D DO VA OSS ALID IER DAT R DE TIED E V DO VAL OSS IDA IER
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D DO VA OSS ALID IER DAT R DE TIED E V DO VAL OSS IDA IER
C O D A - C E R V A-TE ERVUREN N Leuvense esteenweg 17 - B 3080 T Tervuren PRO O/5.4/02/D DOC01/V04 VA ALID DATTIED DO OSSIER R DO DOSSIER R DE E VAL V IDA ATIO ON N Détermi D nation de d l’ochrratoxine A dans les rogn nons, foiie et bou udin noir graphie liquide ccouplée à une spectrom métrie de e masse par chrromatog (UPPLC/MS-MS) SOP/M MYC/A ANA/08 12//10/2012 Pag ge 1 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN PRO O/5.4/02/D DOC02/V01 HISTTORIEK VAN N DE VALID DATIEDOSSIIER / HISTO ORIQUE DU DOSSIER D DE VALIDAT TION SOPP/MYC/ANA A/08 DATUM M / DATE Juin – Août 201 11 FASE – WIJZ ZIGING / PH HASE - MODIFICATION Expé érimentation pilote avec ccolonne de purification (SPETM OAS SIS et IAC colonne d’immuunoaffinité OchraTest O d de VICA AM) avec des échantillonss de Rognonss, foie et filet de porc (Méthode de e la littératurre). Expé érimentation pilote sans ccolonne de purification p p pour UPLC C/MS-MS (test avec chlorroforme, Acé étate d’éthyle e et méth hanol) avec des d échantilloons de Rogn nons, foie et filet f de porc. (Opttion choisie: Extraction auu chloroform me) Sep ptembre – Décembre 201 11 Test de récupé ération et de répétab bilité avec des écha antillons de Rognons R et dee foie Test de récupéra ation avec ddes échantillo ons de boud dins noirss (ingrédientss : viande d e porc 35% ; sang de porc p 8% ; boyyau de porrc ; 30% ; poumonss de porc épice es…) Jan nvier 2012 Etude de l’interfférence des matrices : effets matriices avecc Blanc et extrraits de rognnons, foie et boudins b noirss Test de répétabiliité instrumenntale Févvrier – Mai 2012 Test de récupé ération et de répétab bilité avec des écha antillons de boudins b noirss Reprises R des tests de réccupération ett de répétab bilité avec a des éch hantillons dee Rognons et e de foie ett de boudins b noirss Colle ecte d’échantillons de roggnons, de foie et de boud dins noirss sur le marché en Belgiq ue Juin – Août 201 12 Broyage, extraction et analysse des échan ntillons collecctés (app plication en ro outine) No ovembre – Dé écembre 201 12 Réda action du dosssier de validdation (1ère ve ersion) Jan nvier – Marrs 2013 Finalisation de la a rédaction d u dossier de validation 05//03/2013 Pag ge 2 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN PRO O/5.4/02/D DOC03/V01 VALIDATIEP PARAMETERRS / PARAMETRES DE VALIDATION V N SOPP/MYC/ANA A/08 1. Spécificité Less concentratiions d’ochra atoxine A on nt été déterm minées par analyse a des chromatograammes et au moyen de e la cou urbe d’étalo onnage de l’’ochratoxine A conforméément aux exigences e spécifiques dee l’uniformité é des temps de rétentions (vale eur absolue) et des rapports d’ions ( ion ratio). En n effet, l’och hratoxine A ((OTA) apparait toujours aux tem mps de réten ntion variant entre 2,593 – 2,634 min nutes, sans qu’aucune q interférence dee pics ne soit observée pour p les extraits de rognon, foie et boudins noirs (Annexxe 1). Le tableau 1 prése ente les valeuurs moyenne es des tempss de rétention obten nus en compa araison aux valeurs v des s olutions stan ndards d’OTA A. Table eau 1: Valeu urs moyenness ± Std (CV% %) des temps de rétention (en minutes)) pour la déte ection de l’O OTA dan ns les solution ns standard d d’OTA et les extraits de re eins, foie et bboudin noir Injection 1 Sta andards Re eins Fo oie Bo oudins) 2,618 ± 0,0 005 2,616 ± 0,0 009 2,617 ± 0,0 008 2,623 ± 0,0 007 Injection 2 2,6 618 ± 0,009 9 2,6 621 ± 0,007 7 2,6 614 ± 0,006 6 2,6 613 ± 0,006 6 De e façon satisffaisante, les coefficients de variation ne dépasse ent pas 0,3 %. % En outre, la fragmentation de l’O OTA (m/z 404,178) donne deuxx produits io oniques (m/zz 358,022 ett 238,9) don nt les rapporrts d’intensité és sont résum més dans le tableau u 2. Table eau 2: Valeurrs moyennes (CV %) des rrapports d’in ntensité des 2 adduits prov ovenant de la fragmentation de e l’OTA dan ns les solutions standard d’OTA et less 3 matrices. In njection 1 Standards Reins Foie Boudins Injecction 2 * 0,4 482 (9,6%) 0,5 503 (9,1%) 0,5 513 (13,7%) 0,4 482 (6,9%) 0,533 (14,2%) 0,522 (10,7%) 0,525 (17,0%) 0,469 9 (9,6%) * : Valeur moyyenne (coeffiicient de variation) Il est e à noter q que les CV ne dépassen nt pas le seu uil de 20% (Tableau ( 3) fixé par la ddécision de la commissio on européenne (20 002/657/CE E). En outre, aucune a tracee d’un autre pic p n’a été dé étectée dans la zone d’élution de l’OT TA dans les matricces non conta aminées «bla ancs» de reinss, foies et bo oudins noirs. Tableau 3 : Tolérances maximales a admissibles pour p les inten nsités ioniquees relatives. Intensité relative >50% % >20% % - 50% >10% % à 20% <=10 0% * 05//03/2013 Pag ge 3 of 17 : 2002/657//CE. CL-SM* (Variation relative des intensités)) ± 20% ± 25% ± 30% ± 50% C O D A - C E R V A--TERVUR REN 2. Robustesse La méthode an nalytique com mprenant pe eu d’étapes manuelles est applicable e sans modiffication aux échantillons de reins, de foie et de boudins noirs. Elle est relativvement simplle et ne présente aucunne étape de purification sur collonne à phase solide (SP PE) ou d’imm munoaffinité (IAC), ni de dérivatisation. Les sourcces d’incertitu udes pertinen ntes découlent des vvariations de e reproductib bilité de l’extrraction, des mesures parr UPLC/MS-M MS et de l’am mpleur de l’e effet ma atrice suppre ession ou ren nforcement des d signaux, de l’hétérog généité éventuelle de disstribution de l’OTA dans les éch hantillons ou u de la stabilité des standa ards d’OTA u utilisés. 3. Linéarité et courbe de ca alibration 3.1 1 Linéarité da ans les solutions standard ds Le RIKILT Test (V Van Trijp & Roos, R 1991) a été utilisé pour vérifier la linéarité des d réponsess aux injections de standa ards d’O OTA (ng/ml).. Le Tableau 4 en présentte un exemp le. Table eau 4 : Linéa arité des répo onses (aires) aux injection ns des solutio ons standardss d’OTA Concen ntration d’OTA (ng/mL) ( (C Ci) Surfaces S de ré éponses (Yi) Réponsess normalisées (Ri=Yi/Ci) Ecart à la moyenne (Ei=Rii-M) Dééviations reelatives ((Ei/M) 0,,1 0,2 26 0,,5 1 1 1,2 25 2,,5 5 5 257,5 754,9 1365,6 2559,8 3509,9 6942,7 12880,7 2575 2903 2731 2560 2808 2777 2576 2703 ‐129 199 9 27 7 ‐145 104 4 73 3 ‐128 ‐‐4,8% 7,4% 1,0% ‐‐5,3% 3,8% 2,7% ‐‐4,7% Moyen nne (M) Less déviations o observées da ans ce tablea au ne dépasssent pas le se euil de 10% fixé f par le teest de RIKILT et confirmen nt la bonne linéarité é des réponses obtenuess en fonctio n des conce entrations de es standardss. La régresssion linéaire est utilisée pour éla aborer la courbe de calib bration. Il esst à noter cep pendant qu’u une variationn intra-journa alière (CVpentees = 6,3 3%) existe en ntre 2 séries préparées au cours de la a même jourrnée (Figure 1). La figuree 2 illustre la a variation interjou urnalière (CV Vpentes = 4,8% %) observée entre deux sérries obtenuess en 2 différe ents jours. bration des sttandards mo ontrant Figure 1: Courbes de calib la variation intra-journalière Fig gure 2: Courrbe de calibraation des standards monttrant la variation innter-journaliè ère our les conceentrations tesstées de 0,1 – 5 ng/mL dde solution standard, s ce qui La courbe de ccalibration esst linéaire po corrrespond à u une gamme de concentra ation allant d de 0,4 à 20 0 μg OTA/kg dans des écchantillons de d rognon, fo oie, boudin noir. C Cette variation n découlant des prépara ations de stan ndards reste acceptable (< 10%) ma ais constitue par ailleurs une sou urce d’incertiitude de mesure. 05//03/2013 Pag ge 4 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN 3.2 2 Linéarité da ans les différrentes matrice es L’é étude de la llinéarité dan ns les extraitss de matricee a permis d’évaluer d les l’effet des innterférences matricielles.. Le déttail de la pro océdure utilisée a été préssenté en Ann nexe 2. La figure 3 pré ésente les co ourbes d’étalonnage réa alisées dans les 3 extraits de produitts animaux comparées c à la cou urbe de référrence «Blanc»». Cette comparaison révvèle l’existencce d’effets ma atrices (Tableeau 5). Figure 3: Courbes d’étalonnage réalisées r dan ns les extraitss de reins, foiie et boudinss et dans le so olvant (blanccs) Tableau T 5: E Evaluation de es SSE (Signa al Suppressio on or Enhanccement) caracctérisant l’exiistence des effets e matrice es Pentes Foie Reinss Boudin noir Blancc * ** 3582,2 ± 3317,5 ± 2718,9 ± 2482,3 ± 63,3 41,2 29,6 41,0 SSE S * ± s.e % 145 ± 3,0 % 134 ± 2,3 % 110 ± 2,0 % 100 1 ± 1,7% fets matrrices** ++ ++ +/Basee : SSE= =Signal Suppression or Enhanccement : +/-: Effet non significatif, ++ : Efffet très significatif Less pentes obte enues pour les l matrices animales pa ar régression n linéaire ontt été rapporttées à celle obtenue o avecc le sollvant (MeOH H:Eau) servan nt de référencce. Le calcul des valeurs de SSE («Sig gnal Suppresssion or Enha ancement») (vvoir Equation (1) et les résultats consignés dans d le Tableeau 5) ont pe ermis d’observer que les extraits issuss des reins ett du foie présententt des effets matrices t au boudin , pour leque m sign nificatifs (SSEE > 110%) contrairemen c el cet effet re este anecdotique (entre 100 et 110%). 1 SSE = % (Equation 1) Ce es résultats pe ermettent de conclure que les matricees reins et foies induisent des effets dee renforcement des signau ux qui préservent ttout de mêm me la linéarité é des réponsees. 4. Limite de détection et e de quanttification La limite de détection (LOD D) et la limite de quantificcation (LOQ) ont été déterminées à paartir des bruiits de fonds (BF) ( d’é échantillons non contam minés (blancs). Plusieurss échantillons blancs on nt été injecté tés. Le table eau 6 prése ente l’esstimation dess LOD et LOQ calculées en multiplian nt le signal/B BF respectivem ment par 3 eet par 6. 05//03/2013 Pag ge 5 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN Table eau 6 : Valeu urs estimées des limites de d détection et e de quantifiication Reins Foie Boudin noir LOD (ng/kg) 173 LO OQ (ng g/kg) 346 3 Limite L de rappportage (ng/kgg) 350 93 221 186 442 4 200 450 Répétabilité et reproducctibilité intra a laboratoire e 5. Fidélité : R entale 5.1 Répétabiliité instrume En injectant de eux fois les mêmes m blanccs (solutions de standard ds d’OTA) et extraits de rreins, foies et e boudins noirs con ntaminés en OTA (voir expérimentati e ion des effetts matrices), l’évaluation de la répétaabilité instrum mentale illusttrée par la Figure 4 révèle que la variabilité é des mesurees MS-MS ten nd vers < 6% % pour des cconcentration ns supérieure es à 0,5 5 ng OTA/ml (2 ng OTA//g de produiit) mais attein nt 12% pourr des concenttrations plus faibles <0,5 5 ng/mL. Tou utes les injections d’’extrait ont étté effectuées en doubles a afin de dimin nuer l’incertittude liée à ceette étape. Figure e 4: Evolution d des coefficientss de variation de deux injections des mêmes eextraits dopés La répétabilité des mesuress, surtout à fa aible concenttration est co ompensée pa artiellement ppar des injecctions en dou uble et est e aussi incluse dans l’esstimation de l’incertitude de mesures. 2 Répétabiliité et reprod ductibilité in ntra laborato oire 5.2 La déterminatio on de la répé étabilité et de la reprodu uctibilité est fa aite sur la ba ase des expéériences de validation v 3x3 3x3 analyses d’échantillons de rognons, foie ou de bou udins noirs dopés à 0,5 x LMA, 1x LM MA et 1,5 x LMA pendan nt 3 jou urs. Par défaut d’un ne réglementtation en vigu ueur, les essa ais ont été efffectués en te enant comptee des propossitions de lim mites ma axima tolérée es ou autoriisées (LMA) pour les co ntaminationss en ochrato oxine A danss les triperie es. En cours de disscussion à la Commission n européenn ne, ces limitees sont de 2--5 μg/kg pou ur les produiits animaux à base de sa ang (tel que les bou udins noirs) et e de 5-15 μg/kg pour lees triperies (rrognons, foie es). Les essaiss sont basés sur les valeu urs1 de 10 μg/kg po our les rogno ons et les foie es et 5 μg/kg g pour les bo oudins noirs. 1 : La limite maxim male acceptable e est fixée à 10 μg/kg μ pour le fo oie de porc par les autorités en charge de la séécurité sanitaire au Danemark et e en Esto onie, à 5 μg/kg pour les reins, foie et viande en e Roumanie ett Slovaquie et 1 μg/kg dans les viandes et prodduits dérivés en Italie (Duarte et e al. 201 10 ; Duarte et a al., 2013). 05//03/2013 Pag ge 6 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN La détermination de la ré épétabilité et de la rep roductibilité utilise les critères c de pperformance RSDr < RS SDR. Co oncernant la a reproductib bilité des fra actions pon dérales infé érieures à 100 μg/kg, l’application n de l’équattion d’H Horwitz (CV = 2(1-0,5logC)) donne d des va aleurs élevéees inadmissib bles. Par conséquent, il esst stipulé que e les CV doivvent être aussi bas q que possible (CV Répétab bilité intra lab boratoire < CV C Reproductibilité (CVR) corresponda ant à 0,5*LMA A). Le tableau 7 ré écapitule les résultats r obte enus et l’Ann exe 3 présen nte le détail des d traitemennts statistiques des donnée es. Tableau 7 : Répétabilitté et reproductibilité intra laboratoire Co oncentrations nominales Mesurée es (μg/kg g) Moyenne es (μg/kg) Re eins Fo oie Répétabilité et reproductibilité r intra-laboratoire i e Estimée (Ho orwitz) % 2x 2x 2x 2x 2x 2x Sdays Srw Srrw S(R) S(rw) S Srepl (μg/kg) 2x 2x Srepl Sjours Estimée (Horwitz) 2x 2x S(R) S(rw) 5 4,4 1,0 0,0 1,,0 2,2 1,5 22,2% % 0,0% 222,2% 44,0% % 29,3% 10 0 9,3 1,8 0,5 1,,8 4,4 2,9 18,9% % 5,2% 119,6% 44,0% % 29,3% 15 5 15,2 3,2 0,0 3,,2 6,6 4,4 20,8% % 0,0% 220,8% 44,0% % 29,3% 5 4,4 1,3 0,0 1,,3 2,2 1,5 28,8% % 0,0% 228,8% 44,0% % 29,3% 10 0 9,7 1,7 0,5 1,,8 4,4 2,9 18,1% % 5,4% 118,8% 44,0% % 29,3% 15 5 13,9 3,0 1,3 3,,2 6,6 4,4 21,3% % 9,3% 223,3% 44,0% % 29,3% Bo oudins 2,5 5 2,0 0,5 0,3 0,,5 1,1 0,7 22,4% % 13,5% 226,2% 44,0% % 29,3% noirs n 5 4,3 1,2 0,4 1,,2 2,2 1,5 27,1% % 8,3 228,4% 44,0% % 29,3% 7,5 5 6,1 0,9 0,7 1,,2 3,3 2,2 15,4% % 11,8% 119,4% 44,0% % 29,3% 6. Récupérration Less pourcentag ges de récupé ération ont été é déterminéés par régresssion linéaire et les résultaats obtenus (Tableau ( 8) sont s tou us dans les limites requise es (70% à 11 10%) pour lees critères de performance e du règlemeent 2002/65 57/CE. L’Annexe 3 présente p le détail des traittements statistiques des d données. Tableau 8 : Po ourcentages de récupérattion Rein ns Foie e Bou udins noirs LMA (μg/kg g) Pource entages de récup pération Ordonnéee à l’origine R2 10 10 5 10 07,6% 94 4,5% 81,5% -1,14 -0,12 0,03 0,9532 0,9297 0,9237 Un n pourcentage de récupérration est systématiquemeent déterminé é lors des analyses de rouutine et au co ours des con ntrôles de 2ème, 3ème ligne es inclus. 7. Justesse e Le manque de matériau de e référence certifié à basee de produitss animaux (rognons, foiee, boudins no oirs) contaminés en ochratoxine A auprès de es fournisseu urs habituels (ERM, BIPE EA, FAPAS, AOKIN, A BAM,, Sigma-Aldrrich, Biopure, Rbio opharm, Alexxis biochemicals, Camprro, CFM) et ll’inexistence de test inter laboratoire ou collaboratif utilisant des pro oduits anima aux ont rendu u impossible la détermina ation du biaiss de la métho ode analytiquue. 8. Incertitu udes de messures L’A Annexe 3 pré ésente aussi le détail des traitements t sttatistiques do onnant les incertitudes réssumées danss le tableau 10. 1 05//03/2013 Pag ge 7 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN Tableau 10 : Incertitudes élargies é et ma aximales Re eins Fo oie Bo oudins noirs (*)) u = sd oncentrationss Co nominales ntrations Concen mesu urées moye ennes μg/kg 5 10 15 5 10 15 2,5 5 7,5 μg//kg 4,40 9,30 15,16 4,45 9,65 13,90 1,99 4,25 6,07 (***) U = 2 sd In ncertitude (k = 1) (*) μg/kg 0,49 0,91 1,58 0,64 0,91 1,62 0,26 0,60 0,59 % 11,1% 9,8% 10,4% 14,4% 9,4% 11,6% 13,1% 14,2% 9,7% ncertitude élaargie In U, (k = 2) (***) μg/kg 0,98 1,83 3,16 1,28 1,82 3,23 0,52 1,21 1,18 % 2 22,2% 1 19,6% 2 20,8% 2 28,8% 1 18,8% 2 23,3% 226,2% 228,4% 119,4% Inccertitude maxximale Um max. (k = 2) (***) μg/kg μg % 1,5 2,9 4,4 1,5 2,9 4,4 0,7 1,5 2,2 29,3% 2 2 29,3% 2 29,3% 2 29,3% 2 29,3% 2 29,3% 2 29,3% 2 29,3% 2 29,3% (***)) from modif. Ho orwitz for Srw, HorRat H < 2x2/3 cfr Codex x Alim - mth crite eria - draft 14.2. 08 Pour chaque m matrice une in ncertitude com mbinée est ccalculée à pa artir des incerrtitudes de réépétabilité (va aleur élevée des inccertitudes sta andards) et celles c pouvant être dérivvée de l’exacctitude par analyses a dess matériaux de d référence e. A déffaut de l’exiistence de matériaux m de e référence, un coefficie ent de variattion de 10% % a été utilissé. L’incertitu ude com mbinée (k = 2) pour les rognons, r foie e et boudins sont alors de e 30%, 35% et e 35% (Tableeau 11). Tableau 11 : Inceertitudes com mbinées (Précision + Justeesse) Rognons Foie Boudins noirrs Ureep Ubiais Ucombinée 0,11 11 0,14 44 0,14 42 0,1 0,1 0,1 0,149 0 0,175 0 0,174 0 Urep = incertitude e répétabilité/rep productibilité ; Ubiais = Incertitude de justesse 9. Limite de décision (C CCα) et capa acité de déttection (CCβ) La limite de décision (CCα) et la capa acité de déteection (CCβ) n’ont de signification qque par rapp port aux lim mites ma aximales auto orisées (LMA A) en cours de discussion au niveau européen. e To outefois, les vvaleurs utilisé ées reposent sur les valeurs déjà à adoptées par les autorittés en chargee de la sécurrité sanitaire de certains ppays europée ens. Les résultats de CCα et de C CCβ sont conssignés dans le Tableau 12 2. Tableau u 12 : Limites de décision n et capacité de détection n Reins Foie Boudin no oir LMA (μg/kg)) 10 10 5 μg//kg 11,6 6 12,0 0 6,0 0 CCα %LM MA 116,3 12 20,3 12 21,2 μg/kg 13,3 14,1 7,1 CCβ % LMA 132,9 140,9 142,8 10. Applica ation en routtine avec des échantillonss commerciau ux ns a été fait suivi s de leur homogénéissation. Le Ta ableau 13 prrésente les ré ésultats obtenus Le broyage dess échantillon lorrs des analyse es de routine e portant sur 20 échantillo ons de rogno ons, 20 foies et 20 boudinns noirs. 05//03/2013 Pag ge 8 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN Tableau 13 : Teneurs* (n ng/kg) en OTTA des échan ntillons de reins, foies et bboudins noirss testés. * Echantillons Reins Foies Bo oudins noirs 1 411 ND ND 2 548 ND ND 3 461 ND ND 4 ND 389 ND 5 364 ND ND 6 ND Traces ND 7 351 ND ND 8 ND Traces ND 9 Traces ND ND 10 ND ND ND 11 ND ND ND 12 ND Traces ND 13 Traces ND ND 14 ND Traces ND 15 ND ND ND 16 ND Traces ND 17 Traces ND ND 18 ND ND ND 19 Traces ND ND 20 ND ND ND : Les résultats ont été déjà corrrigés avec less pourcentag ges de récupéération. ND D : concentra ation < LOD D ; Traces : LOD < concentrations < LOQ L’a analyse des é échantillons a été faite en 2 répétitionss en considérant les critèrres suivants : • Un résulttat inférieur à LOQ sera rendu en tan nt que «< LO OQ» ou tracess • Pour dess échantillons dont les ré ésultats des 2 répétitionss (>LOQ) so ont inférieurss à CCα, la moyenne de es 2 répétitions a été éta ablie et l’écha antillon est d déclaré confo orme • Si le résu ultat de l’une e des répétitio ons est égal o ou supérieur au CCα alors cette analysse sera reprise • Pour dess échantillons dont les ré ésultats des 2 répétitions (>LOQ) sont supérieurss à CCα, la moyenne de es 2 répétitions sera établie et l’écha antillon est dééclaré non co onforme 05//03/2013 Pag ge 9 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN PRO O/5.4/02/D DOC04/V01 FA ACTOREN D DIE DE JUIST THEID EN BETROUWBA B AARHEID VA AN DE BEPR ROEVINGEN N BEÏNVLOEDEN FACTEUR RS QUI INFLLUENCENT L’EXACTITU UDE ET LA FIABILITE F D ES ESSAIS SOPP/MYC/ANA A/08 1. UITRUSTING G EN LABORA ATORIUMMA ATERIAAL / E QUIPEMENT T ET MATERIE EL DE LABORRATOIRE E Equipement et e Matériel de e Laboratoiree Contrrôle LLC/MS-MS* Entrettien annuel + Entretien ppériodique Injection QC PPipettes Contrrôlées en rou utine Étalon nnage périod dique B Balances Contrrôlées en rou utine Étalon nnage périod dique Contrrôle de poidss V Verrerie Stand dard + procé édure de netttoyage C Congélateur//Réfrigérateur Vérificcation quotid dienne des teempératures 2. STALEN EN PRODUCTEN N / ECHANTILLONS ET PPRODUITS • L’hétérog généité des échantillons é est e contrôlée par un broyyage préalable suivie d’unne homogéné éisation de to out l’échantillon. • Les interfférences messurées par l’e effet matrice sont corrigée es par les éta alons marquéés 13C. • La justessse des étalon ns est contrôlée par des ssolutions certifiées ou par mesures speectrophotométriques. • L’eau Miilli Q est maîîtrisée via l’en ntretien de l’a appareillage e (Millipore) et e vérificationn journalière 3. PRINCIPE VA AN DE METH HODE / PRINC CIPE DE LA M METHODE Less facteurs crittiques liés au u principe de e la méthodee sont la répé étabilité des mesures, less interférence es matricielles et les variations iinstrumentale es liées aux réponses du u détecteur MS-MS. Pour les résultaats douteux, les échantillons serront soumis à de nouvelle es analyses. 4. OMGEVING G / MILIEU AM MBIANT L’in nfluence de ll’environnem ment sur les étapes d’extra action est nég gligeable. Les solutions sttandards son nt conservéess au con ngélateur pa ar précautio on. L’UPLC utilisé u est pllacé dans une u salle the ermostatisée afin d’évite er d’éventue elles perturbations d des réponsess du détecteu ur MS-MS sussceptible d’ê être influencé é par la temppérature du milieu ambia ant. La température e de la salle est e relevée. 5. PERSONEEL / PERSONNEL Less étapes de p préparation requièrent de e la rigueur et la maîtrise e des manipulations de bbase dans les laboratoire es à savvoir les pesé ées, les dilutiions, les cen ntrifugations ainsi que les respects de es règles dee sécurité et de maintien de pro opreté dans les laboratoiires. En outre e, la vérifica tion des résu ultats requierrt de la rigueeur dans l’interprétation des chrromatogrammes et de la maîtrise dess logiciels acccompagnants l’UPLC/MS-MS. 05//03/2013 Pag ge 10 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN REFERENCES 1. Comité é Technique CEN/TC 27 75 du Com ité Européen n de Norma alisation (CE N). Produits alimentaire es – Biotoxin nes – Critère es des méthod des d’analys e des mycoto oxines. CR 13 3505. Bruxellles : CEN, 1999, 1 8 p. 2. Commission des co ommunautés européennees. Décision de d la commisssion du 12 aaoût 2002 po ortant modallités d’appliication de la a directive 96/23/CE 9 d u Conseil en e ce qui co oncerne les performance es d’analyse e et l’interp prétation des résultats. Jo ournal officie l des Comm munautés euro opéennes, n°° 2002/657//CE du 17 août a 2002, pp. 8-36. 3. Commission des Communautéss Européennees. Règlemen nt (CE) N°401/2006 de laa Commissio on du 23 févvrier 2006 p portant fixatio on des mode es de prélèveement d’écha antillons et des d méthodess d’analyse pour p le contrrôle officiel des teneurs en mycotoxines des den rées alimentaires. Journa al officiel de l’Union euro opéenne L70 0 du 9.3.2006 pp. 12-34 4. 4. Commission of the European co ommunities. Laying down n the samplin ng methods aand the meth hods of analysis for the e official control of the e levels of O Ochratoxin A in foodstu uffs. Officiall Journal off the Europe ean Communities, n° 20 002/26/EC of o 13 March 2002, pp. 38-43. 5. Duarte e S.C., Lino C.M., C Pena, A., A 2010. Myycotoxin food and feed reg gulation and d the specific case of ochrato oxin A: A revview of the wo orldwide stattus. Food Add ditives and Contaminants C s. Part A. Chemistry, Analysiis, Control, Exposure E and d Risk Assessm ment 27, 144 40–1450. 6. Duarte S.C., Lino C.M., Pen na A. 2013 . Novel IAC C-LC–ESI-MS S2 analyticaal set-up for ochratoxin n A determ mination in po ork. Food Ch hemistry 138:: 1055-1061. 7. Horwitzz W., Albert R. 2006. The e Horwitz Ra atio (HorRat):: A useful Ind dex of methood performan nce with resp pect to preccision. Journa al of AOAC International 89( 4) : 109 95-1109. 8. Interna ational Organization for Standardizattion (ISO), 1999. ISO/IEC C 17025: G General requiirements for the compe etence of testiing and calib bration laborratories, ISO,, Geneva, Sw witzerland. 9. Nordicc Committee on Food An nalysis. NMKLL Protocol N° 5, 2011 (11 Octobre) A Analytical Quality Q Contro ol – Guidelines for the publication p of o analytical rresults of che emical analysses in foodstuuffs. pp 1-23. 10. Jorgensen K., Peterrsen A. Conttent of ochra toxin A in pa aired kidney and meat saamples from healthy Dan nish slaughtter pigs. Foo od Additives and a Contamiinants, 2002. 11. Matrellla, R., Mona aci, L., Milillo o, M.A., Palm misano, F., Tantillo, T M.G., 2006. Occhratoxin A determination d n in paired kidneys and muscle sam mples from sw wines slaughttered in south hern Italy. Foood Control 17, 1 114–117 7. 12. Milicevvic D.R., Juricc V.B, Stefano ovic S.M., Veeskovic-Moracanin S.M. Ja ankovic S.I. 2 2009. Analyssis of ochrato oxin A in pig g tissues usin ng high presssure liquid ch hromatograp phy (HPLC) and liquid chrromatograph hy tandem mass m spectro ometry (LC/M MS/MS) as confirmative m methods. Procceedings for natural n sciennces 117: 51-61. 13. Van LLoco J., Bee ernaert H., An Alterna tive Method d Validation Strategy foor the Euro opean Decission 2002/6 657/EC, Proceedings of Euro E Food C hem XII: Stra ategies for Sa afe Food 200 03, 1, 91 -94 4 14. Van Trijp J.M.P., Ro oos A.H. RIKILT TEST Mod del for calcula ation of calib bration curvees. Rikilt report, 1991, n° 9102, pp. 1-4. PRO/5.4/02 2 Gestion de la validation n des méthod des au CERVA A-Tervuren 05//03/2013 Pag ge 11 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN An nnexes Table des anne exes Annexe 1 : Qu uelques chromatogrammes représent atifs de la dé étection de l’’ochratoxine A dans les extraits e de reins, foie et boudin ((analyse de routine) r Annexe 2 : Pro otocole de dé étermination de la linéaritté dans les matrices. m Annexe 3 : Calcul des répéttabilité et rep productibilité intralaboratoire ValMethTe erv_v1-70_2..xls : Ochrato oxin A in kidn ney ValMethTe erv_v1-70_2..xls : Ochrato oxin A in live r ValMethTe erv_v1-70_2..xls : Ochrato oxin A in blacck sausage 05//03/2013 Pag ge 12 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN Annexe A 1 :Q Quelques chrromatogrammes représen ntatifs de la détection d de l’OTA dans lles extraits de e reins, foie et e boudin BEH H C18 1.7uM-2.1x x100mm IL_O OTA_20120714_18 Sm S (Mn, 2x3) 2.61 IL_ _OTA_20120727_49 Sm m (Mn, 2x3) 1: MRM of 1 Channel ES+ TIC (OTA A C13) 3.35e5 2.67 100 % % 10 00 BE EH C18 1.7uM-2.1x1 100mm 1: MRM of 1 Channel ES+ TIC (OTA C13) 4.91e5 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_O OTA_20120714_18 Sm S (Mn, 2x3) 2.75 3.00 3.25 2.61 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_ _OTA_20120727_49 Sm m (Mn, 2x3) 100 2.7 75 3.00 3.25 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 > 238.9 (OTA) ( 1.21e5 3.25 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 > 358.022 (OTA) ( 9.32e4 2.67 % % 10 00 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 8 > 238.9 (OTA) 1.67e5 2.98 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_O OTA_20120714_18 Sm S (Mn, 2x3) 2.75 3.00 3.25 2.61 3.05 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_ _OTA_20120727_49 Sm m (Mn, 2x3) 100 2.7 75 3.00 2.67 % % 10 00 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 > 358.022 (OTA) 8.72e4 0 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 Time Écchantillon de rognon n°2 dopé à 5 pp pb 12C et 10 ppb 13C 1: MRM of 1 Channel ES+ TIC (OTA C13) 4.58e5 2.60 0 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_O OTA_20120714_66 Sm S (Mn, 2x3) 2.75 3.00 3.25 2.61 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 > 238.9 (OTA) 1.90e5 2.25 2.50 2.7 75 3.00 3.25 34 3.3 3.56 3.73 3.86 3.97 3.50 T Time 3.75 Échantillon de foie N°19 9 dopé à 5 ppb p 12C et 10 0 13 ppbb C IL_ _OTA_20120727_67 Sm m (Mn, 2x3) 1: MRM of 1 Channel ES+ TIC (OTA C13) 2..98e5 2.67 100 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_ _OTA_20120727_67 Sm m (Mn, 2x3) 100 2.7 75 3.00 3.25 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 > 238.9 (O OTA) 1..18e5 3.00 3.25 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 > 358.022 (O OTA) 1..05e5 2.66 % % 10 00 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_O OTA_20120714_66 Sm S (Mn, 2x3) 2.75 3.00 3.25 2.60 0 3.50 3.75 2: MRM of 2 Channels ES+ 404.178 > 358.022 (OTA) 9.07e4 0 1.75 2.00 2.25 2.50 IL_ _OTA_20120727_67 Sm m (Mn, 2x3) 100 2.7 75 2.67 % % 10 00 1.60 0 2.00 3.25 % % 10 00 1.75 2.82 2.94 2.97 BE EH C18 1.7uM-2.1x1 100mm BEH H C18 1.7uM-2.1x x100mm IL_O OTA_20120714_66 Sm S (Mn, 2x3) 2.48 2..13 2.35 2.40 1.73 1.82 1.94 0 1.79 1.75 2.94 2.33 2.00 2.25 2.50 2.75 3.13 3.00 1.70 3.2 28 3.33 3.25 3.50 3.75 Time Écchantillon de rognon N°11 dopé à 5ppb 12C et 10 0ppb 13C 05//03/2013 Pag ge 13 of 17 0 1.75 1.88 2.1 11 2.14 2.39 2.50 2.00 2.25 2.50 2.82 2.7 75 2.91 3.06 3.00 3.45 5 3.50 3.25 3.50 3.69 3.86 3.97 3.75 Échantillon n de boudin N°2 dopé à 5ppb 12C et 10pppb 13C T Time C O D A - C E R V A--TERVUR REN Annexe 2 : Pro otocole de dé étermination de la linéaritté dans les matrices. m Concentrration des solutions standards (n ng OTA/mL de solution) Volume d de standard prélevé e en μL (10%) Volume d d’extrait préle evé en μL (90 0%) Volume ttotal de la solution o obtenue en μL μ 0 1 2,5 5 10 12 ,5 25 50 50 0 50 50 50 50 50 0 50 50 450 0 450 450 450 450 45 50 450 450 500 0 500 500 500 500 50 00 500 500 n blanc est ég galement pré éparé en mélangeant 50μ μL de standard avec 450μ μL de solvantt. Ces solutio ons sont ensu uite Un analysées par U UPLC-MS/MS S. 05//03/2013 Pag ge 14 of 17 C O D A - C E R V A--TERVUR REN Annexe 3 : Calcul des répéttabilité et rep productibilité intralaboratoire ValMethTerv_v1 1-70_2.xls : Ochratoxin A in kidney CALCULAT TION of REPEATAB BILITY, WITHIN-LAB B REPRODUCIBILIITY, CC?, CC? and RECOVERY ACCORDING TO 2002/657/EC,, ISO 11843-1 and Van V Loco & Beerna aert (2004) (reminde er : formulas : no ote : this approach givess first approximation of U for single sample but does d not include u recov for f routine samples DATA : O OCHRATOXIN A l linear regression : Method : KIDNEY Matrix : (Maximum Residue Limit) MRL : 10 unit : ug/kg ates) (number of replica Nrepl : 3 (number of days or o analysts) Ndays : 3 (number of levels))) (Nlev : 3 Measured concentra tions : or recovery) : (NOT corrected fo C CCa, CCb : S U: SD, rep lev da ay or analyst : 4 recovery intercept R2 107,6% -1,14 0,9532 t(26,0.05) Yc 1,706 11,37 CC? ug/kg 11,63 nom.ccn ug/kg 5 10 15 av.meas. ug/kg 4,40 9,30 15,16 1 1 4,12 2 3,92 3 4,6 2 4,32 5,07 4,88 0,239 MSrepl 3 4 5 4,12 4,78 3,75 0,489 Srepl 4,396 average for le evel 0,245 SSday s 6 5 6 S days 2 = (MS days -M MS repl ) / n repl S Rw 2 = S days 2 + S rep 2 CC? ug/kg 13,29 RL % of MR 116,3% % 0,122 MSday s 7 -0,039 Sday s 8 9 10 0,000 Sdays 0,489 SRw ) % of MRL M 132,9% uncertainty (k = 1) (*) ug/kg % % 0,49 11,12% 0,91 9,82% 1,58 10,42% % U, ext. unc. (k = 2) (***) ug/kg % 0,98 22,2% % 1,83 19,6% % 3,16 20,8% % Umax. (k = 2) (***) ug/k g % 1,5 29,3% 2,9 29,3% 4,4 29,3% (*) u = S Rw (**) U = 2 S Rw orwitz for Srw, HorRat < 2x2/3 (***) from modif. Ho cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08 8 1,435 SSrepl linear regrression 0.5 x MRL 6 18 y = 1,076 61x - 1,1448 R² = 0,9532 16 5 14 2 4 12 10 3 8 replicate : 2 6 4 1 2 1 10,38 8,51 8,16 4,654 SSrepl 2 3 4 5 10,38 9,02 8,7 10,14 9,94 8,44 0,776 0,881 9,297 1,895 MSrepl Srepl average for le evel SSday s 6 0,948 MSday s 7 0,057 Sday s 2 8 9 10 0,239 Sdays 0,913 SRw 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,0 10 5,0 1 10,0 15,0 20 0,0 Uncertainty (ug/kg) (k k=2, 95% conf. int.) 1 x MRL 4 12 3 10 3 8 2 5 6 10 2 15 4 1 replicate : level 2 (1 x MRL) : Y moy(level,day) -Ymoy (level) ) 2 SS days = n repl ?(Y MS days = SS days / (n days -1) R RESULTS AND GRAPH HS : Analyte : level 3 (1.5 x MRL) : SS repl = ?d ? r (Y-Y moy(level,day) )2 M repl = SS repl /(n-ndays)) S rep 2 = S repl 2 = MS 2 1 12,94 13,96 15,76 14,965 SSrepl 2 15,88 15,4 16,89 2,494 MSrepl 3 4 5 6 17,06 14,73 13,79 1,579 15,157 1,004 0,502 Srepl average for le evel SSday s MSday s 7 -0,664 Sday s 2 8 9 10 0,000 Sdays 1,579 SRw avera age level 1 : 4,1867 4,59 4,41 Sum mSquares 0,0267 0,7154 0 0,6926 avera age level 2 : 9,9267 9,1167 9 8,8467 Sum mSquares 1,2331 1,5889 1 1,8323 avera age level 3 : 15,293 1 14,697 15,48 Sum mSquares 9,0035 1,0385 1 4,9226 05//03/2013 Pag ge 15 of 17 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 x Sre pl 1.5 x MRL 2 x Sda a ys 2 x Srw Uncertainty (%) (k= =2, 95% conf. int.) 18 25% % 16 14 20% % 12 15% % 10 8 5 1 10 10% % 6 1 15 4 5% % 2 average SumSquaress average SumSquaress average SumSquaress 0 0% % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 x Sre pl calculations performed by : hTerv ver 1.70 ussing template : ValMeth t emplate date : 28/02/2 2013 2 x Sda a ys date 2 x Srw C O D A - C E R V A--TERVUR REN ValMethTerv_v1 1-70_2.xls : Ochratoxin A in liver CALCULAT TION of REPEATAB BILITY, WITHIN-LAB B REPRODUCIBILIITY, CC?, CC? and RECOVERY ACCORDING TO 2002/657/EC,, ISO 11843-1 and Van V Loco & Beerna aert (2004) (reminde er : formulas : SS repl = ?d ? r (Y-Y moy(level,day) )2 M repl = SS repl /(n-ndays)) S rep 2 = S repl 2 = MS no ote : this approach givess first approximation of U for single sample but does d not include u recov for f routine samples DATA : O OCHRATOXIN A Analyte : l linear regression : Method : LIIVER Matrix : (Maximum Residue Limit) MRL : 10 unit : ug/kg (number of replica ates) Nrepl : 3 (number of days or o analysts) Ndays : 3 (number of levels))) (Nlev : 3 Measured concentra tions : (NOT corrected fo or recovery) : C CCa, CCb : S U: SD, rep lev da ay or analyst : intercept R2 94,5% -0,12 0,9297 t(26,0.05) Yc 1,706 11,25 CC? ug/kg 12,03 nom.ccn ug/kg 5 10 15 av.meas. ug/kg 4,45 9,65 13,90 1 5,06 2 3,66 3 4,12 2 3,77 4,59 5,15 0,412 MSrepl 3 4 5 4,6 4,97 4,12 0,642 Srepl 4,449 average for le evel 0,008 SSday s 5 6 S days 2 = (MS days -M MS repl ) / n repl S Rw 2 = S days 2 + S rep 2 CC? ug/kg 14,09 % of MR RL 120,3% % 0,004 MSday s 7 -0,136 Sday s 2 8 9 10 0,000 Sdays 0,642 SRw ) % of MRL M 140,9% uncertainty (k = 1) (*) ug/kg % 0,64 14,42% % 0,91 9,42% 1,62 11,63% % U, ext. unc. (k = 2) (***) ug/kg % 1,28 28,8% % 1,82 18,8% % 3,23 23,3% % Umax. (k = 2) (***) ug/k g % 1,5 29,3% 2,9 29,3% 4,4 29,3% (*) u = S Rw (**) U = 2 S Rw (***) from modif. Ho orwitz for Srw, HorRat < 2x2/3 cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08 8 2,471 SSrepl linear regrression 0.5 x MRL 6 20 18 5 y = 0,94 45x - 0,1167 R² = 0,9297 16 14 4 12 3 10 8 replicate : 2 6 4 1 2 1 11,13 9 8,72 4,558 SSrepl 2 3 4 5 9,48 10,3 8,34 10,5 9,47 9,93 0,760 0,872 9,652 1,921 MSrepl Srepl average for le evel SSday s 6 0,960 MSday s 7 0,067 Sday s 2 8 9 10 0,259 Sdays 0,909 SRw 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,0 10 5,0 1 10,0 15,0 20 0,0 Uncertainty (ug/kg) (k k=2, 95% conf. int.) 1 x MRL 4 12 3 10 3 8 2 5 6 10 2 15 4 1 replicate : level 2 (1 x MRL) : 4 recovery 1 6 level 3 (1.5 x MRL) : Y moy(level,day) -Ymoy (level) ) 2 SS days = n repl ?(Y MS days = SS days / (n days -1) R RESULTS AND GRAPH HS : 2 1 14,26 13,5 11,72 13,163 SSrepl 2 13,71 12,84 14,71 2,194 MSrepl 3 4 5 6 17,39 14,06 12,9 1,481 13,899 6,901 3,450 Srepl average for le evel SSday s MSday s 7 0,419 Sday s 8 9 10 0,647 Sdays 1,616 SRw avera age level 1 : 4,4767 4,4067 4 4,4633 Sum mSquares 0,8549 0,9085 0 0,7073 9,28 9,3733 avera age level 2 : 10,303 Sum mSquares 1,3613 2,4504 2 0,7461 avera age level 3 : 15,12 1 13,467 13,11 Sum mSquares 7,8806 0,7459 0 4,5362 05//03/2013 Pag ge 16 of 17 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 x Sda a ys 2 x Srw Uncertainty (%) (k= =2, 95% conf. int.) 20 35% % 18 16 30% % 14 25% % 12 10 8 6 4 20% % 5 15% % 1 10 10% % 1 15 5% % 2 average SumSquaress average SumSquaress average SumSquaress 2 x Sre pl 1.5 x MRL 0 0% % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 x Sre pl calculations performed by : ussing template : ValMeth hTerv ver 1.70 t emplate date : 28/02/2 2013 2 x Sda a ys date 2 x Srw C O D A - C E R V A--TERVUR REN ValMethTerv_v1 1-70_2.xls : Ochratoxin A in black sa usage CALCULAT TION of REPEATAB BILITY, WITHIN-LAB B REPRODUCIBILIITY, CC?, CC? and RECOVERY ACCORDING TO 2002/657/EC,, ISO 11843-1 and Van V Loco & Beerna aert (2004) (reminde er : formulas : SS repl = ?d ? r (Y-Y moy(level,day) )2 M repl = SS repl /(n-ndays)) S rep 2 = S repl 2 = MS no ote : this approach givess first approximation of U for single sample but does d not include u recov for f routine samples DATA : O OCHRATOXIN A Analyte : l linear regression : Method : BLACK SAUSAGE Matrix : (Maximum Residue Limit) MRL : 5 unit : ug/kg (number of replica ates) Nrepl : 3 (number of days or o analysts) Ndays : 3 (number of levels))) (Nlev : 3 Measured concentra tions : (NOT corrected fo or recovery) : C CCa, CCb : S U: SD, rep intercept R2 81,5% 0,03 0,9237 t(26,0.05) Yc 1,706 4,97 CC? ug/kg 6,06 nom.ccn ug/kg 2,5 5 7,5 av.meas. ug/kg 1,99 4,25 6,07 1 1 1,51 2 2,03 3 2 2 2,1 2,43 1,88 0,050 MSrepl 3 4 5 2 2,16 1,82 0,223 Srepl 1,992 average for le evel 0,208 SSday s 5 6 S days 2 = (MS days -M MS repl ) / n repl S Rw 2 = S days 2 + S rep 2 CC? ug/kg 7,14 % of MR RL 121,2% % 6 0,104 MSday s 7 0,018 Sday s 2 8 9 10 0,134 Sdays 0,261 SRw ) % of MRL M 142,8% uncertainty (k = 1) (*) ug/kg % 0,26 13,09% % 0,60 14,18% % 0,59 9,69% U, ext. unc. (k = 2) (***) ug/kg % 0,52 26,2% % 1,21 28,4% % 1,18 19,4% % Umax. (k = 2) (***) ug/k g % 0,7 29,3% 1,5 29,3% 2,2 29,3% (*) u = S Rw (**) U = 2 S Rw orwitz for Srw, HorRat < 2x2/3 (***) from modif. Ho cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08 8 0,299 SSrepl linear regrression 0.5 x MRL 3 8 7 2,5 y = 0,8149x + 0,03 R² = 0,9237 6 2 5 1,5 4 3 1 replicate : level 2 (1 x MRL) : 4 recovery 2 0,5 1 3,2 3,56 4,93 1,998 SSrepl 2 3 4 5 4,93 4,62 4,11 3,97 4,47 4,5 0,333 0,577 4,254 0,851 MSrepl Srepl average for le evel SSday s 6 0,426 MSday s 7 0,031 Sday s 2 8 9 10 0,176 Sdays 0,603 SRw 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,0 10 2,0 4 4,0 6,0 8 8,0 Uncertainty (ug/kg) (k k=2, 95% conf. int.) 1 x MRL 1 6 1 5 1 4 1 2,5 3 5 1 7,5 2 0 replicate : lev da ay or analyst : level 3 (1.5 x MRL) : Y moy(level,day) -Ymoy (level) ) 2 SS days = n repl ?(Y MS days = SS days / (n days -1) R RESULTS AND GRAPH HS : 1 1 5,15 6,69 5,86 1,304 SSrepl 2 5,86 6,63 6,78 0,217 MSrepl 3 4 5 6 5,64 5,7 6,29 0,466 6,067 1,203 0,601 Srepl average for le evel SSday s MSday s 7 0,128 Sday s 8 9 10 0,358 Sdays 0,588 SRw avera age level 1 : 1,87 2,2067 2 Sum mSquares 0,1994 0,0833 0 3,88 avera age level 2 : 4,25 Sum mSquares 1,7018 0,1634 0 6,34 avera age level 3 : 5,55 Sum mSquares 0,2642 0 0,6162 05//03/2013 Pag ge 17 of 17 2 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 average SumSquaress average SumSquaress average SumSquaress 2 x Sda a ys 2 x Srw Uncertainty (%) (k= =2, 95% conf. int.) 8 30% % 7 25% % 6 5 20% % 4 15% % 2 2,5 3 5 10% % 2 7 7,5 5% % 1 1,9 0,0168 4,6333 0,1325 6,31 0,4238 2 x Sre pl 1.5 x MRL 0 0% % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 x Sre pl calculations performed by : ussing template : ValMeth hTerv ver 1.70 t emplate date : 28/02/2 2013 2 x Sda a ys date 2 x Srw