Les bactéries et leurs marqueurs épidémiologiques

Les bactéries et leurs marqueurs
épidémiologiques
Intérêt et limites
TYPAGE BACTERIEN :
• DEFINITIONS
• INTERETS
TYPAGE BACTERIEN
• différents niveaux d ’identification d ’une bactérie
• niveau d ’identification différent selon l ’objectif : clinique ou épidémiologique
DEFINITIONS
 ESPECE :
ensemble de souches ayant des homologies ADN-ADN se traduisant par des %
d ’hybridation supérieurs ou égaux à 70%
 CLONE :
groupes d ’isolats issus d ’un ancêtre commun constituant les maillons d ’une chaîne
directe de réplication et de transmission d ’hôte à hôte ou de l ’environnement à l ’hôte
 EPIDEMIE :
augmentation de l’incidence d’une pathologie infectieuse dans une zone géographique
durant une période donnée
 MARQUEURS EPIDEMIOLOGIQUES :
caractères discriminants permettant de différencier dans une espèce bactérienne les
souches d’origine distincte et les clones bactériens
TYPAGE BACTERIEN
PROUVER LA CLONALITE entre des souches susceptibles d’être liées
épidémiologiquement
L ’idéal : séquençage, organisation de séquences et comparaison des
séquences
En pratique : comparaison de profils de bandes d’un échantillonnage du
génome
Savoir que le degré de similitude entre les souches est fonction:
• de l ’espèce étudiée
• du marqueur épidémiologique
• du cadre spatio-temporel de l ’étude
notion
d’horloge moléculaire
INTERETS DU TYPAGE BACTERIEN
& sur le plan du diagnostic individuel
• infection chronique : différencier récidive ou réinfection (surtout pour les infections par des
gènes opportunistes provenant de réservoir commensal)
→ ex : ostéite à staphylocoque coagulase –
• établir le foyer initial d’une infection disséminée
& sur le plan épidémiologique
étude de bactéries présentant souvent des caractères communs de résistance aux
antibiotiques, ou de pathogénicité
• diffusion à échelle locale (service, petite communauté) de bactéries
 mode de diffusion : différencier accumulation indépendante de cas / diffusion épidémique
 vecteurs de la diffusion clonale : personnel (manque d’hygiène) et/ou objet contaminé
(défaut de stérilisation de cathéters, flacons….)
accumulation de cas
diffusion épidémique
 problème d’hygiène générale
(mauvaise asepsie lors de gestes, mauvaise
stérilisation de matériel…)
 problème de réservoir de germe
(source commune : matériel, personnel ou
malade)
 problème d’une pression de sélection
• diffusion de souches étendue à une région, un pays, un continent, voire
intercontinentale
= surveillance épidémiologique de souches résistantes cause majeure de morbidité
et de mortalité
→ ex : pneumocoque de sensibilité diminuée à la pénicilline (apparition en 1965 et
constante augmentation à travers tout le globe)
* résistance associée à certains sérotypes (23, 14, 19, 9, 6…)
* sérotype insuffisant pour comprendre la diffusion car lien de clonalité
possible entre des souches de sérotypes différents (mutation ponctuelle d’un gène
de la structure capsulaire)
& sur le plan phylogénétique
• définition du niveau de similarité entre les clones (pourcentage de similitude)
→ intérêt pour reconnaître au cours du temps la transmission d’une lignée clonale à
travers de nombreux cycles infectieux
• détermination de la vitesse d’une horloge moléculaire
CHOIX D ’UN MARQUEUR EPIDEMIOLOGIQUE
• CRITERES D ’ EVALUATION
• MARQUEURS
PHENOTYPIQUES
• MARQUEURS GENOTYPIQUES
CRITERES D’EVALUATION D’UNE METHODE DE
TYPAGE
& critères de performance
• typabilité ou sensibilité
proportion de souches attribuées à un type par un système de typage. Elle doit tendre vers 100%
T= nombre de souches assignées à un type/ nombre de souches testées
• reproductibilité
capacité du système de typage à attribuer le même type à une souche testée lors d’essais
indépendants. Elle doit tendre vers 95%.
R= nombre de souches assignées à un même type lors de tests répétés/ nombre de souches
testées
→ si les tests répétés sont intra-série : reproductibilité intra-série
→ si les tests répétés sont inter-série : reproductibilité inter-série (important si épidémie étendue)
• stabilité
capacité d’un système de typage de reconnaître la relation clonale de souches dérivées in vitro ou in
vivo d’une souche ancestrale commune, en dépit des variations phénotypiques ou génotypiques qui
peuvent survenir au cours de la conservation et de la réplication au laboratoire ou au cours de la
dissémination clonale dans l’environnement (important si épidémie à cadre spatio-temporel étendu
et si forte plasticité génomique de l’espèce à typer)
• pouvoir discriminant ou spécificité
probabilité moyenne qu’un système de typage attribue un type différent à deux souches non reliées,
choisies au hasard, au sein d’un taxon donné
Il doit être > à 95% (risque maximal toléré de 5% de classer de manière incorrecte des isolats non
liés épidémiologiquement dans le même type)
• concordance épidémiologique
probabilité moyenne de classer dans le même type les isolats provenant d’une épidémie monoclonale
dépend du pouvoir agrégatif et hiérarchisant de la technique (capacité de faire des groupes de
parenté, d’établir un niveau de parenté)
& critères de praticabilité
• flexibilité
• rapidité
• facilité d’emploi : coûts, équipements, simplicité de la technique, nombre
d’échantillon exploitables
•facilité d’interprétation
• standardisation
MARQUEURS PHENOTYPIQUES
MARQUEURS
BIOTYPE
PRINCIPES
AVANTAGES
INCONVENIENTS
- Détection du profil
morphologique, bioc himique
(auxanogramme…)
- Antibiogramme
- facile
- automatisé et couplé au système
d’identification (API …)
- facile
- automatisé
- signal d’alerte dans l’apparition d’un
phénotype multirésistant
- peu discriminant
- peu reproductible car pouvant être influencé par
facteurs techniques ou environnementaux
- peu discriminant
- variabilité génétique de la résistance aux antibiotiques,
présence de plasmides
- pression de sélection
- système souvent expertisé conduisant à une
homogénéisation des phénotypes de résistance
SEROTYPE
- Détection de la présence de
déterminants bactériens
- facile
- rapide
- standardisé pour certaines bactéries
(Salmonella, E.coli, méningoccoque…)
LYSOTYPE
- Sensibilité d’une souche à un
panel de phages (résistance ou
lyse)
- utilisable pour subdiviser les sérotypes
ou typer les souches non sérotypables
BACTERIOCINOTYPE
- méthode basée sur la
sensibilité de certaines souches
(pousse inhibée) vis-à-vis de
substances (bactériocines)
élaborées par d’autres souches
bactériennes
- variations dans la structure
des protéines bactériennes
détectée par électrophorèse
- séparation des protéines
cellulaires par électrophorèse et
révélation par leur substrat
spécifique : électromorphes ;
distinction des différents allèles
codant pour une m ême enzyme
- peu couteuse
- technique standardisée pour certaines
bactéries
- antisérums coûteux ou non commercialisés
- toutes les souches ne sont pas sérotypables
- faible pouvoir discriminant
- instabilité des déterminants antigéniques :
recombinaison
- technique lourde
- approvisionnement difficile en phages actifs et
souches témoins
- manque de standardisation
- faible reproductibilité
- technique lourde
- faible pouvoir dicriminant
ANTIBIOTYPE
ELECTROPHORESE DES
PROTEINES
ANALYSE DES ISOENZYMES :
MULTILOCAR ENZYME TYP ING
- applicables à toutes les bactéries
- marqueur fiable capable de détecter
une mutation à l’intérieur du gène de
structure d’une enzyme (profil
électrophorétique différent, ou activité
fonctionelle différente)
- marqueur peu soumis à la pression de
sélection
- peu discriminant
- interprétation difficile en raison du grand nombre de
bandes
- technique lourde
- problème de standardisation
MARQUEURS PHENOTYPIQUES (2)
• Marqueurs phénotypes peu à peu abandonnés car :
 pouvoir discriminant et reproductibilité médiocres
 faible stabilité : subissent une variation adaptative due à la
sélection naturelle
 faible typabilité :existe un grand nombre de souches non
typables (dites phénotypiquement nulles)
 variations observées qualitatives et ne permettant pas
d ’évaluer le degré de parenté entre souches
avènement des marqueurs génotypiques plus discriminants,
plus reproductibles
MARQUEURS GENOTYPIQUES
• METHODES DE TYPAGE PAR RESTRICTION DE L ’ADN
• METHODES DE TYPAGE PAR AMPLIFICATION
DES GENES
METHODES DE TYPAGE PAR RESTRICTION DE
L ’ADN
- électrophorèse en champ pulsé
- ribotypage
- AFLP ou IRS-PCR
MACRORESTRICTION
ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE (ECP) ou (PFGE)
• technique de caractérisation moléculaire qui compare le matériel
génétique (ADN chromosomique) d ’une même espèce
• Technique la plus utilisée actuellement (technique de référence)
- grande résolution
- pouvoir discriminant supérieur à celui des autres marqueurs
- applicable à de nombreuses espèces bactériennes
- très bonne reproductibilité
ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE (ECP)
(PFGE)
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE (1)
• isolement des souches, cultures
• intégration des bactéries dans des blocs
d ’agarose (« plug »)
• lyse in situ des bactéries
• digestion par endonucléase(s) de restriction
avec un faible nombre de site de coupure =
macrorestriction
• séparation des fragments d ’ADN (10 à 800
kb) par electrophorèse en champ pulsé 
profils de restriction = pulsotypes
• analyse des pulsotypes par logiciel
dendrogrammes
ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE:
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE (2)
Profils de macrorestriction (SmaI) de
l'ADN total de SARM
Profils de macrorestriction (DraI) de
l'ADN total de P. aeruginosa
ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE
Analyse des profils

Comparaison des profils : logiciel GelCompar®
- Comparaison des courbes densitométriques
coefficient de corrélation de Pearson
- Calcul de la similitude entre 2 profils
coefficient de Dice (position des bandes)

Comparaison inter-gels : standard référence
- Staphylococcus aureus NCTC 8325 (ECP)
- ADN 1 Kb Ladder (PCR, PCR-SSCP)

Construction du dendrogramme
- Algorithme de regroupement hiérarchique UPGMA
Bases méthodologiques
Changements
sur le fragment
de 400 kb
Aucun
Fragments
résultants (kb)
400
250 & 150
600
450
350
A
B
C
D
E
kb
600
500
Gain de
Perte de
1 site de restriction
*
400
gel
ECP
Insertion
Délétion
région de 50 kb
200
*
100
*
*




*

75
Nb de différences
0
3
3
2
2
Bases méthodologiques
Critéres d'interprétation des variations du profil de
macrorestriction
Nombre de modifications
génétiques entre deux souches
Nombre de
fragments de
différence
Interprétation
épidémiologique
0
0
Souches clonales
semblables
1
2-3
Souches clonales très
proches
2
4-6
Souches non clonales
proches
3
7
Souches différentes
ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE:
Exemple de dendrogramme de Legionella
Évaluation de l'enzyme
la mieux adaptée pour le typage de
Streptococcus agalactiae par ECP
 Introduction


 fréquence des SB isolés des prélèvements à visée diagnostique
 suivi épidémiologique
ECP avec SmaI : peu de fragments  autres enzymes
 Matériel et méthodes

Souches collectées : période de 3 mois

Génotypage par ECP : SmaI, ApaI, KspI

Analyse en gels combinés pour augmenter le pouvoir discriminant
S. agalactiae : évaluation de l'enzyme la mieux adaptée pour l'ECP
Résultats

Incidence des colonisations/infections plus élevée
Obstétrique RR = 6,14 (4,44 – 8,50) p <10-7
Diabétologie RR = 4,39 (1,95 – 9,90) p = 0,03
Hépatologie RR = 3,25 (1,44 – 7,34) p = 0,012

Génotypage
• SmaI : moins de fragments que les 2 autres enzymes
pouvoir discriminant le plus faible
• ApaI : ne type pas toutes les souches, profils avec des "smears"
• KspI : typabilité de 100 %
• Discordances entre les résultats obtenus avec les 3 enzymes :
Classement des isolats dans des clones  par 2 et/ou les 3 Ez
S. agalactiae : évaluation de l'enzyme la mieux adaptée pour l'ECP
Dendrogramme du % de similitude obtenu en gels combinés
% de similitude
40 50 60 70 80 90 100
SmaI
ApaI
KspI
Clones
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
C1
C2
C3
C4
C5
C6
D1
D2
S. agalactiae : évaluation de l'enzyme la mieux adaptée pour l'ECP
Conclusion

SmaI largement utilisée dans la littérature

KspI paraît la mieux adaptée pour le génotypage par ECP
 Typabilité et indice discriminant élevés
 Nombre de fragments généré optimal pour une définition
fiable du clone
S. agalactiae : évaluation de l'enzyme la mieux adaptée pour l'ECP
ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE:
AVANTAGES :
• pouvoir discriminant important
• grande résolution, bonne reproductibilité intra-laboratoire
• applicable à un grand nombre d ’espèces
MAIS:
• technique longue : 4 à 5 jours en moyenne ( 5j en moyenne/12 souches)
• technique coûteuse: appareillage,logiciel, réactifs et temps
• technique délicate, manuelle, nécessitant du personnel qualifié
• résultats obtenus non standardisés (comparaison de profils limitées à des souches
isolées dans le même temps et au sein d’un même laboratoire
LE RIBOTYPAGE:
Analyse RFLP par Southern-blot de l ’ADN
• étude de l’identification basée sur le polymorphisme des fragments de restriction de
l ’ADN codant pour les ARNr
• ADN codant pour les ARNr (opérons) :
 structure stable, conservée dans le temps
 nombre variable d’opérons selon les bactéries (1à 11)
 hybridation avec sonde « universelle » : ARN16s et 23s d ’E.coli
• profil obtenu caractéristique d’une espèce ( taxonomie) ou variations intra-espèces (
épidémiologie)
LE RIBOTYPAGE:
Analyse RFLP par Southern-blot de l ’ADN
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE (1)
• Isolement des bactéries, culture
• digestion par endonucléase(s) de restriction possédant de fréquents sites
de coupure
• migration électrophorétique  nombreuses bandes (0,5 à 50 kb)
• transfert du gel sur filtre (nitrocellulose ou nylon) = principe du Southern
• hybridation de l ’ADN par sondes nucléiques : ARN16s/23s E.coli
RIBOTYPAGE
PRINCIPE (2)
SOUCHES
EXTRACTION
RIBOTYPES
ADN
DIGESTION
HYBRIDATION
AVEC UNE
SONDE MARQUEE
(ARN* 16s ou 23s E.coli)
ELECTROPHORESE
TRANSFERT
SUR
MEMBRANE
RIBOTYPAGE
AVANTAGES :
• technique automatisable (Riboprinter®,Qualicon®) donc plus rapide
(32 ribotypes/j)
• technique reproductible et standardisée
(résultats comparables entre laboratoires)
• marqueur taxonomique et épidémiologique
MAIS:
• procédure complexe et longue si manuelle
• pouvoir discriminant plus faible que PFGE, ribotype caractéristique
d’espèce uniquement pour certaines bactéries
• recombinaisons possibles entre opérons  instabilité des ribotypes (problème
pour le diagnostic d’espèces mais pas pour l’épidémiologie : vitesse d’horloge
moléculaire faible)
• problème de standardisation notamment au niveau technique
AFLP (amplified fragment length polymorphism) et
IRS-PCR (infrequent restriction site-PCR)
méthode combinant : profil de restriction et PCR
 restriction de l’ADN génomique par une ER à fréquence de coupure élevée et une ER
à fréquence de coupure faible
 ligation d’adaptateurs (oligonucléotides doubles brins) aux extrémités des fragments
de restriction
 PCR avec sélections d’amorces complémentaires des adaptateurs + 1 base
→ amplification sélective des fragments de restriction définis par les 2 sites de restriction
différents
→ bonne lisibilité
(surtout pour IRS PCR : choix d’adaptateurs qui limitent le nombre de bandes par rapport
à l’AFLP)
 séparation sur gel d’agarose ou polyacrylamide
→ avantages
• bonne reproductibilité (due à l’utilisation de sites de restriction)
• bonne discrimination (proche du champ pulsé)
• très flexible : utilisé pour le groupe [Mycobacterium avium, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus] pour lequel on utilise les mêmes
enzymes de restriction, les même adaptateurs et les mêmes amorces et
Legionella pneumophila
• facile, rapide (1à 2 jours), et technique ne nécessitant pas de matériel
particulier (contrairement au champ pulsé)
→ inconvénients
• cher
• pas de standardisation concernant l’interprétation des profils (contrairement
à la technique PFGE)
méthodes d’amplification de gènes
RAPD ou AP-PCR
rep-PCR
MLST
RAPD (random amplified polymorphic DNA)
AP-PCR (arbitrary primed PCR)
unique amorce de
séquence courte
(plus longue pour
l’AP-PCR)
s’hybridant sur tout
le génome de
manière inconnue
à l’opérateur en
condition de faible
stringence à 35
degrés
comparaison des profils obtenus sur gel
→ avantages :
• technique rapide
• pouvoir de discrimination moyen améliorée par l’utilisation couplée de 3
amorces de type différent : la technique dite alors standard est très
discriminante
• méthode flexible (possible pour plusieurs espèces bactériennes)
→ inconvénients
• manque de standardisation de la technique (pas de critères d’interprétation
véritablement définis)
• mauvaise reproductibilité inter-série et inter-laboratoire (amorçage au
hasard des sondes)
• difficulté de lecture et d’interprétation (bandes d’intensité faible : mauvaise
hybridation de l’amorce)
* méthode intéressante à visée épidémiologique limitée dans le temps
et l’espace
* exploitation intra-laboratoire préférable
la rep-PCR : inter-repeat element PCR typing
 REP-PCR (repetitive extragenic palindrome PCR)
 ERIC-PCR (enterobacterial repetitive intragenic consensus PCR)
* hybridation d’amorces ciblées sur des séquences courtes
répétées,spécifiques d’un genre bactérien
conservées et dispersées sur le génome
non codantes, transcrites
* amorces définies et hybridées dans des conditions de forte stringence
séparation
électrophorétique des
fragments amplifiés (ADN
entre 2 éléments répétés
adjacents séparés au
maximum de 5 kb)
comparaison des profils
→ avantages
• technique rapide, simple et peu cher par rapport au champ pulsé
• bon pouvoir de discrimination (< champ pulsé, car moins de bandes)
• technique flexible (possible pour plusieurs genres bactériens :
entérobactéries, pyocyanique par la séquence ERIC, staphylocoque par la
séquence d’insertion IS 256….)
• meilleure reproductibilité inter-série que la RAPD (applicable aux
grandes et petites séries)
• lecture de profils plus simple que la RAPD
→ inconvénients
• reproductibilité inter-laboratoire médiocre (manque de standardisation
technique et d’interprétation), mais meilleure que la RAPD
* méthode intéressante à visée épidémiologique limitée dans le temps
et l’espace
* exploitation intra-laboratoire préférable, mais exploitation inter-laboratoire possible
Remarque
 frontière parfois floue entre la rep-PCR et la RAPD
 exemple : typage du pyocyanique
l’utilisation d’amorces ERIC spécifique des entérobactéries utilisée en
condition de faible stringence permet la reconnaissance par ces
amorces de séquences répétées sur le génome du pyocyanique :
c’est de la RAPD
• le séquençage multi-locus
Multi Locus Sequence Typing = MLST
* nouvelle approche moléculaire,
dérivée de l’électrophorèse des isoenzymes
MLEE
(multi-locus enzyme electrophoresis)
* basée sur le séquençage de gènes de ménage :« house keeping genes »
(gènes important pour le métabolisme d’une bactérie)
→ utilisation de gènes stable dans le temps (taux de mutation faible)
dont les allèles sont caractéristiques de clones d’espèce
• extraction ADN
• amplification de 5 à 10 gènes d’environ 500 pb chacun (attention : gènes non liés)
* 5 pour Legionella : rpoB, asd, acn (codant des enzymes) et mip, momps
(codant pour des protéines de membrane externe) soit 5 PCR
* 7 pour le staphylocoque aureus soit 7 PCR
• purification et contrôle des amplifiats sur gel d’agarose
7 souches
taille 500
pb
5 gènes
(legionelle)
• séquençage
Séquenceur automatique
96 capillaires
megaBACE1000
Amershampharmacia/Molecular Dynamics
1
obtention des séquences et/ou des chromatogrammes par e-mail ou
sur CD-ROM
• analyse de séquences de gène
identification de l’allèle correspondant à la
séquence grâce à une librairie disponible
sur le site www.MLST.net / obtention d’un
numéro de séquence
identification du profil allélique (ou Sequence
Type ST) à partir des différents numéros de
séquence (banque de donnée)
comparaison du profil allélique (nbre gènes x
500 pb) des différentes souches
évaluation de la distance génétique entre les
souches = phylogénie
logiciel (utilisant la méthode Neighbor
joining) permettant la construction d’un arbre
= dendrogramme
→ avantages
• bonne reproductibilité intra-laboratoire, inter-laboratoire
• données précises (séquençage de gènes)
résultats définitifs
et interchangeables
• performance avec de nombreux pathogènes (Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae, SARM, entérocoques…)
• absence de problème de lecture et d’interprétation (le séquençage remplace la
photo du gel)
méthode excellente pour des études macroépidémiologiques
(nationales, intra-continentales, voire inter-continentales)
et phylogénétiques (par analogie avec la technique MLEE) : formation d’une biothèque
Intérêt particulier pour le suivi des clones de SARM à l’échelle mondiale
inconvénients
• coût
• problème du choix percutant des gènes à séquencer en fonction du pouvoir discriminant
désiré
• les microdélétions présentes en dehors des séquences étudiées ne sont pas mises en
évidence
→ inconvénients
• coût
• problème du choix percutant des gènes à séquencer en fonction du pouvoir
discriminant désiré
• les microdélétions présentes en dehors des séquences étudiées ne sont pas
mises en évidence
Stratégie de choix d'une méthode
 Critères de choix d'une méthode

en fonction des objectifs

en fonction des performances des différents
systèmes de typage

Détermination de combinaison de différents
marqueurs épidémiologiques

Démarche épidémiologique classique

Système d'alerte ou de première intention simple

Exploration plus fine par un système discriminant
Conclusion
méthodes d’épidémiologie moléculaire
 un système de typage doit être validé vis-à-vis d’un écosystème et des
circonstances dans lesquelles il sera utilisé
Il doit être suffisamment discriminant mais aussi suffisamment agrégatif
 techniques très spécialisées
• souvent, manque de standardisation : procédures, matériel, assurance qualité,
critères d’interprétation (sauf pour la technique MLST)
• critères d’interprétation du degré de similitude entre deux souches relatifs au but de
l’étude : investigation locale ou étendue, turn over de la bactérie, marqueurs étudiés
 optimisation des capacités de typage par association des techniques
 importance de la bactériologie standard : il faut des souches!
Applications
Épidémiologie de Pseudomonas aeruginosa
En service de réanimation adulte
Utilité de l’ECP
0
nov-99
oct-99
sept-99
août-99
juil-99
juin-99
mai-99
avr-99
mars-99
févr-99
janv-99
déc-98
nov-98
oct-98
sept-98
août-98
juil-98
juin-98
mai-98
avr-98
mars-98
févr-98
janv-98
déc-97
nov-97
10
oct-97
sept-97
août-97
juil-97
juin-97
mai-97
12
Nombre de patients colonisés par
P.aeruginosa dans le service de Réa Chir
Nombre de patients colonisés par P.aeruginosa
Nombre de patients colonisés par le clone épidémique
8
6
4
2
3009 patients admis
en réanimation
A l’admission
2887 patients
négatifs
122 patients
positifs
28 patients
colonisés/infectés
Pendant
l’hospitalisation
351 patients
positifs
283 patients
porteurs
185 patients
porteurs
94 patients
porteurs
68 patients
colonisés/
infectés
98 patients
colonisés/infectés
76 patients
porteurs
18 patients
colonisés/
infectés
Partie visible :
185 patients colonisés/infectés
Partie immergée :
377 patients porteurs
Place des prélèvements à visée
épidémiologique
Comparaison par champ pulsé :


Souche « épidémiologique »
Et souche clinique chez le même patient
Chez les 116 patients ayant présenté un
prélèvement épidémiologique positif avant le
prélèvement clinique
104/116 : même pulsotype
Sensibilité, spécificité et valeurs prédictives
 Performances :




Sensibilité 53,6%
Spécificité 90,3%
Valeur prédictive positive 27,6%
Valeur prédictive négative 96,6%
 PE permettent d’identifier précocement plus de 50% des
patients qui développeront une Infection à P.a. durant leur
hospitalisation et avec une certitude de plus de 90%
 Amélioration de la prise en charge thérapeutique:


Précocité de l’adaptation impact sur la mortalité
Meilleur usage des anti-P.a.  impact écologique
Classification des infections
 Sans prélèvements à visée épidémiologique : classification
basée sur le délai d’acquisition


28 infections importées
116 infections nosocomiales « attribuables »
- 28 (24,1%) infections précoces (< 5
jours en réa)
- 88 (75,9%) infections tardives
 Avec prélèvements à visée épidémiologique et typage :
classification basée sur le caractère endogène ou exogène
de la bactérie



104 patients parmi les 116 étaient porteurs
44 (42,3%) clone sporadique : infections endogènes
60 (57,7%) clone micro-épidémique ou épidémique : infections
exogènes
Pour maîtriser le risque il faut identifier l’iceberg
dans son entier
Applications
Place de l’environnement
La technique d'électrophorèse en champ pulsé
est-elle un outil valable pour identifier
comme nosocomiales des infections
à Legionella pneumophila ?
Objectifs


Génotyper par ECP toutes les souches de L. pneumophila
isolées
• Dans les réseaux d'eau du CHUB et d'autres hôpitaux de
Franche-Comté
• Dans l'environnement extra-hospitalier
• 2 ans
Les comparer aux souches isolées chez les patients atteints
d'infections pulmonaires
 Cas nosocomiaux ?
 Cas de légionellose
• Nosocomial certain : le patient a séjourné à l'hôpital au cours des 10 jours
précédant les signes cliniques
• Nosocomial probable : le patient a séjourné au moins un jour dans les 10 j
précédant les signes cliniques
La technique d'ECP est-elle un outil valable pour identifier
comme nosocomiales des infections à Legionella pneumophila ?
2
4
5
NCTC 8325
3
Philadelphie
1
Paris
Legionella pneumophila : profils ECP (SfiI)
kpb
673,7
208
175
135
117
80
36
La technique d'ECP est-elle un outil valable pour identifier
comme nosocomiales des infections à Legionella pneumophila ?
 Résultats : génotypage par ECP (SfiI)

Souches environnementales (réseau d'eau hospitalier)
• 5 génotypes majeurs identifiés au CHUB (n° 1 à n° 5)
- 4 sur le site de l'hôpital St Jacques (n° 1 à 4)
1 génotype commun (n° 4)
- 2 sur le site de l'hôpital Jean Minjoz (n° 4 et 5)
sur les 2 sites (rés )
• Le génotype n° 5 identifié aussi à Montbéliard, Belfort et Vesoul
• Le profil de la souche épi de Paris  Belfort, Montbéliard et Vesoul
jamais à Besançon

Souches cliniques
• Génotype majeur n° 1 (St Jacques) : 2 cas nosocomiaux groupés
• Autre génotype majeur n° 6 : 3 isolats d'infections communautaires non
reliées. Rencontré également dans l'eau du réseau de l'hôpital de Vesoul
• 1 patient infecté par une souche génotype n° 12  eau piscine Besançon
La technique d'ECP est-elle un outil valable pour identifier
comme nosocomiales des infections à Legionella pneumophila ?
Les problèmes
 Souches épidémiques à large répartition géographique


Clone ‘Paris’ : cas clinique de répartition nationale
Clone ‘Los Angeles’ : cas clinique de répartition mondiale
- Clones plus virulents ?
- Ou
- Clones plus largement distribués ?
 Durée d’incubation potentiellement supérieure à 10 jours
(20 jours dans certains cas)
 Nosocomial ou communautaire : de nombreux cas
difficiles à classer !!!
Conclusion


Les résultats du génotypage par ECP des souches cliniques
comparées aux souches de l'environnement hospitalier
doivent être interprétés avec prudence
La technique de typage moléculaire doit être couplée à une
étude des données épidémiologiques afin d'être certain que
les critères les plus rigoureux sont appliqués pour
déterminer si le réservoir environnemental de l'hôpital est la
source de la contamination de 1 ou de plusieurs patients
La technique d'ECP est-elle un outil valable pour identifier
comme nosocomiales des infections à Legionella pneumophila ?
MLST et Staphylococcus aureus
résistant à la méticilline
Historique des SASM/SARM
• Avant 1950 : hautement pathogène (mortalité des bactériémies 80%, Arch Int Med
1941;68:851-75)
• 1950 : Diffusion de la pénicillinase + (souches hospitalières, puis
communautaires)
• 1960 : émergence résistance
à la méticilline à l’hôpital
• 1970 : épidémique
(1ère épidémie en 1963)
• 1980 : multi-résistant
• 1990 : multi-sensible
• 2000 : communautaire,
résistance à la vancomycine
Processus évolutif des SARM
• Temps zéro de l’évolution des SARM
– acquisition de gène mecA de 2.1 kb (code une transpeptidase,
PBP2A)
– inclus dans une cassette (jusqu’à 60 kb) : SCCmec
• Emergence et diffusion d’un nombre limité
de clones pandémiques
Epidémiologie de SARM
Evenement
génétique
Diffusion
clonale
Australie, Inde, Turquie
UK
Diffusion
Diffusion
Australie
Irlande
USA
Chine
UK
Danemark
Diversification
sous pression de
selection
EMRSA 15
EMRSA 1
UK
France
Suisse
EMRSA 1..16
GISA
Japon
VRSA
USA
Diffusion?
UK
Espagne, Grèce
Allemagne, France
Italie
USA...
USA
1961
1ère souche
UK
1968
1ère épidémie
USA
1970
Nelle souche
épidémique
EMRSA 1
1980
Nelle souche
épidémique
EMRSA 15
1991
1997
2002
Identification de clones pandémiques
Clonal type
spa type
MLST
ST
SSCme
c
agr type
Archaic
MBQBLO
3-3-1-1/12-4-4-16
250/247
I
1
Iberian
MBQBLO
3-3-1-1/12-4-4-16
250/247
IA
1
Clone V
MBQBLO
3-3-1-1-4-4-3
8
IV
1
Brazilian
KAOMQ
2-3-1-1-4-4-3/30
239/241
IIIA
1
Hungarian
KAOMQ
2-3-1-1-4-4-3
239
III
1
NY/Japan
DMGMK
1-4-1-4-12-1-10
5
II
2
Pediatric
DMGMK
1-4-1-4-12-1-10
5
IV
2
E-MRSA 15
7-6-1-5-8-8-6
22
IV
1
E-MRSA 16
2-2-2-2-3-3-2
36
II
3
MLST, SARM, France