FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Estrogen Receptor α Clone

7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Estrogen Receptor α
Clone 1D5
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Incubate tissue section with 200 µL EnVision™ FLEX/HRP (Code DM802) for 20 (±1) minutes
Rinse in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 1-5 minutes
Incubate tissue section with 200 µL EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 5 (±1) minutes
Rinse in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 1-5 minutes
Incubate tissue section with 400 µL EnVision™ FLEX Substrate Working Solution (Codes DM823 and DM827) for 10 (±1) minutes
Rinse in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 1-5 minutes
Counterstain slide with EnVision™ FLEX Hematoxylin (Code K8018) for 5 (±1) minutes
Rinse in deionized water for 1-5 minutes
Incubate tissue section with 200 µL EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 5 (±1) minutes
Rinse in deionized water for 1-5 minutes
Mount slides with permanent mounting medium.
Programming grid for recommended assay:
Code IS657
ENGLISH
Intended use
For in vitro diagnostic use.
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone 1D5, Ready-to-Use (DakoAutostainer/Autostainer Plus), is intended for use in
immunohistochemistry together with Dako Autostainer/Autostainer Plus instruments. The antibody labels estrogen receptor α-positive cells and is
useful in the assessment of estrogen receptor status in human breast carcinomas (1-3). The clinical interpretation of any staining or its absence
should be complemented by morphological studies using proper controls and should be evaluated within the context of the patient's clinical history
and other diagnostic tests by a qualified pathologist.
Synonyms for antigen
ERα
Summary
and explanation
Steroid receptors exhibit a high affinity and specificity for their ligands. The human estrogen receptor (ER) is a dimeric protein of 65 kDa
located primarily in cell nuclei and belongs to a class of trans-acting proteins which stimulate transcription by binding to specific DNA
elements, also known as hormone response elements. Through binding estrogen, the ER is induced to stimulate gene transcription, hence is
also known as an inducible enhancer factor (4, 5).
Historical studies have shown that ER status is correlated with untreated outcome (i.e., prognostic for well differentiated invasive breast
cancer) and with response to anti-hormonal therapy e.g., tamoxifen. Estrogens have been found to be preferentially concentrated in the
estrogen target organs of animals and in human breast cancers and it is well documented that the mitogenic effects of estrogen are mediated
by ER. Investigations into the biological mechanisms for breast cancer growth have found that the growth rate is dependent on the presence
of estrogen or progesterone or both in most breast cancers (5). Thus, estrogen receptor status in mammary carcinomas is considered to be a
validated prognostic and predictive factor for patient management for anti-hormonal therapy (5, 6).
Refer to Dako’s General Instructions for Immunohistochemical Staining or the detection system instructions of IHC procedures for: 1)
Principle of Procedure, 2) Materials Required, Not Supplied, 3) Storage, 4) Specimen Preparation, 5) Staining Procedure, 6) Quality Control,
7) Troubleshooting, 8) Interpretation of Staining, 9) General Limitations.
Reagent provided
Ready-to-use monoclonal mouse antibody provided in liquid form in a buffer containing stabilizing protein and 0.015 mol/L sodium azide.
Clone: 1D5 (7). Isotype: IgG1, kappa.
Immunogen
Soluble recombinant human estrogen receptor (7).
Specificity
The antibody specifically reacts with ERα and shows no reaction with ERβ (8, 9). The epitope is located in the N-terminal domain (A/B
region) of ERα. In Western immunoblotting using protein extracts from COS cells transfected with a plasmid vector expressing ER, the
human breast cancer cell line MCF-7, and human endometrial tissue, the antibody labels a polypeptide of approximately 67 kDa
corresponding to ER. No labeling of COS cells transfected with plasmid containing a deleted mutant with missing sequences encoding for
the A/B region of ER was observed (7).
All incubation steps should be performed at room temperature. For details, please refer to the Operator’s Manual for the dedicated
instrument. The Auxiliary step should be set to “rinse buffer” in staining runs with ≤10 slides. For staining runs with >10 slides the Auxiliary
step should be set to “none”. This ascertains comparable wash times.
It is recommended that positive and negative controls be run simultaneously using the same protocol as the patient specimens. The positive
control tissue should include cervix and the cells/structures should display reaction patterns as described for this tissue in “Performance
characteristics” in all positive specimens. The recommended negative control reagent is FLEX Negative Control, Mouse, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (Code IS750).
As demonstrated by immunohistochemistry, the antibody reacts with the ERα-equivalent protein in rat (8).
Precautions
1. For professional users.
2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as
hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush
with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing.
3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used.
4. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin.
5. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations.
Storage
Store at 2-8 °C. Do not use after expiration date stam ped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the
conditions must be verified by the user. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, positive and negative
controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in
laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected, contact Dako Technical Support.
Specimen preparation
including materials
required but not supplied
Staining interpretation
Cells labeled by the antibody display nuclear staining. Cytoplasmic labeling, if observed, should be regarded non-specific. For percent
positive assessment, cut-off values ranging from >0% to 45% have been reported (10-18).
Product specific
limitations
1.
False-negative results could be caused by degradation of the antigen in the tissues over time. Specimens should be stained within 2
months of mounting of tissues on slides when stored at room temperature (19).
2.
For optimal and reproducible results, the ER protein requires heat-induced epitope retrieval (HIER) when tissues are routinely fixed
(neutral buffered formalin) and paraffin embedded.
3.
Use of Dako Monoclonal Mouse Anti-Human ERα, Clone 1D5 on tissues with fixatives other than formalin has not been validated.
4.
Pre-analytical parameters, including tissue fixation and processing, may influence the staining procedure conditions.
Performance
characteristics
The antibody can be used for labeling formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Tissue specimens should be cut into sections of
approximately 4 µm.
Pre-treatment with heat-induced epitope retrieval (HIER) is required using Dako PT Link (Code PT100/PT101). For details, please refer to
the PT Link User Guide. Pretreating tissues using EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (Code K8004) for 20 minutes
at 97 °C followed by 5 minutes in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) is recommended.
Abnormal tissues: Numerous studies on formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer tissue sections have shown Anti-ERα, Clone 1D5,
to be reliable and effective for the demonstration of ERα status (1, 2, 21, 22). The antibody also provides accurate prognostic information
regarding response to endocrine therapies (2, 21, 22). Sensitivity data of 90% (2) and 89% (21), and specificity data of 51% (2) and 73%
(21) have been reported when antibody labeling was compared with response to tamoxifen therapy. In (2), an H-score method with an
arbitrary cut-off for positivity of 50 was used, while in (21) a cut-off point of 10% positive cells was used. In another study, the antibody
labeled 10/25 pancreatic insulinomas (23). Occasionally lymphoid tumors and non-lymphoid neoplasms such as melanoma were labeled.
Paraffin-embedded sections: Pre-treatment of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections is recommended using the 3-in-1 specimen
preparation procedure for Dako PT Link. Follow the pre-treatment procedure outlined in the package insert for EnVision FLEX+ Mouse, High
pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Code K8012). Note: After staining the sections must be dehydrated, cleared and mounted using
permanent mounting medium.
The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunohistochemical staining procedure.
Staining procedure
including materials
required but not supplied
The recommended visualization system is EnVision FLEX+ Mouse, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Code K8012) used
according to the protocol given below. Reagents must be appropriately diluted before use. All steps should be performed at room
temperature (20-25 °C).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
(121196-004)
Dako Denmark A/S
Normal tissues: In cervix, the basal squamous epithelial cells and stromal cells show a moderate to strong nuclear staining reaction and the
intermediate and superficial squamous epithelial cells show a weak to moderate nuclear staining reaction. The antibody has been tested on
a large range of other normal tissues. Positive nuclear labeling is observed in the mammary gland, tonsil (weak focal staining of squamous
epithelial cells and germinal center cells), uterus (endometrium) and lung mesenchymal and alveolar lining cells. Granulocytes,
macrophages and prostate fibromuscular stromal cells are occasionally labeled in the cytoplasm. Non-specific staining of necrotic tissue and
secretions in the lung is occasionally seen (20).
Incubate tissue section with 200 µL EnVision™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (Code K8010) for 5 (±1) minutes
Rinse in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 1-5 minutes
Incubate tissue section with 200 µL primary antibody (Code IS657) for 20 (±1) minutes
Rinse in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 1-5 minutes
Incubate tissue section with 200 µL EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) (Code K8022) for 15 (±1) minutes
Rinse in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code K8007) for 1-5 minutes
IS657/EFG/SSM/2012.03.20 p. 1/7
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
(121196-004)
Dako Denmark A/S
IS657/EFG/SSM/2012.03.20 p. 2/7
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
13.
14.
15.
16.
17.
FRANÇAIS
Utilisation prévue
Contre-colorer les lames avec de la EnVision™ FLEX Hematoxylin (Réf K8018) pendant 5 minutes (± 1 minute)
Rincer dans de l’eau déionisée pendant 1 à 5 minutes
Incuber les coupes de tissu avec 200 µL de EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf. K8007) pendant 5 minutes (±1 minute)
Rincer dans de l’eau déionisée pendant 1 à 5 minutes
Monter les lames avec un milieu de montage permanent.
Grille de programmation pour le dosage recommandé :
Pour utilisation diagnostique in vitro.
Le FLEX Monoclonal Mouse Anti- Human Estrogen Receptor α, Clone 1D5, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus), est destiné
à une utilisation en immunohistochimie avec les instruments Dako Autostainer/Autostainer Plus. L'anticorps marque les cellules α-positives
du récepteur de l'œstrogène et permet d'évaluer le statut du récepteur de l'œstrogène dans les cancers du sein humains (1–3).
L’interprétation clinique de toute coloration ou son absence doit être complétée par des études morphologiques en utilisant des contrôles
appropriés et doit être évaluée en fonction des antécédents cliniques du patient et d’autres tests diagnostiques par un pathologiste qualifié.
Synonymes de l’antigène
ERα
Résumé
et explication
Les récepteurs stéroïdiens présentent une affinité et une spécificité élevées envers leurs ligands. Le récepteur des œstrogènes humains
(ER) est une protéine dimère de 65 kDa située principalement dans les noyaux cellulaires et appartenant à une classe de protéines transactives qui stimulent la transcription en se liant à des éléments ADN spécifiques, également connus comme éléments de la réponse
hormonale. Par le biais de la liaison aux œstrogènes, l’ER est induit pour stimuler la transcription génique, raison pour laquelle on parle
également d’activateur de transcription inductible (4, 5).
Des études précédentes ont montré que le statut ER est en relation directe avec le résultat sans traitement (c.-à-d. le pronostic pour les
cancers invasifs du sein différenciés) et avec la réponse au traitement antihormonal, par ex., le tamoxifène. On a découvert que les
œstrogènes sont concentrés de préférence dans les organes cibles de l'œstrogène des animaux et dans les cancers du sein de la femme,
et que l'ER sert de médiateur aux effets mitogènes des œstrogènes. Des recherches sur les mécanismes biologiques de la croissance du
cancer du sein ont mis en évidence que le taux de croissance dépend de la présence d'œstrogènes ou de progestérone ou des deux dans
la plupart des cancers du sein (5). Par conséquent, on considère que le statut du récepteur des œstrogènes dans les carcinomes
mammaires est un pronostic valide et un facteur prédictif de la prise en charge des patientes pour la thérapie antihormonale (5, 6).
Se reporter aux « Instructions générales de coloration immunohistochimique » de Dako ou aux instructions du système de détection
relatives aux procédures IHC pour plus d’informations concernant les points suivants : 1) Principe de procédure, 2) Matériels requis mais
non fournis, 3) Conservation, 4) Préparation des échantillons, 5) Procédure de coloration, 6) Contrôle qualité, 7) Dépannage,
8) Interprétation de la coloration, 9) Limites générales.
Réactifs fournis
Anticorps monoclonal de souris prêt à l’emploi fourni sous forme liquide dans un tampon contenant une protéine stabilisante et 0,015 mol/L
d’azide de sodium.
Clone : 1D5 (7). Isotype : IgG1, kappa.
Immunogène
Récepteur des œstrogènes humains recombinant soluble (7).
Spécificité
L'anticorps réagit spécifiquement avec l'ERα mais ne présente aucune réaction au ERβ (8, 9). L'épitope est localisé sur le domaine terminal
aminé (région A/B) du ERα. Dans des analyses par Western immunoblot à l'aide d'extraits protéiques de cellules COS transfectées par un
vecteur plasmide exprimant l'ER, la lignée cellulaire MCF-7 de cancer du sein humain et de tissu endométrial humain, l'anticorps a marqué
un polypeptide d'environ 67 kDa correspondant à l'ER. Aucun marquage n'a été observé sur des cellules COS transfectées par un plasmide,
contenant un mutant détruit avec des séquences de codage absentes sur la région A/B de l'ER (7).
Toutes les étapes doivent être effectuées à température ambiante. Pour plus de détails, se référer au Guide d’utilisation de l’appareil
correspondant. L’étape Auxiliary doit être réglée sur « rinse buffer » lors des cycles de coloration comptant 10 lames ou moins. Pour les
cycles de coloration de >10 lames, l’étape Auxiliary doit être réglée sur « none ». Cela garantit des temps de lavage comparables.
Comme le démontre l’immunocytochimie, l’anticorps réagit avec la protéine homologue à l'ERα chez le rat (8).
Précautions
1. Pour utilisateurs professionnels.
2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit,
bien que non classé comme dangereux, l’azide de sodium peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations et former des
accumulations d’azides métalliques hautement explosifs. Lors de l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation
d’azide métallique dans les canalisations.
3. Comme avec tout produit d’origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées.
4. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau.
5. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales.
Conservation
Conserver entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser après la d ate de péremption indiquée sur le flacon. Si les réactifs sont conservés dans des conditions
autres que celles indiquées, celles-ci doivent être validées par l’utilisateur. Il n’y a aucun signe évident indiquant l’instabilité de ce produit.
Par conséquent, des contrôles positifs et négatifs doivent être testés en même temps que les échantillons de patient. Si une coloration
inattendue est observée, qui ne peut être expliquée par un changement des procédures du laboratoire, et en cas de suspicion d’un problème lié
à l’anticorps, contacter l’assistance technique de Dako.
Préparation des
échantillons
y compris le matériel
requis mais non fourni
Il est recommandé d’analyser des contrôles positifs et négatifs en même temps et avec le même protocole que les échantillons du patient.
Le tissu de contrôle positif doit comprendre le col de l'utérus et les cellules/structures doivent présenter les schémas de réaction décrits pour
ce tissu dans les « Caractéristiques de performance » pour tous les échantillons positifs. Le contrôle négatif recommandé est le FLEX
Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Réf. IS750).
Interprétation de la
coloration
Les cellules marquées par l’anticorps présentent une coloration nucléaire. La coloration cytoplasmique, si elle est observée, doit être
considérée comme non spécifique. Pour l’évaluation positive en pourcentage, des valeurs seuils se situant entre plus de 0 % et 45 % ont
été signalées (10-18).
Limites spécifiques au
produit
1.
2.
3.
L’anticorps peut être utilisé pour le marquage des coupes de tissus inclus en paraffine et fixés au formol. L’épaisseur des coupes
d’échantillons de tissu doit être d’environ 4 µm.
Un prétraitement avec démasquage d’épitope induit par la chaleur (HIER) est nécessaire avec le Dako PT Link (Réf. PT100/PT101).
Pour plus de détails, se référer au Guide d’utilisation du PT Link. Il est recommandé de prétraiter les tissus à l’aide de la EnVision FLEX
Target Retrieval Solution, High pH (50x) (Réf. K8004) pendant 20 minutes à 97 °C, puis pendant 5 minutes d ans du EnVision™ FLEX Wash
Buffer (Réf. K8007).
4.
Caractéristiques de
performance
Coupes incluses en paraffine : le prétraitement des coupes tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine est recommandé à l'aide de
la procédure de préparation des échantillons 3 en 1 pour Dako PT Link. Suivre la procédure de prétraitement indiquée dans la notice de la
EnVision FLEX+ Mouse, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (réf. K8012). Remarque : après coloration, les coupes doivent être
déshydratées, lavées et montées à l’aide d’un milieu de montage permanent.
Les coupes de tissus ne doivent pas sécher lors du traitement ni lors de la procédure de coloration immunohistochimique suivante.
Procédure de coloration
y compris le matériel
requis mais non fourni
Le système de visualisation recommandé est le EnVision FLEX+ Mouse, High pH, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Réf. K8012) utilisé
conformément au protocole figurant ci-dessous. Les réactifs doivent être correctement dilués avant utilisation. Toutes les étapes doivent
être effectuées à température ambiante (20-25 °C).
Incuber les coupes de tissu avec 200 µL de EnVision™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (Réf. K8010) pendant 5 minutes (± 1 minute)
Rincer dans du EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf K8007) pendant 1 à 5 minutes
Incuber les coupes de tissu avec 200 µL d’anticorps primaire (Réf. IS657) pendant 20 minutes (± 1 minute)
Rincer dans du EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf. K8007) pendant 1 à 5 minutes
Incuber les coupes de tissu avec 200 µL de EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) (Réf. K8022) pendant 15 minutes (± 1 minute)
Rincer dans du EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf. K8007) pendant 1 à 5 minutes
Incuber les coupes de tissu avec 200 µL de EnVision™ FLEX/HRP (Réf. DM802) pendant 20 minutes (± 1 minute)
Rincer dans du EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf. K8007) pendant 1 à 5 minutes
Incuber les coupes de tissu avec 200 µL de EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf. K8007) pendant 5 minutes (± 1 minute)
Rincer dans du EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf. K8007) pendant 1 à 5 minutes
Incuber les coupes de tissu avec 400 µL de EnVision™ FLEX Substrate Working Solution (Réf. DM823 et DM827) pendant 10 minutes
(± 1 minute)
12. Rincer dans du EnVision™ FLEX Wash Buffer (Réf. K8007) pendant 1 à 5 minutes
Dako Denmark A/S
IS657/EFG/SSM/2012.03.20 p. 3/7
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Tissus sains : les cellules pavimenteuses basales et les cellules du stroma présentent une coloration nucléaire modérée à forte et les
cellules pavimenteuses superficielles et intermédiaires présentent une coloration nucléaire faible à modérée. L'anticorps a été testé sur une
large gamme d'autres tissus sains. Un marquage nucléaire positif est observé dans la glande mammaire, l’amygdale (faible coloration
focalisée des cellules pavimenteuses et des cellules des centres germinatifs), l'utérus (endomètre) et dans les cellules tapissant les alvéoles
et le mésenchyme pulmonaires. Le cytoplasme des granulocytes, des macrophages et des cellules du stroma fibromusculaire de la prostate
est occasionnellement marqué. Une coloration non spécifique des tissus nécrotiques et des sécrétions pulmonaires se produit parfois (20).
Tissus tumoraux : de nombreuses études sur des coupes tissulaires de cancers du sein, fixées au formol et incluses en paraffine, ont
montré que l'anticorps Anti-ERα, Clone 1D5, est efficace et fiable pour démontrer le statut de l'ERα (1, 2, 21, 22). L'anticorps fournit
également une information précise pour le pronostic de la réponse aux thérapies endocrines (2, 21, 22). Des données de sensibilité de 90 %
(2) et 89 % (21), et de spécificité de 51 % (2) et 73 % (21) ont été rapportées lors de la comparaison du marquage par l'anticorps et de la
réponse au traitement par tamoxifène. Dans (2), on a utilisé la méthode d'analyse du score H avec un seuil arbitraire de positivité de 50,
tandis que dans (21) on a utilisé un point limite de 10 % de cellules positives. Dans une autre étude, l'anticorps a marqué 10 cas sur 25
d'insulinomes pancréatiques (23). Les tumeurs lymphoïdes et les néoplasmes non lymphoïdes comme les mélanomes peuvent
occasionnellement être marqués.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
(121196-004)
De faux résultats négatifs peuvent être dus à une dégradation de l'antigène dans les tissus au fil du temps. Les échantillons doivent
être colorés dans les 2 mois après le montage des tissus sur les lames lorsqu'ils sont conservés à température ambiante (19).
Pour des résultats optimaux et reproductibles, la protéine ER requiert un démasquage d’épitope induit par la chaleur (HIER) lorsque
les tissus sont fixés selon la procédure de routine (au formol neutre tamponné) et inclus en paraffine.
L'utilisation de l'anticorps Dako Monoclonal Mouse Anti-Human ERα, Clone 1D5 sur des tissus fixés par d'autres produits que le formol
n'a pas été validée.
Les paramètres pré-analytiques, notamment la fixation et le traitement des tissus, peuvent influer sur les conditions de la procédure de
coloration.
(121196-004)
Dako Denmark A/S
IS657/EFG/SSM/2012.03.20 p. 4/7
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
14.
15.
16.
17.
DEUTSCH
Mit entionisiertem Wasser 1-5 Minuten abspülen
Gewebeschnitt mit 200 µL EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 5 (±1) Minuten inkubieren
Mit entionisiertem Wasser 1-5 Minuten abspülen
Objektträger mit permanentem Fixiermittel fixieren
Programmierraster für empfohlenes Assay:
Verwendungszweck
Zur In-vitro-Diagnostik.
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Estrogen Receptor α, Klon 1D5, Ready-to-Use Use (DakoAutostainer/Autostainer Plus) ist zur
Verwendung in der Immunhistochemie in Verbindung mit with Dako Autostainer/Autostainer Plus-Geräten bestimmt. Der Antikörper markiert
östrogenrezeptor-α-positive Zellen und wird bei der Bestimmung des Östrogenrezeptor-Status bei menschlichen humanen Brustkarzinomen
verwendet (1–3). Die klinische Auswertung einer eventuell eintretenden Färbung sollte durch morphologische Studien mit geeigneten
Kontrollen ergänzt und von einem qualifizierten Pathologen unter Berücksichtigung der Krankengeschichte und anderer diagnostischer
Tests des Patienten vorgenommen werden.
Synonyme für das Antigen
ERα
Zusammenfassung und
Erklärung
Steroidrezeptoren weisen eine hohe Affinität und Spezifität gegenüber ihren Liganden auf. Der humane Östrogenrezeptor (ER) ist ein
dimeres Protein von 65 kDa, das sich überwiegend in Zellkernen befindet. Er gehört zu einer Klasse trans-agierender Proteine, die durch
Bindung an spezifische DNA-Elemente, auch bekannt als hormonresponsive Elemente, die Transkription stimulieren. Da die
Östrogenbindung den Östrogenrezeptor zur Stimulation der Gentranskription veranlasst, wird dieser auch als induzierbarer Enhancer-Faktor
bezeichnet (4, 5).
Studien haben gezeigt, dass der ER-Status mit dem Verlauf der Erkrankung ohne Behandlung, d. h. der Prognose für gut differenzierten
invasiven Brustkrebs, und mit der Reaktion auf antihormonelle Therapie, z. B. mit Tamoxifen, korreliert. Östrogene wurden in hoher
Konzentration vor allem in tierischen Zielorganen für Östrogene und in menschlichen Brustkrebsgeweben nachgewiesen, und es ist gut
dokumentiert, dass die mitogene Wirkung von Östrogen durch ER vermittelt wird. Die Untersuchung der für das Brustkrebswachstum
verantwortlichen biologischen Mechanismen hat gezeigt, dass die Wachstumsrate der meisten Brustkrebsarten vom Vorhandensein von
Östrogen oder Progesteron oder beidem abhängig ist (5). Daher gilt der Östrogenrezeptor-Status von Mammakarzinomen als anerkannter
prognostischer und prädiktiver Faktor für das Patientenmanagement bei antihormoneller Therapie (5, 6).
Folgende Angaben bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako oder den Anweisungen des
Detektionssystems für IHC-Verfahren entnehmen: 1) Verfahrensprinzip, 2) Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien,
3) Aufbewahrung, 4) Vorbereitung der Probe, 5) Färbeverfahren, 6) Qualitätskontrolle, 7) Fehlersuche und -behebung, 8) Auswertung der
Färbung, 9) Allgemeine Beschränkungen.
Geliefertes Reagenz
Gebrauchsfertiger monoklonaler Maus-Antikörper in flüssiger Form in einem Puffer, der stabilisierendes Protein und 0,015 mol/L
Natriumazid enthält.
Klon: 1D5 (7). Isotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Löslicher rekombinanter humaner Östrogenrezeptor (7).
Spezifität
Der Antikörper reagiert spezifisch mit ERα und zeigt keine Reaktion mit ERβ (8, 9). Das Epitop liegt auf der N-terminalen Domäne (A/BRegion) von ERα. Beim Western-Immunblotting von Proteinextrakten aus mit einem ER exprimierenden Plasmidvektor transfizierten COSZellen, der menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7, und menschlichem Endometriumgewebe markiert der Antikörper ein Polypeptid von
ungefähr 67 kDa, was mit ER übereinstimmt. Bei mit einem mutierten Plasmidvektor transfizierten COS-Zellen, wobei das Plasmid keine
Sequenzen beinhaltete, die für die A/B-Region des ER kodieren, wurde keine Markierung beobachtet (7).
Alle Inkubationsschritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Nähere Einzelheiten bitte dem Benutzerhandbuch für das
jeweilige Gerät entnehmen. Bei Färbedurchläufen mit 10 oder weniger Objektträgern sollte der Zusatzschritt auf „Pufferspülgang“ eingestellt
werden. Für Färbedurchläufe mit mehr als 10 Objektträgern den Zusatzschritt auf „Keine“ einstellen. Dies gewährleistet vergleichbare
Waschzeiten.
Wie immunhistochemisch belegt wurde, tritt zwischen dem Antikörper und dem ERα-entsprechenden Protein in Ratten eine Reaktion auf (8).
Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur für Fachpersonal bestimmt.
2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Natriumazid kann auch in als ungefährlich
eingestuften Konzentrationen mit Blei- und Kupferrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel
Wasser nachspülen, um Metallazidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen.
3. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese entsprechend gehandhabt werden.
4. Geeignete Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden.
5. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen.
Lagerung
Es wird empfohlen, Positiv- und Negativkontrollen zur gleichen Zeit und mit demselben Protokoll wie die Patientenproben zu testen.
Als positive Kontrolle sollte Zervixgewebe verwendet werden, und die Zellen/Strukturen müssen in allen positiven Proben die für dieses
Gewebe unter „Leistungsmerkmale“ beschriebenen Reaktionsmuster aufweisen. Das empfohlene Negativ-Kontrollreagenz ist FLEX
Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Code-Nr. IS750).
Auswertung der Färbung
Mit diesem Antikörper markierte Zellen weisen ein nukleäres Färbemuster auf. Eine zytoplasmische Markierung sollte, falls beobachtet, als
unspezifisch angesehen werden. Für eine positive Beurteilung wurden Cut-off-Werte von >0 % bis 45 % beschrieben (10-18).
Produktspezifische
Beschränkungen
1.
Falsch-negative Ergebnisse können die Folge eines mit der Zeit stattfindenden Antigenabbaus in den Geweben sein. Werden Proben
bei Raumtemperatur aufbewahrt, so sollten diese innerhalb von 2 Monaten nach dem Aufbringen der Schnitte auf Objektträger gefärbt
werden (19).
2.
Zum Erzielen optimaler und reproduzierbarer Ergebnisse bei routinemäßig fixierten (neutral gepuffertes Formalin) und
paraffineingebetteten Geweben ist für das ER-Protein eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung (HIER) erforderlich.
3.
Die Verwendung des Dako Monoclonal Mouse Anti-Human ERα, Clone 1D5 auf Geweben mit anderen Fixiermitteln als Formalin
wurde nicht validiert.
4.
Vor der Analyse auftretende Faktoren wie beispielsweise Gewebefixierung und -verarbeitung beeinflussen u. U. die Bedingungen für
die Färbung.
Bei 2–8 °C aufbewahren. Nach Ablauf des auf dem Fläsc hchen aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien
unter anderen als den angegebenen Bedingungen aufbewahrt, müssen diese Bedingungen vom Benutzer validiert werden. Es gibt keine
offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Positiv- und Negativkontrollen sollten daher zur gleichen Zeit wie die
Patientenproben getestet werden. Falls es zu einer unerwarteten Färbung kommt, die sich nicht durch Unterschiede bei Laborverfahren erklären
lässt und auf ein Problem mit dem Antikörper hindeutet, ist der technische Kundendienst von Dako zu verständigen.
Vorbereitung der Probe
und erforderliche, aber
nicht mitgelieferte
Materialien
Der Antikörper eignet sich zur Markierung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Gewebeproben sollten in
Schnitte von ca. 4 µm Stärke geschnitten werden.
Die Vorbehandlung durch hitzeinduzierte Epitopdemaskierung (HIER) mit Dako PT Link (Code-Nr. PT100/PT101) ist erforderlich.
Weitere Informationen hierzu siehe PT Link-Benutzerhandbuch. Eine 20-minütige Vorbehandlung der Gewebe bei 97 °C mit EnVision 
FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (Code-Nr. K8004), gefolgt von 5 Minuten in EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007)
wird empfohlen.
Leistungsmerkmale
Paraffineingebettete Schnitte: Die Vorbehandlung der formalinfixierten, paraffineingebetteten Schnitte mit dem 3-in-1Probenvorbereitungsverfahren für Dako PT Link wird empfohlen. Vorbehandlung gemäß der Beschreibung in der Packungsbeilage für
EnVision FLEX+ Mouse High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Code-Nr. K8012) durchführen. Hinweis: Nach dem Färben müssen die
Schnitte dehydriert, gereinigt und unter Verwendung eines permanenten Fixiermittels auf Objektträger aufgebracht werden.
Pathologisches Gewebe: Zahlreiche Studien von formalinfixierten, paraffineingebetteten Brustkrebsgewebeschnitten zeigten, dass AntiERα, Klon 1D5 zuverlässig und effektiv für den Nachweis des ERα-Status ist (1, 2, 21, 22). Der Antikörper liefert auch genaue prognostische
Informationen bezüglich der Reaktion auf endokrine Behandlungen (2, 21, 22). Eine Sensitivität von 90 % (2) und 89 % (21) und eine
Spezifität von 51 % (2) und 73 % (21) wurde berichtet, als die Antikörper-Markierung mit der Reaktion auf eine Tamoxifen-Therapie
verglichen wurde. Bei (2) wurde eine H-Score-Methode mit einem beliebigen Cut-off für eine Färbung von 50 angewendet, während bei (21)
ein Cut-off-Punkt von 10 % positiven Zellen angewendet wurde. In einer anderen Studie markierte der Antikörper 10/25 Insulinomen (23).
Gelegentlich wurden lymphoide Tumore und nicht-lymphoide Neoplasmen wie Melanome markiert.
Die Gewebeschnitte dürfen während der Behandlung oder des anschließenden immunhistochemischen Färbeverfahrens nicht austrocknen.
Färbeverfahren
und erforderliche, aber
nicht mitgelieferte
Materialien
(121196-004)
Dako Denmark A/S
Als Visualisierungssystem wird EnVision FLEX+ Mouse, High pH, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Code-Nr. K8012) gemäß dem
unten aufgeführten Protokoll empfohlen. Reagenzien müssen vor der Verwendung entsprechend verdünnt werden. Alle Schritte sollten bei
Raumtemperatur (20—25 °C) durchgeführt werden.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Gewebeschnitt mit 200 µL EnVision™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (Code-Nr. K8010) 5 (±1) Minuten inkubieren
Mit EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 1-5 Minuten abspülen
Gewebeschnitt mit 200 µL Primärantikörper (Code-Nr. IS657) 20 (±1) Minuten inkubieren
Mit EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 1-5 Minuten abspülen
Gewebeschnitt mit 200 µL EnVision™ FLEX+ Mouse (LINKER) (Code-Nr. K8002) 15 (±1) Minuten inkubieren
Mit EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 1-5 Minuten abspülen
Gewebeschnitt mit 200 µL EnVision™ FLEX/HRP (Code-Nr. DM802) 20 (±1) Minuten inkubieren
Mit EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 1-5 Minuten abspülen
Gewebeschnitt mit 200 µL EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 5 (±1) Minuten inkubieren
Mit EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 1-5 Minuten abspülen
Gewebeschnitt mit 400 µL EnVision™ Substrate Working Solution (Code-Nr. DM823 und DM827) 10 (±1) Minuten inkubieren
Mit EnVision™ FLEX Wash Buffer (Code-Nr. K8007) 1-5 Minuten abspülen
Objektträger mit EnVision™ FLEX Hematoxylin (Code-Nr. K8018) 5 (±1) Minuten gegenfärben
IS657/EFG/SSM/2012.03.20 p. 5/7
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Gesunde Gewebe: Im Zervix weisen die Basalschicht-Plattenepithelzellen und Stromazellen eine mäßige bis starke nukleäre Färbereaktion
auf und die intermediären und oberflächlichen Plattenepithelzellen zeigen eine schwache bis mäßige nukleäre Färbereaktion. Der Antikörper
wurde bei einer Vielfalt von anderen gesunden Geweben getestet. Eine positive nukleäre Markierung wurde in der Brustdrüse, in den
Mandeln (schwache fokale Färbung von Plattenepithelzellen und Zellen der Keimzentren), im Uterus (Endometrium) sowie in den
Mesenchym- und Alveolarwandzellen der Lunge beobachtet. Granulozyten, Makrophagen und fibromuskuläre Prostatastromazellen werden
gelegentlich im Zytoplasma markiert. Gelegentlich können nicht-spezifische Färbungen von nekrotischem Gewebe und Sekretionen in der
Lunge auftreten (20).
(121196-004)
Dako Denmark A/S
IS657/EFG/SSM/2012.03.20 p. 6/7
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
References/ Références/ Literatur
1.
Mauri FA, Veronese S, Frigo B, Girlando S, Losi L, Gambacorta M, et al. ER1D5 and H222 (ER-ICA) antibodies to human estrogen receptor protein in breast carcinomas. Appl
Immunohistochem 1994;2:157-63.
2.
Goulding H, Pinder S, Cannon P, Pearson D, Nicholson R, Snead D, et al. A new immunohistochemical antibody for the assessment of estrogen receptor status on routine
formalin-fixed tissue samples. Hum Pathol 1995;26:291-4.
3.
Shaw JA, Udokang K, Mosquera J-M, Chauhan H, Jones JL, Walker RA. Oestrogen receptors alpha and beta differ in normal human breast and breast carcinomas. J Pathol
2002;198:450-7.
4.
Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987;51:941-51.
5.
Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. In: Diseases of the Breast. Harris JR et al. eds. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 2000:47185.
6.
Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer: College of American Pathologists consensus statement 1999.
Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966-78.
7.
Al Saati T, Clamens S, Cohen-Knafo E, Faye JC, Prats H, Coindre JM, et al. Production of monoclonal antibodies to human estrogenreceptor protein (ER) using recombinant ER
(RER). Int J Cancer 1993;55: 651-4.
8.
Nishihara E, Nagayama Y, Inoue S, Hiroi H, Muramatsu M, Yamashita S, et al. Ontogenetic changes in the expression of estrogen receptor α and β in rat pituitary gland detected
by immunohistochemistry. Endocrinology 2000;141:615-20.
9.
Pettersson K, Grandien K, Kuiper GGJM, Gustafsson J-Å. Mouse estrogen receptor β forms estrogen response element-binding heterodimers with estrogen receptor α. Mol
Endocrinol 1997;11:1486-96.
10. Chebil G, Bendahl PO, Fernö M; South Sweden Breast Cancer Group; North Sweden Breast Cancer Group. Estrogen and progesterone receptor assay in paraffin-embedded
breast cancer-reproducibility of assessment. Acta Oncol 2003;42:43-7.
11. Fernö M, Andersson C, Fallenius G, Idvall I. Oestrogen receptor analysis of paraffin sections and cytosol samples of primary breast cancer in relation to outcome after adjuvant
tamoxifen treatment. The South Sweden Breast Cancer Group. Acta Oncol 1996;35:17-22.
12. Andersen J. Determination of estrogen receptors in paraffin-embedded tissue. Techniques and the value in breast cancer treatment. Acta Oncol 1992;31:611-27.
13. Ferrero-Poüs M, Trassard M, Le Doussal V, Hacène K, Tubiana-Hulin M, Spyratos F. Comparison of enzyme immunoassay and immunohistochemical measurements of
estrogen and progesterone receptors in breast cancer patients. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2001;9:267-75.
14. Santeusanio G, Mauriello A, Ventura L, Liberati F, Colantoni A, Lasorella R, et al. Immunohistochemical analysis of estrogen receptors in breast carcinomas using monoclonal
antibodies that recognize different domains of the receptor molecule. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2000;8:275-84.
15. Grabau DA, Thorpe SM, Knoop A, Vach W, Schrøder HD, Blichert-Toft M, et al. Immunohistochemical assessment of oestrogen and progesterone receptors: correlations with
the DCC method and clinical outcome in primary breast cancer patients. Breast 2000;9:208-17.
16. Molino A, Micciolo R, Turazza M, Bonetti F, Piubello Q, Corgnati A, Sperotto L, Martignoni G, Bonetti A, Nortilli R, et al. Estrogen receptors in 699 primary breast cancers: a
comparison of immunohistochemical and biochemical methods. Breast Cancer Res Treat 1995;34:221-8.
17. Layfield LJ, Gupta D, Mooney EE. Assessment of tissue estrogen and progesterone receptor levels: A survey of current practice, techniques, and quantitation methods. Breast J
2000;6:189-96.
18. Leers MP, Hoop JG, van Beers M, van Rodijnen N, Pannebakker M, Nap M. Determination of threshold values for determining the size of the fraction of steroid hormone
receptor-positive tumor cells in paraffin-embedded breast carcinomas. Cytometry B Clin Cytom 2005;64:43-52.
19. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. Approved guideline. CLSI document MM4-A
(1-56238-396-5)-CLSI, 940 west Valley Road, Suite 1400. Wayne, PA 19087-1898 USA 1999.
20. Dako Technical Report TR10-52.
21. Pertschuk LP, Feldman JG, Kim Y-D, Braithwaite L, Schneider F, Braverman AS, et al. Estrogen receptor immunocytochemistry in paraffin embedded tissues with ER1D5
predicts breast cancer endocrine response more accurately than H222Spγ in frozen sections or cytosol-based ligand-binding assays. Cancer 1996;77:2514-9.
22. Barnes DM, Harris WH, Smith P, Millis RR, Rubens RD. Immunohistochemical determination of oestrogen receptor: comparison of different methods of assessment of staining
and correlation with clinical outcome of breast cancer patients. Br J Cancer 1996;74:1445-51.
23. Alabraba EB, Taniere P, Reynolds GM, Stewart PM, Wigmore SJ, Bramhall SR. Expression and functional consequences of oestrogen and progesterone receptors in human
insulinomas. Endocr Relat Cancer 2007;14:1081-8.
Explanation of symbols/ Explication des symboles/ Erläuterung der Symbole
Catalogue number
Référence catalogue
Bestellnummer
Temperature limitation
Limites de température
Zulässiger Temperaturbereich
Verwendbar bis
In vitro diagnostic medical device
Contains sufficient for <n> tests
Manufacturer
Dispositif médical de diagnostic in vitro
In-vitro-Diagnostikum
Contenu suffisant pour <n> tests
Fabricant
Inhalt ausreichend für <n> Tests
Hersteller
Consult instructions for use
Batch code
Consulter les instructions d’utilisation
Gebrauchsanweisung beachten
Code du lot
(121196-004)
Dako Denmark A/S
Use by
Utiliser avant
Chargenbezeichnung
IS657/EFG/SSM/2012.03.20 p. 7/7
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17