VisuLize-FVIII ELISA kit - quantitative

Transcription

onto the well. The assay is calibrated using the calibrator plasma provided
in the kit.
REAGENTS
A.
**REPRESENTATIVE DATASHEET**
VisuLize™ FVIII Antigen Kit
96 Test Enzyme Immunoassay Kit for
Factor VIII (FVIII) antigen.
For In Vitro Diagnostic Use.
Product # FVIII-AG
Store at 2–
8oC.
Description of Reagent Items
Item 1: Foil pouch containing 6 strips, each containing 16 wells coated with
sheep antibody to human FVIII.
Item 2: 2 vials of Calibrator Plasma, each lyophilized from 1 mL plasma.
Item 3: 2 vials of Control Plasma A, each lyophilized from 1 mL plasma.
Item 4: 2 vials of Control Plasma B, each lyophilized from 1 mL plasma.
Item 5: 1 vial containing 50 mL of 20X Wash Buffer Concentrate.
Item 6: 3 vials, each containing 20 mL of buffered Sample Diluent.
Item 7: 1 vial containing 12 mL peroxidase-labeled sheep
detecting antibody.
Item 8: 1 vial containing 12 mL of tetramethylbenzidine (TMB) substrate.
Item 9: 1 vial containing 12 mL Stop Solution (0.2 M Sulphuric acid).
C
Do not freeze.
INTENDED USE
The VisuLize™ FVIII Antigen kit is an Enzyme Immunoassay for the
quantitative determination of Factor VIII antigen in human plasma samples
and Factor VIII concentrates using the double antibody enzyme linked
immuno-sorbent assay (ELISA).
SUMMARY
Factor VIII (formerly referred to as antihaemophilic globulin and Factor VIII:C)
is a large glycoprotein with a molecular weight of 320000 daltons that
circulates in plasma at a concentration of approximately 200 ng/mL.1,2 FVIII
is stabilized by association with von Willebrand Factor to form a FVIII-vWF
complex required for the normal survival of FVIII in vivo (t1/2 of 8-12 hours).3
FVIII is a pro-cofactor that is activated through limited proteolysis by
thrombin. In this process FVIIIa dissociates from vWF to combine with
activated Factor IX, calcium and a phospholipid surface where it is an
essential cofactor in the assembly of the Factor X activator complex.4,5 Once
dissociated from vWF, FVIIIa is susceptible to inactivation by activated
Protein C and by non-enzymatic decay.4
The biological importance of Factor VIII is demonstrated in Hemophilia A, a
congenital bleeding disorder occurring primarily in males that results from
an X-chromosome-linked deficiency of FVIII.6 The prevalence of Hemophilia
A has been estimated to be between 1/5000 and 1/10000.6 The severity of
the deficiency generally correlates with the severity of the disease.
Individuals with <1% Factor VIII activity are classified as severe patients,
those with between 1 and 5% Factor VIII activity are classified as moderate
and those with between 5 and 40% Factor VIII activity are classified as mild
hemophiliacs.7 Some Hemophiliacs produce a FVIII protein that is partially
or totally inactive. In these cases, the Factor VIII activity is low but the
antigen levels are normal or near normal. These patients, comprising
approximately 5% of Hemophilia A patients, are termed cross-reacting
material (CRM)-positive.8 The production of neutralizing antibodies to FVIII
also occurs in 5-20% of Hemophiliacs.9,10
The laboratory diagnosis of Factor VIII deficiency typically involves
quantitative determinations based on procoagulant levels (functional activity
of Factor VIII typically measured by clotting assay). Clinical bleeding
symptoms may also be used in the diagnosis and classification, however, the
quantitative procoagulant measurement is the preferred method of
classifying the severity of hemophilia.7 An ELISA for Factor VIII antigen may
be used in conjunction with the functional assays in the assessment of
Factor VIII replacement therapies, assessment of carrier status as well as to
distinguish those patients that may be deemed CRM-Positive.
PRINCIPLE OF ENZYME IMMUNOASSAY
Strip wells are pre-coated with sheep polyclonal antibody to human FVIII.
Plasma samples are diluted and applied to the wells. The FVIII antigen
present binds to the coated antibody. After washing away unbound material,
peroxidase-labeled sheep detecting antibody is applied and allowed to bind
to the captured FVIII. The wells are again washed and a solution of TMB (the
peroxidase substrate tetramethylbenzidine) is applied and allowed to react
for a fixed period of time. A blue color develops which changes to yellow
upon quenching the reaction with acid. The color formed is measured
spectrophotometrically in a microplate reader at 450 nm. The absorbance
at 450 nm is directly proportional to the quantity of FVIII antigen captured
B. Caution and Warning
This kit is intended for use by personnel trained in laboratory procedures
and universal precautions for the use of chemicals and potentially
biohazardous substances. Some items contain human source material. Each
unit of source plasma used in the preparation of this product has been
tested by FDA approved methods and found negative for the presence of
Human Immunodeficiency Virus (HIV) Type I and Type II, Hepatitis B surface
antigen (HBSAg) as well as for Hepatitis C (HCV). However, no test can offer
complete assurance that products derived from human blood will not
transmit infectious diseases. As with all materials of human origin, this
product should be handled as a potentially infectious material.
The substrate TMB (tetramethylbenzidine) has reduced toxicity, but
precautions should still be taken to avoid direct contact. The use of gloves
and safety glasses is recommended.
The Stop Solution contains dilute sulphuric acid (0.2 M), which is corrosive.
The use of gloves and safety glasses is recommended.
The disposal of waste materials must be carried out according to current
local regulations.
For a Material Safety Data Sheet for this product contact Affinity Biologicals
Inc.
C.
Reagent Preparation
Item 1 (Antibody-coated strips with frame): Just prior to use, open pouch
and remove strips and frame. Unused strips should be replaced in the pouch
and resealed. Strips may be used directly, see Procedure section C: Assay
Procedure.
Item 2 (Calibrator plasma): Reconstitute one vial with 1.0 mL of reagent
grade water. Allow contents to dissolve for 15 minutes at room temperature
with occasional swirling. Stability after reconstitution is 4 hours at ambient
(18-25oC), or 30 days at –20o C.
Items 3 and 4 (Control plasmas): Reconstitute one vial of each plasma with
1.0 mL of reagent grade water. Allow contents to dissolve for 15 minutes at
room temperature with occasional swirling. Stability after reconstitution is 4
hours at ambient (18-25oC), or 30 days at –20o C.
Item 5 (20X Wash Buffer Concentrate): Allow vial to warm to room
temperature before use. Ensure any crystals that may have formed are
dissolved before proceeding. If necessary the vial can be warmed to 37oC
until all crystals have dissolved. Dilute the concentrate 1/20 before use. For
every 2 strips (32 wells), add 16 mL concentrate to 304 mL reagent grade
water and mix. Stability after dilution is 1 week at 2–8oC.
Items 6-9 are supplied ready to use.
D.
Storage and Stability
Intact kits and un-reconstituted reagents are stable until the expiration date
stated on the box and individual reagent labels when stored at 2–8°C.
SPECIMEN COLLECTION
Blood is collected into 3.2% Buffered Citrate anticoagulant tubes at a ratio of
9 volumes blood to 1 volume anticoagulant and gently mixed by inversion.
Centrifuge at a minimum of 1500 x g for 15 minutes (NCCLS Guideline H21A411). Remove supernatant plasma and use within 4 hours or freeze below
–20oC for up to 1 month.
Page 1 of 4
Document OPI0138, rev 6, March 2009
PROCEDURE
A.
3.
Foil pouch containing 6 strips of antibody coated wells.
Calibrator Plasma, lyophilized.
Control Plasma A, lyophilized.
Control Plasma B, lyophilized.
20X Wash Buffer Concentrate.
Sample Diluent.
Detecting antibody solution.
TMB substrate.
Stop Solution.
Adhesive Plate Sealer.
B.
Additional Material Required (but not provided)
Microplate compatible spectrophotometer capable of 450 nm.
C. Assay Procedure
1.
2.
Preparation of Calibrator Plasma Dilutions: Dilute the Calibrator Plasma
(reconstituted Item 2) into Sample diluent (Item 6) as detailed in Table
1 below: (NOTE: 100% = 1.0 IU/mL)
TABLE 1:
Dilution
Calibrator Plasma
Sample Diluent
100%
175 µL
525 µL
50%
350 µL of 100%
350 µL
25%
350 µL of 50%
350 µL
12.5%
350 µL of 25%
350 µL
6.25%
350 µL of 12.5%
350 µL
3.13%
350 µL of 6.25%
350 µL
1.56%
350 µL of 3.13%
350 µL
0.79%
350 µL of 1.56%
350 µL
Control plasma A (reconstituted Item 3) and normal test plasmas are
diluted 1/8 and 1/16. Add 100 µL plasma into 700 µL sample diluent
(Item 6), mix, then add 350 µL of this 1/8 dilution into 350 µL sample
diluent to obtain the 1/16 dilution. Control Plasma B (reconstituted
Item 4) and samples low in FVIII antigen (Haemophiliac samples)
should be run at lower dilutions of 1/4 and 1/8. Add 175 µL plasma
into 525 µL sample diluent (Item 6), mix, then add 350 µL of this 1/4
dilution into 350 µL sample diluent to obtain the 1/8 dilution.
Place desired number of strips into frame.
Pipette into each pre-coated well:
Test Sample
100 µL
FVIII CAPTURE
(run in duplicate)
Cover strips with the plate sealer and
incubate 1 hour at ambient temperature.
Empty wells and wash with 300 µl diluted wash buffer 3 times.
Detecting Antibody
100 µL
DETECTING
Solution (Item 7)
ANTIBODY
Cover strips with the plate sealer and
incubate 45 minutes at ambient temperature.
Empty wells and wash with 300 µl diluted wash buffer 3 times.
TMB Substrate
100 µL
COLOR
(Item 8)
DEVELOPMENT
Allow color to develop for exactly 10 minutes
at ambient temperature.
Stop Solution
100 µL
(Item 9)
(Add to each well in
same order in which
the TMB was added)
Read plate at a wavelength of 450 nm within
30 minutes of adding Stop Solution.
If necessary, keep plate frame for use with any unused strips.
Discard used strips.
Reagent grade water for reconstitution and for dilution
Single-channel adjustable volume pipettes
Multi-channel pipettes
Pipette Tips
Laboratory timer
Microplate strip-well washer device
PROCEDURAL NOTES:

Reconstitute reagents as described in REAGENTS, Section C,
Reagent Preparation. Allow reagents to warm to room
temperature before use.

It is recommended that all calibrator, control and test sample
dilutions be run in duplicate and that each run include a buffer
blank (see Assay Calibration section).

All dilutions must be made just prior to use in the assay.

Do not allow the wells to become dry at any time. Keep plate
covered during incubations.

Plasma samples should not be applied at dilutions lower than
1/4.

Do not use kit components from different lot numbers.

Incubation temperatures above or below normal room
temperature (18 -25°C) may contribute to inaccurate results.

Do not use kit components beyond expiration date

Used strips must be discarded and not re-used.
Assay
PLATE
PREPARATION
STEP
Material Provided
CALIBRATION
A.
Assay Calibration
The FVIII antigen value stated on the Calibrator Plasma vial has been
determined by comparison to a secondary standard that is traceable to the
WHO International standard for FVIII antigen 02/150. This antigen value
should be used as the concentration of the initial dilution of the calibrator
plasma.
It is recommended that the plate be blanked on wells that have received
Sample Diluent alone instead of diluted sample (reagent blank wells).
B.
Reference Curve and Calculation of Results
The reference curve is a log-log plot of the mean absorbance values (y axis)
versus the FVIII antigen concentration (x axis). The Factor VIII antigen
content of test samples and controls can be read from the reference curve
and multiplied by the appropriate dilution factor. Under the conditions
described here, a sample diluted 1/4 will have a dilution factor of 1, a
dilution of 1/8 will have a dilution factor of 2, and a dilution of 1/16 has a
dilution factor of 4.
Example: Test plasma when diluted 1/8 gives an absorbance corresponding
to 45% when read from the reference curve. This value would be multiplied
by a dilution factor of 2 to obtain the corrected value of 90%.
QUALITY CONTROL
The supplied Control Plasmas (Item 3 and 4) should be assayed with every
series of samples that are run. The FVIII antigen values obtained for test
samples should be considered suspect if the values obtained for the control
plasmas fall outside of the range stated on the Control Plasma labels.
LIMITATIONS AND INTERFERENCES
The Factor VIII antigen values obtained using this assay should not be used
in isolation to diagnose disease. Patient history, clinical presentation and
findings from other diagnostic procedures should also be considered.
Clinically significant states are known to exist in which plasma Factor VIII
antigen levels are normal or near-normal in the presence of a significant
reduction in Factor VIII activity.8
This kit has been developed for use with citrated plasma. The use of
samples containing anticoagulants other than 3.2% sodium citrate is not
recommended.
Assay interference due to the presence of drugs or due to the presence of
heterophilic antibodies such as Lupus Anticoagulant (LA) has not been
reported, however, the potential for interference by high levels of
heterophilic antibodies cannot be excluded. The presence of Rheumatoid
Factor in test samples will cause interference in the assay. The theoretical
possibility of test samples containing antibodies to sheep immunoglobulin
may also interfere in the assay.
Page 2 of 4
EXPECTED VALUES
The normal range for Factor VIII as reported in the literature is 0.5-1.8
IU/mL.12 Each laboratory should determine a normal range independently
but results from three lots measured in 99 healthy individuals indicate a
normal reference interval for FVIII antigen of 0.64-1.89 IU/mL (mean 1.268
IU/mL, SD = 0.3116).
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
A.
Specificity
This assay measures Factor VIII antigen in human plasma, therapeutic
Factor VIII concentrates and recombinant Factor VIII preparations.
B.
Detection Limit
When assay is performed as indicated in Section C, Assay Procedure, the
detection limit of this assay is 0.008 IU/mL (0.8 %) Factor VIII antigen. The
upper limit of detection may vary with each lot of kit depending on the
assayed value of the calibrator plasma supplied in the kit. Samples with
values outside the range of the reference curve should be re-tested at an
appropriate dilution to obtain accurate results.
C.
Method Comparison:
The average results of three lots of the VisuLize™ Factor VIII Antigen kit were
compared internally to the Coamatic® FVIII Assay on 142 patient samples
containing Factor VIII levels ranging across the entire detection range. The
correlation co-efficient (r) was 0.970 (R2 =0.940, y=1.2059x + 0.1053). The
VisuLize™ Factor VIII Antigen kit was also compared at two external testing
sites to the Coamatic® FVIII Assay on patient samples with Factor VIII levels
ranging across the entire detection range. At external site #1, 110 samples
were tested and the correlation co-efficient (r) was 0.969 (R2 =0.9381
y=1.2261x + 0.1085). At external site #2, 81 samples were tested and the
correlation co-efficient (r) was 0.974 (R2 =0.9488, y=1.1768x + 0.0242).
D.
Precision
Intra-assay Precision, Method 1: In each of three lots of product, normal and
abnormal plasma samples were tested in 4 assays total with 38 replicates
per sample per plate. The mean coefficient of variation (CV) from all results
was 4.56%
Intra-assay Precision, Method 2: Three plasmas with different Factor VIII
antigen concentrations were tested in replicates of 8 in 20 assay events
using 3 lots of product. The intra-assay coefficient of variation (CV) was
calculated according to NCCLS Guideline EP5-A13 and is indicated in the
summary below for each Factor VIII level. The mean CV from all results by
this method was 4.51%.
Lot 1
Lot 2
Lot 3
1.35-1.75 IU/mL sample
2.17%
2.85%
3.89%
2.85%
3.33%
5.19%
<0.055 IU/mL sample
5.23%
6.83%
8.25%
Inter-assay Precision: Three plasmas with different Factor VIII antigen
concentrations were tested in replicates of 8 in 20 assay events using 3 lots
of product. The inter-assay coefficient of variation (CV) was calculated
according to NCCLS Guideline EP5-A13 and is indicated in the summary
below for each Factor VIII level. The mean CV from all results by this method
was 4.69%
Lot 1
Lot 2
Lot 3
2.12%
3.92%
4.11%
1.63%
3.19%
7.30%
<0.055 IU/mL sample
6.79%
5.49%
7.71%
E.
Lot-to-Lot Variability
H
h
Expiry date
Catalogue Number
l
Temperature limitation
M
i
X
Manufacturer
Consult instructions for use
Contains sufficient for <n> tests
REFERENCES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Pittman, D.D., Kaufman, R.J. Structure-Function Relationships of
Factor VIII Elucidated through Recombinant DNA Technology. Thromb.
Haemostas., 61(2), pp. 161-165, 1989.
Hoyer LW, Wyshock EG, Colman RW, “Coagulation Cofactors: Factor V
and VIII” in Hemostasis and Thrombosis, 3rd Edition, eds. RW Colman,
J Hirsh, VJ Marder and EW Salzman, pp. 109-133, J.B. Lippincott Co.,
Philadelphia, 1994.
Brettler, D.B., Levine, P.H.,”Clinical Manifestations and Therapy of
Inherited Coagulation Factor Deficiencies” in Hemostasis and
Thrombosis, 3rd Edition, eds. RW Colman, J Hirsh, VJ Marder and EW
Salzman, pp. 169-183, J. B. Lippincott Co., Philiadelphia, 1994.
Lenting, P.J., van Mourik, J.A., Mertens, K. The Life Cycle of Coagulation
Factor VIII in View of its Structure and Function. Blood, 92(11), pp.
3983-3996, 1998.
Furie B, Limentani SA, Rosenfield CG. A Practical Guide to the
Evaluation and Treatment of Hemophilia, Blood, 1994, 84(1), pp. 3-9.
Hedner, U., Ginsburg, D., Lusher, J.M., High, K. A. Congenital
Hemorrhagic Disorders: New Insights into the Pathophysiology and
Treatment of Hemophilia. Hematology, pp. 241- 290, 2000.
White GC, Rosendaal F, Aledort LM, Lusher JM, Rothschild C, Ingerslev
J. Definitions in Hemophilia, Recommendation of the Scientific
Subcommittee on Factor VIII and Factor IX of the Scientific and
Standardization Committee of the International Society on Thrombosis
and Haemostasis, Thrombosis and Haemostasis, 2001, 85, p. 560.
Amano, K., Sarkar, R., Perberton, S., Kemball-Cook, G., Kazazian, H.H.,
Kaufman, R.J. The Molecular Basis for Cross-Reacting Material-Positive
Hemophilia A Due to Missense Mutations Within the A2-Domain of
Factor VIII. Blood, 91(2), pp. 538-548, 1998.
Feinstein, D.I., in Hemostasis and Thrombosis, 3rd Edition, eds. RW
Colman, J Hirsh, VJ Marder and EW Salzman, pp. 881-905, J.B.
Lippincott Co., Philadelphia, 1994.
Bhopale, G.M., Nanda, R.K., Blood Coagulation Factor VIII: An overview,
J. Biosci, 28(6), 783-789, 2003.
“Collection, Transport and Processing of Blood Specimens for
Coagulation Testing and General Performance of Coagulaton Assays,
Approved Guideline, Third Edition. H21-A4, NCCLS, Vol. 23. No. 35,
1998.
Kasper, C.K., Herediatry Clotting Factor Deficiencies and Their
Management, 2005, Monograph.
“Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices;
Approved Guideline”, EP5-A, NCCLS, Vol. 19, No. 2, Feb. 1999.
“Graphical Symbols for Use in the Labelling of Medical Devices”, EN
980:2003, European Committee for Standardization, April 2003.
94 control samples with Factor VIII antigen values ranging from 0.23-2.3
IU/mL were tested in duplicate on three lots to determine assay precision
between lots. The mean lot-to-lot variability was 7.78%.
SYMBOL LEGEND 14
V
g
P
For in vitro diagnostic use
Batch code
Authorized Representative
Page 3 of 4
Limited Warranty: This product is warranted to perform in accordance with
its labelling and literature. Affinity Biologicals Inc. disclaims any implied
warranty of merchantability or fitness for any other purposes, and in no
event will Affinity Biologicals Inc. be liable for any consequential damages
arising out of aforesaid express warranty.
M
P
AFFINITY BIOLOGICALS INC.
1395 Sandhill Drive
Ancaster, ON
CANADA L9G 4V5
Tel: (905) 304-9896
(800) 903-6020
Fax: (905) 304-9897
[email protected]
Emergo Europe
Molenstraat 15
2513 BH The Hague
The Netherlands
+31 (0)70.345.8570
Page 4 of 4
gespült und es wird eine Lösung TMB (mit dem Peroxidasesubstrat
Tetramethylbenzidin) aufgebracht, damit sie für eine definierte Zeit
reagieren kann. Es entsteht eine blaue Farbe, die ins Gelbe umschlägt,
sobald die Reaktion durch Säure gestoppt wird. Die gebildete Farbe wird
spektrophotometrisch mit einem Mikroplattenreader mit einer Wellenlänge
von 450 nm gemessen. Die Absorption bei 450 nm ist direkt proportional zur
Menge des F-VIII-Antigen, der in dem Well immobilisiert wurde. Der Assay
wird mit dem Kalibratorplasma kalibriert, das in dem Kit mitgeliefert wurde.
VisuLize™ FVIII Antigen-Kit
REAGENZIEN
Enzym-Immunoassaykit mit 96 Tests auf Faktor VIII (FVIII)
Antigen
für In-vitro-Diagnose
Produkt-Nr. FVIII-AG
C
Bei 2 bis 8 °C aufbewahren. Nicht einfrieren.
BESTIMMUNGSGEMÄSSER GEBRAUCH:
Der VisuLize FVIII Antigen-Kit ist ein Enzym-Immunoassay für die quantitative
Bestimmung des Faktor-VIII-Antigens in humanen Plasmaproben, wobei
Faktor VIII in einem ELISA-Test (enzyme linked immunosorbent assay) an
zwei Antikörper gebunden wird.
ZUSAMMENFASSUNG
Faktor VIII (früher bezeichnet als antihämophiles Globulin und Faktor VIII: C)
ist ein großes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 320.000
Dalton, das im Plasma mit einer Konzentration von etwa 200 ng/ml
zirkuliert.1,2 FVIII wird durch Zusammenwirken mit dem von WillebrandFaktor stabilisiert und bildet einen FVIII-vWF-Komplex, der erforderlich ist,
um die normale Beständigkeit von FVIII in vivo (Halbwertszeit von 8 bis 12
Stunden) sicherzustellen.3 FVIII ist ein Pro-Kofaktor, der durch die limitierte
Proteolyse durch Thrombin aktiviert wird. Bei diesem Prozess trennt sich
FVIIIa von vWF und wird mit dem aktivierten Faktor IX sowie mit Kalzium und
einer Phospholipidoberfläche kombiniert, wo es ein essentieller Kofaktor bei
der Bildung des Faktor-X-Aktivatorkomplexes ist.4,5 Nach der Trennung von
vWF reagiert FVIIIa empfindlich auf die Deaktivierung durch aktiviertes
Protein C und durch nicht-enzymatische Zersetzung.4
Die biologische Bedeutung von Faktor VIII wird bei Hämophilie A deutlich,
einer ererbten Bluterkrankung, die vorwiegend bei Männern auftritt und auf
einen Defekt im X-Chromosom für FVIII zurückzuführen ist.6 Hämophilie A
kommt bei einer von 5.000 bis 10.000 Personen vor.6 Je schwerer der
Gendefekt, umso schwerer die Erkrankung. Personen, bei denen die Aktivität
des Faktors VIII unter 1 % liegt, werden als schwere Hämophilieklassifiziert,
Personen mit einem Faktor VIII zwischen 1 und 5 % als mittelschwere Fälle
und Patienten mit einer Aktivität des Faktors VIII zwischen 5 und 40 % als
leichte Hämophilie.7 Viele Bluterkranke produzieren ein Protein FVIII, das
ganz oder teilweise inaktiv ist. In diesen Fällen ist die Aktivität des Faktors
VIII niedrig, aber die Antigenspiegel sind normal oder fast normal. Diese
Patienten machen etwa 5 % der Patienten mit Hämophilie A aus und werden
als CRM-positiv bezeichnet.8 Eine Produktion von neutralisierenden
Antikörpern für FVIII tritt ebenfalls bei 5 bis 20 % der Bluterkranken ein.9,10
Die Labordiagnose des Faktor VIII-Mangels besteht in der Regel aus
quantitativen Bestimmungen in Abhängigkeit von den Proagulansspiegeln
(die funktionelle Aktivität des Faktors VIII wird in der Regel durch einen
Gerinnungstest bestimmt). Zur Diagnose und Klassifizierung können auch
klinische Blutungssysteme herangezogen werden, jedoch ist die quantitative
Bestimmung des Proagulans die bevorzugte Methode zur Klassifizierung des
Schweregrads der Hämophilie.7 Ein ELISA-Test für Faktor-VIII-Antigen kann
zusammen mit den Funktionsassays zur Bewertung der Ersatztherapien für
Faktor VIII eingesetzt werden, ebenso eine Bewertung des Trägerstatus, um
die Patienten zu erkennen, die als CRM-positiv gelten.
PRINZIP DES ENZYM-IMMUNOASSAYS
Mikrotiterstreifen-Wells werden mit polyklonalen Schaf-Antikörpern für
humanes FVIII vorbeschichtet. Danach werden Plasmaproben verdünnt und
auf die Wells aufgetragen. Das vorhandene F-VIII-Antigen bindet sich an den
als Beschichtung aufgebrachten Antikörper. Nach dem Abspülen der nicht
gebundenen Substanzen wird ein mit Peroxidase markierter
Erkennungsantikörper aufgetragen, der aus Schaf gewonnen wird und sich
an den gebundenen FVIII binden kann. Danach werden die Wells erneut
A.
Beschreibung der Reagenzien
Reagenz 1: Folientasche mit 6 Streifen mit jeweils 16 Wells, die mit SchafAntikörper für humanen FVIII beschichtet sind
Reagenz 2: 2 Ampullen Kalibratorplasma, jeweils aus 1 ml Plasma
lyophilisiert
Reagenz 3: 2 Ampullen Kontrollplasma A, jeweils aus 1 ml Plasma
lyophilisiert
Reagenz 4: 2 Ampullen Kontrollplasma B, jeweils aus 1 ml Plasma
lyophilisiert
Reagenz 5: 1 Ampulle mit 50 ml 20-fachem Waschpufferkonzentrat
Reagenz
6:
3
Ampullen
mit
jeweils
20
ml
gepufferter
Probenverdünnungsmedium
Reagenz 7: 1 Ampulle mit 12 ml Peroxidase-markierter Schaf-Antikörper zur
Detektion
Reagenz 8: 1 Ampulle mit 12 ml Tetramethylbenzidinsubstrat (TMB)
Reagenz 9: 1 Ampulle mit 12 ml Stopplösung (Schwefelsäure 0,2 M)
B. Sicherheits- und Warnhinweise
Dieser Kit ist zur Verwendung durch geschultes Personal im Labor
vorgesehen. Es sind die allgemeinen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang
mit Chemikalien und potentiell infektiösen Stoffen einzuhalten. Einige
Substanzen enthalten Material humanen Ursprungs. Jede Quelle des
Ausgangsplasmas, das bei der Herstellung dieses Produkts verwendet
wurde, wurde gemäß den von der FDA zugelassenen Verfahren getestet, und
es wurden keine Erreger des HIV-Typs I und II, keine Oberflächenantigene für
Hepatitis B (HBSAg) sowie keine Nachweise für Hepatitis C (HCV) festgestellt.
Es kann jedoch kein Test absolute Sicherheit gewährleisten, dass Produkte,
die aus humanem Blut gewonnen wurden, nicht doch Infektionskrankheiten
übertragen. Wie bei allen Materialien menschlichen Ursprungs sollte dieses
Produkt als potentiell infektiöses Material behandelt werden.
Das Substrat TMB (Tetramethylbenzidin) hat eine geringe Toxizität, es sollten
jedoch Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, um einen direkten Kontakt
zu vermeiden. Wir empfehlen die Verwendung von Handschuhen und
Arbeitsschutzbrillen.
Die Stopplösung enthält verdünnte Schwefelsäure (0,2 M), die korrosiv wirkt.
Wir empfehlen die Verwendung von Handschuhen und Arbeitsschutzbrillen.
Die Entsorgung von Abfallmaterialien muss entsprechend den geltenden
lokalen Vorschriften erfolgen.
Wenn Sie ein Materialsicherheitsdatenblatt für dieses Produkt benötigen,
wenden Sie sich bitte an Affinity Biological Inc.
C.
Reagenzvorbereitung
Reagenz 1 (mit Antikörper beschichtete Streifen mit Rahmen): Unmittelbar
vor der Verwendung die Tasche öffnen und Streifen und Rahmen
herausnehmen. Nicht verwendete Streifen wieder in die Tasche legen und
neu versiegeln. Die Streifen können direkt verwendet werden, siehe
Abschnitt C: Ablauf des Tests.
Reagenz 2 (Kalibratorplasma): 1 Ampulle mit 1,0 ml reagenzgeeignetem
Wasser rekonstituieren. Den Inhalt 15 min bei Raumtemperatur auflösen
und hin und wieder schütteln. Nach der Rekonstituierung 4 Stunden lang bei
Raumtemperatur (18 bis 25 oC) bzw. 30 Tage bei –20 o C stabil.
Reagenz 3 und 4 (Kontrollplasma): 1 Ampulle des jeweiligen Plasmas mit
1,0 ml reagenzgeeignetem Wasser rekonstituieren. Den Inhalt 15 min bei
Raumtemperatur auflösen und hin und wieder schütteln. Nach der
Rekonstituierung 4 Stunden lang bei Raumtemperatur (18 bis 25 oC) bzw.
30 Tage bei –20 o C stabil.
Reagenz 5 (20-faches Waschpufferkonzentrat): Vor der Verwendung muss
die Ampulle auf Raumtemperatur erwärmt werden. Eventuell gebildete
Kristalle müssen aufgelöst sein, bevor der nächste Schritt ausgeführt wird.
Gegebenenfalls die Ampulle bei 37 oC erwärmen, bis sich alle Kristalle gelöst
haben. Das Konzentrat im Verhältnis 1:20 vor der weiteren Verwendung
verdünnen. Für jeweils 2 Streifen (32 Wells) 16 ml Konzentrat mit 304 ml
reagenzgeeignetem Wasser mischen. Die Lösung ist nach der Verdünnung 1
Woche bei 2 bis 8 oC stabil.
Die Reagenzien 6 bis 9 werden gebrauchsfertig geliefert.
Seite 1 von 4
Dokument OPI0138, 6. Fassung, März 2009
D.
Aufbewahrung und Stabilität
3,13 %
1,56 %
0,79 %
Intakte Kits und nicht rekonstituierte Reagenzien sind bis zum Verfallsdatum
auf der Verpackung und auf den einzelnen Reagenzetiketten stabil, wenn sie
bei 2 bis 8 °C gelagert werden.
PROBENNAHME
Kontrollplasma A (rekonstituiertes Reagenz 3) und normale
Testplasmen werden im Verhältnis 1:8 und 1:16 verdünnt. 100 µl
Plasma zu 700 µl Probenverdünnungsmedium (Reagenz 6) geben,
mischen und 350 µl dieser Verdünnung im Verhältnis 1:8 in 350 µl
Probenverdünnungsmedium geben, um eine Verdünnung 1:16 zu
erhalten. Kontrollplasma B (rekonstituiertes Reagenz 4) und Proben
mit niedrigem FVIII-Gehalt (hämophile Proben) sollten mit
Verdünnungen von 1:4 und 1:8 verarbeitet werden. 175 µl Plasma in
575 µl Probenverdünnungsmedium (Reagenz 6) geben, mischen und
dann 350 µl dieser Verdünnung im Verhältnis 1:4 in 350 µl
Probenverdünnungsmedium geben, um die Verdünnung 1:8 zu
erhalten.
3.
Test
MikrotiterplattenVORBEREITUNG
SCHRITT
ABLAUF
Gelieferte Materialien
Folientasche mit 6 Streifen mit Wells, die mit Antikörper beschichtet sind
Kalibratorplasma, lyophilisiert
Kontrollplasma A, lyophilisiert
Kontrollplasma B, lyophilisiert
20-faches Waschpufferkonzentrat
Probenverdünnungsmedium
Peroxidase-markierter Antikörper zur Detektion
TMB-Substrat
Stopplösung
Versiegelung für die Mikrotiterplatte
B. Weitere benötigte
Lieferumfang)
Materialien
(gehören
nicht
Die gewünschte Anzahl Streifen in den
Rahmen setzen.
Folgende Flüssigkeiten in jedes vorbeschichte
Well pipettieren:
Testprobe
100 µl
FVIII-BINDUNG
(Doppelwerte)
Die Streifen abdecken und 1 Stunde bei
Raumtemperatur inkubieren.
Die Wells entleeren und 3-mal mit 300 µl verdünnter Waschpufferlösung
spülen.
Peroxidase-markierter
100 µl
Detektion
Antikörper
(Reagenz 7)
Die Streifen abdecken und 45 Minuten bei
Raumtemperatur inkubieren.
Die Wells entleeren und 3-mal mit 300 µl verdünnter Waschpufferlösung
spülen.
TMB-Subtrat
100 µl
FARBENTWICKLUNG
(Reagenz 8)
Die Farbbildung bei Zimmertemperatur exakt
10 min verfolgen.
Stopplösung
100 µl
(Reagenz 9)
(Die Stopplösung in
der gleichen
Reihenfolge zu
jedem Well geben,
in der die TMBLösung hinzugefügt
wurde)
Die Mikrotiterplatte bei einer Wellenlänge von 450 nm innerhalb von 30
min nach Zusatz der Stopplösung ablesen.
Gegebenenfalls den Plattenrahmen für weitere nicht verwendete Streifen
aufheben. Verwendete Streifen entsorgen
zum
Reagenzgeeignetes Wasser zur Rekonstituierung und Verdünnung
Einstellbare Volumenpipetten
Mehrkanalpipetten
Pipettenspitzen
Stoppuhr
Mikroplattenstreifenwasher
Für Mikroplatten geeignetes Spektrophotometer für eine Wellenlänge von
450 nm
C. Ablauf des Tests
HINWEISE ZUM ABLAUF:

Die Reagenzien, wie im Abschnitt C „REAGENZIEN,
Reagenzvorbereitung“ beschrieben, rekonstituieren. Vor der
Verwendung müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur
gebracht werden.

Alle Kalibratoren, Kontrollen und Testprobenverdünnungen
sollten in Doppelwerten gemessen werden, und jeder Lauf sollte
einen Blank (siehe Abschnitt Testkalibrierung) enthalten.

Alle Verdünnungen müssen unmittelbar vor dem Test angefertigt
werden.

Die Wells dürfen keinesfalls austrocknen. Die Platte während der
Inkubationen abdecken.

Plasmaproben dürfen nicht mit Verdünnungen unter 1:4
verarbeitet werden.

Keine Kitkomponenten mit verschiedenen Chargennummern
verwenden.

Inkubationstemperaturen über oder unter der normalen
Raumtemperatur (18 bis 25 °C) können die Ergebnisse
verfälschen.

Kitkomponenten nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.

Verwendete Streifen müssen entsorgt und dürfen nicht wieder
verwendet werden.
1.
Vorbereitung
der
Kalibratorplasmaverdünnungen:
Das
Kalibratorplasma
(rekonstituiertes
Reagenz
2)
mit
dem
Probenverdünnungsmedium (Reagenz 6), wie in Tabelle 1 angegeben,
verdünnen: (HINWEIS: 100 % = 1,0 IU/ml)
TABELLE 1:
Verdünnung
100 %
50 %
25 %
12,5 %
6,25 %
Kalibratorplasma
175 µl
350 µl von 100 %
350 µl von 50 %
350 µl von 25 %
350 µl von 12,5 %
Probenverdünnungsmedi
um
525 µl
350 µl
350 µl
350 µl
350 µl
350 µl
350 µl
350 µl
2.
Das Blut wird in mit 3,2 % Citrat gepufferten Röhrchen mit einem Verhältnis
von 9 Teilen Blut auf 1 Teil Antikoagulanzmittel gesammelt und durch
Umdrehen vorsichtig gemischt. Mindestens 15 min lang mit 1500 g
zentrifugieren (NCCLS-Richtlinie H21-A411). Das überstehende Plasma
innerhalb von 4 Stunden verwenden oder unter -20 oC bis zu 1 Monat
einfrieren.
A.
350 µl von 6,25 %
350 µl von 3,13 %
350 µl von 1,56 %
KALIBRIERUNG
A.
Testkalibrierung
Der auf der Ampulle mit dem Kalibratorplasma angegebene Antigenwert für
FVIII wurde durch Vergleich mit einem sekundären Standard ermittelt, der
auf den internationalen Standard für Antigen 02/150 FVIII der WHO
zurückgeht. Als Konzentration der anfänglichen Verdünnung des
Kalibratorplasmas sollte dieser Antigenwert verwendet werden.
Wir empfehlen, auf der Mikrotiterplatte ein Well zu reservieren, in das allein
Probenverdünnungsmedium anstatt verdünnte Probe gefüllt wird (d. h. einen
Reagenzienblank).
B.
Referenzkurve und Berechnung der Ergebnisse
Die Referenzkurve ist eine doppelt logarithmische Darstellung der
Absorptionsmittelwerte (y-Achse) in Abhängigkeit von der FVIII-antigenKonzentration (x-Achse). Der Faktor-VIII-antigen-Gehalt dieser Testproben
und Kontrollen lässt sich aus der Referenzkurve ablesen und mit dem
entsprechenden Verdünnungsfaktor multiplizieren. Unter den hier
beschriebenen Bedingungen ergibt sich für eine im Verhältnis 1:4 verdünnte
Probe ein Verdünnungsfaktor von 1, für ein Verhältnis von 1:8 ein
Verdünnungsfaktor 2 und für ein Verdünnungsverhältnis 1:16 ein
Verdünnungsfaktor 4.
Beispiel: Testplasma mit einem Verdünnungsverhältnis 1:8 ergibt eine
Absorption, die 45 % des Werts aus der Referenzkurve entspricht. Dieser
Seite 2 von 4
Wert wird dann mit einem Verdünnungsfaktor 2 multipliziert, um den
korrigierten Wert von 90 % zu erhalten.
QUALITÄTSKONTROLLE
Die mitgelieferten Kontrollplasmen (Reagenzien 3 und 4) sollten bei jeder
Probenserie, die verarbeitet wird, gemessen werden. Die FVIII-antigen-Werte
für die Testproben sollten dann überprüft und eventuell wiederholt werden,
wenn die Werte für die Kontrollplasmen außerhalb des Bereichs liegen, der
auf den Etiketten der Kontrollplasmen angegeben ist.
EINSCHRÄNKUNGEN UND INTERFERENZEN
Wiederholgenauigkeit innerhalb der Tests, Methode 2: Es wurden 3 Plasmen
mit verschiedenen Faktor-VIII-antigen-Konzentrationen in 8 Replikaten bei
20 Testereignissen mit 3 Chargen des Produkts getestet. Der
Variationskoeffizient zwischen den Tests wurde entsprechend der NCCLSRichtlinie EP5-A13 berechnet und ist in der Zusammenfassung für jeden
Faktor-VIII-Spiegel angegeben. Der mittlere Variationskoeffizient aller
Ergebnisse lag bei dieser Methode bei 4,51 %.
Charge 1 Charge 2 Charge 3
1,35–1,75 IU/ml Probe
2,17 %
2,85 %
3,89 %
2,85 %
3,33 %
5,19 %
< 0,055 IU/ml Probe
5,23 %
6,83 %
8,25 %
Die Antigenwerte für Faktor VIII, die mit diesem Test bestimmt werden,
dürfen nicht allein zur Diagnose der Erkrankung verwendet werden. Die
Krankenakte, die klinische Präsentation und die Ergebnisse anderer
Diagnosen sind ebenfalls zu berücksichtigen. Es sind klinisch signifikante
Fälle bekannt, bei denen die Antigenspiegel von Faktor VIII im Plasma
normal oder fast normal sind und eine signifikante Reduktion der Aktivität
von Faktor VIII vorliegt.8
Dieser Kit wurde für die Verwendung mit Plasma entwickelt, das mit Citrat
angesäuert ist. Es wird empfohlen, keine anderen Antikoagulanzmittel außer
3,2-prozentigem Natriumcitrat einzusetzen.
Über Störungen des Tests durch Medikamente oder aufgrund von
heterogenen Antikörpern wie Lupus-Antikoagulant (LA) sind nicht bekannt,
die Möglichkeit einer Störung durch hohe Konzentrationen heterogener
Antikörper kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Wenn ein
rheumatoider Faktor in den Testproben vorhanden ist, kommt es zu
Störungen der Testergebnisse. Auch die theoretisch mögliche Existenz von
Antikörpern auf Schaf-Immunoglobulin in den Testproben kann die Testwerte
verfälschen.
Wiederholgenauigkeit zwischen den Tests: Es wurden 3 Plasmen mit
verschiedenen Faktor-VIII-antigen-Konzentrationen in 8 Replikaten bei
20 Testereignissen mit 3 Chargen des Produkts getestet. Der
Variationskoeffizient zwischen den Tests wurde entsprechend der NCCLSRichtlinie EP5-A13 berechnet und ist in der Zusammenfassung für jeden
Faktor-VIII-Spiegel angegeben. Der mittlere Variationskoeffizient aller
Ergebnisse lag bei dieser Methode bei 4,69 %.
Charge 1 Charge 2 Charge 3
2,12 %
3,92 %
4,11 %
1,63 %
3,19 %
7,30 %
< 0,055 IU/ml Probe
6,79 %
5,49 %
7,71 %
SOLLWERTE
V
g
P
H
h
Der normale Bereich für Faktor VIII liegt laut Literatur zwischen 0,5 und
1,8 IU/ml.12 Jedes Labor sollte selbst einen Normalbereich festlegen.
Ergebnisse aus drei Chargen, die an 99 gesunden Einzelpersonen gemessen
wurden, deuten darauf hin, dass das normale Referenzintervall Factor VIIIantigen zwischen 0,64 und 1,89 IU/ml (Mittelwert 1,268 IU/ml, SD =
0,3116) liegt.
MESSGENAUIGKEIT
A.
Spezifizität
Dieser Test misst das Faktor-VIII-Antigen in humanem Plasma,
therapeutische Konzentrationen von Faktor VIII und rekombinante FaktorVIII-Zubereitungen.
B.
Erkennungsgrenze
Wird der Test, wie in Abschnitt C „Testablauf“ angegeben, durchgeführt, liegt
die Erkennungsgrenze dieses Tests bei 0,008 IU/ml (0,8 %) für Faktor VIIIantigen. Der obere Detektionsgrenzwert kann bei jeder Kitcharge je nach
dem Textwert des im Kit mitgelieferten Kalibratorplasmas schwanken.
Proben mit außerhalb des Bereichs der Referenzkurve liegenden Werten
sollten mit einer angemessenen Verdünnung neu getestet werden, um
exakte Ergebnisse zu erhalten.
C. Methodenvergleich:
Die durchschnittlichen Ergebnisse von drei Chargen VisuLize® Faktor-VIIIAntigen-Kits wurden intern mit dem Coamatic®FVIII-Test bei 142
Patientenproben mit dem Faktor VIII in Konzentrationen, die den gesamten
Nachweisbereich überdeckten, verglichen. Der Korrelationskoeffizient (r)
betrug 0,970 (R2 = 0,940; y = 1,2059x + 0,1053). Der VisuLize® Faktor-VIIIAntigen-Kit wurde darüber hinaus an zwei externen Test-Standorten mit dem
Coamatic®FVIII-Test bei Patientenproben mit dem Faktor VIII in
Konzentrationen, die den gesamten Nachweisbereich überdeckten,
verglichen. Am externen Standort 1 wurden 110 Proben getestet, der
Korrelationskoeffizient (r) betrug 0,969 (R2 = 0,9381 y = 1,2261x +
0,1085). Am externen Standort 2 wurden 81 Proben getestet, der
Korrelationskoeffizient (r) betrug 0,974 (R2 = 0,9488; y = 1,1768x +
0,0242).
D.
Wiederholgenauigkeit
Wiederholgenauigkeit innerhalb der Tests, Methode 1: Bei jeder der
3 Chargen des Produkts wurden normale und anormale Plasmaproben von
insgesamt 4 Tests mit 38 Replikaten pro Probe und Platte getestet. Der
mittlere Variationskoeffizient aller Ergebnissen lag bei 4,56 %.
E.
Schwankungen von Charge zu Charge
Es wurden 94 Kontrollen mit Faktor-VIII-antigen-Werten zwischen 0,23 und
2,3 IU/ml doppelt bei 3 Chargen getestet, um die Testwiederholgenauigkeit
zwischen verschiedenen Chargen zu bestimmen. Die mittlere Schwankung
von Charge zu Charge lag bei 7,78 %.
SYMBOLLEGENDE 14
für In-Vitro-Diagnose
Chargencode
Autorisierter Vertreter
Verfallsdatum
Katalognummer
l
Temperaturgrenzwert
M
i
X
Hersteller
Gebrauchsanleitung konsultieren
Inhalt ausreichend für <n> Tests
LITERATURHINWEISE
1.
2.
3.
4.
5.
Seite 3 von 4
Pittman, D.D., Kaufman, R.J. Structure-Function Relationships of Factor
VIII Elucidated through Recombinant DNA Technology. Thromb.
Haemostas., 61(2), pp. 161-165, 1989.
Philadelphia, 1994.
3983-3996, 1998.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
J. Biosci, 28(6), 783-789, 2003.
1998.
“Graphical Symbols for Use in the Labelling of Medical Devices”, EN
Eingeschränkte Gewährleistung: Für dieses Produkt wird eine
Gewährleistung entsprechend Kennzeichnung und Fachliteratur zugesichert.
Affinity Biologicals Inc. lehnt jede indirekte Haftung für die Eignung zu einem
bestimmten Zweck oder die Handelbarkeit ab; in keinem Fall haftet Affinity
Biologicals Inc. für Folgeschäden, die aus der oben erwähnten
ausdrücklichen Gewährleistung entstehen.
M
P
1395 Sandhill Drive
Ancaster, ON
KANADA L9G 4V5
Tel: +1 (905) 304-9896
+1 (800) 903-6020
Fax: +1 (905) 304-9897
[email protected]
Emergo Europe
Molenstraat 15
2513 BH Den Haag
Niederlande
+31 (0)70.345.8570
Seite 4 von 4
Coffret VisuLize™ pour la détection de
l’antigène du facteur VIII
Pour la réalisation de 96 tests par détection immunoenzymatique de l’antigène du facteur VIII (FVIII).
Conçu uniquement pour une utilisation diagnostique in vitro.
Produit n° FVIII-AG
C
A conserver entre +2 et +8 oC. Ne pas congeler.
USAGE PREVU
Le coffret VisuLize™ pour la détection de l’antigène du facteur VIII consiste
en un dosage immuno-enzymatique pour déterminer la quantité d’antigènes
du facteur FVIII dans des échantillons de plasma humain et dans les
concentrés de facteur VIII utilisant le dosage immuno-enzymatique (ELISA) à
double anticorps.
INTRODUCTION
Le facteur VIII (précédemment appelé globuline antihémophilique et facteur
VIII:C) est une grosse glycoprotéine au poids moléculaire de 320 000
daltons qui circule dans le plasma à une concentration d'environ 200
ng/ml.1,2 FVIII est stabilisé par association au facteur von Willebrand pour
former un complexe FVIII-vWF requis pour la survie normale du facteur VIII in
vivo (t1/2 de 8-12 heures).3 FVIII est un pro-cofacteur activé via protéolyse
limitée par thrombine. Dans ce processus, FVIIIa se dissocie de vWF pour
s'associer au facteur IX activé, au calcium et à une surface phospholipide où
il est un co-facteur essentiel dans l'assemblage du complexe activateur
facteur X.4,5 Une fois dissocié de vWF, FVIIIa est susceptible d'inactivation
par la protéine C activée et par désintégration non-enzymatique.4
L’importance biologique du facteur VIII est démontrée en cas d’hémophilie
A, un trouble de saignement congénital que l'on retrouve principalement
chez des sujets masculins lié à une carence de chromosome X du facteur
VIII.6 La prévalence de l'hémophilie A est estimée entre 1/5000 et
1/10000.6 La sévérité de la carence est généralement en corrélation avec la
sévérité de la maladie. Les individus ayant une activité de facteur VIII <1 %
sont classés comme cas sévères, ceux ayant une activité de facteur VIII
comprise entre 1 et 5 % sont classés comme cas modérés et ceux ayant une
activité de facteur VIII comprise entre 5 et 40 % sont classés comme légers.7
Certains hémophiles produisent une protéine FVIII qui est partiellement ou
totalement inactive. Dans ces cas, l'activité du facteur VIII est faible mais les
niveaux d'antigènes sont normaux ou quasi-normaux. Ces patients, qui
représentent environ 5 % des patients souffrant d'hémophilie A, sont
considérés avoir un matériel à réaction croisée (CRM)-positive.8 La
production d'anticorps neutralisants du facteur VIII se produit également
chez 5 à 20 % des hémophiles.9,10
Le diagnostic en laboratoire de la carence en facteur VIII consiste en général
à déterminer quantitativement les niveaux de procoagulants (activité
fonctionnelle du facteur VIII généralement mesurée par épreuve de
coagulation). Des symptômes de saignement clinique peuvent également
être utilisés lors du diagnostic et de la classification ; cependant, la mesure
quantitative des procoagulants est la méthode préférée de classification de
la sévérité de l'hémophilie.7 La méthode ELISA pour détecter les antigènes
du facteur VIII peut être utilisée conjointement avec des dosages
fonctionnels dans l'évaluation des thérapies de remplacement du facteur VIII
, la détermination du statut de porteur ainsi que le dépistage des patients
qui ont un matériel à réaction croisée positive.
détection marqué à la peroxydase est ajouté et peut se lier de l’antigène du
facteur VIII capturé. Les puits sont à nouveau lavés, puis on y ajoute une
solution de TMB (le tétra-méthyl-benzidine, substrat de la peroxydase) qui va
réagir pendant une durée déterminée. Une couleur bleue se développe, qui
devient jaune lorsque la réaction est arrêtée au moyen d’un acide. La
couleur formée est mesurée spectrophotométriquement dans un lecteur de
microplaques à 450 nm. L’absorbance à 450 nm est directement
proportionnelle à la quantité de facteur FVIII capturée dans le puit. Le
dosage est étalonné grâce au plasma étalon fourni dans le coffret.
REACTIFS
A.
Description des éléments réactifs
Elément 1 : Poche pelable contenant 6 barrettes de 16 puits sensibilisés à
partir d’anticorps de mouton anti-facteur VIII humain.
Elément 2 : 2 flacons de plasma étalon lyophilisés à partir de 1 ml de
plasma.
Elément 3 : 2 flacons de plasma de contrôle A lyophilisés à partir de 1 ml de
plasma.
Elément 4 : 2 flacons de plasma de contrôle B lyophilisés à partir de 1 ml de
plasma.
Elément 5 : 1 flacon contenant 50 ml de concentré de tampon de lavage
20X.
Elément 6 : 3 flacons contenant chacun 20 ml de diluant échantillon
tamponné.
Elément 7 : 1 flacon contenant 12 ml d’anticorps de mouton de détection
marqué à la peroxydase.
Elément 8 : 1 flacon contenant 12 ml de substrat de tétra-méthyl-benzidine
(TMB).
Elément 9 : 1 flacon contenant 12 ml de solution d’arrêt (O,2 M d’acide
sulfurique).
B. Avertissement
Ce coffret est conçu pour être utilisé par un personnel formé pour les
procédures en laboratoire et les précautions universelles concernant
l’utilisation de produits chimiques et de substances potentiellement nocives
pour l’organisme. Certains éléments contiennent des matériels humains.
Chaque unité de plasma source utilisée dans la préparation de ce produit a
été testée par les méthodes agréées de la FDA et testée négative pour le
virus d’immuno-déficience humaine (VIH) de type I et de type II, pour
l’antigène de surface du virus de l’hépatite B (AgHBS), ainsi que pour
l’hépatite C (HCV). Cependant, aucun test ne permet de garantir
complètement que les produits dérivés du sang humain ne transmettront
pas de maladies infectieuses. Comme pour tous les matériels d'origine
humaine, ce produit doit être manipulé comme un matériel potentiellement
infectieux.
Le substrat de TMB (tétra-méthyl-benzidine) a une toxicité réduite mais il est
toutefois nécessaire de prendre des précautions pour éviter tout contact
direct. Il est recommandé d’utiliser des gants et des lunettes de protection.
La solution d’arrêt contient de l’acide sulfurique dilué (O,2 M) corrosif. Il est
recommandé d’utiliser des gants et des lunettes de protection.
L’élimination des déchets doit être effectuée en accord avec la
réglementation locale
Pour avoir un exemplaire de la fiche signalétique de ce produit, contactez
Affinity Biologicals Inc.
C.
Préparation des réactifs
Elément 1 (barrettes sensibilisées à partir d’anticorps, avec support) : Juste
avant l’utilisation, ouvrez la poche et retirez barrettes et support. Les
barrettes non utilisées doivent être remises dans la poche et refermées. Les
barrettes peuvent être utilisées directement, reportez-vous à la procédure
dans la section C. Procédure de dosage.
Elément 2 (plasma étalon) : Reconstituez un flacon avec 1,0 ml d’eau pure.
Laissez le contenu se dissoudre pendant 15 minutes à température
ambiante, en remuant de temps en temps. La stabilité après reconstitution
est de 4 heures à température ambiante (18-25°C) ou 30 jours à -20°C.
Eléments 3 et 4 (plasmas de contrôle) : Reconstituez un flacon de chaque
plasma avec 1,0 ml d’eau pure. Laissez le contenu se dissoudre pendant 15
minutes à température ambiante, en remuant de temps en temps. La
stabilité après reconstitution est de 4 heures à température ambiante (1825°C) ou 30 jours à -20°C.
Elément 5 (concentré de tampon de lavage 20X) : Laissez le flacon se
réchauffer à température ambiante avant utilisation. Avant de poursuivre,
assurez-vous que tous les cristaux qui ont pu se former sont dissous. Si
nécessaire, le flacon peut être réchauffé jusqu’à 37°C jusqu’à ce que tous
PRINCIPE DE LA METHODE IMMUNO-ENZYMATIQUE
les cristaux soient dissous. Diluez le concentré au 1/20 avant utilisation.
Les puits sont pré-sensibilisés à partir d’anticorps polyclonal de mouton antiPour chaque groupe de deux barrettes (32 puits), ajoutez 16 ml de
facteur FVIII humain. Les échantillons de plasma sont dilués et ajoutés dans
concentré à 304 ml d’eau pure et mélangez. La stabilité après dilution est
les puits. L’antigène du facteur VIII présent se lie à l’anticorps sensibilisé.
d’une semaine à 2-8°C.
Après lavage afin d’évacuer tout matériel non lié, l’anticorps de mouton de
Les éléments 6 à 9 sont prêts à l’emploi.
Page 1 sur 4
Document OPI0138, rév. 6, mars 2009
D.
6,25 %
3,13 %
1,56 %
0,79 %
Stockage et stabilité
A condition d’être conservés entre +2 et +8°C, les coffrets intacts et les
réactifs non reconstitués sont stables jusqu’à la date d’expiration située sur
la boîte et sur les étiquettes individuelles des réactifs.
COLLECTE DES SPECIMENS
Le plasma de contrôle A (élément 3 reconstitué) et les plasmas de test
normaux sont dilués au 1/8 et au 1/16. Ajoutez 100 µl de plasma
dans 700 µl de diluant échantillon (élément 6), mélangez, puis ajoutez
350 µl de cette dilution au 1/8 dans 350 µl d’échantillon de diluant
pour obtenir la dilution au 1/16. Le plasma de contrôle B (élément 4
reconstitué) et les échantillons contenant une faible quantité de
l’antigène du facteur VIII (échantillons d'hémophiles) doivent être
manipulés à des dilutions inférieures, au 1/4 et 1/8. Ajoutez 175 µL
de plasma dans 525 µL de diluant échantillon (élément 6), mélangez,
puis ajoutez 350 µL de cette dilution au 1/4 dans 350 µL d’échantillon
de diluant pour obtenir la dilution au 1/8.
3.
Dosage
PREPARATION DE LA
PLAQUE
ETAPE
PROCEDURE
Matériel fourni
Poche pelable contenant 6 barrettes de puits sensibilisés à partir
d’anticorps.
Plasma étalon, lyophilisé.
Plasma de contrôle A, lyophilisé.
Plasma de contrôle B, lyophilisé.
Concentré de tampon de lavage 20X.
Diluant échantillon.
Solution d’anticorps de détection.
Substrat de TMB.
Solution d’arrêt.
Ruban adhésif pour recouvrir la plaque.
B.
Placez le nombre souhaité de barrettes sur le
support.
Pipetez dans chaque puits pré-sensibilisé :
Echantillon pour essai
100 µl
CAPTURE DU FVIII
(manipulé en double)
Couvrez les barrettes avec le ruban adhésif
fourni et incubez 1 heure à température
ambiante.
Videz les puits et lavez-les avec 300 µl de tampon de lavage 3 fois.
Solution d’anticorps de
100 µl
ANTICORPS DE
détection (élément 7)
DETECTION
Couvrez les barrettes avec le ruban adhésif
fourni et incubez 45 minutes à température
ambiante.
Videz les puits et lavez-les avec 300 µl de tampon de lavage 3 fois.
Substrat de TMB
100 µl
DEVELOPPEMENT DE
(Elément 8)
LA COULEUR
Laissez la couleur se développer pendant
exactement 10 minutes à température
ambiante.
Solution d’arrêt
100 µl
(Elément 9)
(Ajoutez à chaque
puits dans l’ordre
selon lequel la TMB
a été ajoutée)
Lisez la plaque à une longueur d'onde de 450 nm dans les 30 minutes
après avoir ajouté la solution d'arrêt
Si nécessaire, conservez le support de la plaque pour l’utiliser avec les
barrettes non utilisées. Jetez les barrettes qui ont été utilisées.
Matériel supplémentaire requis (mais non fourni)
Eau pure pour la reconstitution et la dilution
Pipettes à volume variable à canal unique
Pipettes multi-canaux
Embouts de pipettes
Chronomètre de laboratoire
Appareil de lavage pour les puits des microplaques.
Spectrophotomètre compatible avec les microplaques allant jusqu’à 450 nm.
C. Procédure de dosage
NOTES PROCEDURALES :

Reconstituez les réactifs comme décrit dans REACTIFS, section C,
Préparation des réactifs. Laissez les réactifs se réchauffer à
température ambiante avant utilisation.

Il est recommandé de réaliser en double toutes les dilutions
d’étalons, d’échantillons pour essai et de contrôle, et chaque
manipulation doit inclure un blanc (reportez-vous à la section
Etalonnage du dosage).

Toutes les dilutions doivent être effectuées juste avant d’être
utilisées dans le dosage.

Ne laissez les puits s’assécher à aucun moment. Laissez les
plaques couvertes pendant les incubations.

Les échantillons de plasma ne doivent pas être ajoutés aux
dilutions à moins de 1/4.

N’utilisez pas des éléments de coffret qui ont un numéro de lot
différent.

Les températures d’incubation supérieures ou inférieures à la
température ambiante normale (18 à 25°C) peuvent fausser les
résultats.

N’utilisez pas les éléments de ce coffret au-delà de la date
d’expiration

Les barrettes usées doivent être jetées ; vous ne devez pas les
réutiliser.
1.
350 µl
350 µl
350 µl
350 µl
2.
Le sang est prélevé dans des tubes d’anticoagulants de citrate tamponné à
3,2 %, selon un rapport de 9 volumes de sang pour 1 volume
d’anticoagulant, et mélangé délicatement par inversion. Centrifugez à un
minimum de 1500 x g pendant 15 minutes (ligne directrice H21-A411 du
NCCLS6). Retirez le plasma surnageant et utilisez-le dans les 4 heures ou
congelez-le à moins de -20°C pendant une durée maximum de 1 mois.
A.
350 µl sur 12,5 %
350 µl sur 6,25 %
350 µl sur 3,13 %
350 µl sur 1,56 %
Préparation des dilutions du plasma étalon : Diluez le plasma étalon
(élément 2 reconstitué) dans le diluant échantillon (élément 6) comme
détaillé dans le tableau 1 ci-dessous : (REMARQUE : 100 % = 1,0
IU/ml)
TABLEAU 1 :
Dilution
Plasma étalon
Diluant échantillon
100 %
175 µl
525 µl
50 %
350 µl sur 100 %
350 µl
25 %
350 µl sur 50 %
350 µl
12,5 %
350 µl sur 25 %
350 µl
ETALONNAGE
A.
Etalonnage du dosage
La valeur d'antigène du facteur VIII indiquée par le flacon de plasma étalon a
été déterminée par comparaison avec un étalon secondaire traçable à
l’étalon international de la WHO pour l'activité du facteur VIII 02/150. Cette
valeur d’antigène doit être utilisée comme concentration de la dilution
initiale du plasma étalon.
Il est recommandé que la plaque soit vidée des puits qui ont reçu du diluant
échantillon pur au lieu d'échantillon dilué (puits de réactif à blanc).
B.
Courbe de référence et calcul des résultats
La courbe de référence est un graphique logarithmique représentant les
valeurs d'absorbance moyennes (axe des ordonnées) selon la concentration
en l’antigène du facteur VIII (axe des abscisses). La concentration en
l’antigène du facteur VIII des échantillons pour essai et des contrôles peut
être lue sur la courbe de référence et multipliée par le facteur de dilution
approprié. Dans les conditions décrites ici, un échantillon dilué au 1/4 aura
un facteur de dilution de 1, une dilution au 1/8 aura un facteur de dilution
de 2, et une dilution au 1/15 aura un facteur de dilution de 4.
Exemple : Dilué au 1/8, le plasma de test donne une absorbance
correspondant à 45 % d'après lecture sur la courbe de référence. Cette
valeur serait multipliée par un facteur de dilution de 2 pour obtenir la valeur
correcte qui est de 90 %.
Page 2 sur 4
CONTROLE QUALITE
intra-essai (CV) a été calculé conformément à la ligne directrice EP5-A13 du
NCCLS et est indiqué dans le résumé ci-dessous, pour chaque niveau de
facteur VIII. Le CV moyen, calculé avec cette méthode à partir de tous les
résultats, était de 4,51 %.
Lot 1
Lot 2
Lot 3
Echantillon de 1,35-1,75 IU/ml 2,17 %
2,85 %
3,89 %
Echantillon de 0,6-0,9 IU/ml
2.85%
3,33 %
5,19 %
Echantillon <0,055 IU/ml
5.23%
6,83 %
8,25 %
Les plasmas de contrôle fournis (éléments 3 et 4) doivent être dosés avec
chaque série d’échantillons manipulés. Les valeurs de l’antigène du facteur
VIII obtenues dans les échantillons pour essai doivent être considérées
comme douteuses si les valeurs obtenues pour les plasmas de contrôle se
situent en dehors de la plage indiquée sur l’étiquette des plasmas de
contrôle.
LIMITES ET INTERFERENCES
Les seules valeurs d'antigène du facteur VIII obtenues par ce dosage ne
permettent pas de diagnostiquer une maladie. Les antécédents médicaux
du patient, son tableau clinique, et les éléments révélés par d'autres
procédures de diagnostic doivent également entrer en considération. Des
états cliniques sérieux ont été rapportés, alors que le niveau d'antigènes du
facteur VIII dans le plasma était normal ou quasi-normal en présence d’une
réduction conséquente de l’activité du facteur VIII.8
Ce coffret a été élaboré pour être utilisé avec un plasma citraté. Il n’est pas
recommandé d’utiliser des échantillons contenant des anticoagulants autres
que le citrate de sodium à 3,2 %.
L’interférence de dosage due à la présence de médicaments ou à la
présence d’anticorps hétérophiles tels que le lupus anticoagulant (LA) n’a
pas été rapportée, cependant, un risque d'interférence par des niveaux
élevées d’anticorps hétérophiles ne peut pas être exclu. La présence du
facteur rhumatoïde dans les échantillons pour essai est une source
d'interférence dans le dosage. La possibilité théorique que des échantillons
contiennent des anticorps anti-immunoglobine de mouton peut aussi
interférer sur le dosage.
VALEURS ATTENDUES
La plage normale pour le facteur VIII telle qu'indiquée dans la
documentation est comprise entre 0,5 et 1,8 IU/ml.12 Chaque laboratoire
doit déterminer une plage normale indépendamment, mais les résultats de
trois lots mesurés auprès de 99 individus en bonne santé montrent un
intervalle de référence normal de 0,64 à 1,89 IU/ml (moy = 1,268 IU/ml,
écart-type = 0,3116).
PERFORMANCES DU TEST
A.
Limite de détection
LEGENDE DES SYMBOLES 14
V
Pour utilisation diagnostique in vitro
g
Code du lot
P
H
h
l
Représentant agréé
Référence du catalogue
Limite de température
X
Comparaison des méthodes:
Les résultats moyens des trois échantillons du coffret VisuLize™ pour la
détection de l’antigène du facteur VIII ont été comparés de manière interne
au dosage Coamatic® FVIII sur 142 échantillons de patients contenant des
niveaux de facteur VIII différents à l’intérieur de la plage de détection. Le
coefficient de corrélation (r) était de 0,970 (R2 = 0,940, y = 1,2059x +
0,1053). Le coffret VisuLize™ pour la détection de l’antigène du facteur VIII
a été également comparé dans deux centres de tests extérieurs au dosage
Coamatic® FVIII sur des échantillons de patients avec des niveaux de facteur
VIII différents à l’intérieur de la plage de détection. Dans le centre n°1, 110
échantillons ont été testés et le coefficient de corrélation (r) était de 0,969
(R2 = 0,9381, y = 1,2261x + 0,1085). Dans le centre n°2, 81 échantillons
ont été testés et le coefficient de corrélation (r) était de 0,974 (R2 = 0,9488,
y = 1,1768x + 0,0242).
D.
Variabilité d'un lot à l'autre
94 échantillons de contrôle avec une concentration de l’antigène du facteur
VIII comprise entre 0,23 et 2,3 IU/ml ont été testés en double sur trois lots
afin de déterminer la précision entre les lots. La variabilité moyenne d’un lot
à l’autre était de 7,78 %.
M
i
Lorsque le dosage est réalisé comme indiqué dans la section C, Procédure
de dosage, la limite de détection de ce dosage est de 0,008 IU/ml (0,8 %)
de l’antigène du facteur VIII. La limite supérieure de détection peut varier
pour chaque lot dans un coffret en fonction de la valeur dosée du plasma
étalon fourni dans le coffret. Les échantillons dont les valeurs se situent en
dehors de la plage de la courbe de référence devraient être testés à
nouveau à une dilution appropriée afin d'obtenir des résultats exacts.
C.
E.
Date d’expiration
Spécificité
Ce dosage mesure l’antigène du facteur VIII dans le plasma humain, les
concentrés de facteur VIII thérapeutiques et les préparations de facteur VIII
recombiné.
B.
Précision inter-essai : Trois plasmas avec des concentrations de l’antigène
du facteur VIII différentes ont été testés sur les répliques de 8 dosages sur
20, en utilisant 3 lots de produit. Le coefficient de variation inter-essai (CV) a
été calculé conformément à la ligne directrice EP5-A13 du NCCLS et est
indiqué dans le résumé ci-dessous, pour chaque niveau de facteur VIII. Le
CV moyen, calculé avec cette méthode à partir de tous les résultats, était de
4,69 %.
Lot 1
Lot 2
Lot 3
Echantillon de 1,35-1,75 IU/ml 2,12 %
3,92 %
4,11 %
Echantillon de 0,6-0,9 IU/ml
1,63 %
3,19 %
7,30 %
Echantillon <0,055 IU/ml
6,79 %
5,49 %
7,71 %
Fabricant
Consulter le mode d’emploi
Contient suffisamment de réactif pour <n> tests
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.
2.
3.
4.
Précision
Précision intra-essai, méthode 1 : Les échantillons de plasma normal et
anormal ont été testés dans 4 dosages au total dans chacun des trois lots,
avec 38 répliques par échantillon et par plaque. Le coefficient de variation
moyen (CV) calculé à partir de tous les résultats était de 4,56 %.
Précision intra-essai, méthode 2 : Trois plasmas avec des concentrations de
l’antigène du facteur VIII différentes ont été testés sur les répliques de 8
dosages sur 20, en utilisant 3 lots de produit. Le coefficient de variation
5.
6.
7.
Page 3 sur 4
Haemostas., 61(2), pp. 161-165, 1989.
and VIII” in Hemostasis and Thrombosis, 3ème Edition, éds. RW
Colman, J Hirsh, VJ Marder et EW Salzman, p. 109-133, J.B. Lippincott
Co., Philadelphia, 1994.
Brettler, D.B., Levine, P.H., « Clinical Manifestations and Therapy of
Inherited Coagulation Factor Deficiencies », Hemostasis and
Thrombosis, 3ème Edition, éds. RW Colman, J Hirsh, VJ Marder et EW
Salzman, p. 169-183, J. B. Lippincott Co., Philiadelphia, 1994.
3983-3996, 1998.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Feinstein, D.I., in Hemostasis and Thrombosis, 3ème Edition, éds. RW
Colman, J Hirsh, VJ Marder et EW Salzman, p. 881-905, J.B. Lippincott
Co., Philadelphia, 1994.
J. Biosci, 28(6), 783-789, 2003.
Approved Guideline, 3ème Edition. H21-A4, NCCLS, Vol. 23. No. 35,
1998.
Approved Guideline”, EP5-A, NCCLS, Vol. 19, No. 2, Février 1999.
Symboles graphiques utilisés pour l’étiquetage des dispositifs
médicaux, Norme européenne, EN 980:2003, Comité européen de
normalisation, Avril 2003.
Limite de garantie: Ce produit est garanti pour une utilisation conforme à
son étiquetage et à la documentation qui l’accompagne. Affinity Biologicals
Inc. n’offre aucune garantie implicite quant à l’adéquation de ce produit à
tout autre usage ou à la commercialisation, et Affinity Biologicals Inc. ne
pourra en aucun cas être tenue responsable de dommages indirects
survenant dans le cadre de la garantie expresse susmentionnée.
M
P
1395 Sandhill Drive
Ancaster, ON
CANADA L9G 4V5
Tél : (905) 304-9896
(800) 903-6020
Fax : (905) 304-9897
[email protected]
Emergo Europe
Molenstraat 15
2513 BH The Hague
The Netherlands
+31 (0)70.345.8570
Page 4 sur 4
conjugado, se aplica anticuerpo de detección de oveja con marcador de
peroxidasa, que se conjugará con el antígeno FVIII capturado. Los pocillos
se lavan otra vez y se aplica una solución de TMB (tetrametilbencidina
sustrato peroxidasa) y se deja reaccionar durante un período de tiempo fijo.
Aparece un color azul que cambia a amarillo al parar la reacción con ácido.
El color que se forma se mide por espectrofotometría en un lector de
microplacas a 450 nm. La absorbancia a 450 nm es directamente
proporcional a la cantidad de FVIII capturado en el pocillo. El ensayo se
calibra mediante el plasma calibrador incluido en el kit.
Kit de antígeno VisuLize™ FVIII
REACTIVOS
A.
Inmunoensayo enzimático de 96 test para la detección del
antígeno factor VIII (FVIII).
Descripción de los reactivos
El kit de antígeno VisuLize™ FVIII es un inmunoensayo enzimático para la
determinación cuantitativa del antígeno factor VIII en muestras de plasma
humano y concentraciones de factor VIII mediante el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA).
Reactivo 1: Bolsa de papel de aluminio que contiene 6 tiras, cada una de
ellas con 16 pocillos revestidos con anticuerpo de oveja contra el factor VIII
humano.
Reactivo 2: 2 viales de plasma calibrador, cada uno de ellos liofilizado de 1
mL de plasma.
Reactivo 3: 2 viales de plasma control A, cada uno de ellos liofilizado de 1
mL de plasma.
Reactivo 4: 2 viales de plasma control B, cada uno de ellos liofilizado de 1
mL de plasma.
Reactivo 5: 1 vial que contiene 50 mL de concentrado de tampón de lavado
de 20X.
Reactivo 6: 3 viales, cada uno de ellos con 20 mL de diluyente de muestra
de tampón.
Reactivo 7: 1 vial que contiene 12 mL de anticuerpo de detección de oveja
con marcador de peroxidasa.
Reactivo 8: 1 vial que contiene 12 mL de sustrato de tetrametilbencidina
(TMB).
Reactivo 9: 1 vial que contiene 12 mL de solución de parada (ácido sulfúrico
0,2 M).
RESUMEN
B. Precaución y advertencia
Para diagnóstico in vitro.
Ref. de producto FVIII-AG
C
Almacenar entre 2–8 oC. No congelar.
USO
El factor VIII (anteriormente denominado globulina antihemofílica y factor
VIII:C) es una glicoproteína de gran tamaño con un peso molecular de
320.000 daltons que circula en el plasma con una concentración de
aproximadamente 200 ng/mL.1,2 El FVIII se estabiliza mediante la asociación
con el factor von Willebrand para formar un complejo FVIII-vWF, necesario
para la supervivencia normal del FVIII in vivo (t1/2 de 8-12 horas)3. El FVIII es
un pro-cofactor que se activa mediante la proteolisis limitada de la trombina.
En este proceso, el FVIIIa se disocia del vWF para combinarse con el factor
IX activado, calcio y una superficie fosfolipídica, donde es un cofactor
esencial para la formación del complejo activador factor X4,5. Una vez
disociado del vWF, el FVIIIa es susceptible de inactivación por la proteína C
activada y por la descomposición no enzimática4.
La importancia biológica del factor VIII se demuestra en la hemofilia A, un
trastorno hemorrágico congénito que se produce principalmente en varones
y que es el resultado de una deficiencia de FVIII relacionada con un
cromosoma X6. Se estima que la prevalencia de la hemofilia A está entre
1/5.000 y 1/10.0006. El grado de deficiencia está normalmente relacionado
con la gravedad de la enfermedad. Las personas con una actividad de factor
VIII <1% se clasifican como pacientes graves, con una actividad de factor VII
entre el 1 y el 5% se clasifican como moderados, y con una actividad de
factor VIII entre 5 y 40% como hemofílicos leves7. Algunos hemofílicos
producen una proteína FVIII que es parcial o totalmente inactiva. En estos
casos, la actividad del factor VIII es baja, pero los niveles de antígeno son
normales o casi normales. Estos pacientes, que suponen aproximadamente
un 5% de los pacientes con hemofilia A, se denominan positivos de reactivo
cruzado (CRM)8. La producción de anticuerpos neutralizantes al FVIII
también se da en un 5-20% de hemofílicos9,10.
Para el diagnóstico en laboratorio de la deficiencia de factor VIII se
requieren normalmente determinaciones cuantitativas basadas en niveles
de procoagulante (actividad funcional del factor VIII medida normalmente
mediante ensayo de coagulación). Los síntomas de sangrado clínico
también se pueden utilizar en el diagnóstico y la clasificación, si bien la
medición cuantitativa de procoagulante es el método preferido para la
clasificación de la gravedad de la hemofilia7. Junto con los ensayos
funcionales, se puede utilizar un ELISA para el antígeno del factor VIII para la
evaluación de los tratamientos de sustitución del factor VIII, así como para la
determinación del estado de portador y para distinguir aquellos pacientes
que se pueden considerar positivos de reactivo cruzado (CRM).
PRINCIPIO DEL INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
Las tiras que contienen los pocillos están recubiertas de anticuerpos
policlonales de oveja contra el factor VIII humano. Las muestras de plasma
se diluyen y se introducen en los pocillos. El antígeno FVIII presente se
conjuga con el revestimiento de anticuerpo. Tras lavar el material no
Este kit está destinado para su uso por personal con formación en
procedimientos de laboratorio y seguridad en el laboratorio en el uso de
sustancias químicas y con riesgo biológico potencial. Algunos reactivos
contienen material de origen humano. Cada unidad de plasma utilizada en
la preparación de este producto ha sido comprobada mediante métodos
aprobados por la FDA de Estados Unidos y ha demostrado ser negativa en
cuanto a la presencia de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de tipo I y
II y antígeno de superficie de hepatitis B (HBSAg), así como hepatitis C (HCV).
Sin embargo, no existe ninguna prueba que pueda ofrecer una seguridad
total de que los productos derivados de sangre humana no transitan
enfermedades infecciosas. Al igual que todos los materiales de origen
humano, este producto se debe manipular como material potencialmente
infeccioso.
La toxicidad del TMB sustrato (tetrametilbencidina) es leve, pero se deben
adoptar precauciones para evitar un contacto directo. Se recomienda utilizar
guantes y gafas de seguridad.
La solución de parada contiene ácido sulfúrico diluido (0,2 M), que es
corrosivo. Se recomienda utilizar guantes y gafas de seguridad.
El desecho de materiales se debe realizar de acuerdo a la normativa local
vigente.
Si desea obtener una Hoja de datos de seguridad de materiales de este
producto, póngase en contacto con Affinity Biologicals Inc.
C.
Preparación de los reactivos
Reactivo 1 (tiras recubiertas de anticuerpos con soporte): Justo antes de
proceder a su utilización, abra la bolsa y retire las tiras y el soporte. Las tiras
no utilizadas se deben volver a colocar en la bolsa, que se debe volver a
sellar. Las tiras se pueden utilizar directamente, consultar la sección C del
Procedimiento: Procedimiento de ensayo.
Reactivo 2 (plasma calibrador): Reconstituya un vial con 1,0 mL de agua de
grado reactivo. Deje que el contenido se disuelva durante 15 minutos a
temperatura ambiente, removiendo de vez en cuando. La estabilidad tras la
reconstitución es de 4 horas a temperatura ambiente (18-25 oC) o 30 días a
–20 oC.
Reactivos 3 y 4 (plasmas control): Reconstituya un vial de cada plasma con
1,0 mL de agua de grado reactivo. Deje que el contenido se disuelva
durante 15 minutos a temperatura ambiente, removiendo de vez en cuando.
La estabilidad tras la reconstitución es de 4 horas a temperatura ambiente
(18-25 oC) o 30 días a –20 oC.
Reactivo 5 (concentrado de tampón de lavado 20X): Deje que el vial se
atempere antes de proceder a su utilización. Antes de continuar, asegúrese
de que los cristales que se puedan haber formado se hayan disuelto. Si
fuese necesario, el vial se puede calentar a 37 oC hasta que se hayan
disuelto todos los cristales. Diluya el concentrado en una proporción 1/20
Página 1 de 4
Documento OPI0138, rev 6, marzo 2009
antes de proceder a su utilización. Añada 16 mL de concentrado a 304 mL
de agua de grado reactivo por cada 2 tiras (32 pocillos) y mézclelos. La
estabilidad tras la dilución es de 1 semana a 2–8 oC.
Los reactivos 6-9 se suministran listos para su uso.
D.
25%
12.5%
6.25%
3.13%
1.56%
0.79%
Almacenamiento y estabilidad
Los kits cerrados y los reactivos sin reconstituir son estables hasta la fecha
de caducidad indicada en la caja y en la etiqueta de cada reactivo si se
almacenan a una temperatura de 2–8 °C.
El plasma de control A (elemento 3 reconstituido) y los plasmas de
análisis normales se diluyen en proporción 1/8 y 1/16. Añada 100 µL
de plasma a 700 µL de diluyente de muestras (elemento 6), mezcle y,
a continuación, añada 350 µL de esta dilución 1/8 a 350 µL de
diluyente de muestra para obtener la dilución 1/16. El plasma de
control B (elemento 4 reconstituido) y las muestras de bajo contenido
del antígeno FVIII (muestras hemofílicas) se deben analizar con
diluciones inferiores en proporción 1/4 y 1/8. Añada 175 µL de plasma
a 525 µL de diluyente de muestras (elemento 6), mezcle y, a
continuación, añada 350 µL de esta dilución 1/4 a 350 µL de
diluyente de muestra para obtener la dilución 1/8.
3.
Ensayo
PREPARACIÓN DE LAS
PLACAS
PASO
La sangre se recoge mediante tubos anticoagulantes que contienen tampón
citrato al 3,2% en una proporción de 9 volúmenes de sangre por cada
volumen de anticoagulante y se mezcla suavemente mediante inversión.
Centrifúguelos a un mínimo de 1500 x g durante 15 minutos (según la
indicación H21-A4 de NCCLS)11. Retire el plasma sobrenadante y utilícelo en
las 4 horas siguientes; también puede congelarlo a una temperatura inferior
a –20 oC durante un período máximo de 1 mes.
A.
Material proporcionado
Colocar el número de tiras deseado en el
soporte.
Introducir con la pipeta en cada pocillo:
Analizar la muestra
100 µL
CAPTURA DE FVIII
(por duplicado)
Tapar las tiras con el sellador de placas e
incubar durante 1 hora a temperatura
ambiente.
Vaciar los pocillos y lavar 3 veces con 300 µL de tampón de lavado
diluido.
Solución de
100 µL
DETECCIÓN DE
anticuerpos de
ANTICUERPOS
detección (reactivo 7)
Tapar las tiras con el sellador de placas e
incubar durante 45 minutos a temperatura
ambiente.
Vaciar los pocillos y lavar 3 veces con 300 µL de tampón de lavado
diluido.
Sustrato TMB
100 µL
DESARROLLO DEL
(reactivo 8)
COLOR
Dejar que se desarrolle el color durante
exactamente 10 minutos a temperatura
ambiente.
Solución de parada
100 µL
(reactivo 9)
(Añadir a cada
pocillo en el mismo
orden en que se
añadió el TMB)
Realizar una lectura de la placa con una longitud de onda de 450 nm en
los 30 minutos siguientes a la adición de la solución de parada.
Si fuese necesario, conservar el soporte de placas para utilizarlo con las
tiras restantes que no se hayan utilizado. Desechar las tiras utilizadas.
Bolsa de papel de aluminio que contiene 6 tiras de pocillos recubiertos de
anticuerpos.
Plasma calibrador, liofilizado.
Plasma control A, liofilizado.
Plasma control B, liofilizado.
Concentrado de tampón de lavado 20X.
Diluyente de muestra.
Solución de anticuerpos de detección.
Sustrato TMB.
Solución de parada.
Sellador de placas adhesivo.
B.
Material adicional requerido (pero no suministrado)
Agua de grado reactivo para reconstitución y dilución
Pipetas monocanal con ajuste de volumen
Pipetas multicanal
Puntas de pipeta
Temporizador de laboratorio
Dispositivo para el lavado de microplacas/tiras de pocillos
Espectrofotómetro de microplacas compatible con una longitud de onda de 450
nm.
C. Procedimiento de ensayo
NOTAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO:

Reconstituya los reactivos de la manera indicada en REACTIVOS,
Sección C, "Preparación de los reactivos". Deje que los reactivos
se atemperen antes de proceder a su utilización.

Se recomienda realizar por duplicado todas las diluciones de
muestras de análisis, calibración y control, y que cada una incluya
una muestra tampón blanco (consulte la sección Calibración del
ensayo).

Todas las diluciones se deben realizar justo antes de proceder a
su utilización en el ensayo.

No deje que se sequen los pocillos en ningún momento.
Mantenga cubiertas las placas durante las incubaciones.

Las muestras de plasma no se deben aplicar a diluciones
inferiores al 1/4.

No utilice componentes del kit con distintos números de lote.

Las temperaturas de incubación superiores o inferiores a la
temperatura ambiente normal (18 - 25 °C) pueden afectar a la
exactitud de los resultados.

No utilice componentes del kit que hayan caducado.

Las tiras utilizadas se deben desechar y no se pueden volver a
utilizar.
1.
Preparación de las diluciones de plasma calibrador: Diluya el plasma
calibrador (reactivo reconstituido 2) en el diluyente de muestra
(reactivo 6) de la manera indicada en la tabla 1 siguiente: (NOTA:
100% = 1,0 UI/mL)
TABLA 1:
Dilución
Plasma calibrador
Diluyente de muestra
100%
175 µL
525 µL
50%
350 µL de 100%
350 µL
350 µL
350 µL
350 µL
350 µL
350 µL
350 µL
2.
TOMA DE MUESTRAS
PROCEDIMIENTO
350 µL de 50%
350 µL de 25%
350 µL de 12,5%
350 µL de 6,25%
350 µL de 3,13%
350 µL de 1,56%
CALIBRACIÓN
A.
Calibración del ensayo
El valor de antígeno FVIII indicado en el vial del plasma de calibración se ha
determinado mediante comparación con un estándar secundario del que se
puede realizar un seguimiento conforme al estándar internacional de la
OMS para actividad de factor VIII 02/150. Este valor del antígeno se debe
utilizar como concentración de la dilución inicial del plasma de calibración.
Se recomienda eliminar la placa en los pocillos que tengan diluyente de
muestra solo en lugar de muestra diluida (pocillos de reactivo en blanco).
B.
Curva de referencia y cálculo de resultados
La curva de referencia es un gráfico de registro de los valores de
absorbencia medios (eje y) frente a la concentración de antígeno factor VIII
(eje x). El contenido del antígeno factor VIII de las muestras del análisis y de
los controles se puede leer a partir de la curva de referencia y multiplicar por
el factor de dilución adecuado. En las condiciones descritas aquí, una
muestra diluida en una proporción 1/4 tendrá un factor de dilución de 1,
una dilución de 1/8 tendrá un factor de dilución de 2, y una dilución de
1/16 tendrá un factor de dilución de 4.
Ejemplo: El plasma de análisis con dilución 1/8 tiene una absorbancia
correspondiente al 45% de la lectura de la curva de referencia. Este valor se
Página 2 de 4
multiplicaría por un factor de dilución de 2 para obtener el valor corregido de
90%.
CONTROL DE CALIDAD
El plasma control suministrado (reactivos 3 y 4) se debe analizar con todas
las series de muestras que se realicen. Los valores del antígeno FVIII
obtenidos para las muestras de ensayo se deben considerar dudosos si los
valores obtenidos para el plasma de control se encuentran fuera del rango
indicado en las etiquetas del plasma control.
LIMITACIONES E INTERFERENCIAS
Los valores del antígeno factor VIII obtenidos mediante este ensayo no se
deben utilizar aisladamente para el diagnóstico de enfermedades. Se deben
tener en cuenta también el historial del paciente, el cuadro clínico y los
resultados de otros procedimientos de diagnóstico. Se sabe que existen
estados clínicamente significativos en los que los niveles plasmáticos de
antígeno factor VIII son normales o casi normales en presencia de una
reducción significativa de la actividad del factor VIII8.
Este kit se ha desarrollado para su uso con plasma citrato. No se
recomienda utilizar muestras con un contenido de anticoagulante que no
sea citrato sódico al 3,2%.
Aunque no se han comunicado interferencias en el ensayo debidas a la
presencia de fármaco o de anticuerpos heterofílicos de tipo anticoagulante
de lupus (LA), no se puede excluir la posibilidad de interferencia de niveles
elevados de anticuerpos heterofílicos. La presencia de factor reumatoide en
las muestras de análisis interferirá en el ensayo. La posibilidad teórica de
analizar muestras que contengan anticuerpos contra la inmunoglobulina de
oveja también puede interferir en el ensayo.
VALORES ESPERADOS
El rango normal del factor VIII indicado en la literatura es de 0,5-1,8
UI/mL12. Cada laboratorio debe determinar un rango normal de manera
independiente, pero los resultados de tres lotes medidos en 99 individuos
sanos indican un intervalo de referencia normal de 0,64-1,89 UI/mL (media
= 1,268 UI/mL, SD = 0,3116).
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
A.
Especificidad
Este ensayo mide el antígeno factor VIII en plasma humano,
concentraciones terapéuticas de factor VIII y preparaciones recombinantes
de factor VIII.
B.
Límite de detección
Si se realiza el ensayo de la manera indicada en la sección C, Procedimiento
de ensayo, el límite de detección del mismo es de 0,008 UI/mL (0,8 %) de
factor VIII. El límite de detección superior puede variar en cada lote, en
función del valor analizado del plasma calibrador suministrado con el kit.
Las muestras con valores fuera del rango de la curva de referencia se
deberían volver a analizar en la dilución adecuada para poder obtener
resultados precisos.
C.
Precisión interensayo: Se analizaron tres muestras de plasma con distintas
concentraciones del antígeno factor VIII en repeticiones de 8 en 20 análisis
con 3 lotes de producto. El coeficiente de variación interensayo (CV) se
calculó según las indicaciones EP5-A de NCCLS13, cuyos resultados se
indican en el resumen siguiente para cada nivel de factor VIII. La media del
CV de todos los resultados de este método fue de 4,69%.
Lote 1
Lote 2
Lote 3
Muestra de 1,35-1,75 UI/mL 2,12%
3,92%
4,11%
Muestra de 0,6-0,9 UI/mL
1,63%
3,19%
7,30%
Muestra <0,055 UI/mL
6,79%
5,49%
7,71%
E.
Variabilidad entre lotes
Para determinar la precisión del ensayo entre lotes se analizaron por
duplicado 94 muestras de control con valores de factor VIII entre 0,23 y 2,3
UI/mL en tres lotes. La variabilidad media entre lotes fue de 7,78%.
LEYENDAS DE SÍMBOLOS 14
V
Para uso en diagnóstico in vitro
g
Código de lote
P
H
Representante autorizado
Fecha de caducidad
h
l
Número de catálogo
Límite de temperatura
M
i
X
Fabricante
Consultar las instrucciones de uso
Contiene material suficiente para <n> análisis
REFERENCIAS
Comparación del método:
Los resultados medios de tres lotes del kit de antígeno VisuLize™ Factor VIII
se compararon internamente con el ensayo Coamatic® FVIII en 142
muestras de pacientes con niveles de factor VIII en todo el rango de
detección. El coeficiente de correlación (r) fue 0,970 (R2 = 0,940, y =
1,2059x + 0,1053). El kit de antígeno VisuLize™ Factor VIII también se
comparó en dos laboratorios externos con el ensayo Coamatic® FVIII en
muestras de pacientes con niveles de factor VIII en todo el rango de
detección. En el laboratorio externo nº 1 se analizaron 110 muestras y el
coeficiente de correlación (r) obtenido fue 0,969 (R2 = 0,9381 y = 1,2261x
+ 0,1085). En el laboratorio externo nº 2 se analizaron 81 muestras y el
coeficiente de correlación (r) obtenido fue 0,974 (R2 = 0,9488, y = 1,1768x
+ 0,0242).
D.
se calculó según las indicaciones EP5-A de NCCLS13, cuyos resultados se
indican en el resumen siguiente para cada nivel de factor VIII. La media del
CV de todos los resultados de este método fue de 4,51%.
Lote 1
Lote 2
Lote 3
Muestra de 1,35-1,75 UI/mL 2,17%
2,85%
3,89%
Muestra de 0,6-0,9 UI/mL
2,85%
3,33%
5,19%
Muestra <0,055 UI/mL
5,23%
6,83%
8,25%
Precisión
1.
2.
3.
4.
Precisión intraensayo, método 1: Se analizaron muestras de plasma
normales y anormales en un total de 4 ensayos en cada uno de los tres
lotes, con 38 repeticiones por muestra y placa. El coeficiente de variación
media (CV) de todos los resultados fue de 4,56%
5.
Precisión intraensayo, método 2: Se analizaron tres muestras de plasma con
distintas concentraciones del antígeno factor VIII en repeticiones de 8 en 20
análisis con 3 lotes de producto. El coeficiente de variación intraensayo (CV)
7.
6.
Página 3 de 4
Haemostas., 61(2), pp. 161-165, 1989.
Philadelphia, 1994.
3983-3996, 1998.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
J. Biosci, 28(6), 783-789, 2003.
1998.
Símbolos gráficos para uso en el etiquetado de dispositivos médicos,
norma europea EN 980:2003, Comité Europeo de Normalización, abril
de 2003.
Garantía limitada: Se garantiza el rendimiento de este producto de acuerdo
a su etiquetado y literatura. Affinity Biologicals Inc. no ofrece ninguna
garantía para su comercialización o adaptación para cualquier otro fin y no
será responsable en ningún caso de ningunos daños y perjuicios excepto en
los casos indicados en la garantía expresa anterior.
M
P
1395 Sandhill Drive
Ancaster, ON
CANADÁ L9G 4V5
Tel: (905) 304-9896
(800) 903-6020
Fax: (905) 304-9897
[email protected]
Emergo Europe
Molenstraat 15
2513 BH The Hague
Holanda
+31 (0)70.345.8570
Página 4 de 4
tempo stabilito. Si sviluppa un colore blu che vira in giallo a seguito del
quenching della reazione con acido. Il colore che si forma viene misurato
spettrofotometricamente in un lettore di micropiastre a 450 nm.
L'assorbanza a 450 nm è direttamente proporzionale alla quantità di
l'antigene Fattore VIII catturato sul pozzetto. Il dosaggio viene calibrato
mediante il plasma di calibrazione fornito nel kit.
Kit dell'antigene FVIII VisuLize™
Kit di immunodosaggio enzimatico di 96 test per l'antigene
del Fattore VIII (FVIII).
Per uso diagnostico In Vitro.
N. prodotto FVIII-AG
C
Conservare a 2–8 oC. Non congelare.
UTILIZZO PREVISTO
Il kit dell'antigene VisuLize™ FVIII è un immunodosaggio enzimatico per la
determinazione quantitativa dell'antigene Fattore VIII in campioni di plasma
umano e di concentrati di Fattore VIII mediante la tecnica ELISA (Enzyme
Linked Immuno-Sorbent Assay) con doppio anticorpo.
INTRODUZIONE
Il Fattore VIII (noto in precedenza come globulina antiemofilica e Fattore
VIII:C) è una grande glicoproteina con un peso molecolare pari a 320000
dalton circolante nel plasma a una concentrazione di circa 200 ng/mL.1,2 Il
Fattore VIII viene stabilizzato mediante associazione con il Fattore von
Willebrand con cui crea un complesso FVIII-vWF necessario per la normale
sopravvivenza del Fattore VIII in vivo (t1/2 di 8-12 ore).3 FVIII è un procofattore che viene attivato attraverso una proteolisi limitata mediata dalla
trombina. In questo processo FVIIIa si dissocia dal vWF per combinarsi con il
Fattore IX attivato, Ca++ e una superficie fosfolipidica dove è un cofattore
essenziale nell'assemblaggio del complesso attivatore del Fattore X.4,5 Dopo
essersi dissociato da vWF, FVIIIa può essere inattivato dalla Proteina C
attivata e dal decadimento non enzimatico.4
L'importanza biologica del Fattore VIII è dimostrata nell'Emofilia A, una
disfunzione congenita che impedisce la coagulazione del sangue. L'emofilia
A colpisce principalmente i maschi ed è causata da una deficienza legata al
cromosoma X di FVIII.6 Si stima che la prevalenza dell'emofilia A si attesti tra
1/5000 e 1/10000.6 La gravità della deficienza è generalmente correlata
alla gravità della malattia. Gli individui in cui si registra un'attività del Fattore
VIII <1% sono considerati pazienti gravi, quelli con un'attività del Fattore VIII
tra l'1 e il 5% sono considerati pazienti moderatamente gravi e quelli con
un'attività del Fattore VIII tra il 5 e il 40% sono considerati emofiliaci lievi.7
Alcuni emofiliaci producono una proteina FVIII che è parzialmente o
totalmente inattiva. In questi casi, l'attività del Fattore VIII è bassa, ma i
livelli di antigene sono normali o quali normali. Questi pazienti, che
comprendono circa il 5% dei malati di Emofilia A, sono definiti positivi al
materiale a reazione crociata (CRM, cross-reacting material).8 La produzione
di anticorpi neutralizzanti il Fattore VIII si verifica anche nel 5-20% di
emofiliaci.9,10
La diagnosi di laboratorio della deficienza di Fattore VIII implica in genere
calcoli quantitativi basati sui livelli procoagulanti (attività funzionale del
Fattore VIII misurata in genere tramite prova di coagulazione). Nella diagnosi
e nella classificazione è anche possibile utilizzare i sintomi emorragici clinici;
la misurazione quantitativa della procoagulazione, tuttavia, rimane il metodo
preferito per la classificazione della gravità dell'emofilia.7 È possibile
ricorrere alla tecnica ELISA per l'antigene Fattore VIII in combinazione con
dosaggi funzionali per la valutazione delle terapie di sostituzione, la
valutazione dello stato del portatore, nonché per distinguere quei pazienti
destinati a essere CRM positivi (positivi al materiale a reazione crociata).
PRINCIPIO DI IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO
I micropozzetti a striscia sono prerivestiti di un anticorpo policlonale di
pecora del Fattore VIII umano. I campioni di plasma vengono diluiti e
applicati ai pozzetti. L'antigene Fattore VIII presente si lega all'anticorpo
rivestito. Dopo aver rimosso il materiale che non è stato legato, viene
applicato l'anticorpo di pecora di rilevamento marcato con perossidasi
affinché si leghi al Fattore VIII catturato. I pozzetti vengono nuovamente
lavati, dopodiché viene applicata una soluzione di TMB (tetrametilbenzidina
che è un substrato per la perossidasi) e lasciata reagire per un periodo di
REAGENTI
A.
Descrizione degli elementi reagenti
Elemento 1: Sacchetto di alluminio contenente 6 strisce, ognuna delle quali
contiene 16 pozzetti rivestiti di anticorpo di pecora del Fattore VIII umano.
Elemento 2: 2 fiale di plasma di calibrazione, ognuna liofilizzata da 1 mL di
plasma.
Elemento 3: 2 fiale di plasma di controllo A, ognuna liofilizzata, da 1 mL di
plasma.
Elemento 4: 2 fiale di plasma di controllo B, ognuna liofilizzata, da 1 mL di
plasma.
Elemento 5: 1 fiala contenente 50 mL di tampone di lavaggio concentrato
(20X).
Elemento 6: 3 fiale, ognuna delle quali contiene 20 mL di tampone di
diluizione del campione concentrato (2X).
Elemento 7: 1 fiala contenente 12 mL di anticorpo di pecora marcato con
perossidasi per il rilevamento.
Elemento 8: 1 fiala contenente 12 mL di substrato di tetrametilbenzidina
(TMB).
Elemento 9: 1 fiala contenente 12 mL di soluzione di arresto (acido solforico
0.2 M).
B. Avvertenze
Il kit è destinato a essere utilizzato da personale che ha ricevuto una
formazione specifica sulle procedure di laboratorio e sulle precauzioni
universali relative all'impiego di sostanze chimiche e sostanze a rischio
biologico elevato. Alcuni elementi contengono materiale di origine umana.
Ogni unità di plasma di origine utilizzata nella preparazione di questo
prodotto è stata testata mediante metodi approvati dall'FDA e trovata
negativa alla presenza del virus da immunodeficienza umano (HIV) Tipo I e
Tipo II, dell'antigene di superficie dell'Epatite B (HBSAg), nonché dell'Epatite
C (HCV). Tuttavia, nessun test può garantire totalmente che i prodotti
derivati dal sangue umano non trasmetteranno malattie infettive. Come tutti
i materiali di origine umana, questo prodotto deve essere manipolato come
materiale potenzialmente infetto.
La tetrametilbenzidina (TMB) è un substrato che presenta una ridotta
tossicità, tuttavia è necessario adottare delle precauzioni per evitare il
contatto diretto. È consigliabile utilizzare guanti e occhiali protettivi.
La soluzione di arresto contiene acido solforico diluito (0,2 M), che è
corrosivo. È consigliabile utilizzare guanti e occhiali protettivi.
Lo smaltimento dei rifiuti deve essere svolto in conformità alle normative
locali in vigore.
Per una scheda tecnica di sicurezza dei materiali relativa a questo prodotto,
contattare Affinity Biologicals Inc.
C.
Preparazione dei reagenti
Elemento 1 (strisce rivestite di anticorpo con supporto): Aprire il sacchetto
ed estrarre le strisce e il supporto appena prima dell'uso. Riporre nel
sacchetto e risigillare le strisce non utilizzate. Le strisce possono essere
utilizzate direttamente, vedere la sezione C: Procedura di dosaggio.
Elemento 2 (plasma di calibrazione): Ricostituire una fiala con 1,0 mL di
acqua distillata. Attendere 15 minuti per la dissoluzione del contenuto a
temperatura ambiente miscelando occasionalmente. La stabilità dopo la
ricostituzione è di 4 ore a temperatura ambiente (18-25oC) o 30 giorni a –
20o C.
Elementi 3 e 4 (plasma di controllo): Ricostituire una fiala di ogni plasma
con 1,0 mL di acqua distillata. Attendere 15 minuti per la dissoluzione del
contenuto a temperatura ambiente miscelando occasionalmente. La
stabilità dopo la ricostituzione è di 4 ore a temperatura ambiente (18-25oC)
o 30 giorni a –20o C.
Elemento 5 (tampone di lavaggio concentrato (20X)): Attendere che la fiala
si riscaldi a temperatura ambiente prima dell'uso. Prima di procedere,
assicurarsi che eventuali cristalli che si possono formare vengano dissolti.
Se necessario, è possibile scaldare la fiala a 37oC finché tutti i cristalli non
siano dissolti. Prima dell'uso diluire il tampone di 1/20. Ogni 2 strisce (32
pozzetti), aggiungere 16 mL di tampone a 304 mL di acqua distillata e
miscelare. La stabilità dopo la diluizione è di 1 settimana a 2–8oC.
Gli elementi 6-9 vengono forniti pronti all'uso.
Pagina 1 di 4
D.
Conservazione e stabilità
I kit intatti e i reagenti non ricostituiti sono stabili fino alla data di scadenza
indicata sulla confezione e sulle etichette dei singoli reagenti se conservati a
2–8°C.
2.
Il Plasma di controllo A (Elemento 3 ricostituito) e i plasma destinati ai
test sono diluiti 1/8 e 1/16. Aggiungere 100 µL di plasma in 700 µL di
diluente campione (Elemento 6), miscelare, quindi aggiungere 350 µL
di questa diluizione 1/8 in 350 µL di diluente campione per ottenere la
soluzione diluita 1/16. Il Plasma di controllo B (Elemento 4 ricostituito)
e i campioni a basso contenuto di l'antigene Fattore VIII (campioni
emofilici) devono essere analizzati a diluizioni più basse di 1/4 e di
1/8. Aggiungere 175 µL di plasma in 525 µL di diluente del campione
(Elemento 6), miscelare, quindi aggiungere 350 µL di questa soluzione
diluita 1/4 in 350 µL di diluente del campione per ottenere la soluzione
diluita 1/8.
3.
Dosaggio
PREPARAZIONE
DELLA PIASTRA
FASE
PRELIEVO DI CAMPIONI
Il sangue deve essere raccolto in provette con soluzione anticoagulante al
3,2% di tampone citrato nella proporzione di 9 volumi di sangue in 1 volume
di soluzione anticoagulante e miscelato con cautela per inversione.
Centrifugare a una velocità minima di 1500 x g per 15 minuti (NCCLS
Guideline H21-A411). Rimuovere il plasma sopranatante e utilizzarlo entro 4
ore oppure congelarlo a –20oC o temperature inferiori per un massimo di 1
mese.
Inserire il numero desiderato di strisce nel
supporto.
Pipetta in ogni pozzetto prerivestito:
Campione destinato ai
100 µL
CATTURA FVIII
test
(analizzare in
duplicato)
Coprire le strisce con il sigillante per piastre e
incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
Svuotare i pozzetti e lavarli 3 volte con 300 µL di tampone di lavaggio
diluito.
Soluzione di un
100 µL
ANTICORPO DI
anticorpo di
RILEVAMENTO
rilevamento (Elemento
7)
Coprire le strisce con il sigillante per piastre e
incubare per 45 minuti a temperatura
ambiente.
Svuotare i pozzetti e lavarli 3 volte con 300 µL di tampone di lavaggio
diluito.
Substrato di TMB
100 µL
SVILUPPO DEL
(Elemento 8)
COLORE
Attendere lo sviluppo del colore per 10 minuti
esatti a temperatura ambiente.
Soluzione di arresto
100 µL
(Elemento 9)
(Aggiungere a ogni
pozzetto nello
stesso ordine in cui
era stata aggiunta la
TMB)
Leggere la piastra a una lunghezza d'onda di 450 nm entro 30 minuti
dall'aggiunta della soluzione di arresto
Se necessario, conservare il supporto della piastra per utilizzarlo con
pozzetti non usati. Smaltire i pozzetti usati.
PROCEDURA
A.
Materiale fornito
Sacchetto di alluminio contenente 6 strisce di pozzetti rivestiti di anticorpo.
Plasma di calibrazione, liofilizzato.
Plasma di controllo A, liofilizzato.
Plasma di controllo B, liofilizzato.
Tampone di lavaggio concentrato (20X).
Diluente del campione.
Soluzione di un anticorpo di rilevamento.
TMB Substrato.
Soluzione di arresto.
Sigillante adesivo per piastre.
B.
Materiale aggiuntivo necessario (non fornito)
Acqua distillata per la ricostituzione e la diluizione
Pipette a singolo canale a volume variabile
Pipette multicanale
Puntali per pipette
Timer da laboratorio
Strumento di lavaggio delle micropiastre a pozzetti
Spettrofotometro compatibile con micropiastre con capacità pari a 450 nm.
C. Procedura di dosaggio
NOTE PROCEDURALI:

Ricostituire i reagenti come descritto in REAGENTI, Sezione C,
Preparazione dei reagenti. Attendere che i reagenti si riscaldino a
temperatura ambiente prima dell'uso.

È consigliabile analizzare in duplicato tutte le diluizioni di
calibrazione, di controllo e dei campioni di prova e predisporre per
ogni analisi un tampone bianco (vedere la sezione Calibrazione
del dosaggio).

Tutte le diluizioni devono essere effettuate immediatamente
prima dell'uso.

Evitare sempre che i pozzetti secchino. Mantenere coperta la
piastra durante le incubazioni.

I campioni di plasma non devono essere utilizzati con diluizioni
inferiori a 1/4.

Non utilizzare componenti del kit con numeri di lotto diversi.

Temperature di incubazione superiori o inferiori alla temperatura
ambiente normale (18 -25°C) possono causare risultati imprecisi.

Non utilizzare componenti del kit scaduti

Le strisce usate devono essere eliminate e non riutilizzate.
1.
Preparazione delle diluizioni di plasma di calibrazione: Diluire il plasma
di calibrazione (Elemento 2 ricostituito) nel diluente campione
(Elemento 6) come descritto nella Tabella 1 seguente: (NOTA: 100% =
1,0 IU/mL)
TABELLA 1:
Diluizione
Plasma di calibrazione
Diluente campione
100%
175 µL
525 µL
50%
350 µL di 100%
350 µL
25%
350 µL di 50%
350 µL
12,5%
350 µL di 25%
350 µL
6,25%
350 µL di 12,5%
350 µL
3,13%
350 µL di 6,25%
350 µL
1,56%
350 µL di 3,13%
350 µL
0,79%
350 µL di 1,56%
350 µL
CALIBRAZIONE
A.
Calibrazione del dosaggio
Il valore dell'antigene Fattore VIII indicato sulla fiala di plasma di calibrazione
è stato determinato eseguendo un confronto con uno standard secondario
attribuibile allo standard internazionale WHO per l'attività del Fattore VIII
02/150. Questo valore dell'antigene deve essere utilizzato come
concentrazione della diluizione iniziale del plasma di calibrazione.
È consigliabile sottrarre i valori relativi ai pozzetti che hanno ricevuto solo
diluente del campione anziché campione diluito.
B.
Curva di riferimento e calcolo dei risultati
La curva di riferimento è un tracciato logaritmo-logaritmo dei valori medi di
assorbanza (asse y) rispetto alla concentrazione di l'antigene Fattore VIII
(asse x). Il contenuto di l'antigene Fattore VIII dei controlli e dei campioni di
prova può essere letto dalla curva di riferimento e moltiplicato per il fattore
di diluizione appropriato. Nelle condizioni qui descritte, un campione diluito
di 1/4 presenterà un fattore di diluizione di 1, una diluizione di 1/8
presenterà un fattore di diluizione di 2 e una diluizione di 1/16 presenterà
un fattore di diluizione di 4.
Esempio: Se diluito di 1/8, il plasma destinato ai test offre un'assorbanza
corrispondente al 45% quando letto dalla curva di riferimento. Questo valore
deve essere moltiplicato per un fattore di diluizione di 2 per ottenere il
valore corretto del 90%.
CONTROLLO QUALITÀ
I plasmi di controllo forniti (Elementi 3 e 4) devono essere dosati con ogni
serie di campioni analizzati. I valori di Fattore VIII l'antigene ottenuti per i
Pagina 2 di 4
campioni destinati ai test devono essere considerati sospetti se i valori
ottenuti per i plasma di controllo non rientrano nell'intervallo indicato sulle
etichette del plasma di controllo.
LIMITAZIONI E INTERFERENZE
I valori dell'antigene Fattore VIII ottenuti utilizzando questo dosaggio non
devono essere utilizzati da soli per la diagnosi della malattia. È altresì
opportuno considerare l'anamnesi del paziente, la presentazione clinica e i
risultati di altre procedure diagnostiche. Sono noti stadi clinicamente
significativi in cui i livelli dell'antigene Fattore VIII del plasma sono normali o
quasi normali in presenza di una sostanziale riduzione dell'attività del
Fattore VIII.8
Il kit è stato sviluppato per essere utilizzato con plasma citrato. Non è
consigliabile utilizzare campioni contenenti anticoagulanti diversi dal citrato
di sodio al 3,2%.
Non sono state riscontrate interferenze nel dosaggio dovute alla presenza di
farmaci o di anticorpi eterofili quali il Lupus Anticoagulant (LA); tuttavia, non
è possibile escludere completamente l'insorgenza di interferenze dovute a
livelli elevati di anticorpi eterofili. La presenza del fattore reumatoide nei
campioni destinati ai test causerà interferenze nel dosaggio. La possibilità
teorica che campioni destinati ai test contengano anticorpi
dell'immunoglobina di pecora può essere causa di interferenze nel dosaggio.
VALORI PREVISTI
L'intervallo normale del Fattore VIII, come indicato nella letteratura, è 0,51,8 IU/mL.12 Ogni laboratorio dovrebbe determinare un intervallo normale in
modo indipendente; tuttavia i risultati di tre lotti misurati in 99 individui sani
indicano un intervallo di riferimento normale di 0,64-1,89 IU/mL (media =
1,268 IU/mL, SD = 0,3116).
PRESTAZIONI
A.
Specificità
Il dosaggio misura l'antigene Fattore VII nel plasma umano, i concentrati di
Fattore VIII a scopo terapeutico e preparazioni di Fattore VIII ricombinanti.
B.
Limite di rilevamento
Quando il dosaggio viene eseguito secondo quanto indicato nella Sezione C
Procedura di dosaggio, il limite di rilevamento è 0,008 IU/mL (0,8 %) di
l'antigene del Fattore VIII. Il limite superiore di rilevamento può variare con
ciascun lotto di kit a seconda del valore dosato del plasma di calibrazione
fornito nel kit. I campioni con valori non compresi nell'intervallo della curva
di riferimento devono essere nuovamente testati a una diluizione
appropriata per ottenere risultati accurati.
C.
Confronto dei metodi:
I risultati medi dei tre lotti del kit dell’antigene Fattore VIII VisuLize™ sono
stati confrontati internamente al dosaggio FVIII Coamatic® su 142 campioni
di pazienti contenenti livelli di Fattore VIII che coprono l’intero intervallo di
rilevamento. Il coefficiente di correlazione (r) è stato di 0,970 (R2 = 0,940, y
= 1,2059x + 0,1053). Il kit dell’antigene Fattore VIII VisuLize™ è stato inoltre
confrontato, presso due laboratori di test esterni, al dosaggio FVIII
Coamatic® su campioni di pazienti contenenti livelli di Fattore VIII che
coprono l’intero intervallo di rilevamento. Presso il laboratorio esterno 1,
sono stati testati 110 campioni e il coefficiente di correlazione (r) è stato di
0,969 (R2 = 0,9381 y = 1,2261x + 0,1085). Presso il laboratorio esterno 2,
sono stati testati 81 campioni e il coefficiente di correlazione (r) è stato di
0,974 (R2 = 0,9488, y = 1,1768x + 0,0242).
D.
Precisione
Precisione intra-assay, Metodo 1: In ognuno dei tre lotti di prodotto,
campioni di plasma normali e anormali sono stati testati in 4 dosaggi con 38
replicati per campione per piastra. Il coefficiente medio di variazione (CV) di
tutti i risultati era 4,56%
Precisione intra-assay, Metodo 2: Tre plasmi con concentrazioni diverse di
Fattore VIII sono stati testati nei replicati con 8 replicati in 20 dosaggi
utilizzando 3 lotti di prodotto. Il coefficiente intra-assay di variazione (CV) è
stato calcolato secondo la direttiva NCCLS Guideline EP5-A13 ed è indicato
nel riepilogo seguente per ogni livello di l'antigene Fattore VIII. Il valore CV
medio di tutti i risultati ottenuti con questo metodo era 4,51%.
Lotto 1
Lotto 2
Lotto 3
1,35-1,75 IU/mL di campione 2,17%
2,85%
3,89%
0,6-0,9 IU/mL di campione
2,85%
3,33%
5,19%
<0,055 IU/mL di campione
5,23%
6,83%
8,25%
Precisione inter-assay: Tre plasmi con concentrazioni diverse di l'antigene
Fattore VIII sono stati testati con 8 replicati in 20 dosaggi utilizzando 3 lotti
di prodotto. Il coefficiente inter-assay di variazione (CV) è stato calcolato
secondo la direttiva NCCLS Guideline EP5-A13 ed è indicato nel riepilogo
seguente per ogni livello di Fattore VIII. Il valore CV medio di tutti i risultati
ottenuti con questo metodo è stato del 4,69%.
Lotto 1
Lotto 2
Lotto 3
1,35-1,75 IU/mL di campione 2,12%
3,92%
4,11%
0,6-0,9 IU/mL di campione
1,63%
3,19%
7,30%
<0,055 IU/mL di campione
6,79%
5,49%
7,71%
E.
Variabilità tra lotti
94 campioni di controllo con valori di l'antigene Fattore VIII compresi
nell'intervallo tra 0,23 e -2,3 IU/mL sono stati testati in duplicato su tre lotti
per determinare la precisione del dosaggio da un lotto a un altro. La
variabilità media tra lotti è stata del 7,78%.
LEGENDA DEI SIMBOLI 14
V
Per uso diagnostico in vitro
g
Codice lotto
P
H
Rappresentante autorizzato
Data di scadenza
h
l
Numero di catalogo
Limite di temperatura
M
i
X
Produttore
Consultare le istruzioni per l'uso
Contiene reagente sufficiente per <n> test
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Pagina 3 di 4
Haemostas., 61(2), pp. 161-165, 1989.
Philadelphia, 1994.
Salzman, pp. 169-183, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1994.
3983-3996, 1998.
10. Bhopale, G.M., Nanda, R.K., Blood Coagulation Factor VIII: An overview,
J. Biosci, 28(6), 783-789, 2003.
11. “Collection, Transport and Processing of Blood Specimens for
1998.
12. Kasper, C.K., Herediatry Clotting Factor Deficiencies and Their
13. “Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices;
14. “Graphical Symbols for Use in the Labelling of Medical Devices”, EN
Garanzia limitata: Si garantisce che il prodotto funzionerà in base a quanto
stabilito nella documentazione e sulle etichette. Affinity Biologicals Inc. non
riconosce alcuna garanzia implicita di commerciabilità o idoneità per ogni
altro scopo e in nessun caso Affinity Biologicals Inc. potrà essere ritenuta
responsabile di eventuali danni consequenziali connessi alla garanzia
espressa di cui sopra.
M
P
1395 Sandhill Drive
Ancaster, ON
CANADA L9G 4V5
Tel: (905) 304-9896
(800) 903-6020
Fax: (905) 304-9897
[email protected]
Emergo Europe
Molenstraat 15
2513 BH The Hague
The Netherlands
+31 (0)70.345.8570
Pagina 4 di 4