UNIVERSITE DE CORSE-PASCAL PAOLI Thèse

Transcription

UNIVERSITE DE CORSE-PASCAL PAOLI
ECOLE DOCTORALE ENVIRONNEMENT ET SOCIETE
UMR CNRS 6134 (SPE)
Thèse présentée pour l’obtention du grade de
DOCTEUR EN ASPECTS MOLECULAIRES ET
CELLULAIRES DE LA BIOLOGIE
Mention : Biochimie et Biologie Moléculaire
Soutenue publiquement par
Florine Gonord
le 28 septembre 2011
__________________________________________________________
Etude des effets des facteurs de l’environnement sur la
concentration en caroténoïdes dans la pulpe de clémentines (Citrus
clementina Hort. Ex Tan.)
__________________________________________________________
Directeurs:
Mr Laurent Urban, Professeur, Université d’Avignon
Mme Liliane Berti, Professeur, Université de Corse
Rapporteurs :
Mme Hélène Gautier, Dr-HDR, INRA d’Avignon
Mr Pierre Baldet, Dr-HDR, INRA de Bordeaux
Jury
Mr Laurent Urban, Professeur, Université d’Avignon
Mme Liliane Berti, Professeur, Université de Corse
Mme Hélène Gautier, Dr-HDR, INRA d’Avignon
Mr Pierre Baldet, Dr-HDR, INRA de Bordeaux
Mr Félix Tomi, Professeur, Université de Corse
Mr Frédéric Bourgaud, Professeur, Université de Nancy
REMERCIEMENTS
Merci à l’INRA et à la Collectivité Territoriale de Corse d’avoir financé mon travail de
thèse.
Merci à Mme Dominique Agostini, présidente du centre INRA de San Giuliano et à Mr
Olivier Pailly, directeur de l’unité de recherche Génétique et Ecophysiologie de la Qualité des
Agrumes de l’INRA de San Giuliano de m’avoir accueillie et permis de réaliser mes travaux de
recherches au sein de l’unité.
Merci à Mr Laurent Urban, professeur au laboratoire de Physiologie des Fruits et
Légumes à l’Université d’Avignon et des Pays du Vaucluse de m’avoir confié ce sujet de thèse
et de m’avoir encadré au cours de ces 4 années. Merci d’avoir partagé tes idées, tes
réflexions, de ton encadrement, de tes relectures et corrections et d’avoir su me remotiver
quand cela était nécessaire.
Merci à Mme Liliane Berti, professeur et directrice du laboratoire de Biochimie et
Biologie Moléculaire du Végétal à l’Université de Corse de m’avoir co-encadré. Merci.
Merci à Melle Anne-Laure Fanciullino, chargé de recherche au sein de l’unité GEQA de
l’INRA de San Giuliano, pour son encadrement, son aide et ses encouragements infaillibles
depuis son arrivée.
Merci à Mme Hélène Gautier, chargé de recherche au sein de l’unité Plantes et
Systèmes de cultures Horticoles de l’INRA d’Avignon et à Mr Pierre Baldet, chargé de
recherche au sein de l’unité à l’UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie de l’INRA de
Bordeaux, d’avoir accepté d’être rapporteur de cette thèse.
Merci à Mr Frédéric Bourgaud, directeur du laboratoire Agronomie et Environnement
de l’UMR 1121 INRA-Université de Nancy et à Mr Félix Tomi, professeur et directeur du
laboratoire de Chimie et Biomasse de l’Université de Corse d’avoir accepté de faire partie de
mon jury de thèse également constitué de Mme Liliane Berti, et Mr Laurent Urban.
Merci à Mme Félicie Lauri, maitre de conférence au laboratoire Physiologie des Fruits
et Légumes à l’Université d’Avignon et des Pays du Vaucluse, à Mme Huguette Sallanon,
professeur et directrice du laboratoire Physiologie des Fruits et Légumes à l’Université
d’Avignon et des Pays du Vaucluse, à Mme Hélène Gautier, à Mr Frédéric Bourgaud et à Mr
Luc Bidel, professeur au laboratoire de biochimie et Physiologie Végétale à l’Université de
Montpellier pour leur participation à mon comité de thèse, pour leurs conseils scientifiques,
leurs aides sur les méthodes de dosages et leurs soutiens.
Merci à Melle Elodie Carcouët, technicienne au sein de l’unité GEQA de l’INRA de San
Giuliano pour sa contribution aux analyses biochimiques et, à Mr Jérémie Santini, doctorant
au sein de l’unité GEQA de l’INRA de San Giuliano pour sa contribution aux analyses des
activités enzymatiques lors de son stage de master, à Mr Jérôme Barbaggio, technicien au
sein de l’unité GEQA de l’INRA de San Giuliano et à Mme Isabelle POGGI, ingénieur à la
DDTM pour leurs contributions à la mise en place des expérimentations.
Merci à l’équipe du domaine, Franck, Emmanuel, Maxime, Jean-Marc, Charles-Hugo,
Jean-Jacques, Abel, Matthieu, Stéphane, Philippe 1, René, Philippe 2, Jean-François,
Christian, Paul-Eric, Augustin, Victor et Josée pour tous les bons moments passés ensemble
autour d’une tasse de thé, d’un gâteau ou d’un barbecue.
Merci à l’équipe du labo, Yann, François, Gilles, Albert, Jean, Isabelle, Sajjad, JeanBaptiste, Matthieu, Sabrina et Emmanuel. Une tasse de thé, un gâteau, un ragot, des retours
de vacances, … tous est prétexte pour faire une petite pause et oublier le quotidien du
travail par quelques bons fous rires.
Merci à Jeanine et à Jean-Pierre. On se rappellera de ces discussions autour d’un sirop
et de nos soirées jeux de société inoubliables.
Pour finir, un merci un peu spécial pour ma petite famille de corse : Sandrine, Jérôme,
Mourad et Julien. Tellement de choses se sont passées au cours de ces 4 années, que
quelques lignes ne suffiraient pas à exprimer toute ma reconnaissance, mon amitié et plus
encore alors que dire de plus que merci.
SOMMAIRE
PARTIE I : INTRODUCTION ...............................................................................1
I.
Les caroténoïdes et la santé humaine ........................................................................ 1
II.
Le modèle d’étude : les agrumes................................................................................ 4
II.1.
Importance économique ............................................................................................ 4
II.2.
Origine des agrumes................................................................................................... 5
II.3.
Classification des agrumes ......................................................................................... 6
II.4.
Le fruit ........................................................................................................................ 7
II.4.1.
Structure du fruit ................................................................................................ 7
II.4.2.
Développement du fruit ..................................................................................... 9
II.5.
Valeur nutritionnelle des fruits .................................................................................. 9
III. La qualité des fruits ................................................................................................. 12
III.1.
Le métabolisme des sucres et des acides organiques ............................................. 12
III.2.
Le métabolisme des caroténoïdes ........................................................................... 13
III.2.1.
Structure des caroténoïdes .............................................................................. 14
III.2.2.
Caractéristiques des caroténoïdes ................................................................... 16
III.2.3.
Localisation et stockage des caroténoïdes....................................................... 18
III.2.4.
Rôles des caroténoïdes dans la plante ............................................................. 19
III.2.1.
La voie de biosynthèse des précurseurs .......................................................... 23
III.2.1.1. La biosynthèse des précurseurs : le diméthyallyle et le pyrophosphate et
l’isopentényle pyrophosphate ..................................................................... 24
III.2.1.1.1. La voie du mévalonate ......................................................................... 25
III.2.1.1.2. La voie du méthylérythritol phosphate ................................................ 26
III.2.1.2. La biosynthèse du phytoène ....................................................................... 28
III.2.2.
La biosynthèse des caroténoïdes ..................................................................... 28
III.2.2.1. Les réactions de déshydrogénation............................................................. 28
III.2.2.2. Les réactions de cyclisation ......................................................................... 29
III.2.2.3. La formation des xanthophylles .................................................................. 30
III.2.3.
La dégradation des caroténoïdes ..................................................................... 30
III.2.3.1. Formation de l’acide abscissique ................................................................ 31
III.2.3.2. Formation des autres apocaroténoïdes ...................................................... 32
III.2.4.
La régulation de la voie de biosynthèse ........................................................... 34
III.2.4.1. Régulation transcriptionnelle ...................................................................... 34
III.2.4.1.1. Régulation au niveau de la voie du méthylérythritol phosphate ......... 34
III.2.4.1.2. Les étapes clés de la voie de biosynthèse des caroténoïdes ............... 36
III.2.4.2. Rôle de la lumière ........................................................................................ 37
III.2.4.3. Rôle du statut redox des plastoquinones .................................................... 37
III.2.4.4. Rôle des produits finaux .............................................................................. 38
III.2.4.5. Rôle du stockage des caroténoïdes ............................................................. 39
IV. Influence des facteurs de l’environnement sur la biosynthèse et l’accumulation des
caroténoïdes................................................................................................................... 41
IV.1.
Les effets de l’environnement sur l’accumulation des caroténoïdes ...................... 41
IV.2.
Statut carboné ou stress oxydatif ?.......................................................................... 43
IV.2.1.
L’influence du statut carboné sur la concentration en caroténoïdes .............. 43
IV.2.1.1. Liens entre les métabolismes primaire et secondaire ................................ 43
IV.2.1.1.1. Théories déterministes ........................................................................ 45
IV.2.1.1.2. Théories mécanistes............................................................................. 47
IV.2.2.
L’influence du stress oxydatif sur la concentration en caroténoïdes .............. 47
IV.2.2.1. Le stress oxydatif et les espèces réactives de l’oxygène ............................ 49
IV.2.2.2. La formation des espèces réactives de l’oxygène ....................................... 52
IV.2.2.2.1. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours la
photosynthèse ...................................................................................... 54
IV.2.2.2.2. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours de la
photorespiration ................................................................................... 57
IV.2.2.2.3. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours de la
respiration ............................................................................................. 58
IV.2.2.3. Le statut redox cellulaire ............................................................................. 59
IV.2.2.4. Rôles des espèces réactives de l’oxygène et des variations de statut redox
dans le contrôle de la biosynthèse des caroténoïdes ................................. 61
IV.2.3.
V.
Les interactions entre l’effet du statut carboné et l’effet du stress oxydatif .. 63
Problématique et objectifs ...................................................................................... 64
PARTIE II : MATERIELS ET METHODES ............................................................66
I.
Le matériel végétal .................................................................................................. 67
II.
Les dispositifs expérimentaux .................................................................................. 67
II.1.
Effet de l’alimentation en sucres sur les critères de qualité des fruits d’agrumes .. 67
II.1.1.
Première étude : en fonction du stade de maturité des fruits ........................ 67
II.1.2.
Deuxième étude : en fonction des différents stades de développement du
fruit ................................................................................................................... 68
II.2.
Troisième étude : effet d’un stress photooxydatif imposé au niveau des feuilles sur
la concentration en caroténoïdes des fruits proches .............................................. 72
III. Conservation des échantillons ................................................................................. 75
IV. Mesure de l’indice de maturité ................................................................................ 75
V.
Les analyses biochimiques ....................................................................................... 76
V.1.
Dosage des sucres et des acides organiques ........................................................... 76
V.1.1.
Préparation des échantillons............................................................................ 76
V.1.1.1. Extraction des sucres.................................................................................... 76
V.1.1.2. Extraction des acides organiques ................................................................. 76
V.1.2.
Analyse des sucres par HPLC ............................................................................ 77
V.1.3.
Analyse des acides organiques par HPLC ......................................................... 77
V.1.4.
Identification et quantification des sucres et des acides organiques .............. 78
V.2.
Dosage des caroténoïdes ......................................................................................... 78
V.2.1.
Préparation des standards ............................................................................... 78
V.2.2.
Extraction et saponification des caroténoïdes ................................................. 79
V.2.1.
Analyse des caroténoïdes par HPLC ................................................................. 81
V.2.2.
Identification et quantification des caroténoïdes ............................................ 81
V.3.
Dosage du péroxyde d’hydrogène ........................................................................... 82
V.4.
Dosage de l’ascorbate .............................................................................................. 83
VI. Les analyses statistiques .......................................................................................... 84
VI.1.
Analyse de variance .................................................................................................. 84
VI.2.
Représentation Heatmap ......................................................................................... 84
PARTIE III : RESULTATS ET DISCUSSION..........................................................85
I.
L’effet de l’alimentation en sucres sur la biosynthèse des caroténoïdes ................... 87
I.1.
En fonction des stades de maturité des fruits ......................................................... 87
I.1.1.
L’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité organoleptiques et
nutritionnels ..................................................................................................... 87
I.1.1.1.
L’effet de la charge en fruits sur le calibre du fruit et sur les indicateurs de
maturité ........................................................................................................ 87
I.1.1.2.
I.1.2.
L’effet de la charge en fruits sur les caroténoïdes ....................................... 91
L’effet de la charge en fruits, à la date III, sur les concentrations et la
composition en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes .................. 95
I.1.3.
I.2.
Conclusion ........................................................................................................ 98
En fonction de différents stades de développement des fruits ............................... 98
I.2.1.
Variations de calibre et d’indice de maturité du fruit .................................... 100
I.2.1.
Concentration en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes ............. 102
I.2.2.
Variations des concentrations et des proportions en sucres, en acides
organiques et en caroténoïdes pour les deux traitements considérés .......... 106
I.2.3.
Conclusion ...................................................................................................... 110
II.
L’effet du stress oxydatif et du statut redox sur la biosynthèse des caroténoïdes ....110
II.1.
L’effet de fortes intensités lumineuse sur les indicateurs de stress des feuilles ... 112
II.2.
Mise en évidence d’un signal entre les feuilles et le fruit ...................................... 115
II.3.
L’effet de fortes intensités lumineuses sur les différentes formes d’ascorbate et sur
le statut redox ........................................................................................................ 118
II.4.
L’effet de fortes intensités lumineuses sur les critères de qualité du fruit ........... 121
II.5.
Conclusion .............................................................................................................. 122
PARTIE IV : CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................. 123
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................ 130
ANNEXES ..................................................................................................... 158
ANNEXE 1 : ARTICLE DE SYNTHESE......................................................................................... 159
ANNEXE 2 : POSTERS .............................................................................................................. 178
TABLE DES FIGURES
Partie I : Introduction bibliographique
Figure 1: Production d'agrumes ................................................................................................. 3
Figure 2: Origine et dispersion des agrumes.............................................................................. 5
Figure 3: Classification des Aurantioideae. ................................................................................ 6
Figure 4: Structure du fruit d'agrumes ....................................................................................... 7
Figure 5: Croissance et développement du fruit ........................................................................ 8
Figure 6: Métabolisme des sucres et des acides organiques .................................................. 11
Figure 7: Les caroténoïdes........................................................................................................ 14
Figure 8: Structure fine des caroténoïdes d’après Britton (1995). .......................................... 15
Figure 9: Représentation de la transition chloroplaste-chromoplaste)................................... 17
Figure 10: Spectres d'absorption de la chlorophylle a, de la chlorophylle b, des carotènes et
des xanthophylles pour les différentes longueurs d’onde. ............................................. 20
Figure 11 : Cycle des xanthophylles (A) et répartition des xanthophylles au cours du cycle (B)
.......................................................................................................................................... 22
Figure 12: Biosynthèse des précurseurs .................................................................................. 24
Figure 13: Voie du mévalonate ................................................................................................ 25
Figure 14: Voie du méthylérythritol phosphate ....................................................................... 26
Figure 15: Voie de biosynthèse des caroténoïdes ................................................................... 27
Figure 16: Voie de biosynthèse de l'acide abscissique ............................................................ 31
Figure 17: La régulation de la voie de biosynthèse des précurseurs. ...................................... 33
Figure 18: La régulation de la voie de biosynthèse des caroténoïdes. .................................... 35
Figure 19: Théorie de l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance 44
Figure 20: Réseau de signalisation impliquant les interactions entre les hormones et les
espèces réactives de l’oxygène ........................................................................................ 46
Figure 21: Déséquilibre de la balance entre les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les
antioxydants ..................................................................................................................... 48
Figure 22: Formation des différentes espèces réactives de l'oxygène ................................... 50
Figure 23 : Formation d'espèces réactives de l'oxygène dans les chloroplastes ..................... 53
Figure 24: Formation de peroxyde d'hydrogène lors de la photorespiration ......................... 56
Figure 25: Production d’anion superoxyde dans la chaine de transport des électrons de la
membrane mitochondriale interne.................................................................................. 58
Partie II: Matériels et méthodes
Figure 26: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les critères de qualité du
fruit d’une réduction réversible ou non de l’alimentation en sucres en fonction du stade
de développement. .......................................................................................................... 69
Figure 27: Spectre de caractérisation de la transmission de l’énergie lumineuse pour les deux
ombrières utilisées ........................................................................................................... 71
Figure 28: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les fruits d’un stress
photooxydatif appliqué au niveau des feuilles proches. ................................................. 73
Partie III: Résultats et discussion
Figure 29: Diamètre (A) et poids frais de fruits de clémentine (B), au cours de la maturation,
en fonction de la charge en fruits .................................................................................... 86
Figure 30 : Concentrations en sucres totaux (A), en acide totaux (B) et du rapport matière
sèche sur matière fraîche (MS/MF) de fruits de clémentine (C), au cours de la
maturation, en fonction de la charge en fruit ................................................................. 88
Figure 31: Concentrations en caroténoïdes totaux de fruits de clémentine, au cours de la
maturation, en fonction de la charge en fruits ............................................................... 90
Figure 32: Quantité de caroténoïdes totaux par fruit de, à la date III, pour les traitements
avec une charge en fruits ................................................................................................. 90
Figure 33 : Concentrations en sucres (A), en acides organiques (B) et en caroténoïdes (C)
dans les fruits de clémentine, à la date III, pour tous les traitements correspondent à
une charge en fruits ......................................................................................................... 94
Figure 34: Concentration en caroténoïdes totaux, en fonction de la charge en fruits (élevée
et moyenne), du stade de développement auquel la charge été appliquée (précoce,
intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au
témoin ............................................................................................................................ 101
Figure 35: Heatmap représentant les concentrations en métabolites primaires (sucres et
acides organiques) et secondaires (caroténoïdes) dans la pulpe en fonction des
différents traitements appliqués. .................................................................................. 103
Figure 36: Concentrations en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes, en fonction de
la méthode utilisée : défoliation ou ombrage pour une charge en fruits élevée appliquée
précocement, après la chute physiologique du fruit par rapport au témoin ............... 105
Figure 37: Evolution du rendement quantique maximal du photosystème II (Fv/Fm) (A), de la
fluorescence minimale (Fo) (B) et de la fluorescence maximale (Fm) (C), au cours du
stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse ......................................... 111
Figure 38: Variation de l’indice de performance (PI) (A), et de ses composantes : la densité
des centres de réactions actifs exprimée en fonction de la chlorophylle (RC/ABS) (B),
des réactions lumineuses pour la photochimie primaire (Fv/Fo) (C) et des réactions
sombres [(1-Vj)/Vj] (C), après exposition à un stress photooxydatif, en fonction de
l’intensité lumineuse ..................................................................................................... 113
Figure 39: Evolution du statut rédox de l’ascorbate dans la pulpe des fruits, au cours du
stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse .......................................... 119
Figure 40: Concentrations en sucres (A), en acides organiques (B) et en caroténoïdes (C) dans
la pulpe des fruits, à t=99h après l’application du stress photooxydatif, en fonction de
l’intensité lumineuse ...................................................................................................... 120
TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1: Composition en caroténoïdes dans la pulpe des fruits d'agrumes exprimée en
mg.L-1 ................................................................................................................................ 10
Tableau 2: Effets positifs des facteurs de l’environnement, la lumière, la température,
l’approvisionnement en carbone, la sécheresse, la salinité et la fertilisation azotée, sur
la concentration en caroténoïdes par rapport à la matière fraîche dans différents fruits
.......................................................................................................................................... 40
Tableau 3: Effets négatifs des facteurs de l’environnement, la lumière, la température,
l’approvisionnement en carbone, la sécheresse, la salinité et la fertilisation azotée, sur
la concentration en caroténoïdes par rapport à la matière fraîche dans différents fruits
.......................................................................................................................................... 42
Tableau 4 : Production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans une cellule végétale. 51
Partie II: Matériels et méthodes
Tableau 5: Données climatiques du mois de juillet 2007 au mois de janvier 2008 à San
Giuliano. ........................................................................................................................... 68
Tableau 6 : Données climatiques du mois de juillet 2008 au mois de décembre 2008 à San
Giuliano. ........................................................................................................................... 70
Tableau 7: Données climatiques du 3 au 13 février 2009 à San Giuliano. ............................... 75
Tableau 8: Préparation des solutions standards. ..................................................................... 78
Partie III: Résultats et discussion
Tableau 9: Indice de maturité des fruits de clémentine en fonction des charges en fruits et
des dates considérées ...................................................................................................... 89
Tableau 10: Pourcentages des différentes formes de caroténoïdes, de sucres et d’acides
organiques, en fonction de la charge en fruits, à la date III............................................. 96
Tableau 11: Diamètre, poids du fruit frais et indice de maturité, en fonction de la charge en
fruits (élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a été appliquée
(précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par
rapport au témoin (charge en fruits faible) ..................................................................... 99
Tableau 12: Concentrations en sucres totaux et en acides organiques totaux, en fonction de
la charge en fruits (élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a
été appliquée (précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou
ombrage) par rapport au témoin (charge en fruits faible). ........................................... 101
Tableau 13: Pourcentages des différentes molécules de caroténoïdes, de sucres et d’acides
organiques, respectivement, en fonction de la méthode utilisée (défoliation ou
ombrage) pour une charge en fruits élevée appliquée précocement, après la chute
physiologique du fruit. ................................................................................................... 107
Tableau 14: Concentrations en peroxyde d’hydrogène, dans la pulpe des fruits, en fonction
de l’intensité du stress photooxydatif ........................................................................... 116
Tableau 15 : Concentrations en ascorbate réduit, en déshydroascorbate, et en ascorbate
total, dans la pulpe du fruit, en fonction de l’intensité du stress photooxydatif. ......... 117
ABBREVIATIONS
CMK
A
A
Anthéraxanthine
AA
Ascorbate réduit
ABA
Acide abscissique
4-(cytidine-5’-diphospho)-2Cméthyl-D-érythritol kinase
CMT
2-C-méthyl-D-xylulose-5phosphate synthase
Acétyl-CoA Acétyl-Coenzyme A
CoA-SH
Coenzyme A
ADN
Acide désoxyribonucléique
CRTISO
Caroténoïde isomérase
ADP
Adénosine diphosphate
CS
Citrate synthase
ALD
Aldolase
CTP
2-C-méthyl-D-xylulose-5-
AOX
Alternative oxydase
APX
Ascorbate peroxydase
ARNm
Acide
phosphate synthase
D
ribonucléique
messager
D
Défoliation
AT
Acidité titrable
DBMIB
2,5-dibromo-6-isopropyle-3-
ATP
Adénosine triphosphate
méthyle-1,4-benzoquinone
DCMU
diméthylurée
B
BHT
Ter-nutylhydroxytoluène
DHA
Déshydroascorbate
DHAR
Déshydroascorbate
réductase
C
C
Cytochrome c
CAT
Catalase
CDD
Dioxygénase
DMAPP
clivant
les
DTT
DL-dithioéthréitol
DXP
1-désoxy-D-xylulose-5phosphate
4-(cytidine-5’-diphospho)-2Cméthyl-D-érythritol
CDP-MEP
DXPS
diphospho-2C-méthyl-D-
1-désoxy-D-xylulose-5phosphate synthase
2-phospho-4-cytidine-5’-
érythritol
Diméthylallyle
pyrophosphate
caroténoïdes
CDP-Me
3-(3,4-dichlorophényle)-1,1
DXR
1-désoxy-D-xylulose-5phosphate réductase
E
E1/E2
ESS
NAD(P)H
H
déshydrogénase
HDR
1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)-
externe
butényl-4-phosphate
Extrait soluble sec
réductase
HDS
1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)butényl-4-phosphate
F
synthase
FAD
Flavine adénine diphosphate
Fd
Ferrédoxine
HK
Hexokinase
FNR
Ferrédoxine NADP-réductase
HMBPP
1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)-
FPP
Farnésyle pyrophosphate
Fo
Fluorescence minimale
Fm
Fluorescence maximale
Fv/Fo :
Réactions lumineuses pour la
butényl-4-phosphate
HMG-CoA
CoA
HMGR
Rendement
quantique
HMGS
3-hydroxy-3-méthylglutarylCoA synthase
maximal du photosystème II
HPLC
Chromatographie
liquide
haute performance
G
GDBH
3-hydroxy-3-méthylglutarylCoA réductase
photochimie primaire
Fv/Fm
3-hydroxy-3-méthylglutaryl-
Théorie de l’équilibre entre la
différenciation
et
I
la
I1
croissance
NADH
déshydrogénase
interne
GO
Glycolate oxydase
GPP
Géranyle pyrophosphate
IDH
Isocitrate déshydrogénase
GGPP
Géranyle
IM
Indice de maturité
INV
Invertase
IPP
Isopentényle pyrophosphate
IPS
Isopentényle
géranyle
pyrophosphate
GGPPS
Géranyle
géranyle
pyrophosphate synthase
GR
Glutathion réductase
GSH
Glutathion réduit
GSSG
Glutathion disulfide
isomérase
diphosphate
L
NEM
N-éthylmaléimide
LOD
Limite de détection
NO
Monoxyde d’azote
LOQ
Limite de quantification
NPQ
Non
LCY-β
Lycopène β cyclase
LCY-ε
Lycopène ε cyclase
quenching
NSY
Néoxanthine synthase
O
M
MCS
photochemical
O
2-C-méthyl-D-érythritol-2,4-
Ombrage
cyclodiphosphate synthase
P
MDHA
Monodéshydroascorbate
MDHAR
Monodéshydroascorbate
PDH
Pyruvate déshydrogénase
réductase
PDS
Phytoène désaturase
2-C-méthyl-D-érythritol-2,4-
PFK
Phosphofructokinase
cyclodiphosphate
PGP
Phosphoglycolate phosphate
2-C-méthyl-D-érythritol-4-
Pi
Phosphate inorganique
phosphate
PI
Indice de performance
MF
Matière fraîche
PK
Pyruvate kinase
MnSOD
Superoxyde
PQ
Plastoquinone
manganèse
PQH2
Plastoquinone réduite
MS
Matière sèche
PTOX
Plastoquinone oxydase
MTBE
Méthyl-tert-butyl éther
PSI
Photosystème I
MVA
Mévalonate
PSII
Photosystème II
MVK
Mévalonate kinase
PSY
Phytoène synthase
MVP
Mévalonate-5-phosphate
PMD
Mévalonate diphosphate
MVPP
Mévalonate-5-diphosphate
PMK
Di-phospho-mévalonate
Me-cPP
MEP
dismutase
à
kinase
N
NAD(P)
Nicotinamide
adénine
PPi
Pyrophosphate inorganique
PVP
Polyvinyle pirrolidone
dinucléotide (phosphate)
NCED
Q
Dioxygénase clivant les 9-cisapocaroténoïdes
Q
Pool d’ubiquinone
R
RC/ABS
ROS
U
Densité
des
centres
UDP
Uridine diphosphate
réactionnels actifs exprimée
UTP
Uridine triphosphate
en fonction de la chlorophylle
UV
Ultra-violet
Espèces
réactives
de
l’oxygène
S
SAA
V
V
Violaxanthine
VDE
Violaxanthine dé-époxydase
Acclimatation de systémique
acquise
SE
SM
Z
Stress d’intensité lumineuse
Z
Zéaxanthine
élevé
ZDS
ζ-carotène désaturase
Stress d’intensité lumineuse
ZEP
Zéaxanthine époxydase
moyen
SOD
Superoxyde dismutase
(1-Vj)/Vj
Réactions en phase obscure
SS
Saccharose synthase
3-PGA
Glycéraldéhyde-3-phosphate
β-HY
β-carotène hydroxylase
ε
Coefficient
T
T
Témoin
TPP
Thiamine pyrophosphate
TRX
Thiorédoxine
d’extinction
molaire
ε-HY
ε-carotène hydroxylase
AVANT PROPOS
Ce travail a été réalisé au sein de l’unité GEQA « Génétique et Ecophysiologie de la
Qualité des Agrumes » à l’INRA de Corse. Une partie de ce travail a fait l’objet d’une
valorisation sous forme d’articles, de communications orales, et de posters.
ARTICLE PUBLIE :
Poiroux-Gonord F., Bidel L.P.R., Fanciullino A.L., Gautier H., Lauri-Lopez F., Urban L.
2010. Health benefits of vitamins and secondary metabolites of fruits and vegetables and
prospects to increase their concentrations by agronomic approaches. Journal of Agricultural
and Food Chemistry 58, 12065-12082.
ARTICLE SOUMIS :
Poiroux-Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. Effect of fruit load on maturity
and the concentration in carotenoids of Clementine fruits (Citrus clementina Hort. Ex Tan.).
Soumis à Journal of the Science of Food and Agriculture.
COMMUNICATION ORALE :
Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. 2009. It is possible to increase the
carotenoid concentrations of Citrus fruits by acting on environment factors. 3 rd International
Symposium on Human Health Effects of Fruits and Vegetables. Avignon, France.
POSTERS:
Gonord F., Berti L., Urban L. 2008. Effet des facteurs de l’environnement sur la teneur
en caroténoïdes dans la pulpe de clémentine. Journée de l’école doctorale. Corte, France.
Urban L., Gonord F., Berti L., Sallanon H., Lauri F. 2008. Effet de l’agriculture
biologique sur la valeur santé des fruits et légumes: réflexions et études en cours sur la
clémentine et la tomate. DINABIO. Montpellier, France.
Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. 2009. Sugars influence the biosynthesis
of carotenoids in the pulp of clementine fruits (Citrus clementina). Les réserves végétales et
leurs importances agronomiques et sylvicoles. Caen, France.
Gonord F., Fanciullino A.L., Berti L., Urban L. 2011. Effet de la charge en fruits sur la
maturité et la concentration en caroténoïdes dans les fruits de la clémentine (Citrus
clementina Hort. Ex Tan.). Journée de l’école doctorale. Corte, France.
Partie I : Introduction
I.
Les caroténoïdes et la santé humaine
Les plantes produisent une large diversité de molécules organiques. On appelle
métabolites secondaires, celles qui ne sont pas impliquées directement dans les processus
majeurs que sont la croissance et le développement. En accord avec la nomenclature
adoptée par la Fondation Anglaise de Nutrition, les métabolites secondaires des plantes
peuvent être divisés en trois groupes majeurs : les terpénoïdes (environ 25000 composés
actuellement recensés), les alcaloïdes (environ 1200 composés) et les composés phénoliques
(environ 8000 composés) (Goldberg, 2003). Contrairement aux métabolites primaires, les
métabolites secondaires sont souvent inégalement répartis à travers les groupes
taxonomiques du règne végétal. Parmi les métabolites secondaires, certains sont essentiels à
la vie, les vitamines comme, par exemple les tocophérols. Cependant toutes les vitamines ne
sont pas considérées comme des métabolites secondaires. C’est le cas de l’ascorbate,
l’antioxydant principal chez les plantes et pour l’Homme. D’autres métabolites secondaires
sont des provitamines. Ils sont convertis en vitamines dans l’intestin des animaux. Ainsi, la βcryptoxanthine et le β-carotène, présents chez plusieurs fruits et légumes, sont des
précurseurs de la vitamine A (Fraser et Bramley, 2004; Fraser et al., 2007; Krinsky, 1989).
Les fruits et légumes représentent la principale source de vitamines, et de métabolites
secondaires (Kaur et Kapoor, 2001). Les bénéfices nutritionnels des fruits et des légumes
sont partiellement attribuables à leurs fortes teneurs en vitamines et en composés
secondaires (UNESCO, 2008). En 2008, l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) a estimé
que 63% des décès dans le monde sont dus aux maladies non transmissibles. Parmi ces
maladies non transmissibles, 80% des décès sont dus aux maladies cardiovasculaires, aux
cancers, aux maladies respiratoires et au diabète. Dans un rapport publié conjointement par
l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) et la FAO en 2003, il est recommandé de
consommer au moins 400g, de fruits et légumes journellement (FAO, 2003). Bien que les
bénéfices nutritionnels des fruits et des légumes frais aient été établis depuis longtemps,
leur consommation demeure insuffisante. Dans certains pays, comme la France, malgré le
nombre de campagnes d’informations organisées par le ministère de la santé et les
associations, les quantités de fruits et légumes frais consommées restent inférieures aux
recommandations de la FAO. Dans les pays développés, il peut être intéressant pour les
1
filières de proposer des fruits et des légumes avec des quantités augmentées ou garanties en
micronutriments pour que les consommateurs n’aient pas besoin d’augmenter leur
consommation journalière de fruits et de légumes. De même, les fruits et légumes enrichis
en micronutriments permettraient aux populations des pays en voie de développement
d’avoir une alimentation de meilleure qualité.
Contrairement aux glucides, aux lipides et aux protéines, qui sont hydrolysés en petites
molécules assimilables lors de l’ingestion par l’Homme, les caroténoïdes précurseurs de la
vitamine A (β-carotène, α-carotène et β-cryptoxanthine) sont convertis dans l’intestin en
vitamine A. Les caroténoïdes précurseurs de la vitamine A (β-carotène, α-carotène et βcryptoxanthine) sont des composants essentiels au régime alimentaire humain (Fraser et
Bramley, 2004; Fraser et al., 2007; Krinsky, 1989). La vitamine A est impliquée dans la
synthèse d’hormones, les réponses immunitaires, la régulation de la croissance et la
différenciation cellulaire (Bender, 2003; Combs, 1995). La consommation accrue de fruits et
légumes et un apport supplémentaire en caroténoïdes joueraient un rôle important dans la
prévention de certaines formes de cancers, des maladies cardiovasculaires et de la
dégénérescence maculaire. Par exemple, Miller et al. (2004) ont montré une association
inverse entre la consommation de fruits et le risque de cancer du poumon chez les sujets
non-fumeurs. Un effet protecteur des fruits et légumes sur les cancers des voies aérodigestives supérieures (pharynx, larynx, œsophage,…) a également été observé par Boeing et
al. (2006). De même, les teneurs en lycopène et en caroténoïdes totaux présentes dans le
plasma et le risque de cancer de la prostate ont été corrélés négativement (Key et al., 2004).
La β-cryptoxanthine et la zéaxanthine seraient impliquées en association avec la vitamine C,
le rétinol et l’α-tocophérol, dans la prévention des cancers gastriques et du cancer colorectal
(Jenab et al., 2006). Des études récentes ont montré que le lycopène pourrait avoir des
effets bénéfiques sur certaines lésions malignes dans la cavité buccale et pourrait donc
contribuer à la prévention et au traitement des cancers (Lu et al., 2011). Des études
épidémiologiques ont mis en évidence l’existence d’une corrélation négative entre le taux de
caroténoïdes et l’augmentation du risque de maladies cardiovasculaires (Gaziano et al.,
1995). Une forte concentration en caroténoïdes, et en particulier en zéaxanthine et en
lutéine, est corrélée avec un moindre risque de dégénérescence sénile maculaire (Tavani et
al., 1996).
2
Figure 1: Production d'agrumes (Source FAO).
A : Principales cultures fruitières mondiales ; B : Principales zones de productions des
agrumes dans le monde ; C : Principaux pays producteurs d’agrumes dans le Bassin
Méditerranéen.
3
Du fait de leur concentration et de leur composition en caroténoïdes, les agrumes sont
un modèle d’étude idéal. En effet, les agrumes contiennent de forte concentrations en
caroténoïdes et une grande diversité de caroténoïdes (Gross et al., 1987), dont la βcryptoxanthine qui est une provitamine A. La β-cryptoxanthine et la violaxanthine sont les
principaux caroténoïdes respectivement chez la clémentine et chez l’orange.
II.
Le modèle d’étude : les agrumes
II.1.
Importance économique
En 2009, la production mondiale a été de 124,4 millions de tonnes (Mt). La production
d’agrumes est au 1er rang des productions fruitières devant la banane (95.6 Mt), la pomme
(71,7 Mt), et le raisin (66,9 Mt) (Figure 1A). Cette production est composée à 60% d’oranges,
à 22% de petits agrumes (clémentines et mandarines), à 12% de citrons et à 4% de pomelos.
Le reste de la production correspond à des cultures marginales comme le cédrat et le
kumquat. Plus de la moitié de la production mondiale est destinée à la consommation de
fruits frais, le reste étant transformé (Source FAO).
Les principales zones de production d’agrumes sont la Chine (25 Mt), le Brésil (20,5
Mt), le Bassin Méditerranéen (20 Mt) et les Etats-Unis (10,7 Mt), suivis par le Mexique (7,5
Mt) et l’Inde (7,2 Mt) (Figure 1B). Les productions issues du Brésil et des Etats-Unis sont
principalement destinées à la transformation, tandis que les productions issues de la Chine
et du Bassin Méditerranéen sont avant tout destinées à la consommation de fruits frais.
Au sein du Bassin Méditerranéen, les principaux pays producteurs sont l’Espagne (5,5
Mt), l’Italie (3,6 Mt), la Turquie (2,8 Mt), l’Egypte (2,6 Mt) et le Maroc (1,3 Mt) (Figure 1C)
(Source FAO).
4
II.2.
Origine des agrumes
Figure 2: Origine et dispersion des agrumes d'après Ollitrault et al. (2003).
Les agrumes ont une origine asiatique. Ils sont issus des régions tropicales et
subtropicales du nord-est asiatique, du nord-est de l’Inde, de la péninsule indochinoise et de
l’archipel malais (Nicolosi, 2007). La diffusion des agrumes a eu lieu à travers le monde. Les
conquêtes grecques et romaines en Asie Mineure et au Moyen-Orient ont permis la
dispersion du cédrat. Les croisades et l’expansion de la civilisation islamique, quant à eux,
ont permis de propager les agrumes acides, les échanges commerciaux et la découverte des
nouveaux mondes ont permis l’introduction des orangers (Figure 2). La seule espèce non
originaire d’Asie est le pomelo (Citrus paradisi Macf.) découvert par C. Colomb lorsqu’il est
arrivé dans les Caraïbes. De nos jours, les agrumes sont cultivés dans le monde entier entre
le 40ème parallèle nord et le 40ème parallèle sud.
La première espèce d’agrumes introduite et cultivée dans le Bassin Méditerranéen en
300 av. J.C. est le cédratier (C. medica L.). Le bigaradier (C. aurantium L.) a été introduit par
les Arabes en Afrique depuis l’Inde puis diffusé en Méditerranée. La clémentine est une
espèce récente, caractérisée au XXème siècle, originaire d’Afrique du Nord et issue d’un
5
croisement entre l’oranger doux et le mandarinier. Le bassin méditerranéen est une zone
importante de diversification secondaire pour les orangers (C. sinensis (L.) Osbeck), les petits
fruits d’agrumes: mandariniers et clémentiniers (C. reticulata Blanco et C. clementina Hort.
Ex Tan.), et les citronniers (C. Limon (L.) Burm.).
II.3.
Classification des agrumes
Figure 3: Classification des Aurantioideae d’après Swingle et Reece (1967).
Les agrumes appartiennent à la famille des Rutaceae, l’une des 21 familles composant
l’ordre des Géréniales. Les Rutaceae comprennent 1600 espèces et 150 groupes regroupés
en 7 sous-familles et 12 tribus. Les « agrumes vrais » regroupent 6 genres sexuellement
compatibles de la famille des Rutaceae, de la sous-famille des Aurantioideae, et de la tribu
des Citreae (Figure 3) (Swingle et Reece, 1967).
La majorité des espèces dont les fruits sont consommés appartiennent au genre Citrus.
Le genre Fortunella rassemble deux à sept espèces communément appelées kumquat. Le
genre Poncirus, mono-spécifique, est utilisé comme porte-greffe du fait de ses résistances
aux contraintes biotiques (Praloran, 1971). La classification des agrumes diverge selon les
taxonomistes. Swingle et Reece (1967) ont identifié 16 espèces dont 8 comestibles alors que
Tanaka (1961) a décrit 162 espèces.
6
II.4.
Le fruit
Le fruit d’agrumes est un type spécial de baie appelé « hespéridium ». C’est un fruit
« vrai » né de la croissance et du développement d’un ovaire, composé d’un nombre
variable d’unités, arrangées radialement en carpelles. Un petit fruit secondaire, appelé
« navel », est présent chez certaines espèces (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996).
II.4.1.
Structure du fruit
Les fruits d’agrumes sont composés de deux régions morphologiques distinctes, le
péricarpe communément appelé la peau, et l’endocarpe, qui est la partie comestible du fruit
connue sous le nom de pulpe (Figure 4).
Figure 4: Structure du fruit d'agrumes d'après Praloran (1971).
La peau est composée de l’épicarpe ou flavedo qui est la couche externe colorée, et du
mésocarpe ou albédo qui est la couche interne blanche riche en glandes à huiles essentielles.
Durant les premiers stades du développement du fruit, le flavedo est un tissu vert
photosynthétique (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996). Au cours de la maturation, la
chlorophylle est dégradée et les chloroplastes sont transformés en chromoplastes riches en
caroténoïdes. La pulpe qui est la partie comestible du fruit, est composée de segments qui
sont entourés d’une membrane et remplis de sacs à jus (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996).
7
8
Figure 5: Croissance et développement du fruit d'après Spiegel-Roy et
Goldschmidt (1996) et Tadeo et al. (2008).
II.4.2.
Développement du fruit
La croissance et le développement des fruits suivent une courbe de croissance
sigmoïde typique, divisée en trois phases : la division cellulaire (phase I), le grossissement
cellulaire (phase II) et la maturation des fruits (phase III) (Figure 5A) (Bain, 1958).
La phase initiale, ou phase I, est caractérisée par la division cellulaire et un faible
grossissement cellulaire. Cette phase dure entre cinq et dix semaines après la floraison
(Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996). Par la suite, pendant la période de croissance rapide
(phase II), les fruits subissent une très forte augmentation de la taille par grossissement
cellulaire et accumulent des réserves et de l’eau. Cette période dure de 4 à 6 mois
(Mehouachi et al., 1995). La phase III, également définie comme la période de maturation,
où la croissance ralentit très fortement. L’accumulation des sucres dans les fruits commence
lors de la phase II pour atteindre un maximum au stade de maturité tandis que
l’accumulation des acides organiques atteint son maximum au milieu de la phase II (Figure
5B). Ensuite, une diminution de la quantité d’acide est observée. Les fruits mûrs, sont
caractérisés par une faible acidité (Iglesias et al., 2007). L’accumulation massive de
caroténoïdes est concomitante à la dégradation de la chlorophylle (Figure 5C) (Kato et al.,
2004).
La quantité de caroténoïdes est faible au début du développement des fruits. Au cours
du changement de couleur des fruits (passage de la couleur verte à la couleur orange), on
observe une diminution en carotènes (β-, α-, δ-, et ζ-carotènes) et en β,ε-xanthophylles
(lutéine) et une augmentation de β,β-xanthophylles (β-cryptoxanthine, zéaxanthine et
violaxanthine) (Kato et al., 2004; Rodrigo et al., 2004). A maturité, les petits fruits tels que la
mandarine accumulent préférentiellement de la β-cryptoxanthine (Goodner et al., 2001;
Ikoma et al., 2001) tandis que les oranges accumulent de la violaxanthine (Lee, 2001).
II.5.
Valeur nutritionnelle des fruits
La pulpe des fruits d’agrumes est composée à 85-90% d’eau (Erickson, 1968). A côté
des sucres solubles, des acides organiques dont la vitamine C, des acides aminés, et de la
9
pectine, on trouve des composés secondaires (flavonoïdes, anthocyanes, et caroténoïdes) et
des minéraux (Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996).
Il existe une grande diversité de caroténoïdes chez les agrumes. Leurs concentrations
sont spécifiques des espèces (Tableau 1).
Tableau 1: Composition en caroténoïdes dans la pulpe des fruits d'agrumes exprimée en mg.L-1
d'après Fanciullino et al. (2006).
Citron
Euréka
lutéine
cis-violaxanthine
zéaxanthine
phytoène
β-cryptoxanthine
phytofluène
ζ-carotène
α-carotène
β-carotène
lycopène
caroténoïdes
totaux
Pomelo
Star Ruby
2,130
0,165
0,126
1,711
0,369
2,826
10,072
0,291
17,566
Mandarine
Willowleaf
2,389
0,670
0,682
1,126
10,287
1,267
0,465
0,133
1,781
Orange
Shamouti
1,155
10,581
0,853
0,758
2,694
0,703
0,957
0,091
0,587
22,481
17,790
Clémentine
0,733
3,261
0,830
0,946
9,087
1,265
1,098
0,147
2,434
24,962
La pulpe des agrumes a une composition complexe en caroténoïdes, elle peut contenir
jusqu’à 40 molécules différentes (Rouseff et al., 1996). Les agrumes peuvent être classés en
trois groupes. Le groupe des mandarines, clémentines et oranges, est caractérisé par une
forte concentration en caroténoïdes totaux et notamment en xanthophylles. La βcryptoxanthine est le composant majeur des clémentines et des mandarines tandis que la
cis-violaxanthine s’accumule préférentiellement chez l’orange. Le groupe des citrons et des
limes est caractérisé par une faible concentration en caroténoïdes, tandis que le groupe des
pomelos est riche en lycopène (Fanciullino et al., 2006).
10
Figure 6: Métabolisme des sucres et des acides organiques d’après Buchanan et Balmer (2005) et
Taiz et Zieger (2006).
ALD : aldolase ; ATP-PFK: phosphofructokinase dépendante de l’ATP; CoA-SH : coenzyme A ;
CS : citrate synthase ; HK : hexokinase ; IDH : isocitrate déshydrogénase ; INV : invertase ;
PPi : pyrophosphate ; PPi-PFK: phosphofructokinase dépendante du PPi ; PDH : pyruvate
déshydrogénase ; PK : pyruvate kinase ; SS : saccharose synthase.
11
III.
La qualité des fruits
Chez les agrumes, la qualité des fruits est liée à plusieurs propriétés physiques incluant
la taille, la forme, la couleur, la texture, le nombre de graines, la facilité d’épluchage,… et à
des composés chimiques : sucres, acides, composés aromatiques volatils, vitamine C et
caroténoïdes (Iglesias et al., 2007). Même si l'aspect extérieur des fruits n'est pas
déterminant dans la qualité du fruit, une belle couleur orange est habituellement exigée sauf
chez le pomelo et le citron. Les caroténoïdes, intervenant dans la coloration des fruits, et le
rapport sucres/acidité, essentiel pour le goût représentent les plus importants indicateurs de
la qualité des agrumes. La teneur de ces composés est variable d’une variété à une autre et
selon le stade de développement du fruit (Iglesias et al., 2007). La qualité du fruit est
déterminée pour une grande partie par leur croissance et la charge en fruits, mais également
par les conditions environnementales, l’intensité lumineuse, la température, l’humidité du
sol et les conditions biotiques et abiotiques (Davies et Albrigo, 1994; Iglesias et al., 2008;
Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996). Les caractéristiques les plus appréciées des agrumes
destinés à la transformation sont liés à la qualité interne du fruit qui est une fonction de la
saveur et du goût (Tadeo et al., 2008). La qualité des fruits est propre aux préférences des
consommateurs qui varient considérablement selon les pays.
III.1.
Le métabolisme des sucres et des acides organiques
Les sucres et les acides sont les principaux facteurs déterminants du goût des fruits.
Ainsi, le rapport sucres/acidité est généralement utilisé pour la détermination du stade
optimal de récolte de la plupart des fruits d’agrumes (Loussert, 1989).
La variation des concentrations en sucres et en acides organiques dépend de
l’équilibre entre la synthèse, la dégradation et le stockage des métabolites (Figure 6)
(Ruffner, 1982; Tucker et al., 1993).
Le métabolisme des sucres débute par la formation du saccharose. Le saccharose est
produit dans les cellules du mésophylle des feuilles et exporté vers le phloème pour être
12
transporté dans les organes non photosynthétiques, tels que les sacs à jus présents dans les
fruits d’agrumes (Taiz et Zeiger, 2006).
Dans le cytoplasme des cellules des sacs à jus, le saccharose est hydrolysé en glucose
et fructose via l’action de l’invertase et/ou de la saccharose synthase (une réaction
réversible qui permet également la synthèse dans le cytoplasme du saccharose à partir du
fructose et du glucose). L’hexokinase phosphoryle le glucose et le fructose en glucose-6phosphate et fructose-6-phosphate. Le fructose-6-phosphate sert de substrat aux
phosphofructokinases (ATP et PPi dépendantes) pour former le fructose-1,6-bisphosphate.
Ce dernier est converti en dihydroxyacétone phosphate et en glyceraldehyde-3-phosphate,
le précurseur du phosphoénolpyruvate et du pyruvate. Au niveau du cytoplasme, le
saccharose peut également être re-synthétisé à partir du glucose et du fructose via la
saccharose phosphate synthase, la saccharose phosphatase ou la saccharose synthase (Kubo
et al., 2001; Richardson et al., 1997). Les acides organiques sont synthétisés directement
dans les mitochondries des cellules des sacs à jus (Tucker et al., 1993; Varma et
Ramakrishnan, 1956), dans le cycle de Krebs (acide citrique, malique et succinique) ou
directement dans le cytoplasme (acide ascorbique) (Bogin et Wallace, 1966; Sinclair, 1984;
Tucker et al., 1993).
Le pyruvate et le phosphoénolpyruvate servent de précurseurs à la synthèse des acides
organiques. L’acétyl-CoA est produit à partir du pyruvate via la pyruvate déshydrogénase. La
condensation de l’acétyl-CoA avec l’oxaloacétate permet la formation du citrate. Cette
réaction de condensation est catalysée par la citrate synthase. En fonction des besoins
énergétique de la cellule, le citrate est soit converti dans la mitochondrie en isocitrate, soit
exporté vers le cytoplasme puis, éventuellement vers la vacuole pour y être stocké (Chen et
Gadal, 1990).
III.2.
Le métabolisme des caroténoïdes
Les caroténoïdes forment l’une des plus importantes classe de pigments des plantes et
jouent un rôle crucial dans la définition des paramètres de la qualité des fruits et des
légumes (Van den Berg et al., 2000).
13
III.2.1. Structure des caroténoïdes
La structure basique des caroténoïdes est un squelette terpénique symétrique formé
par la conjugaison de deux unités composées de 20 atomes de carbone (Van den Berg et al.,
2000).
Figure 7: Les caroténoïdes
Tous les caroténoïdes dérivent d’une molécule acyclique, C40H56. Ils contiennent un
système de double liaisons qui influence leurs propriétés physiques, biochimiques et
chimiques (Van den Berg et al., 2000). Les caroténoïdes sont sous-divisés en deux groupes
du fait de leur composition (Figure 7). Les carotènes, tels que le β-carotène, l’α-carotène ou
encore le lycopène, sont composés d’atomes de carbone et d’hydrogène. Les xanthophylles,
telles que la β-cryptoxanthine, la violaxanthine ou la lutéine contiennent au moins un
groupement hydroxyle (Van den Berg et al., 2000). Les doubles liaisons peuvent exister sous
14
Figure 8: Structure fine des caroténoïdes d’après Britton (1995).
%III/II : rapport de la hauteur des pics III et II.
15
deux configurations, cis ou trans (E/Z). Dans leur état naturel, les caroténoïdes se trouvent
sous la forme trans (Van den Berg et al., 2000). Les caroténoïdes avec un système étendu de
doubles liaisons en configuration trans sont des molécules linéaires, contrairement aux
caroténoïdes en configuration cis qui ne sont pas linéaires, ce qui affecte leur
positionnement dans les structures cellulaires (Van den Berg et al., 2000). Les caroténoïdes
sont des composés lipophiles. Les carotènes sont solubles dans l’hexane, l’éther de pétrole
et le toluène. Les xanthophylles sont solubles dans l’éthanol et le méthanol (Britton, 1995).
Les xanthophylles sont souvent estérifiés ce qui les rend plus hydrophobes.
III.2.2. Caractéristiques des caroténoïdes
Du fait de leurs longues chaines de doubles liaisons polyinsaturés, le spectre
d’absorption des caroténoïdes se situe dans le visible et l’UV (Britton, 1995). Ils ont une
couleur perceptible (jaune, orange et rouge) lorsqu’ils possèdent au moins sept doubles
liaisons conjuguées et qu’ils absorbent dans le visible (Rodriguez-Amaya, 1999). Les
caroténoïdes absorbent l’énergie à trois longueurs d’onde différentes et le maximum
d’absorption dépend du nombre de doubles liaisons conjuguées. Il se situe entre 290 nm
pour le phytoène et 470 nm pour le lycopène. Le spectre des caroténoïdes est
caractéristique pour chacun des caroténoïdes et peut être utilisé pour une identification
spécifique. La longueur d’onde maximale d’absorption et la structure fine du spectre
fournissent des informations structurales sur le chromophore de la molécule (Britton, 1995).
La structure fine du spectre est exprimée comme un rapport de la hauteur des pics III et II
(%III/II). Le pic III représente la longueur d’onde maximale et le pic II représente l’absorbance
maximale (Figure 8).
L’intensité de l’absorption est l’indicateur de la structure et de la concentration des
caroténoïdes dans l’échantillon (Britton, 1995). Les isomères cis montrent une bande
d’absorption additionnelle autour de 320-360 nm. L’intensité de cette bande dépend de la
localisation de la liaison cis avec la molécule (Van den Berg et al., 2000).
Du fait de la présence de doubles liaisons, les caroténoïdes contiennent un système
réactif riche en électrons qui est susceptible de réagir avec des composés électrophiles. En
16
Figure 9: Représentation de la transition chloroplaste-chromoplaste d'après Egea et al. (2010).
Le schéma montre la rupture des granules d’amidon (1) et celle des thylakoïdes et des grana (2) ; la
synthèse de nouvelles structures membranaires depuis la membrane interne de l’enveloppe (3)
menant à la formation de sacs membraneux riches en caroténoïdes (4) ; l’augmentation du nombre
et de la taille des plastoglobules (5) ; l’aspect des cristalloïdes contenant des caroténoïdes (6) ; et
l’augmentation du nombre de saillies émanant de l’enveloppe des plastes appelées stromule (7).
17
présence d’oxygène, les caroténoïdes ont tendance à s’auto-oxyder. La réaction des
caroténoïdes avec des agents oxydants ou des radicaux libres dépend de la longueur de la
chaine carbonée polyinsaturée et de la nature du groupe terminal (groupement hydroxyle,
cycle β, cycle ε,…) (Van den Berg et al., 2000).
III.2.3. Localisation et stockage des caroténoïdes
Les caroténoïdes s’accumulent dans les plastes, et plus particulièrement dans les
plastoglobules. Les plastoglobules sont des structures lipidiques (Ytterberg et al., 2006)
contenant des protéines spécifiques (Austin et al., 2006). Bien que tous les plastes
contiennent des caroténoïdes, les caroténoïdes se retrouvent principalement dans les
chloroplastes et les chromoplastes (Giuliano et al., 2003; Vishnevetsky et al., 1999).
Dans les chloroplastes, la plupart des plastoglobules (95%) sont couplés à la membrane
des thylakoïdes. Le reste des plastoglobules (5%) est organisé en petits groupes de 2 ou 3
plastoglobules interconnectés. En condition de stress photooxydatif, le nombre de
plastoglobules augmente et ils s’organisent en amas plus grands, contenant au moins 7
plastoglobules liés ensemble. Il y a formation d’agrégats linéaires et de structures ramifiées
(Austin et al., 2006). Les plastoglobules des chloroplastes contiennent une faible quantité de
chlorophylles et de caroténoïdes (Ytterberg et al., 2006). Leurs concentrations augmentent
en conditions de stress (Deruere et al., 1994). Dans les tissus verts, en conditions normales,
les caroténoïdes se retrouvent principalement dans les membranes photosynthétiques en
association avec les antennes collectrices et les complexes réactionnels des photosystèmes I
et II (Cunningham et Gantt, 1998). Les xanthophylles sont les caroténoïdes qui dominent
dans les antennes collectrices (Croce et al., 2002; Kuhlbrandt, 1994; Lee et Thornber, 1995).
Durant le processus impliquant la conversion des chloroplastes en chromoplastes, les
membranes des thylakoïdes se désintègrent, la chlorophylle et la plupart des composants de
la machinerie photosynthétique disparaissent, et il y a une accumulation massive de
plastoglobules et de caroténoïdes (Figure 9) (Egea et al., 2010).
18
Dans les chromoplastes, en l’absence de chlorophylles, les caroténoïdes sont
responsables des couleurs jaune, orange et rouge, des fleurs et des fruits (Vishnevetsky et
al., 1999). Dans les chromoplastes, les caroténoïdes peuvent se situer dans les membranes,
dans les plastoglobules ou d’autres structures lipoprotéiques du stroma (Cunningham et
Gantt, 1998). Quand les caroténoïdes sont produits en excès, ils s’accumulent et sont
stockés dans des structures lipoprotéiques spécifiques (Deruere et al., 1994; Vishnevetsky et
al., 1999). Ces structures peuvent être de type fibrillaire, globulaire, réticulo-tubulaire,
membranaire ou cristalloïde en fonction des caroténoïdes contenus dans les infrastructures
(Deruere et al., 1994). Par exemple, les structures globulaires ou plastoglobules, présentes
chez la mangue et le poivron, contiennent des teneurs importantes en cis-β-carotène
contrairement aux structures cristalloïdes, présentes chez la tomate et la carotte, qui
contiennent de grandes quantités en caroténoïdes sous forme trans (carotènes et lycopène).
Plusieurs types de chromoplastes peuvent coexister dans le même organe (Egea et al.,
2010). Dans les chromoplastes fibrillaires, la protéine fibrilline est nécessaire pour
l’assemblage et le stockage des caroténoïdes (Deruere et al., 1994). Chez les agrumes, lors
de la transformation des chloroplastes en chromoplastes, un changement dans le profil des
caroténoïdes est observé, avec une augmentation massive de xanthophylles et une
accumulation de plastoglobules (Huyskens et al., 1985).
III.2.4. Rôles des caroténoïdes dans la plante
Dans les chloroplastes, les pigments caroténoïdes sont présents dans tous les organes
photosynthétiques où leur couleur est généralement masquée par celle de la chlorophylle
(Granado et al., 1992).
Les caroténoïdes des plantes, tels que l’α-carotène, le β-carotène, le lycopène, les
xanthophylles, sont des pigments solubles de couleur jaune, orange et rouge (Van den Berg
et al., 2000). Certains caroténoïdes, comme le lycopène et les β-carotènes, confèrent leur
couleur aux fleurs et aux fruits dans lesquels ils s’accumulent (Bartley et Scolnik, 1995). Leur
principale fonction au sein des chromoplastes est d’être attractif pour les animaux et ainsi
aider à la pollinisation et à la dispersion des graines (Chen et al., 1998).
19
Les caroténoïdes sont également des composants essentiels de la membrane
photosynthétique (Cunningham et Gantt, 1998). Ils jouent un rôle important dans
l’assemblement des photosystèmes, dans la collecte de la lumière et dans la
photoprotection des photosystèmes (Havaux, 1998).
Dans les antennes collectrices de lumière, ils absorbent la lumière bleue-verte et
transfèrent l’énergie aux chlorophylles, étendant ainsi la gamme de longueurs d’onde
absorbées et l’efficience photosynthétique (Frank et Cogdell, 1996). Leur maximum
d’absorption dépend du nombre de doubles liaisons. Il est compris en 400 et 500 nm (Figure
10) (Van den Berg et al., 2000).
Figure 10: Spectres d'absorption de la chlorophylle a, de la chlorophylle b, des
carotènes et des xanthophylles pour les différentes longueurs d’onde.
La lumière est nécessaire à la photosynthèse mais les plantes ont besoin de protection
contre la lumière lorsque cette dernière est en excès. La photosynthèse génère
inévitablement des intermédiaires hautement réactifs qui peuvent provoquer des
dommages oxydatifs à l’appareil photosynthétique. Si les dommages photooxydatifs ne sont
20
pas réparés, une diminution de l’efficacité et/ou du taux maximum de photosynthèse,
appelé photo-inhibition est observée (Niyogi, 1999).
La première façon d’évacuer l’énergie est de la transférer pour la photosynthèse. Ce
processus est appelé « Quenching photochimique ». Quand l’énergie emmagasinée dans les
molécules de chlorophylles excitées est rapidement dissipée à travers le transfert de
l’excitation, le statut excité est dit atténué (Demmig-Adams et Adams, 1996).
Si ce n’est pas le cas, les molécules de chlorophylles excitées peuvent réagir avec des
molécules d’oxygène et former une forme excitée de l’oxygène appelée l’oxygène singulet
1
O2 (Demmig-Adams et Adams, 1996).
Les caroténoïdes, comme le β-carotène, peuvent exercer une action photo-protective
par atténuation des molécules de chlorophylles excitées. Les caroténoïdes excités n’ont pas
assez d’énergie pour former de l’oxygène singulet. Ils reviennent à leur état de base en
perdant progressivement leur excitation sous forme de chaleur.
Les caroténoïdes jouent également un rôle vital de photo-protection de la machinerie
photosynthétique par élimination directe de l’oxygène singulet (Collins, 2001; Griffith et al.,
1955).
Plus récemment, il a été démontré que les xanthophylles atténuent l’état excité de la
chlorophylle singulet dans le photosystème II lorsque ce dernier est soumis à des radiations
excessives (Muller et al., 2001; Robert et al., 2004). Ce processus appelé « Non
Photochemical Quenching » (NPQ), permet aux plantes de s’acclimater à des niveaux
variables de lumière tout en empêchant les dommages dus à la lumière (Demmig-Adams et
21
Adams, 1996; Horton et al., 1996; Kulheim et al., 2002). L’activation et la régulation du NPQ
sont liées à un processus enzymatique rapide et réversible, connu sous le nom de cycle des
xanthophylles. Le cycle des xanthophylles est localisé dans les chloroplastes, et plus
précisément dans l’espace transmembranaire des thylakoïdes (Hieber et al., 2000). En
présence de forte lumière, d’une diminution du pH dans le lumen des thylakoïdes, et en
présence d’ascorbate, la violaxanthine dé-époxydase (VDE) est activée (Hieber et al., 2000).
La VDE convertit la violaxanthine en anthéraxanthine, et ensuite en zéaxanthine (Kulheim et
al., 2002) (Figure 11A). Dans les feuilles de la pervenche (Vinca minor L.), cultivées à la
lumière, par rapport à celle de feuilles de plantes cultivées à l’ombre, la concentration en
violaxanthine diminue de 77% et les concentrations en anthéraxanthine et zéaxanthine
augmentent respectivement de 56% et 22% (Figure 11B) (Demmig-Adams et Adams, 1996).
Figure 11 : Cycle des xanthophylles (A) et répartition des xanthophylles au cours du cycle (B)
d’après Demmig-Adams et Adams (1996).
DHA : déshydroascrobate ; ZEP : zéaxanthine époxydase ; VDE : violaxanthine dé-époxydase ;
A : anthéraxanthine ; V : violaxanthine ; Z : zéaxanthine.
22
La zéaxanthine permet la dissipation de l’énergie accumulée en excès par les chlorophylles.
L’énergie accumulée par la zéaxanthine est ensuite dissipée sous forme de chaleur (DemmigAdams et al., 1996).
Quand l’intensité lumineuse diminue, le procédé est inversé. La présence de NADPH,
d’oxygène et l’alcalinisation du lumen activent la zéaxanthine époxydase. La zéaxanthine est
convertie en violaxanthine via l’anthéraxanthine (Gilmore et al., 1994).
Chez les plantes, les xanthophylles sont également les précurseurs de l’acide
abscissique, une phytohormone, qui module les processus de développement et la réponse
aux stress abiotiques (Chernys et Zeevaart, 2000; Nambara et Marion-Poll, 2005).
III.2.1. La voie de biosynthèse des précurseurs
La voie de biosynthèse des caroténoïdes peut être divisée en trois phases. La phase I
inclut la formation de l’isopentényle pyrophosphate (IPP) et du diméthyallyle pyrophosphate
(DMAPP). Chez les plantes, deux voies distinctes sont utilisées pour la synthèse de ces
intermédiaires en C5 : la voie cytosolique du mévalonate (MVA) et la voie plastidiale du
méthylérythritol phosphate (MEP). Les deux voies métaboliques sont séparées par leur
localisation et fournissent de l’IPP et du DMAPP pour la biosynthèse de leurs propres
isoprénoïdes. Cependant des échanges d’une faible fraction de ces précurseurs entre les
deux voies ont été observées (Laule et al., 2003). Seule la voie plastidiale du MEP permet la
biosynthèse des caroténoïdes. La phase II commence avec l’isomérisation de l’IPP en
DMAPP. Les deux composés, IPP et DMAPP, serviront de précurseurs pour les réactions de
condensation afin de former le géranyle pyrophosphate (GPP, C10), le géranyle-géranyle
pyrophosphate (GGPP, C20), puis le phytoène (C40). Dans la phase III, le phytoène subit une
série de réactions afin de produire différents caroténoïdes.
23
III.2.1.1. La biosynthèse des précurseurs : le diméthyallyle et le
pyrophosphate et l’isopentényle pyrophosphate
Figure 12: Biosynthèse des précurseurs d'après Cheng et al. (2007), Enfissi et al. (2005), et
Rodriguez-Concepcion et Boronat (2002).
DMAPP : diméthyallyle pyrophosphate ; DX5P : 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate ; FPP : farnésyle
pyrophosphate ; IPP : isopentényle pyrophosphate ; GPP : géranyle pyrophosphate ; GGPP : géranylegéranyle pyrophosphate ; HMG-CoA : 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA ; 3-PGA : glycéraldéhyde-3phosphate. La flèche orange représente une possibilité d’échanges entre les précurseurs des deux
voies.
La voie cytosolique du mévalonate (MVA) fournit les précurseurs pour la synthèse de
certains séquisterpènes, des stérols et pour la chaine latérale de l’ubiquinone (Cheng et al.,
2007; Enfissi et al., 2005; Laule et al., 2003) (Figure 12). La voie plastidiale du
méthylérythritol phosphate (MEP) est utilisée pour la synthèse des précurseurs de la
biosynthèse des isoprènes, des mono-terpènes, de certains séquisterpènes, des di-terpènes,
des caroténoïdes, et de la chaine latérale des tocophérols, des phylloquinones et des
chlorophylles (Cheng et al., 2007; Lange et Ghassemian, 2003) (Figure 12).
24
III.2.1.1.1. La voie du mévalonate
La voie du mévalonate a été caractérisée dans les années 1950 (Fraser et Bramley,
2004) (Figure 13).
Figure 13: Voie du mévalonate d’après Rodriguez-Conception et Boronat (2002).
HMGS : 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA synthase ; HMG-CoA Réductase : 3hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA réductase ; MVK : mévalonate kinase ; PMK :
diphospho-mévalonate kinase ; PMD : mévalonate diphosphate.
Elle débute par la condensation de deux molécules d’acétyl-CoA pour produire
l’acétoacétyl-CoA. Cette réaction est catalysée par la thiolase (Goldstein et Brown, 1990;
McGarvey et Croteau, 1995). Un troisième acétyl-CoA est condensé, par l’action de la 3hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA synthase (HMGS) à l’acétoacétyl-CoA pour former le 3hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA (HMG-CoA) (Hunter, 2007). Ce dernier est ensuite convertit
par l’enzyme HMG-CoA réductase (HMGR) en mévalonate (Hunter, 2007). Le mévalonate est
phosphorylé en mévalonate-5-diphosphate (MVPP) par l’intermédiaire du mévalonate-5phosphate (MVP) (Hunter, 2007). Cette étape est ATP dépendante et requiert deux
enzymes : la mévalonate kinase (MVK) et la diphospho-mévalonate kinase (PMK) (Hunter,
2007). Le MVPP est décarboxylé par la mévalonate diphosphate (PMD) pour former un
réservoir d’isopentényle pyrophosphate (IPP) (Hunter, 2007).
25
III.2.1.1.2. La voie du méthylérythritol phosphate
Dans les années 1990, une voie alternative a été décrite (Fraser et Bramley, 2004) : la
voie du méthylérithritol phosphate. Cette voie se déroule dans les plastes (RodriguezConcepcion et Boronat, 2002; Rohdich et al., 2001; Rohmer, 1999) (Figure 14).
Figure 14: Voie du méthylérythritol phosphate d'après Rodriguez-Conception et Boronat (2002).
CMK : 4-(cytidine-5’-diphospho)-2-C-méthyl-D-érythritol kinase ; CMT : 2-C-méthyl-D-érythritol-4phosphate-cytidyl-transférase ; CTP : cytidine triphosphate ; DXPS : 1-désoxy-D-xylulose-5-phosphate
synthase ; DXR : 1-désoxy-D-xylulose-5-phosphate réductase ; HDR : 1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)butényl-4-phosphate réductase ; HDS : 1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)-butényl-4-phosphate synthase ;
IDS : isopentényle pyrophosphate isomérase ; MCS : 2-C-méthyl-D-érythritol-2,4-cyclodiphosphate ;
TPP : thiamine pyrophosphate ;.
Elle débute avec la condensation du pyruvate et du glycéraldéhyde-3-phosphate pour
produire le 1-désoxy-D-xylulose-5-phosphate (DX5P) qui est catalysée par la 1-désoxy-Dxylulose-5-phosphate synthase (DXS) en utilisant la thiamine pyrophosphate comme cofacteur (Hunter, 2007). La 1-désoxy-D-xylulose-5-phosphate réductase (DXR) convertit le
DX5P en 2-C-méthyl-D-érythritol-4-phosphate (MEP) (Hunter, 2007). Le MEP est converti en
IPP et DMAPP via quatre intermédiaires (Hunter, 2007).
26
<
Figure 15: Voie de biosynthèse des caroténoïdes
27
La conversion du 1-hydroxy-2-méthyl-2-(E)-butényl-4-phosphate (HMBPP) en un mélange
5:1 d’IPP et de DMAPP est catalysée par l’isopentényle-pyrophosphate (IDS), également
appelée IPP/DMAPP synthase. L’IPP isomérase catalyse l’isomérisation réversible de l’IPP en
DMAPP, son isomère allélique (Cunningham et Gantt, 1998; Fraser et Bramley, 2004).
III.2.1.2. La biosynthèse du phytoène
La formation de la molécule de géranyle-géranyle pyrophosphate (GGPP ; C20),
précurseur intermédiaire de la biosynthèse des caroténoïdes, est obtenue par l’addition
linéaire de trois molécules d’IPP à une molécule de DMAPP (Cunningham et Gantt, 1998) par
la GGPP synthase (GGPS) (Fraser et Bramley, 2004; McGarvey et Croteau, 1995). La
formation du phytoène, molécule symétrique en C40, est la première réaction spécifique de
la voie de biosynthèse des caroténoïdes (Cunningham et Gantt, 1998). C’est une réaction qui
est catalysée par la phytoène synthase (PSY) (Cunningham et Gantt, 1998).
III.2.2. La biosynthèse des caroténoïdes
Les caroténoïdes sont synthétisés dans les plastes mais les gènes codant pour les
enzymes sont nucléaires (Taylor et Ramsay, 2005). Les enzymes impliquées dans la voie de
biosynthèse sont intégrées ou associées à la membrane (Sandmann, 2001). La voie de
biosynthèse des caroténoïdes peut être divisée (Figure 15) en trois grands groupes de
réactions : la formation du lycopène par des réactions de déshydrogénation, la cyclisation
des caroténoïdes et la formation des xanthophylles.
III.2.2.1. Les réactions de déshydrogénation
Chez les plantes supérieures, le phytoène existe de façon prédominante sous la forme
cis (Fraser et Bramley, 2004). Le phytoène subit une série de quatre réactions de
désaturation, qui permettent la formation du phytofluène, du ζ-carotène, du neurosporène
et du lycopène (Cunningham et Gantt, 1998). Ces réactions de désaturation servent à
allonger la série de double liaisons qui constitue le chromophore des caroténoïdes, et qui
transforme le phytoène non coloré au lycopène de couleur rouge (Cunningham et Gantt,
1998). Les quatre réactions de désaturation sont catalysées par deux enzymes : la phytoène
28
désaturase (PDS) et la ζ-carotène désaturase (ZDS) (Cunningham et Gantt, 1998). La PDS et la
ZDS requièrent du FAD (flavine adénine diphosphate) et des plastoquinones oxydées pour
transférer les électrons (Fraser et Bramley, 2004; Lopez et al., 2008).
Les plastoquinones sont ensuite réoxydées par une plastoquinone oxydase (PTOX), en
utilisant une molécule d’oxygène comme accepteur final d’électrons (Barr et al., 2004; Carol
et Kuntz, 2001; Josse et al., 2000; Scolnik et al., 1987). Les plastoquinones sont sous forme
oxydées pour pouvoir accepter l’électron produit lors de la synthèse du ζ-carotène et du
lycopène. La plastoquinone réduite (PQH2) peut être réoxydée par le photosystème I ou la
plastoquinone oxydase plastidiale (PTOX) qui est co-exprimée avec la PDS et la ZDS (Joet et
al., 2002; Josse et al., 2000).
III.2.2.2. Les réactions de cyclisation
Le lycopène est majoritairement présent sous la forme trans chez les plantes (Fraser et
Bramley, 2004). La formation de cycles terminaux est initiée par l’attaque d’un proton au
niveau de la double liaison en position C1-C2 (C1’-C2’) (Fraser et Bramley, 2004).
A partir du lycopène, deux voies distinctes conduisent à la formation de carotènes bicycliques : l’une produisant du β-carotène et l’autre l’α-carotène. Dans la première voie, la
lycopène β-cyclase (LCY-β) catalyse la formation du β-carotène bi-cyclique à partir du
lycopène. L’ajout des deux cycles se réalise en deux étapes, et par l’intermédiaire du γcarotène (Cunningham et Gantt, 1998). Les cycles ε, sont également commun chez les
plantes (Cunningham et Gantt, 1998). Dans la seconde voie, l’addition d’un cycle ε à la
molécule de lycopène, catalysée par la lycopène ε-cyclase (LCY-ε), forme le δ-carotène. Puis,
29
l’addition d’un cycle β forme l’α-carotène. Cette étape est catalysée par la lycopène βcyclase (LCY-β) (Cunningham et Gantt, 1998).
III.2.2.3. La formation des xanthophylles
Les xanthophylles (caroténoïdes oxygénés) comprennent la plupart des caroténoïdes
présents dans la membrane des thylakoïdes (Cunningham et Gantt, 1998). Chez les plantes
supérieures, les xanthophylles sont formés par hydroxylation réalisée dans les cycles ε et β
en position C3 et C3’, de l’ α-carotène et du β-carotène respectivement (Cunningham et
Gantt, 1998; Fraser et Bramley, 2004).
Dans la première voie, la lutéine est formée par l’introduction de groupements
hydroxyles dans les cycles β et ε au cours de réactions catalysées par la β-carotène
hydroxylase (β-HY) et la ε-carotène hydroxylase (ε-HY), respectivement. L’intermédiaire
formé est la zéinoxanthine (Fraser et Bramley, 2004).
Dans la deuxième voie, l’introduction de groupement hydroxyle dans les cycles β est
catalysée par la β-carotène hydroxylase (β-HY). Deux réactions d’hydroxylation sont
nécessaires pour former la zéaxanthine avec la β-cryptoxanthine comme intermédiaire
(Fraser et Bramley, 2004). La violaxanthine est formée à partir de la zéaxanthine par
l’introduction de groupes époxy en position 5,6 dans les cycles β (Fraser et Bramley, 2004).
La formation de la violaxanthine, est catalysée par la zéaxanthine époxydase (ZEP) (Hieber et
al., 2000), via l’anthéraxanthine. Cette réaction est réversible chez les feuilles (Hirschberg,
2001). La dernière étape de la voie de biosynthèse des caroténoïdes est la formation de la
néoxanthine à partir de la violaxanthine. Cette réaction est catalysée par la néoxanthine
synthase (NSY) (Fraser et Bramley, 2004).
III.2.3. La dégradation des caroténoïdes
Les dioxygénases constituent une famille d’enzymes répandues qui permettent le
clivage des doubles liaisons pour former des molécules qui possèdent le même squelette
carboné que les caroténoïdes (Schwartz et al., 2001). Chez les plantes, ces enzymes
30
appartiennent à deux familles, les dioxygénases clivant les 9-cis-époxycaroténoïdes (NCED)
et les dioxygénases clivant les caroténoïdes (CDD) (Schwartz et al., 2001).
III.2.3.1. Formation de l’acide abscissique
L’acide abscissique (ABA) est une phytohormone impliquée dans différents processus
physiologiques chez les plantes. Elle joue également un rôle important dans le
développement végétatif en réponse à divers stress environnementaux tels que les
conditions de sécheresse et de forte salinité (Seo et Koshiba, 2002).
Le clivage de la 9-cis-violaxanthine ou de la 9’-cis-néoxanthine, par les NCEDs, se fait au
niveau de la double liaison C11-C12 (Rodrigo et al., 2006), pour former un époxyapocaroténale en C25 et la xanthoxine en C15 (Figure 16) (Kato et al., 2006). La xanthoxine
est convertie en un aldéhyde d’acide abscissique par une série de trois modifications au
niveau du cycle (Liotenberg et al., 1999).
Figure 16: Voie de biosynthèse de l'acide abscissique d'après Han
et al. (2004).
NCED : dioxygénase clivant les 9-cis-époxycaroténoïdes ; NSY :
néoxanthine synthase ; ZEP : zéaxanthine époxydase.
31
Les NCED ont été identifiées chez de nombreuses espèces, telles que le maïs (Schwartz
et al., 1997), le haricot (Qin et Zeevaart, 1999), l’avocat (Chernys et Zeevaart, 2000),
Arabidopsis thaliana (Iuchi et al., 2001; Tan et al., 2003), et les agrumes (Kato et al., 2006).
III.2.3.2. Formation des autres apocaroténoïdes
Chez les plantes, les apocaroténoïdes se situent en grande partie dans la membrane
des thylakoïdes (Kloer et Schulz, 2006) et peuvent jouer des fonctions biologiques
importantes dans la croissance et le développement des plantes ainsi que dans la couleur, la
saveur et les arômes des fruits et légumes et des plantes ornementales (Ohmiya, 2009).
Les apocaroténoïdes sont issus du clivage d’une grande variété de carotènes et de
xanthophylles par les enzymes appartenant à la famille des CDD. Il existe 4 sous-familles :
CDD1, CDD4, CDD7, et CDD8.
Les CDD1 clivent de nombreux substrats, tous les carotènes sous forme trans (βcarotène, zéaxanthine et lycopène) (Auldridge et al., 2006; Bouvier et al., 2005a; Giuliano et
al., 2003), les apocaroténales (Schmidt et al., 2006; Vogel et al., 2008) et les apolycopénales
(Ilg et al., 2009), en position C9-C10 (C9’-C10’) pour former deux cétones (C13) et un
dialdéhyde (C14). Les produits formés dépendent du substrat (Schwartz et al., 2001). Les
CDD1 peuvent également cliver, en position C5-C6 (C5’-C6’) du lycopène, chez Arabidopsis
thaliana, pour former un composé volatile (Vogel et al., 2008), et en position C7-C8, chez le
riz, pour former du géraniale (Ilg et al., 2009).
L’enzyme CDD4 permet le clivage du β-carotène, chez E. coli en position C9-C10 (C9’C10’), pour former la β-ionone (Huang et al., 2009; Rubio et al., 2008). Elle peut également
cliver la zéaxanthine en position C7-C8 (C7’-C8’) chez le crocus (Bouvier et al., 2003), et le
lycopène en position C5-C6 (C5’-C6’) chez Bixa orellana (Ohmiya, 2009).
Les enzymes CDD7 catalysent le clivage du β-carotène, en position C9-C10, pour
produire un aldéhyde (C27), le 10’-apo-β-caroténale et la β-ionone. L’aldéhyde formé est
clivé par la CDD8, en position C13-C14 pour donner le 13-apo-β-caroténone (Schwartz et al.,
2004).
32
Figure 17: La régulation de la voie de biosynthèse des précurseurs.
Les flèches rouges représentent les enzymes flux-déterminantes et flux-limitantes, les flèches
jaunes une régulation par la lumière, les flèches vertes le rétrocontrôle négatif et les flèches
rouges le rétrocontrôle positif.
33
III.2.4. La régulation de la voie de biosynthèse
La régulation de la voie de biosynthèse des caroténoïdes est complexe et se produit à
différents niveaux (Taylor et Ramsay, 2005) (Figure 17).
III.2.4.1. Régulation transcriptionnelle
Plusieurs étapes de la voie du méthylérythritol-phosphate (MEP) et de la voie de
biosynthèse des caroténoïdes sont connues pour être des étapes régulant l’accumulation
des caroténoïdes.
III.2.4.1.1. Régulation au niveau de la voie du
méthylérythritol phosphate
Dans la voie du MEP, deux enzymes permettent la régulation de la synthèse des
précurseurs, IPP et DMAPP, nécessaires à la biosynthèse des caroténoïdes : la 1-déoxy-Dxylulose-5-phosphate synthase (DXPS), et la 1-déoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXR)
(Botella-Pavia et al., 2004; Carretero-Paulet et al., 2006) (Figure 17).
La DXPS qui contrôle la première réaction dans la voie de biosynthèse de MEP est une
enzyme flux-déterminante, c’est-à-dire qu’elle module plus ou moins le flux de la voie de
biosynthèse. L’analyse de l’expression de DXPS, chez plusieurs espèces, lors de
l’accumulation des isoprénoïdes terminaux suggère que l’augmentation des niveaux en DXPS
est indispensable pour fournir les précurseurs nécessaires (Botella-Pavia et al., 2004; Bouvier
et al., 1998; Chahed et al., 2000; Estevez et al., 2001; Lois et al., 2000; Veau et al., 2000).
La DXR est une enzyme flux-limitante, c’est-à-dire qu’elle peut stopper le flux de la voie
de biosynthèse. Chez Arabidopsis thaliana, l’augmentation de l’expression de la DXR
entraîne une augmentation de l’accumulation de chlorophylles et de caroténoïdes
(Carretero-Paulet et al., 2006). Par contre, il n’existe pas de corrélation entre les niveaux de
DXR et l’accumulation des caroténoïdes dans les chromoplastes lors de la maturation chez la
34
Figure 18: La régulation de la voie de biosynthèse des caroténoïdes.
Les flèches rouges représentent les enzymes flux-déterminantes et flux-limitantes, les
flèches jaunes une régulation par la lumière, et les flèches vertes un rétrocontrôle
négatif. Les enzymes notées en vert indiquent qu’elles requièrent un rapport PQ/PQH2
élevé.
35
tomate (Rodriguez-Concepcion et Boronat, 2002). Ces observations suggèrent que la DXR ne
serait plus une étape limitante après la transformation des chloroplastes en chromoplastes.
Lois et al. (2000) ont montré qu’il existe une corrélation entre l’expression des gènes
Psy et Dxps dans les fruits de tomate. L’augmentation des niveaux d’expression de Dxps
induit une augmentation de l’expression de la Psy et une augmentation de la quantité de
caroténoïdes.
III.2.4.1.2. Les étapes clés de la voie de biosynthèse des
caroténoïdes
Plusieurs étapes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes sont connues pour être
des étapes régulatrices (Figure 18).
La PSY est une enzyme flux-déterminante (Cazzonelli et Pogson, 2010; Romer et al.,
2000; Shewmaker et al., 1999; Stalberg et al., 2003) et le principal contrôle de la voie en aval
de la GGPP (coefficient de contrôle du flux = 0,36) (Fraser et al., 2002). L’augmentation de
l’expression de la Psy chez les bactéries et les plantules transgéniques d’Arabidopsis thaliana
a montré une augmentation de la concentration en caroténoïdes (Shewmaker et al., 1999;
Stalberg et al., 2003). De plus elle réagit aux facteurs environnementaux (Cazzonelli et
Pogson, 2010).
De même, de nombreuses études indiquent que les étapes de biosynthèse des
caroténoïdes catalysées par la PDS (coefficient de contrôle du flux = 0,1), LCY-β ou HY-β
peuvent être des étapes limitantes. L’augmentation de l’expression de Pds, par addition de
copie du gène chez E. coli induit une augmentation de l’accumulation de caroténoïdes
(Kajiwara et al., 1997). L’augmentation de l’expression de la Lcy-β résulte également en une
augmentation des niveaux en caroténoïdes totaux (Ronen et al., 2000; Rosati et al., 2000).
L’enzyme HY-β joue également un rôle crucial dans la régulation. Chez Arabidopsis thaliana,
trois gènes sont impliqués, Chy1, Chy2 et P450. Un mutant chy1chy2, inhibant l’expression
de ces gènes, montre une augmentation en caroténoïdes totaux, en β-carotène, en
36
violaxanthine et en phytoène mais une diminution en zéaxanthine (Fiore et al., 2006). De la
même façon, l’augmentation de l’expression de la Hy-β chez Arabidopsis thaliana résulte en
la conversion de β-carotène en xanthophylles (Du et al., 2010). Chez les tubercules de
pomme de terre, l’augmentation de l’expression de la Psy, de la Pds, de la Zds, de la Crtiso et
de la Lcy- β ou l’étude des mutants chy1, chy2, lut5 (β-HY) et lcy-β amènent à l’accumulation
de β-carotène (Diretto et al., 2010; Diretto et al., 2006).
III.2.4.2. Rôle de la lumière
La lumière a un rôle régulateur dans la biosynthèse des caroténoïdes chez les plantes
(Giuliano et al., 2003; Von Lintig et al., 1997; Welsch et al., 2000; Welsch et al., 2003;
Woitsch et Romer, 2003). Alba et al. (2000) ont montré que les phytochromes transmettent
le signal lumineux requis pour la pigmentation des fruits lors de la maturation. Chez la
tomate, les mutants hp1 et hp2 caractérisés par une augmentation de la concentration en
caroténoïdes, sont hypersensibles à la lumière (Peters et al., 1989). De même les niveaux
d’ARNm du gène Psy sont plus élevés dans les feuilles de tomate (Giuliano et al., 2003) et
d’Arabidopsis thaliana (Von Lintig et al., 1997) lorsqu’elles sont exposées à la lumière. Les
résultats obtenus par Liu et al. (2004), sur les fruits de tomate, par l’étude mutant hp1 qui
présente une mutation au niveau d’un gène codant pour une protéine impliquée dans la
transmission du signal lumineux, suggèrent que la lumière est également impliquée dans la
synthèse des caroténoïdes au niveau des chromoplastes.
L’expression des gènes de la voie du MEP peut également être régulée par la lumière
(Carretero-Paulet et al., 2002; Estevez et al., 2001; Rodriguez-Concepcion et al., 2004). Chez
Arabidopsis thaliana, l’étude de mutants hypo-sensibles à la lumière montre que les voies de
perception et de transduction du signal lumineux régulent la voie du MEP au niveau de la
DXPS et de la DXR (Rodriguez-Concepcion et al., 2004).
III.2.4.3. Rôle du statut redox des plastoquinones
Le contrôle redox est connu pour être un mécanisme régulateur majeur de la voie de
biosynthèse des caroténoïdes (Pfannschmidt et al., 2001).
37
La désaturation du phytoène par la phytoène désaturase et celle du ζ-carotène par la ζcarotène désaturase, est une réaction complexe nécessitant des co-facteurs et une étape
d’oxydation, durant laquelle un électron est transféré du phytoène à la plastoquinone (Voir
réaction p.29). Chez le tabac, lorsque le transport d’électrons photosynthétiques et la
réduction de la plastoquinone ont été inhibés par le 3-(3,4-dichlorophényle)-1,1
diméthylurée (DCMU), une augmentation des niveaux de transcrits de la β-carotène
hydroxylase et de la zéaxanthine époxydase, est observée ainsi qu’une augmentation de la
quantité de pigments photosynthétiques. Les niveaux de transcrits des gènes Hy-β et Zep
sont également régulés par le statut redox des plastoquinones (Woitsch et Romer, 2003). En
effet ils nécessitent, tout comme PDS et ZDS, un rapport PQ/PQH2 élevé (Steinbrenner et
Linden, 2003).
III.2.4.4. Rôle des produits finaux
L’expression de la Dxs peut être inhibée par des intermédiaires de la voie du MEP tels
que le déoxyxylulose, chez la tomate (Lois et al., 2000; Rodriguez-Concepcion et al., 2001).
Chez des tomates surexprimant de façon constitutive le gène Pds, une diminution de la
quantité de caroténoïdes totaux a été observée (Giuliano et al., 2000). La surexpression de la
désaturase d’origine bactérienne, qui transforme le phytoène en lycopène, dans des plants
de tomates est responsable de l’obtention de fruits présentant des teneurs accrues en βcarotène mais, avec des concentrations en caroténoïdes totaux 2,5 fois plus faibles par
rapport aux fruits des plants non transformés. Ce phénotype est dû à l’augmentation de
l’expression de la lycopène β-cyclase, à la diminution de l’expression du gène codant pour la
phytoène synthase, et à l’augmentation des teneurs en β-carotène (Botella-Pavia et
Rodriguez-Concepcion, 2006). Ces études suggèrent un rétrocontrôle négatif sur l’expression
des gènes Psy et Pds par le β-carotène ou l’un de ses métabolites.
Cazzonelli et Pogson (2010) soulignent l’existence d’une interaction entre la voie de
biosynthèse des caroténoïdes et la voie du méthylérythritol phosphate dans la régulation de
DXPS. En effet, la DXPS peut être rétrocontrôlée par une accumulation de caroténoïdes chez
la tomate (Lois et al., 2000; Rodriguez-Concepcion et al., 2001). L’augmentation de
38
l’expression de la Psy chez un transgène d’Arabidopsis thaliana, induit une augmentation des
ARNm de la Dxps, ce qui révèle un mécanisme de rétrocontrôle initié par la PSY qui stimule
les substrats de le voie du MEP (Rodriguez-Villalon et al., 2009a, b).
III.2.4.5. Rôle du stockage des caroténoïdes
La biogenèse des organites, tels que les chloroplastes, est déterminante dans la taille
et le nombre des compartiments de stockage des plastes et peut affecter l’accumulation des
caroténoïdes (Cazzonelli et Pogson, 2010).
Chez le chou-fleur, le mutant or, dont le niveau de transcrit des gènes impliqués dans
la biosynthèse des caroténoïdes est identique à celui des plantes témoins, présente une
augmentation de la concentration en β-carotène. Cette accumulation de β-carotène dans les
chromoplastes révèle que la différenciation des plastes est un mécanisme important dans le
contrôle de l’accumulation des caroténoïdes dans les plantes (Li et al., 2001). Chez la tomate,
le mutant hp1 montre une augmentation des niveaux en caroténoïdes dus à l’augmentation
du nombre et de la taille des plastes (Cookson et al., 2003). Chez la tomate, des mutants
hp2dg ont montré une augmentation, au stade mature, des métabolites ayant une activité
antioxydante : caroténoïdes, tocophérols et acide ascorbique, en même temps qu’une
augmentation du nombre de cellules dans le fruit, une augmentation du nombre de
chloroplastes par cellule, et une augmentation du volume des chloroplastes (Bino et al.,
2005). Cette étude a été complétée par une étude des gènes impliqués (Kolotilin et al.,
2007). L’expression des gènes impliqués dans la voie du méthylérythritol phosphate
synthétisant les précurseurs nécessaires à la biosynthèse des caroténoïdes, ceux impliqués
dans la biogénèse des chlorophylles, ainsi que ceux impliqués dans la photosynthèse est
augmentée (Kolotilin et al., 2007). Il y a apparemment une coordination entre les
mécanismes moléculaires dirigeant la biogénèse des plastes et ceux impliqués la biogénèse
des métabolites secondaires (Kolotilin et al., 2007).
Dans les fruits mûrs de tomate, le mutant hp3 est caractérisé par un déficit de 75%
d’acide abscissique, une augmentation de 60% des niveaux de transcrits du gène FtsZ codant
pour une protéine de tubuline impliquée dans la division des plastes et une concentration en
39
Tableau 2: Effets positifs des facteurs de l’environnement, la lumière, la température, l’approvisionnement en carbone, la sécheresse, la salinité et la
fertilisation azotée, sur la concentration en caroténoïdes par rapport à la matière fraîche dans différents fruits d’après Poiroux-Gonord et al. (2010).
Facteurs environnementaux
Espèces
Composés
Effets
Références
Faible température moyenne journalière
Solanum lycopersicum L.
β-carotène
++
(Koskitalo et Ormrod, 1972)
Forte exposition à la lumière
Spectre de lumière (lumière bleue)
Forte radiation UV-B
Malus domestica Borkh. cv. Gala
Malus domestica Borkh.
caroténoïdes totaux
lycopène et β-carotène
β-carotène
+
+
+
(Li et Cheng, 2008)
(Gautier et al., 2005b)
(Rudell et al., 2002)
Rapport feuilles sur fruit élevé
Mangifera indica L.
Citrus unshiu [Mak.] Marc.
Fortunella crassifolia Swingle
β-cryptoxanthine
++
++
+++
Sécheresse
Solanum lycopersicum L. cv. Mini Carol, cv.
Cherry Pink, cv. Yellow Carol
Spinacia oleracea L.
+
(Matsuzoe et al., 1998)
β-carotène, lutéine, néoxanthine et
violaxanthine
+
(Leskovar et al., 2007)
Salinité élevée
Lactuca sativa L.
Capsicum annuum L.
lycopène
Conductance électrique élevée
carotènes
Teneur en azote élevée
Capsicum annuum L.
Citrus, Solanum tuberosum
lycopersicum L.
lycopène
carotènes
+, jusqu’à + 30% ; ++, de +30% à +100% ; +++, supérieur à +100% .
40
L.,
Solanum
++/+++
+
++
+/++
++
+/++
+/++
+
(Joas, 2008)
(Iglesias et al., 2001)
(Kondo et al., 2005)
(Kim et al., 2008)
(Navarro et al., 2006)
(De Pascale et al., 2001)
(Krauss et al., 2006)
(Wu et al., 2004)
(Flores et al., 2004)
(Aziz, 1968)
(Mozafar, 1993)
caroténoïdes plus élevée de 30% (Galpaz et al., 2008). Ces résultats montrent qu’une
carence en acide abscissique conduit à une augmentation de la taille des plastes,
probablement due à une augmentation de la division des plastes, ce qui entraînerait une
biosynthèse accrue des caroténoïdes.
IV.
Influence des facteurs de l’environnement sur la biosynthèse et l’accumulation des
caroténoïdes
Les facteurs environnementaux (lumière, température, et disponibilité en eau) qui
déterminent la conductance stomatique et la pression partielle en CO2 au niveau des sites de
carboxylation. Ils conditionnent donc des gains et des pertes de carbone, et influencent
l’allocation des ressources carbonées entre les différents puits. Le statut carboné qui en
résulte détermine la synthèse des métabolites primaires et secondaires.
IV.1.
Les effets de l’environnement sur l’accumulation des caroténoïdes
Un certain nombre d’études se sont intéressées aux effets des facteurs climatiques sur
la concentration en micronutriments, en vitamines et en composés secondaires des fruits et
légumes. Ces études ont montré qu’il est possible d’augmenter substantiellement les
concentrations en métabolites secondaires, et notamment en caroténoïdes, chez divers
fruits et légumes en fonction des conditions environnementales (Tableau 2) mais également
de les diminuer (Tableau 3).
La biosynthèse des caroténoïdes est affectée par les faibles températures moyennes
journalières. Chez la tomate, la diminution des températures de 17,8/25.6°C à 2,8/13,9°C
entraîne une augmentation de la concentration en β-carotène (+68,2%) (Koskitalo et
Ormrod, 1972).
Généralement une bonne exposition et/ou une forte intensité lumineuse sont des
facteurs positifs pour l’accumulation des caroténoïdes chez la pomme (Li et Cheng, 2008).
L’utilisation de longueurs d’onde spécifiques (Gautier et al., 2005b) et l’irradiation aux UV-B
(Rudell et al., 2002) sont également des techniques favorables à l’augmentation, de la
41
Tableau 3: Effets négatifs des facteurs de l’environnement, la lumière, la température, l’approvisionnement en carbone, la sécheresse, la salinité et la
fertilisation azotée, sur la concentration en caroténoïdes par rapport à la matière fraîche dans différents fruits d’après Poiroux-Gonord et al. (2010).
Facteurs environnementaux
Espèces
Composés
Augmentation de température du fruit
Spectre de lumière (verre/plastique contre
condition de culture en plein champ)
Concentration en concentration élevée
Citrus aurantium L. (feuilles)
lycopène
Rapport feuilles sur fruit élevé
Citrus clementina Hort. ex Tan.
Sécheresse
Effets
-/--
Références
(Gautier et al., 2005a)
(Cabibel et Ferry, 1980)
--
(Schwanz et al., 1996)
--- (exprimé
en MS)
(Gonord et al., 2009)
-
(Riggi et al., 2008)
Salinité élevée
-
(De Pascale et al., 2007)
Teneur en azote élevée
Citrus unshiu [Mak.] Marc.
Color index
-
(Iglesias et al., 2001)
-, jusqu’à - 30% ; --, de -30% à -100% ; ---, supérieur à -100%
42
concentration en β-carotène et en lycopène chez la tomate (Gautier et al., 2005b), et en βcarotène chez la pomme (Rudell et al., 2002).
L’augmentation du nombre de feuilles par fruit entraîne une augmentation de la
concentration en caroténoïdes totaux chez la mangue (Joas, 2008), et la mandarine (Iglesias
et al., 2001), et en β-cryptoxanthine (+31,8% ) chez le kumquat (Kondo et al., 2005).
Les effets sur la biosynthèse des caroténoïdes de la sécheresse et d’une salinité élevée
sont variables. Les effets peuvent être négatifs (De Pascale et al., 2007; Riggi et al., 2008)
positifs (De Pascale et al., 2001; Kim et al., 2008; Krauss et al., 2006; Leskovar et al., 2007;
Navarro et al., 2006; Wu et al., 2004), ou non significatifs (Krumbein et al., 2006). Ces
observations contradictoires sont dues à des interactions de facteurs. Ainsi, une baisse de la
conductance stomatique et de la photosynthèse serait favorable en pénalisant la formation
des précurseurs tandis que l’exacerbation du stress photooxydatif fournirait un stimulus
positif pour la synthèse des caroténoïdes. Cependant, l’effet d’une salinité élevée n’est pas
totalement assimilable à un stress hydrique car les plantes sont en plus soumises à un stress
lié à un excès en ions sodium et chlorure ce qui pourraient expliquer, partiellement, la
diversité des réponses obtenues.
L’effet de la privation en azote sur la concentration en caroténoïdes est différent selon
les espèces. Un effet négatif a été observé chez le poivron (Flores et al., 2004), les agrumes,
la pomme de terre (Mozafar, 1993) et chez la tomate (Aziz, 1968; Mozafar, 1993), et un effet
positif chez la mandarine (Iglesias et al., 2001).
IV.2.
Statut carboné ou stress oxydatif ?
IV.2.1. L’influence du statut carboné sur la concentration en caroténoïdes
IV.2.1.1. Liens entre les métabolismes primaire et secondaire
Les métabolites primaires (chlorophylles, acides aminés, nucléotides, carbohydrates,...)
participent à la croissance et au développement de la plante via leurs rôles dans la
photosynthèse, la respiration, ou le transport des solutés. Les métabolites secondaires sont
impliqués dans la structure des plantes, dans les interactions avec les facteurs biotiques du
milieu et en particulier dans la défense contre les agressions.
43
Figure 19: Théorie de l’équilibre entre les mécanismes de
différenciation et de croissance. Représentation de l’évolution du
taux net d’assimilation, du taux de croissance relatif et du taux de
synthèse des métabolites secondaires en fonction de la disponibilité
en nutriments d’après Glynn (2007).
44
IV.2.1.1.1. Théories déterministes
L’idée centrale des théories déterministes est que les plantes doivent optimiser la
répartition de leurs ressources entre le métabolisme primaire impliqué dans la croissance et
le développement et le métabolisme secondaire orienté vers la défense contre les
pathogènes, l’adaptation à l’environnement, la survie et la propagation de l’espèce. Les deux
métabolismes, sont en compétition pour les ressources carbonées.
La répartition du carbone entre les métabolismes primaire et secondaire est étudiée
depuis des dizaines d’années par les écologues. Plusieurs hypothèses complémentaires et
parfois contradictoires ont été proposées pour expliquer cette distribution. La théorie de
l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance (Growth Differentiation
Balance Hypothesis, GDBH), est la plus élaborée des hypothèses de défense des plantes
(Stamp, 2003).
La théorie de l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance a été
formulée initialement par Loomis (1932, 1953) et complétée par la suite par Lorio (1986) et
Herms et Mattson (1992) (Figure 19).
Elle prédit comment les plantes allouent leurs ressources entre les processus liés à la
différenciation et les processus liés à la croissance dans différentes conditions
environnementales. Cette théorie prédit que I) les plantes soumises à de faibles
disponibilités en ressources présentent une faible croissance et une faible production en
métabolites secondaires ; II) l’allocation pour la production de métabolites secondaires est
plus faible chez les plantes croissant avec des ressources élevées (Herms et Mattson, 1992) ;
III) les plantes soumises à des disponibilités en ressources intermédiaires ont la plus grande
concentration en métabolites secondaires tandis que l’accumulation de la biomasse est
intermédiaire (Loomis, 1932, 1953; Luxmoore, 1991) (Figure 19).
Les concentrations en métabolites secondaires suivent une courbe en cloche et
présentent un maximum pour de niveaux de ressources intermédiaires.
45
Figure 20: Réseau de signalisation impliquant les interactions entre
les hormones et les espèces réactives de l’oxygène d’après Fujita et
al. (2006).
46
IV.2.1.1.2. Théories mécanistes
Les physiologistes ont émis l’hypothèse que les carbohydrates ont un rôle modulateur
sur la biogénèse des métabolites secondaires. Chez les agrumes, le saccharose favorise le
changement de couleur d’une manière dépendante de l’éthylène (Iglesias et al., 2001). La
limitation en saccharose, due à la répression du gène Psy1, retarde et réduit l’accumulation
de lycopène et de phytoène sur les disques de péricarpe (Telef et al., 2006). Ces
observations suggèrent que le saccharose agit comme une molécule stimulante qui accroît
l'accumulation des caroténoïdes après l'induction de leur synthèse. Dans les feuilles,
l’accumulation des sucres solubles régule négativement l’expression des gènes de la
photosynthèse et conduit à une perte de chlorophylles (Koch, 1996; Krapp et al., 1991;
Rolland et al., 2002; Rolland et al., 2001). En admettant que les synthèses des chlorophylles
et des caroténoïdes sont coordonnées, il faut s’attendre à ce que les sucres répriment la
synthèse des caroténoïdes. Mortain-Bertrand et al. (2008) ont observé que l’accumulation
des sucres dans les feuilles de tomate réprime les gènes codant pour les enzymes de la voie
de biosynthèse des caroténoïdes (Psy, Pds, Lcy-β) aussi bien que ceux de la voie du
méthylérythritol phosphate (Dxps) (Mortain-Bertrand et al., 2008).
En résumé, l’accumulation des sucres stimule la synthèse des caroténoïdes dans les
fruits alors que c’est l’effet inverse dans les feuilles.
IV.2.2. L’influence du stress oxydatif sur la concentration en caroténoïdes
Les végétaux sont exposés à de multiples stress biotiques et abiotiques dans leur
environnement naturel. Pour survivre, les plantes possèdent des mécanismes évolués qui
impliquent une signalisation par les hormones (acide salicylique, acide jasmonique, éthylène,
acide abscissique) et les espèces réactives de l’oxygène (ROS). La perception des signaux
extérieurs induit des réponses adaptées telles que l’acclimatation par l’augmentation de la
capacité de détoxication des ROS (Foyer et Noctor, 2003; Fujita et al., 2006). Les
phytohormones et les espèces réactives de l’oxygène jouent un rôle essentiel dans la
signalisation des réponses aux stress biotiques et abiotiques (Figure 20) (Foyer et Noctor,
2003; Fujita et al., 2006). Les voies de réponses des phytohormones et des espèces réactives
47
Figure 21: Déséquilibre de la balance entre les
espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les
antioxydants d'après Scandalios (2005).
48
de l’oxygène interagissent pour contrôler à la fois la tolérance aux stress et la résistance aux
maladies. Le monoxyde d’azote (NO) jouerait également un rôle dans les réponses aux stress
des plantes. En effet, il régulerait les réponses des plantes aux stress abiotiques (sécheresse,
températures basses et élevées, salinité, métaux lourds et stress oxydatif) et serait impliqué
dans la signalisation des réponses de défense au cours des interactions plantes-pathogènes
(Arasimowicz et Floryszak-Wieczorek, 2007).
En absence de stress, les ROS sont produits par de nombreuses réactions
métaboliques. L’homéostasie des ROS est maintenue grâce à leur détoxication mais ils
peuvent toutefois agir comme des molécules de signalisation (Foyer et Noctor, 2005b, 2003).
Cependant, lors de stress plus intenses, la production de ROS peut augmenter rapidement et
les systèmes antioxydants qu’ils soient enzymatiques (le cycle ascorbate-glutathion, la
catalase, les superoxydes dismutases, les péroxydases) ou non-enzymatiques (les
caroténoïdes, la vitamine C, …) peuvent alors être dépassés. Il en résulte un stress oxydatif,
et donc l’accumulation de ROS (Laloi et al., 2004). Il est probable que le stress oxydatif soit
impliqué dans la régulation de la biosynthèse des composés impliqués dans la détoxication
des ROS, tels que les caroténoïdes.
IV.2.2.1. Le stress oxydatif et les espèces réactives de l’oxygène
Le stress oxydatif se définit comme le résultat d’un déséquilibre entre les espèces
réactives de l’oxygène et les systèmes de détoxication, conduisant à l’apparition de lésions,
de dysfonctionnements physiologiques (dommages au niveau des membranes, réduction de
l’efficacité métabolique, mutations, réduction de la fixation du carbone, perte de fonction
des organites…) pouvant conduire à la mort cellulaire des plantes (Scandalios, 2005) (Figure
21).
Les plantes supérieures, comme les autres organismes aérobies, nécessitent de
l’oxygène pour la production efficace d’énergie. Les espèces réactives de l’oxygène sont des
dérivés partiellement réduit de l’oxygène moléculaire, O2 (Figure 22).
49
Figure 22: Formation des différentes espèces réactives de l'oxygène d’après Apel et Hirt (2004).
La formation de l’oxygène singulet (1O2) est induite par l’excitation de molécules
d’oxygène tandis que les autres espèces réactives de l’oxygène tels que l’anion superoxyde
(O2•-), et les radicaux hydroxyles (OH•) sont formés par transfert d’un ou plusieurs électrons
à la molécule d’oxygène (Apel et Hirt, 2004). Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) n’est pas une
espèce réactive de l’oxygène stricto sensu mais participe à la formation de radicaux libres.
L’oxygène singulet (1O2), est très réactif et instable du fait de son état excité. Il réagit
facilement avec les molécules voisines en les oxydant (Halliwell et Gutteridge, 2007). Il peut
être formé par un excès d’énergie (radiations UV ou photo-inhibition) lors des réactions de
transfert des électrons au niveau du photosystème II (Nyathi et Baker, 2006). Il est éliminé
par l’α-tocophérol et les caroténoïdes dans la membrane des thylakoïdes à proximité des
pigments (Asada, 2006).
L’anion superoxyde (O2•-) n’est pas aussi réactif que les autres espèces réactives de
l’oxygène car il ne réagit pas avec la plupart des molécules biologiques, contrairement au
radical hydroxyle (Halliwell et Gutteridge, 2007). Il est formé au cours de différentes
réactions enzymatiques et par l’auto-oxydation de composés tels que les quinones, les
ferrédoxines et les thiols. Il est également produit au cours de la réaction de Mehler, qui
permet de réguler le flux d’électrons dans la photosynthèse, et au cours de la respiration
dans les mitochondries (Baker et al., 2006). Il est impliqué dans la peroxydation des lipides et
des brins d’ADN. Il est responsable de l’inactivation de la catalase, de la glutathion
peroxydase et de l’oxydation du NADPH (Halliwell et Gutteridge, 2007).
50
Tableau 4 : Production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans une cellule végétale d’après
Ramel (2009).
Sites de
production
Chloroplastes
ROS
produites
1
O2
•O2
H2O2
•
OH
Mitochondries
•-
O2
H2O2
Peroxysomes
•-
O2
H2O2
H2O2
H2O2
H2O2
Processus
1
Excitation de la chlorophylle
Transfert des électrons
photosynthétiques
Réaction de Fenton
Chl* + O2
Chl + O2
•Fd réduite + O2
Fd oxydé + O2
•PQ réduite + O2
PQ oxydé + O2
•O2
H2O2
2+
3+
•
H2O2 + Fe
Fe + OH + OH
Transfert des électrons de la
respiration
O2
•-
H2O2
•-
Xanthine oxydase
Photorespiration
β-oxydation des acides gras
Métabolisme de l’urée
Xanthine + O2
•O2
H2O2
2 glycolate + O2
•-
NADPH oxydase
NADPH + 2 O2
•-
Détoxication cellulaire
Oxydation, hydroxylation, désamination,
déhalogénation, et désaturation
Membrane
plasmique
O2
Réticulum
endoplasmique
O2
Fd : ferrédoxine ; PQ : plastoquinone.
51
Réactions
Acide urique + H2O2 + O2
2 glyoxylate + H2O2
+
+
•-
NADP + H + 2 O2
Le radical hydroxyle (OH•) est considéré comme le plus réactif des oxydants dans les
cellules végétales. Il peut se combiner avec presque tous les composants cellulaire par
échange d’électrons, addition de doubles liaisons ou attachement d’un atome d’hydrogène
(Halliwell et Gutteridge, 2007). Il est formé par la réaction de l’anion superoxyde avec le
peroxyde d’hydrogène (la réaction de Haber-Weiss), et par la réaction d’ions fer ou cuivre ou
de métaux lourds (plomb, cadmium) avec le peroxyde d’hydrogène (la réaction de Fenton)
(Baker et al., 2006). Il peut initier des réactions en chaine avec de nombreuses molécules
organiques, conduisant à la peroxydation des lipides, à l’inactivation d’enzymes, et à la
dégradation des acides nucléiques (Young et al., 2002). Il est éliminé par l’α-tocophérol et
l’ascorbate (Asada, 2006).
Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est un faible agent oxydant ou réducteur et est
généralement peu réactif en l’absence de métaux (Halliwell et Gutteridge, 2007). Il est formé
au cours de la photorespiration (Nyathi et Baker, 2006). Il est responsable de l’inhibition des
enzymes du cycle de Calvin et de certaines enzymes par oxydation des liaisons S-H (Baker et
al., 2006). Il est éliminé par la catalase dans les peroxysomes et par l’ascorbate peroxydase
dans les chloroplastes (Asada, 2006).
IV.2.2.2. La formation des espèces réactives de l’oxygène
Chez les plantes, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont produites dans les
chloroplastes, les mitochondries, les peroxysomes, la membrane plasmique et le réticulum
endoplasmique (Tableau 4).
Les cellules chlorophylliennes sont particulièrement exposées à la génération de ROS.
Le chloroplaste est souvent considéré comme étant la principale source de ROS (peroxyde
d’hydrogène, anion superoxyde, oxygène singulet et radicaux hydroxyles) chez les
organismes photosynthétiques (Asada, 2006; Edreva, 2005; Foyer et Noctor, 2003). La
mitochondrie et la respiration sont une source de production d’anion superoxyde et de
peroxyde d’hydrogène lors de la détoxication de ce dernier. Les peroxysomes sont le siège
d’une forte activité.
52
Epiderme de la feuille
Chloroplaste
1
3
O2
Phloème
O2
O2
•-
O2
H2O2
4
Fd
H2O
NADP+
-
1/2O2 + 2e
NADP+
3
Cycle de
Calvin
ADP
ADP
Figure 23 : Formation d'espèces réactives de l'oxygène dans les chloroplastes, induite par la
fermeture des stomates (1), un blocage de la translocation du saccharose au niveau du phloème (2),
déficit en ATP (3), et l'inhibition de la chaine de transport (4). Fd, ferrédoxine ; FNR, ferrédoxineNADP-réductase; PQ, plastoquinone ; PSI, photosystème I ; PSII, photosystème II d’après Grassmann
(2002).
53
métabolique centrée sur le métabolisme oxydatif (Corpas et al., 2001; Nyathi et Baker,
2006). Ils possèdent de nombreux systèmes antioxydants et prooxydants. Le peroxyde
d’hydrogène est formé à la suite de plusieurs réactions dans les peroxysomes, la β-oxydation
des acides gras, la photorespiration, le métabolisme de l’urée et lors de la détoxication de
l’anion superoxyde par la superoxyde dismutase. L’anion superoxyde est quant à lui formé
lors de la réaction de la xanthine avec l’oxygène et dans la chaine de transfert des électrons.
Les plantes possèdent plusieurs enzymes ou complexes enzymatiques, telles que les NAPDHoxydases, les peroxydases végétales, les oxalates-oxydases, les amines-oxydases ou les
oxydases péroxysomales, qui sont responsables de la production de ROS. La fonction de
détoxication des cellules présente dans le réticulum endoplasmique fait intervenir de
nombreux processus oxydants, tels que des oxydations, des hydroxylations, des
désalkylations, des désaminations, des déshalogénations et des désaturations. Les réactions
d’oxydation, catalysées par les cytochromes P450 mono-oxygénases (Coleman et al., 1997),
génèrent des ROS et plus particulièrement de l’anion superoxyde.
IV.2.2.2.1. La
production
d’espèces
réactives
de
l’oxygène au cours la photosynthèse
Les principales sources de ROS se situent au niveau des photosystèmes I (PSI) et II
(PSII) dans les chloroplastes (Asada, 2006; Zhang et al., 2003). En conditions normales, le flux
d’électrons provenant du centre réactionnel du PSI est dirigé vers le NADP+, qui une fois
réduit, participe à la réduction du CO2 au niveau du cycle de Calvin.
Dans les tissus photosynthétiques (Figure 23), la fixation du CO2 est limitée par de
nombreux stress abiotiques (Long et al., 1994; Murata et al., 2007). Les faibles et les fortes
températures, la sécheresse, ainsi que de fortes salinités, limitent fortement la fixation du
CO2. Cette limitation entraîne une diminution du transport des électrons dans la chaine
photosynthétique. La limitation du cycle de Calvin diminue l’utilisation du NADPH et conduit
à la diminution du NADP+, le principal accepteur d’électron au niveau du PSI. Les
photosystèmes I et II sont maintenus dans un état réduit, ce qui se traduit par l’inactivation
du PSII par inhibition et donc une diminution de la photolyse de l’eau en O 2 et H+ (Demmigadams et Adams, 1993; Krause, 1988; Murata et al., 2007; Powles, 1984). Mais surtout les
54
électrons qui sont transférés vers l’oxygène moléculaire conduisant à la formation d’O2•- puis
d’H2O par dismutation (Asada, 1999). Lorsque l’énergie lumineuse est en excès, les
plastoquinones sont dans un état réduit. Il y a formation de chlorophylle sous forme triplet,
et par transfert d’énergie, formation d’oxygène singulet (1O2) (Hideg et al., 2002). Les fortes
intensités lumineuses peuvent donc endommager directement le PSII en produisant des ROS
(Nishiyama et al., 2006; Takahashi et Murata, 2008). Une production d’O2•- est également
possible au niveau du PSII lors de la réduction de l’oxygène moléculaire par les
plastoquinones (Cleland et Grace, 1999; Navari-Izzo et al., 1999; Zhang et al., 2003). En
résumé, tout stress provoquant la fermeture des stomates, ou une diminution de la
translocation du saccharose, est susceptible d’entrainer une augmentation de la production
de ROS.
La superoxyde dismutase (SOD) est la première ligne de défense des plantes contre le
stress oxydatif. Elle catalyse la dismutation de deux anions superoxydes formés, par exemple
lors de la photosynthèse, en dioxygène et en peroxyde d’hydrogène.
2 O2.- + 2H+
O2 + H2O2
Le H2O2 formé est éliminé via le cycle ascorbate-glutathion et la catalase (Asada, 2006;
Dat et al., 2000; Scandalios, 2005).
AA : ascorbate réduit ; APX : ascorbate peroxydase ; DHA : déshydroascorbate ; DHAR :
déshydroascorbate réductase ; GSSG : glutathion disulfide ; GSH : glutathion réduit ; GR : glutathion
réductase ; H2O2 : peroxyde d’hydrogène ; MDHAR : monodéshydroascorbate réductase.
55
Figure 24: Formation de peroxyde d'hydrogène lors de la photorespiration d'après Foyer et al.
(2009). GO : glycolate oxydase ; PGP : phosphoglycolate phosphatase
56
Le cycle de l’ascorbate-glutathion comprend quatre enzymes : l’ascorbate peroxydase
(APX), la monodéshydroascorbate réductase (MDHAR), la déshydroascorbate réductase
(DHAR) et la glutathion réductase (GR). Il est localisé au niveau des chloroplastes et permet
d’éliminer le peroxyde d’hydrogène en excès généré au cours de la photosynthèse. La
première enzyme du cycle ascorbate-glutathion est l’ascorbate péroxydase (APX). Elle
catalyse la réduction de l’H2O2 en H2O en utilisant l’ascorbate comme donneur d’électrons
pour former du monodéshydroascorbate et de l’eau. Dans les chloroplastes, au niveau du
PSI, l’association des réactions catalysées par la SOD et l’APX constituent la réaction de
Mehler, également connue sous le nom de cycle eau-eau. Le monodéshydroascorbate est
réduit en présence de NADH par la monodéshydroascorbate réductase (MDHAR) en
ascorbate. Le monodéshydroascorbate peut également être dismuté de manière non
enzymatique en ascorbate et déshydroascorbate. Le déshydroascorbate (DHAR) est convertit
en ascorbate et en glutathion oxydé (GSSG) par la déshydroascorbate réductase en utilisant
le glutathion réduit comme donneur d’électron (GSH). La glutathion réductase (GR) permet
de convertir le glutathion oxydé en présence de NADPH en glutathion réduit (Drew et al.,
2007).
Le peroxyde d’hydrogène produit par la chaine de transfert des électrons, la βoxydation peroxysomale et la photorespiration est éliminée par la catalase. C’est une
enzyme majoritairement peroxysomale qui catalyse la dismutation de deux molécules de
peroxyde d’hydrogène, en eau et en oxygène (Smirnoff, 1998).
2 H2 O 2
O2 + 2 H2O
IV.2.2.2.2. La
production
d’espèces
réactives
de
l’oxygène au cours de la photorespiration
Lors de la photorespiration, la Rubisco, en présence de ribulose-1,5-bisphosphate,
peut réagir avec l’O2 présent dans les chloroplastes pour produire du 2-phosphoglycolate. La
phosphoglycolate phosphate le transforme en glycolate, qui est ensuite exporté dans le
peroxysome (Foyer et al., 2009). La réaction d’oxydation du glycolate conduit à la formation
57
de glyoxylate et de péroxyde d’hydrogène (Figure 24) (Foyer et al., 2009; Nyathi et Baker,
2006). Ce dernier est éliminé par la catalase.
IV.2.2.2.3. La
production
d’espèces
réactives
de
l’oxygène au cours de la respiration
Dans les cellules photosynthétiques, et en conditions de lumière, la production de ROS
d’origine mitochondriale ne représente qu’une faible proportion de la production totale de
ROS. Au contraire, à l’obscurité ou dans les tissus non photosynthétiques, les mitochondries
peuvent devenir la source la plus importante de ROS (Rhoads et al., 2006). En effet, une
partie de l’oxygène consommé par les cellules est convertie en ion superoxyde. Chez les
plantes, 1% de l’oxygène absorbé est transformé en ROS et le reste est consommé par la
respiration et réduit en eau (Moller, 2001).
Figure 25: Production d’anion superoxyde dans la chaine de transport des électrons de la
membrane mitochondriale interne d’après Taiz Et Zeiger (2006).
AOX : oxydase alternative ; c : cytochrome c ; Complexe I : NADH déshydrogénase ; complexe II :
succinate déshydrogénase ; complexe III : cytochrome bc1 ; complexe IV : cytochrome c oxydase ;
complexe V : ATPase ; E1 et E2 : NAD(P)H déshydrogénase externe ; I1 : NADH déshydrogénase ; Q :
pool d’ubiquinone.
La production de ROS dans les mitochondries est causée par la fuite d’électrons
inhérente au fonctionnement même de la chaine respiratoire et à la fixation des électrons
sur l’oxygène moléculaire, qui conduit à la réduction incomplète de l’O2 et à la formation de
ROS (Figure 25) (Brookes, 2005). Cette fuite se fait au niveau de la NADH déshydrogénase
58
appartenant au complexe I (Turrens et Boveris, 1980) ainsi qu’au niveau du cytochrome bc1
du complexe III (Rich et Bonner, 1978). Bien que les principales sources de ROS soient les
complexes I et III, les flavoprotéines du complexe II pourraient également contribuer à la
formation d’ion superoxyde (Young et al., 2002). Cette production de ROS est indissociable
du processus respiratoire et fortement modulée par les conditions environnementales
(Moller, 2001). La production de ROS augmente chaque fois que le flux d’électrons traité par
la cytochrome c oxydase est ralenti, et chaque fois que le flux d’électrons entrant dans la
chaine de transport augmente au-delà de la capacité de la voie respiratoire, ce qui conduit à
la formation d’un pool d’ubiquinone (Q) réduit (Rhoads et al., 2006). Le superoxyde formé
sera ensuite transformé en H2O2 par dismutation spontanée ou par action de la superoxyde
dismutase (Boveris et Chance, 1973).
IV.2.2.3. Le statut redox cellulaire
Le potentiel redox intracellulaire, ou statut redox, est la résultante de l’état redox des
couples oxydo-réducteurs présents dans la cellule. Les réactions redox sont des processus
métaboliques fondamentaux par lesquels les cellules convertissent et distribuent l’énergie
qui est nécessaire au fonctionnement de la cellule (Noctor, 2006). Les cellules des plantes
ont acquis des composants sensibles au statut redox qui agissent comme des baromètres
sensibles aux changements environnementaux. Elles ont développé des mécanismes qui
peuvent déclencher des changements redox pour altérer l’expression des gènes et les
fonctions cellulaires (Noctor, 2006). Les conditions redox régnant dans les cellules sont
évaluées par le rapport des concentrations sous des formes oxydées et réduites des couples
redox (Noctor, 2006). Les couples redox GSH/GSSG et AA/DHA sont prépondérants du fait de
leurs concentrations dans les cellules mais d’autres couples tels que NAD(P)/NAD(P)H
TRXox/TRXred, Fdox/Fdred ou encore PQ/PQH2 (plastoquinone oxydée/réduite) sont également
importants (Foyer et Noctor, 2005b).
Beaucoup d’enzymes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes sont sensibles au
statut redox. En effet, certaines enzymes telles que la 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate
réductoisomérase, la phytoène désaturase, la ζ-carotène désaturase et la zéaxanthine
59
époxydase nécessitent du NADPH ou des rapports élevés en PQ/PQH2 pour fonctionner
(Steinbrenner et Linden, 2003).
Il existe une interaction entre les ROS et le statut redox. L’augmentation du niveau de
ROS provoque une oxydation partielle ou complète des composants cellulaires induisant de
ce fait une modification du statut redox de la cellule (Mittler et al., 2004). Par exemple, le
GSH et l’ascorbate sont capables de réduire directement l’O2•- et le H2O2 et servent
également de co-substrat aux enzymes antioxydantes ayant pour rôle de détoxifier les ROS.
Ainsi, par leur potentiel oxydant et par le biais de leur interaction avec les couples redox
majoritaires, les ROS contribuent à l’établissement de potentiels redox intracellulaires. Le
potentiel redox cellulaire détermine les proportions relatives des espèces oxydées ou
réduites de chaque couple redox. Ces proportions dépendent du potentiel redox de ces
couples. Cette fonction du potentiel redox cellulaire est particulièrement importante car
l’activité de nombreuses protéines, et, en particulier de nombreux facteurs de transcription,
est régulée par leur état redox (Foyer et Noctor, 2005b; Noctor, 2006). En conditions
normales, le cytoplasme cellulaire est un milieu très réducteur, ce qui a pour conséquence
de maintenir la grande majorité des groupements thiols à l’état réduit (Foyer et Noctor,
2005a).
L’état redox cellulaire contribue à la régulation post-traductionnelle de nombreuses
protéines et de voies métaboliques. Par exemple, le système ferrédoxine/thioredoxine
permet l’activation de plusieurs enzymes, et notamment des enzymes chloroplastiques par
réduction des ponts disulfures, ce qui induit un changement de conformation des protéines.
La thioredoxine régule des processus impliqués dans la photorespiration, le métabolisme
azoté, le transport membranaire, la synthèse des hormones et la réponse aux stress
(Buchanan et Balmer, 2005). Par exemple, chez la pomme de terre, le transporteur de
saccharose est régulé par le statut redox puisque la présence d’oxydants stimule l’absorption
de sucres au niveau du phloème (Kruegel et al., 2008). L’ADP glucose phosphorylase, une
enzyme impliquée dans le contrôle de la synthèse d’amidon est également régulée par le
statut redox (Hendriks et al., 2003; Tiessen et al., 2002). Des résultats récents ont montré
que la modification d’enzymes impliquées dans l’état redox de l’ascorbate pouvait entrainer
des modifications dans le métabolisme carboné et notamment sur le métabolisme des
sucres. Par exemple, il a été montré que des lignées sous-exprimant l’alternative oxydase,
60
qui oxyde l’ascorbate et qui joue sur l’équilibre entre les deux formes d’ascorbate,
induiraient des modifications d’activités enzymatiques impliquées dans le métabolisme des
sucres (invertase, sucrose phosphate synthase) et une augmentation du transport du
saccharose vers les fruits. De même, la monodéshydroascorbate pourrait influer par le statut
redox sur le transport et le métabolisme des sucres (Stevens, 2011).
IV.2.2.4. Rôles des espèces réactives de l’oxygène et des variations
de statut redox dans le contrôle de la biosynthèse des
caroténoïdes
Le stress oxydatif stimule la synthèse des caroténoïdes dans les feuilles (Simkin et al.,
2008). Les ROS stimuleraient la biosynthèse des caroténoïdes durant la différenciation des
chloroplastes dans les disques de péricarpe de poivron (Bouvier et al., 1998). En effet
Bouvier et al. (1998) ont observé une augmentation de l’expression des gènes codant pour
les enzymes clefs de la voie de biosynthèse de la capsanthine par l’utilisation de molécules
générant l’anion superoxyde et des molécules pro-oxydantes inhibant l’ascorbate
peroxydase, la glutathion peroxydase, ou la catalase, ce qui induit une augmentation de la
concentration en H2O2. Le mécanisme impliqué n’est pas connu mais les ROS générées
pourraient influencer directement les gènes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes, ou
indirectement à travers leurs effets sur le statut redox. Les résultats obtenus par Kuntz et al.
(1998) sur l’induction de deux gènes impliqués dans la synthèse et l’accumulation des
caroténoïdes chez la tomate sont en contradiction avec les résultats précédents et ne sont
pas en faveur d’une implication directe des ROS (Kuntz et al., 1998). Les résultats obtenus
par Steinbrenner et Linden (2001) sont également en contradiction avec les observations de
Bouvier et al. (1998). En effet, l’addition de composés générant des ROS n’influence pas
l’expression des gènes codant pour la phytoène désaturase (PSY) et la caroténoïde
hydroxylase (HY) chez l’algue verte Haematococus pluvialis (Steinbrenner et Linden, 2001).
Kobayashi et al. (1993) ont proposé que l’effet des ROS sur la voie de biosynthèse des
caroténoïdes serait post-transcriptionnel, et conduirait au renforcement de l’activité d’une
ou plusieurs enzymes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes.
61
Des études et des observations montrent également que le statut redox pourrait
contrôler la voie de biosynthèse des caroténoïdes. La désaturation du phytoène par la
phytoène désaturase (PDS), ainsi que la désaturation du ζ-carotène par la ζ-carotène
désaturase (ZDS), sont des réactions complexes nécessitant des cofacteurs et une étape
d’oxydation (Voir réaction p.29). Au cours de cette étape d’oxydation, le phytoène et le ζcarotène transfèrent un électron, à l’aide de la PDS et de la ZDS, à la plastoquinone (PQ). La
plastoquinone est ensuite ré-oxydée par une plastoquinone oxydase, en utilisant une
molécule d’oxygène comme accepteur final d’électrons (Barr et al., 2004; Carol et Kuntz,
2001; Josse et al., 2000; Scolnik et al., 1987). La plastoquinone a besoin d’être sous forme
oxydée pour être capable d’accepter les électrons produits durant la synthèse du ζ-carotène.
PQH2, la forme réduite de la PQ, doit être ré-oxydée par le photosystème I ou la terminale
oxydase plastidiale (PTOX) (Joet et al., 2002; Josse et al., 2000). L’augmentation de
l’expression du gène codant pour la PTOX a été observée chez les oranges pendant la
maturation des fruits. Cette régulation coïncide avec une accumulation d’ARNm de la PTOX,
de la PDS, et de la ZDS (Rodrigo et al., 2004). Les facteurs contrôlant la PTOX n’ont pas été
identifiés. Cependant, le statut redox des plastoquinones jouerait un rôle essentiel dans le
contrôle de la transcription de plusieurs gènes (Pfannschmidt et al., 1999). La PTOX montre
des similarités avec l’oxydase alternative (AOX) mitochondriale (Wu et al., 1999) qui est
régulée par le statut redox des ubiquinones. Les gènes en aval de la voie de biosynthèse,
codant pour la β-carotène hydroxylase (β-HY), qui catalyse la formation de la zéaxanthine
depuis le β-carotène, et pour la zéaxanthine époxydase (ZEP), qui catalyse la conversion de
la zéaxanthine en violaxanthine, sont également contrôlées par le statut redox des
plastoquinones (Woitsch et Romer, 2003). En effet, lorsque la réduction des plastoquinones
est inhibée par le DCMU (3-(3,4-dichlorophényle)-1,1-diméthylurée), l’expression des gènes
de la β-Hy et de la Zep est augmentée et une accumulation de xanthophylles est observée.
Au contraire, quand l’oxydation des plastoquinones par le complexe du cytochrome b6f est
inhibée par application du DBMIB (2,5-dibromo-6-isopropyle-3-méthyle-1,4-benzoquinone),
les expressions des gènes codant pour la β-HY et de la ZEP sont diminuées. Il a également
été observé que l’expression de 4 gènes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes, Psy,
Pds, lycopène-β-cyclase (Lcy-β) et Chy de l’algue verte Haematococcus pluvialis était corrélée
avec le statut redox résultant du transport des électrons photosynthétiques, et plus
spécifiquement avec le statut redox du pool des plastoquinones (Steinbrenner et Linden,
62
2003). Steinbrenner et Linden (2003) considèrent que la voie de biosynthèse des
caroténoïdes est complètement contrôlée par le statut redox de la chaine photosynthétique.
La phytoène synthase, la phytoène désaturase, la ζ-carotène désaturase, la β-hydroxylase et
la zéaxanthine époxydase serait contrôlées par le statut des redox des plastoquinones
(Cazzonelli et Pogson, 2010; Fraser et al., 2007; Fraser et al., 2002; Woitsch et Romer, 2003).
De plus, le statut redox pourrait jouer un rôle clef dans la synthèse des caroténoïdes puisque
plusieurs étapes de la voie de biosynthèse nécessitent du NADPH (Bouvier et al., 2005a). La
première étape utilisant du NADPH est celle catalysée en amont par la 1-desoxy-D-xylulose5-phosphate réductoisomérase dans la voie de Rohmer, et la seconde est catalysée en aval
par la zéaxanthine époxydase en présence d’O2 (Hieber et al., 2000). De plus, le NADPH a la
capacité de moduler le statut redox du pool d’ubiquinone (Kobayashi et al., 1993; Ryu et al.,
2004).
IV.2.3. Les interactions entre l’effet du statut carboné et l’effet du stress
oxydatif
Il y a cependant des hypothèses alternatives à celle du contrôle de la voie de
biosynthèse des caroténoïdes par le statut redox. A l’obscurité, dans certaines conditions,
quand l’oxydation du NAD(P)H persiste en l’absence de génération d’ATP, le glucose inhibe
l’induction de la synthèse des caroténoïdes chez la cyanobactérie Synechocystis, suggérant
ainsi que ni le statut redox du cytosol, ni le pool de plastoquinone de la membrane
photosynthétique ne sont impliqués (Ryu et al., 2004). A l’obscurité, le glucose induirait
l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse des caroténoïdes par le biais du pH
cytosolique (Ryu et al., 2004). Plus spécifiquement, l’alimentation en glucose serait à
l‘origine d’une augmentation du pouvoir réducteur sous la forme de NAD(P)H produit par la
glycolyse et la voie des pentoses phosphates. Ce pouvoir réducteur serait par la suite réoxydé par le biais de la chaine de transport des électrons de la respiration, ce qui
entraînerait l’alcalinisation du cytosol. Le mécanisme par lequel l’augmentation du pH
cytosolique agirait sur la régulation des gènes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes n’a
pas été élucidé.
63
Les sucres semblent jouer un double rôle dans la mesure où les ROS sont concernées.
Les sucres solubles peuvent alimenter le processus métabolique de production du NADPH tel
que la voie oxydative des pentoses phosphates. En effet d’une part, le NADPH est nécessaire
dans les processus de détoxication tels que le cycle ascorbate-glutathion (Corpas et al., 1998;
Leterrier et al., 2007; Noctor et Foyer, 1998; Noctor et al., 2005; Valderrama et al., 2006) et
dans la régulation des voies métaboliques pour la thioredoxine réductase, via la réduction
des groupes thiols (Nordman et al., 2002). Et d’autre part, le glucose est le principal
précurseur de la synthèse des caroténoïdes et de l’ascorbate (Smirnoff et al., 2001), et les
éléments constitutifs du glutathion (Niyogi et al., 1998).
V.
Problématique et objectifs
Les fruits d’agrumes contiennent plusieurs groupes de métabolites secondaires, dont
les caroténoïdes. Les fortes concentrations et la diversité des caroténoïdes présents dans les
fruits d’agrumes sont des caractéristiques importantes pour la qualité nutritionnelle des
fruits. Différentes études ont montré qu’il était possible d’augmenter substantiellement la
concentration en caroténoïdes chez la carotte (+120%), l’épinard (30%) et la tomate (50%)
(Abushita et al., 2000; Kidmose et al., 2000), à travers des approches purement
agronomiques.
Le
levier
environnemental
peut
être
utilisé
pour
augmenter
considérablement la concentration en caroténoïdes d’une large gamme de fruits et de
légumes (Poiroux-Gonord et al., 2010). Parmi les approches utilisées, deux facteurs semblent
prédominants : le statut carboné et le statut redox. Il est en effet généralement admis que le
statut carboné influence la biosynthèse des métabolites secondaires, notamment par la
disponibilité des précurseurs essentiels à leur biogénèse. Les théories déterministes,
élaborées par les écologues, essayent de prédire comment les plantes allouent les
ressources alors que les théories mécanistes élaborées par les physiologistes sont basées sur
le rôle modulateur et signal des sucres. De la même façon, tous les stress induisent un stress
oxydatif et une production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui jouent un rôle dans la
régulation de la voie de biosynthèse des caroténoïdes. Par exemple, les caroténoïdes sont de
forts antioxydants et sont utilisés à des fins de détoxication. Ils jouent un rôle important
dans la dissipation de l’énergie absorbée en excès par les tissus photosynthétiques à travers
le cycle des xanthophylles.
64
Dans le but de produire des fruits d’agrumes à teneurs augmentées ou garanties en
caroténoïdes, ces deux hypothèses ont été étudiées dans le cadre de ce travail de thèse.
Le premier objectif a été de déterminer l’impact de l’alimentation en sucres sur les
critères de qualité organoleptiques (calibre, maturité, sucres et acides organiques) et sur les
critères de qualité nutritionnels (caroténoïdes). Cette étude s’est déroulée en deux étapes
successives. Dans un premier temps, nous avons appliqué différentes charges en fruits dans
le but de modifier l’alimentation carbonée à un stade de développement unique, juste après
la chute physiologique afin d’observer les variations dans les critères de qualité, et
notamment dans la concentration en caroténoïdes de la pulpe du fruit à différents stades de
maturité. Dans un deuxième temps, nous avons mis en place ces différentes charges en
fruits, par défoliation ou ombrage des feuilles de façon à tester l’effet du stade d’application
du traitement : après la chute physiologique des fruits, au changement de couleur, et au
stade de maturité. Les effets ont été étudiés à une date précise correspondant à la maturité
pour les fruits témoins. Cette expérimentation a plusieurs intérêts. Premièrement, elle avait
pour but de déterminer à quel stade de développement du fruit, une forte charge en fruit
est plus propice à l’amélioration de certains critères de qualité tels que la concentration en
caroténoïdes, tout en maintenant le calibre et la cinétique de maturité du fruit.
Deuxièmement, cette étude avait pour but de définir si la durée d’application du traitement
est un élément déterminant dans l’amélioration de la concentration en caroténoïdes.
Le deuxième objectif a été d’étudier un effet éventuel d’un stress photooxydatif
appliqué sur des feuilles, à l’aide de différentes ombrières, sur les paramètres
photosynthétiques des feuilles. Puis, nous avons observé les effets que ce stress
photooxydatif pouvait produire dans la pulpe du fruit et notamment sur le métabolisme
antioxydant, d’une part, et sur la concentration en caroténoïdes, d’autre part.
65
Partie II : Matériels et
méthodes
Partie II : Matériels et méthodes
I.
Le matériel végétal
Les expérimentations ont été réalisées sur des clémentiniers âgés de 18 ans et des
orangers ‘Navelate’ âgés de 15 ans. Les arbres sont issus d’un verger expérimental sur le
domaine INRA-CIRAD de San Giuliano en Corse (42°18’55’’ N, 9°29’29’’ E ; 51m a.s.l.). Les
clémentiniers (Citrus clementina Hort. Ex Tan.) sont greffés sur le porte-greffe CitrangeCarrizo et les orangers (Citrus sinensis (L.) Osbeck) sur le porte-greffe Poncirus trifoliata (L.)
Raf. Les arbres ont une hauteur d’environ 2,5 m et sont espacés de 4 m dans un même rang
et de 6 m entre les rangs. Les expérimentations ont été réalisées sur des arbres irrigués,
indemnes de maladies et soumis aux mêmes conditions culturales (fertilisation et
traitements phytosanitaires).
II.
Les dispositifs expérimentaux
II.1.
Effet de l’alimentation en sucres sur les critères de qualité des fruits
d’agrumes
II.1.1.
Première étude : en fonction du stade de maturité des fruits
27 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés sur la
face est des clémentiniers et à hauteur d’hommes (environ 1,50 m). Les rameaux sont
répartis sur 10 arbres, ont un diamètre équivalent (environ 1 cm) et sont exposés de
manière similaire. La pleine floraison a été observée à la mi-avril et les rameaux ont été
« annelés » après la chute physiologique des fruits, à la mi-juillet. L’annélation a consisté à
enlever un morceau de l’écorce large de 10 à 15 mm au milieu de la tige principale de
chaque rameau afin d’empêcher tout transport des assimilats depuis les rameaux vers le
reste de l’arbre, ou inversement. Seules les connexions phloémiennes ont été supprimées.
Les traitements ont été appliqués aléatoirement, à raison de 2 ou 3 rameaux fructifères par
arbre. Chaque rameau possède un seul fruit. Pour le témoin, les rameaux ont été annelés à
30 feuilles. Ce traitement correspond à une charge en fruit faible par rapport au nombre de
feuilles. Ce rapport élevé (30 feuilles par fruit) ou cette faible charge en fruits, a été choisi en
fonction d’études précédentes, et il garantit un approvisionnement en sucres non-limitant
67
pour le développement et la croissance du fruit. Pour le second traitement, 15 feuilles par
rameaux ont été conservées (charge en fruits moyenne). Et pour le troisième traitement, 5
feuilles par rameaux ont été gardées. Ce dernier traitement correspond à une charge en
fruits élevée. Aucune chute de fruits n’a été observée durant l’expérimentation.
Durant l’expérimentation, les données climatiques ont été enregistrées : température,
pluviométrie et rayonnement global (Tableau 5).
Tableau 5: Données climatiques du mois de juillet 2007 au mois de janvier 2008 à San Giuliano.
Pluviométrie
Radiation globale
(mm)
(J.cm-2)
23,8
0
2719,4
29,3
23,4
2
2152,4
15,3
25,7
20,1
12,5
1712,4
Octobre
12,5
21,3
16,5
354,3
1108,2
Novembre
8,6
16,6
11,9
49
711,9
Décembre
6,1
15,5
9,6
165
564,8
Janvier
6,2
14,8
9,9
63.2
625,1
T min (°C)*
T max (°C)*
T moy (°C)*
Juillet
17,9
29,6
Août
18,4
Septembre
* T min : température mensuelle minimale ; T
journalière ; T moy : température mensuelle moyenne.
max:
température mensuelle maximale
3 fruits par traitement ont été récoltés, pour chacune des trois dates de
récolte choisies: 25 octobre 2007 (date I), 22 novembre 2007 (date II), et 9 janvier 2008
(date III). La maturité des fruits a été estimée en utilisant des indicateurs de maturité tels
que l’extrait sec soluble (ESS), l’acidité titrable (AT) et l’indice de maturité (ESS/AT).
II.1.2.
Deuxième
étude :
en
fonction
des
différents
stades
de
développement du fruit
75 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés sur la
face est des clémentiniers et à hauteur d’homme (environ 1,50 m). Les rameaux sont
répartis sur 3 arbres, ont un diamètre équivalent (environ 1 cm) et sont exposés de la même
manière. L’annélation a été appliquée sur les rameaux possédant 40 feuilles le 23 juillet 2008
après la chute physiologique des fruits. Au moment de l’annélation, tous les fruits
68
Figure 26: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les critères de qualité du fruit
d’une réduction réversible ou non de l’alimentation en sucres en fonction du stade de
développement. Les deux traitements, défoliation et ombrage, ont été appliqués à deux stades de
développement du fruit (le 24 juillet et le 15 septembre). Durant la phase de maturation, seule un
traitement défoliation a été réalisé (le 17 novembre). Le témoin correspond à la faible charge en
fruits (30 feuilles par fruit).
69
ont un diamètre compris entre 23 et 27 mm. Aucune chute de fruits n’a été observée durant
toute la durée de l’expérimentation. Tous les rameaux fructifères possèdent 40 feuilles au
début de l’expérimentation. Avant chaque traitement, tous les rameaux ont été défoliés à 30
feuilles afin qu’ils soient dans les mêmes conditions. Ils ont tous été soumis au stress que
peut provoquer une défoliation. La défoliation et l’ombrage des feuilles ont été utilisés pour
obtenir trois niveaux de charge en fruits : élevée (5 feuilles par fruit), moyenne (15 feuilles
par fruit), et faible (30 feuilles par fruit) (Figure 26). La défoliation (traitement permanent) et
l’ombrage (traitement réversible) ont été réalisés sur 15 rameaux (5 rameaux par traitement
x 3 niveaux de charge en fruits) le 24 juillet 2008, précocement après la chute physiologique
des fruits, et le 15 septembre 2008, à un stade intermédiaire au moment du changement de
couleur. Au stade de maturité correspondant à un stade tardif, seule une défoliation a été
appliquée (le 17 novembre 2008). L’ombrage des feuilles a été réalisé en utilisant un filet
d’ombrage totalement opaque, pour obtenir soit 5 ou 15 feuilles par fruit. Après 15 jours, les
ombrages ont été retirés.
Tableau 6 : Données climatiques du mois de juillet 2008 au mois de décembre 2008 à San Giuliano.
Pluviométrie
Radiation globale
(mm)
(J.cm-2)
24,2
0
2644,4
30,5
24,5
9
2326,8
15,5
26
20
21,5
1612,5
Octobre
13,2
23,2
17,4
248,5
1125,3
Novembre
9
17,9
12,6
345
639,4
Décembre
5,9
13,9
9,2
222,5
458,6
T min (°C)*
T max (°C)*
T moy (°C)*
Juillet
18,8
29,6
Août
19,4
Septembre
* T
température mensuelle minimale ; T
min :
max:
Tous les fruits ont été récoltés le 1er décembre 2008. La maturité des fruits a été
estimée en utilisant les indicateurs de maturité habituels : l’extrait sec soluble (ESS), l’acidité
titrable (AT) et l’indice de maturité (ESS/AT).
70
Figure 27: Spectre de caractérisation de la transmission de l’énergie lumineuse pour les deux
ombrières utilisées : l’ombrière transmettant 81,78% de la lumière source (A) et celle transmettant
9,15% de la lumière source (B). La lumière source correspondant au soleil est représenté par un trait
plein de couleur bleu et la source agrémentée d’un filtre par un trait en pointillée de couleur rose.
71
II.2.
Troisième étude : effet d’un stress photooxydatif imposé au niveau des
feuilles sur la concentration en caroténoïdes des fruits proches
Dans cette expérimentation, nous avons choisi de travailler sur des oranges et non sur
des clémentines pour différentes raisons techniques. Pour cet essai, il était nécessaire de
travailler sur des arbres bien orientés pour recevoir le plus de lumière naturelle possible.
Donc nous avons choisi des arbres bien exposés, n’étant ombrés ni par des rangs de bordure
ni par des haies brise-vent. De plus, afin de pouvoir réaliser toutes les analyses souhaitées
pour notre étude, une plus grande quantité de matière était nécessaire. Les oranges
« Navelate » possédaient toutes ses caractéristiques.
48 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés parmi 4
orangers de façon à avoir la même exposition à la lumière, et le même diamètre initial
(environ 1 cm). Tous les rameaux ont la même orientation à l’est et sont à la même hauteur
(environ 1,5 m du sol). Les rameaux ont été annelés à 40 feuilles avant le début de
l’expérimentation le 3 février 2009 durant la phase III du développement du fruit, c’est-àdire lorsque le fruit est en cours de maturation. Les traitements ont été répartis
aléatoirement sur les arbres sélectionnés.
Nous avons utilisé deux types de filet d’ombrage permettant de diminuer l’énergie de
la lumière transmise. Leurs spectres de transmissions ont été comparés à une lumière
source, qui est le soleil et ont été caractérisées par spectrométrie Li-Cor-Li-1800. L’énergie
(300-1100 nm) transmise par le soleil est de 693,30 W/m² tandis que celle transmise lorsque
la lumière du soleil est additionnée d’un filtre est de 564,22 W/m² pour le filet d’ombrage de
couleur verte et de 63,46 W/m² pour le filet d’ombrage de couleur noir. Nos deux filets
d’ombrages permettent donc la transmission de 9,15% (filet d’ombrage de couleur noir
bloquant la transmission de 91,75% de l’énergie lumineuse) et de 81,78% (filet d’ombrage de
couleur noir bloquant la transmission de 18,22% de l’énergie lumineuse). La quantité de
lumière a été modifiée à l’aide de ces ombrages mais pas la qualité. En effet, aucune
longueur d’onde n’a été filtrée spécifiquement (Figure 27).
72
Figure 28: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les fruits d’un stress photooxydatif
appliqué au niveau des feuilles proches.
73
Sur chacun des rameaux, les 10 feuilles les plus proches du fruit, en position terminale,
et les plus exposées à la lumière, ont été ombrées individuellement à l’aide du filet
d’ombrage 91,75% (Figure 28).
Après 6 jours d’adaptation à une faible quantité de lumière, un stress photooxydatif a
été testé, le 9 février 2009. 16 rameaux, correspondant au témoin (T), ont conservé leurs
filets d’ombrage à 91,75% jusqu’à la fin de l’expérimentation. 16 rameaux, correspondant au
traitement d’intensité lumineuse élevé, ont été soumis brutalement à une forte intensité
lumineuse par l’élimination des filets d’ombrage des feuilles. Pour finir, 16 rameaux,
correspondant au traitement d’intensité lumineuse moyenne, ont reçu une intensité
lumineuse intermédiaire : les filets d’ombrage à 91,75% ont été remplacés par des filets
d’ombrage à 18,22%. Les feuilles ont reçu ainsi 81,78% de l’intensité lumineuse.
Pendant l’expérience, de mesures écophysiologiques ont été réalisées sur une
quinzaine de feuilles afin de déterminer si les feuilles ont été exposées à un stress
photooxydatif.
Les paramètres mesurés sur ces feuilles sont le rendement quantique maximum du
photosystème II (Fv/Fm), le rendement minimal de la fluorescence (Fo), le rendement
maximal de la fluorescence (Fm), la variation de la fluorescence (Fv), et l’indice de
performance (PI) en utilisant le système portable handyPEA (Hansateck, Norfalk, Angleterre).
L’indice de performance est composé de trois composantes indépendantes
contribuant à la photosynthèse : RC/ABS , Fv/Fo et (1-Vj)/Vj. Les trois composantes
représentent respectivement la contribution au PI de la densité des centres réactionnels
actifs, des réactions lumineuses pour la photochimie primaire et les réactions de la phase
sombre.
Pour chacun des rameaux fructifères traités, quatre récoltes ont été effectuées : I) le 9
février, 3 heures après l’application du stress ; II) le 10 février, 27 heures après ; III) le 11
février, 51 heures après ; et IV) le 13 février, 99 heures après. Les récoltes ont porté sur 4
fruits par traitement.
74
Stress
Acclimatation
Tableau 7: Données climatiques du 3 au 13 février 2009 à San Giuliano.
Tmoyenne
Précipitations
Radiation globale
(°C)*
(mm)
(J.cm )
15
10.2
0
854
6
15.6
10.8
0
991
5 février
6.1
18.4
11.9
1
818
6 février
8.1
18
12.6
0
733
7 février
6.4
15.1
9.7
0.5
1101
8 février
3.1
13.7
8.2
0
1061
9 février
4.2
15.2
8.9
0
1174
10 février
6.5
19.1
12
0
830
11 février
5.3
11.8
9
0.5
482
12 février
3.8
11.5
7.2
0.5
849
13 février
1.7
8.9
4.1
0
713
Tmin (°c)*
Tmax (°C)*
3 février
6.3
4 février
* T min : température mensuelle minimale ; T
max:
-2
III.
Conservation des échantillons
Après la récolte, les fruits ont été pelés et l’échantillon de pulpe du fruit a été broyé en
une fine poudre à l’aide d’azote liquide. Cette dernière a été placé dans un contenant en
verre ambré sous atmosphère d’azote et conservée au congélateur à -80°C. Une partie de
cette poudre a été pesée puis lyophilisée afin d’obtenir la matière sèche et la matière de
départ pour le dosage des sucres et des acides organiques. Les feuilles récoltées ont été
plongées dans un bain d’azote liquide puis placées directement au congélateur à -80°C.
IV.
Mesure de l’indice de maturité
La mesure de l’acidité titrable a été déterminée par titrage de la soude (0.1 mol.L-1,
pH=8.2) grâce à un titrateur automatique Mettler, DL 25 (Mettler-Toledo, France). Elle a
75
neutralisé les protons libres à l’aide d’une base forte et a été exprimée en milliéquivalent
d’acide citrique/g de matière fraîche (Boland, 1990). Les mesures d’extrait sec soluble (°
Bricks) contenu dans la pulpe ont été réalisées à l’aide d’un réfractomètre (modèle Atago, 032%, VWR). Les degrés Brix ont été exprimés en pourcentage (Bassene et al., 2009). L’indice
de maturité a été déterminé en utilisant le rapport ESS (Extrait Sec Soluble) / AT (Acidité
titrable). Pour les fruits de clémentines mûrs, l’indice de maturité est situé aux alentours de
12.
V.
Les analyses biochimiques
V.1.
Dosage des sucres et des acides organiques
V.1.1.
Préparation des échantillons
V.1.1.1.
Extraction des sucres
Les sucres ont été extraits selon la méthode décrite par Gomez et al. (2002) : 100 mg
de poudre lyophilisées de pulpe d’agrumes ont été homogénéisées dans 10 mL d’un
mélange méthanol/eau (50:50, v:v, VWR (West Chester, USA)) et 5 mL de chloroforme
(VWR). Cette suspension a été agitée pendant 30 min puis centrifugée à 5500 g pendant 15
min. Le surnageant a été séché pendant une nuit à l’aide d’un évaporateur rotatif à
température ambiante puis dissous dans un mélange de 3 mL d’eau et de 1 mL de polyvinyle
pirrolidone (PVP) à 5% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne). Après agitation, le mélange a
été placé 30 min à température ambiante avant de le centrifuger à 5500 g pendant 10 min.
Le surnageant a été filtré sur une membrane d’acétate de cellulose de diamètre 25 mm et de
porosité 22 µm (VWR) puis placé dans un flacon pour l’analyse par HPLC.
V.1.1.2.
Extraction des acides organiques
Les acides organiques ont été extraits selon la méthode décrite par Albertini et al.
(2006). 100 mg de poudre ont été lyophilisés, puis solubilisés dans 5 mL d’eau bi-distillée, et
homogénéisées au vortex puis au Dounce pendant 1 min. La suspension a été centrifugée à
76
4000 g pendant 10 min à température ambiante. Le surnageant a été filtré sur une
membrane d’acétate de cellulose de diamètre 25 mm et de porosité 22 µm (VWR), puis
placé dans un flacon pour l’analyse par HPLC.
V.1.2.
Analyse des sucres par HPLC
Les sucres ont été analysés par HPLC en utilisant un réfractomètre (Perkin-Elmer, série
200, Waltham, USA). Les sucres ont été séparés par une colonne en C16 de silice avec des
groupements amines (High Performance Carbohydrates, 250 x 4,6 mm, d. 4 µm (Waters,
Mulfort, USA)) selon la méthode décrite par Albertini et al. (2006). Les phases mobiles sont
l’acétonitrile (VWR) comme éluant A et l’eau bi-distillée comme éluant B. Le débit a été fixé
à 1 mL.min-1, la température de la colonne est à 35°C et le volume d’injection est de 10 µL.
L’élution des sucres a été réalisée en mode isocratique en plusieurs étapes : I) l’étape
d’équilibrage, 0-15 min, 70%A 30%B ; II) l’étape d’élution, 15-25 min, 70%A 30%B ; III)
l’étape de rinçage, 25-27 min, 100% A.
V.1.3.
Analyse des acides organiques par HPLC
Les acides organiques ont été analysés par HPLC en utilisant un détecteur UV (PerkinElmer, série 200, Waltham, USA) selon la méthode décrite par Albertini et al. (2006). Les
acides organiques ont été séparés en phase interne par une colonne en C18, échangeuse de
cations (Sphéri-5 RP 18, 220 x 4,6 mm, d. 5 µm, Perkin-Elmer). Les phases mobiles sont le
tampon phosphate 25 mM à pH 2,4 (VWR) comme éluant A, l’acétonitrile (VWR) comme
éluant B, et l’eau comme éluant C. Le débit a été fixé à 1 mL.min -1, la température de la
colonne est de 20°C et le volume d’injection est de 20 µL. L’élution des acides organiques a
été réalisée en mode isocratique en plusieurs étapes : I) l’étape d’équilibrage, 0-15 min,
100%A ; II) l’étape d’élution, 15-30 min, 100%A ; III) l’étape de rinçage, 30-31 min, 30%B
70%C. Les acides organiques ont été détectés à une longueur d’onde de 210 nm.
77
V.1.4.
Identification et quantification des sucres et des acides organiques
Les sucres ont été identifiés par leur indice de réfraction et leur temps de rétention en
comparaison avec l’injection de trois standards : glucose, fructose et saccharose (Sigma
Aldrich). Les acides organiques ont été identifiés par leur temps de rétention en
comparaison avec l’injection de cinq standards : acide oxalique, acide malique, acide
ascorbique, acide citrique et acide succinique (Sigma Aldrich).
Les données ont été collectées, stockées et intégrées en utilisant le logiciel
TotalChromTM version 6,2 (Perkin-Elmer).
Les sucres et les acides organiques ont été quantifiés en utilisant des courbes de
calibrage pour les différents composés identifiés. Les concentrations ont été exprimées en
mg.g-1 de matière sèche. Les concentrations totales de sucres et d’acides organiques ont été
calculées par addition des concentrations de tous les composés identifiés.
V.2.
Dosage des caroténoïdes
V.2.1.
Préparation des standards
Les concentrations des solutions standard ont été calculées par des mesures au
spectrophotomètre en les dissolvant dans un solvant approprié dans un bain à ultrasons, et
en utilisant leur coefficient d’extinction molaire (ε) (Tableau 8).
Tableau 8: Préparation des solutions standards.
Solvant de dissolution
Coefficient d’extinction (L.mol-1.cm-1)
lutéine
Ethanol
144 800
zéaxanthine
Ethanol
140 900
β-cryptoxanthine
Dichlorométhane
135 700
β-carotène
Dichlorométhane
138 900
lycopène
Dichlorométhane
184 900
Standard
78
La solution de lycopène servant de standard interne a été diluée afin d’obtenir une
concentration finale de 120 mg.L-1.
V.2.2.
Extraction et saponification des caroténoïdes
Les caroténoïdes ont été extraits selon la méthode décrite par Fanciullino et al. (2006).
Les caroténoïdes étant des molécules sensibles à la lumière et à l’oxygène, toutes les étapes
ont été conduites en lumière inactinique et les extraits transférés dans des flacons de verre
ambré sous atmosphère d’azote.
Les caroténoïdes de la pulpe des agrumes ont été extraits à partir de 2,5 g de matière
fraîche broyée en une fine poudre à laquelle ont été ajoutés 120 mg d’hydroxyde de
carbonate de magnésium (MgCO3, Sigma-Aldrich) et 35 mL du mélange d’extraction
(éthanol/hexane (VWR), 4:3, v:v, contenant 0,1% de ter-butylhydroxytoluène (BHT, SigmaAldrich)). 300 µL, équivalents à 30 µg d’une solution de lycopène ont été ajoutés comme
standard interne. Le mélange a été agité pendant 5 min. Les résidus ont été séparés de la
phase liquide par filtration avec un entonnoir filtrant de porosité n°2, puis ré-extraits avec 35
mL d’éthanol/hexane (4:3, v:v). Les résidus ont ensuite été rincés avec successivement 30 mL
d’éthanol et 30 mL d’hexane jusqu’à leur décoloration. Les phases organiques ont été
transférées dans une ampoule à décanter et lavées successivement avec 2 X 50 mL de
chlorure de sodium à 10% (NaCl, VWR) et 3 X 50 mL d’eau bi-distillée. La phase aqueuse a
été éliminée. La phase hexanique a été séchée à l’aide du sulfate de sodium anhydre (NaSO4,
VWR), filtrée et évaporée à 40°C dans un évaporateur rotatif.
L’extrait sec a ensuite été dissout dans 20 mL d’hexane puis placé dans un flacon
ambré dans lequel 10 mL d’hydroxyde de potassium 20% (KOH, VWR) méthanolique ont été
ajoutés. La saponification a été effectuée durant toute une nuit à température ambiante
sous agitation et sous atmosphère d’azote. L’échantillon a ensuite été transféré dans une
ampoule à décanter pour séparer la phase hexanique de la phase méthanolique. La phase
hexanique a été lavée à l’eau bi-distillée jusqu’à la neutralité. Les caroténoïdes présents dans
la phase méthanolique ont été extraits par ajout de 3 X 10 mL de dichlorométhane (VWR).
Ces extraits ont également été lavés à l’eau distillée jusqu’à neutralité. Les extraits issus des
deux phases ont été regroupés, séchés à l’aide de NaSO4, filtrés et évaporés à 40°C au
79
Tableau 9: Caractéristiques spectrales des caroténoïdes présent dans la pulpe des agrumes
N°
Temps de
rétention
(min)
Identification
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
22.06
23.77
25.30
26.62
29.02
29.45
30.84
31.72
34.51
39.00
40.14
50.98
60.74
Cis-violaxanthine
a
Lutéine
a
Zéaxanthine
Cis-anthéraxanthine
15-cis-β-cryptoxanthine
Zéinoxanthine
Phytoène
a
β-cryptoxanthine
Phytofluène
a
β-carotène
ζ-carotène
Cis-lycopène
a
Lycopène
a
λ max (nm) observée
Cis328
Cis330
Cis335
Cis360
λ max (nm) dans la littérature
Pic I
Pic II
Pic III
% III/II
413
419
426
421
421
421
276
428
332
436
444
449
442
441
444
286
452
348
452
401
466
473
465
470
473
469
470
474
297
478
367
479
427
496
502
86
33.3
6
55.5
381
440
447
Cis328
Cis330
Cis338
25
84
13
52.7
62.5
Cis355
Pic I
Pic II
Pic III
% III/II
412
422
426
417
420
421
276
427
331
436
444
450
440
444
445
286
450
348
452
400
466
472
464
472
476
468
470
472
298
477
368
477
420
490
502
81
48
17
47
379
441
446
20
68
12
90
45
71
Identifiés en utilisant les standards authentiques, par comparaison avec leur temps de rétention et le spectre UV-visible. Nous avons tenté d’identifier les autres pigments
en utilisant les caractéristiques des spectres rapportés dans la littérature. Les solvants et le programme d’élution en gradient sont les mêmes que dans la littérature
(Fanciullino et al., 2008).
80
moyen d’un évaporateur rotatif. Les résidus ont été dissous dans 500 µL d’un mélange
méthyl-tert-butyl-éther (MTBE,Sigma-Aldrich)/méthanol (VWR) (80:20, v:v). Les échantillons
ont ensuite été placés dans un flacon ambré pour l’analyse par HPLC.
V.2.1.
Analyse des caroténoïdes par HPLC
Les caroténoïdes ont été analysés par HPLC en utilisant un détecteur à barrettes de
diodes (L-2455 Hitashi, Tokyo, Japon) selon la méthode décrite par Fanciullino et al. (2006).
Les caroténoïdes ont été séparés par une colonne en C30 (250 x 4,6 mm, d. 5 µm, YMC
(EUROP GmbH)). Les phases mobiles sont l’eau bi-distillée comme éluant A, le méthanol
comme éluant B et le MTBE comme éluant C. Le débit est fixé à 1 mL.min -1, la température
de la colonne est de 25°C et le volume d’injection est de 20 µL. L’élution des caroténoïdes
est réalisée en mode gradient en plusieurs étapes : I) 0-5 min, 40%A 60%B ; II) 5-10 min,
20%A 80%B ; III) 10-60 min, 4%A 81% B 15%C ; IV) 60-71 min, 4%A 11%B 85%C ; et V) 71-72
min, 100%B.
Le détecteur à barrettes de diodes a permis de mesurer l’absorbance à différentes
longueurs d’onde : 290, 350, 400, 450, et 470 nm.
V.2.2.
Identification et quantification des caroténoïdes
Les données chromatographiques et les spectres UV-visibles ont été collectés, stockés
et intégrés par le logiciel EZChrome version 6,8 (VWR).
Les
caroténoïdes
ont
été
identifiés
en
comparant
leurs
caractéristiques
chromatographiques et spectrales à celles des standards disponibles ou aux données
détaillées dans la bibliographie et obtenues dans les mêmes conditions chromatographiques
et sur le même matériel végétal (Tableau 9).
Les composés ont été quantifiés en utilisant une courbe de calibrage du β-carotène.
Les concentrations en caroténoïdes ont été exprimées en µg (β-carotène équivalent).g-1 de
matière fraîche. Chaque caroténoïde a été quantifié en utilisant les aires collectées à la
81
longueur d’onde maximale de son spectre. Le rendement a été déterminé par l’ajout d’un
étalon interne, le lycopène, dans chaque échantillon avant l’extraction. Le rendement a été
utilisé pour corriger les concentrations obtenues. La concentration en caroténoïdes totaux a
été calculée par addition des concentrations de chacun des composés.
Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été déterminées pour le
β-carotène à partir d’une série de dilution d’un standard (concentrations comprises entre 1
et 10 mg.L-1) et de plusieurs injections de chaque point de dilution. Les LOQ et LOD ont été
calculées selon les équations suivantes : LOD = 3 X S/a et LOQ = 10 / S/a où « S » est l’écart
type de l’ordonnée à l’origine et « a » le coefficient de la droite de calibrage obtenue avec
les points de dilution (Melendez-Martinez et al., 2003).
V.3.
Dosage du péroxyde d’hydrogène
Les niveaux en peroxyde d’hydrogène ont été déterminés par la méthode décrite par
Murshed (2009) et Velikova et al. (2000). 250 mg de pulpe finement broyée à l’aide d’azote
liquide ont été homogénéisés dans un bain de glace dans 5 mL d’acide trichloroacétique
(TCA, Fisher (Waltham, USA)) à 0,1%. L’homogénat a été centrifugé à 12000 g pendant 5 min
à 4°C.
A 500 µL de surnageant ont été ajoutés 500 µL de tampon potassium (VWR) à 10 mM à
pH 7 et 1 mL d’iodure de potassium à 1M (VWR). Le mélange a été agité brièvement puis
incubé à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 30 minutes avant la lecture de
l’absorbance à 390 nm au spectrophotomètre (Specord 205, Analytic Jena (Wembley,
Angleterre)).
Une solution de peroxyde d’hydrogène commerciale (VWR) a été utilisée pour générer
une courbe de calibrage afin de quantifier la concentration en peroxyde d’hydrogène dans la
pulpe des agrumes. Les concentrations ont été exprimées en mM.g-1 de matière fraîche.
82
V.4.
Dosage de l’ascorbate
Les concentrations en ascorbate total (AA et DHA) et en ascorbate réduit (AA) ont été
mesurées en accord avec la méthode décrite par Gillepsie et Ainsworth (2007). 150 mg de
pulpe finement broyée dans l’azote liquide ont été homogénéisées dans 3 mL d’une solution
froide d’acide trichloroacétique (TCA, Fischer) à 6%. L’homogénat a été centrifugé à 13000 g
pendant 5 min à 4°C. Le surnageant a été utilisé pour le dosage de l’ascorbate et de
l’ascorbate total.
Pour mesurer l’ascorbate total, 500 µL d’extrait ont été ajoutés à 100 µL de tampon
phosphate 75 mM (pH 7) (VWR), 200 µL de TCA 6% et 100 µL de DL-dithiothréitol (DTT,
Sigma-Aldrich). Après une incubation de 10 min à température ambiante, 100 µL de Néthylmaléimide (NEM, Sigma-Aldrich) à 0,5% (v:v) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé
pendant 30 s à température ambiante afin de supprimer l’excès de DTT. Ensuite 1,5 mL d’un
mélange réactionnel contenant 500 µL de TCA 10%, 400 µL d’acide orthophosphorique
(H3PO4, VWR) à 43% (v:v), 400 µL de 2,2-bipyridyl (Sigma-Aldrich) à 4% (w:v) dissous dans de
l’éthanol 70%, et 200 µL de chlorure de fer (Sigma-Aldrich) à 3% (w:v) ont été ajoutés. Après
1 heure d’incubation à 37°C, l’absorbance a été mesurée à 525 nm au spectrophotomètre
(Specord 205, Analytic Jena (Wembley, Angleterre)).
Pour la détermination de la concentration en ascorbate réduit, la même réaction a été
utilisée mais 200 µL de tampon phosphate ont été utilisés à la place du DTT et du NEM.
Une solution de L-acide ascorbique commerciale (VWR) a été utilisée pour générer une
courbe de calibrage afin de quantifier la concentration en ascorbate total et en ascorbate
réduit dans la pulpe des agrumes. Les concentrations ont été exprimées en mM.g-1 de
matière fraîche.
La quantité de déshydroascorbate (DHA) a été estimée par la différence entre la
concentration en ascorbate totale et celle en ascorbate réduit (AA).
83
VI.
Les analyses statistiques
D’une manière générale, nous avons considéré que les traitements ont été distribués
de manière aléatoire dans une population homogène de rameaux fructifères.
VI.1.
Analyse de variance
Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± des erreurs standards (SE). Une
analyse de variance, suivie par des comparaisons multiples des moyennes, a été effectuée à
l’aide du logiciel statistique R (http.R-project.org). Les moyennes ont été comparées en
utilisant le test de Kruskal-Wallis (α=0,05).
VI.2.
Représentation Heatmap
La représentation Heatmap a été obtenue en utilisant le logiciel R. La matrice de
données est constituée par les concentrations en métabolites (sucres, acides organiques et
caroténoïdes) représentée dans les colonnes et les différents traitements représentés dans
les lignes. Les concentrations en métabolites dont les valeurs ont été centrées réduites ont
servi de base pour la construction des classifications hiérarchiques en utilisant les distances
euclidiennes. A ces concentrations ont été associées des couleurs dont l’intensité varie en
fonction de la valeur. Les valeurs augmentent de la couleur verte vers les couleurs orangerouge.
84
Partie III : Résultats et
discussion
A
60
c
c
c
c
ab
a
ab
Date I
Date II
Date III
c
Diamètre (mm)
50
40
30
bc
20
10
0
B
Poids frais du fruit (g)
70
d
d
60
50
cd
40
30
cd
20
10
cd
bc
a
a
Date I
Date II
ab
0
Date III
Figure 29: Diamètre (A) et poids frais de fruits de
clémentine (B), au cours de la maturation, en fonction
de la charge en fruits : élevée (
), moyenne (
)
et faible (
). Les points correspondent aux moyennes
et les barres aux erreurs standard. Des lettres
différentes (a, b, c) indiquent des différences
significatives entre les traitements et entre les dates
considérées (α=5%).
86
Partie III : Résultats et discussion
I.
L’effet de l’alimentation en sucres sur la biosynthèse des caroténoïdes
I.1.
En fonction des stades de maturité des fruits
Différentes études ont montré qu’il est possible d’augmenter substantiellement la
concentration en caroténoïdes chez la carotte (+120%), l’épinard (30%) et la tomate (50%)
(Abushita et al., 2000; Kidmose et al., 2000), à travers les approches purement
agronomiques.
Le
levier
environnemental
peut
être
utilisé
pour
augmenter
considérablement la concentration en caroténoïdes d’une large gamme de fruits et de
légumes (Poiroux-Gonord et al., 2010).
L’objectif de cette étude est de déterminer l’effet de l’alimentation en sucres sur les
critères de qualité des agrumes, cultivés en plein champ, et en particulier sur la
concentration en caroténoïdes. Pour cela, nous avons imposé des défoliations contrôlées,
juste après la chute physiologique des fruits. Les critères de qualité, et notamment la
concentration en caroténoïdes, ont été étudiés à différents stades de développement du
fruit.
I.1.1.
L’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité
organoleptiques et nutritionnels
I.1.1.1.
L’effet de la charge en fruits sur le calibre du fruit et sur les
indicateurs de maturité
Les résultats présentés correspondent aux derniers stades de développement du fruit.
Aucune augmentation significative du diamètre ou du poids frais du fruit n’a été observée de
la date I à la date III dans aucun des trois traitements considérés (Figures 29A et 29B). Il n’y a
aucune différence sur le diamètre des fruits soumis à une charge en fruits moyenne, mais les
fruits soumis à une charge en fruits élevée sont environ 23% plus petits que les témoins, et
cela aux trois dates de prélèvements. Le poids frais des fruits le plus faible a été observé
avec le traitement correspondant à une charge en fruits élevée et cela qu’on le compare
avec le témoin (-50%) ou avec le traitement correspondant à une charge
87
A
600
Concentration en sucres
(mg.g-1 MS)
a
a
500
400
ab
bc
c
c
d
300
d
200
d
100
0
Date I
Date II
e
e
Date III
B
Concentration en acides
totaux (mg.g-1 MS)
400
350
300
250
d
200
150
cd
cd
bc
cd
100
ab
a
Date II
Date III
50
0
Date I
C
0,18
MS/MF
0,14
0,12
ab
b
0,16
ab
ab
ab
0,10
a
a
a
a
Date II
Date III
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
Date I
Figure 30 : Concentrations en sucres totaux (A), en acide
totaux (B) et du rapport matière sèche sur matière fraîche
(MS/MF) des fruits de clémentine (C), au cours de la
maturation, en fonction de la charge en fruits : élevée
(
), moyenne (
) et faible (
). Les points
correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs
standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des
différences significatives entre les traitements et entre les
dates considérées (α=5%).
88
en fruits moyenne (-50%). Bien que non significatif, le poids frais des fruits soumis à une
charge en fruits moyenne est inférieur de 22% par rapport au témoin. Si l’on considère
l’indice de maturité (IM) (Tableau 9), les fruits témoins ont atteint leur maturité à la date II,
alors que pour les fruits des deux autres traitements il a fallu un mois et demi en plus pour
atteindre la maturité (IM≈13,6).
Tableau 9: Indice de maturité des fruits de clémentine en fonction des charges en fruits et des
dates considérées. Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres différentes (a,
b, c) indiquent des différences significatives entre les traitements et les dates (α=5%).
Charge en fruits
Date I
Date II
Date III
Elevée
Moyenne
Faible (témoin)
6,67±0,67 ab
6,46±0,96 a
13,81±1,97 c
9,41±0,45 b
7,43±0,90 ab
13,97±1,95 c
9,58±1,18 b
15,21±0,90 c
13,02±0,79 c
Une augmentation de la charge en fruits se traduit par un retard de la maturité des
fruits. Chez le témoin, l’augmentation de l’indice de maturité de la date I à la date II est
caractérisée par une augmentation de la concentration en sucres totaux et une diminution
concomitante de la concentration en acides organiques totaux (Figures 30A et 30B). Il n’y a
eu cependant aucun changement supplémentaire de la concentration en sucres et en acides
organiques de la date II à la date III, alors que l’indice de maturité a diminué légèrement
pour atteindre la valeur de 13.
Pour les traitements ayant des charges en fruits moyenne et élevée, la concentration
totale en sucres (Figure 30A) et l’indice de maturité ont continué d’augmenter de la date II à
la date III. A la date III, les trois traitements ont un indice de maturité similaire (Tableau 9) (≈
13,6). De ce fait, nous avons décidé de comparer nos différents traitements à cette date.
Le rapport MS/MF ne semble pas être affecté ni par les traitements ni par les dates
(Figure 30C). Nous avons conclu de cette observation que toutes les comparaisons de
concentrations réalisées sur la base de la matière sèche sont également valables pour une
expression en fonction de la matière fraîche.
89
Concentration en
caroténoïdes (µg.g-1 MS)
450
d
400
350
300
c
250
200
150
100
d
bc
ab
a
a
ab
Date I
Date II
c
50
0
Date III
Figure 31: Concentrations en caroténoïdes totaux des
fruits de clémentine, au cours de la maturation, en
fonction de la charge en fruits : élevée (
),
moyenne (
) et faible (témoin) (
). Les points
correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs
standard. Des lettres différentes (a, b, c, d) indiquent
des différences significatives entre les traitements et
entre les dates considérées (α=5%).
Caroténoïdes totaux
(mg/fruit)
1,60
b
1,40
1,20
1,00
a
a
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Elevée
Moyenne
Faible
Figure 32: Quantité de caroténoïdes totaux par fruit, à
la date III, pour les traitements avec une charge en
fruits élevée ( ), moyenne ( ) et faible (témoin) ( ).
Les données représentées sont des moyennes et les
barres correspondent aux erreurs standard. Des lettres
différentes (a, b) indiquent des différences significatives
entre les traitements (α=5%).
90
Ces observations sont cohérentes avec les observations réalisées sur la vigne, la pêche,
la tomate et la mangue (Gautier et al., 2008; Genard et al., 1998; Lechaudel et al., 2002,
2005; Lescourret et al., 1998). Globalement les acides organiques ont suivi une tendance
inverse, leurs concentrations sont les plus basses dans les fruit témoin, ce qui correspond à
ce que nous savons de la dynamique des sucres et des acides organiques dans les fruits
d’agrumes (Tadeo et al., 2008). Nos résultats ont confirmé que la charge en fruits élevée a
un effet négatif sur les critères de qualité organoleptique du fruit.
I.1.1.2.
L’effet de la charge en fruits sur les caroténoïdes
La concentration en caroténoïdes totaux a augmenté globalement de la date I à la date
III dans les trois traitements, à l’exception du témoin qui a atteint un plateau à la date III, ce
qui est cohérent avec l’hypothèse formulée précédemment, c’est-à-dire qu’à la date II les
fruits témoins ont déjà atteint leur maturité (Figure 31). La concentration en caroténoïdes
totaux est plus élevée (106 % et 82% respectivement) chez les fruits soumis aux traitements
correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin. Au
contraire, il n’y a pas de différence significative entre ces deux traitements à la date III.
Ces résultats suggèrent que la limitation de l’alimentation en sucres du fruit pourrait
fortement améliorer ses qualités nutritionnelles, si ils sont exprimés en matière sèche.
Cependant, ces conclusions sont différentes si ces données sont exprimées en quantité de
caroténoïdes par fruit.
La quantité de caroténoïdes par fruit la plus élevée a été obtenue avec le traitement
correspondant à une charge en fruits moyenne par rapport au témoin (+26,7%) ou par
rapport au traitement correspondant à une charge élevée en fruits (+43,8%) (Figure 32). Ce
sont les fruits provenant du traitement correspondant à la charge en fruits moyenne qui
contiennent la plus grande quantité de caroténoïdes et semblent donc posséder les
meilleurs critères de qualité nutritionnels.
91
Nos résultats sur l’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité organoleptique
et nutritionnel ne soutiennent pas l’hypothèse selon laquelle les carbohydrates déterminent
la synthèse des caroténoïdes dans les fruits.
La concentration en caroténoïdes totaux ne semble pas être corrélée avec la
concentration totale en sucres (R²=0,04) ni d’ailleurs avec la concentration en sucres et en
acides organiques (R²=0,02). Clairement, nos observations ne vont pas dans le sens de l’idée
selon laquelle les carbohydrates influenceraient sur la synthèse des caroténoïdes en
influençant la disponibilité des précurseurs.
L’hypothèse selon laquelle la disponibilité en carbohydrates déterminerait la synthèse
des caroténoïdes en influençant la disponibilité des précurseurs a été exprimée à plusieurs
reprises dans la littérature (revue de Cunningham (2002)) même si nous ne connaissons que
peu de choses sur la manière dont les flux métaboliques sont orchestrés entre les
métabolismes primaire et secondaire (Bouvier et al., 2005b).
Deux idées majeures sont à l’origine de cette hypothèse. La première est basée sur le
fait que les caroténoïdes dérivent des métabolites primaires, et plus précisément du 3phosphoglycérate et du pyruvate dans la voie du méthylérythritol phosphate (Rohmer et al.,
1996) et qu’ils sont couteux à synthétiser. La seconde idée vient des écologues qui ont
essayé de prédire comment les plantes allouaient leurs ressources entre les processus liés à
la différenciation (incluant le métabolisme secondaire) et les processus liés à la croissance
(Herms et Mattson, 1992; Lorio, 1986). Certains résultats indiquent que la disponibilité des
ressources carbonées ne détermine pas nécessairement la biogénèse des métabolites
secondaires dans les fruits. En effet, les caroténoïdes représentent seulement une très faible
proportion des carbohydrates. Nos résultats montrent, par exemple, que les sucres sont
environ 1000 fois plus concentrés que les caroténoïdes dans la pulpe des fruits de
clémentines. De plus, les théories d’interaction ou de compétition entre les métabolismes
primaire et secondaire s’appliquent à des plantes entières qui doivent arbitrer
continuellement entre les fonctions de croissance et défense, mais elles ne sont
probablement pas pertinentes pour des organes de réserve comme les fruits. L’observation
faite par Bénard et al. (2009) selon laquelle les composés phénoliques s’accumulent dans les
feuilles de tomate comme prévu par les théories écologistes mais pas dans les fruits est
92
cohérente avec l’idée selon laquelle les feuilles et les fruits ne se comportent pas de la
même façon.
La vision qui émerge chez les physiologistes est plutôt celle d’un rôle modulateur des
carbohydrates sur la biogénèse des métabolites secondaires (Cazzonelli et Pogson, 2010;
Fraser et al., 2007; Telef et al., 2006). L’accumulation des sucres solubles dans les feuilles de
tomate réprime des gènes codant les enzymes de la voie du méthylérythritol phosphate
(Mortain-Bertrand et al., 2008). En effet, il est logique que les sucres solubles répriment la
synthèse des caroténoïdes dans les feuilles en considérant que les synthèses des
caroténoïdes et de la chlorophylle sont coordonnées et que l’accumulation des sucres
solubles régule négativement l’expression des gènes photosynthétiques et mène à une perte
de chlorophylle (Koch, 1996; Mortain-Bertrand et al., 2008). Ce raisonnement, cependant ne
s’applique pas aux fruits qui perdent leur machinerie photosynthétique au moment où les
chloroplastes sont transformés en chromoplastes. Il existe pourtant des observations
d’effets positifs de l’approvisionnement en saccharose sur la synthèse des caroténoïdes dans
les fruits (Iglesias et al., 2001; Telef et al., 2006).
On peut se demander pourquoi nos résultats sur l’effet du statut carboné sur la
concentration en caroténoïdes et plus particulièrement l’absence de corrélation entre la
concentration en sucres et la concentration en caroténoïdes ne sont pas en accord avec ces
observations. Une explication possible est que notre expérimentation a été menée sur des
fruits ayant atteint le même stade de maturité alors que dans les données rapportées dans
la littérature ont été obtenu durant le processus de maturation (Iglesias et al., 2001). Ces
observations ont montré que l’alimentation en saccharose accélère le changement de
couleur à travers une voie dépendante de l’éthylène, ce qui suggère que l’effet positif du
saccharose sur la synthèse des caroténoïdes est un effet indirect, qui est lié à la stimulation
du processus de maturation.
93
B
A
250
ab b
500
a
400
b b
300
a
200
b
b b
a
100
a a
Concenrtration en acides
organiques (mg.g-1 MS)
(mg.g-1 MS)
600
b
200
b
150
a
b
b
100
50
a
b c
a a a
a
b b a
0
0
Fructose
Glucose
Saccharose
Acide
Acide
Acide
malique ascorbique citrique
Sucres
totaux
Acide
succinique
Acides
totaux
C
Concentration en caroténoïdes (µg.g-1 MS)
450
b
400
350
b
300
250
b
200
a
b
150
a
100
50
0
b
b
b
a
b
a
bb
bb
a
a
b c a
aaa
bba
aaa
a a a
Figure 33 : Concentrations en sucres (A), en acides organiques (B) et en caroténoïdes (C) dans les fruits de
clémentine, à la date III, pour les traitements correspondant à une charge en fruits élevée ( ), moyenne ( ) et
faible (témoin) ( ). Les données représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard.
Des lettres différentes (a, b) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).
94
I.1.2.
L’effet de la charge en fruits, à la date III, sur les concentrations et
la composition en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes
Le traitement correspondant à une charge en fruits élevée est caractérisé par une
concentration plus faible en sucres et une concentration plus forte en acides organiques et
en caroténoïdes par rapport au témoin (Figure 33). Les valeurs pour le traitement
correspondant à une charge en fruits moyenne apparaissent intermédiaires par rapport aux
deux autres traitements (Figure 33).
La concentration en sucres totaux dans les fruits soumis à un traitement
correspondant à une charge en fruits élevée est 12,6% plus basse que dans le témoin. Cette
différence apparaît comme la conséquence d’une concentration plus faible à la fois du
fructose et du saccharose (-22,3 et -26,9%, respectivement), alors que la concentration en
glucose est plus élevée chez le témoin (+58,3%) (Figure 33A).
La concentration en acides organiques totaux est plus élevée dans les traitements
correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin (+33,7% et
+55,4%, respectivement) (Figure 33B). Ces différences sont dues à une concentration plus
forte en acide succinique (+62,2 et +86,5%, respectivement). Les traitements ayant des
charges moyenne et élevée en fruits ont des concentrations plus importantes en acide
ascorbique et des concentrations plus faibles en acide malique par rapport au témoin.
Les concentrations en caroténoïdes totaux sont supérieures dans les traitements
correspondant à des charges en fruits moyenne et élevée par rapport au témoin (+69,5% et
+93%, respectivement) (Figure 33C). Presque tous les caroténoïdes ont suivi ce modèle, le
principal contributeur étant la β-cryptoxanthine, le caroténoïde le plus important dans les
fruits de clémentine (85,7%). Les concentrations en phytoène, phytofluène, ζ-carotène,
zéaxanthine, cis-β-cryptoxanthine, cis-anthéraxanthine et β-carotène sont de 5,4 à 211%
plus élevées dans les traitements correspondant aux charges en fruits moyenne et élevée
par rapport au témoin.
95
La charge en fruits a également nettement influencé la composition en caroténoïdes,
en sucres et en acides organiques des fruits (Tableau 10).
Tableau 10: Pourcentages des différentes formes de caroténoïdes, de sucres et d’acides
organiques, en fonction de la charge en fruits, à la date III. Les données sont des moyennes ± des
erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des différences significatives entre les
traitements (α=5%).
Traitement
Charge en fruits
Elevée
Moyenne
Faible (témoin)
Caroténoïdes (%)
phytoène
phytofluène
ζ-carotène
cis-violaxanthine
lutéine
zéaxanthine
cis-anthéraxanthine
cis-β-cryptoxanthine
β-cryptoxanthine
β-carotène
9,15±0,63 b
9,24±0,47 b
7,54±0,36 b
11,31±0,65 a
0,59±0,08 a
3,49±0,10 a
3,31±0,21 a
1,49±0,20 a
49,10±1,02 a
4,49±0,25 a
5,81±0,31 a
6,67±0,52 a
6,95±0,32 ab
11,65±0,64 a
1,05±0,10 b
3,76±0,21 a
3,55±0,25 a
1,29±0,14 a
52,88±0,76 b
6,39±0,46 b
6,32±0,30 a
5,78±0,23 a
6,35±0±30 a
13,03±0,49 a
0,57±0,18 a
4,18±0,11 a
3,99±0,15 a
1,56±0,13 a
50,40±0,89 a
7,83±0,14 b
Sucres (%)
fructose
glucose
saccharose
14,79±0,64 a
28,81±0,44 c
56,41±0,59 a
19,74±0,52 c
16,79±0,48 b
63,47±0,98 b
16,41±0,79 b
15,90±1,30 a
67,68±1,14 c
Acides organiques (%)
acide malique
acide oxalique
acide ascorbique
acide citrique
acide succinique
7,33±0,67 a
2,41±0,60 a
2,21±0,15 b
29,69±1,37 a
58,36±1,80 c
11,39±0,90 b
1,71±0,53 a
3,07±0,22 c
31,65±1,93 a
52,18±1,67 b
19,78±0,78 c
1,66±0,27 a
1,57±0,06 a
33,38±1,44 a
43,61±1,49 a
Ainsi, dans le traitement correspondant à une charge élevée en fruits, la proportion de
fructose et de saccharose apparaît plus faible et celle du glucose est plus élevée, tandis que
la proportion d’acide malique apparaît plus faible et celle d’acide succinique plus élevée par
rapport au témoin. Toujours dans le traitement correspondant à une charge en fruits élevée,
les caroténoïdes en amont de la voie de biosynthèse, le phytoène, le phytofluène et le ζcarotène se sont accumulés aux dépens du β-carotène. Dans le traitement correspondant à
une charge en fruits moyenne, les pourcentages des différentes formes de caroténoïdes,
96
sucres et acides organiques apparaissent globalement entre les deux traitements extrêmes
(charge en fruits élevée et faible).
Alors que les caroténoïdes totaux apparaissent plus concentrés en conséquence d’un
faible rapport feuilles/fruit, les proportions des différents formes de caroténoïdes d’amont
(phytoène, phytofluène et ζ-carotène) et d’aval (β-carotène) de la voie de biosynthèse
augmentent et diminuent, respectivement. Cette observation confirme que l’effet des
carbohydrates sur le métabolisme des caroténoïdes ne peut pas être réduit à leur seul rôle
de substrat.
Dans un travail précédent, Dhuique-Mayer et al. (2009), ont déjà observé que les
conditions environnementales peuvent influencer le profil des caroténoïdes des agrumes.
Les clémentines et les mandarines de la zone méditerranéenne possèdent des proportions
de phytoène, de phytofluène et de β-carotène plus élevées que celles des fruits des zones
tropicales et subtropicales. Chez la tomate, Gautier et al. (2008) ont observé qu’une
augmentation de la température de 21 à 26°C modifie la composition en caroténoïdes en
réduisant les carotènes à l’exception du lycopène. Ces observations pourraient être
interprétées en fonction du rôle joué par les facteurs environnementaux dans le contrôle
des flux de la voie de biosynthèse des caroténoïdes et de la production d’acide abscissique.
Plusieurs mécanismes ont été suggérés par différents auteurs. La biosynthèse du phytoène
est une étape déterminante dans la biosynthèse des caroténoïdes, et est fortement
influencée par les facteurs environnementaux. Les stress influençent positivement
l’abondance des ARNm de la PSY chez le riz ou le maïs et qu’elle est positivement corrélée à
une augmentation du flux des caroténoïdes et de l’acide abscissique (Li et al., 2008a; Li et al.,
2008b; Welsch et al., 2008). Donc l’augmentation relative des caroténoïdes de fin de chaine,
pourrait être expliquée par une augmentation concomitante de l’expression de la 9-cisépoxycaroténoïde dioxygénase (NCED) et une régulation à la baisse de la cis-violaxanthine
qui est associée à la production d’ABA. Bien sûr, d’autres mécanismes de régulation
pourraient être impliqués, par exemple un transfert du rôle de contrôle de la PSY à une autre
étape de la voie de biosynthèse des caroténoïdes (Fraser et al., 2002).
97
I.1.3.
Conclusion
Nos résultats ne confirment pas l’idée selon laquelle un statut carboné élevé serait
favorable à la synthèse des caroténoïdes dans les fruits à travers son influence positive sur la
disponibilité des précurseurs. L’effet de l’alimentation en sucres, le cas échéant, au même
stade de maturité, pourrait même être négatif, suggérant que les sucres pourraient réprimer
les gènes codant pour les enzymes de la voie des caroténoïdes ou de la voie du
méthylérythritol phosphate, comme il a été précédemment observé dans les feuilles, mais
pas encore chez les fruits. Nos observations plaident en faveur de nouvelles études, sur la
manière dont les carbohydrates régulent la biosynthèse des caroténoïdes mais également
leur dégradation et leur stockage dans les fruits.
I.2.
En fonction de différents stades de développement des fruits
L’étude précédente a permis de mettre en évidence l’effet d’une charge en fruits
élevée sur les critères de qualité de la clémentine. Certains de ces effets sont positifs
puisque nous avons pu observer une augmentation de la concentration en caroténoïdes et
du nombre de composés présents selon les traitements. Cependant, l’application de charges
en fruits élevée ou moyenne (5 et 15 feuilles par fruit) induit également un retard de la
maturité, une diminution significative du calibre du fruit et des concentrations en sucres
solubles qui restent inférieures par rapport au témoin pour un stade de maturité équivalant.
Tout comme dans d’autres études visant à déterminer l’effet des sucres et/ou de
l’alimentation carbonée sur la synthèse des caroténoïdes, les traitements ont été appliqués
de manière précoce au cours du développement du fruit. Il n’existe à notre connaissance
aucune étude de l’interaction entre le stade de développement du fruit et l’alimentation
carbonée sur les critères de qualité, et en particulier la concentration en caroténoïdes.
L’objectif de cet essai est d’étudier la manière dont l’alimentation en sucres influence le
programme qui conduit à l’accumulation de caroténoïdes au cours du développement des
fruits de clémentine.
98
Tableau 11: Diamètre, poids du fruit frais et indice de maturité, en fonction de la charge en fruits
(élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a été appliquée (précoce,
intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin
(charge en fruits faible). Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres
différentes (a, b, c, d, e) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).
Précoce
Défoliation
Ombrage
Intermédiaire
Défoliation
Ombrage
Tardif
Défoliation
Témoin
(Charge en
fruits faible)
Diamètre (mm)
Elevée
Moyenne
37,1±1,9 a
37,6±2,3 ab
38,7±2,4 abc
48,6±1,6 d
44,0±1,9 abcd
44,8±1,2 bcd
45,5±1,4 cd
45,1±1,9 cd
47,9±2,3 cd
45,2±2,6 cd
47,0±1,15 d
Poids du fruit (g)
Elevée
Moyenne
18,9±1,2 a
20,2±2,3 ab
20,3±3,4 a
40,4±3,5 c
30,1±3,4 bc
34,2±3,3 bc
33,8±3,9 ab
34,1±2,6 b
40,5±5,9 bc
34,4±6,1 c
35,4±3,6 bc
10,5±0,3 cde
10,9±0,3 de
9,6±0,3 bc
9,9±0,1 cd
10,5±0,3 cde
10,6±0,6 cde
11,5±0,9 c
9,6±0,4 cd
11,0±0±3 de
Indice de maturité
Elevée
6,3±0,08 ab
Moyenne
7,3±0,3 a
99
Le travail dont les résultats sont présentés ici a pour objectif de déterminer le stade le
plus propice pour l’application d’un traitement modulant la disponibilité en carbone et la
qualité des fruits. De plus, nous souhaitions définir si la durée d’application de la
modification de la charge en fruits est un élément déterminant. Pour cela, nous avons
travaillé sur des rameaux fructifères de clémentine sur lesquels nous avons appliqué, à trois
stades de développement du fruit, différents niveaux de charge en fruits obtenus par
défoliation ou par ombrage des feuilles. La défoliation est un traitement permettant
d’appliquer des niveaux de charge en fruits de manière permanente. L’ombrage est un
traitement permettant d’appliquer des niveaux de charge en fruits de façon temporaire. De
cette façon, l’apport en carbone dans les fruits est non limitant à l’exception de la période
durant laquelle on souhaite modifier leur statut carboné.
I.2.1.
Variations de calibre et d’indice de maturité du fruit
Les données présentées dans le tableau 11 montrent que seuls les traitements
appliqués précocement, après la chute physiologique des fruits, ont induit une modification
du calibre des fruits.
En effet, lorsque le traitement a été appliqué précocement, des diminutions
significatives du diamètre ont été observées chez les fruits soumis à des charges en fruits
élevée et moyenne obtenues par défoliation et chez les fruits soumis à une charge élevée
par ombrage. En ce qui concerne les diminutions du poids frais, elles ont été observées chez
les fruits soumis à une charge en fruits élevée obtenue par défoliation et chez les fruits
soumis à des charges élevée et moyenne obtenues par ombrage. Pour ces traitements, la
diminution du diamètre du poids frais est d’environ 19,6% et de 44%, respectivement par
rapport au témoin, qui correspond à une charge en fruits faible. Les autres traitements n’ont
induit aucune modification. Si l’on considère l’indice de maturité (IM), nous avons observé
que les traitements correspondant à une forte charge en fruits, et à une charge moyenne
appliquée précocement par défoliation, et le traitement correspondant à une forte charge
en fruits appliquée au stade de développement intermédiaire par défoliation, ont induit un
retard dans le processus de maturation du fruit. Les indices de maturité obtenus sont
100
Tableau 12: Concentrations en sucres totaux et en acides organiques totaux, en fonction de la
charge en fruits (élevée, moyenne), du stade de développement auquel la charge a été appliquée
(précoce, intermédiaire et tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au
témoin (charge en fruits faible). Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres
différentes (a, b, c, d) indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).
Précoce
Défoliation
Ombrage
Intermédiaire
Défoliation
Ombrage
Tardif
Défoliation
Témoin
(Charge en
fruits faible)
-1
Sucres totaux (mg.g MS))
Elevée
345,2±2,9 a
Moyenne
298,3±14,8 a
412,7±8,9 bc
423,6±9,6 bc
420,2±24,5 bc
398,6±3,5 b
414,6±7,2 bc
402,4±18,1 bc
422,9±25,7 c
381,2±15,2 b
421,8±6,9 bc
226,7±16,5 cd
189,2±4,9 abcd
186,3±10,4 abc
199,5±8,9 abc
201,9±15,9 abcd
200,2±7,9 abcd
181,2±4,8
abc
-1
Concentration en caroténoïdes totaux
(µg.g-1 MS)
Acides organiques totaux (mg.g MS)
Elevée
265,3±2,6 c
232,2±16,9 d
Moyenne
163,9±10,8 a 171,6±14,7 ab
700
e
600
d
500
400
bc
cd
bc
bc
ab
a
300
a
bc
a
200
100
0
élevée moyenne élevée moyenne élevée moyenne élevée moyenne élevée moyenne
Défoliation
Ombrage
Précoce
Défoliation
Ombrage
Intermédiaire
Défoliation
faible
Témoin
Tardif
Figure 34: Concentration en caroténoïdes totaux, en fonction de la charge en fruits : élevée ( ),
moyenne ( ), du stade de développement auquel la charge été appliquée (précoce, intermédiaire et
tardif) et la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) par rapport au témoin ( ). Les données
représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard. Des lettres
différentes (a, b, c, d) indiquent des différences significatives entre les traitements, le stade de
développement et la méthodologie (α=5%).
. Les données sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standards. Des lettres
101
compris entre 7,29 et 9,63 pour les fruits des rameaux correspondant, alors que les fruits
témoins ont un indice supérieur (IM=11,02).
Notre objectif est d’évaluer les possibilités pour augmenter la concentration en
caroténoïdes dans la pulpe des fruits tout en conservant son calibre et son indice de
maturité. Les résultats obtenus apparaissent donc intéressants au regard de notre objectif
puisque plusieurs traitements correspondant à une charge élevée en fruits n’ont montré ni
diminution du calibre du fruit, ni retard dans la maturité.
Il n’y a pas de variations observées dans le rapport matière sèche/matière fraîche
(MS/MF). Ce dernier ne semble affecté ni par la charge en fruits, ni par la durée d’application
du traitement (défoliation ou ombrage), ni par le stade de développement auquel la charge
en fruits a été appliquée. De ce fait, toutes les comparaisons effectuées sur la base de la
matière sèche sont également valables si on exprime les résultats par rapport à la matière
fraîche.
I.2.1.
Concentration en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes
Les fruits soumis à des charges en fruits élevée et moyenne présentent une
concentration en sucres totaux inférieure de 18,2% et de 29,3%, respectivement dans le cas
où le traitement a été appliqué par défoliation précoce par rapport au témoin (Tableau 12).
Au contraire, la concentration en acides organiques est plus élevée de 46,3% et de 28,4%
pour les fruits soumis à une charge en fruits élevée appliquée respectivement par défoliation
et par ombrage précoce (Tableau 12).
Certains traitements ont induit une augmentation de la concentration en caroténoïdes
totaux alors que d’autres ont conduit à une diminution par rapport au témoin (Figure 34). La
concentration en caroténoïdes augmente de 50,2% et de 17.8%, respectivement dans les
traitements correspondant à une charge en fruits élevée lorsqu’elle a été appliquée par
défoliation et ombrage précoce. Elle diminue de 29,4% lorsque le traitement par défoliation
a été appliqué au stade de changement de couleur et ne varie pas quand le traitement a été
appliqué tardivement (Figure 34).
102
Figure 35: Heatmap représentant les concentrations en métabolites primaires (sucres et acides
organiques) et secondaires (caroténoïdes) dans la pulpe de clémentine en fonction des différents
traitements appliqués. Chaque ligne représente un fruit moyen (n=5) soumis à un traitement
rassemblant plusieurs conditions : la charge en fruits (élevée, moyenne et faible), le stade auquel le
traitement a été appliqué (précoce, intermédiaire : au changement de couleur et tardif), et le type de
traitement (défoliation (D.) ou ombrage (O.)) Chaque colonne représente un composé. Les
concentrations en métabolites (données centrées réduites) ont servi de base pour la construction
des classifications hiérarchiques en utilisant les distances Euclidiennes. A chaque teneur a été
associée une couleur. Les valeurs augmentent du vert au rouge.
103
Pour analyser l’ensemble des données, nous avons réalisé une cartographie des profils
en métabolites primaires et secondaires de la pulpe de la clémentine en fonction des
traitements de charge en fruits (Figure 35). Les profils obtenus présentent un effet positif
d’une forte charge en fruits sur la concentration en caroténoïdes lorsque ce traitement est
appliqué de façon précoce dans le développement du fruit. Cependant, l’intensité de la
réponse dépend à la fois du type de traitement (défoliation ou ombrage) qui permet de
jouer sur la durée d’application du traitement et du stade de développement auquel la
charge en fruits a été appliquée. Tous les résultats obtenus par des traitements d’ombrage, à
l’exception de celui appliqué précocement, sont proches de la modalité charge faible qui
constitue le témoin (Figure 35). Il apparait également que les concentrations en acides
organiques totaux et en caroténoïdes totaux réagissent dans le même sens alors que les
sucres totaux varient dans le sens opposé. De plus, nos résultats ont montré que tous les
composés appartenant à une même classe, sucres, acides organiques ou caroténoïdes, ont
répondu de façon identique et sont situés dans le même groupe.
Ces résultats confirment que dans nos conditions expérimentales, il est impossible
d’obtenir des fruits ayant une concentration en caroténoïdes plus élevée en maintenant un
calibre et un stade de maturité équivalent au témoin. Cependant, ils sont en accord avec nos
précédents résultats et confirment qu’une charge en fruits élevée appliquée après la chute
physiologique des fruits a un impact sur la biosynthèse des caroténoïdes. De plus, Iglesias et
al. (2001) ont observé que, chez les fruits d’agrumes, des modifications dans le statut
carboné obtenues par l’ajout de saccharose 35 à 45 jours après l’anthèse, induisent une
augmentation de la concentration en caroténoïdes. Par ailleurs, Kondo et al. (2005) ont
observé, chez le kumquat, que l’augmentation de la charge en fruits obtenus par défoliation
des rameaux 90 jours après la pleine floraison, conduit à une augmentation de la
concentration en métabolites secondaires et plus particulièrement en caroténoïdes et en βcryptoxanthine. Chez les fruits d’agrumes, l’augmentation de la charge en fruits exerce
apparemment un effet positif sur la biosynthèse des caroténoïdes lorsqu’elle est appliquée
de façon précoce au cours du développement du fruit. Nos résultats sont certes en accord
avec les études précédentes menées par Kondo et al. (2005) et Iglesias et al. (2001) sur le
fait que le statut carboné doit être modifié précocement dans le développement du fruit
pour que l’on observe un effet sur la concentration en caroténoïdes. Par contre, ils sont en
104
B
A
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
b b
a
b b
a
a a a
a b ab
Glucose
Fructose Saccharose
organiques (mg.g-1 MS)
(mg.g-1 MS)
300
c
b
250
200
a
c b
150
a
100
b a
a
b
50
b ab a
Sucres
totaux
a a
b a a
0
Acide
oxalique
Acide
Acide
Acide
Acide
malique ascorbique citrique succinique
Acides
totaux
C
700
b
Concentration en caroténoïdes
(µg.g-1 MS)
600
a
500
a
400
300
b
ab
200
100
a
b a
a
c b
a
c
b a
b
a a
b a a
b ab a
b b a
b ab a
b a a
0
Figure 36: Concentrations en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes, en fonction de la méthode utilisée :
défoliation ( ) ou ombrage ( ) pour une charge en fruits élevée appliquée précocement, après la chute physiologique
du fruit par rapport au témoin ( ). Les données sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standards.
Des lettres différentes indiquent des différences significatives entre les traitements (α=5%).
105
désaccord en ce qui concerne l’effet du statut carboné. En effet, chez Kondo et al. (2005) et
Iglesias et al. (2001), le statut carboné influence positivement la concentration en
caroténoïdes dans les fruits d’agrumes, contrairement à ce qui a été observé dans notre
essai.
Au vu des résultats précédents, concernant la concentration en caroténoïdes dans les
fruits, deux traitements semblent favorables : les charges élevées en fruits et l’application
précoce de ce traitement que ce soit par défoliation ou par ombrage. Dans la suite des
résultats, nous allons nous focaliser sur ces deux conditions afin d’étudier en détail les effets
d’une charge en fruits élevée sur les critères organoleptiques et nutritionnels.
I.2.2.
Variations des concentrations et des proportions en sucres, en
acides organiques et en caroténoïdes pour les deux traitements
considérés
Le traitement avec une charge en fruits élevée appliquée après la chute physiologique
des fruits a induit une augmentation de la concentration en caroténoïdes totaux et en acides
organiques totaux que le traitement soit appliqué par défoliation ou par ombrage. La
concentration en sucres totaux présente une tendance différente puisqu’elle diminue
lorsque le traitement est appliqué par défoliation par rapport au témoin (Figure 36).
La concentration en sucres totaux est plus faible de 18,2% pour le traitement obtenu
par défoliation par rapport au témoin (Figure 36A). La diminution de la concentration en
saccharose (-23,9%) peut expliquer, en partie, cette diminution. La concentration en acides
organiques totaux est plus élevée de 46,3% et de 28,4%, respectivement pour les
traitements obtenus par défoliation et ombrage par rapport au témoin (Figure 36B). Ces
différences sont attribuables, en partie, à l’augmentation de la concentration en acide
succinique (49,6%) dans le traitement obtenu par ombrage. En ce qui concerne, le
traitement obtenu par défoliation, ces différences sont attribuables, en partie, à
l’augmentation des concentrations en acide oxalique (6,8%), en acide ascorbique (64,6%), en
acide citrique (15,5%) et en acide succinique (63%). Quant à la concentration en
caroténoïdes (Figure 36C), elle est plus élevée de 50,2% et de 17,8%, respectivement
106
Tableau 13: Pourcentages des différentes molécules de caroténoïdes, de sucres et d’acides
organiques, respectivement, en fonction de la méthode utilisée (défoliation ou ombrage) pour une
charge en fruits élevée appliquée précocement, après la chute physiologique du fruit. Les données
présentées sont des moyennes ± des erreurs standard. Des lettres différentes (a, b, c) indiquent des
différences significatives entre les traitements pour un même composé (α=5%).
Charge en fruits élevé
Témoin (Charge en
Défoliation
Ombrage
fruits faible)
Caroténoïdes (%)
phytoène
phytofluène
ζ-carotène
lutéine
cis-violaxanthine
zéaxanthine
cis-anthéraxanthine
cis-β-cryptoxanthine
β-cryptoxanthine
β-carotène
8,16±0,25 b
7,01±0,37 b
5,11±0,08 b
2,40±0,11 a
16,33±0,75 a
3,95±0,09 a
5,53±0,21 a
2,63±0,52 a
44,19±0,35 b
4,69±0,36 b
7,55±0,35 ab
4,72±0,55 ab
3,01±0,46 ab
2,48±0,33 a
19,28±0,53 ab
5,34±0,28 b
6,34±0,25 ab
2,16±0,30 a
45,04±0,37 ab
4,06±0,24 a
6,31±0,19 a
3,76±0,23 a
2,68±0,19 a
2,27±0,06 a
20,71±0,36 b
4,78±0,24 ab
6,61±0,17 b
1,78±0,08 a
47,19±0,35 a
3,89±0,12 a
Sucres (%)
fructose
glucose
saccharose
14,57±0,01 b
26,11±0,03 b
59,31±0,05 a
13,51±0,10 a
23,52±0,54 a
62,97±0,62 b
13,88±0,15 a
22,54±0,19 a
63,59±0,33 b
Acides organiques (%)
acide oxalique
acide malique
acide ascorbique
acide citrique
acide succinique
0,59±0,25 a
14,17±0,15 b
3,21±0,02 b
26,90±0,28 a
55,14±0,29 b
1,04±0,17 a
9,97±1,06 a
2,13±0,14 a
31,21±1,19 b
55,66±1,99 ab
0,78±0,12 a
13,05±0,79 b
2,88±0,17 b
33,75±2,15 b
49,54±2,50 a
107
pour le traitement obtenu par défoliation et par ombrage par rapport au témoin. Dans le
traitement obtenu par défoliation, tous les caroténoïdes suivent le même profil. Le
composant majoritaire est la β-cryptoxanthine, qui est 41,2% plus élevée par rapport au
témoin. Les autres caroténoïdes, le phytoène, le phytofluène, le ζ-carotène, la cisviolaxanthine, la zéaxanthine, la cis-anthéraxanthine, la cis-β-cryptoxanthine ont augmentés
entre 18,6 et 196,5% selon les composés par rapport au témoin. Dans le traitement obtenu
par ombrage deux caroténoïdes à eux seuls, le phytoène et la zéaxanthine expliquent
l’augmentation de la concentration en caroténoïdes, avec une concentration plus élevée de
42,3% et de 31% par rapport au témoin, respectivement.
Les fortes charges en fruits obtenues par défoliation n’affectent pas uniquement la
concentration en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes, mais également leurs
proportions respectives (Tableau 13).
Il y a proportionnellement plus de fructose (4,9%), plus de glucose (15,8%) et moins de
saccharose (-6,7%) dans le fruit soumis à une charge en fruits élevée obtenue par défoliation
par rapport au témoin. Alors que la proportion d’acide succinique est plus élevée (11,3%),
l’acide citrique est plus faible (-20,3%) par rapport au témoin. Les concentrations relatives en
caroténoïdes ont également été affectées. Les caroténoïdes en aval de la voie de
biosynthèse, tels que la β-cryptoxanthine, la cis-anthéraxanthine, et la cis-violaxanthine sont
en proportions réduites (-6,3%, -16,3% et -21,1%, respectivement), à l’exception du βcarotène (+20,6%), tandis que les caroténoïdes du début de la voie, tels que le phytoène, le
phytofluène et le ζ-carotène, sont en plus grandes proportions (29,3%, 86,4% et 90,7%,
respectivement).
Nos résultats sur la concentration en sucres, en acides organiques et en caroténoïdes
montrent, tout comme la première étude, que la charge en fruits, qu’elle soit appliquée par
défoliation ou par ombrage après la chute physiologique des fruits, a un impact positif sur
les critères de qualité du fruit, et plus particulièrement sur la concentration en caroténoïdes.
Deux idées majeurs pourraient être utilisées pour interpréter nos résultats : I) la théorie de
l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance (GDBH); et II)
108
l’hypothèse selon laquelle la capacité de stockage régulerait la biosynthèse des
caroténoïdes.
La théorie déterministe de l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de
croissance (GDBH) prédit qu’en condition de faibles ressources carbonées, les plantes
allouent en priorité leurs ressources à la synthèse de métabolites secondaires au dépens de
la croissance (Herms et Mattson, 1992; Lorio, 1986). Si l’on prend en considération, les
résultats obtenus par l’application d’un traitement précoce dans le développement des
fruits, ils sont en accord avec cette hypothèse. Il n’en va pas de même, si l’on prend en
considération l’ensemble de nos résultats. En effet, si l’on suit les prédictions de la GDBH, on
devrait observer un effet positif sur la concentration en métabolites secondaires et un effet
négatif sur le calibre du fruit chez les fruits soumis à une charge en fruits élevée appliquée
au mois de septembre, puisque la croissance du fruit de clémentine n’est pas terminée à ce
stade (Bain, 1958; Spiegel-Roy et Goldschmidt, 1996). La théorie de la GDBH a été surtout
testée par des études sur l’effet de l’alimentation azotée sur la concentration en composés
phénoliques. Les résultats obtenus sur la tomate (Hoffland et al., 2000; Stewart et al., 2001;
Stout et al., 1998), et sur d’autres cultures (Cartelat et al., 2005; Cipollini et al., 2002;
Haukioja et al., 1998) ont montré une corrélation négative entre la concentration en
composés phénoliques et la croissance dans des conditions de faibles apports d’azote, dans
les feuilles. Ces observations indiquent que les feuilles et les fruits ne se comportent pas de
la même façon et que la théorie de la GDBH n’est probablement pas pertinente pour des
organes de réserve comme des fruits. Cette idée est corroborée par les travaux de Bénard et
al. (2009) qui ont montré, chez la tomate soumise à une privation d’azote, une accumulation
des composés phénoliques dans les feuilles conforme aux prévisions de la GDBH, mais pas
dans les fruits.
L’idée selon laquelle la voie de biosynthèse des caroténoïdes serait régulée à travers la
capacité de stockage des plastes est cohérente avec nos résultats. En effet, plusieurs études
ont montré que l’augmentation de la concentration en caroténoïdes est liée au nombre et à
la taille des plastes présents chez la tomate (Bino et al., 2005; Cookson et al., 2003). Ces
études ont été complétées par une analyse des gènes impliqués. Kolotilin et al. (2007) ont
observé que l’expression des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse des
caroténoïdes, de la chlorophylle et de la photosynthèse sont exprimés plus fortement au
109
même moment que l’expression des gènes dirigeant la biosynthèse des plastes. Chez les
agrumes, les plastes, sont capables de se diviser et d’augmenter leur capacité de stockage
des caroténoïdes (Kolotilin et al., 2007) lors des étapes de division et de grossissement
cellulaire (Tadeo et al., 2008). Ces observations sont en accord avec nos résultats qui
montrent une augmentation de la concentration en caroténoïdes lorsque la charge en fruits
est augmentée de façon précoce. Il a également été montré que les chloroplastes étaient
capables d’un plus grand nombre de division que les chromoplastes (Kuroiwa et al., 1998), ce
qui expliquerait l’absence de différences dans les concentrations en caroténoïdes lorsque le
statut carboné est modifié au moment de la conversion des chloroplastes en chromoplastes,
et après. Cependant, il est indispensable de réaliser des études supplémentaires pour
caractériser ces mécanismes chez les agrumes afin de conclure sur le rôle éventuel de la
variation de la taille et du nombre de plastes sur la synthèse des caroténoïdes.
I.2.3.
Conclusion
Nos résultats ont montré l’impact négatif d’un faible apport en sucres sur la croissance
et son impact positif sur la biosynthèse des métabolites secondaires lorsque la charge en
fruits est modifiée précocement au cours du développement du fruit. Des études
supplémentaires seront nécessaires pour tester l’hypothèse selon laquelle la concentration
en caroténoïdes serait déterminée indirectement par le nombre et la taille des plastes
nécessaires au stockage des caroténoïdes. Il serait également intéressant d’étudier la
manière dont l’alimentation carbonée influence le nombre de plastes par cellule et leur
taille.
II.
L’effet du stress oxydatif et du statut redox sur la biosynthèse des caroténoïdes
Nous avons montré précédemment que le statut carboné peut avoir une influence sur
la qualité des fruits en fonction du stade de développement.
Un deuxième facteur parait intéressant à étudier dans le but d’accroître et de stimuler
la concentration en caroténoïdes dans le fruit : le stress. Ce dernier est d’autant plus
intéressant qu’il peut être appliqué par les agriculteurs, même dans des conditions de
110
A
a,A
0,9
a,A
0,8 a,AB
0,7
a,A
0,6
0,5
0,4
A 0,3
0,2
0,1
0
A
j-5
a,A
b,BC
a,C
Fv/Fm
a,A
c,A
b,A
a,B
j0
a,B
j2
j3
b,A
a,C
a,B
j4
Temps d'exposition (jours)
B
b,C
600
550
a,BC
Fo
500
450
B
400
350
300
b,B
a,AB
j-5
B
a,B
a,B
a,A
a,A
a,A
a,B
a,B
a,AB
a,AB
j2
j3
a,A a,A
j0
j4
C
b,A
b,A
b,A
a,A
a,B
Fm
2600
2400
2200
2000
a,A
1800
a,B
1600
C 1400
a,AB
1200
1000
800
j-5
a,A
a,A
a,A
a,B
j0
a,A
a,A
a,A
j2
j3
j4
Figure 37: Evolution du rendement quantique maximal du photosystème II (Fv/Fm) (A), de la
fluorescence minimale (Fo) (B) et de la fluorescence maximale (Fm) (C), au cours du stress
photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse : élevée (
), moyenne (
) par
rapport au témoin (intensité lumineuse faible (
). Les points correspondent aux moyennes
et les barres aux erreurs standard. Les lettres a, b, c indiquent des différences significatives
entre les traitements d’intensité lumineuse différente pour chacune des dates considérées et
les lettres A, B, C indiquent des différences significatives entre les dates (j-5, j0, j2, j3 et j4)
pour chacun des traitements (α=5%). Graphique A et C : Les stress d’intensité lumineuse
élevée et moyenne montrent à la fois une diminution de Fv/Fm et de Fm par rapport aux
mesures réalisées avant l’application du stress (A vs B) et par rapport au témoin (a vs b).
Graphique B : les stress d’intensité lumineuse élevée et moyenne ne montrent pas de réelle
différence par rapport au témoin à l’exception du jour 2 où Fo est supérieure.
111
cultures en plein champ. Dans cette étude, nous nous intéresserons plus particulièrement au
stress photooxydatif, sachant que tous les stress conduisent à du stress oxydatif. L’objectif
est de vérifier l’hypothèse selon laquelle un stress photooxydatif peut influencer le
métabolisme antioxydant du fruit et les critères de qualité du fruit (sucres, acides organiques
et caroténoïdes.).
II.1.
L’effet de fortes intensités lumineuse sur les indicateurs de stress des feuilles
Différents paramètres utilisant la fluorescence de la chlorophylle a émise par le
photosystème II (PSII) ont été utilisés comme des indicateurs du stress photooxydatif. Ce
dernier a été appliqué à l’aide d’ombrières sur les feuilles voisines du fruit.
Le rendement quantique maximum du photosystème II (Fv/Fm) donne une indication de la
fonctionnalité des centres de réactions du PSII. Dans des conditions normales, il se situe aux
alentours de 0,8 (Ballottari et al., 2007). Un effet sur le rendement quantique maximum du
photosystème II (Fv/Fm) des traitements correspondant à une intensité lumineuse élevée et
à une intensité moyenne a été observé 2 et 3 jours après le début de l’expérimentation,
respectivement (Figure 37). Au 3ème jour, Fv/Fm est plus faible de 37,7% et de 20,2% par
rapport au témoin dans les traitements correspondant à une intensité lumineuse élevée et à
une intensité moyenne, respectivement. Fv/Fm est également inférieur de 17,3% dans le
traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée par rapport au traitement
correspondant à une intensité lumineuse moyenne. Au jour 4, Fv/Fm diminue de 30% par
rapport au témoin pour les deux traitements. Des différences de Fv/Fm peuvent être dues à
un niveau plus élevé de la fluorescence minimale (Fo) ou à un niveau plus faible de la
fluorescence maximale (Fm). Dans notre essai, la diminution du Fv/Fm est attribuable à une
augmentation de Fo (14,4% et 35,5% pour les traitements correspondant à une intensité
lumineuse élevée et à une intensité moyenne, respectivement) et à une diminution de Fm (44,2% et -30,1%, respectivement), observables à partir du 2ème jour (Figure 37).
L’augmentation de Fo est attribuable à la libération de chlorophylles libres, des
complexes protéine-pigment alors que la diminution du Fm reflète l’engagement de la
zéaxanthine dans la dissipation de l’énergie en excès (Wingler et al., 2004). Nos observations
112
B
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1,6
a,C
a,A
a,C
b,A
b,A
a,AB
a,A
a,B
j0
1,2
b,A
a,B
a,A
j-5
a,B
a,AB
1,0
a,C
a,B
a,A
0,8
a,AB
a,AB
j2
j3
j4
a,AB
a,A
0,4
a,A
b,A
a,A
0,6
b,A
b,A
a,AB
a,A
a,A
a,A
j3
j4
0,2
0,0
j-5
j0
j2
C
D
0,60
6,0
a,C
a,C
4,0
3,0
b,A
a,A
a,B
a,A
a,B
2,0
1,0
a,A
c,A
b,A
0,55
b,A
a,A
a,A
a,A
a,A
j2
j3
j4
(1-Vj)/Vj
5,0
Fv/Fo
a,A
1,4
RC/ABS
Indice de performance
A
0,50
a,B
b,B
a,A
0,45
0,40
b,B
a,AB
a,AB
a,AB a,A
a,A
a,A
ab,AB
a,A
a,A
0,35
a,A
a,A
0,30
0,0
j-5
j0
j-5
j0
j2
j3
j4
Figure 38: Variation de l’indice de performance (PI) (A), et de ses composantes : la densité des centres de
réactions actifs exprimée en fonction de la chlorophylle (RC/ABS) (B), des réactions lumineuses pour la
photochimie primaire (Fv/Fo) (C) et des réactions sombres [(1-Vj)/Vj] (C), après exposition à un stress
photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse : élevée (
), moyenne (
) par rapport au
témoin (intensité lumineuse faible) (
). Les points correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs
standard. Les lettres a, b, c indiquent des différences significatives entre les traitements d’intensité
lumineuse différente pour chacune des dates considérées et les lettres A, B, C indiquent des différences
significatives entre les dates (j-5, j0, j2, j3 et j4) pour chacun des traitements (α=5%). Graphiques A, B et C :
Les stress d’intensité lumineuse élevée et moyenne montrent à la fois une diminution du PI et de RC/ABS et
de Fv/Fo par rapport aux mesures réalisées avant l’application du stress (A vs B) et par rapport au témoin (a
vs b). Graphique D : [(1-Vj)/Vj] est inférieur par rapport au témoin à partir du jour 3 pour le stress d’intensité
lumineuse élevée et au jour 4 pour le stress d’intensité lumineuse moyenne.
113
sont cohérentes avec l’idée que la régulation négative du rendement quantique maximum
du photosystème II observée est interprétable en termes de dommages liés à la lumière et
non pas seulement en termes de photoprotection. L’amplitude de la diminution du Fv/Fm
est en accord avec cette idée. En effet, seules les faibles diminutions du Fv/Fm peuvent être
interprétées en termes de photoprotection (Adams et al., 2006).
L’indice de performance (PI) (Srivastava et Strasser, 1999), est basé sur l’analyse de la
cinétique de la fluorescence de la chlorophylle (OJIP), mesurée de 50 ms à 1 s après
illumination des échantillons photosynthétiques (Strasser et al., 2000). Il est considéré
comme un indicateur de stress plus sensible et plus discriminant que Fv/Fm (Thach et al.,
2007).
L’indice de performance (PI) a également été affecté par les traitements
correspondant à une intensité lumineuse élevée et à une intensité moyenne (Figure 38). A
partir du jour 2, le PI diminue pour les traitements correspondant à une intensité lumineuse
élevée et à une intensité moyenne (-71,9% et -56,6% par rapport au témoin,
respectivement). De la même façon, les valeurs de PI, au jour 2, sont inférieures dans les
deux traitements par rapport au jour 0, avant le début de l’expérimentation (-64,5% et 54,6% pour les traitements correspondant à une intensité lumineuse élevée et à une
intensité moyenne, respectivement). Aucune différence significative n’a été observée entre
les deux traitements.
Les diminutions de l’indice de performance sont attribuables à des variations dans la
contribution au PI des réactions lumineuses pour la photochimie primaire (Fv/Fo), de la
densité des centres de réactions actifs exprimée en fonction de la chlorophylle (RC/ABS) et
des réactions en phase obscure ou la performance due à la conversion de l’énergie
d’excitation en flux d’électrons [(1-Vj)/Vj)] (Figure 38). RC/ABS et Fv/Fo ont le même profil
que le PI. En effet, à partir du 2ème jour, RC/ABS est inférieur de 38,7% et-33% dans les
traitements correspondant à une intensité lumineuse élevée et à une intensité moyenne,
respectivement par rapport au témoin et de -23% et -22,9% par rapport au jour 0. La
diminution de Fv/Fo est de 60,5% et 31,1% par rapport au témoin pour les traitements
correspondant à une intensité lumineuse élevée et à une intensité moyenne (à partir du 2ème
jour) par rapport au témoin et d’environ 47,5% et 38,1%, respectivement par rapport au jour
0. La contribution des réactions en phase obscure dans l’indice de performance a été
114
beaucoup moins importante que celle de Fv/Fo et de RC/ABS. Pour le traitement
correspondant à une intensité lumineuse élevée, [(1-Vj)/Vj] est plus faible de 14,3% au jour
3. En ce qui concerne le traitement correspondant à une intensité lumineuse moyenne, [(1Vj)/Vj] est plus faible de 18,9% au jour 4.
La diminution du PI dans les deux traitements stress est attribuable en grande partie à
la diminution de Fv/Fo, secondairement à une diminution de RC/ABS, et pas du tout à la
diminution de [(1-Vj)/Vj]. Ces réponses sont cohérentes avec nos connaissances sur la
photoinhibition (Critchley et Raghavendra, 1998; Hikosaka, 2004; Lambers et al., 1998;
Loreto et al., 2004; Thach et al., 2007). La diminution des paramètres Fv/Fo et RC/ABS
représente une réponse adaptative visant à réduire les dommages liés à la lumière tout en
préservant la productivité photosynthétique dans les conditions caractérisées par un excès
de lumière absorbée par rapport à la quantité de lumière qui peut être utilisée par la
photosynthèse.
Nos résultats démontrent clairement que les traitements correspondant à une
intensité lumineuse élevée et à une intensité moyenne appliqués sur les feuilles d’orangers
provoquent une photoinhibition. Bien que les paramètres mesurés ne montrent pas de
différences significatives entre les deux traitements, certaines données, telles que le Fv/Fo,
indiquent que les conditions de stress ont été plus sévères pour le traitement correspondant
à une intensité lumineuse élevée que pour le traitement correspondant à une intensité
lumineuse moyenne.
II.2.
Mise en évidence d’un signal entre les feuilles et le fruit
Afin de mettre en évidence que le stress photooxydatif appliqué sur les feuilles a été
transmis à la pulpe du fruit, les activités des enzymes de détoxication des espèces réactives
de l’oxygène ont été mesurées. En effet, l’activation de ces enzymes traduit une réponse
rapide et efficace pour limiter les espèces réactives de l’oxygène en excès générées par les
stress environnementaux (Sofo et al., 2004). Ces activités ont été réalisées en collaboration
avec l’université de Corse, par Jérémie Santini, étudiant de master.
115
La superoxyde dismutase totale (SODt) et l’ascorbate peroxydase (APX) sont les
premières enzymes utilisées pour détoxiquer les espèces réactives de l’oxygène.
A t=3h après l’application du stress photooxydatif l’activité de la SODt est augmentée
de 57,4% pour le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée et de 26,2%
pour le traitement correspondant à une intensité lumineuse moyenne par rapport au
témoin. Ces résultats sont cohérents si l’on considère que la SODt est activée par divers
stress environnementaux chez les plantes et permet la génération de peroxyde d’hydrogène
lors de la régénération de l’anion superoxyde (Bowler et al., 1994). Nos résultats ont montré
une augmentation de la concentration en peroxyde d’hydrogène dans le traitement
correspondant à une intensité lumineuse élevée (+17%), à t=99h par rapport au témoin
(Tableau 14).
Tableau 14: Concentration en peroxyde d’hydrogène, dans la pulpe des fruits, en fonction de
l’intensité du stress photooxydatif. SE : stress d’intensité lumineuse élevée ; SM : stress d’intensité
lumineuse moyenne ; T : témoin. Les données sont des moyennes ± des erreurs standard. Les lettres
a, b indiquent des différences significatives entre les traitements d’intensité lumineuse différente
pour chacune des dates considérées et les lettres A, B, C indiquent des différences significatives entre
les dates (j-5, j0, j2, j3 et j4) pour chacun des traitements (α=5%).
3h
Peroxyde d’hydrogène (H2O2)
SE
5,36±0,22 a,A
SM
6,28±0,30 b,A
T
5,69±0,29 ab,A
27h
51h
99h
6,81±0,25 a,B
7,10±0,41 a,A
6,43±0,20 a,A
6,61±0,21 a,B
6,24±0,40 a,A
6,46±0,23 a,A
7,58±0,26 b,C
6,48±0,30 a,A
6,48±0,35 a,A
Ces résultats sont en accord avec l’hypothèse selon laquelle le stress photooxydatif
induirait une production d’espèces réactives de l’oxygène dans la pulpe des fruits et
spécialement d’anion superoxyde, avec pour conséquence une activation de la SODt qui est
à l’origine d’une partie de l’augmentation de la concentration en peroxyde d’hydrogène.
Le peroxyde d’hydrogène est détoxifié par la catalase (CAT) et l’ascorbate peroxydase
(APX). Dans nos conditions, seule l’activité de l’APX a été affectée par les traitements
correspondants aux intensités lumineuses élevée et moyenne. A t=27h après l’application du
stress photooxydatif, l’activité de l’APX est plus élevée de 57,7% pour le traitement
correspondant à une intensité lumineuse élevée et de 26,2% pour le traitement
116
Tableau 15 : Concentration en ascorbate réduit, en déshydroascorbate, et en ascorbate total, dans
la pulpe du fruit, en fonction de l’intensité du stress photooxydatif. SE : stress d’intensité lumineuse
élevée ; SM : stress d’intensité lumineuse moyenne ; T : témoin. Les données sont des moyennes ±
des erreurs standard. Les lettres a, b indiquent des différences significatives entre les traitements
d’intensité lumineuse différente pour chacune des dates considérées et les lettres A, B, C indiquent
des différences significatives entre les dates (j-5, j0, j2, j3 et j4) pour chacun des traitements (α=5%).
Ascorbate réduit (AA)
SE
SM
T
3h
27h
51h
99h
2,43±0,10 a,AB
2,66±0,11 a,BC
2,72±0,06 a,A
2,36±0,11 a,A
2,97±0,10 b,C
2,71±0,08 b,A
2,85±0,15 a,B
2,46±0,12 a,AB
2,51±0,11 a,A
2,63±0,06 b,AB
2,35±0,07 a,A
2,64±0,12 ab,A
0,63±0,10 a,AB
0,78±0,010 a,AB
0,80±0,08 a,A
0,39±0,06 a,A
0,63±0,04 b,A
1,00±0,13 b,A
0,77±0,10 a,B
0,88±0,07 a,B
0,93±0,09 a,A
2,99±0,11 a,A
3,75±0,10 b,C
3,51±0,08 b,A
3,24±0,15 a,AB
3,09±0,12 a,A
3,30±0,11 a,A
3,41±0,06 a,B
3,23±0,07 a,AB
3,57±0,12 a,A
Déshydroascorbate (DHA)
SE
0,82±0,13 a,B
SM
0,76±0,10 a,AB
T
0,75±0,09 a,A
Ascorbate total
SE
SM
T
117
3,24±0,10 a,AB
3,43±0,11 a,BC
3,47±0,06 a,A
correspondant à une intensité lumineuse moyenne par rapport au témoin. Ces résultats sont
en accord avec les études réalisées sur les enzymes de détoxication des ROS qui montrent
que l’activité de l’APX augmente généralement en réponse au stress environnementaux
(Shigeoka et al., 2002).
Nos résultats sont cohérents avec des études réalisées sur la tomate et la fraise
impliquant un stress photooxydatif. Torres et al. (2006) ont trouvé des valeurs élevées pour
les activités enzymatiques de détoxication des espèces réactives de l’oxygène (superoxyde
dismutase, catalase, déshydroascorbate réductase, monodéshydroascorbate réductase,
ascorbate peroxydase, glutathion réductase) des fruits immatures de tomate soumis à un
stress photooxydatif. Chez la fraise, des éclairages UV ont induit une augmentation des
valeurs des activités enzymatiques de détoxication des espèces réactives de l’oxygène (Erkan
et al., 2008).
Nos résultats nous permettent d’affirmer que le stress photooxydatif appliqué sur des
feuilles voisines a été transmis jusque dans la pulpe du fruit du fait de l’activation des
enzymes de détoxication des espèces réactives de l’oxygène.
II.3.
L’effet de fortes intensités lumineuses sur les différentes formes d’ascorbate
et sur le statut redox
Le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée a induit de faibles effets
sur la concentration en ascorbate réduit (AA), en déshydroascorbate (DHA) et en ascorbate
total (Tableau 15).Une diminution des concentrations en ascorbate réduit (-12,9%) et en
ascorbate total (-14,8%) est observée au temps t=27h par rapport au témoin. Quant à la
concentration en déshydroascorbate, elle est plus faible de 61%, au temps t=51h, par
rapport au témoin.
En plus, de la diminution de la concentration en ascorbate réduit (AA) et en
déshydroascorbate (DHA), les résultats sur les activités enzymatiques de détoxication des
ROS ont montré une augmentation de l’activité de la monodéshydroascorbate réductase
(MDHAR) et dans une moindre mesure de la déshydroascorbate réductase (DHAR) dans des
conditions de stress oxydatif élevé. En effet, tout au long du stress photooxydatif, l’activité
de la MDHAR est plus élevée de 388% pour le traitement correspondant à une intensité
118
lumineuse élevée et de 172% pour le traitement correspondant à une intensité lumineuse
moyenne par rapport au témoin. L’activité de la DHAR est plus élevée, à t=3h, de 30% pour
le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée. Ces observations sont
cohérentes avec l’hypothèse de Jimenez et al. (2002) qui interprète les variations de la
concentration en AA et DHA dans les fruits par des variations dans la synthèse de l’AA ou
dans la régénération de ce dernier par le DHA, et donc des modifications dans l’activité des
enzymes MDHAR et DHAR.
Le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée a un effet plus marqué
sur le statut redox de l’ascorbate (AA/DHA) (Figure 39). Le statut redox dans le traitement
correspondant à une intensité lumineuse élevée, à t=51h, est plus élevé d’environ 42% par
rapport au témoin. Tout au long de l’expérimentation, aucune différence significative n’a été
observée entre le traitement correspondant à une intensité lumineuse moyenne et le
témoin.
b, B
16
Rapport AA/DHA
14
12
10
8
6
4
a, A
a, B
a,A
a,B
a,A
a,AB
a,A
a, A
a,A
a,A
2
a,A
0
3h
27h
51h
99h
Temps d'exposition (heure)
Figure 39: Evolution du statut rédox de l’ascorbate dans la pulpe des fruits, au cours
du stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse : élevée (
),
moyenne (
) par rapport au témoin (intensité lumineuse faible) (
). Les
points correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs standard. Les lettres a, b
indiquent des différences significatives entre les traitements d’intensité lumineuse
différente pour chacune des dates considérées et les lettres A, B, indiquent des
différences significatives entre les dates (j-5, j0, j2, j3 et j4) pour chacun des
traitements (α=5%).
Nos résultats montrent qu’un stress photooxydatif appliqué sur les feuilles induit une
modification
du
statut
redox
de
l’ascorbate
dans
la
pulpe
du
fruit.
119
B
A
18
a
100
a
organiques (mg.g-1 MF)
(mg.g-1 MF)
120
a
80
60
a
40
b b a
b b a
b b
20
0
a
16
ab
b
14
12
10
a a
a
8
a
6
4
2
a a a
a a a
b b
ab b a
0
Glucose
Fructose Saccharose
Sucres
totaux
Acide
oxalique
Acide
Acide
Acide
Acide
malique ascorbique citrique succinique
Acides
totaux
C
130
b
120
Concentration en caroténoïdes (µg.g-1 MF)
110
100
ab
a
90
80
70
b
60
a
50
a
40
30
20
10
aaa
aaa
aaa
aaa
aaa
bba
b
bba
bba
ab a
aaa
0
Figure 40: Concentrations en sucres (A), en acides organiques (B) et en caroténoïdes (C) dans la pulpe des fruits, à
t=99h après l’application du stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse : élevée ( ), moyenne ( ) et
faible ( ). Les données représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard. Les lettres a,
b, c indiquent des différences significatives parmi les traitements (α=5%).
120
II.4.
L’effet de fortes intensités lumineuses sur les critères de qualité du
fruit
A t=99h, alors que la concentration en sucres totaux n’est pas affectée par le
traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée, les concentrations en acides
organiques totaux et en caroténoïdes totaux apparaissent supérieures de 13,2% et de 25,7%,
respectivement par rapport au témoin (Figure 40).
Même si la concentration en sucres totaux n’est pas touchée, le traitement
correspondant à une intensité lumineuse élevée induit une augmentation de la
concentration en saccharose (+16,2%) et une diminution des concentrations en glucose (10,5%) et en fructose (-13,2%) par rapport au témoin pour chacun des composés (Figure
40A). De la même façon, par comparaison au témoin, l’augmentation à la concentration en
acides organiques totaux est en partie due à l’augmentation de la concentration en acide
succinique (+25,6%) (Figure 40B). En ce qui concerne l’augmentation de la concentration en
caroténoïdes, elle est en grande partie due à l’augmentation de la cis-violaxanthine (+38%),
de la zéaxanthine (28,9%) et de β-cryptoxanthine (24,7%) (Figure 39C). D’autres
xanthophylles, telles que la cis-β-cryptoxanthine et la zéinoxanthine suivent le même profil.
Puisque le statut redox dans la pulpe des fruits d’orange a été fortement affecté par le
stress photooxydatif, l’interprétation de l’effet d’un stress photoinhibiteur appliqué aux
feuilles sur les caroténoïdes dans la pulpe des fruits pourrait être réalisée en fonction de nos
connaissances sur l’effet des variations du statut redox sur la voie de biosynthèse des
caroténoïdes. L’idée dominante est que les enzymes clefs de la voie de biosynthèse des
caroténoïdes en entier est sous le contrôle du statut redox (Steinbrenner et Linden, 2003).
C’est le cas de la phytoène synthase (PSY) et de la phytoène désaturase (PDS), qui sont les
deux enzymes exerçant le plus grand contrôle sur la voie de biosynthèse des caroténoïdes
(Fraser et al., 2007; Fraser et al., 2002). Les gènes Psy sont connus pour répondre fortement
aux facteurs environnementaux, tels que les fortes intensités lumineuses, la salinité, la
sécheresse, la température et la photopériode (Cazzonelli et Pogson, 2010). Il a été suggéré
que les plantes s’adapteraient à leur environnement à travers des variations du statut redox
(Buchanan et Balmer, 2005). La désaturation du phytoène par la PDS, de même que la
désaturation de la ζ-carotène par la ζ-carotène désaturase (ZDS), est une réaction complexe
121
qui requièrt un rapport PQH2/PQ élevé. (Barr et al., 2004; Carol et Kuntz, 2001; Joet et al.,
2002; Josse et al., 2000; Scolnik et al., 1987). PQH2, la forme réduite de PQ, peut être
réoxydée par le photosystème I (PSI) ou la plastoquinone terminale oxydase plastidiale
(PTOX) (Joet et al., 2002; Josse et al., 2000). Les facteurs contrôlant le gène Ptox n’ont pas
été identifiés, mais il est suggéré que le statut redox des plastoquinones jouerait un rôle clef,
si l’on considère que l’état redox des plastoquinones est connu pour contrôler la
transcription de plusieurs gènes (Pfannschmidt et al., 1999). Par ailleurs, les gènes situés en
aval de la voie de biosynthèse, tels que le gène β-carotène hydroxylase (Hy-β), qui catalyse la
conversion de la zéaxanthine en β-carotène, et le gène zéaxanthine époxydase qui convertit
la zéaxanthine en violaxanthine, sont contrôlés également par le statut redox des
plastoquinones (Woitsch et Romer, 2003).
L'influence exercée par les feuilles sur les fruits suggère fortement l'existence de
signaux hormonaux. L'hypothèse selon laquelle des feuilles soumises à un stress
photooxydatif peuvent influencer la synthèse de caroténoïdes dans des fruits à travers un
contrôle redox est séduisante sachant qu'il a été montré que certains des systèmes
impliqués dans la signalisation redox modulent la réponse des plantes aux hormones
(Buchanan et Balmer, 2005) Nous proposons le monoxyde d’azote (NO) comme un candidat
potentiel pour nos études futures. En effet, le NO est connu pour être produit après un
stress et il a un potentiel pour interagir avec les composés ayant un rôle dans la régulation
redox, incluant la MDHAR (Navrot et al., 2011).
II.5.
Conclusion
Nos résultats montrent qu’un stress photooxydatif appliqué sur les feuilles peut
engendrer une réponse dans la pulpe des fruits situés à proximité. En effet, le stress
photooxydatif a induit une activation des systèmes enzymatiques de recyclage et de
détoxication des espèces réactives de l’oxygène, des variations dans le statut redox de
l’ascorbate et des critères de qualité organoleptiques (sucres et acides organiques) et des
critères de qualité nutritionnels (caroténoïdes). Ces observations suggèrent que des signaux
sont transmis des feuilles aux fruits dans des conditions de stress environnementaux tels que
de l’exposition de fortes intensités lumineuses.
122
Partie IV : Conclusion et
perspectives
Partie IV : Conclusion et perspectives
Les fruits et légumes représentent une part importante de l’alimentation humaine et
une source majeure de substances biologiquement actives telles que les vitamines et les
métabolites secondaires. La consommation de fruits et légumes, de nos jours, reste
globalement insuffisante, c’est pourquoi elle doit être encouragée, et il serait intéressant de
proposer des fruits et légumes avec une concentration augmentée en vitamines et en
métabolites secondaires. Il y a deux façons d’atteindre cet objectif : l’approche génétique et
la manipulation de l’environnement. Nos observations sur fruits de clémentine et d’orange
confirment ce qui a déjà été vu par exemple chez la tomate, l’épinard et la carotte, à savoir
qu’il est possible d’agir fortement sur la concentration en caroténoïdes des fruits et légumes
par la seule action sur l’alimentation en sucres ou par l’application de conditions stressantes.
Effet de l’alimentation carbonée sur la biosynthèse des caroténoïdes
Notre premier objectif a été de déterminer l’effet de l’alimentation en sucres sur les
critères de qualité des agrumes et notamment la concentration en caroténoïdes.
Dans un premier essai, nous avons étudié l’effet de l’alimentation en sucres en testant
les conséquences de différentes charges en fruits appliquées après la chute physiologique.
Cette première étude nous permet d’affirmer que le statut carboné n’agit probablement pas
sur la biosynthèse des caroténoïdes en influençant positivement la biodisponibilité des
précurseurs. En effet, dans le traitement correspondant à une alimentation en sucres élevée,
les caroténoïdes présents en amont de la voie de biosynthèse (phytoène, phytofluène, ζcarotène) ont augmenté à la fois en termes de concentration absolue et de manière relative
(par rapport aux caroténoïdes totaux), alors que la concentration totale en caroténoïdes a
diminué. Nos observations n’ont cependant pas permis de déterminer à quel niveau le statut
carboné a influencé la voie de biosynthèse des caroténoïdes.
Dans un deuxième temps, nous avons testé l’effet de la charge en fruits sur les critères
de qualité du fruit récolté à maturité en fonction du stade de développement. Cette
deuxième étude nous a permis de déterminer que l’augmentation de la charge en fruits
induit une augmentation de la concentration en caroténoïdes dans la pulpe du fruit lorsque
celle-ci est appliquée après la chute physiologique. Ce stade de développement serait donc
124
le plus propice à l’amélioration des critères de qualité nutritionnelle des fruits. De plus, au
même stade de développement, la diminution de l’alimentation carbonée sur une courte
période de 15 jours a un effet moindre en ce qui concerne l’augmentation de la
concentration en caroténoïdes.
Les théories déterministes, et spécifiquement la théorie de l’équilibre entre la
différenciation et la croissance ne permettent pas d’expliquer nos résultats. Deux
hypothèses relatives aux rôles direct ou indirect de l’alimentation carbonée sur la voie de
biosynthèse des caroténoïdes mériteraient d’être étudiées de manière plus approfondie.
La première de ces hypothèses est fondée sur l’idée que les sucres pourraient jouer un
rôle modulateur de la voie de biosynthèse des caroténoïdes (effet direct). Il serait
intéressant d’étudier l’effet des sucres sur les facteurs de transcriptions et les gènes
impliqués dans la voie du MEP et dans la voie de biosynthèse des caroténoïdes. En effet, il a
été montré que les sucres ont occupé une place centrale dans le contrôle du métabolisme
des plantes, de leur croissance et de leur développement. Il a été montré de surcroît
l’existence d’interactions des sucres avec la lumière, le stress et les hormones (Rolland et al.,
2002). La diminution des sucres dans les feuilles augmente l’expression des gènes impliqués
dans la photosynthèse, la remobilisation, et l’exportation des sucres tandis qu’elle induit une
diminution de l’expression des gènes impliqués dans leur stockage (Koch, 1996). Au niveau
des feuilles, la régulation des gènes par les sucres, tels que les gènes impliqués dans la
photosynthèse, la réponse au stress ou le métabolisme secondaire, s’exercerait au niveau
transcriptionnel (Rolland et al., 2002). Les études menées sur le maïs et les promoteurs des
gènes de la photosynthèse suggèrent l’implication de facteurs de transcriptions (Sheen et al.,
1999). Toutes les études évoquées concernent la photosynthèse, la remobilisation et
l’exportation des sucres dans les feuilles. Fort peu de choses sont connues concernant les
organes autres que les feuilles et le métabolisme secondaire. Tout au plus peut-on évoquer
les études menées sur pétunia par Tsukaya et al. (Tsukaya et al., 1991). Celles-ci avaient
montré qu’une augmentation des sucres entraînait une augmentation de l’expression de la
chalcone synthase.
125
La deuxième hypothèse est que les sucres agiraient de manière indirecte sur la voie de
biosynthèse des caroténoïdes, en influençant la division et la croissance des chloroplastes.
Ces derniers sont destinés à se transformer en chromoplastes au cours du développement
du fruit, et sont les organites de stockage des caroténoïdes. Li et al. (2001) ont montré, par
l’étude de mutants, que la différenciation des plastes est un mécanisme fortement impliqué
dans le contrôle de l’accumulation des caroténoïdes chez le chou-fleur. De plus, chez la
tomate, il a été montré que augmentation de la concentration en caroténoïdes était corrélée
à l’augmentation du nombre de cellules dans le fruit, à l’augmentation du nombre de
chloroplastes par cellule et à la taille de chloroplastes (Bino et al., 2005). Si quelques études
ont montré l’existence d’un lien entre la concentration en caroténoïdes avec le nombre et la
taille des plastes, il n’existe en revanche aucune étude de l’effet de l’alimentation en sucres
sur la biogénèse ou la division des plastes. En revanche, on sait que les chloroplastes ont une
capacité de division supérieure à celle des chromoplastes (Kuroiwa et al., 1998). Or nos
essais ont justement montré qu’une augmentation de la concentration en caroténoïdes était
observable uniquement lorsque l’alimentation en sucres était diminuée précocement, c’està-dire avant la transformation des chromoplastes en chloroplastes. Il serait donc intéressant
d’étudier : I) les liens entre l’alimentation en sucres et la taille et le nombre de plastes et ; II)
les liens entre la taille et le nombre de plastes, d’une part, et la concentration en
caroténoïdes dans la pulpe du fruit, d’autre part. Pour cela, il serait nécessaire de
développer des approches histologiques conjointement à des études de l’expression des
gènes impliqués dans la division des plastes et de la biosynthèse des précurseurs des
caroténoïdes et de la voie de biosynthèse des caroténoïdes.
Effet du stress oxydatif et du statut rédox sur la biosynthèse des caroténoïdes
Notre deuxième objectif a été d’étudier l’effet d’un stress photooxydatif appliqué sur
les feuilles, à l’aide de différentes ombrières sur les paramètres photosynthétiques des
feuilles, sur le métabolisme antioxydant et sur la concentration en caroténoïdes dans la
pulpe du fruit. Les premiers résultats obtenus montrent qu’un stress photooxydatif appliqué
sur les feuilles peut engendrer une réponse dans la pulpe du fruit. Le stress photooxydatif a
stimulé les systèmes enzymatiques de recyclage et de détoxication des espèces réactives de
l’oxygène, et plus particulière la superoxyde dismutase, la déshydroascrobate réductase, la
126
monodéshydroascorbate réductase et l’ascorbate peroxydase. Il a aussi augmenté le statut
redox de l’ascorbate (rapport ascorbate réduit/déshydroascrobate), la concentration en
peroxyde d’hydrogène, en acides organiques et en caroténoïdes. Enfin, il a été à l’origine
d’une diminution de la concentration en sucres des fruits. Ces résultats suggèrent fortement
que des signaux peuvent être transmis des feuilles vers le fruit. Ils suggèrent aussi que le
stress photooxydatif peut impacter de façon positive la concentration en caroténoïdes dans
la pulpe du fruit.
Ces résultats ouvrent de nombreuses perspectives scientifiques et appliquées. Nous
allons envisager ici quelques pistes de manière ouverte, sans trop nous préoccuper à ce
stade des questions de faisabilité.
La question de l’implication du stress oxydant et des variations de statut redox qui lui
sont associées dans le contrôle de la synthèse des caroténoïdes nous paraît l’une des plus
importantes à traiter. L’hypothèse selon laquelle le stress photooxydatif agirait sur la
biosynthèse des caroténoïdes par le biais du statut rédox pourrait être vérifiée d’abord en
appliquant des molécules exacerbant la production d’espèces réactives de l’oxygène dans le
fruit. Les effets sur le statut rédox pourraient être suivis via le dosage des différentes formes
d’ascorbate, de glutathion et du NADP, et l’analyse de l’expression des gènes impliqués dans
leur métabolisme. Il est rappelé que les réactions catalysées par la ZEP et la LCY-β
nécessitent du NADPH (Mialoundama et al., 2010; Yu et al., 2010). Il serait certainement
intéressant d’inclure la plastoquinone dans ces études. En effet, la PDS, la ZDS, la ZEP et la
HY-β sont contrôlées par le statut rédox des plastoquinones et requièrent un rapport
PQ/PQH2 élevé (Barr et al., 2004; Woitsch et Romer, 2003). Les études envisagées devraient
impliquer une caractérisation du statut oxydant global, par exemple par des études de
résonance spectrométrique paramagnétique (EPR). En ce qui concerne les étapes sensibles,
nous pensons qu’il faudrait en premier lieu nous concentrer sur la PSY et la PDS, qui sont les
deux enzymes exerçant le plus grand contrôle sur la voie de biosynthèse des caroténoïdes
(Steinbrenner et Linden, 2003).
La deuxième grande question porte sur la nature de la signalisation mise en évidence
et des mécanismes qui lui sont associés. Plusieurs hormones et espèces réactives de
l’oxygène ou de l’azote sont de bons candidats pour ce rôle. Les observations réalisées par
127
Rossel et al. (2007) à propos de l’acclimatation systémique acquise (SAA) suggèrent que ni
l’acide abscissique, ni l’acide salicylique, ni le méthyl jasmonate, ni le peroxyde d’hydrogène
sont impliqués dans la signalisation. Le monoxyde d’azote (NO) nous semble être le meilleur
des candidats pour de futures études. Le monoxyde d’azote est connu pour agir comme une
molécule signale modulant les réponses aux stress biotiques et abiotiques des plantes
(Wendehenne et al., 2005; Wilson et al., 2008). Plusieurs études ont également suggéré que
le NO jouerait un rôle dans la protection des plantes contre le stress oxydatif. Chez le blé,
l’application de molécule favorisant la production de NO confère à la plante, dans des
conditions de sécheresse, une augmentation de la tolérance en induisant notamment la
fermeture des stomates (Garcia-Mata et al., 2001). De même, chez le haricot, l’application
de molécule favorisant la production de NO protège les plantes des dommages pouvant être
causés par les UV-B probablement par l’intermédiaire de l’activation des enzymes
antioxydantes (SODt, APX, CAT) (Shi et al., 2005).
Le rôle du NO pourrait être testé en appliquant des molécules générant du NO à des
fruits détachés, puis en mesurant à différents pas de temps les activités enzymatiques et
l’expression des gènes impliqués dans la détoxication des espèces réactives de l’oxygène
(SOD, CAT, MDHAR, DHAR, GR, APX), le statut rédox de l’ascorbate dans les fruits, et les
l’expression de la PSY et de la PDS.
Il faudrait également étudier l’effet du stress
photooxydatif sur la production de NO dans les feuilles et se donner les moyens de suivre
NO dans le phloème.
Il serait enfin également intéressant de chercher à préciser de quelle manière le signal
en provenance des feuilles est perçu par les fruits, ainsi que son influence sur le
métabolisme antioxydant et sur la synthèse des caroténoïdes. Si l’on admet que la
stimulation du métabolisme antioxydant et celle de la synthèse des caroténoïdes dans le
fruit résultent d’une augmentation de la concentration en espèces réactives de l’oxygène ou
des variations de statut redox qui lui sont associées, il conviendrait d’étudier comment le
signal en provenance des feuilles impacte la production d’espèces réactives de l’oxygène. Il a
été observé que NO justement avait la capacité de stimuler la production d’O 2- en favorisant
la réduction des cytochromes de la chaine de transport des électrons mitochondriale de
cellules animales endothéliales (Palacios-Callender et al., 2004). Il est intéressant de noter
que, dans le même essai, il avait été observé que la production d’O2- initiait l’activation du
facteur de transcription NF-kB impliqué dans la réponse des cellules animales au stress.
128
Dans un but plus appliqué, il serait certainement utile de vérifier que l’augmentation
de la concentration en caroténoïdes dans la pulpe du fruit induite par un stress
photooxydatif sur une courte période se retrouve dans le fruit à maturité. En cas d’effet
positif démontré, il faudra déterminer à quel stade de développement du fruit l’application
du stress photooxydatif est la plus efficace pour induire une augmentation de la
concentration en caroténoïdes dans la pulpe. Une expérimentation a déjà été réalisée dans
cette perspective. Deux stades de développement du fruit ont été choisis dans un premier
temps : le stade de grossissement cellulaire et la maturation du fruit. Pour ces deux stades,
des rameaux ont été sélectionnés, annelés et soumis à un stress photooxydatif. Des fruits
one été récoltés selon une cinétique allant de 3h après l’application de stress photooxydatif
jusqu’au stade de maturité du fruit. Ces échantillons n’ont toutefois pu être analysés pour le
moment.
A plus long terme, ces résultats pourraient nous permettre de réaliser des
comparaisons avec d’autres stress, tels que la sécheresse, connus pour favoriser
l’augmentation de la concentration en caroténoïdes, afin de proposer à la filière des
itinéraires culturaux pour produire des fruits ayant une teneur enrichie en caroténoïdes tout
en maintenant les autres critères de qualité que sont la teneur en acides, la maturité et le
calibre du fruit.
129
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Annexes
Annexe 1 : Article de synthèse
Health benefits of vitamins and secondary metabolites of fruits and
vegetables and prospects to increase their concentrations by agronomic
approaches.
POIROUX-GONORD F., FANCIULLIONO A.L., BERTI L., URBAN L.
Journal of Agricultural and Food Chemistry
159
160
25.1
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177
Annexe 2 : Posters
Annexe 2 : Posters
Annexe 2 : Posters
(1) INRA, Unité GEQA, 20230 San Giuliano, France
(2) UMR 6134, laboratoire de biochimie et biologie
moléculaire du végétal, quartier Grossetti BP 52
20250 Corte, France
179
Annexe 2 : Posters
Effet de l’agriculture biologique sur la valeur-santé des fruits et des
légumes : réflexions et études en cours sur clémentine et tomate
L. Urban1, F. Gonord1, L. Berti2, H. Sallanon3, F. Lauri3
1
2
3
INRA, Unité de Recherche GEQA, San Giuliano ([email protected])
Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire Végétales, Université Pascal Paoli, Corte
Laboratoire de Physiologie des Fruits et Légumes, Université d’Avignon et de Pays de Vaucluse, Avignon
Introduction
Il est maintenant avéré que toutes les contraintes, qu’elles soient d’origine biotique ou abiotique, résultent en une augmentation de la
production d’espèces actives de l’oxygène (AOS) chez les plantes (1). On sait que les enzymes de détoxication des AOS, les
systèmes antioxydants, au 1er rang desquels on trouve la vitamine C, et des métabolites secondaires jouent un rôle crucial dans les
dispositifs de protection que les plantes mettent en place lorsqu’elles sont soumises à un stress oxydatif. Il paraît donc raisonnable de
faire l’hypothèse que les contraintes, comme celles auxquelles les plantes sont soumises dans les systèmes de production de
l’agriculture biologique (AB), stimulent les enzymes de détoxication, les systèmes antioxydants et la synthèse de métabolites
secondaires via les AOS. Certains résultats semblent effectivement indiquer que les AOS jouent un rôle important, entre autres, dans le
contrôle de la biosynthèse des caroténoïdes et de certains composés phénoliques (2, 3). De plus, les métabolites secondaires sont
coûteux à synthétiser. Certaines observations suggèrent que la croissance et la production sont en compétition avec la
synthèse des métabolites secondaires (4, 5). Notre objectif est de tester ces hypothèses sur clémentine et tomate, et de développer à
terme une vision intégrée de l’effet des stress et du statut carboné sur la concentration en métabolites secondaires et en vitamine C.
Matériel et méthodes
Nous cherchons actuellement à établir le rôle joué par le stress photooxydatif au niveau des feuilles dans le contrôle des voies de
biosynthèse des caroténoïdes chez la clémentine. Dans cette étude, le niveau de lumière est modulé par ombrage pour obtenir une gamme de
niveaux de stress et d’états redox. Nous étudions également l’effet du statut carboné en faisant varier le rapport feuilles sur fruit et donc la
teneur en sucres de fruits portés par des rameaux dont les connections phloémiennes ont été supprimées. Dans ces deux études, les effets du
stress photooxydatif et de la concentration en sucres sont évalués à la fois au niveau moléculaire et au niveau biochimique. Les fruits sont
prélevés à différents stades de développement pour tenir compte de l’effet de la maturité sur la biosynthèse des caroténoïdes. Une approche
similaire est actuellement développée sur la tomate. Des plants de tomates ont soumis à divers stress abiotiques (déficit hydrique, salinité, …) au
cours de la croissance des fruits.
Premiers résultats
Accumulation d’AOS dans les fruits de tomate accompagnée d’une
augmentation de la teneur en vitamine C et de l’activité des
enzymes impliqués dans le recyclage de cette vitamine (Tabs. 1 et 2).
Les premiers résultats suggèrent l’existence d’un signal foliaire induisant
des modifications du métabolisme du fruit.
Tableau 2 : Effets de défici ts hydriques appliqués
pendant 24h sur la te ne ur en vitamine C de fruits
de m icro-tom
Tableau 1 : Effets d’un déficit hydrique
d’une d u r é e de 1 semaine sur la teneur en
vitamine C
Concentrations (µmol/g MS) en ascorbate total, en ascorbate (Asc),en déhydroascorbate (DHA) et état redox (Asc/total) dans les
fruits de tomates issues de plantes témoins (C), acclimatées au déficit hydrique (DA) et non acclimatées (NA). Les fruits sont
prélevés à la fin d’un premier stress hydrique modéré (S1) permettant l’acclimatation, après une période de réhydratation (R) et
à la fin d’une deuxième période de stress intense (S2). Les plantes NA n’ont pas subi le stress d’acclimatation S1. Les valeurs
correspondent à la moyenne (± SE) des mesures réalisées sur 5 plantes pour chaque traitement (n=5). * indique les différences significatives du
traitement par rapport au témoin (ANOVA à 5%).
21 DAA
Ψh foliaire
Vit C
DHA
Contrôle
-0.34 ± 0.02
0.87 ±0.02
0.46 ±0.03
Déficit hydrique 1
-0.63 ± 0.03
1 ±0.06
0.34 ±0.03
Déficit hydrique 2
-1.37 ± 0.07
1.63 ±0.03
0.14 ±0.02
Pas d’effet significatif
38 DAA
31 DAA
Effet significatif de S2 sur
NA et non sur DA
Discussion
Il avait déjà été montré que les contraintes favorisaient l’activité antioxydante des tomates (6, 7). Les résultats obtenus sur tomate suggèrent
de surcroît que ce sont les stress subis par les feuilles qui stimulent les systèmes antioxydants dans les fruits. Ils semblent donc confirmer
l’hypothèse que les contraintes influencent les systèmes antioxydants et la concentration en vitamine C des fruits à travers le stress photooxydatif
subi au niveau des feuilles. Ces résultats devront être complétés, en particulier par une étude de l’effet des contraintes sur le métabolisme
secondaire et par la prise en compte du statut carboné.
Résumé
Il existe des rapports contradictoires concernant l’effet des pratiques de
l’agriculture biologique sur la teneur en micronutriments et en vitamine C
des fruits et légumes. Nous testons l’hypothèse que les différences
observées sont dues aux effets des stress et du statut carboné, et de leurs
interactions. Les premières observations sur tomate suggèrent que les
stress subis par les feuilles se traduisent par une activation des
systèmes antioxydants dans les fruits.
Mots clés :[s1] agriculture biologique, caroténoïdes, Vitamine C, sucres, stress
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19 & 20 mai, centre Inra de Montpellier
180
Annexe 2 : Posters
181
Annexe 2 : Posters
182
RESUME
Les fruits représentent une source majeure de vitamines et de métabolites
secondaires. Bien qu’il y ait débat sur les mécanismes d’action des métabolites secondaires
sur la santé humaine, il y a un consensus général sur le fait que les avantages santé des fruits
sont en partie attribuables à leur forte concentration en vitamines et en métabolites
secondaires. Les caroténoïdes, et principalement les caroténoïdes précurseurs de la vitamine
A (β-carotène, α-carotène et β-cryptoxanthine) sont des composants essentiels au régime
alimentaire de l’Homme. Un certain nombre d’observations suggèrent qu’ils jouent des rôles
dans la prévention de certaines maladies. Les agrumes représentent une source majeure de
caroténoïdes à la fois par leur concentration et par leur diversité.
Dans le but de produire des fruits d’agrumes à teneurs augmentées ou garanties en
caroténoïdes, nous avons testé deux hypothèses. La première concernait l’implication de la
disponibilité en carbone dans la synthèse et l’accumulation des caroténoïdes et la deuxième
le rôle du stress oxydatif ou des variations de statut redox sur cette biosynthèse.
L’effet des sucres sur la biosynthèse des caroténoïdes, a été étudié à l’aide de trois
niveaux de charge en fruits. Nos premières observations indiquent qu’une charge en fruits
élevée impacte fortement les critères de qualité du fruit. On observe ainsi : une diminution
du calibre, une diminution de la concentration en sucres, un retard de la maturité, et une
augmentation de la concentration en acides organiques et en caroténoïdes. Nos résultats
contredisent l’idée selon laquelle un statut carboné élevé est favorable à la synthèse des
caroténoïdes dans les fruits par une disponibilité accrue en précurseurs. L’étude de l’effet de
la charge en fruits nous a également permis de montrer que la concentration en
caroténoïdes des fruits était déterminée précocement au cours du développement du fruit.
Nous émettons l’hypothèse que l’alimentation carbonée influence précocement la synthèse
des caroténoïdes ou leur accumulation en agissant sur le nombre ou la taille des plastes.
L’impact sur la biosynthèse des caroténoïdes du stress oxydatif ou des variations de
statut redox qui lui sont associées a été étudié, sur des rameaux isolés par annélation, par
l’application de différents niveaux de stress photooxydatif sur des feuilles voisines du fruit.
Nos résultats suggèrent, tout d’abord, que le statut redox de l’ascorbate et le métabolisme
antioxydant peuvent être influencés dans la pulpe des fruits quand un stress photooxydatif
est appliqué sur les feuilles voisines. Ils suggèrent également que le stress photooxydatif
pourrait être utilisé pour augmenter la concentration des caroténoïdes dans les fruits.
Les données recueillies ont permis d’émettre certaines hypothèses sur le rôle
essentiel des sucres et du stress oxydatif sur la synthèse des caroténoïdes, mais des études
complémentaires seront nécessaires afin de déterminer les processus impliqués et de
pouvoir proposer des itinéraires culturaux favorables à une augmentation la concentration
en caroténoïdes dans les fruits d’agrumes.
183
SUMMARY
Fruits are a major source of vitamins and secondary metabolites. Although there is a
debate about the way secondary metabolites impact human health, there is a general
consensus that the much praised health benefits of fruits are, at least partially, attributable
to their high concentrations in vitamins and secondary metabolites. Carotenoids, and in
particular carotenoids endowed with provitamin A activity (β-carotene, α-carotene and βcryptoxanthine) are vital components of the human diet. Many observations suggest that
they have an impact in preventing of diseases. Citrus fruits are a major source of carotenoids
by both concentration and diversity.
With the objective to produce citrus fruit with increased or guaranteed amounts of
carotenoids, we tested two hypotheses. The first is that sugar supply influences biosynthesis
and accumulation of carotenoids, and the second, is that oxidative stress or the associated
variations in redox status in this biosynthesis.
The effect of sugars on the biosynthesis of carotenoids had been studied using three
levels of fruit load. Our results showed clearly that high fruit load has a strong impact on
criteria of fruit quality. We observed: a decrease in size in total sugars concentration, a delay
in maturity and an increase in the concentrations of total organic acids and carotenoids. Our
results do not support the common view that a high carbon status is favorable to synthesis
of carotenoids in fruits through its positive influence on precursor availability. Our
observations also show that the concentration of carotenoids in fruits is determined during
early fruit development. We hypothesize that carbon supply influences synthesis of
carotenoids or their accumulation by affecting the number or size of plastids.
The impact of oxidative stress on the biosynthesis of carotenoids was studied on
fruiting branches isolated by girdling, by applying different levels of photo-oxidative stress
on leaves close to the fruits. Our results suggest: firstly, that the redox status of ascorbate
and antioxidant metabolism of fruits can be affected when photo-oxidative stress is applied
to their neighboring leaves. They also suggest that the photo-oxidative stress could be
exploited to increase the concentration of carotenoids in fruits.
Data collected were used to develop hypotheses on the role of sugars and oxidative
stress in synthesis of carotenoids, but further studies are needed to determine the processes
involved and to offer viable cultural routes to increase the concentration of carotenoids in
citrus fruits.
184

UNIVERSITE DE CORSE-PASCAL PAOLI Thèse

Transcription

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