Les méthodes de détermination des espèces animales à partir

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.,
1983, 2 (1), 79-86.
Les méthodes de détermination
des espèces animales à partir de la viande
ou des produits à base de viande*
D.PROTZ"
Résumé : Parmi les méthodes d'analyses électrophorétiques, la focalisation isoélectrique est une méthode particulièrement efficace pour
l'identification de l'espèce animale à partir d'échantillons constitués de
viande en l'état, de poisson ou autres produits. Par rapport aux méthodes sérologiques, la focalisation permet l'identification d'espèces animales appartenant à des familles proches du point de vue génétique.
Étant donné qu'elle est indépendante des antiserums, elle constitue un
complément très utile en particulier pour l'identification des viandes de
gibier et du poisson. Elle permet l'identification de certaines espèces
exotiques à partir d'échantillons de viande, à condition que l'on ait des
extraits de référence correspondants. La différenciation des espèces
animales à partir d'échantillons qui ont été soumis à la chaleur n'est
satisfaisante avec aucune des méthodes exposées dans ce rapport.
INTRODUCTION
Le commerce international des viandes (y compris celles de volaille et de
gibier) et du poisson, ne cesse de se développer. Bien souvent, les services
chargés des diagnostics sont dans l'impossibilité de déterminer l'espèce animale d'origine à partir des échantillons de viande, par l'emploi de méthodes
anatomiques/histologiques (24) et biologiques. En matière de législation
douanière, il suffit certes d ' u n diagnostic d'exclusion établi grâce à ces
méthodes. Cependant, en raison de la législation en vigueur en matière d'épizooties, de produits alimentaires et de protection des espèces, la détermination de l'espèce pour les viandes non déclarées ou ayant fait l'objet d ' u n e
fausse déclaration devient de plus en plus importante. Les méthodes
d'analyse sérologique habituelles sont bien souvent inutilisables dans ces cas.
Il apparaît donc nécessaire de mettre au point des méthodes qui permettent
e
* Rapport général sur le Thème 3 de la X Conférence de la Comission Régionale de
l'O.I.E. pour l'Europe. Londres, 28 septembre-1er octobre 1982. Traduction du rapport original
intitulé « Methoden der Tierartbestimmung aus Fleisch und Fleischerzeugnissen ».
** Institut für Veterinärmedizin des Bundesgesundheitsamtes (Robert
Institut), Thielallee 88-92, D-1000 Berlin 33.
von
Ostertag-
— 80 —
d'identifier l'espèce animale à partir d'échantillons dont on dispose, sans
faire intervenir des réactifs biologiques. Nous examinerons ci-après les possibilités d'utilisation des techniques biologiques et physico-chimiques de détermination de l'espèce animale à partir d'échantillons de viandes en l'état ou
transformées.
MÉTHODES
SÉROLOGIQUES
La méthode d'analyse sérologique, mise au point au début de ce siècle par
P . Uhlenhuth en tant que méthode biologique de différenciation des protéines, est largement utilisée. A la suite d'introduction parentérale d'antigène,
l'organisme des animaux d'expérience appropriés réagit par la formation
d'anticorps spécifiques des antigènes. Ces anticorps qui sont présents dans le
sérum des donneurs (antisérums) provoquent, en présence de l'antigène
homologue, des réactions qui peuvent être mises en évidence directement ou
indirectement suivant les différentes techniques utilisées en sérologie. La spécificité et la réactivité des antisérums obtenus dépendent de plusieurs facteurs. Un facteur très important est la nature de l'antigène utilisé pour
l'immunisation.
Pour la production des antisérums destinés à l'identification des espèces
animales, on utilise comme antigènes, la plupart du temps, des sérums ou des
fractions de sérum mais également des protéines musculaires ou des fractions
de celles-ci. Dans ces conditions, il est extrêmement difficile de produire un
antisérum spécifique capable de se lier exclusivement aux protéines de
l'espèce animale homologue de l'antigène. Certes, on peut améliorer la
monospécificité des antisérums par absorption à l'aide d'antigènes mais ces
de groupes génétiquement proches (25). Les caractéristiques individuelles des
animaux utilisés pour la préparation des antisérums sont souvent la cause
d'une réactivité insuffisante (titre trop faible) de ces antisérums. Lorsque l'on
utilise les méthodes habituelles comme la précipitation en gélose (30, 31) ou
l'immunoélectrophorèse (12), les réactions spécifiques antigène-anticorps
pouvant intervenir ne sont pas reconnaissables en raison d'une réactivité trop
basse ou de la présence de réactions annexes non spécifiques.
L'utilisation de la réaction de fixation du complément pour identifier
l'espèce animale à partir de la viande n ' a pas conduit jusqu'ici à une amélioration par rapport à la méthode de précipitation mentionnée ci-dessus. La
réaction de fixation du complément, qui est beaucoup plus sensible que les
méthodes indiquées ci-dessus, n'est pas spécifique lorsque l'on utilise un
échantillon non homogène, comme par exemple du muscle; d'une manière
générale, elle permet seulement la détermination du groupe animal.
Les méthodes d'investigation immunologique servant à déterminer
l'espèce animale à partir de la musculature du squelette présentent des inconvénients qui en empêchent bien souvent l'utilisation dans la pratique. Ainsi,
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la g a m m e des antisérums des espèces d ' a n i m a u x domestiques et sauvages
extra-européens, qui est offerte dans le commerce, est insuffisante. Les spécialistes qui se consacrent à ces travaux sont donc contraints de préparer euxmêmes ces antisérums. Or ceci est pratiquement impossible par suite de la difficulté qu'il y a à se procurer des sérums susceptibles de servir d'antigènes.
Jusqu'ici on n'est pas parvenu à identifier l'espèce animale à partir de
protéines musculaires entièrement dénaturées. Toutes les méthodes d'investigation dépendent, dans leurs réactions, de la présence de protéines réactives
ou de substances résultant de leur dégradation. Ce qui distingue les méthodes
c'est simplement la mise en évidence des protéines réagissant encore grâce à
des techniques de séparation améliorées.
Les produits à base de viande, traités à différentes températures de chauffage, ont fait l'objet de n o m b r e u x travaux permettant de déterminer l'espèce
animale de la viande préparée en utilisant des méthodes immunologiques (3,
12, 14, 23, etc.), électrophorétiques (7, 16, 28, 29, etc.) et immunoélectrophorétiques (2, 20, 26, 33, 35, etc.). Ces méthodes n ' o n t cependant pas permis
d'obtenir des résultats satisfaisants lorsque la transformation a provoqué des
modification structurelles et chimiques importantes.
La difficulté est de pouvoir extraire, dans le cas de transformation p r o fonde, des protéines capables de réagir ou bien des substances résultant de la
dégradation de ces dernières, qui sont spécifiques de l'espèce animale. En
effet, lorsque l'on chauffe la viande ou les produits à base de viande, la solubilité de ces substances dans l'eau ou dans les solutions t a m p o n diminue. La
viande traitée par la chaleur forme un coagulum de protéines qui peut être
considéré comme un réseau tridimensionnel irrégulier de chaînes polypeptides
imbriquées les unes dans les autres. En utilisant des solvants capables
d'influencer l'action réciproque des charges électriques en présence, tels que
le sulfate dodécylique de sodium et les solutions d'urée ou de chlorure de
guanidine, on peut améliorer l'extraction des substances encore susceptibles
de réagir, le résultat de l'extraction dépendant des températures auxquelles
ont été soumises les substances analysées.
Sinell et Mentz (34) décrivent l'utilisation d ' u n e méthode d'extraction des
protéines avec une solution d'urée de 6 M . Ces protéines, obtenues à partir de
protéines de sarcoplasma de bovins, de chevaux ou de porcs, coagulées par la
chaleur, ont été utilisées p o u r la préparation de l'antisérum. Les antisérums
obtenus présentent un titre élevé, sont spécifiques et réagissent encore de
manière nettement positive avec des extraits d'urée provenant de la musculature, et qui ont été chauffés à 120°C. Les méthodes immunoélectrophorétiques se sont révélées les plus efficaces pour ces analyses. De tels antisérums
préparés à partir de thermoantigènes ont réagi de façon n o n spécifique lors
d'essais d'identification de l'espèce animale à partir de conserves de viande;
elles ont simplement permis, dans le meilleur des cas, d'émettre des suppositions (36). Les analyses par chromatographie en phase gazeuse et par spectroscopie infrarouge pratiquées sur la graisse (8) de ces échantillons ont confirmé, sur la base de l'ester méthylique obtenu par décomposition des acides
gras, la présence de graisse de cheval et l'absence de graisse de r u m i n a n t .
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MÉTHODES
ÉLECTROPHORÉTIQUES
Le principe de l'électrophorèse repose sur la séparation de mélanges de
substances par l'action d ' u n c h a m p électrique. En fonction de la somme des
charges en présence, de la taille et de la structure des différentes particules de
substance, il y a migration en direction de l'électrode opposée. La méthode
convient tout particulièrement au fractionnement des protéines, étant donné
que leurs molécules possèdent le poids moléculaire requis (supérieur à
10.000). La vitesse de migration des molécules dépend également des facteurs
indiqués ci-dessus. On obtient ainsi une répartition des protéines par bandes
qui peuvent être mises en évidence. En faisant précipiter ces bandes avec un
antisérum (immunoélectrophorèse), on peut donner des informations qualitatives sur la provenance des substances. C o m m e milieu de séparation, on utilise souvent des gels de polyacrylamide (32) qui fournissent des résolutions
plus élevées que les gels d'agar et d ' a m i d o n et permettent une meilleure
analyse des résultats de la séparation (6, 21). H o f m a n n et Penny (18) décrivent l'électrophorèse P A G E avec utilisation de sulfate dodécylique de sodium
dans la méthode d'extraction des protéines. Les anions sulfate entourent la
molécule de protéine ainsi que les substances dérivées de celle-ci, d o n n a n t
ainsi un comportement électrophorétique unique à tous ces éléments. La formation de bandes de protéines n'est plus alors déterminée que par la taille des
molécules en migration. A l'aide de protéines de poids moléculaire connu,
qui sont utilisées pour établir une courbe d'étalonnage, il est donc possible de
déterminer les poids moléculaires des protéines à analyser (5, 17, 39) et ainsi
d'avoir des indications sur la présence de différentes espèces animales.
P o u r l'identification des espèces animales correspondant à des tissus musculaires dénaturés, on utilise aussi bien les protéines des myofibrilles que celles du sarcoplasma. Plus la dénaturation due à la chaleur est importante, plus
l'affaiblissement des bandes de myosine est supérieur à celui de l'actine, ce
qui fournit des indications sur la présence de viande de certaines espèces animales déterminées.
P o u r la séparation des protéines et l'identification des espèces animales à
partir de la viande, de la chair de volailles ou de poissons, on utilise depuis
15 ans environ la variante électrophorétique de la focalisation isoélectrique
en gel de polyacrylamide (27, 38). P a r r a p p o r t aux méthodes indiquées cidessus, les techniques d'analyse et de préparation de la méthode de focalisation se distinguent en particulier par une résolution plus importante et par
une meilleure mise en évidence des protéines. Dans la technique de focalisation, la séparation des protéines est effectuée à un gradient de p H qui s'établit dans un ampholyte porteur par application d ' u n c h a m p électrique dans
un milieu stabilisant.
Dans ce système, les molécules de protéine migrent, compensant peu à
peu leur différence de charge électrique, j u s q u ' à ce qu'elles atteignent enfin la
position où leur charge est nulle (point isoélectrique : pI). Toutes les substances de nature protéinique peuvent être séparées rapidement et avec une résolution élevée ce qui facilite leur mise en évidence.
— 83 Il est ainsi possible d'avoir une focalisation spécifique pour chaque espèce
animale étant d o n n é que l'on est en présence de compositions où interviennent différents aminoacides, avec des proportions différentes, des séquences
d'aminoacide différentes et des valeurs pI différentes. P a r r a p p o r t aux aut
méthodes électrophorétiques, la focalisation isoélectrique se distingue p..
une séparation des protéines suivant des critères isoélectriques.
r
Dans des analyses de produits alimentaires, la technique de focalisation
isoélectrique est utilisée depuis environ dix ans pour différencier et classifier
les protéines végétales (4, 21). Il était donc assez naturel que l'on songe à se
servir de la présence de séquences d'aminoacides spécifiques à des espèces animales pour utiliser cette méthode afin d'identifier la viande et le poisson. Les
résultats obtenus ont démontré que cette méthode de focalisation, employée
pour identifier les espèces animales à partir d'échantillons de viandes en
l'état, était plus efficace que les méthodes citées précédemment. Il a m ê m e été
possible de différencier, à quelques rares exceptions près, des espèces animales a p p a r t e n a n t à des familles très proches du point de vue génétique (19).
Les modifications des protéines provoquées par la dénaturation thermique ont un effet défavorable également sur les résultats obtenus avec la
méthode de focalisation. Seuls Tuibergen et Olsmann font la description de la
détermination des espèces animales à partir d'échantillons chauffés à 90°C,
extraits à l'urée (37).
Les différentes techniques d'application choisies telles que l'épaisseur des
gels utilisés (11), les méthodes de préparation des échantillons (9, 22, 37), la
teneur en protéine des extraits à analyser, la coloration et l'utilisation de différents procédés d'analyse, font que les limites de fiabilité de cette méthode
ont été appréciées diversement.
Ainsi Kaiser et al. (22) décrivent non seulement l'identification parfaite de
différentes espèces d ' a n i m a u x appartenant à des familles proches génétiquement mais aussi la différenciation entre les différents âges et les différents
sexes parmi ces mêmes espèces animales; de plus, ils parviennent à distinguer
les différences entre muscles d ' u n même animal. Führling et Gersonde (9)
parviennent à différencier des espèces d ' a n i m a u x apparentés du point de vue
génétique alors que les méthodes sérologiques avaient échoué. La différenciation entre cochon/sanglier, bœuf, veau, cerf, chevreuil à l'aide de
Gerber et U n t e r m a n n (10) sont en mesure d'identifier les espèces animales
à partir d'échantillons de viande pour autant qu'ils disposent d'échantillons
de référence ou de structures de bande typiques. Ils décrivent également la
différenciation d ' u n e série de mélanges de viandes hachées réalisés à partir de
bœuf et de porc dans lesquels ils ont été en mesure de mettre en évidence une
proportion de 3 % de viande de b œ u f et de 5 % de viande de porc.
L'identification des espèces de poisson à partir de morceaux de poisson
ou de produits à base de poisson non chauffés a été réalisée par Kaiser (22) et
p
— 84 —
Bau (1). La détermination de l'espèce de poisson au moyen de la focalisation
est plus facile que celle des autres viandes étant d o n n é que les bandes
bution beaucoup plus large des points isoélectriques sur toute la zone de séparation.
D'après les analyses faites par l'auteur, il est judicieux d'inclure dans les
essais des extraits de référence pour identifier l'espèce animale lorsque l'on se
sert de la méthode de focalisation. Ils sont nécessaires pour la différenciation
d'« espèces à problème » comme m o u t o n / c h è v r e et cochon/sanglier étant
donné que, même avec des techniques de travail standardisées, les longueurs
des zones de séparation des diverses plaques ne coïncident pas toujours exactement.
P o u r l'identification de ces « espèces à problème », les bandes annexes
sont déterminantes et de très faibles décalages lors des comparaisons avec les
phérogrammes témoins dont on dispose peuvent conduire à de fausses interprétations.
L'intensité et, en partie, la présence des bandes sont directement fonction
des quantités de protéines appliquées sur le gel, qui doivent être séparées. Il
est donc nécessaire d'appliquer une même quantité de protéine pour les
extraits à analyser et p o u r les extraits de référence lorsque l'on utilise la
méthode de focalisation afin que la différenciation de l'espèce animale soit
sûre.
Le respect de ces paramètres permet une utilisation judicieuse des m é t h o des d'analyse densitométriques, méthodes qui permettent d'objectiver les
résultats de la méthode de focalisation.
*
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