Mise au point d`une méthode de congélation de la semence de

MISE AU POINT D’ UNE METHODE DE CONGELATION
DE LA SEMENCE DE PINTADE.
François Seigneurin1, Elisabeth Blesbois2
1
SYSAAF, Station de Recherches Avicoles, 37380 Nouzilly
2
INRA, Station de Recherches Avicoles, 37380 Nouzilly
Mise au point d’une méthode de congélation de la semence de pintade.
La France est le seul pays au monde à pratiquer la sélection généalogique de la pintade. Plus de 80% du cheptel
mondial de reproducteur pintade et la totalité des lignées pures sont situés dans l’hexagone. Aussi, pour
minimiser l’impact d’un problème sanitaire grave, un programme de mise au point d’une méthode de
cryoconservation du sperme de pintade a été initié afin de préserver ex situ une partie du patrimoine génétique de
cette espèce. Il existe plusieurs techniques fonctionnelles de congélation du sperme de coq, caractérisées par leur
mode de conditionnement du sperme (billes, paillettes, fioles) ou par le cryoprotecteur utilisé. Le taux de survie
in vitro des spermatozoïdes de coq est en moyenne de 37% et permet d’obtenir des taux de fertilité de l’ordre de
80%. Chez la pintade la viabilité initiale du sperme est beaucoup plus faible que chez le coq. Plusieurs
techniques de congélation mises au point chez le coq ont été testées chez la pintade, dans leur version originale
et en faisant varier seul ou simultanément un ou plusieurs paramètres : conditionnement du sperme (billes ou
paillettes), dilueur de congélation, concentration (4, 3, 1.5 ou 1 milliard), agent cryoprotecteur
(diméthylsulfoxide, diméthylacétamide, diméthylformamide), vitesse de congélation (60, 30, 15, ou 7°/mn). La
technique de congélation en billes induit une mortalité de 90% des spermatozoïdes. La technique de congélation
en paillettes présente plus de capacité d’utilisation (identification, facilité de stockage). Plusieurs paramètres des
techniques utilisées chez le coq et le dindon ont été optimisés chez la pintade. Le dilueur IGGK, contenant du
myoinositol, associé à 6% de cryoprotecteur DMF et une vitesse de congélation de 15°C/mn ont permis
d’obtenir des taux de survie in vitro des spermatozoïdes de l’ordre de 50%. Ces conditions ont permis d’obtenir
des taux de fertilité de 20%. Ces résultats montrent, pour la première fois, la mise au point d’une méthode de
congélation de la semence de pintade. Cette méthode permet d’ores et déjà de développer la gestion ex situ de
l’essentiel du patrimoine génétique de cette espèce.
The first method of freezing guinea fowl spermatozoa
France is the unique country that practices the genealogic selection of guinea fowl pure lines and contains more
than 80 % of the world guinea fowl parentstock. This project was planned to deal with the increasing risk of line
extinction for health and safety reasons (e.g.: bird influenza epidemic). To limit such risks, the aim of the present
study was to establish the first method of freezing of guinea fowl semen that may introduce the ex situ
management of guinea fowl livestock. Different freezing methods previously established in chicken were tested
in guinea fowl. Parameters of freezing including dilution rate and semen concentration, nature of the diluents and
of the cryoprotectant agents, freezing rate and packaging of semen were then studied and optimized. The highest
surviving rates of spermatozoa after freezing-thawing (50%) were obtained with semen diluted in IGGK diluent
(Surai, 1996) with 6% of the cryoprotectant agent dimethyformamide, the freezing rate 15°C/min and the use of
0.5 ml straws. This method led to a mean of 20 % fertility. These results show the establishment of the first
method of freezing of guinea fowl spermatozoa that may be used for the conservation of the genetic variability
of guinea fowl genetic resources.
INTRODUCTION
La France est le seul pays au monde à pratiquer la
sélection généalogique de la pintade. Plus de 80% du
cheptel mondial de reproducteur pintade est situé
dans l’hexagone. Aussi, pour minimiser les risques
représentés par un problème sanitaire sur le cheptel
français de reproducteurs et de lignées pures, le
Comité Interprofessionnel de la Pintade (CIP) a initié
en 2000, avec la collaboration du SYSAAF et de
l’INRA, un programme de recherche visant à mettre
au point une méthode de cryoconservation du sperme
de pintade, de façon à préserver ex situ une partie du
patrimoine génétique de cette espèce en cas
d’épizootie.
Chez les oiseaux, la congélation de la semence a
surtout été étudiée chez le coq. Dans cette espèce, il
existe plusieurs techniques fonctionnelles de
congélation du sperme, pouvant se décrire par leur
Sixièmes Journées de la Recherche Avicole, St Malo, 30 et 31 mars 2005.
563
mode de conditionnement du sperme (billes,
paillettes, fioles) ou par le cryoprotecteur utilisé :
glycérol,
diméthylsulfoxide
(DMSO),
diméthylacétamide (DMA), diméthylformamide
(DMF), (Seigneurin et Blesbois, 1995 ; Tselutin et al,
1995; Chalah et al, 1999). Le processus de
congélation-décongélation induit une perte de 40 à
50 % du pourcentage de spermatozoïdes vivantsnormaux (%VNx). Néanmoins les taux de fertilité
obtenus avec une telle semence sont de l’ordre de
80% si l’on double les volumes de semence
inséminée et la fréquence des inséminations.
L’objectif de l’étude a été d’utiliser les connaissances
acquises sur la congélation du sperme de coq pour
développer celle du sperme de pintade. Nous avons,
dans un premier temps, appliqué à la pintade les
méthodes connues chez le coq, puis nous les avons
progressivement adaptées à l’espèce avant de choisir
la meilleure solution pour la conservation ex situ de
la semence de pintade.
demi est estimée grâce à un spectrophotomètre (λ =
540 nm). Quatre aliquotes, de volume égal, sont
réalisées aux concentrations de 4, 3, 1.5 et 1 milliards
de spermatozoïdes par ml (spz/ml), par addition du
volume adéquat de FEB. Les aliquotes sont refroidies
à 4°C au réfrigérateur, puis le DMA, également à
4°C, est ajouté pur à raison de 6% (v/v) du volume
total. Après 1 minute d’équilibration sous agitation
douce chaque aliquote est congelée en laissant
tomber goutte à goutte, des gouttes d’environ 80 µl
de semence dans de l’azote liquide. Les billes ainsi
formées sont stockées dans des visotubes immergés
dans de l’azote liquide. Les billes sont décongelées
en quelques secondes, par un passage sur des plaques
chauffantes thermo statées à 75°C.
1.2.2. Congélation en paillettes.
Nous avons utilisé successivement 4 lots de
reproducteurs mâles (Galor G55) logés en cages
individuelles, recevant 14 heures de lumière par jour
et 100 g/mâle/jour d’un aliment contenant 11.7 MJ
d’énergie métabolisable et 14.8 g de protéines/kg.
Compte tenu de la faible qualité initiale du sperme de
pintade (55% à 60% de spermatozoïdes vivants
normaux en moyenne dans les éjaculats frais) nous
avons testé puis trié les mâles sur la qualité de leurs
éjaculats (calcul du % VNx décrit au chapitre 1.2.3).
Nous avons utilisé pour ces protocoles des semences
dont la moyenne était de l’ordre de 70% VNx chez
les jeunes mâles. Cette moyenne baissait ensuite
régulièrement avec l’augmentation de l’âge des
reproducteurs, pour finir autour de 45%. Ainsi les
mâles utilisés pour le premier test in vivo étaient âgés
de 55 semaines et le % de spermatozoïdes vivants
normaux avant congélation était d’environ 50%,
alors que ceux utilisés pour le second test étaient
âgés de 37 semaines et présentaient des taux de
spermatozoïdes vivants-normaux de 70%. Les
éjaculats d’une dizaine de mâles ont été mélangés
afin d’obtenir 1 ml de semence.
La vitesse de congélation, la taille des paillettes, le
cryoprotecteur, son temps d’équilibration avec la
semence et la nature du dilueur ont été testés avec la
méthode de congélation en paillettes. Les dilueurs de
conservation ou de congélation avaient tous une base
commune de sucre et d’acides aminés et variaient par
la présence ou non de 0.3% d’un cryoprotecteur
externe, polyvinylpirolidone (PVP) ou myoinositol :
FEB, TSEL, BPSE, BPSE 2, BHSV, IGGK (Tselutin
et al, 1995 ; Sexton, 1977 ; Schramm, 1989 ; Surai,
1996, Seigneurin, non publié).
Un millilitre de sperme est collecté dans 1 ml de
dilueur, la concentration est ajustée à 1.5 milliard de
spz /ml par dilution dans le même dilueur. La
semence diluée est refroidie à 4°C. Le cryoprotecteur
est ajouté à 4°C et équilibré à cette température sous
agitation douce. La semence est mise en paillettes
(I.M.V. L’Aigle. France). Les paillettes sont
bouchées,
placées
dans
un
congélateur
programmable (minidigitcool, I.M.V.) et congelées
dans les vapeurs d’azote. Les paillettes sont stockées
dans l’azote liquide et décongelées en 8 secondes
dans un bain marie à 50°C.
Quatre vitesses de congélation ont été comparées,
avec du sperme conditionné dans deux types de
paillettes de contenance de 0.5 ml ou de 0.25 ml.
Trois des principaux cryoprotecteurs ont été testés à
leur taux habituel d’utilisation chez les autres espèces
avicoles (6% pour le DMA et le DMF et 4% pour le
DMSO).
1.2. Techniques de congélation.
1.2.3. Tests de qualité de la semence.
1.2.1. Congélation en billes.
In vitro : le pourcentage de spermatozoïdes vivants
normaux a été calculé par comptage au microscope
des spermatozoïdes vivants normaux, des
spermatozoïdes
vivants
anormaux
et
des
spermatozoïdes morts. Pour cela des colorations à
l’éosine-nigrosine (Blom, 1950) ont été réalisées sur
toutes les semences à l’état frais et après congélationdécongélation. Deux lames par échantillon ont été
réalisées et 300 spermatozoïdes par lame ont été
1. MATERIELS ET METHODES
1.1. Animaux
Nous avons utilisé la technique décrite chez le coq
(Tselutin et al, 1999; Chalah et al, 1999) et nous
avons testé un éventuel effet de la concentration en
spermatozoïdes sur l’aptitude à la congélation. Un
millilitre de sperme est récolté dans un tube
contenant un millilitre de dilueur FEB, (Tselutin et
al, 1999). La concentration du sperme ainsi dilué au
564
Sixièmes Journées de la Recherche Avicole, St Malo, 30 et 31 mars 2005.
comptés. Six répétitions par traitement ont été
effectuées.
Le taux de survie (%) est le rapport du nombre de
spermatozoïdes vivants normaux après décongélation
sur le nombre de vivants normaux en frais x 100.
Iin vivo : deux séries d’inséminations artificielles ont
été réalisées sur des groupes de 48 femelles par
traitement. Les femelles étaient des reproductrices
Galor vierges ou virginisées par arrêt des IA 3
semaines avant le début du protocole. Pendant le
protocole elles étaient inséminées tous les 3 ou 4
jours (2 IA/semaine) avec des volumes de semence
décongelée de 130 µl. Les taux de fertilité ont été
déterminés par mirage au 9ème jour d’incubation.
Test 1 : à l’issue des premiers tests in vitro effectués,
nous avons retenu l’association de paramètres
permettant d’obtenir les meilleurs taux de survie des
spermatozoïdes (BHSV, 1.5 milliards spz/ml, 6%
DMF, équilibré 4 mn, paillettes de 0.5 ml, 15°C/mn)
et nous avons testé cette technique optimisée sur un
groupe de femelles à 70% de ponte. Sept
inséminations successives ont été effectuées,
correspondant à 7 congélations de sperme mélangé.
Test 2 : compte tenu des résultats du premier test,
nous avons comparé la combinaison dilueurconcentration BHSV-1.5 milliards spz/ml aux
combinaisons BHSV-3 milliards spz/ml et IGGK-3
milliards spz/ml.
1.2.4. Analyses statistiques.
Les % de spermatozoïdes vivants normaux, les taux
de survie* (%) et les taux de fertilité (%) ont été
comparés par analyses de variance suivi d’un test de
comparaison de moyennes Fisher PLSD après
transformation des variables en arc sinus racine de x.
2. RESULTATS
2.1. Technique de congélation en billes et
concentration de congélation.
La technique de congélation en billes, telle qu’elle a
été décrite chez le coq, conduit, chez la pintade, à un
taux de survie de 10%. Le % de spermatozoïdes
vivants normaux après décongélation est de l’ordre
de 7%. Les taux de survie des spermatozoïdes sont
supérieurs (16 et 17%) avec des concentrations de
sperme de 1et 1.5 milliards spz/ml à ceux obtenus
avec des concentrations de 3 ou 4 milliards spz/ml
(11%) (Tableau 1).
2.2. Technique de congélation en paillettes.
2.2.1. Vitesse de congélation et taille des paillettes.
supérieurs lorsque le sperme est conditionné en
paillettes de 0.5 ml. Les meilleurs taux de survie sont
obtenus avec des vitesses de congélation de
15°C/mn. La combinaison paillette de 0.5 ml et
15°C/mn permet d’obtenir un taux de survie de 37%,
significativement supérieur à toutes les autres
combinaisons.
2.2.2. Nature de l’agent cryoprotecteur.
La comparaison des différents cryoprotecteurs
montre que le meilleur taux de survie (31%) est
obtenu avec le DMF (Tableau 3).
2.2.3. Temps d’équilibration.
Quatre temps de mise en contact de la semence avec
le cryoprotecteur ont été testés (Tableau 4). Les
résultats montrent un optimum pour le temps de 4
mn (42% de survie). Un temps plus court ne permet
pas une pénétration suffisante du cryoprotecteur dans
les cellules (37% de survie) et des temps plus longs
laissent les effets toxiques du cryoprotecteur
s’exprimer (30 et 32% de survie).
2.2.4. Dilueur.
Les résultats, présentés dans le tableau 5, montrent
que des taux de survie de 47% et 53% sont obtenus
avec les deux dilueurs BHSV et IGGK contenant du
myoinositol. Ces taux sont significativement
supérieurs à ceux de 33% à 38% obtenus avec les
dilueurs contenant du PVP (FEB, BPSE 2 et TSEL)
ou celui ne contenant pas de cryoprotecteur externe
(BPSE).
2.2.5. Tests in vivo.
Lors du premier test (Tableau 6) les taux de survie
obtenus ont été répétables (38% en moyenne),
comparables à ceux obtenus chez le coq. En
revanche, le % spz vivants-normaux de la semence
fraîche étant très faible (50%), cela a conduit à des
taux de spermatozoïdes vivants-normaux d’environ
19% dans la semence décongelée inséminée. Dans
ces conditions, les taux de fertilité étaient de 7.8% en
moyenne.
Lors du second test (Tableau 7), le taux de survie in
vitro obtenu avec la combinaison BHSV1.5x109spz/ml est de 30%. A cette concentration les
taux de fertilité obtenus sont de l’ordre de 9%,
comparables à ceux obtenus dans le test 1. La
combinaison BHSV-3x109spz/ml n’améliore pas le
taux de survie (28%) ni le taux de fertilité moyen
(12%). Par contre la combinaison IGGK3x109spz/ml a permis d’obtenir un taux de survie
(35%) et surtout un taux de fertilité (20%) supérieurs.
Les résultats présentés dans le tableau 2 montrent
que, quelle que soit la vitesse de congélation, les taux
de survie des spermatozoïdes sont significativement
Sixièmes Journées de la Recherche Avicole, St Malo, 30 et 31 mars 2005.
565
CONCLUSION
Dès le début du programme, il est apparu que la
qualité de la semence fraîche de pintade était faible
par rapport à ce qui est connu chez le coq et le
dindon (Tselutin et al., 1999, Chalah et al., 1999,
Labbé et al., 2003, Blesbois et al. 2005). Or, le
processus congélation-décongélation provoque une
chute importante de cette qualité. Dans ces
conditions la qualité des semences de pintade,
décongelées et inséminées, est dramatiquement
faible en comparaison des autres espèces.
Contrairement à ce qui est observé chez le coq et le
dindon (Chalah et al., 1999, Labbé et al., 2003), le
conditionnement de la semence en paillettes est plus
performant que celui en billes. Les différents essais
de congélation en billes n’ont jamais permis de
dépasser un taux de survie de 17%, alors que ce taux
variait de 30% à 50% suivant les protocoles de
congélation en paillettes. Même si la raison de cette
différence de réponse au conditionnement n’est pas
connue, le conditionnement en paillettes est très
intéressant car il permet une identification facile des
semences congelées compatible avec une traçabilité
optimale de la gestion des stocks. Pour ces raisons, le
conditionnement en paillettes a été privilégié chez la
pintade.
L’optimisation de la technique a nécessité la
réévaluation d’un grand nombre de paramètres.
Parmi ceux-ci la présence de myoinositol, la nature
du cryoprotecteur et son temps d’équilibration, la
vitesse de congélation se sont révélés être de
véritables points critiques. Finalement, la
combinaison optimale in vitro a consisté à congeler
la semence de pintade diluée dans le dilueur IGGK
avec 6% de DMF, à une concentration finale de 1.5
milliards de spz/ml, conditionnée en paillettes de 0.5
ml, et à une vitesse de congélation de 15°C/mn
(Tableau 5).
Cependant, les tests in vivo réalisés avec cette
technique optimisée ont conduit à des taux de fertilité
de l’ordre de 9%. Il semble bien que le nombre de
spermatozoïdes vivants-normaux inséminé n’était
pas suffisant pour assurer une bonne fertilité (Brillard
et al., 1979, Jamenot (Galor), communication
personnelle, Seigneurin, non publié) . Sachant que le
volume d’une dose d’insémination ne peut guère
dépasser 130 µl sous peine de rejet par la femelle, un
compromis entre la concentration de congélation et
un nombre de spermatozoïdes inséminés, plus proche
des besoins physiologiques des femelles, a du être
trouvé. Ainsi, la combinaison IGGK-3x109spz/ml
(Tableau 7) a permis d’obtenir des taux de fertilité de
20%. Ce taux reste plus bas que ce qui est attendu
dans les autres espèces (Chalah and al., 1999, Labbé
and al., 2003, Massip and al., 2004). Il est cependant
suffisant pour permettre la sauvegarde à long terme
d’une grande partie du patrimoine génétique de la
pintade et assurer la gestion ex situ de cette espèce.
BIBLIOGRAPHIE
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Tableau 1 – Taux de survie des spermatozoïdes en fonction de la concentration de la semence après congélation
– décongélation en billes dans du FEB + 6% DMA.
Concentration
(milliards spz/ml)
4
3
1.5
1
% de survie
11 a
11 a
17 b
16 b
N =6. Les valeurs affectées de la même lettre ne sont pas significativement différentes (P<0.05)
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Sixièmes Journées de la Recherche Avicole, St Malo, 30 et 31 mars 2005.
Tableau 2 - Taux de survie de spermatozoïdes (%) en fonction de la vitesse de congélation et du type de
paillettes utilisées. Dilueur : FEB. Cryoprotecteur : DMA 6%. Concentration : 1.5 milliards spz/ml.
Vitesses (°C/mn)
60
30
15
7
Paillettes 0,5 ml
25 c
28 b
37 a
25 c
Paillettes 0,25 ml
12 e
18 d
30 b
17 d
N =6. Les valeurs affectées de la même lettre ne sont pas significativement différentes (P<0.05).
Tableau 3 - Taux de survie des spermatozoïdes en fonction du cryoprotecteur.
Dilueur : FEB. Paillettes de 0.5 ml. Vitesse de congélation : 15°C/mn. Concentration : 1.5 milliards spz/ml
Cryoprotecteur
DMA
DMSO
DMF
Taux de survie (%)
17 b
4a
31 c
N =6. Les valeurs affectées de la même lettre ne sont pas significativement différentes (P<0.05)
Tableau 4 - Taux de survie des spermatozoïdes en fonction du temps d’équilibration avec le DMF.
Dilueur : FEB. Paillettes de 0.5 ml. Vitesse de congélation : 15°C/mn. Concentration : 1.5 milliards spz/ml
Temps d'équilibration
1 mn
4 mn
7 mn
10 mn
Taux de survie (%)
37 b
42 a
32 c
30 c
N =6. Les valeurs affectées de la même lettre ne sont pas significativement différentes (P<0.05)
Tableau 5 - Taux de survie des spermatozoïdes en fonction du dilueur de congélation.
DMF 6%. Paillettes de 0.5 ml. Vitesse de congélation : 15°C/mn. Concentration : 1.5 milliards spz/ml
Dilueur
FEB
TSEL
BPSE
BPSE 2
Protecteur membranaire
PVP
PVP
PVP
0
Taux de survie (%)
33 a
34 a
38 a
38 a
BHSV
IGGK
myoinositol myoinositol
47 b
53 b
N =6. Les valeurs affectées de la même lettre ne sont pas significativement différentes (P<0.05).
Tableau 6 – Résultats du premier test in vivo.
BHSV, 1.5 milliards spz/ml, 6% DMF, équilibré 4 mn, paillettes de 0.5 ml, 15°C/mn
N° d'insémination
1
2
3
4
5
6
7
Moyenne
Taux de survie des spz (%)
32
35
35
40
41
44
41
38
% spz vivants-normaux
17
18
18
20
20
22
20
19
Taux de fertilité (%)
4,7
14,5
3,7
11,7
9,5
3,2
7,8
7,8
Tableau 7 - Résultats du second test in vivo.
6% DMF, équilibré 4 mn, paillettes de 0.5 ml, 15°C/mn
Paramètres
% survie
IA 1
IA2
Moyenne
BHSV 1,5 milliards
30
6,3
11,9
9,1
BHSV 3 milliards
28
7,9
16,5
12,2
IGGK 3 milliards
35
20,3
21,2
20,7
Sixièmes Journées de la Recherche Avicole, St Malo, 30 et 31 mars 2005.
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