de mieux ancrer la membrane externe au reste de la cellule. Une de ses extrémités est liée à la surface externe du peptidoglycane, l'autre, lipidique s’insère dans la membrane externe. La particularité fonctionnelle de la membrane externe des bactéries à Gram négatif réside dans la forte sélectivité de la barrière qu'elle constitue. I.2. Les lipopolysaccharides. I.2.1. Définition. Au siècle dernier, Pfeiffer inventa le terme "ENDOTOXINE", pour nommer une substance thermo-stable, biologiquement active, découverte dans le filtrat de culture de bactéries à Gram négatif. (32) L'endotoxine également appelée lipopolysaccharide est un élément constitutif de la paroi de toute bactérie à Gram négatif. C'est un complexe macromoléculaire glucido-lipidoprotéique présentant l'antigène somatique des bactéries de souches lisses. Les mutants rugueux de ces souches ont une endotoxine de structure plus simple (27). En réalité, le terme "endotoxine" désignait à l'époque de sa découverte, une toxine en majorité polysaccharidique, thermostable et retrouvée dans le filtrat de culture sous forme encore liée à la cellule au niveau des protéines de la membrane externe. Ce terme avait donc été choisi par opposition au premier type de toxine connu "l'exotoxine", de nature protéique, thermolabile et retrouvée libre, détachée de la cellule, dans le filtrat de culture. Le lipopolysaccharide proprement dit était donc la substance thermostable, biologiquement active découverte par PFEIFFER. L'ensemble LPS lié aux protéines de la membrane externe formait alors, l'endotoxine. 8 Cependant, il est possible pour simplifier, d'utiliser l'un ou l'autre des 2 termes pour évoquer les propriétés endotoxiques thermostables du LPS, siégeant dans sa portion lipidique (64). I.2.2. Localisation. Les lipopolysaccharides (LPS) constituent la couche lipidique la plus externe de la paroi des bactéries à Gram négatif. Les LPS sont situés sur le feuillet externe de la membrane externe où ils forment une surface lipidique plus rigide que celle classiquement formée par les phospholipides dans les autres membranes (46). Les LPS représentent 40 % de la surface cellulaire ; la membrane externe est asymétrique, en ce sens que tous les LPS se concentrent dans son feuillet externe (64). Le LPS est le produit final d'un processus biosynthétique complexe. Cette synthèse a lieu au niveau de la membrane cytoplasmique où sont assemblés les divers constituants de la macromolécule ; il se produit ensuite une translocation rapide qui transfere irréversiblement le LPS complet sur la membrane externe (64, 47). L'endotoxine est l'élément déterminant de l'interaction de la bactérie à Gram négatif, avec son environnement ; cette fonction est assurée par ses chaînes latérales polysaccharidiques, support de la spécificité antigénique O. Des techniques utilisant la ferritine conjuguée à des anticorps anti LPS et couplés à la microscopie électronique montrent que l'antigène O peut s'étendre sous forme de rubans jusqu'à 150 nm au delà de la paroi (61). I.2.3. Etude immunochimique du LPS. Le LPS est le constituant majeur de la membrane externe des bactéries à Gram négatif (13). C’est un complexe macromoléculaire hétérogène comprenant : - une fraction polyosidique - une fraction lipidique 9 En effet, le microscope électronique permet de visualiser, chez les souches lisses, la structure tridimensionnelle (41) du LPS "complet" qui comporte: - deux couches de polysaccharides - des lipides apôlaires, occupant la zone interne ancrée dans la membrane. Le LPS est lié aux autres constituants de la paroi par des ions bivalents tels que les ions magnésium Mg2+. Ceci explique le fait que des agents chélateurs tel que l'EDTA puissent libérer jusqu'à 50% du LPS total des bactéries à Gram négatif. I.2.3.1. Extraction du LPS. En vue d'isoler et d'étudier le LPS, plusieurs méthodes d'extraction ont été entreprises au niveau de la membrane bactérienne (61). - dans la méthode de BOIVIN, l'acide trichloracétique libère un complexe glucido-lipidoprotéique qui est précipité par l'alcool. - dans la méthode phénol-eau de WESTPHAL - la couche lipoprotéinique est dissoute par le phénol - le LPS passe dans la phase aqueuse (62). Dans la méthode de WESTPHAL, l'extraction est suivie d'une purification par précipitation fractionnée dans l'alcool et par action de nucléases. - Le LPS des souches rugueuses (LPSR) peut être extrait par la méthode de GALANOS, qui utilise un mélange phénol-chloroforme-éther de pétrole.(31) En outre, l'électrodialyse permet d'obtenir des LPSR sous forme de sels de solubilité satisfaisante : après extraction, l'endotoxine donne généralement une structure filamenteuse agrégée difficilement dissociable (61). L'une des premières informations fournies par ces diverses préparations est la taille du LPS qui peut varier de 10 à 200 Kilodaltons. Cette donnée est d'autant plus importante que l'activité biologique du LPS, dont l'étude constitue l'enjeu premier de son extraction, dépend du poids moléculaire de ladite particule. 10 Il régne,en conséquence, une forte hétérogénéité, au niveau des molécules de lipopolysaccharides, au sein d'une même espèce bactérienne.(15) I.2.3.2. Etude immunochimique du LPS. Selon Westphal (62), le LPS obtenu par la méthode phénol eau à partir de bactéries de souches lisses, comprend trois régions : I- les chaînes latérales polysaccharidiques, à spécificité O II- le noyau polysaccharidique de base ou "core oligosaccharide" III- le lipide A (Figure 2) - Les fractions polyosidiques portent les caractéres antigéniques : . O, au niveau des chaines latérales, quand il s'agit de souches lisses (S) . R, au niveau du polysaccharide de base, pour les souches rugueuses (R). Les LPS les plus étudiés sont ceux des entérobactéries, particulièrement ceux des salmonelles. Ainsi, la classification de KAUFFMAN-WHITE permet de distinguer les salmonelles en fonction de la nature de leurs antigénes O et H. (24,28); pour une étude sérologique et biochimique, les régions I et II peuvent être séparées de la région III non hydrosoluble par hydrolyse acide douce, à pH3 (64). I-2-3-2-1- Les chaînes polysaccharidiques à spécificité O. Elles consistent en un polymère antigénique (antigéne O) communément appelé "chaînes latérales", du fait de leur émergence à la surface de la bactérie. L'hydrolyse acide permet d'obtenir ces polyosides en vue d'en étudier la structure. Les chaînes latérales sont composées de séquences oligo-saccharidiques répétitives de 3 ou 4 monosaccharides (64). Chez Salmonella typhimurium, le monomère constituant l'antigéne O est un tétrasaccharide formé de : 11 - galactose - rhamnose - mannose - abequose - Aprés assemblage sur un lipide transporteur, les monomères d'antigéne O se polymérisent. La polymérisation est catalysée par une polymérase. Le géne codant pour cette enzyme se situe sur le locus rfc. Pendant que la polymérisation se poursuit, une fraction du polymère déjà formé est détachée du pool de polymérisation et transférée à une molécule "lipide A-core oligosaccharide" déjà formée. L'enzyme responsable de ce transfert est une ligase, dont le géne codant correspond aux loci rfb T et rfal. Le LPS complet ainsi formé migre par translocation de la surface externe de la membrane cytoplasmique à la membrane externe. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de dodécyl sulfate de sodium a révélé que la distribution des monomères d'antigéne O, dans la molécule de LPS n'est pas uniforme au sein des bactéries à Gram négatif; elle est multimodale et spécifique d'une souche bactérienne (13). Ceci explique le polymorphisme des LPS. En effet, chez Escherichia coli,on connaît 170 formes d'antigéne O (46). De même chez les salmonelles, on distingue 67 facteurs O différents selon la constitution de l'oside terminal des chaînes latérales : c'est à dire la nature et/ou le mode de liaison d'au moins 3 ou 4 sucres. Il existe par conséquent, un lien étroit entre la spécificité antigénique O d'un sérovar de salmonelle et la structure chimique de son LPS (24, 28). - En outre, l'antigéne O constitue un site récepteur, spécifique de certains bactériophages (64). Cette spécificité "bactériophagique" est elle aussi, déterminée par le profil hydrocarboné de la molécule de LPS. 12 - Certaines souches bactériennes perdent l'antigéne O quand elles sont cultivées au laboratoire, dans des conditions particulières. Ce phénomène est le résultat d'une mutation qui affecte soit la synthèse de l'antigène O lui même (mutant rfb) soit la synthèse du coreoligosaccharide (mutant rfa) : l'antigène O, en général, ne se lie pas à un core incomplet (46). Ces deux types de mutants donnent sur gélose, des colonies plates et rugueuses (souches R). I.2.3.2.2. Le noyau polysaccharidique de base ou core oligosaccharide. - Cette région peut être arbitrairement scindée en core interne et core externe (63) -Le core interne est composé de : . acide 2 céto 3 déoxyoctonique (KDO) . heptose . phosphate . pyrophosphate lié à de l'éthanolamine. Le KDO est lié au glucosamine du lipide A. Le core interne est commun à tous les LPS des souches lisses et des mutants rugueux de type Ra. - le core externe comprend : . des hexoses : glucose, galactose, N-acétylglucosamine Toutes les Salmonella ont un core oligosaccharide commun,(Figure 3) lequel différe de celui des Shigella ou des Escherichia. C'est au niveau de la membrane cytoplasmique que le core se forme : ses sucres constitutifs sont additionnés au lipide A de façon séquentielle, pour former l'unité "lipid A-core" auquel viendra se fixer la polymère d'antigéne O (13). Comme le montre le Figure 3, le core des Salmonella est un polysaccharide linéaire. Les mutants R, incapables de synthétiser l'antigéne O ou de franchir l'ensemble des étapes de la synthése du noyau oligosaccharide peuvent être classés en fonction du niveau d'avancement de la synthèse de leur chaîne polysaccharidique : 13 les mutants rugueux "profonds" qui sont incapables de synthétiser le core interne : mutants Re. . les mutants "superficiels" qui ne synthétisent pas le core externe. Par ailleurs, cette mutation revêt un intérêt clinique. En effet, les patients présentant des titres élevés en anticorps anti LPS Re, ont moins de risque de choc et de décès que ceux ayant des taux bas (64). I.2.3.2.3. Le lipide A - pour étudier le lipide A, Lüderitz et coll (29) utilisent des mutants Re, qui sont les formes les plus rudimentaires de LPS . - le lipide A des Salmonelles est constitué d'un squelette de Béta 1-6 diglucosamine auquel se rattachent : des phosphates de longues chaînes d'acides gras (acides laurique, myristique, hydroxymyristique et palmitique...) liés au diglucosamine (13) au niveau de ses groupements hydroxyl et amine. Ces acides gras constituent 60% du poids total de la molécule. - Du fait de sa richesse en acides gras, le lipide A se comporte comme un phosphoglycolipide trés peu soluble dans l'eau. Le KDO améliore l'hydrosolubilité du lipide A et peut en être séparé par hydrolyse acide douce laquelle clive la liaison cétosique. Le lipide A est la partie la plus interne du LPS : il est complétement ancré dans la membrane externe où il se lie à des phospholipides et à des protéines membranaires. La synthèse du lipide A est la première étape de l'élaboration du LPS. Les gènes impliqués sont dispersés, et dans certains cas,associés à des gènes responsables de la synthése d'autres macromolécules. On présume que ceci permet de coupler la biosynthése du LPS à la croissance bactérienne. (1) Le lipide A isolé n'existe pas dans la nature, en tant que précurseur du LPS : au niveau de la membrane cytoplasmique, il se forme un composé précurseur du lipide A, auquel se fixe le KDO : (Lipide A+ KDO = Re LPS), puis les sucres 14 composant le core viennent s'ajouter de façon séquentielle pour former l'unité "Lipide A - core oligosaccharide". Les monomères d'antigéne O préalablement formés dans le cytoplasme et pris en charge par un lipide transporteur passe sur la surface externe de la membrane plasmique où ils se lient à la molécule Lipide A-core (13). II. ETUDE PHYSIOLOGIQUE DU LPS : propriétés biologiques L'endotoxine ou LPS, complexe macromoléculaire comportant une portion lipidique liée de façon covalente à une partie polysaccharidique est responsable de la majorité des effets biologiques liés à l'infection par les germes à Gram négatif. La composante glycolipidique constante du LPS, le lipide A, est le support des propriétés endotoxiniques thermostables. La spécificité sérologique réside dans la portion polysaccharidique variable, qui correspond à l'antigène somatique O des bactéries à Gram négatif. II.1. Propriètés physiopathologique. endotoxiniques thermostables du LPS: L'injection de LPS à l'animal produit des effets variables tels que : la fièvre, le choc fotal, la nécrose tissulaire et des actions intravasculaires et/ou abortives. II.1.1. L'effet pyrogène. Il constitue l'action endotoxinique la mieux connue, car l'homme y est paticulièrement sensible ; la contamnation des liquides de transfusion par les LPS a longtemps été une intrigue. La sensibilité du lapin à cet effet du LPS, en fait l'animal de prédilection pour le contrôle des produits pharmaceutiques injectables à l'homme. Le mécanisme de la réponse fébrile est complexe . Le temps de latence qui la précède a suggéré que l'action du LPS n'était pas directe sur les centres hypothalamiques de régulation de la température ; il existe un médiateur d'origine leucocytaire (monocyte-macrophage) appelé "pyrogène endogène" qui induit la synthèse de prostaglandines hypothalamiques responsables de la fièvre (34). 15 Cette fièvre s'accompagne d'une modification du taux des protéines plasmatiques dites de la phase aiguë de la réaction inflammatoire, à savoir le fibrinogène, la protéine C-réactive, la transferrine etc... II.1.2. L'effet léthal (23). - Le chien et le lapin ont une sensibilité relativement importante à l'effet léthal de l'endotoxine (DL50 = 0,025mg/Kg) - Les oiseaux, comme la plupart des animaux à sang froid sont réfractaires à cet effet. Cependant, l'embryon de poulet est tué par l'injection intraveineuse de très faibles doses d'endotoxine (DL 50 : 0,003 mg/kg) - Les gluco-corticoïdes jouent un rôle important dans la résistance au choc fatal. Il semblerait que l'action hormonale ait lieu sur la perméabilité capillaire. - Un état d'hyperréactivité aux endotoxines s'observe chez la souris quelques jours ou quelques semaines après l'injection de bactéries viables ou tuées comme Bordetella pertussis. Le mécanisme de cette sensibilisation est probablement lié à la prolifération des macrophages et à la stimulation de l'activité phagocytaire qui s'accompagnent d'une augmentation de la résistance aux infections. Par ailleurs, les endotoxines étant des substances antigéniques susceptibles de présenter de nombreuses réactions croisées, certains auteurs ont tenté d'expliquer le choc à bactéries Gram négatif comme étant une réaction d'hypersensibilité. Cependant, de nombreuses thèses attestent qu'il ne s'agit pas d'un processus immunologique. C'est ainsi que KIM et Watson (25) ont démontré la toxicité primaire du LPS chez le porcelet nouveau-né avant même l'ingestion du colostrum. II.1.3. La nécrose tissulaire 16 L'injection intraveineuse de deux faibles doses d'endotoxine, à 24 ou 48 heures d'intervalle, provoque chez le lapin une nécrose rénale bilatérale aboutissant à la mort : c'est la réaction généralisée de SCHWARTZMAN. La réaction localisée de SCHWARTZMAN est quant à elle, le résultat d'une probable action locale d'adrénaline. Elle consiste en une lésion hémorragique de la peau, au lieu d'injection : le lapin est sensibilisé par une première dose intradermique avant de recevoir, 24 heures plus tard, une seconde dose intraveineuse. II.1.4. Les manifestations vasculaires Ceux ci sont essentiellement : - l'hypotension artérielle qui conduit à une congestion des organes. - l'activation de la coagulation sanguine : à cet effet des LPS coopèrent les plaquettes, les leucocytes et le complément (34) II.1.5. L'action abortive Elle s'observe chez la souris gestante. On l'attribue à une libération de sérotonine par les plaquettes, suite à une injection de LPS. II.1.6. Actions diverses Le LPS est en outre responsable de troubles mineurs tels que : - leucopénie - troubles du métabolisme (du glucose notamment), par atteinte du foie (32) - augmentation de la sensibilité à l'adrénaline. (23) Il est à noter par ailleurs, que le peptidoglycane possède des propriètés "Endotoxin-like" anciennement connues, et non imputables à une contamination par l'endotoxine; le peptidoglycane pouvant être extrait de la paroi des bacilles à gram positif, indemne de LPS. II.2. Propriétés immunologiques du LPS. II.2.1. La spécificité sérologique (46). 17 - Elle réside dans la portion polysaccharidique variable du LPS qui correspond à l'antigéne somatique O des souches lisses ou à la partie externe du core oligosaccharide des souches R. - L'injection de bactéries à Gram négatif ou de LPS à un animal induit la production d'anticorps dirigés contre les déterminants polysaccharidiques. - L'antigéne O est hautement immunogénique. Cependant, l'immunogénicité diminue considérablement ou s'annule quand, il est séparé du lipide A. L'antigéne O se comporte donc comme un haptène dont l'activité immunologique nécessite l'effet adjuvant du lipide A ou d'une protéine, quand il s'agit de l'antigène O préparé par hydrolyse acide du LPS. L'antigène O est un antigène thymo indépendant, c'est à dire qu'il donne une réponse anticorps en l'absence de cellules T. Les complexes antigène-anticorps formés activent ensuite le système complément en se fixant à son composant C1q (voie classique) aboutissant à la lyse, cellulaire ou à la phagocytose. Les anticorps produits sous l'effet du LPS sont essentiellement de nature IgM. Il peut également s'agir d'IgA, c'est le cas lors d'immunisation par Salmonella enteritica (serovar typhi), ou d'IgG. Les raisons de la stimulation préférentielle d'IgM restent encore inexpliquées. -Tous ces anticorps sont protecteurs mais la protection conférée par les IgM est 1000 fois plus effective, cet anticorps étant plus apte à provoquer la lyse. Ceci a pu être démontré par l'utilisation d'anticorps monoclônaux. - Théoriquement, les anticorps dirigés contre des portions actives du LPS donnent lieu à des réactions croisées anti-LPS et protectrices, lors d'infections systémiques à bactéries à Gram négatif diverses. (32) Ce phénomène est accentué chez les souches R, chez lesquelles la spécificité antigénique est pratiquement nulle. - Il existe une tolérance immunologique aux LPS : . une tolérance précoce induite par l'exposition à des doses subléthales de LPS : l'injection est suivie par une réponse qui décroît en 3 à 4 jours et se normalise. Cette 18 tolérance est attribuée à des modifications hématopoïétiques spécifiques et à une diminution de la capacité à produire des cytokines. . une tolérance tardive, durable, Antigéne O spécifique, qui est le résultat de la production d'anticorps anti - LPS. Contrairement à la tolérance précoce, la tolérance tardive est seulement spécifique du LPS inducteur. II.2.2. Mécanisme d'action In vivo des LPS - Quand le LPS est libéré de la surface bactérienne, il se complexe avec des protéines liant le LPS (LBP) telle que la CD 14, avant de se lier à des récepteurs spécifiques des LPS sur les cellules hôtes (monocytes, macrophages ou neutrophiles). Il s'en suit une activation cellulaire. - Les macrophages activés libèrent des cytokines : l'interleukine I (IL1) et le TNF (tumor necrosis factor). Ces deux types de cytokines agissent sur presque toutes les cellules, et augmentent l'expression des gènes impliqués dans le processus inflammatoire. - L'endotoxine stimule également l'immunité humorale. La grande variété des anticorps anti-LPS produits, témoigne de la diversité de structure de l'endotoxine et des particularités des différentes bactéries à gram négatif. II.2.3. Propriétés immunologiques non spécifiques du LPS II.2.3.1. L'effet adjuvant : Il est attribué au lipide A. Il a été démontré en 1956 par Johnson et Coll (19): que le LPS augmente de façon non spécifique la réponse immune à un antigéne administré simultanément. D'autre part, l'endotoxine rompt la tolérance immunologique à un antigène. II.2.3.2. L'effet mitogène sur les lymphocytes B. - L'endotoxine stimule la prolifération de lymphocytes B de souris en provoquant l'augmentation de la synthèse de l'acide désoxyribonucléique (DNA). 19 - L'addition de LPS à une culture de lymphocytes B stimule et leur multiplication et leur différenciation en cellules productrices d'anticorps, pour des antigènes trés différents du LPS. - Cet effet mitogène est conféré par le lipide A. II.2.3.3. Activation du complément Le LPS peut activer le complément par la voie alterne : le composant C3 en association avec des protéines sériques, complexe le lipide A, aboutissant à la lyse. La bactérie est protégée de cette action non spécifique du complément par l'antigéne O. C'est pourquoi, les mutants rugueux y sont plus sensibles. 20 III. LPS ET VIRULENCE BACTERIENNE - Il existe un lien étroit entre la structure du LPS et la virulence d'une souche bactérienne (7, 21). - Les chaînes latérales à spécificité O constituent la région du LPS la plus impliquée dans la virulence. C'est pourquoi les souches rugueuses sont généralement moins virulentes que les souches lisses. - L'antigène O intervient d'abord dans la première phase de l'infection : il constitue un moyen d'attachement à des récepteurs cellulaires. Chez Neisseria gonorrheae, l'antigéne O permet l'adaptation et la translocation de la bactérie à travers la barrière muqueuse (56). Le LPS méningococcique augmente l'invasivté des souches lisses de meningocoques (57). Chez Actinobacillus pleuropneumoniae, les sérotypes ayant un LPS de type lisse adhèrent plus massivement aux anneaux trachéens que les LPS de type intermédiaire (3). - Dans une étape plus tardive, l'antigène O permet à la bactérie d'échapper aux mécanismes de défense de l'hôte. En effet, le complément peut être activé par la voie alterne, par fixation de son composant C3 sur le lipide A. Pour la plupart des germes, cette lyse n'est possible que pour les mutants rugueux : les chaînes latérales à spécificité O bloquent l'accès du complément à la bactérie. - L'importance du LPS lisse pour la virulence des Shigelles a été démontrée avec Shigella sonnei et Shigella flexneri ; Sansonetti a montré que les souches virulentes de Shigella sonnei possédent un plasmide de 120 mégadaltons qui code pour une chaîne latérale à spécificité O. La perte de ce plasmide donne naissance à des souches rugueuses avirulentes (49). 21 - Une étude comparative du LPS de souches virulentes et avirulentes de Shigella sonnei phase I a montré que l'immunisation de souris par les dits LPS induisait une formation de cellules productrices d'anticorps beaucoup plus importante dans le cas où le LPS de la souche virulente était utilisé comme immunogène (39). L'immunogénicité de la souche avirulente était fortement réduite (3 - 4 fois). Cette modification biologique dans la souche avirulente est une conséquence évidente d'une modification dans la structure du LPS (40). - L'antigène O protège donc la bactérie de la lyse. La composition du core oligosaccharide de Aeromonas hydrophila contribue à la résistance du germe vis à vis du complément (30). - Chez Escherichia coli, l'inhibition de la biosynthèse du core polysaccharidique augmente la sensibilité de la bactérie à la phagocytose, à l'activité du complément, et améliore l'élimination du germe de la circulation sanguine de la souris (14). De même, des mutations opérées sur les gènes rfa H et Gal U impliqués dans la synthèse du LPS ont considérablement réduit la sécrétion d'alpha hémolysine, facteur majeur de virulence de Escherichia coli (60). - Une souche rugueuse de Salmonella enterica s. v Choleraesuis n'était virulente qu'après inoculation dans une veine ou dans le péritoine, et non après administration orale : l'antigène O est nécessaire à la survie du germe dans le tractus digestif (16). - En outre, chez les souches lisses (S), l’accès du complément à la bactérie diminue avec l'épaisseur de l'antigène O. 22 IV. LPS ET RESISTANCE BACTERIENNE AUX ANTIBIOTIQUES (4) - Les antibiotiques les plus couramment testés sont ceux appartenant à la classe des Bêta-lactamines. Ces substances ont pour site d'action, les "penicillin Binding - proteins" (PBP) situés sur le feuillet interne de la membrane cytoplasmique. - L'essentiel des résistances à ces antibiotiques a été observé chez les bactéries à Gram négatif (38,53). - En effet, leur membrane externe, comportant des lipopolysaccharides en surface, constitue une barrière hydrophobe pour les bêta-lactamines qui sont des molécules hydrophiles. Dès lors, leur passage occasionnel à travers la membrane n'est possible qu'au niveau des porines, canaux hydrophiles insérés dans la couche hydrophobe. C'est ainsi que l'on explique la résistance intrinsèque d'Eschericha coli à la pénicilline G, à la méticilline et à l'oxacilline et celle de Pseudomonas aeruginosa à la méticilline et à certaines céphalosporines. - D'autre part, l'espace périplasmique des bactéries à Gram négatif est plus étendu que celui des bactéries à Gram positif. Et c'est là que se trouvent les Bêta lactamases, sur le passage obligé de la Bêta-lactamine vers sa cible. Il est à noter en revanche, que les mutants rugueux de souches de bactéries à Gram négatif, perdent une bonne partie de cette fonction de barrière (55). Certains mutants apparaissent même plus sensibles aux antibiotiques hydrophiles (6). - Les mutants rugueux de Proteus mirabilis sont sensibles aux polymyxines B et E alors que les autres souches de P. mirabilis sont résistantes (22). - A des conditions normales de croissance, le mutant LPXA2 de E.coli qui produit des quantités très réduites de lipide A s'avère être très sensible à un certain nombre d'antibiotiques (59) : * les concentrations minimales inhibitrices (CMI) d'antibiotiques hydrophobes tel que la Rifampicine, l'Erythromycine, la Clindamycine et l'Acide fusidique sont 32 à plus de 128 fois plus basses que pour les souches parentales. Pour des antibiotiques peptidiques tels que la Vancomycine et la Bacitracine, les CMI sont respectivement 32 et 256 fois plus basses. 23 V. METHODE D’ETUDE DES LPS (18, 44) - Les LPS sont des macromolécules complexes très hétérogènes. - La caractérisation des LPS des entérobactéries a pu être réalisée après élimination du lipide A par hydrolyse acide douce et fractionnement de la portion polysaccharidique par chromatographie sur gel (colonne Séphadex) (18) - Cette technique a montré la grande diversité dans la composition des chaînes polysaccharidiques, et, qu'une bactérie pouvait présenter à sa surface plusieurs types de lipopolysaccharides. - L'hétérogénéité ne pouvait donc être observée qu’après dégradation des extraits de LPS et fractionnement des LPS ainsi dégradés. - Du fait de la lourdeur et de la durée de cette procédure, il a été adopté une méthode plus simple d'analyse des différents types moléculaires de LPS (S,SR,R) : l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) (18). - La méthode SDS-PAGE date de 1969 et a été initié par WEBER et OSBORN (44). C'est une électrophorèse de zone qui permet de séparer les molécules en fonction de leur taille : ceci aboutit à la caractérisation des molécules par la détermination de leurs poids moléculaires grâce à des marqueurs de taille. . Le gel de polyacrylamide peut avoir une porosité uniforme : la séparation est rapide (2 - 3 heures), mais elle n'est pas excellente, surtout pour les molécules de petite taille, du fait de la diffusion. . Le gel peut aussi être utilisé en gradient de concentration : la résolution est meilleure, mais elle dure plus longtemps (une nuit); - Le SDS est un détergent anionique qui a pour rôle : . d'uniformiser la charge des molécules à séparer et . de solubiliser la molécule de LPS qui est amphipatique. En effet, le SDS se lie au lipide A qui constitue la région hydrophobe du LPS (18). 24 - Les LPS séparés peuvent être détectés par diverses techniques, après avoir retiré le gel de la plaque de verre : . coloration au bleu de coomassie. . coloration au nitrate d'argent. . coloration au bromure d'éthidium. Dans les deux premiers cas, les bandes sont visibles tout de suite après la coloration. Avec le bromure d'éthidium, elles sont visualisés en lumière ultraviolette (λ = 300 nm). Les gels peuvent ensuite être photographiés ou séchés pour la conservation. On peut également les conserver dans un sac plastique à fermeture contenant de l’eau. 25 I : PRESENTATION I - 1 - Cadre de l'étude. Ce travail a été réalisé au laboratoire de Bactériologie-Virologie de l'hôpital Aristide le Dantec de Dakar, situé sur l'avenue Pasteur. Outre son statut de laboratoire de référence pour les MST (maladies sexuellement transmissibles) en Afrique, il abrite plusieurs projets de recherche sur le Virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) et le SIDA (Syndrôme d'Immunodéficience acquise). Au sein du laboratoire sont également entrepris : - des travaux de recherche appliquée ou fondamentale, dans le cadre de Thèses de médecine, pharmacie, chirurgie dentaire, voire de la faculté des sciences. - et des analyses biologiques dans le diagnostic de routine d'infections virales ou bactériologiques. I - 2 - Objectifs du travail - Devant les manifestations particulièrement néfastes des infections à germes Gram négatif, nous nous sommes proposé d'étudier l'endotoxine des dit-germes, incriminée dans leur physiopathologie. - Les grands axes du travail sont : . Le réisolement de souches bactériennes conservées, de profils d'antibiorésistance et ou de virulence connus. . La transformation des souches lisses (S) obtenues, en souches rugueuses (R). . L'extraction des lipopolysaccharides des deux types de souches (LPSS et LPSR). . La caractérisation des LPS par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS - PAGE). 26 . Enfin tenter d'établir une corrélation entre la structure de l'endotoxine et les données que nous possédons sur l'antibiorésistance et ou la virulence des souches respectives. 27 II :Matériel et Méthode II - 1 - Souches Bactériennes Il s'agit : - de souches d'entérobactéries d'origines diverses, isolées au laboratoire, à partir de différents prélèvements : (voir le tableau I) durant la période 1993- 94 . - Salmonelles, au nombre de 20 - Shigelles, au nombre de 33 - Escherichia coli, au nombre de 10 - de souches de Vibrio cholerae isolées lors de la récente épidémie d'Août 1995 à Janvier 1996 au Sénégal, au nombre de 11. Toutes ces souches étaient conservées en tubes Nunc à -70°C. II - 2 - Obtention du matériel à extraire II - 2 - 1 - Matériel : II - 2 - 1 - 1- Souches bactériennes II - 2 - 1- 2- Milieux de culture : - bouillon viande-foie glucosé pour la réactivation des souches et l'extraction des souches lisses - (B.VFG) - gélose Müller - Hinton en boîte pour le réisolement des souches (MH) - bouillon nutritif simple pour la préparation des souches R - (BN) - gélose nutritive simple pour l'isolement des souches R - (GN) NB : voir la composition des milieux en annexe. 28 II - 2 - 1 - 3 - Réactifs : - solution mère de chlorure de sodium à 100 grammes par litre (Nacl 100 g/l) - solution mère de chlorure de lithium à 100 grammes par litre (Licl 100 g/l) - solution mère de D-alanine à 100 grammes par litre (D - Ala 100 g/l) NB : voir la préparation en annexe. II - 2 - 1- 4 - Matériel divers - tubes à hémolyse pour la réactivation des souches. - tubes à essais de 16 ml, avec bouchon pour les bouillons d'extraction. - boîtes de pétri. - étuve à 37°C. - "Hospital Jar" pour la conservation des boîtes de Pétri. - pipette Eppendorf de 1000µl. - embouts stériles de 1000µl. - portoirs pour tubes Eppendorf. - ensemenceurs stériles, anse de platine. II - 2 - 2 - Méthode II - 2 - 2 - 1 - Obtention des souches lisses (S) * Réactivation - sortir la souche conservée à -70°C. - En prélever une petite quantité par grattage avec l'anse de platine et ensemencer un microbouillon viande - foie glucosé. - incuber 24 heures à l'étuve à 37°C. * Réisolement et enrichissement - avec l'anse, repiquer le bouillon (s'il y a eu pousse) sur une gélose MH. - incuber 24 heures à l'étuve à 37°C. 29 * préparation du bouillon d'extraction - le lendemain, prélever une colonie (après avoir vérifié que la culture est pure) et la mettre en culture dans un tube à essai à vis contenant 10 ml de bouillon viande - foie glucosé. - incuber 24 heures à 37°C. II - 2 - 2 - 2 - Obtention des souches rugueuses (R) (6) - une colonie de la boîte MH précédente est repiquée dans un bouillon nutritif préparé comme suit : - dans un tube à essai contenant 9 ml de bouillon nutritif, ajouter 1ml : . de la solution mère de NaCl ou de Li Cl s'il s'agit des Salmonelles ou des Shigelles. . de la solution mère de Nacl s'il s'agit des vibrions . de la solution mère de D-Ala ou de LiCl s'il s'agit de Escherichia coli. On obtient 10 ml de bouillon à une concentration finale de 10g/l. Toutes ces solutions sont stérilisées par autoclavage en même temps que le bouillon nutritif. Les manipulations ont lieu dans un arc stérile, autour de la flamme d'un bec bunsen. l'on * incuber le bouillon à 37°C * durant une période de 10 à 15 jours, repiquer le bouillon tous les 2 à 3 jours sur gélose nutritive contenant 10g/l de Nacl ou de D-alamine pour voir si obtient des colonies rugueuses. * on prélève alors une ou deux colonies R que l'on extrait directement sans ensemencer un bouillon. II - 3 - Extraction des lipopolysaccharides II - 3 - 1 - Matériel II - 3 - 1 - 1 - souches bactériennes : - bactéries en bouillon de culture pour les souches S. - colonies isolées sur gélose pour les souches R. 30 II - 3 - 1 - 2 - Réactifs (17). 1 - Tampon Tris - acétate - EDTA (T.A.E) pour mettre le culot bactérien en suspension. 2 - Solution alcaline de lyse pour lyser les bactéries. 3 - mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25-24-1) pour l'extraction. 4 - Solution d’acétate de sodium 3 M à pH 5,2 pour favoriser la précipitation des LPS. 5 - mélange Tris - HCl 50 mM à pH 8 + acétate de sodium 100 mM 6 - eau distillée 7 - éthanol à 70° pour précipiter les LPS. NB : voir la préparation des réactifs en annexe II - 3 - 1 - 3 - Matériel divers : - tubes Eppendorf de 1,5 ml. - Micropipettes Eppendorf et embouts adaptés. - Vortex pour homogénéiser les suspensions. - Micro centrifugeuse KM 15.200. - Bain-Marie II - 3 - 2 - Méthode C'est la méthode rapide de Nobuo - Kido. (42) II - 3 - 2 - 1 - Principe - Après lyse de la paroi cellulaire, le LPS est extrait par centrifugation en présence d'une solution de phénol - chloroforme; le LPS passe dans la phase aqueuse supérieure qui est recueillie. - Dans cette phase, le LPS est précipité par de l'éthanol en présence d'une forte concentration saline. 31 II - 3 - 2 - 2 - Mode opératoire 1 - Prélever : . 1,5ml de bouillon de culture (souches S) dans un tube Eppendorf ou . 1 colonie (souches R) dans un tube Eppendorf contenant 1,5 ml de bouillon nutritif. 2 - Centrifuger pendant 5 - 10 mn à 16.000 tours/mn. Eliminer le surnageant avec une pipette pasteur 3 - mettre le culot bactérien en suspension dans 100µl de tampon T.A.E. Vortexer, pour avoir une suspension homogène. 4 - ajouter 200µl de solution de lyse Chauffer le mélange pendant 70 mn au bain - marie entre 55 et 60°C. 5 - ajouter 1ml de mélange phénol - chloroforme - centrifuger 10 mn à 16.000 t/mn - recueillir le surnageant dans un 2e tube Eppendorf à l'aide d'une pipette pasteur (éviter la couche blanchâtre de protéines à l'interface). 6 - ajouter au surnageant : . 200 µl d'eau distillée + 50 µl acètate de sodium 3M à pH 5,2 - vortexer 7 - ajouter 2 volumes d'Ethanol à 70° - mélanger par retournements. - laisser précipiter une nuit à - 20°C. 8 - centrifuger - éliminer le surnageant. - resuspendre le précipité dans 200µL de mélange Tris - Hcl 50 mM (pH8) + acétate de sodium 100 mM - vortexer 9 - ajouter 2 volumes d'éthanol à 70° - mélanger par retournements. - relarguer le LPS à -70°C pendant 15 - 20 mn. 10 - centrifuger - éliminer le surnageant - mettre en suspension le culot final de LPS dans 50µl d'eau distillée. Cet extrait peut être conservé à -20 ou -70°C, indéfiniment. 32 II - 4 - Electrophorèse des LPS sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS - PAGE) II - 4 - 1- Matériel II - 4 - 1 - 1 - Réactifs (48) 1 - solution d'acrylamide - bisacrylamide à 30%; - L'acrylamide est un monomère de formule CH2=CH-C-NH2, qui en présence de radicaux libres, se polymérise en longues chaînes. - Le bisacrylamide (plutôt N, N', méthylène bisacrylamide) permet aux chaînes de polyacrylamide de s'entrecroiser pour former un gel. 2 - solution de persulfate d'ammonium (APS) à 30% l'APS fournit les radicaux libres qui permettent la polymérisation. 3 - solution de tétraméthyléne diamine (TEMED) qui accélère la polymérisation en catalysant la libération de radicaux libres à partir de l'APS. 4 - tampon Tris-HCl à pH 8,8 pour la résolution. 5 - tampon Tris-HCl à pH 6,8 pour le regroupement. 6 - tampon Tris-glycine à pH 8,3 pour la migration. 7 - tampon échantillon NB : voir la préparation des réactifs en annexe. II - 4 - 1 - 2 - Matériel divers (Figure 4) - marqueurs de poids moléculaire - cuve électrophorétique verticale (BIORAD). - plaques de verre (8 x 11cm) pour couler les gels. - espaceurs à intercaler entre les plaques pour former des moules. - peignes pour la formation des puits de dépôt. - dispositif de montage. - support de migration. - papier buvard. - tubes Eppendorf pour la préparation des échantillons. - vortex pour homogénéiser les échantillons. - bain - marie. 33 - pipettes graduées et micropipettes. - générateur de tension. II - 4 - 2 - Méthode Méthode de Laemmli (26) modifiée par Tsaï et Frasch (54) II - 4 - 2 - 1 - Principe (8) - Elle consiste en une séparation des molécules de LPS contenues dans l'extrait, en fonction de leur taille : l'échantillon migre à travers le gel de polyacrylamide qui constitue un tamis moléculaire dont les mailles sont déterminées par la concentration de la solution d'acrylamide. - Du SDS est adjoint au gel. C'est un détergent anionique qui se fixe aux différentes molécules et annule leurs charges : la préparation se fait alors, uniquement en fonction de la taille et non de la charge électrique. II - 4 - 2 - 2 - Description de la méthode - C'est une électrophorése verticale, sur minigel : les substances migrent de haut en bas et d'autant plus loin qu'elles sont plus légères. Le LPS complet se localise en général dans la première moitié du gel. - Le système est dissociant (50) . non seulement, l'échantillon est traité avec du SDS (chargé négativement) qui en modifie la charge, mais . il est mis en suspension dans un tampon contenant du Bétamercaptoéthanol (composé à groupement thiol) qui rompt les ponts disulfure. Ceci permet d'étaler les molécules. - La migration se fait selon un mode discontinu l'échantillon traverse deux gels superposés : 34 . un gel de regroupement supérieur dit "stacking gel" qui est plus lâche (à 3%). Il permet le tassement de l'échantillon dans le puit de dépôt en vue d'une bonne séparation en bandes nettes. . un gel de résolution inférieur dit "resolving gel" dont les mailles sont plus serrées (12,5%). A travers ce gel, les LPS ont une hauteur de migration inversement proportionnelle à leur poids moléculaire. - Un générateur de tension connecté au système d'électrophorèse fournit du courant électrique. Les différences de pH entre les deux gels et le tampon de migration créent une différence de potentiel. II - 4 - 2 - 3 - Mode opératoire II - 4 - 2 - 3 - 1 - Montage du système d'électrophorèse - nettoyer 4 plaques de verre (2 grandes + 2 petites) avec de l'alcool à 70°C. - intercaler deux espaceurs (enduits légèrement de vaseline pour améliorer l'étanchéité) de même épaisseur, du côté de la largeur, pour former un moule. - fixer l'ensemble sur l'assembleur en serrant délicatement les vis placer le tout sur le support de montage. - vérifier l'étanchéité du montage en faisant couler de l'eau distillée II - 4 - 2 - 3 - 2 - préparation des gels 1 - gel de résolution à 12,5% . Dans un flacon propre (genre pot de selles), mélanger : - tampon de résolution (Lower buffer), 6ml - Acrylamide - Bisacrylamide à 30% 8,3ml - eau distillée 5,7ml . Au moment de couler, et aprés avoir éliminé l'eau entre les plaques, ajouter rapidement : - APS à 30% - TEMED 80µl 20µl 35 . couler la solution immédiatement avec une pipette de grand volume, jusqu'à 1,5 cm du bord supérieur de la plaque - Eviter les bulles d'air. A l'aide d'une pipette, couvrir la surface du gel avec de l'eau distillée pour le protéger de l'air : l'oxygène gêne la polymérisation. . laisser polymériser le gel 30 à 45 mn à la température ambiante. - 2 gel de regroupement à 3% - Dans un flacon identique, mélanger : - tampon de regroupement (upper buffer) 6,25ml - Acrylamide - Bisacrylamide à 30% 3,75ml - Eau distillée 15ml . Au moment de couler, aprés avoir vidé l'eau recouvrant le 1er gel, ajouter rapidement : - APS à 30% - TEMED 75µl 25µl . couler immédiatement la solution . insérer tout de suite les peignes afin de creuser les puits. II - 4 - 2 - 3 - 3 - préparation des échantillons - pendant que le "stacking gel" se polymèrise, on peut préparer les échantillons. - Dans un tube Eppendorf de 1,5ml, introduire : . eau distillée 20µl . tampon échantillon 20µl . extrait de LPS ou marqueur de poids moléculaire 20µl - Vortexer - chauffer le mélange au bain - marie à 100°C pendant 2 à 3 mn. - Conserver le tube au réfrigérateur (4°C) jusqu'au moment du dépôt. II - 4 - 2 - 3 - 4 - Dépôt des échantillons 36 - quand la polymérisation du "stacking gel" est achevée, retirer les peignes et éponger les restes de tampon contenus dans les puits à l'aide de papier buvard. - Sortir les échantillons du réfrigérateur et les vortexer. - Avec une micropipette, déposer dans chaque puit ( au besoin) 15µl de mélange - Echantillon. II - 4 - 2 - 3 - 5 - Mise en route de la migration - remplir la cuve au 1/4 avec le tampon de migration - transférer les gels sur le support d'électrophorèse aprés avoir nettoyé la partie inférieure des plaques avec du papier buvard pour ne pas gêner le contact du gel avec le tampon de migration. - introduire les gels dans la cuve. - achever de la remplir avec le tampon. Remplir la partie centrale de la cuve avec le tampon de sorte qu'il soit en contact avec la partie supérieure des gels. - refermer la cuve et la connecter au générateur de tension en respectant la pôlarité. - la migration se fait à intensité constante : 45 mA pendant 2 à 3 heures. II - 4 - 2 - 3 - 6 - Arrêt de la migration Quand le front de migration, formé par le bleu de bromophénol contenu dans le tampon échantillon, a atteint l'extrémité du gel, il faut : . arrêter le générateur de tension . sortir les plaques et décoler délicatement les gels pour la détection des bandes. II - 5 - Détection des bandes de LPS II - 5 - 1 - Détection par coloration des gels avec du bleu de Coomassie brillant. 37 II - 5 - 1 - 1- Matériel II - 5 - 1 - 1 - 1- Réactifs - solution de coloration avec bleu de Coomassie brillant. - solution de décoloration sans bleu de Coomassie. NB : voir la préparation des solutions en annexe. II - 5 - 1 - 1 - 2 - Matériel divers - hotte chimique - agitateur rotatif - gants II - 5 - 1 - 2 - Méthode II - 5 - 1 - 2 - 1- Fixation - Coloration 1 - le gel retiré de la plaque est trempé dans le bain de coloration. 2 - la coloration se fait sous agitation lente pendant une heure et trente minutes, sous la hotte. 3 - vider la solution de coloration et décolorer. II - 5 - 1 - 2 - 2- Décoloration 1 - verser la solution de décoloration dans la cuvette. 2 - faire une prédécoloration, sous agitation lente pendant 15 mn - puis jeter ce premier bain. 3 - faire une 2e prédécoloration avec un deuxième bain, pendant 15 mn - puis jeter. 4 - Rajouter la solution de décoloration et laisser décolorer sous agitation lente, toute la nuit. 38 I- Répartition des souches. Notre étude a été effectuée sur un total de 74 souches incluant une série d’Entérobactéries et des Vibrio cholerae isolés lors de la dernière épidémie de choléra d’Août à Décembre 1995, au Sénégal. Les entérobactéries comprenaient : .10 souches de Escherichia coli uropathogènes originaires du sénégal, du togo, et du Niger.(N°s 1s -3s, 1T - 3T, 1N - 4N) .20 souches de Salmonella comportant : .7 Salmonella Typhi (N°S 1-7) .10 Salmonella spp .3 Salmonella enteritidis (N°S 1-3) Les Salmonella spp étaient constituées de : Salmonella Saint-Paul (N°S 1- 2), Salmonella Kentucky (1), Salmonella Bredney (1), Salmonella Goelzau (1), Salmonella spp (N°S 1-5). 33 souches de shigella comportant : 11 souches de Shigelle flexneri (N°S 1-11) 7 souches de Shigella dysenteriae(N°S 1-7) 7 souches de Shigella boydii (N°S 1-7) 8 souches de Shigella sonnei (N°S 1-8) Les Salmonella et les Shigella ont toutes été isolées à Dakar. Les Vibrio cholerae au nombre de 11 ont été isolés de prélèvements provenant de divers endroits du Sénégal.( N°S 1-11) De toutes nos souches, il a été établi des profils d’antibiorésistance et/ou de virulence . 39 Tableau I : Répartition des souches dans notre échantillon Souches Escherichia coli Salmonella Shigella Vibrio cholerae Effectifs n=74 10 20 33 11 Fréquence 13,5% 27% 44,5% 15% II- Profil de virulence des souches. II-1- Profil de virulence des souches de E coli. Le critère de virulence recherché chez nos souches était la sécrétion d’alphahémolysine. Tabaleau II-1 : Sécrétion d’alpha-hémolysine par nos souches de E coli Origine SENEGAL TOGO NIGER Souches de E coli E.coli1 E coli2 E coli3 E coli1 E coli2 E coli3 E coli1 E coli E coli E coli Alpha-hémolysine + + + + + + - Les souches étudiées ont été en majorité sécrétrices d’alpha-hémolysine : -deux souches sur les trois du Sénégal - deux souches sur les trois du Togo - deux souches sur les quatre du Niger. 40 II -2- Profil de virulence des souches de Shigella Sur nos 33 souches de Shigella, 27 soit 82% ont donné un test de Sereny positif, principalement toutes les souches de Shigella boydii. Le test de Sereny consiste en une recherche de Kérato-conjonctivite chez le cobaye après inoculation d’une suspension de culture de shigella au niveau de la conjonctive. Un test de Sereny positif détermine une souche invasive. Tableau II-2 : Résultat du test de Sereny sur les souches de Shigella en fonction de l’espèce. Résultats du test de Sereny / Espèces de shigelles Shigella flexneri (11) Shigella dysenteriae (7) Shigella boydii (7) Shigella sonnei (8) POSITIF Effectif N = 33 8 6 7 6 Fréquence 72,70% 85,70% 100% 75% II-3- Profil de virulence des souches de Vibrio cholerae Nous avons considéré comme critère de virulence la sécrétion d’hémolysine Tableau II-3 : Sécrétion d’hémolysine par nos souches de Vibrio cholerae. Origine DARA MOUSTY NIORO SAINT-LOUIS DAKAR Souches de virulence V. cholerae1 V. cholerae2 V. cholerae V. cholerae4 V. cholerae5 V. cholerae6 V. cholerae7 V. cholerae8 V. cholerae9 V. cholerae10 NAG Hémolysine + + + + + + + + + Une seule des souches étudiées était sécrétrice d’une hémolysine 41 III - Profil de sensibilité des souches III-1- Profil de sensibilité des souches de Salmonella Tableau III-1 : Sensibilité de nos souches de Salmonella Souches de Bêta Salmonella lactamase S. spp1 S. Kentucky S. Typhi2 S. Typhi3 S. Typhi409 S. Typhi5 S. Typhi6 S. Typhi7 + + + + - ANTIBIOTIQUES AMP R R S S R S S S AMX R R R R R R R R AMC R R R R R R R S CRO S R R S R R R R CFZ S S S S S R R R CTX R R R R R R R R Les souches testées ont toutes été résistantes à la céfotaxime et à l’amoxicilline III-2 Profil de sensibilité des souches de E coli Tableau III-2 : Sensibilité des souches de E coli d’origine urinaire isolées en milieu hospitalier au Sénégal, au togo et au Niger ORIGINE Souches de E. coli E. coli1 SENEGAL E. coli2 E. coli3 E. coli1T TOGO E. coli2T E. coli3T E. coli1N NIGER E. coli2N E. coli3N E. coli4N ANTIBIOTIQUES AMP R R I R R S R R R S CRO S S S S S S S S S S IPM S S S S S S S S S S STX S R I S R S S S S S ATM S S S S R S S S S S NOR S S S S S S S S S S NI I S S I I I I S S I 42 Toutes nos souches de E. coli, indépendemment de leurs origines étaient sensibles à la CRO, à l’IPM; à la NOR. Seule la souche 2 du Togo était résistante à l’ATM. La STX était inactive sur les souches 2 du Sénégal et du Togo. La souche 3 du sénégal était intermédiaire. Les souches 3 du Togo et 4 du Niger étaient sensibles à l’AMC. La souche 3 du Sénégal était intermédiaire. La NI était totalement efficace contre les souches du Togo et du Niger (sauf la souche 2N) ; de même que sur les souches du Sénégal sauf la souche 1S qui était intermédiare. 43 III-3- Profil de sensibilité des souches de Shigella Tableau III-3 : Fréquence de résistance des souches de Shigella à divers antibiotiques Souches Fréq. des S. flexneri S. S. boydii S. sonnei shigella souches dysenteriae Antibiotique N=11 % N=7 % N=7 % N=8 % N=33 % s 1 9% 0 0% 1 14% 1 13% 3 9% C 4 36% 1 14% 1 14% 1 13% 7 21% TIC 4 36% 1 14% 1 14% 0 0% 6 18% AMC 5 46% 1 14% 5 71% 6 75% 17 52% AMP 3 27% 2 29% 1 14% 0 0% 6 18% AMX 3 27% 1 14% 0 0% 8 100% 12 36% STX 8 73% 7 100% 6 86% 8 100% 29 88% Te Les souches de Shigella ont montré globalement une résistance importante à la tétracycline, en particulier les souches de Shigella dysenteriae et Shigella sonnei. III-4- Profil de sensibilité des souches de Vibrio cholerae. Tableau III-4 : Antribiorésistance des souches de Vibrio cholerae Souches de V.cholerae 0129 R V.C.ogawa1 R V.C.ogawa2 R V.C.ogawa3 R V.C.ogawa4 R V.C.ogawa5 R V.C.ogawa6 R V.C.ogawa7 R V.C.ogawa8 R V.C.ogawa9 S V.C.ogawa10 R V.C.ogawa11 ANTIBIOTIQUES STX R R R R R R R R R R R C R R R R R R R R R R R AMP AMC I I I I I I I I I I I I R R I I I I I I I I OM S S S S S S S S S S S AN S S S S S S S S S S S Fe S S S S S S S S S S S 44 Nous avons noté une résistance généralisée à l’0129 et par conséquent, une résistance croisée à l’association sulfamétazole + triméthoprime. Seule la souche de Vibrio cholerae NAG était sensible à l’0129. Les souches avaient entre autres particularités d’être résistantes au chloramphénicol. IV- Obtention des souches rugueuses. IV-1- Obtention des souches R de Salmonella. Le délai d’obtention des colonies rugueuses variait avec : - la substance introduite dans le bouillon de culture - le gélose de réisolement - la souche elle même. Ainsi, pour Salmonella, la substance la plus efficace était la D-alanine : au bout de 10 jours, le bouillon pour souches R repiqué sur gélose nutritive additionnée de D-alanine a donné après une semaine d’incubation sur la paillasse des colonies rugueuses. Elles étaient géantes, opaques, sèches, à contour régulier ou crénelé et paraissaient ancrées dans la gélose. Sur les 20 souches de Salmonella étudiées : - 14 ont montré une transformation des colonies S en colonies R sur la gélose. - 5 sont demeurées sous forme S quelle que fût la substance utilisée - 1 a conservé la forme intermédiaire S-R, sans évolution. Tableau IV-1 : Différentes formes de colonies obtenues après traitement des souches de Salmonella avec la solution de D-alanine. Formes des colonies Rugueuse (R) Lisse (S) Intermédiare (I) Effectif N=20 14 5 1 Fréquence de formation 70,00% 25,00% 5,00% 45 Tableau IV-2 : Comparaison des aptitudes à la transformation des différentes espèces de Salmonella étudiées. Espèces de salmonella Effectif N=20 Nombre de souches Fréquence de formation formant des colonies R des colonies R n=15 5 33,30% S .typhi 2 13,30% S. enteritidis 8 53,30% S. spp Les souches de Salmonella spp qui incluaient Salmonella Saint-Paul, Salmonella Kentucky, Salmonella bredney, Salmonella goelzau (avaient une plus grande tendance a se dissocier en colonies R que les souches de Salmonella Typhi et Salmonella enteritidis. IV-2 : Obtention des souches R de Escherichia coli. Pour Escherichia coli, au bout de 10 jours d’incubation, la solution de Dalanine n’a induit une transformation que chez 2 souches : elles ont formé des colonies R et le reste des souches est demeuré lisse. Les formes lisses des souches de E .coli se sont transformées difficilement en formes rugueuses. Même après incubation prolongée sur la paillasse, le résultat restait inchangé. IV-3 : Obtention des souches R de shigella. Pour les Shigella, le NaCl a permis d’obtenir des colonies R sur gélose nutritive, pour la grande majorité des souches étudiées . Au bout de 10 jours, on a obtenu sur gélose nutritive « simple » de petites colonies à contours réguliers, plates et sèches. 46 Tableau IV-3 : Formes des colonies obtenues après traitement des souches de Shigella avec la solution de NaCl. Formes des colonies Rugueuse R Intermédiare S-R Lisse S Effectif n=33 25 0 8 Fréquence de formation type de colonie 75,75% 0,00% 24,24% Aucune souche n’a donné de colonies de type intermédiaire S-R. La tendance à la transformation des souches de Shigella a été très importante. Tableau IV-4 : Comparaison des aptitudes à la transformation des différentes espèces de shigella étudiées. Espèces de shigella / Effectif n=33 Sh. flexneri (11) Sh. dysenteriae (7) Sh. boydii (7) Sh. sonnei (8) Nombre de souches formant des colonies R 7 6 5 7 Fréquence de formation des colonies R 63,63% 85,70% 71,40% 87,50% Une seule souche Shigella sonnei et Shigella dysenteriae sont demeurées lisses. Par contre les souches de Shigella flexneri se sont transformées de façon prédominante. IV-4 : Obtention des souches R de Vibrio cholerae Pour les souches de Vibrio , le NaCl s’est révélé plus commode pour la transformation des souches S en souches R : au bout de 12 jours, on obtenait sur gélose nutritive « simple », des colonies très plates, sèches, de contour régulier, présentant quelquefois un aspect fongiforme. Sur les 11 souches de Vibrio étudiées, 3 seulement sont demeurées « S » au delà de la période déterminée pour la transformation. Les 8 autres ont montré sur la gélose, des colonies rugueuses. 47 Tableau IV-5 : Formes des colonies obtenues après traitement des souches de Vibrio cholerae avec la solution de NaCl Formes des colonies Rugueuse R Intermédiare S-R Lisse S Effectif n=11 8 0 3 Fréquence de formation du type de colonie 72,72% 0,00% 27,27% Après les Shigella, les souches de Vibrio sont celles qui ont montré la meilleure aptitude à la transformation. Tableau IV-6 : Comparaison des aptitudes à la transfromation des différentes souches de notre échantillon. Nature des germes / Effectif Salmonelles (20) Vibrions (11) E. coli (10) Shigelles (33) Nombre de souches formant des colonies R 14 8 2 25 Fréquence de formation des colonies R 70,00% 72,7% 20,00% 75,75% 48 V- Profils électrophorétiques des lipopolysaccharides (LPS) des différentes souches. V-1- Evaluation des bandes et détermination de la taille des LPS. La méthode SDS-PAGE permet d’uniformiser les molécules à étudier du point de vue de leurs configurations et de leurs charges. toute différence dans la mobilité au sein du gel résulte d’une différence de taille. Les poids moléculaires correspondant aux diverses bandes obtenues sur gel sont déterminées par comparaison avec le profil observé pour le marqueur de taille en fonction de la distance de migration des protéines composant le marqueur. Détermination du poids moléculaire : 1- Mesurer la mobilité relative (Rf) des différentes protéines du marqueur de taille. Distance de migration de la protéine à partir de l’origine Rf =------------------------------------------------------------------------Distance de l’origine à un point de référence. 2-Tracer la courbe d’étalonnage des poids moléculaires (logarithme népérien) en fonction du rf. 3- Pour une bande donnée, mesurer le Rf et chercher sur la courbe le poids moléculaire correspondant. Le standard Laemmli que nous avons utilisé ne permet pas de détecter des molécules de poids moléculaire supérieur à 200Kd. Ainsi, entre 60 et 95Kd, migrent les lipopolysaccharides à longues chaînes latérales.Au délà de 95Kd, ce sont de très longues chaînes latérales. Il s’agit de LPS de structure compléte, extraits de souche formant des colonies lisses. Entre 60et 50Kd, migrent les LPS de structure intermédiaire, leur chaîne latérale est incomplète. 49 En deçà de 50Kd, se trouvent les LPS de structure rudimentaire, c’est à dire sans chaîne latérale à spécificité 0.Et la chaîne polysaccharidique de base est courte, très courte (Ra------Rd) ou inexistante (Re) (voir figure 3). V-2- Profils électrophorétiques globaux des différentes souches. V-2-1- Souches de Salmonella. L’électrophorèse du LPS des souches lisses de Salmonella a livré un profil global en « échelle » comportant deux à neuf bandes dont un à quatre doublets. Les bandes s’étageaient dans une zone de poids moléculaire allant de 19 à 113Kd. Pour les LPS des souches R, le profil a été moins étalé avec deux à six bandes dont un à deux doublets. Les différentes bandes ayant des tailles allant de 19 à 20Kd. Quatorze formes lisses ont eu un LPS de taille supérieure à 75Kd. Certaines formes R ont livré le même profil que les formes S mères ; cependant les premières bandes de haut poids moléculaire, disparaissaient toujours. 50 Tableau V-1- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 19 souches lisses de Salmonella Classe de poids moléculaire 15 - 35 Kd 35 -55 Kd 55 - 75 Kd 75 -95 Kd 95 - 115 Kd 115 - 135 Kd Effectifs N=19 14 18 17 10 4 0 Fréquence d’apparition 73,68% 94,73% 89,47% 52,63% 21,05% 0,00% La plupart des souches de Salmonella (95 et 90%) ont donné des bandes de LPS : . entre 35 et 55 Kd : chaînes courtes . entre 55 et 75 Kd chaînes peu longues et de type intermédiaire. Aucune souche n’a donné de LPS au delà de 115Kd. Tableau V-2- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 15 souches rugueuses de Salmonella Classe de poids moléculaire 15 - 35 Kd 35 -55 Kd 55 - 75 Kd 75 -95 Kd 95 - 115 Kd 115 - 135 Kd Effectifs N=19 14 15 7 4 0 0 Fréquence d’apparition 93,33% 100% 46,66% 26,66% 0,00% 0,00% Aucune souche n’a donné de bande de LPS au delà de 95Kd. Les bandes de LPS à chaînes très courtes sont apparues prédominantes 51 Tableau V-3- Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à l’électrophorèse des LPS des souches lisses (S) et rugueuses (R) de Salmonella Classe de poids moléculaire Effectifs des souches S=19 15 - 35 Kd 35 -55 Kd 55 - 75 Kd 75 -95 Kd 95 - 115 Kd 115 - 135 Kd 14 18 17 10 4 0 R=15 14 15 7 4 0 0 Fréquence d’apparition chez les souches S R 73,68% 93,33% 94,73% 100% 89,47% 46,66% 52,63% 26,66% 21,05% 0,00% 0,00% 0,00% La comparaison des profils a montré une grande rareté des chaînes longues pour les formes R de Salmonella, et que très peu de souches S ont eu des LPS de plus de 95Kd. V- 2-2- Souches de E. coli Le profil électrophorètique global des LPS des formes lisses a montré un modéle « en échelle » avec un nombre de bandes allant de 3 à 8, incluant 1 à 3 doublets. La taille des bandes variait de: . 76 à 30 Kd pour les souches de Sénégal . 90 à 32 Kd pour les souches du Togo . 81 à 33 Kd pour les souches du Niger Pour les souches rugueuses (R), il était possible de visualiser une ou deux bandes, dont un doublet à 33 Kd. 52 Tableau V-4- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèseb du LPS des 10 souches lisses de E. coli Classe de poids moléculaire 25 - 35 Kd 35 - 45 Kd 45 - 55 Kd 55 - 65 Kd 65 - 75 Kd 75 - 85 Kd 85 - 95 Kd Effectifs N=10 9 8 9 3 9 8 1 Fréquence d’apparition 90% 80% 90% 30% 90% 80% 10% Pour les souches de E.coli, nous avons observé très peu de bandes à chaînes longues entre 85 et 95 Kd (une seule souche sur les dix a présenté une bande) Tableau V-5- Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des formes lisses de E. coli en fonction de leur origine Classe de poids moléculaire 25 - 35 Kd 35 - 45 Kd 45 - 55 Kd 55 - 65 Kd 65 - 75 Kd 75 - 85 Kd 85 - 95 Kd S = Sénégal S=3 2 2 2 1 2 1 0 T = Togo Effectifs T=3 3 3 2 1 3 3 0 N=4 4 4 1 1 4 4 0 Fréquence d’apparition S T N 67% 100% 100% 67% 100% 100% 67% 67% 25% 33% 33% 25% 67% 100% 100% 33% 100% 100% 0% 0% 0% N = Niger V-2-3- Souches de Shigella Globalement, l’électrophorèse des LPS des souches lisses de Shigella livrait un profil en « échelle » de trois à huit bandes, incluant un à cinq doublets.La taille des bandes variant de 25 à 130 Kd pour les souches rugueuses, le profil a été beaucoup plus simple, montrant généralement une à trois bandes dont un doublet. Les bandes avaient des tailles allant de 25 à 60 Kd. 53 Il est arrivé que les souches R (2) livrent le même profil que la souche lisse d’origine. Dans ce cas, ou les bandes de grande taille, ou les doublets disparaissaient. Tableau V-6- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse des LPS de 33 souches lisses de Shigella. Classe de poids moléculaire 25 - 50 Kd 50 - 75 Kd ]75 - 100 ] Kd 100 - 125 Kd 125 - 150 Kd Effectifs N=33 31 29 30 4 1 Fréquence d’apparition 93,93% 87,87% 90;90% 12,12% 3,03% Les souches S en grande majorité (94% ; 91%) ont donné des bandes de LPS comprises: . entre 25 et 55 Kd : chaînes courtes . entre 75 et 100 Kd chaînes longues Seule une souche a donné une bande au delà de 125 Kd. Tableau V-7- :Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 25 souches rugueuses de shigella Classe de poids moléculaire [25 - 50 ] Kd ]50 - 75 Kd] ]75 - 100 ]Kd ]100 - 125 ] Kd ]125 -150] Kd Effectifs N=25 25 3 2 0 0 Fréquence d’apparition 100% 12% 8% 0% 0% Toutes les souches (100% ) ont développé des bandes appartenant à la classe des [25 - 50 Kd]: LPS à chaînes courtes. Seules deux souches ont donné des bandes dans la classe des 75 - 100 Kd. Aucune souche n’a donné de bande au delà de 100 Kd. 54 Tableau V-8- : Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à l’électrophorése des LPS des souches lisses (S) et rugueuses (R) de Shigella Classe de poids moléculaire Effectifs des souches S=33 [25 - 50 ] Kd ]50 - 75 ] Kd ]75 - 100] Kd ]100 - 125] Kd ]125 - 150] Kd 31 29 30 4 1 R=25 25 3 2 0 0 Fréquence d’apparition chez les souches S R 93,93% 100% 87,87% 12% 90,90% 8% 12,12% 0% 3,03% 0% La bande entre 25 et 50 Kd est quasi constante, quelle que fût la forme de Shigella V-2-4- Souches de Vibrion cholerae L’électrophorèse des extraits lipopolysaccharidiques n’a pas montré pour les souches de vibrions un profil en « échelle » comme pour les entérobactéries. Pour les différentes souches on avait deux bandes d’apparition constante: - la première correspondant à un poids moléculaire inclus dans la classe des 65 80Kd. - la deuxième appartenant à la classe des 35 - 50 Kd. Entre ces deux bandes principales, ou quelques fois situées plus bas dans le gel , se trouvaient des bandes moins importantes correspondant à des poids moléculaires allant de 20 à 60 Kd.(Figure 5) 55 Tableau V-9- : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 11 souches lisses de Vibrions. Classe de poids moléculaire 20 - 35 Kd 35 - 50 Kd 50 - 65 Kd 65 80 Kd 80 - 95 Kd 95 - 110 Kd Effectifs N=11 8 11 10 10 1 0 Fréquence d’apparition 72,70% 100% 90,90% 90,90% 9,09% 0,00% L’essentiel des souches a donné des bandes de LPS compris entre 35 - 80 Kd Une seule souche a donné une bande de plus de 80 Kd. Tableau V-10 : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 8 souches rugueuses de Vibrio Classe de poids moléculaire 20 - 35 Kd 35 - 50 Kd 50 - 65 Kd 65 - 80 Kd 80 - 95 Kd 95 - 100 Kd Effectifs N=8 8 8 6 2 0 0 Fréquence d’apparition 100% 100% 75% 25% 0% 0% L’ensemble des formes R (100%) a présenté des bandes comprises entre 20 et 35 Kd : c’étaient des LPS à chaînes polysaccharidiques très courtes ou inexistantes. Deux souches seulement, ont donné des bandes de plus de 65 Kd. 56 Tableau V-11 : Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à l’électrophorèse des LPS des souches S et R de Vibrio Classe de poids moléculaire Effectifs des souches S=11 8 11 10 10 1 0 20 - 35 Kd 35 - 50 Kd 50 - 65 Kd 65 - 80 Kd 80 - 95 Kd 95 - 100 Kd R=8 8 8 6 2 0 0 Fréquence d’apparition chez les souches S R 72,70% 100% 100,00% 100% 90,90% 75% 90,90% 25% 9,09% 0% 0,00% 0% Comme dans le cas des Shigella, nous avons observé une disparition fréquente des bandes de LPS à chaînes très longues. V-3- Profils détaillé des différentes souches (Figure 5) V-3-1- Souches de Salmonella. Tableau VI-1- : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des souches S de Salmonella en fonction de l’espèce Espèces / Classe de poids moléculaire 15 - 35 Kd 35 - 55 Kd 55 - 75 Kd 75 -95 Kd 95 - 115 Kd 115 - 135 Kd Salmonella typhi N=6 5 6 5 1 1 0 % 83,33% 100,00% 83,33% 16,66% 16,66% 0,00% Salmonella enteritidis N=3 % 2 66,66% 3 100,00% 3 100,00% 2 66,66% 0 0,00% 0 0,00% Salmonella spp N=10 7 9 9 7 3 0 % 70% 90% 90% 70% 30% 0% Quelle que soit l’espèce, nous avons noté une faible fréquence des bandes de LPS à chaînes longues et très longues. 57 Tableau VI-2 : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des souches R de Salmonella en fonction de l’espèce Espèces / Classe de poids moléculaire 15 - 35 Kd 35 - 55 Kd 55 - 75 Kd 75 - 95 Kd 95 - 115 Kd 115 - 135 Kd Salmonella typhi N=5 5 5 1 0 0 0 % 100% 100% 20% 0% 0% 0 Salmonella enteridis N=2 % 2 100% 2 100% 1 50% 1 50% 0 0% 0 0% Salmonella spp N=8 7 8 4 3 0 0 % 88% 100% 50,00% 37,50% 0,00% 0,00% Les souches ont toutes pratiquement donné des chaînes courtes. Par contre, les chaînes longues et très longues avaient tendance à disparaître. 58 Tableau VI-3 : Comparaison des profils électrphorétiques des LPS des souches lisses et rugueuses de Salmonella. Souches de Salmonella Type de colonie S.Spp1 S R S R S R S R S R S R S R S S S R S R S R S S R S R S S S S. St paul 1 S. Spp 2 S. St paul 2 S. Spp 3 S. Goelzau S. Bredeney S. Shwazengrund S. Spp4 S. Kentucky S. enteritidis 1 S. enteritidis 2 S. enteritidis 3 S. typhi 1 S. typhi 2 S.typhi 3 S.typhi4 03 S.typhi 5 S.typhi 6 S.typhi 7 R R S S-R Taille des LPS correspondant aux différentes bandes 90 -81 - 67 - 45 - 30 37 - 30 90 - 67 - 40 - 37 67 - 37 - 30 - 22 110 - 99 - 74 - 67 - 48 -42 90 - 67 - 48 - 42 106- 90 - 81- 67 -48 - 42 90 - 81 - 67 - 48 - 42 - 24 76 - 62 - 34 - 30 45 - 34 - 30 - 20 76 - 62 - 48 - 34 - 30 76- 48 - 34 -30 - 20 76 - 62 - 45 - 34 - 30 62 - 45 - 34 - 30 67 - 62 - 45 -34 -30 76-55- 30 107 -58 - 45 - 30 45 - 37 - 30 81 - 67 - 60 - 40 - 37 - 20 40 - 37 - 20 81- 67 - 60 - 40 - 37 81 - 67 - 60 - 40 - 37 - 20 67 - 45 - 34 - 30 90 - 60 - 49 - 40 - 37 - 20 45 - 40 - 37 - 30 - 20 72 - 62 - 51 - 37 - 30 58 - 42 - 37 - 30 55 - 30 67 - 55 - 45 - 37 - 30 113-107-71-58-51-45-3730-19 42 - 37 - 30 -19 45 - 37 - 30 72 - 60 - 58 - 55 45 - 30 Caractères gras : bandes les plus fréquentes chez les formes lisses. Caractères en italique : bandes les plus fréquentes chez les formes rugueuses Caractères soulignés : bandes sous forme de doublet. 59 Chez les souches lisses, les bandes à 67 - 62, 45 et 30 Kd étaient quasi constantes. Seules quelques souches (4) ont eu des bandes de plus de 100 Kd. Les profils des formes R étaient, dans leur ensemble plus réduits que ceux des formes S.On observait une grande fréquence des bandes à 30, 37, et 45 Kd. Quelque fois, le profil de la souche S se répétait de façon identique ou avec perte d’une ou deux bandes supérieures. Plus généralement, le profil de la souche R ne présentait que les bandes R de la souche S avec ou non des bandes R supplémentaires. V-3-2- Souches de E. coli. Les souches de E. coli ont livré un profil très étalé présentant : - Trois ou quatre bandes pour les souches du Sénégal, avec deux doublets à chaque fois. - Quatre à huit bandes pour les souches du Togo avec deux ou trois doublets. - Cinq ou six bandes pour les souches du Niger avec deux ou trois doublets. Les deux souches rugueuses que nous avons obtenues (une du Sénégal et une du Togo) présentaient respectivement deux bandes et une bande, dont un doublet. Tableau VI-4 : Comparaison des profils électrophorétiques des LPS des formes lisses et rugueuses des deux souches transformées Origine des souches Sénégal (souche 2) Togo (souche 1) Type de colonie Taille de LPS correspondant aux différentes bandes S R 67 - 51 - 33 42 - 33 S 90 - 81 - 74 - 58 55 - 49 - 42 30 33 R 60 Tableau VI 4’ : Profil électrophorétique détaillé des souches lisses de E. coli en fonction de l’origine Origine Souches de E coli E.coli 1S E. coli 2S E. coli 3S E. coli 1T E. coli 2T E. coli 3T E. coli 1N E. coli 2N E. coli 3N E. coli 4N SENEGAL TOGO NIGER Tailles de LPS correspondant aux diférentes bandes 76 -58 - 37 67 - 51 - 33 74 - 55 - 49 - 30 90- 81- 74- 58 -55 49- 42- 30 81 - 67 - 45 - 33 81 - 67 - 55 - 45 - 32 81 - 67 45 - 39 - 33 81 - 67 - 45 - 40 - 33 81 - 67 - 58 - 45 - 40 - 33 81 - 67 - 55 - 45 - 42 - 33 Les souches de E.coli présentaient toutes une bande dans les 30 Kd. Toutes les souches du Togo et du Niger ont donné des bandes à 81 et 67 Kd. Les profils des souches du Niger étaient tous identiques. V-3-3 Souches de Shigella Tableau VI-5 : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse des souches S de Shigella en fonction de l’espèce. Espèces / Classe de poids moléculaire Shigella flexneri N=11 % Shigella dysenteriae N=7 % Shigella boydii N=7 Shigella sonnei % N=8 [25 - 50] Kd ]50 - 75] Kd 75 - 100 Kd 100 - 125 Kd 125 - 150 Kd % 11 100% 6 85,70% 6 85,70% 8 100% 11 100% 5 71,40% 6 85,70% 8 100% 10 90,90% 6 85,70% 7 100,00% 7 87,50% 1 9,09% 2 28,50% 1 14,28% 1 12,50% 1 9,09% 0 0,00% 0 0,00% 0 0% 61 Comme constaté précédemment avec les autres Entérobactéries, les bandes à chaînes courtes étaient fréquemment présentes dans les profils des différentes espèces de Shigella. Par contre, les chaînes très longues l’étaient beaucoup moins : seule une souche de Shigella flexneri a donné une bande dans la classe des 125 - 150 Kd Tableau VI-6 Taille des bandes obtenues à l’électrophorése des bandes R de Shigella en fonction de l’espèce. Espèces / Classe de poids moléculaire 25 - 50 Kd 50 - 75 Kd 75 - 100 Kd 100 - 125 Kd 125 - 150 Kd Shigella flexneri N=7 % 7 0 0 0 0 100% 0% 0% 0% 0% Shigella dysenteriae N=6 % 6 0 0 0 0 100% 0% 0% 0% 0% Shigella Shigella boydii sonnei N=5 % N=7 % 5 1 0 0 0 100% 20% 0% 0% 0% 7 2 1 0 0 100% 28,57% 14,28% 0% 0% Avec les souches R de Shigella, en particulier celles Sh. dysenteriae et Sh. flexneri, seules les bandes entre 25 et 50 Kd étaient quasi constantes. 62 Tableau VI-7 : comparaison détaillée des profils électrophrétiques des LPS des souches lisses (S) et rugueuses (R) de Shigella Souches de Shigella Type de colonie Sh. flexneri 1 S R S S S S R S R S R S R S R S R S S S R S R S R S R S R S R S R S S R S S R S R S Sh. flexneri 2 Sh. flexneri 3 Sh. flexneri 4 Sh. flexneri 5 Sh. flexneri 6 Sh. flexneri 7 Sh. flexneri 8 Sh. flexneri 9 Sh. flexneri 10 Sh. flexneri 11 Sh. Dysenteriae A21 Sh. dysenteriae A11 Sh. dysenteriae A12 Sh. dysenteriae A13 Sh. dysenteriae A14 Sh. dysenteriae A15 Sh. dysenteriae A16 Sh. boydii 1 Sh. boydii 2 Sh. boydii C1 Sh. boydii 3 Sh. boydii 4 Sh. boydii 5 Sh. boydii 31 Taille de LPS correspondant aux différentes bandes 58 -58 - 33 34 - 33 100 - 62 - 55 - 45 90 - 76 - 58- 51 -42 76 - 67 55 - 45 - 37 - 30 90 - 82 - 67 - 45 - 39 - 30 45 - 39-30 87 - 67 -60 51 - 33 - 26 26 87-72-65-55-45-37-30 37-30 130-110-90-74-67-60-45-37 30 30 90-72-45-30 39-30 90-72-67-58-46-40-30 30 90 - 76-67-51-42-32 113 - 90-67-58-47 113-87- 82 -67-55 37 72-56-45-37-31 33 90-82-39-34 30 90 -72-48-32-30-27 27 90-76-67 -55-48-39- 34 25 100 - 82 - 76 - 49 37- 30 100 - 90 - 67 - 40 - 33 46- 33 90 - 71 - 58 - 51 - 39 82 - 74 - 62 - 51 - 45 33 125 - 107 - 82 - 65 - 51 90 - 82 - 48 - 34 90 - 72 - 42 - 30 90 - 76 - 67 - 55 - 45 - 39 - 30 - 25 48 - 33 - 30 84 - 76 - 72 - 46 - 42 33 63 Sh. sonnei 1 Sh. sonnei 2 Sh. sonnei 3 Sh. sonnei 4 Sh. sonnei 5 Sh. sonnei 6 Sh. sonnei 7 Sh. sonnei 8 R S R S R S R S R S R S R S R S 33 110 90 - 67 - 58 - 46 33 82 - 59 - - 39 - 33 - 26 26 82 - 72 - 55 - 32 - 26 26 82 - 67 55 - 51 - 37 - 32 - 26 40 -26 71 - 67 - 45 - 37 31 30 90 - 84 - 72 - 46 - 42 - 33 60- 46 - 40 - 33 90 - 72 - 62 - 46 - 40 - 30 90 - 72 62 46 - 40 - 30 90 - 72 - 67 - 58 -46 - 40 - 30 Les profils des souches S présentaient tous pratiquement une bande à 30 - 33 et 80 - 90 Kd. Huit souches donnaient des bandes de taille supérieure ou égale à 100 Kd. Les souches R donnaient également une bande à 30 Kd, parfois à 26 Kd. Contrairement aux Salmonella, on obtenait rarement, avec les souches R le même profil que les souches S. 64 V - 3 - 4 - Souches de Vibrio cholerae Tableau VI-8 : Comparaison des profils électrophorétiques des LPS des souches lisses (S) et rugueuses R de vibrio cholerae Origine des souches DARA MOUSTY Souches de Vibrio cholerae Type de colonie Taille des LPS correspondant aux différentes bandes V. cholerae Ogawa 1 S R S R S R S R S R S R S R S S S R S 60-55-45-38-31 60-45-38-30 74-67-55-45-30 55-45-20 71-60-45-33 45-40-20 74-67-55-45 60-45-37-20 71-55-45-35 60-45-35 67-55-45-38-30 67-55-45-38-31 67-58-45-35 67-45-40-22 74-67-55-45 74-45 71-60-45-33 45-40-20 74-55-45-38-31 V. cholerae Ogawa 2 V. cholerae Ogawa 3 V. cholerae Ogawa 4 NIORO V. cholerae Ogawa 5 SAINT-LOUIS V. cholerae Ogawa 6 V. cholerae Ogawa 7 DAKAR V. cholera Ogawa 8 V. cholerae Ogawa 9 V. cholerae NAG 10 V. cholerae 11 La bande à 45 Kd a été constante, quel que soit le type de colonie et quelle que soit la souche de Vibrio cholerae.(Figure 5) 65 VI - Analyse du profil électrophorétique des LPS en fonction de la virulence. VI-1 Souches d’ E. coli Tableau VII-1 : Profils des LPS et détection de lalpha hémolysine chez les souches d’ E. coli. Origine Souches de α-hémolysine E. coli SENEGAL TOGO NIGER profil électrophorétique des LPS E.coli1S E coli2S + + 76 -58 - 37 67 - 51 - 33 E coli3S - 74 - 55 - 49 - 30 E coli1T + 90- 81- 74- 58 -55 49- 42- 30 E coli2T E coli3T + - 81 - 67 - 45 - 33 81 - 67 - 55 - 45 - 32 E coli1N E coli2N E coli3N + + - 81 - 67 45 - 39 - 33 81 - 67 - 45 - 40 - 33 81 - 67 - 58 - 45 - 40 - 33 E coli4N - 81 - 67 - 55 - 45 - 42 - 33 Les souches alpha hémolysine positives comme alpha hémolysine négatives ont eu généralement les mêmes profils. De plus certaines souches alpha hémolysine négatives ont eu des bandes à chaînes plus longues (E. Coli 2s) que les souches alpha hémolysine négatives. . 66 VI-2 Souches de Shigella Tableau VII-2: Profils des LPS et et test de Sereny chez les souches de Shigella Souches de Shigella Sh. flexneri 1 Sh. flexneri 3 Sh. flexneri 6 Sh. flexneri 2 Sh. flexneri 7 Sh. dysenteriae A12 Sh. dysenteriae A14 Sh. dysenteriae A2 Sh. boydii 1 Sh. boydii C3 Sh. sonnei7 Sh. sonnei4 Sh. sonnei 1 Sh. sonnei 8 Test de Sereny + + + + + + + + + - Profil électrophorétique des LPS 58 -58 - 33 90-76-58-51-42 90-82-67-45-39-30 100-62-55-45 87-67-60-51-33-26 72-56-45-37-31 90-72-48-32-30-27 113-90-67-58-47 100-90-67-40-33 84-76-72-46-42-33 90-72-62-46-40-30 82-67-55-51-37-32-26 110-90-67-58-46 90-72-67-58-46-40-30 Les souches à tester de Sereny négatif ont toutes eu des bandes à très longues chaînes. Sh. flexneri 1 à test de Sereny positif n’avait sa plus haute bande qu’à 58 Kd. 67 VI-3- Souches de Vibrio cholerae Tableau VII-3: Profil des LPS et détection de l’alpha hémolysine chez les souches de Vibrio cholerae. Origine des souches DARA MOUSTY NIORO SAINT-LOUIS DAKAR Souches de Vibrio cholerae hémolysine V cholerae Ogawa 1 + V cholerae Ogawa 2 V cholerae Ogawa 3 V cholerae Ogawa 4 V cholerae Ogawa 5 + + + V cholerae Ogawa 6 V cholerae Ogawa 7 V cholera Ogawa 8 + + + V cholerae Ogawa 9 V cholerae NAG 10 V cholerae 11 + + + profil électrophorétique des LPS 60-55-45-38-31 74-67-55-45-30 71-60-45-33 74-67-55-45 71-55-45-35 67-55-45-38-30 67-58-45-35 74-67-55-45 74-45 71-60-45 -33 74-55-45 -38-31 La seule souche à hémolysine négative s’est avérée être parmi celles ayant les bandes à plus longues chaînes. 68 VII- Analyse du profil électrophorétique des LPS en fonction de la sensibilité aux antibiotiques VII-1- Souches de Salmonella Tableau VII-1: Profils de LPS et de sensibilité des souches de Salmonella Souches de Bêta Salmonella lactamase ANTIBIOTIQUES Profil électrophorétique des LPS AMP AMX AMC CRO CFZ CTX S. Typhi 7 S. Kentucky S. Typhi 2 S. Typhi 3 S. Spp 1 S. Typhi 409 S. Typhi 5 + + + S R S S R R S R R R R R R R S R R R R R R R R R S S R R R S S S S S R R R R R R R R S. Typhi 6 + S R S R R R 72 -60 - 58 -55 107-58-45-30 72-62-51-37-30 55-30 90-81-67-45-30 67-55-45-37-30 113-107-71-5851-45-37-30-19 45-37-30 Pour les souches à Bêta-lactamase positive, nous avons observé des résistances à tous les antibiotiques sauf à la CRO et CFZ (S. spp 1) ) la CFZ (S.Typhi O9) et l’AMP (S. Typhi5 ) . Pour les souches à bêta-lactamase négative, en revanche, nous avons noté la multirésistance de la souche de Salmonella kentucky qui pouvait être en rapport avec la multiplcité de ses doublets (dont un à très longue chaînes (107 kd). Cette souche seule, était résistante à l’ampicilline. De plus, la souche de S. typhi3 qui était la seule souche sensible à la ceftriaxone était dépourvue de bandes de LPS à longues chaînes. 69 VII-2- Souches de E. coli. Tableau VIII-2 : Profils des LPS et de sensibilité des souches de E. coli Origine SENEGAL TOGO NIGER Souches de E. coli profil électrophorétique des LPS ANTIBIOTIQUES AMP CRO IPM STX ATM NOR NI E.coli1S E coli2S E coli3S E coli1T R R I R S S S S S S S S S R I S S S S S S S S S I S S I E coli2T E coli3T E coli1N E coli2N E coli3N E coli4N R S R R R S S S S S S S S S S S S S R S S S S S R S S S S S S S S S S S I I I S I I 76-58-37 67-51-33 74-55-49-30 90- 81-74-58-55 49-42-30 81-67-45-33 81-67-55-45-32 81-67-45-39-33 81-67-45-40-33 8167-58-45-40-33 81-67-55-45-4233 E. Coli 3T était la seule souche sensible à l’ampicilline pourtant, son profil pouvait se superposer aux autres profils.Et comportait même un doublet à 81 Kd, inexistant chez les souches du sénégal. E. Coli 2S et E. Coli 2T seulement ont été résistante à l’association sulfaméthoxazole + triméthoprime ; elles ont eu en commun les bandes à 33 et 67 Kd, bandes également données par les autres souches qui possédaient par ailleurs des LPS de taille plus élevée. Enfin, E. Coli 2t était l’unique souches résistante à l’azthréonam malgré son profil très proche notamment de ceux des souches du Niger, toutes sensibles. 70 VII - 3 - Souches de Shigella Tableau VIII-3 : Profils des LPS et de sensibilté des souches de shigella. ANTIBIOTIQUES Souches de shigella profil électrophorétique des LPS C TIC AMC AM AMX STX TE AN GM Sh. flexneri 1 S S S S S S R S S 58-58-33 Sh. flexneri 2 R R R R R S R S S 100-62-55-45 Sh. flexneri 4 S S S S S R S S S 90-76-67-51-42-32 Sh. flexneri 11 S R R R R R R S S 90-72-67-58-46-40-30 Sh. Dysenteriae A2 1 S R R R R R R S S 113-90-67-58-47 Sh. dysenteriae A1 1 S S S S S S R S S 113-87-82-67-55 Sh. boydii 6 S S S R S S S S S 90-76-67-55-45-39-30 Sh. boydii C 3 1 R R R R R R R S S 84-76-72-46-42-33 Sh. sonnei1 S R S R S R R S S 110-90-67-58-46 Sh. sonnei3 S S S S S R R S S 82-72-55-32-26 Sh. sonnei 8 S S S R S R R R R 90-72-67-58-46-40-30 Sh. flexneri 2 et 11, Sh. dysenteriae A2 et Sh. boydii C3, se sont montrée particulièrement multirésistantes. Leurs profils présentaient toujours une bande à 90 Kd ou plus, sauf pour Sh.boydii C3, dont la plus haute bande n’était qu’à 84 Kd. Les souches de Shigella étaient toutes résistantes à la Tétracycline. Bien que Sh. flexneri 4 et Sh. boydii 6 aient eu les mêmes profils pratiquement, ceux -ci se superposaient pourtant aux profils d’autres souches. 71 VII - 4 Souches de Vibrio cholerae Tableau VIII -4 : Profil des LPS et de sensibilté des souches de Vibrio cholorae V cholerae Ogawa 1 V cholerae Ogawa 2 V cholerae Ogawa 3 V cholerae Ogawa 4 V cholerae Ogawa 5 V cholerae Ogawa 6 V cholerae Ogawa 7 V cholera Ogawa 8 V cholerae Ogawa 9 V cholerae NAG 10 V cholerae 11 profil électrophorétique des LPS ANTIBIOTIQUES Souches de Vibrio cholerae O129 STX C AM AMC GM AN TE R R R R R R R R R S R R R R R R R R R R S R R R R R R R R R R R R I I I I I I R I I I I I I I I I I R I I I I S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 60-55-45-38-31 74-67-55-45-30 71-60-45-33 74-67-55-45 71-55-45-35 67-55-45-38-30 67-58-45-35 74-67-55-45 74-45 71-60-45-33 74-55-45-38-31 V. cholerae ogawa 7 était seule résistante et à l’ampicilline et à l’association amoxicilline + acide clavulanique. V. cholerae NAG n’était résistante qu’à la colistine. 72 I- Obtention des souches rugueuses(R) - Nous avons utilisé du bouillon nutritif additionné de solutions de D- alanine, chlorure de sodium ou chlorure de Lithium à 10g/l pour induire la formation de souches R. - Le bouillon de transformation, au bout d'une semaine à 10 jours, était repiqué sur gélose nutritive (milieu minimum). Aprés incubation de 24 heures à 37°C, s'il y avait pousse, la boîte était à nouveau incubée 10 jours sur la paillasse pour obtenir des colonies R. - L'obtention de colonies R a été plus rapide avec Vibrio cholerae, ceci pourrait s'expliquer par la structure du LPS : Bahrani et Oliver ont démontré avec des souches de Vibrio vulnificus que les profils électrophorétiques des LPS des colonies S et R étaient identiques (2). Cependant, certaines souches sont quand même demeurées lisses au bout des 10 jours. - Les Shigella ont été ensuite les souches les plus sensibles aux solutions de transformation. Puis venaient Salmonella et E.coli. Nous avons tenté d'expliquer ce phénomène par les différences au départ, dans la forme des colonies S ; elles étaient trés grosses, épaisses et trés muqueuses pour Salmonella et surtout E.coli, alors que les colonies S de Shigella étaient de taille moyenne et trés peu muqueuses. - Pour permettre à un plus grand nombre de souches de se transformer, il aurait peut-être fallu laisser les boîtes plus longtemps et utiliser pour toutes les souches, sans distinction, la solution de D-alanine, aussi bien dans le bouillon que dans la gélose nutritifs. II - Extraction des LPS des souches S et des Souches R - La méthode de Nobuo-Kido (42) que nous avons appliquée, n'était consignée nulle part pour l'extraction ni des LPSR ni des LPSS. 73 - La méthode généralement employée pour les LPSR est celle de Galanos et coll (11 in 1, 15, 18, 31) plus spécifique, dans laquelle, l'extraction est réalisée avec un mélange de phénol-chloroforme-éther de pétrole à température ambiante. Ceci est un élément important dans l'analyse des profils électrophorètiques du LPS de nos souches R. - Pour l'extraction du LPS des souches S la majorité des auteurs ont utilisé la méthode phénol-eau de Westphal à 65°C (11 in 15, 18). - Enfin, dans l'ensemble des études effectuées sur les LPS, l'extrait était purifié généralement soit par digestion en présence de protéinase K (15) pendant l'extraction, soit en phase finale par ultracentrifugation (18) - Notre méthode d'extraction quant à elle, ne comportait pas d'étape de purification. Nous avons donc misé sur le temps d'incubation (1h 30 à 2h au lieu de 70 mn à 55 - 60°C) pendant l'extraction, et sur le temps de dégradation (15 - 20mn au lieu d'une minute, à 100°C) avant le dépôt des échantillons pour l'électrophorèse. III - Electrophorèse des LPS sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) - Les études réalisées sur les LPS appliquaient toutes, la méthode standard de Laemmli (2, 15, 32, 55). - Cette technique qui permet de séparer les molécules allant jusqu'à 200Kd constitue une échelle serrée de poids moléculaire, pour l'élution de l'ensemble des LPSR, SR et S (15). - Hitchcock et Brown, contrairement à nous, n'ont pas rajouté le SDS (agent dissociant) dans les gels de regroupement et de résolution (15). - Jann et Coll (18), Pinon et Coll (45) ont utilisé pour le tampon échantillon, du dithiotréitol à la place du bêta mercaptoéthanol. Néanmoins, toutes ces variations ne modifiaient en rien l'efficience de la résolution. - Enfin, certains auteurs comme Pinon et Coll (45) ont pratiqué une électrophorèse sur gel en gradient de concentration. Elle permet une séparation plus fine, comparable à une chromatographie. Cette méthode présente cependant, 74 l'inconvénient d'être plus laborieuse et beaucoup plus longue (se réalisant sur 2 jours). - Du point de vue de la détection des bandes de LPS, la coloration au nitrate d'argent de Tsaï et Frasch (54) est la technique la plus répandue (15, 18,45) du fait de son importante sensibilité et de sa plus grande spécificité à l’égard aux LPS. Par rapport aux profils proprement dit, les entérobactéries ont montré pour les souches S un profil «en escalier» avec tous les types de LPS : S, SR, R. Ce caractère a été établi depuis plusieurs travaux notamment ceux de Hitchock et Brown en 1983 (15) et Jann et coll en 1975 (18). Les premiers ont étudié l'hétérogénéité des LPS de Salmonella en gel de polyacrylamide teint avec du nitrate d'argent. Ils ont montré que des souches S de Salmonella typhi murium donnaient des bandes des différents chimiotypes S, SR et R. Jann et coll quant à eux, dans une étude de l'hétérogénéité des LPS sur gel de polyacrylamide coloré au shiff-acide périodique ont montré la même diversité structurale dans le patrimoine LPS d'une souche lisse de Citrobacter 396. Les souches R, donnaient généralement une ou deux bandes dans la moitié inférieure du gel. Ou quelquefois, un doublet isolé (cas des Shigella). Ceci étaint en accord avec les résultats de Jann et coll (18) qui ont montré qu'une souche R de E coli F470, donnait une seule bande de forte mobilité. Cependant certaines souches, celles de Salmonella, notamment livraient un profil identique pour les souches S et R. ce problème pouvait être dû au mode de prélèvement de la colonie R. En effet, le plus souvent, la colonie R observée est très superficielle, ou est accolée à d'autres colonies formées de bactéries non encore transformées ou en cours de transformation. Dans ce cas, il aurait fallu ne pas racler l'ensemble de la colonie, mais en prélever juste la surface pour éviter de prendre les colonies S sous-jacentes. Pour ce même problème Jann et coll (18) ont incriminé la méthode d'extraction qui, si elle avait été spécifique au chimiotype R, comme préconisé par Galanos et coll (18) aurait permis d'obtenir un profil plus spécifique. En ce qui concerne V. cholerae, les formes S et R de nos souches donnaient globalement le même profil de LPS. Des résultats identiques ont été trouvés par Bahrani et Oliver (2) qui ont étudié des formes S et R de Vibrio vulnificus. 75 cependant, nos souches présentaient des bandes de LPS à longues chaînes contrairement à ce que donnaient leurs souches ; toutes les bandes étaient des LPS à chaînes courtes comme l’ont stipulé Shimizu et coll (51) qui ont démontré que le LPS de Vibrio Anguillarum, dépourvu de KDO, avait une action antitumorale chez la souris. D'autre part, Bahrani et coll faisaient état pour les souches S comme pour les souches R, d'une large bande de LPS R unique et constante. Cette bande correspond fort probablement à la bande à 45 Kd que nous avons obtenue de nos souches S et R Par ailleurs, les multiples autres bandes que nous avons détectées peuvent avoir été le fait du bleu coomassie qui s'avère être une méthode de coloration très peu spécifique, pouvant colorer aussi bien les protéines que des restes de sucre. En effet, il est reconnu que les protéines peuvent même gêner la migration des LPS en gel de polyacrylamide (15). D'où encore une fois, la caractère primordial de la purification de l'extrait lipopolysaccharidique. IV- LPS et virulence bactérienne Il a été clairement établi que le LPS joue un rôle déterminant dans la pathogénicité des bactéries à Gram négatif (7, 21). Outre les propriétés endotoximiques constantes quelque soit le type de la souche : Dues au lipide A, la chaîne polysaccharidique constitue elle même un facteur de virulence certain, surtout chez les souches lisses. C'est ainsi que Belanger et coll (3) ont montré que les souches lisses de Actinobacillus pleuro pneumoniae adhéraient plus massivement aux anneaux trachéens que les souches de type rugueux ou intermédiaire. De même, Merino et coll(30) ont prouvé que les chaînes polysaccharidiques à spécificité O permettaient à la bactérie de type lisse d'échapper aux défenses de l'hôte.. En effet, ils ont montré que la composition du core oligosaccharide de souches de Aeromonas hydrophila contribuait à la résistance de ces germes vis à vis du complément. Généralement, il est admis une relation directe entre la longueur des chaînes polysaccharidiques (correspondant à des LPS de haut poids moléculaire) et la virulence d'une souche. 76 Cependant, pour l'ensemble des souches dont nous avons étudié un facteur de virulence : - hémolysine pour les souches de E. coli et de Vibrio cholerae. - Test de Sereny pour les souches de Shigella, cette évidence n'était pas vérifiée, eu égard aux profils électrophorétiques identiques des souches positives et négatives aux différents tests de virulence. Pourtant Wandersman et Letoffé (60) ont démontré chez des souches de E.coli que le LPS était bien impliqué dans l'incorporation correcte, au niveau de l'enveloppe cellulaire, de la protéine Tolc requise pour la sécrétion d'hémolysine. Vu le mécanisme génétique profond de ce procédé, l'observation unique des bandes de LPS n'est sûrement pas un argument suffisant pour discuter un tel phénomène. Notre étude a montré que les souches de Shigella à test de Sereny négatif ont toutes eu des bandes à trés longues chaînes et que par ailleurs la souche de Shigella flexneri1 à test de Sereny positif n'avait sa bande supérieure qu'à 58Kd. Cependant des travaux menés par Nikolaeva et coll (39) confirmaient bien que les chaînes latérales jouent un rôle dans la pathogénéicité de souches de Shigella sonnei.Pourtant leur étude portait comme la nôtre sur des souches lisses virulentes et non virulentes. Mais, n'ayant pas précisé le caractère de virulencve qu'ils avaient considéré, nous pouvons supposer que le test de Sereny que nous avons appliqué, et la molécule de LPS sont des facteurs de virulence indépendants. Pour nos souches de Vibrio cholerae, la seule souche à hémolysine négative s"est avérée être parmi celles ayant les bandes à plus longues chaînes . Cela nous laisse supposer qu'il n'éxiste pas de lien entre la sécrétion d'hémolysine et la taille du LPS. Nos résultats rejoignent ceux de Bahrani et Oliver (2), qui ont étudié des souches virulentes et non virulentes de Vibrio vulnificus et ont émis l'hypothèse qu'il n'existe pas de lien,entre le LPS et la virulence des dites souches. De même sur une étude portant sur l'analyse électrophorétique des protéines de membrane et des LPS de souches d'Haemophilus influenzae, Pinon et coll (45) ont déclaré ne pas pouvoir établir de relation entre le pouvoir pathogène et le LPS de ces souches. 77 Prenant en compte toutes ces considérations, nous pouvons conclure que les LPS peuvent jouer un rôle dans la virulence. Mais la physiopathologie des infections à Vibrio cholerae, à Shigella et à Escherichia coli est liée à la présence de toxines très proches : ST(thermostable) et LT(thermolabile) (12) repose essentiellement sur la sécrétion. V- LPS et sensibilité bactérienne aux antibiotiques La résistance bactérienne est le fait de plusieurs mécanismes qui peuvent se cumuler (33): - interférences dans le transport, la pénétration et le maintien de l'antibiotique dans la bactérie : augmentation de l'efflux (exemple : porines de bacilles à Gram négatif). Ce premier mécanisme peut concerner plusieurs familles d'antibiotiques (mécanisme pleiotropique). - détoxification enzymatique de l'antibiotique (Exemple: bêta-lactamase ou enzyme inactivant les aminosides) - altération de la cible (Streptococcus pneumoniae et Bêta-lactamines) - substitution de la cible (Exemple: sulfamide-triméthoprime). Les mécanismes de résistance mettant en jeu l'accès du médicament à sa cible sont d'origine génétique, soit secondaires à une mutation chromosomique, soit dus à l'acquisition de gènes étrangers (plasmides, transposons). L'étude de la sensibilité des bactéries à Gram négatif intégre de plus en plus celle des LPS. Il est généralement admis que la grande taille de ces molécules, en rapport avec l'importance de leurs chaînes polysaccharidiques, favorise la résistance des germes à certains antibiotiques. Ainsi, Kaca et coll (22) dans une étude portant sur Proteus mirabilis ont constaté que les souches rugueuses étaient sensibles aux polymyxines B et E, contrairement aux souches lisses. En revanche, Dechêne et Leying (9) ont établi un lien entre la résistance des souches de Serratia marcescens 992 à la ciprofloxacine et la baisse de la quantité de KDO au niveau de leur membrane externe. De même, Borneleit et coll (5) ont montré par électrophorèse d'affinité que les porines se liaient de façon plus spécifique aux LPS des souches lisses qu’à ceux des souches rugueuses. 78 Par rapport au mécanisme de résistance par défaut de pénétration ou de transport, ceci nous permet de comprendre qu’il existe des mutants LPS, déficients en un ou plusieurs osides nécessaires au transport de certains antibiotiques. De plus, l'orientation des porines au niveau de la membrane externe est souvent déterminée par les LPS (5). Or, les antibiotiques hydrophiles comme les bêtalactamines empruntent ces porines aménagées dans la membrane externe. Cependant, le LPS n'intervient pas seulement par sa portion polysaccharidique, sur la sensibilité. Vuorio et Vaara (59) ont travaillé sur le mutant LPxA2 de E.coli produisant des quantités fortement réduites de lipide A. Ce mutant s'est avéré être à des conditions normales de croissance très sensible à de nombreux antibiotiques tels que l'acide fusidique et la vancomycine. D'autre part, chez des mutants de Vibrio cholerae résistants aux antibiotiques courants, Paul S. et coll (43) ont évalué le contenu en acide gras du lipide A : 50-56% chez les souches mutantes et 29-37% chez les souches sauvages. Ainsi, en fonction de la taille des LPS, la multi-résistance de certaines souches à Bêta lactamase négative par exemple pourrait s'expliquer par: - un défaut de transport de certains antibiotiques : les chaînes latérales des LPS de haut poids moléculaire créant un encombrement allostérique à l'entrée des porines adjacentes. - un manque d'atteinte de la cible : efflux Pour la résistance des souches dont les petites tailles de LPS n'expliquaient pas le phénoméne, on peut penser à l'absence de sucres indispensables au transport des antibiotiques concernés. La résistance des souches à Bêta lactamase positive était à priori imputable à l'enzyme . Cependant, il arrivait que des souches à Bêta lactamase positive, soient par exemple sensibles à l’ampicilline. Dans ce cas, nous avons spéculé en faveur d'une Bêta lactamase de bas niveau inductible ou constitutive ou d’une Bêta lactamase spécifique pour le cas présent, une céphalosporinase. En conclusion il peut être retenu que la résistance bactérienne aux antibiotiques, imputée aux LPS peut s’expliquer de façons diverses: 79 - le passage des antibiotiques hydrophiles peut être gêné par les LPS à longues chaînes latérales (Souches lisses), qui créent un encombrement à l’entrée des porines. - pour les antibiotiques hydrophobes, l’efficacité sur les souches de bactéries à Gram négatif peut varier avec le contenu en acides gras du lipide A. 80 Devant les manifestations particulièrement spectaculaires des septicémies à bacilles à Gram négatif, nous nous sommes proposé d'étudier les lipopolysaccharides des formes lisses et rugueuses de certains germes responsables d'infections graves. L'enveloppe bactérienne est le support de l'interaction du microorganisme avec son environnement. Chez les bactéries à Gram négatif, cette fonction est assurée par la membrane externe qui est constituée essentiellement de lipopolysaccharides. Ces composants membranaires sont déterminants dans la virulence et l'antibiosusceptibilité de ces germes. Les variations structurales et fonctionelles du LPS selon le type de colonie formé par la bactérie nous ont amené à étudier les LPS de souches lisses et rugueuses obtenus à partir de 74 souches d'agents infectieux comprenant des Salmonella, Escherichia coli, Shigella et Vibrio cholerae. Après transformation des formes lisses d'origine en formes rugueuses, les LPS des deux types (LPSS et LPS R) ont été extraits puis caractérisés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE). Les profils électrophorétiques obtenus ont été analysés en fonction des données préalablement recueillies sur la virulence et/ou l'antibiorésistance des diverses souches. Il découle de notre étude que l'obtention des souches R dépend de la substance utilisée pour induire la dissociation mais aussi et surtout de la souche elle-même. Ainsi, les Shigella ont donné le plus grand nombre de transformations (25 sur 33 souches contre 2 souches sur 10 pour Escherichia coli par exemple). En ce qui concerne l'électrophorèse, les entérobactéries ont donné pour les formes lisses, un profil « en escalier » comportant tous les chimiotypes de LPS : S-SR-R-. Les formes rugueuses quant à elles, ont donné généralement une à deux bandes de type R. Les souches de Vibrio cholerae ont livré un profil plus simple qui dans l'ensemble, s'est avéré identique pour les formes lisses et les formes rugueuses. L'analyse du modèle électrophorétique des LPS des différentes souches eu égard à leurs profils de virulence, nous a permis de retenir que le LPS pouvait être considéré comme un facteur de virulence à part entière.Ce caractère pouvant être lié à d’autres facteurs (LPS et Alpha hémolysine chez E. Coli),ou s’exprimer 81 indépendemment d’autres composantes telles que les toxines de Shigella, E. Coli, Vibrio cholerae. Du point de vue de la sensibilité, nous avons pu constater le lien essentiel entre ces molécules et la résistance à certains antibiotiques: - d'une part, le LPS peut interférer de par sa taille, , avec la pénétration des antibiotiques hydrophiles comme les Bêta-lactamines. Il crée avec ses chaînes latérales, un encombrement allostérique à l'entrée des porines, canaux protéiques empruntés par ces substances. - d'autre part, le LPS peut intervenir de par sa structure.La chaîne polysaccharidique de certains mutants résistants peut montrer un déficit en osides nécessaires au transport des antibiotiques en cause. De même, des modifications au niveau du lipide A peuvent être à l'origine d'un accroissement ou d'une baisse de la sensibilité. Néanmoins, il serait judicieux d'approfondir notre travail, en soumettant les formes R obtenues, après résolution du problème de leur conservation, aux mêmes tests de virulence et de sensibilité que les formes S parentales.En effet, l'étude plus pousséedes formes R est d'autant plus intéressante que leurs LPS ont des effets biologiques atténués et conservent une immunogénicité satisfaisante. C'est la raison pour laquelle, les LPS et les LOS sont appelés à supplanter l'adjuvant de Freund dans la préparation des vaccins. 82 ANNEXES ANNEXES I - Milieux de culture - composition pour 1 litre 1 - Bouillon viande - foie glucosé à 2°/°° - base viande - foie 29,5 g - glucose 2g - chlorhydrate de cysténie 0,5 g pH final 7,4 plus ou moins 0,2 2 - Bouillon nutritif : - macérat de viande - peptone trypsique - Nacl ou Kcl 1l 15 g 5g préparation des bouillons : - peser la quantité de milieu lyophilisé nécessaire. - Dissoudre dans l'eau distillée sur un agitateur magnétique en chauffant. - ajuster le pH. - répartir dans des tubes à vis - Autoclaver. - Conserver au réfrigérateur à 4°C. 3 - Gélose Müller - Hinton. - infusion de viande de boeuf - hydrolysat de caséine - Amidon - gélose (agar) - pH final 7,4 300 g 17,5 g 1,5 g 17 g 83 4 - Gélose nutritive - macérat de viande - peptonetrypsique - Nacl ou Kcl - Agar 1l 15 g 5g 15 - 20 g - peser la quantité de milieu lyophilisé nécessaire - Dissoudre dans l'eau distillée sur un agitateur magnétique en chauffant jusqu'à ébullition. - ajuster le pH. - Autoclaver. - Couler la gélose dans des boîtes de pétri stériles. - Conserver les boîtes au réfrigérateur à 4°C. Solutions pour obtention des souches R 1 - solution mère de chlorure de sodium à 100 g/l - Nacl en cristaux - eau distillée QSP 10 g 100 ml 2 - solution mère de chlorure de Lithium à 100 g/l - Licl en cristaux - eau distillée QSP 10 g 100 ml 3 - solution mère de D - alamine à 100 g/l - D - ala en poudre - Eau distillée QSP 10 g 100 ml préparation des solutions : - peser le réactif - le dissoudre dans 50 ml d'eau, sur un agitateur magnétique. - Complèter le volume à 100 ml 84 II - Réactifs d'extraction II -1 - Solution d'EDTA 0,5M - EDTA - Eau distillée QSP 23,25 g 125 ml Dissoudre sur agitateur magnétique. Conserver à température ambiante. NB * l'EDTA ne se dissout qu'à un pH aux environs de 8. II -2 - Tampon Tris - Acétate - EDTA (T.A.E) 50x (x : 40mM Tris 2mM EDTA) - Tris base 24,2 g - Acide acétique 5,71 ml - EDTA 0,5 M 10 ml - eau distillée QSP 100 ml Dissoudre sur agitateur magnétique. Conserver à 4°C; II -3 - Solution de soude : NaOH 2N. - NaOH (pastilles) - Eau distillée QSP 10 g 125 ml Dissoudre sur agitateur magnétique. Conserver à température ambiante. II -4 - Solution base de Kado pour la lyse. - Tris base - Eau distillée QSP Dissoudre sur agitateur magnétique. 0,6 g 100 ml 85 Conserver à température ambiante. II - 5 - Solution alcaline de lyse : - Solution base de Kado 10 ml - NaOH 2N 250 µl pour obtenir un pH d'environ 12,6. Utiliser imédiatement, ne se conserve pas. II - 6 - Solution Tris - cl 0,5M à pH8 - Tris base - Eau distillée QSP 15,15 g 250 ml II - 7 - Solution Tris - Cl 0,1M à pH8 - Tris base 3,03 g - Eau distillée QSP 250 ml Dissoudre le Tris avec une partie de l'eau. Ajuster le pH à 8 avec de l'Hcl 2N. Compléter le volume avec le reste de l'eau. II - 8 - Solution de phénol équilibré (33) - Au préalable, faire fondre des cristaux de phénol au bain - marie et conserver le phénol ainsi liquéfié dans un flacon teinté à -20°C. - Au moment de la préparation, 1 - retirer le phénol des -20°C. - abaisser sa température sur la paillasse (à l'air libre). - puis le faire fondre au bain - marie à 68°C. 2 - prélever 100 ml de ce phénol dans un flacon teinté. - ajouter 100 ml de Tris-cl O,5 M à pH 8. - Agiter 20 mn sur agitateur magnétique. - laisser reposer. Lorsque les 2 phases sont séparées, éliminer la phase aqueuse supérieure avec une pipette aid. 86 3 - A la phase phénolique, ajouter 100 ml de Tris-cl 0,1M à pH8. - agiter 20 mn sur agitateur magnétique. - laisser reposer et retirer entièrement la phase aqueuse supérieure. 3' - Vérifier le pH de la phase phénolique avec du papier pH : Si le pH est supérieur à 7,8, le phénol est équilibré. Sinon, répéter l'étape (4), jusqu'à ce que la phase phénolique ait un pH supérieur à 7,8 ; 4 - A la surface de la phase phénolique, ajouter 10 ml de Tris-cl 0,1 M à pH 8. 5 - ajouter . 9 6 ml de chloroforme. . 4 ml d'alcool isoamylique. 6 - rajouter au mélange final 10 ml de Tris-cl 0,1 M à pH 8. - conserver dans la bouteille teintée et enveloppée de papier aluminium à 4°C. la - lors de l'utilisation, prélever la phase phénolique inférieure en y plongeant pipette. 9 - Solution d'acétate de sodium 3 M à pH 5,2 - Acétate de sodium 30,75 g - Eau distillée QSP 125 ml Dissoudre le sel avec une partie de l'eau. Ajuster le pH à 5,2 avec de l'acide acétique. Compléter le volume avec le reste de l'eau. 10 - Ethanol à 70° mouillage de l'alcool à 95° : - éthanol à 95° - Eau distillée Volume totale 73,7 ml 26 3 ml ______ 1 0 0 ml 87 III - réactifs d'électrophorèse III - 1 - tampon de résolution ("lower buffer") à pH 8,8 - Tris 1,5 M 18,17 g* - SDS 0,4 g - eau distillée QSP 100 ml III - 2 - tampon de regroupement ("upper buffer") à pH 6,8 - tris 0,5 M 12 g* - SDS 0,8 g - eau distillée QSP 200 ml *Ces quantités permettent de préparer les solutions à 1,5 M et 0,5M . puis il faut ajouter le SDS et ajuster le pH avec l'HCl concentré. III - 3 - solution d'acrylamide - Bisacrylamide à 30% - acrylamide 29,7 g - N,N' méthyléne Bisacrylamide 0,3 g - eau distillée QSP 100 ml NB : . l'acrylamide est un toxique du système nerveux central. le Tris et le SDS sont cancérigènes . Ces produits ne doivent être ni inhalés, ni portés au contact de la peau. Il faut les peser avec un masque et des gants, puis nettoyer la balance et ses alentours. . Le pH des solutions est ajusté avec Hcl 12 N. III - 4 - persulfate d'ammonium à 30% - APS - eau distillée QSP 1,5 g 5 ml Aliquoter (100 µl) et conserver au froid à -20°C ou -70°C III - 5 - TEMED C'est une solution prête à l'emploi trouvée dans le commerce. 88 III - 6 - solution de Tris - glycine 10X pour la migration - Tris base 30,3 g - Glycine 144 g - eau distillée QSP 1000 ml III - 7 - tampon de migration ( "Running buffer") - solution Tris glycine 10X 100 ml - SDS à 10% 10 ml Ajuster le pH à 8,2 avec Hcl 12N - eau distillée QSP 1000 ml III - 8 - tampon échantillon ("sample buffer") - Tris 1,5 M pH 6,8 2,68 ml - Bétamercaptoéthanol 2,5 ml - SDS 1,15 g - glycérol pur 4 ml - bleu de bromophénol à 1% dans l'eau (50 mg /5 ml) 0,5 ml IV : réactifs de détection IV - 1 - solution de coloration au bleu de Coomassie brillant. - bleu de coomassie brillant 3,8 g - Ethanol à 95° 1895 ml - Acide acètique 380 ml - Eau distillée 1525 ml ______ Volume total 3800 ml IV - 2 - solution de décoloration sans bleu de Coomassie. - Ethanol à 95° 189 ml - Acide acètique 135 ml - Eau distillée 1800 ml ______ Volume total 2124 ml 89 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1- AUSTIN ELISABETH A., GRAVES J. 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