For Reference Purposes Only For Research Use Only

Commentaires

Transcription

For Reference Purposes Only For Research Use Only
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Onconeural Antigens IgG
Immuno Line Blot Assay
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural
HuD, Ri, Yo and Amphiphysin specific IgG autoantibodies
Page 1 - 10
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-,
Ri-, Yo- und Amphiphysin-spezifischen IgG Autoantikörpern
Seite 11 - 20
Dot Blot per la determinazione qualitativa di autoanticorpi IgG
onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e Amfifisina
Pagina 21 - 30
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (IgG)
anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine
Page 31 - 39
ef
MKONA-1
MKONA-Z
Fo
Fo
rR
REF:
1 x 24
1x 8
Privates Institut für Immunologie
und Molekulargenetik GmbH
Kriegsstraße 99
D-76133 Karlsruhe, Germany
T: +49 721-85 000 0
F: +49 721-85 000 199
www.laborseelig.de
Version A 20111214
Distribution/ Euro Diagnostica AB
Service:
P.O. Box 50117
SE-202 11 Malmö
Sweden
T: +46 40 53 76 85
F: +46 40 43 22 88
www.eurodiagnostica.com
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-2-
Materials Supplied, Storage and Stability
Components
Cat.-No.
TESTSTR
ONA Dotblot Strips,
nitrocellulose strips
coated with
recombinant
onconeural antigens
HuD, Ri, Yo and
Amphiphysin
NEG
ONA negative control
POS
ONA positive control
CON
rR
WASH
Fo
(5x)
SUBS
Substrate Solution,
contains 5-Brom-4chloro-3-indolyl
phosphate and 4Nitrobluetetrazoliumchlori
de
Disposable
incubation trays
Evaluation Sheet
Store at
Shelf life
2 - 8 °C
see expiry
Protect from date
moisture!
Store
together with
desiccant in
the tube!
Do not touch
with fingers!
2 (1) vial(s)
50 µL
Predilution!
Dilute 1 : 20 with
1 x wash buffer
2 – 8 °C
MONAC2
2 (1) vial(s)
50 µL
Predilution!
Dilute 1 : 20 with
1 x wash buffer
2 – 8 °C
MEONA
2 (1) vial(s)
15 mL
ready to use
2 - 8 °C
MWBONA
1 vial 50 mL
Dilute before
use: e.g. add to
10 mL 5 x wash
buffer to 40 mL
dest. water
2 - 8 °C
30 days
after
opening, 5
days after
dilution
MSONA
2 (1) vial(s)
15 mL
ready to use
2 - 8 °C
Protect from
light!
30 days
after
opening,
resp. until
the expiry
date
MONAP
3 (1)
ONAA
1 (1)
Fo
ONA Buffered Wash
Solution, Concentrate
Preparation
ready to use
MONAC1
ef
ONA Enzyme
Conjugate,
polyclonal (goat) antihu-IgG antibodies,
labeled with alkaline
phosphatase
Content
24 (8)
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
MONADS
30 days
after
dilution,
resp. until
the expiry
date
30 days
after
dilution,
resp. until
the expiry
date
30 days
after
dilution,
resp. until
the expiry
date
Material Safety Data Sheets are available on request
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-3-
Materials Required
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
horizontal Shaker
Vortex mixer
destilled water
graduated cylinder for 250 mL; storage flasks for the wash buffer
pipettes for 10, 50 and 1000 µL
reaction tubes for predilution of the samples
optional: Westernblot Processor
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef







Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-4-
Specimen Collection and Preparation
Serum, plasma (EDTA, citrated, heparinized) and cerebrospinal fluid (CSF) can
be used as sample materials. All serum/plasma samples and controls
provided with the kit should be prediluted 1:20 with wash buffer; e.g. 10 µL
sample is mixed with 190 µL wash buffer. CSF can be used undiluted. At the
end of the procedure the final dilution of the sample is 1:2000.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
During transportation, patient samples may be stored at room temperature for
up to 24 hours. For short term storage the samples can be stored at 2-8 °C for
up to 5 days. For long term storage the samples should be dispensed and
stored frozen at < -18°C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Warnings and Precautions
All reagents of this test kit are strictly intended for in vitro diagnostic use only.
This test should be carried out only by persons who are familiar in performing
in vitro diagnostic procedures. Please follow strictly the sequence of pipetting
steps provided in this protocol.
Sample materials of patients are always potentially infectious. Handling of
samples suspected to be infectious should be done in a laminar flow clean
bench.
rR
ef
Method and Test Principle
Fo
Fo
The Onconeural Antigens IgG assay is an immunoassay in a dot blot format for
the qualitative detection of human IgG autoantibodies against the neuronal
antigens HuD, Ri, Yo and Amphiphysin. Human recombinant proteins HuD, Ri,
Yo and Amphiphysin are immobilized on fixed locations of a nitrocellulose
membrane; in addition anti-human IgG antibodies are immobilized as
functional control.
The prediluted sample is pipetted to the antigen coated carrier membrane.
During the first incubation period the autoantibodies present in the patient’s
samples will bind according to their antigen specificity. In the following step
unbound serum components are washed away. Bound immune complexes
are labelled with alkaline phosphatase conjugated anti-human IgG during the
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-5-
next incubation period. Surplus of conjugate is removed by washing the strips.
Finally, immunocomplexes are visualized by the addition of the colorless
enzym substrate BCIP which forms a blue precipitate line. Type of antibodies in
the sample is then identified by comparing its position with the reference
bands on the evaluation sheet.
Important notes:





r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Test Performance
Do not interchange components of different lots and assays.
Do not use kit components beyond their expiration dates.
All components should be prewarmed at room temperature (18 – 28 °C)
before use.
Dilute concentrates at least 30 minutes prior to use. Mix well, but prevent
foam formation.
To avoid carryover contamination, carefully aspirate fluids; take
particularly care on patient sample containing fluids!
Dilute patient samples
and controls 1:20 with
wash buffer (e.g. pipet
10 µL of sample + 190
µL of wash buffer); mix
well.
2.
Using tweezers, place
the required number of
strips in the incubation
tray (labeling must
face up).
Fo
Fo
rR
ef
1.
3.
Overlay the strips with 1,000 µL wash buffer and incubate for 5 minutes at
room temperature (18-28 °C) on a shaker. Do not aspirate; wash buffer
remains in the reservoirs !
4.
Add 10 µL prediluted patient serum/plasma and prediluted controls (resp.
50 µL undiluted cerebrospinal fluid) and incubate for 90 minutes on a
shaker.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-6-
Aspirate and wash the strips with 1,000 µL wash buffer. Do it by carefully
mixing and aspiration.
6.
Add 1,000 µL of wash buffer and shake for 5 minutes. Aspirate the wash
buffer. Repeat this step once.
7.
Pipet 1,000 µL Enzyme Conjugate solution and incubate for 60 minutes
on a shaker.
8.
Aspirate and wash the strips with 1,000 µL wash buffer. Do it by carefully
mixing and aspiration.
9.
Add 1,000 µL of wash buffer and shake for 5 minutes. Aspirate fluid.
Repeat this step once.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
5.
10. Pipet 1,000 µL of Substrate Solution and incubate 5-15 minutes on a
shaker. Control the color development after 5 minutes. The functional
control should be a clearly visible band on all strips. Especially the
positive control should show five clearly visible bands.
11. Aspirate Substrate Solution and wash twice with 1,000 µL of distilled
water.
ef
12. Remove the strips from their reservoir using tweezers. Airdry on adsorbent
paper for about 30 minutes.
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
13. Interpret the band pattern according the evaluation sheet provided with
the kit.
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-7-
Interpretation of Results
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
After complete drying, the strips will be placed according their functional
control on the evaluation sheet (see interpretation sample), with the numbers
on top and the ends of the strips fixed with adhesive film. The position of the
antigen bands may slightly vary from lot to lot, but they always lay within the
indicated marks of the evaluation sheet. The blue color of the antigen bands
will fade, if the dry strips are exposed to air and light for a longer time.
M:
marker for position of antigens.
1.
negative control.
2.
positive control.
Antigen
M
1
2
3
4
5
6
7
8
Amphiphysin
3 - 8. example of patient sera.
Yo
Ri
HuD
Funktionskontrolle
Test results are interpreted by comparing locations and color intensities of the
bands with those of the positive control supplied with the kit. For that, the
positive control serves as cut-off control.
Fo
Fo
rR
ef
Positive Result
only samples with a
stronger or similar
color intensity as the
signal obtained with
the positive control
from the kit are clearly
positive
Negative Result
no bands or very
weak bands are
interpreted as
negative
Borderline
lower intensities than
that of the positive
control but more
intensive than that of the
negative control are
borderline
In principle, the results of this immuno dot blot should only be interpreted for
diagnosis only in context with the patient´s clinical state of health and other
diagnostic and epidemiologic data.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-8-
Quality Control
The functional control on each strip (internal reaction control) has to display an
intensive color. The negative control must show only the functional control
band; in very rare cases very faint bands can be seen, which have no
importance.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
The positive control must always show an intensive staining of the four
antigens (Yo, Ri, Hu-D and Amphiphysin) and the functional control; if not, the
test has to be repeated.
Assay Characteristics
serum, plasma, cerebrospinal fluid
3.5 hours
by probing 100 healthy blood donors none tested
serum was found to be positive.
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
Sample material:
Time for test procedure:
Specificity:
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
-9-
Short Instruction: Onconeural Antigens IgG
(all sample volumes are given in µL)
Steps
Pipet to the strips
Solution
Sample
Controls
negative/positive
Wash Buffer
1000
1000
Add
Add
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Incubate for 5 min at room temperature (18-28
°C) on a shaker; do not aspirate
the solution!
pre-diluted
Control
-
10
pre-diluted
Sample
(CSF
undiluted)
10
(50)
-
Conjugate
1000
1000
Substrate
1000
1000
Incubate for 90 min at room temperature (RT) on
a shaker
Aspirate; wash the strips with 1,000 µL wash
buffer by mixing gently and aspirate again
Add 1,000 µL of wash buffer to each strip
and incubate for 5 min at RT on a shaker;
aspirate
Repeat this step once
Add
Incubate for 60 min at RT on a shaker
rR
ef
Aspirate; wash the strips with 1,000 µL wash
buffer by mixing gently and aspirate again
Add
Fo
Fo
Add 1,000 µL of wash buffer to each strip
and incubate for 5 min at RT on a shaker;
aspirate
Repeat this step once
Incubate for 5 – 15 min at RT on a shaker
Decant and wash the strips twice with
1,000 µL destilled water
Remove the strips with tweezers and airdry on
adsorbent paper for about 30 min
Analyze the band pattern using the evaluation
sheet
For a detailed description of the procedure see also page 5.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
- 10 -
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 11 -
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Onconeural Antigens IgG
Immuno Line Blot Assay
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural
HuD, Ri, Yo and Amphiphysin specific IgG autoantibodies
Page 1 - 10
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-,
Ri-, Yo- und Amphiphysin-spezifischen IgG Autoantikörpern
Seite 11 - 20
Dot Blot per la determinazione qualitativa di autoanticorpi IgG
onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e Amfifisina
Pagina 21 - 30
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (IgG)
anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine
Page 31 - 39
ef
MKONA-1
MKONA-Z
Fo
Fo
rR
REF:
1 x 24
1x 8
Privates Institut für Immunologie
und Molekulargenetik GmbH
Kriegsstraße 99
D-76133 Karlsruhe, Germany
T: +49 721-85 000 0
F: +49 721-85 000 199
www.laborseelig.de
Version A 20111214
Distribution/ Euro Diagnostica AB
Service:
P.O. Box 50117
SE-202 11 Malmö
Sweden
T: +46 40 53 76 85
F: +46 40 43 22 88
www.eurodiagnostica.com
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 12 -
Kitbestandteile, Lagerung und Stabilität
Komponente
Art.-Nr.
MONADS
ONA Dot-Blot Streifen
Nitrozellulose-Streifen
beschichtet mit rekombinanten onkoneuralen
Antigenen HuD, Ri, Yo und
Amphiphysin
POS
ONA Positivkontrolle
NEG
ONA Negativkontrolle
CON
Substrat-Lösung
(Substrate Solution),
enthält 5-Brom-4-Chlor-3Indolyl-Phosphat und 4Nitro-Blautetrazoliumchlorid
Einweg-Inkubationswannen
Auswertebogen
Haltbarkeit
Bis zum
Verfallsdatum
MONAC2
1 Fl.
50 µL
Vorverdünnung!
1:20 mit 1 x
Waschpuffer
verdünnen
2 – 8 °C
MEONA
2 (1) Fl.
15 mL
gebrauchsfertig
2 - 8 °C
MWBONA
1 Fl.
50 mL
Vor Gebrauch
verdünnen: z.B.
zu 10 mL
WaschpufferKonzentrat
40 ml dest.
Wasser
zugeben
gebrauchsfertig
2 - 8 °C
30 Tage nach
dem Öffnen, 5
Tage nach
dem
Verdünnen,
bzw. bis zum
Verfallsdatum
2 - 8 °C
Vor Licht
schützen!
30 Tage nach
dem Öffnen
bzw. bis zum
Verfallsdatum
Fo
SUBS
Fo
Konzentrat (5x)
Lagerung bei
2 - 8 °C
Vor Feuchtigkeit
schützen!
Zusammen mit
Trocknungsmitt
el in dem
Röhrchen
aufbewahren
Nicht mit den
Fingern
anfassen!
Vorverdünnung1:
2 – 8 °C
20 mit 1 x
Waschpuffer
verdünnen
1 Fl.
50 µL
ef
rR
ONA Waschpuffer
(ONA Buffered Wash
Solution),
Vorbereitung
gebrauchsfertig
MONAC1
ONA Enzym-Konjugat
, polyklonaler (Ziegen) antihu-IgG Antikörper, markiert
mit alkalischer Phosphatase
WASH
Inhalt
24 (8)
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
TESTSTR
MSONA
2 (1) Fl.
15 mL
MONAP
ONAA
3 (1)
1 (1)
30 Tage nach
dem
Verdünnen
bzw. bis zum
Verfallsdatum
30 Tage nach
dem
Verdünnen
bzw. bis zum
Verfallsdatum
30 Tage nach
dem
Verdünnen
bzw. bis zum
Verfallsdatum
Sicherheitsdatenblätter sind auf Anfrage erhältlich.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 13 -
Erforderliche Hilfsmittel
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
•
•
•
Horizontal-Schüttler
Wirbelmischer (Vortex)
destilliertes Wasser
Messzylinder für 250 mL; Plastikgefäße zur Aufbewahrung des
Waschpuffers
Mikropipetten für 10, 50 und 1000 µL
Reaktionsgefäße zur Probenverdünnung
Optional: Westernblot Prozessor
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
•
•
•
•
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 14 -
Probenentnahme und -vorbereitung
Als Probenmaterial können Serum, Plasma (EDTA, Citrat, Heparin) und Liquor
cerebrospinalis verwendet werden. Alle Serum-/Plasmaproben und die im Kit
befindlichen Kontrollen werden 1:20 mit Waschpuffer vorverdünnt; dazu wird
beispielsweise 10 µL Probe zu 190 µL Wasch-Puffer gegeben. Liquor kann
unverdünnt eingesetzt werden. Am Ende der Testdurchführung ist die
Endverdünnung der Probe 1:2000.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Für den Transport kann das Untersuchungsmaterial bis zu 24 Stunden bei
Raumtemperatur gelagert werden. Die Proben können gekühlt bei 2-8 °C bis
zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten
die Proben aliquotiert und bei < -18 °C tiefgefroren werden. Wiederholte
Einfrier- und Auftauzyklen sind zu vermeiden.
Hinweise und Vorsichtsmassnahmen
Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitroDiagnostik verwendet werden. Die Anwendung sollte durch Personal erfolgen,
das speziell in Verfahren von in vitro-Diagnostika unterrichtet und ausgebildet
wurde. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des
Tests ist unbedingt erforderlich.
ef
Untersuchungsmaterial von Patienten ist stets als potentiell infektiös
einzustufen und sollte stets in einer Sicherheitswerkbank weiterbearbeitet
werden.
rR
Methodik und Testprinzip
Fo
Fo
Der Onconeural Antigens IgG Test ist ein Immunoassay im Dot-Blot-Verfahren
zur qualitativen Bestimmung von humanen IgG-Autoantikörpern gegen die
neuronalen Antigene HuD, Ri, Yo und Amphiphysin. Die rekombinanten
humanen Proteine HuD, Ri, Yo und Amphiphysin sind auf einer NitrozelluloseMembran an fixen Stellen aufgetragen; zusätzlich sind anti-human-IgGAntikörper als Funktionskontrolle aufgetragen.
Die vorverdünnte Patientenprobe wird zu der Antigen-beladenen
Trägermembran pipettiert. Während der ersten Inkubation (90 Minuten) binden
die in der Patientenprobe vorhandenen Autoantikörper entsprechend ihrer
Antigen-Spezifität.
Im
nächsten
Schritt
werden
ungebundene
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 15 -
Testdurchführung
Wichtige Hinweise




Patientenproben
und Kontrollen 1:20
mit
Waschpuffer
verdünnen (z.B. 10
µL Probe + 190 µL
Waschpuffer); gut
mischen.
2.
Fo
Fo
rR
1.
Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke dürfen
nicht ausgetauscht werden.
Kitbestandteile dürfen nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums nicht benutzt
werden.
Alle Komponenten müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-28 °C)
erwärmt werden.
Die Konzentrate müssen mindestens 30 Minuten vor Gebrauch verdünnt
werden. Gut mischen, Schaumbildung vermeiden.
Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden Flüssigkeiten vorsichtig
absaugen; das gilt vor allem für die Patientenproben-haltigen
Flüssigkeiten!
ef

r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Serumbestandteile weggewaschen. Während der nächsten Inkubation (60
Minuten) werden die gebundenen Immunkomplexe mit anti-human-IgG, das
mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, markiert. Überschüssiges Konjugat
wird durch Waschen der Streifen entfernt. Schließlich werden die
Immunkomplexe sichtbar gemacht, indem sich durch Zugabe von farblosem
Enzymsubstrat (BCIP) eine blaue Präzipitat-Linie bildet. Die Antikörper-Typen
der Probe werden durch den Vergleich der Positionen mit denen der
Referenzbanden auf der Auswerteschablone identifiziert.
Mit einer Pinzette
die benötigte Anzahl
an Streifen in die
Inkubationswannen
legen (Beschriftung
nach oben).
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 16 -
Streifen mit 1000 µL Waschpuffer überschichten und 5 Minuten bei
Raumtemperatur (18-28 °C) auf einem Schüttler inkubieren. Nicht
Absaugen, Waschpuffer verbleibt in den Reservoirs!
4.
10 µL vorverdünntes Serum/Plasma und vorverdünnte Kontrollen (bzw. 50
µL unverdünnten Liquor) zugeben und 90 Minuten auf einem Schüttler
inkubieren.
5.
Absaugen und die Streifen mit 1000 µL Waschpuffer waschen. Dabei
vorsichtig schwenken und dann wieder absaugen.
6.
1000 µL Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer
absaugen. Diesen Schritt einmal wiederholen.
7.
1000 µL Enzymkonjugat-Lösung zupipettieren und 60 Minuten auf einem
Schüttler inkubieren.
8.
Absaugen und die Streifen mit 1000 µL Waschpuffer waschen. Dabei
vorsichtig schwenken und dann wieder absaugen.
9.
1000 µL Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer
absaugen. Diesen Schritt einmal wiederholen.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
3.
rR
ef
10. 1000 µL Substrat-Lösung zupipettieren und 5 - 15 Minuten unter Schütteln
inkubieren. Nach 5 Minuten die Farbentwicklung kontrollieren. Die
Funktionskontrolle sollte auf allen Streifen als intensive Bande sichtbar
sein. Insbesondere soll Positivkontrolle fünf deutlich sichtbare Banden
aufweisen.
Fo
Fo
11. Substratlösung absaugen und Streifen zweimal mit 1000 µL dest. Wasser
waschen.
12. Streifen mit einer Pinzette der Wanne entnehmen und für ca. 30 Minuten
auf Filterpapier lufttrocknen.
13. Das Bandenmuster mit dem im Kit vorhandenen Auswertebogen
interpretieren.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 17 -
Auswertung der Ergebnissse
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Die komplett getrockneten Streifen werden anhand der Funktionskontrolle auf
dem Auswertebogen (siehe Auswertebeispiel) mit der Nummerierung nach
oben ausgerichtet und mit Tesafilm an ihren Enden befestigt. Die Position der
Antigene auf den Streifen kann chargenabhängig geringgradig variieren, sie
liegen aber stets in dem Bereich der auf dem Auswertebogen befindlichen
Markierungen. Die blaue Färbung der Antigen-Banden verblasst, wenn die
trockenen Streifen Luft und Licht für längere Zeit ausgesetzt sind.
M:
Positionsmarker der Antigene
1.
Negativ-Kontrollserum
2.
Positiv-Kontrollserum
Antigen
M
1
2
3
4
5
6
7
8
Amphiphysin
Yo
3 - 8. Beispiele für Patientenseren
Ri
HuD
Funktionskontrolle
ef
Die Testergebnisse werden anhand vonLokalisation und Farbintensität der
Banden mit der Positivkontrolleaus dem Kit interpretiert. Dabeidient die
Positivkontrolle als Cut-off-Kontrolle.
rR
Positives Ergebnis
Fo
Fo
Nur Proben mit einer
kräftigen oder ähnlichen
Bandenintensität wie die
der Positivkontrolle sind
eindeutig Antikörperpositiv!
Negatives
Ergebnis
Keine oder ganz
schwache
Banden sind als
negativ zu
interpretieren
Grenzwertig
Geringere Intensitäten als
die der Positivkontrolle, aber
intensivere als die der
Negativkontrolle, sind als
grenzwertig zu interpretieren
Prinzipiell sollten die Ergebnisse des Immunoblots zur Diagnosestellung nur im
Zusammenhang mit dem klinischen Bild und anderen diagnostischen und
epidemiologischen Daten interpretiert werden.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 18 -
Qualitätskontrolle
Die
auf
jedem
Streifen
vorhandene
Funktionskontrolle
(interne
Reaktionskontrolle) muss kräftig gefärbt sein. Die Negativ-Kontrolle darf nur die
Färbung der Funktionskontrolle aufweisen; in wenigen seltenen Fällen treten
sehr schwache Banden auf, denen keine Bedeutung zukommt.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Die Positiv-Kontrolle muss immer eine kräftige Färbung der vier Antigene (Yo,
Ri, HuD und Amphiphysin) und der Funktionskontrolle zeigen; falls nicht, muss
der Test wiederholt werden.
Testcharakteristika
Serum, Plasma, Liquor
3,5 Stunden
Bei der Testung von 100 gesunden Blutspendern
wurde für keines der untersuchten Seren ein
positives Ergebnis gefunden
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
Probenmaterial:
Zeit zur Testdurchführung:
Spezifität:
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 19 -
Kurzanleitung:
(alle Volumenangaben in µL)
Schritte
Zu den Streifen pipettieren
Lösung
Probe
Kontrolle negativ/positiv
Waschpuffer
1000
1000
vorverdünnte
Kontrolle
-
10
vorverdünnte Probe
(Liquor
unverdünnt)
10
(50)
-
Enzym-Konjugat
1000
1000
Substrat-Lösung
1000
1000
5 min bei Raumtemperatur (18-28 °C) auf
einem Schüttler inkubieren;
die Lösungen nicht absaugen!
Zugeben
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Zugeben
90 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem
Schüttler inkubieren
Absaugen; die Streifen mit 1000 µL
Waschpuffer durch vorsichtiges Mischen
waschen und wieder absaugen
1000 µL Waschpuffer zu jedem Streifen
zugeben und für 5 min bei RT auf einem
Schüttler inkubieren; absaugen
Diesen Schritt einmal wiederholen
Zugeben
60 min bei RT auf einem Schüttler
inkubieren
Absaugen; die Streifen mit 1000 µL
Waschpuffer durch vorsichtiges Mischen
waschen und wieder absaugen
rR
ef
1000 µL Waschpuffer zu jedem Streifen
zugeben und für 5 min bei RT auf einem
Schüttler inkubieren; absaugen
Fo
Zugeben
Fo
Diesen Schritt einmal wiederholen
5 – 15 min bei RT auf einem Schüttler
inkubieren
Absaugen und zweimal mit 1000 µL dest.
Wasser waschen
Die Streifen mit einer Pinzette entfernen
und auf einem Papier ca. 30 min
lufttrocknen lassen
Die Bandenmuster anhand des
Auswertebogens analysieren
Vgl. auch Seite 15 für eine detaillierte Beschreibung der Testdurchführung.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
- 20 -
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 21 -
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Onconeural Antigens IgG
Immuno Line Blot Assay
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural
HuD, Ri, Yo and Amphiphysin specific IgG autoantibodies
Page 1 - 10
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-,
Ri-, Yo- und Amphiphysin-spezifischen IgG Autoantikörpern
Seite 11 - 20
Dot Blot per la determinazione qualitativa di autoanticorpi IgG
onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e Amfifisina
Pagina 21 - 30
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (IgG)
anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine
Page 31 - 39
ef
MKONA-1
MKONA-Z
Fo
Fo
rR
REF:
1 x 24
1x 8
Privates Institut für Immunologie
und Molekulargenetik GmbH
Kriegsstraße 99
D-76133 Karlsruhe, Germany
T: +49 721-85 000 0
F: +49 721-85 000 199
www.laborseelig.de
Version A 20111214
Distribution/ Euro Diagnostica AB
Service:
P.O. Box 50117
SE-202 11 Malmö
Sweden
T: +46 40 53 76 85
F: +46 40 43 22 88
www.eurodiagnostica.com
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 22 -
Materiale Fornito, Conservazione e
Componenti
Cat.-No.
MONADS
TESTSTR
Contenuto
Preparazione
24 (8)
Pronte
all’uso
POS
ONA controllo positivo
NEG
ONA controllo negativo
CON
MONAC1
2 (1)
flaconi (e)
da
50 µL
MONAC2
2 (1)
flaconi (e)
da 50 µL
MEONA
2 (1)
flaconi (e)
da 15 mL
MWBONA
1 flacone
da 50 mL
MSONA
2 (1)
flaconi (e)
da 15 mL
MONAP
3 (1)
ONAA
1 (1)
ONA Coniugato con Enzima
anticorpi policlonali (pecora)
anti-h-IgG, marcati con
fosfatasi alcalina
WASH
Fo
SUBS
Fo
rR
ef
ONA Soluzione di lavaggio
tamponata (ONA Buffered
Wash Solution)
Concentrata (5x)
2 - 8 °C
Proteggere
dall’umidità!
Conservare nel
tubo con
l’essiccante!
Non toccare
con le dita!
2 - 8 °C
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
ONA Dotblot Strisce
strisce di nitrocellulosa
rivestite con antigeni
ricombinanti onconeurali
HuD, Ri, Yo e Amfifisina
Conservare a
Soluzione Substrato
(Substrate Solution),
contiene 5'Bromo-4'Cloro3'Indolil-Fosfato e Cloruro di
4'Nitro-Tetrazolio
Contenitori disposable per
l’incubazione
Schema di valutazione
Prediluizione
!
Diluire 1:20
con tampone
di lavaggio
Prediluizione
!
Diluire 1:20
con tampone
di lavaggio
Pronto
all’uso
Diluire prima
dell’uso, ad
es
aggiungendo
40 mL acqua
dist. a 10 mL
tampone
lavaggio
Pronta
all’uso
Stabilità
Fino alla
data di
scadenza
30 giorni
dopo la
diluizione o
fino alla data
di scadenza
2 - 8 °C
30 giorni
dopo la
diluizione o
fino alla data
di scadenza
2 - 8 °C
30 giorni
dopo la
diluizione o
fino alla data
di scadenza
2 - 8 °C
30 giorni
dopo
l’apertura, 5
giorni dopo
diluizione
2 - 8 °C
Proteggere dalla
luce!
30 giorni
dopo
l’apertura o
fino alla data
di scadenza
Le schede di sicurezza sono disponibili a richiesta
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 23 -
Materiale richiesto
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Agitatore orizzontale
Vortex mixer
acqua distillata
cilindro graduato per 250 mL; contenitori per il tampone di lavaggio
pipette da 10, 50 e 1000 µL
provette per la prediluizione dei campioni
opzionale: Processore automatico per Western-blot
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef







Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 24 -
Raccolta e preparazione dei campioni
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Siero, plasma (EDTA, citrato, eparinato) e liquido cerebrospinale (CSF)
possono essere utilizzati come materiale campione. Tutti i campioni di
siero/plasma forniti col kit devono essere prediluiti 1: 20 con tampone
lavaggio; ad es. 10 µL di campione è diluito con 190 µL di tampone lavaggio. Il
liquido cerebrospinale (CSF) può essere utilizzato non diluito. Alla fine di
esecuzione del test la diluizione finale del campione è 1:2000.
Durante il trasporto i campioni possono essere conservati a temperatura
ambiente fino a 24 ore. I campioni refrigerati at 2-8 °C si conservano fino a 5
giorni. Per periodi più lunghi i campioni vanno aliquotati e congelati a < -18°C.
Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti del campione.
Avvertimenti e precauzioni
Tutti I reattivi di questo kit sono tassativamente da intendersi solo per uso
diagnostico in vitro. Il kit va utilizzato esclusivamente da personale addestrato
all’uso di metodologie diagnostiche in vitro. Preghiamo di seguire alla lettera lo
schema di pipettaggio indicato in questa procedura.
I campioni dei pazienti sono sempre da considerarsi come potenzialmente
infetti. I campioni di pazienti potenzialmente infetti vanno maneggiati in banchi
di lavoro con cappe a flusso laminare.
rR
ef
Metodo e principio del test
Fo
Fo
Il test per gli Onconeural Antigens IgG è un immunoassay in formato “dot blot”
per la determinazione qualitativa di autoanticorpi IgG umani anti antigeni
neuronali HuD, Ri, Yo e Amfifisina. Proteine umane ricombinanti di HuD, Ri, Yo
e Amfifisina sono fissate su posizioni prestabilite su una membrana di
nitrocellulosa; inoltre anticorpi antii-IgG umane sono fissati sulla membrana
come controllo funzionale.
Il campione prediluito è pipettato sulla membrana di supporto su cui sono
fissati gli antigeni. Nel corso della prima incubazione gli autoanticorpi presenti
nel campione del paziente si legano secondo la loro specificità agli
antigeni.Nel passaggio successivo i componenti del campione non legati sono
eliminati col lavaggio. Durante il periodo di incubazione seguente gli
immunocomplessi legati vengono marcati con anticorpi anti-IgG umane,
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 25 -
coniugati con fosfatasi alcalina. L’eccesso di coniugato è rimosso con il
lavaggio delle strisce. Infine aggiungendo una soluzione di substrato incolore
(BCIP), gli immunocomplessi vengono visualizzati, con la formazione di una
banda di precipitato blu. Confrontando con le bande di riferimento sul foglio di
valutazione gli autoanticorpi presenti nei campioni vengono identificati.
Important notes:





r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Esecuzione del test
Non mescolare componenti di lotti e dosaggi differenti.
Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza.
Tutti i componenti devono essere portati a temperatura ambiente (18 –
28°C) prima dell’ uso.
Diluire I concentrati almeno 30 minuti prima dell’ uso Mescolare bene,
evitando la formazione di schiuma.
Per evitare contaminazione da trascinamento aspirare i liquidi con cura,
particolarmente i liquidi contenenti il campione!
Diluire I campioni e i
controlli 1:20 con
tampone
lavaggio
(ad es. pipettare 10
µL di campione +
190 µL di tampone);
mescolare bene.
2.
Usando le pinzette,
collocare il numero
di strisce richiesto
nel contenitore per
reazione
(l’etichettatura deve
apparire verso l’alto).
Zona di
Aspirazione
Camera di reazione
Aggiunta reattivi
3.
Fo
Fo
rR
ef
1.
Ricoprire le strisce con 1.000 µL tampone lavaggio e incubare per 5
minuti a temperatura ambiente (18-28 °C) su un agitatore. Non aspirare; il
tampone rimane nelle cellette!
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 26 -
Aggiungere 10 µL di siero/plasma del paziente prediluito e i controlli
prediluito (oppure 50 µL di liquido cerebrospinale non diluito) ed incubare
per 90 minuti su agitatore.
5.
Aspirare e lavare le strisce con 1.000 µL tampone lavaggio. Mescolare e
aspirare con molta cura.
6.
Aggiungere 1.000 µL di tampone lavaggio e agitare per 5 minuti. Aspirare
il tampone lavaggio. Ripetere questo lavaggio per una volta.
7.
Pipettare 1.000 µL di soluzione Coniugato e incubare per 60 minuti su
agitatore.
8.
Aspirare e lavare le strisce con 1.000 µL tampone lavaggio. Mescolare e
aspirare con molta cura.
9.
Aggiungere 1.000 µL tampone lavaggio e agitare per 5 minuti. Aspirare il
liquido. Ripetere questo lavaggio per una volta.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
4.
10. Pipettare 1.000 µL soluzione Substrato e incubare 5-15 minuti su
agitatore. Controllaree dopo circa 5 minuti lo sviluppo del colore. La linea
del controllo funzionale deve essere chiaramente visibile in tutte le strisce.
In particolare il controllo positivo deve presentare cinque bande ben
visibili.
rR
ef
11. Aspirare la Soluzione Substrato e lavare due volte con 1.000 µL di acqua
distillata.
Fo
Fo
12. Rimuovere le strisce dal contenitore usando le pinzette. Asciugare con
aria calda su carta assorbente per circa 30 minuti.
13. Interpretare le bande presenti confrontandole con il foglio di valutazione
fornito col kit.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 27 -
Interpretazione dei Risultati
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Dopo che le strisce sono completamente asciugate, le stesse vengono
posizionate sul foglio di valutazione a partire dalla posizione del controllo di
funzionamento (v. esempio di interpretazione) con i numeri in cima alla parte
terminale della striscia fissata con pellicola adesiva. La posizione delle bande
degli antigeni può variare leggermente da lotto a lotto, ma le stesse si trovano
sempre in corrispondenza della posizione indicata sul foglio di valutazione. La
colorazione blu delle bande tende a sbiadire se le strisce asciutte sono
esposte all’aria e alla luce per un periodo prolungato.
M:
posizione delle bande di antigeni.
1.
controllo negativo.
2.
controllo positivo.
3 - 8. sieri dei pazienti.
Antigen
M
1
2
3
4
5
6
7
8
Amphiphysin
Yo
Ri
HuD
Funktionskontrolle
ef
I risultati del test vengono interpretati comparando le posizioni e l’intensità di
colore delle bande con quelle del controllo positivo contenuto nel kit. Il
controllo positivo funge da valore cut-off.
Fo
Fo
rR
Risultati positivi
solamente i campioni
con intensità di colore
forte e simile alle bande
del controllo positivo del
kit sono chiaramente
positive
Risultati negativi
nessuna banda o
bande molto deboli
vengono interpretate
come negative
Borderline
intensità più deboli di
quelle del controllo
positivo devono essere
interpretate come
borderline
In linea di principio, i risultati di questo immuno dot blot dovrebbero essere
tenuti in considerazione per una diagnosi solo insieme ad un quadro clinico ed
altri dati diagnostici ed epidemiologici.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 28 -
Controllo di qualità
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Il controllo di funzionalità su ciascuna striscia (controllo di reazione interno)
deve mostrare un colore intenso. Il controllo negativo deve mostrare
solamente la banda di controllo interno; in casi molto rari possono essere
osservate bande molto deboli, senza nessun valore.
Il controllo positivo deve presentare sempre una colorazione intensa per i 4
antigeni (Yo, Ri, Hu-D e Amfifisina); altrimenti il test deve essere ripetuto.
Caratteristiche del test
siero, plasma, liquido cerebrospinale
3,5 ore
il test eseguito su 100 donatori sani non ha dato
alcun risultato positivo
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
Campione:
Tempo di esecuzione:
Specificità:
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 29 -
Metodica breve: Onconeural Antigens IgG
(quantità espresse in µL)
Operazioni
Soluzioni
Pipettare sulle strisce
Tampone lavaggio
Campion
e
Controllo
negativo/positivo
1000
1000
Aggiungere
Aggiungere
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Incubare per 5 min. a temperatura
ambiente (TA) su un agitatore, non
aspirare le soluzioni!
Controllo prediluito
-
10
Campione prediluito
(CSF non diluito )
10
(50)
-
Coniugato
1000
1000
Soluzione Substrato
1000
1000
Incubare per 90 min. a TA su un agitatore
Aspirare il liquido. Lavare le strisce con
1000 µL di tampone lavaggio , mescolare
delicatamente e aspirare di nuovo
Aggiungere 1000 µLtampone lavaggio ad
ogni striscia e incubare per 5 min. su un
agitatore.
Ripetere una seconda volta
Aggiungere
Incubare per 60 min. a TA su un agitatore
Aspirare. Lavare con 1000 µL di tampone
lavaggio. Mescolare delicatamente.
Aspirare ancora
rR
ef
Aggiungere 1000 µL di tampone lavaggio
incubare per 5 min. a TA su un agitatore.
Ripetere una seconda volta
Aggiungere
Fo
Fo
Incubare per 5-15 min. a TA e su un
agitatore
Vuotare e lavare due volte con 1000 µL di
acqua distillata
Rimuovere le strisce con una pinzetta e
lasciarle asciugare su carta da filtro per
almeno 30 min.
Confrontare le bande ottenute con il foglio
di valutazione
Per una descrizione dettagliata della procedura vedi anche alle pagine 25.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
- 30 -
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 31 -
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Onconeural Antigens IgG
Immuno Line Blot Assay
Dot Blot for the qualitative detection of onconeural
HuD, Ri, Yo and Amphiphysin specific IgG autoantibodies
Page 1 - 10
Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen HuD-,
Ri-, Yo- und Amphiphysin-spezifischen IgG Autoantikörpern
Seite 11 - 20
Dot Blot per la determinazione qualitativa di autoanticorpi IgG
onconeurali specifici per HuD, Ri, Yo e Amfifisina
Pagina 21 - 30
Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (IgG)
anti-onconeuronaux HuD, Ri, Yo et Amphiphysine
Page 31 - 39
ef
MKONA-1
MKONA-Z
Fo
Fo
rR
REF:
1 x 24
1x 8
Privates Institut für Immunologie
und Molekulargenetik GmbH
Kriegsstraße 99
D-76133 Karlsruhe, Germany
T: +49 721-85 000 0
F: +49 721-85 000 199
www.laborseelig.de
Version A 20111214
Distribution/ Euro Diagnostica AB
Service:
P.O. Box 50117
SE-202 11 Malmö
Sweden
T: +46 40 53 76 85
F: +46 40 43 22 88
www.eurodiagnostica.com
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 32 -
Contenu du kit, stockage et stabilité
Composants
Cat.-No.
MONADS
TESTSTR
Quantité
24 (8)
Préparation
Conservation
Durée de vie
Prêt à l’emploi
2 - 8 °C
Protéger des
moisissures !
Stocker avec
du dessicant !
Ne pas
toucher avec
les doigts!
Voir date de
péremption
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Bandelettes Dotblot ONA
(ONA Dotblot Strips),
Bandelettes de
nitrocellulose coatées
avec des antigènes
onconeuraux
recombinants HuD, Ri, Yo
et Amphiphysine
MONAC1
2
flacons
de
50 µL
Prédilution !
dilution 1:20
avec la
solution de
lavage 1x
2 – 8 °C
30 jours après
ouverture ou
jusqu'à la date
de péremption
MONAC2
2
flacons
de
50 µL
Prédilution !
dilution 1:20
avec la
solution de
lavage 1x
2 – 8 °C
30 jours après
ouverture ou
jusqu'à la date
de péremption
MEONA
2 (1)
Prêt à l’emploi
flacon(s)
de 15 ml
2 - 8 °C
30 jours après
ouverture ou
jusqu'à la date
de péremption
1 flacon Diluer avant
de 50 ml usage : 10 ml
de solution de
lavage
concentrée
dans 40 ml
d’eau distillée
2 - 8 °C
30 jours après
ouverture, 5
jours après
dilution
MSONA
2 (1)
Prêt à l’emploi
flacon(s)
de 15 ml
2 - 8 °C
Protéger de la
lumière !
30 jours après
ouverture ou
jusqu'à la date
de péremption
Plateau d’incubation
MONAP
3 (1)
Fiche d’évaluation
ONAA
1 (1)
NEG
Sérum de contrôle ONA
contrôle négatif
POS
Sérum de contrôle ONA
contrôle positif
CON
ef
Conjugué enzymatique
ONA
(ONA Enzyme
Conjugate),
Anticorps polyclonal (de
chèvre) anti-IgG
humaines, marqué à la
phosphatase alcaline
MWBONA
rR
WASH
Fo
Fo
Solution de lavage ONA
(ONA Buffered Wash
Solution),
Concentrée (5x)
SUBS
Solution de substrat
(Substrate Solution),
Substrat : 5-Bromo-4chloro-3-indolyl
phosphate and 4-Nitrobluetetrazoliumchloride
Les fiches de sécurité sont disponibles sur demande
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 33 -
Matériel requis
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Agitateur horizontal
Vortex
Eau distillée
Eprouvette graduée de 250 ml; flacon pour stocker la solution de lavage
Pipettes de 10, 50 et 1000 µL
Tubes à essais pour la prédilution des échantillons
optionnel: automate de western-blot
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef







Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 34 -
Echantillon et Préparation
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Le sérum, le plasma (sous EDTA, citrate, héparine) et le liquide cérébrospinal
(CSF) peuvent être employés pour ce test. Tous les échantillons de sérum et
de plasma doivent être prédilués au 1:20 avec la solution de lavage; ex: 10 µL
d’échantillon mélangé à 190 µL de solution de lavage. Le CSF peut être utilisé
sans dilution. À la fin de la réalisation du test la dilution finale de l´échantillon
est 1:2000.
Pendant le transport, les échantillons peuvent être stockés à température
ambiante pendant 24 heures. Pour le stockage à court terme (5 jours
maximum), les échantillons peuvent être conservés à 2-8°C. Pour une
conservation à plus long terme, aliquotez les échantillons et congelez les à < 18°C. Evitez des cycles de congélation / décongélation répétitifs.
Avertissement et précautions d’emploi
ef
Tous les réactifs de ce kit sont strictement réservés à un usage de diagnostic
in vitro. Le personnel doit être formé et exercer les bonnes pratiques de
laboratoire nécessaires au diagnostic in vitro (EN 375). Respecter
rigoureusement l'ordre des étapes de pipetage du protocole.
Les réactifs du kit doivent être considérés comme potentiellement infectieux.
Les échantillons issus de groupes de patients à risque doivent être identifiés et
manipulés sous hotte à flux laminaire.
rR
Méthode et Principe du test
Fo
Fo
Le test Onconeural Antigens IgG est un immuno-test dot blot pour la détection
qualitative des auto-anticorps humains IgG anti antigènes neuronaux, HuD, Ri,
Yo et Amphiphysine. Des protéines humaines recombinantes HuD, Ri, Yo et
Amphiphysine sont fixées sur une membrane de nitrocellulose. Des anticorps
anti IgG humaines sont également fixés sur la membrane et servent de
contrôle interne.
L'échantillon prédilué est déposé à la pipette sur la membrane porteuse des
antigènes. Pendant la première période d'incubation (90 minutes) les autoanticorps présents dans l’échantillon du patient se fixent à leur antigène
spécifique. Le lavage permet d’éliminer les éléments non liés. Un conjugué
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 35 -
anti-IgG humaines couplé à de la phosphatase alcaline est ajouté et se fixe sur
les immunocomplexes liés à la membrane. L'excédent de conjugué est éliminé
par le lavage. En phase finale, les immunocomplexes sont visualisés par
l'addition d’un substrat incolore (BCIP) qui forme un précipité bleu en leur
présence. Les types d'anticorps présents dans l'échantillon sont alors identifiés
en comparant leur position aux bandes de référence sur la fiche d'évaluation.
Important :





r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Réalisation du test
Ne pas échanger les composants de différents lots.
Ne pas utiliser après la date de péremption.
Tous les composants doivent être à température ambiante (18 – 28 °C)
avant usage.
Diluer les concentrés moins de 30 minutes avant usage. Bien mélanger,
mais éviter la formation de mousse.
Pipeter soigneusement pour éviter les contaminations par transfert !
Diluer les échantillons et les
contrôles au 1:20 avec la
solution de lavage (ex:
ajouter 10 µL d’échantillon
à 190 µL de solution de
lavage); mélanger.
2.
En utilisant des pincettes,
placer le nombre requis
de bandelettes sur le
plateau
d’incubation
(marquage vers le haut).
Réservoir
Aspirer
Chambre d´incubation
Adjonction de réactifs
3.
Fo
Fo
rR
ef
1.
Recouvrir les bandelettes de 1000 µL de solution de lavage et incuber 5
minutes à température ambiante (18-28°C) sous agitation. Ne pas aspirer,
la solution de lavage reste dans les barquettes !
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 36 -
Ajouter 10 µL d’échantillon prédilué (sérum/plasma) ainsi que les
contrôles positif et négatif prédilués (remarque: ou 50 µL de liquide
cérébrospinal non dilué) et incuber 90 minutes sous agitation.
5.
Aspirer le liquide et laver les bandelettes avec 1000 µL de solution de
lavage. Mélanger et aspirer soigneusement.
6.
Ajouter 1000 µL de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer la
solution de lavage. Répéter l’opération de lavage encore une fois.
7.
Ajouter 1000 µL de conjugué et incuber 60 minutes sous agitation.
8.
Aspirer le liquide et laver les bandelettes avec 1000 µL de solution de
lavage. Mélanger et aspirer soigneusement.
9.
Ajouter 1000 µL de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer la
solution de lavage. Répéter l’opération de lavage encore une fois.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
4.
10. Ajouter 1000 µL de substrat et incuber 5-15 minutes sous agitation.
Vérifier le développement de la couleur après 5 minutes. Le contrôle
interne doit être clairement visible sur chaque bandelette. La bandelette
contrôle positif doit présenter 5 lignes colorées nettement visibles.
11. Aspirer le substrat et laver deux fois avec 1000 µL d’eau distillée.
rR
ef
12. Retirer les bandelettes du portoir en utilisant des pincettes. Laisser sécher
à l’air sur du papier absorbant pendant 30 minutes.
Version A 20111214
Fo
Fo
13. Interpréter le profil des bandelettes en vous référant à la fiche d’évaluation
fournie avec le kit.
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 37 -
Interprétation des Résultats
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Après séchage complet, placer les bandelettes sur une feuille, numérotation
vers le haut, en alignant le contrôle interne. Fixer les extrémités des
bandelettes avec du ruban adhésif (voir l'exemple d'interprétation). La position
des bandes d'antigène peut légèrement varier d’un lot à l’autre, mais elles sont
toujours comprises entre les marques indiquées par la fiche d'évaluation. La
couleur bleue des bandes d'antigènes peut pâlir si les bandelettes sont
exposées trop longtemps à l'air et à la lumière.
M:
Marqueur de position pour les antigènes.
1.
contrôle négatif.
2.
contrôle positif.
3 - 8. exemples de sérums de patient.
Antigen
M
1
2
3
4
5
6
7
8
Amphiphysin
Yo
Ri
HuD
Funktionskontrolle
Les résultats du test sont interprétés en comparant les localisations et les
intensités de couleur des bandes à celles du contrôle positif fourni avec le kit.
Pour cela, le contrôle positif sert de contrôle cut-off.
Fo
Fo
rR
ef
Résultat positif
Seuls les échantillons avec
une intensité plus forte ou
semblable au signal
obtenu avec le contrôle
positif du kit sont
clairement positifs.
Résultat négatif
Pas de coloration ou
une coloration très
faible est interprétée
comme un résultat
négatif.
Résultat douteux
Des intensités de
coloration comprises
entre celle du
contrôle négatif et
celle du contrôle
positif sont
interprétées comme
résultat douteux.
Par principe, les résultats d’un immuno-dot blot doivent être interprétés
uniquement en fonction de l’état clinique du patient et des autres données
diagnostiques et épidémiologiques.
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 38 -
Contrôle Qualité
Le contrôle interne de chaque bande doit être de couleur intense. Le contrôle
négatif doit seulement présenter une coloration au niveau du contrôle interne;
dans de très rares cas des lignes d’intensité très faible peuvent être visibles,
sans aucune incidence sur le résultat.
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Le contrôle positif doit toujours présenter des colorations intenses pour les 4
antigènes (Yo, Ri, Hu-D et Amphiphysine) et pour le contrôle interne, sinon le
test ne peut être interprété.
Caractéristiques du test
sérum, plasma, liquide cérébrospinal (CSF)
3h 30 min.
Sur 100 donneurs sains testés aucun n’est apparu
positif.
Version A 20111214
Fo
Fo
rR
ef
Echantillons :
Temps de manipulation :
Spécificité :
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 39 -
Protocole court: Onconeural Antigens IgG
(Tous les volumes sont donnés en µL)
Etapes
Ajouter sur les bandelettes
Solution
Echantillo
n
Contrôles
négatif/positif
solution de
lavage
1000
1000
Ajouter
Ajouter
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Incuber 5 min à température ambiante (18-28 °C)
sous agitation;
ne pas aspirer la solution!
Contrôles
prédilués
-
10
échantillons
prédilués
(CSF pur)
10
-
(50)
Conjugué
1000
1000
Substrat
1000
1000
Incuber 90 min à température ambiante (RT) sous
agitation
Aspirer, laver les bandelettes avec 1000 µL de
solution de lavage, mélanger doucement et aspirer
de nouveau.
Ajouter 1000 µL de solution de lavage sur chaque
bandelette et incuber 5 min à
RT sous agitation; aspirer
Répéter l’opération une fois
Ajouter
ef
Incuber 60 min à RT sous agitation
rR
Aspirer; laver les bandelettes avec 1000 µL de
solution de lavage mélanger doucement et aspirer
Ajouter
Fo
Fo
Ajouter 1000 µL de solution de lavage sur chaque
bandelette et incuber 5 min à RT sous agitation;
aspirer. Répéter l’opération une fois
Incuber 5 – 15 min à RT sous agitation
Aspirer et laver les bandelettes 2 fois avec 1000 µL
d’eau distillée.
Enlever les bandelettes avec des pincettes et
sécher à l’air et sur papier absorbant 30 min
Analyser le profil des bandelettes en utilisant la
fiche d’évaluation
Pour plus de détails voir page 35
Version A 20111214
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z
Offered in the US by ALPCO - 26G Keewaydin Drive, Salem, NH 03079 - www.alpco.com - Ph: (800) 592-5726
- 40 -
Explanation of Symbols
Fo
Fo
rR
ef
REF
Version A 20111214
Explanation / Erklärung / Significato /
Signification
Expiry date
Haltbarkeitsdatum
Data di scadenza
Date de péremption
In Vitro Diagnostic Medical Device
In Vitro Diagnostikum
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Diagnostic in vitro
Batch code
Los-Bezeichnung
Codice del lotto
Numéro de lot
Catalogue number
Artikel-Nummer
Numero di catalogo
Référence
Storage conditions
Lagerungsbedingungen
Temperatura di conservazione
Température de conservation
Consult Instructions for Use
Gebrauchsanweisung beachten
Consultare le istruzioni per l‘uso
Consulter la notice
Consult attended documents
Begleitdokumente beachten
Consultare i documenti relativi
Consulter le document avec attention
Package size
Packungsgröße
Numero di test
Nombre de tests par trousse
Manufacturer
Hersteller
Produttore
Fabriqué par
Only for evaluation purposes
Nur zur Leistungsbewertung
Solo per uso sperimentale
Pour évaluation uniquement
r R er
es enc
ea e
rc Pu
h rp
U os
se e
O sO
nl n
y
ly
Symbols (GB) / Symbole (D) / Symboli (I) /
Symboles (F)
Onconeural Antigens IgG MKONA1/Z

Documents pareils