thèse finale hayat Caidi

UNIVERSITÉ MOHAMMED V – AGDAL
FACULTÉ DES SCIENCES
Rabat
N° d’ordre 2381
THÈSE DE DOCTORAT
Présentée par
Nom et Prénom : CAIDI Hayat
Discipline : Biologie
Spécialité : Virologie –Biologie moléculaire
Titre :
SÉROLOGIE ET CARACTÉRISATION MOLÉCULAIRE DES SOUCHES
DE LA RUBÉOLE AU MAROC ET IDENTIFICATION DU NOUVEAU
GÉNOTYPE 1g EN AFRIQUE.
Soutenue le 10 septembre 2007
Devant le jury
Président :
Pr Abdelaziz BENJOUAD, Faculté des Sciences Rabat
Examinateurs :
Pr Abdelkarim FILALI-MALTOUF, Faculté des Sciences Rabat
Pr Rajae EL AOUAD, Faculté de Médecine/Directeur INH, Rabat
Pr Saïd AMZAZI, Faculté des Sciences Rabat
Pr Abdelaziz SOUKRI, Faculté des Sciences Ain Chock, Casablanca
Pr Bachir KISSI, Laboratoire National de Contrôle de Médicaments Vétérinaires IAV Hassan
II Rabat.
Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat – Maroc
Tel +212 (0) 37 77 18 34/35/38, Fax : +212 (0) 37 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma
Je dédie cette thèse
À mon père, À ma mère
À
mes frères et mes sœurs
Et à toute ma famille.
AVANT PROPOS
Le présent travail a été réalisé au sein de l’UFR de Biochimie Immunologie (UFR
SV99/07), dirigée par le Professeur Abdelaziz Benjouad dans le cadre d’une
collaboration entre le laboratoire de Biochimie Immunologie (Pr Benjouad Aziz), le
laboratoire d’Immunologie Virologie à l’Institut National d’Hygiène (Pr Rajae El Aouad)
et, le laboratoire spécialisé Rougeole/ Rubéole du Centre de Contrôle et de Prévention
des maladies CDC- Atlanta (Dr J. Icenogle).
Je remercie infiniment Pr Abdelaziz Benjouad d’avoir accepter d’encadrer ce travail,
pour les discussions scientifiques enrichissantes et ses encouragements, ses précieuses
connaissances dans le domaine, l’immensité de son savoir, la rigueur de son
raisonnement, ses conseils et orientation m’ont été d’un grand aide pour mener a bien ce
travail.
Qu’il trouve ici l’expression de ma respectueuse gratitude et ma vive reconnaissance.
Je remercie énormément mon Directeur de thèse, le Professeur Rajae El Aouad,
Directeur de l’Institut National d’Hygiènes pour l’intérêt qu’elle a accordé pour cette
thèse. Pr R. El Aouad a suivi mes travaux avec intérêt constant et une confiance
imperturbable en leurs réussites. Son savoir et ses talents multiples m’ont profondément
inspiré tout au long de mon travail.
Qu’elle trouve ici l’expression de tout mon respect, le témoignage de ma sincère
gratitude et l’expression de ma très grande considération.
J’exprime mes profonds remerciements au Dr Joseph Icenogle de m’avoir permis de
réaliser ce travail au sein de son laboratoire (CDC Atlanta), de m’avoir fait profité de ses
connaissances théorique et expérimental, pour ses conseils précieux et pour m’avoir fait
confiance tout le long de cette thèse en me laissant orienter ce travail selon mes
aspirations. J’exprime toute ma reconnaissance et mes remerciements les plus vifs.
Je tiens à remercier très sincèrement et tout particulièrement les membres du jury qui ont
eu l’amabilité d’accepter cette tâche toujours quelque peu contraignante. Le travail
présenté n’aurait pas abouti sans leur aide.
A mes rapporteurs qui ont du lire et relire la thèse pour établir un rapport critique,
j’exprime toute ma reconnaissance et mes remerciements les plus vifs.
Je tiens à remercier Dr S. Smit du NICD (National Institute for Communicable Diseases,
Johannesburg, Afrique du Sud, et Dr S.D.K Sempala, Uganda Virus Institute, Kampala,
Ouganda, et aux autorités des Camps des Réfugiés, de l’Etat New Hampshire, USA pour
leur collaboration.
Je tiens à remercier, également Dr William Bellini, Directeur du département
Rougeole/Rubéole NCID CDC Atlanta.
Je tiens à remercier Dr Mark Papania, Dr Susan Reef, Dr John Glasser NIP/ CDC
Atlanta, de m’avoir aidé dans l’analyse statistique des données épidémiologiques.
Je tiens à remercier également Mme Emily. S Alberathy, Dr Chen Min-Hsin, Dr Raydel
Mair, Mme Yvonne Villamaro, Mme Qi Zheng, Dr Hong Son, CDC Atlanta pour leur
aide et leur soutien et pour l’atmosphère plus qu’agréable qu’elles ont contribué à
maintenir au sein du département tout au long de ce travail.
Je remercie beaucoup mes collègues du Département d’Immunologie Virologie qui, de
près comme de loin m’ont aidé et encouragé aux moments opportuns. Je remercie
également mes amies et particulièrement Dr Amal Alla et Dr Samira Senouci, Dr Amina
Hançali pour leur amitié et leur soutien qu’elles n’ont cessé d’apporter tout au long de ce
travail.
PUBLICATIONS
Hayat Caidi, Emily S. Abernathy, Abdelaziz Benjouad, Sheilagh Smit, S.D.K
Sempala, Rajae El Aouad and Joseph Icenogle. Phylogenetic analysis of rubella
viruses found in Morocco, Uganda Ivory Coast and South Africa from 2001 to 2004.
Journal of Clinical Virology, Manuscript Number: JCV-S-06-00221. (Accepted- January
2007).
Hayat Caidi, Sharon Bloom, Mustapha Azilmaat, Abdelaziz Benjouad, Susan Reef
and Rajae El Aouad. Rubella Seroprevalence among women 15-39 years of age,
Morocco, 2002. EASTERN MEDITERRANEAN HEALTH JOURNAL Date: 20 August
2006, EMHJ.8/314. R4/27/8, Manuscript No.: 06/434. In press (Accepted- December
2006).
Hayat. Caidi, Amal Alla, Emily S Abernathy, Abdelaziz Benjouad and Rajae El
Aouad. Genomic analysis of Rubella viruses circulating in Morocco during measles
outbreaks 2005-2006. Soumis. Journal of Clinical Virology, Manuscript Number: JCV-S06-00234. (Marsh 2007).
H. Caidi, Fares, A. Alla, A. Laskri, A.Benjouad, A and El Aouad R. Avidity assay for
distinguishing between primary and secondary immune response to Rubella infection in
pregnant women in Morocco. Soumis, EASTERN MEDITERRANEAN HEALTH
JOURNAL, 19 February 2007 EMHJ.9/316, R4/27/9, Manuscript No.: 06/481.
COMMUNICATIONS INTERNATIONALES
Hayat Caidi, Emily Abernathy, Min-Hsin Chen, Hong Sun, Qi Zheng, Shigetaka
Katow and Joseph Icenogle. Characterization of a new Genotype 1g in Uganda and
Ivory Coast.
Rubella and CRS Elimination in the Unites States of America. November 12th 2004,
CDC, Atlanta. USA.
Hayat Caidi, Emily Abernathy, Min-Hsin Chen, Hong Sun, Qi Zheng, Shigetaka
Katow and Joseph Icenogle. Alternative RT-PCR from C region for rubella virus
detection.
Seminar for New Algorithm for rubella virus diagnosis. Koger Royal Center, CDC
Atlanta, USA May 24 2005.
Hayat Caidi, Amal Alla and Rajae El Aouad. Rubella and Measles genotypes in
Morocco. Intercountry Meeting on Measles/Rubella Control Elimination EMRO, WHO.
Amman Jordan, Intercontinental Hotel, 27-29 November 2006.
RÉSUMÉ
Afin de déterminer la susceptibilité de la rubéole chez les femmes en âge de procréer, au
Maroc, 967 échantillons sont testés pour les IgG spécifiques. Ainsi, 83,5% des femmes sont
séropositives. En prenant en considération le facteur milieu, aucune différence
statistiquement significative (p=0,87) n’est observé, entre le milieu urbain (85,0%) et le
milieu rural (81,5%).
L’infection par le virus indique un grand risque pour le syndrome de la rubéole congénitale
(SRC) au Maroc. Seules des stratégies de vaccination, conduites et bien ciblées, sur les
enfants et sur les femmes en âge de procréer, permettront d’atteindre les objectifs
d’élimination du SRC.
Pour différencier entre une infection primaire susceptible d’infecter le fœtus et une
réinfection, un test d’avidité (IA) des IgG est effectué sur 100 femmes enceintes ayant une
suspicion d’infection. Ainsi, 52% des femmes sont positives en IgM et IgG, 76,9% d’entre
elles présentent un IA faible (< à30%), 7,6% un IA modéré (30 à 50 %) et 15,4% un IA élevé
(> à 50). Le test de l’avidité des IgG, révélant des valeurs prédicatives plus élevées que le test
IgM EIA, est recommandé en tant qu’analyse complémentaire de routine.
L’analyse moléculaire des souches de la rubéole circulant, au Maroc, de 2001 à 2005, montre
que le génotype 1E, associé à la transmission épidémique du virus, est reconnu comme
génotype international. Les souches ougandaises et ivoiriennes se regroupent parmi le
génotype 1g alors que la souche originaire de l’Afrique du Sud se regroupe avec les souches
du génotype 2B. Ces données permettront de combler les lacunes concernant l’étude
épidémiologique moléculaire du virus de la rubéole dans le continent africain.
La caractérisation moléculaire du nouveau génotype 1g, réalisée pour la première fois, est
effectuée par séquençage de la région (3186 nucléotides) codant pour les protéines
structurales SP-ORFs (C-E2-E1). La comparaison est faite avec le virus originaire d’Israël,
pour confirmer l’usage des souches du génotype 1g.
Mots- clés : Virus de la rubéole, SRC, Analyse génétique, test d’avidité, femmes en âge
de procréer, séquençage, épidémiologie moléculaire.
TABLE DES MATIÈRES
INTRODUCTION
CHAPITRE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE……………………………………1
Généralités…………………………………….…………………………………………2
I- Le virus de la rubéole…….............................................................................................2
I-1 Structure du virus……………………………………………………………………2
I-2 Génome du virus………………………………………………………………............3
I-3 Réplication du génome……………………………………..........................................4
I-4 Protéines du virus……………………………………..................................................6
I-4-1 Protéine C…………………………….…………………………………………….6
I-4-2 Protéines d’enveloppe……………………..……………………………………….7
II-MALADIE…………………………………………………………………………….8
II-1 Historique…………………………………………………………………………….8
II- 2 Manifestations cliniques………………………………………..................................9
II-3 Épidémiologie………………………………….........................................................10
II-4 Transmission ……………………………………………………………………......11
II-5 Immunité…………………………………………………………………………….12
II-5-1 Immunité à médiation cellulaire………………………………………………….13
II-5-2 Immunité humorale…………………………………………………….................14
II-6 Vaccination….……………………………………………………….....................15
II-6-1 Séroconversion selon les vaccins…………………………………………………16
II-6-2 Persistance des anticorps……………………. …………………………………...16
II-6-3 Protection conférée par un faible taux d'anticorps ………………………………16
II-6-4 Réinfection selon les vaccins utilisés …………………………………………….17
II-6-5 Vaccination rubéoleuse au Maroc ……………………..........................................17
II-6-6 Effets de la revaccination……………………………….......................................19
II-6-7 Pharmacovigilance des vaccins……………………..….........................................19
II-7 Syndrome de la Rubéole Congénitale………………...............................................20
II-7-1 Infection du fœtus ………………………………………………………………..21
II-7-2 Apparition du SRC chez le fœtus infecté.………………………………………..21
II-7-3 Réinfection et le syndrome de la rubéole congénitale …………………………..22
III- Surveillance de la rubéole……………………………………...............................22
III-1 La rubéole en Afrique……………….....................................................................23
III-2 Estimation de la charge de morbidité due au SRC….........................................24
III-2-1 Enquêtes sérologiques…………………………………………………………...24
III-2-2 Enquêtes sérologiques de la population stratifiée sur l’âge……………………..24
III-2- 3 Enquêtes sérologiques chez les femmes en âge de procréer.…………………...25
III-3 Stratégies de contrôle……………………………………………………………..26
III-3-1 Stratégies préconisées……………………….…………………………………...26
III-3-2 Stratégie de l’élimination de la rubéole au Maroc……………………….............28
IV- Diagnostic biologique de la rubéole……………………………………………… 28
IV-1 Diagnostic sérologique………………………………………………………….....28
IV-1-1 Diagnostic indirect …………………………........................................................31
IV-1-2 Les IgM spécifiques……………………………………………………………...31
IV-1-3 Mesure de l'avidité des IgG spécifiques…………………………………………32
IV-2 Isolement et identification du virus ………………………………………………..33
IV-3 Test d'Immuno-Fluoresence (IF) ………………………….....................................35
IV-4 Détection du virus par la réaction RT-PCR………………………………….........35
IV-5 Séquençage et analyse des séquences……………………………………………...36
CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES……………………………………44
I-Étude du statut immunitaire chez les femmes en âge de procréer……..………….45
I- 1 Population étudiée…………………………………………………………………..45
I-2 Prélèvements…………………………………………………………………………45
I-3 Test sérologique……………………………………………………...........................46
II- Mesure de l’avidité des IgG……………………………………………..................46
II-1 Population étudiée…………………………………………………………….........46
II-2 Prélèvements……………………………………………………………...................46
II-3 Test sérologique…………………………………………………………………….47
II-4 Détermination de la dilution optimale d avidité des IgG anti-rubéole……………..47
II-5 Interprétation………………………………………………………..........................48
III- Analyse moléculaire des souches de la rubéole au Maroc, Ouganda, Côte
d’Ivoire et en Afrique du Sud………………………………………………………….48
III- 1 Prélèvements.…………….………………………………………..........................49
III- 2 Inoculation et passage sur culture cellulaire Vero et Vero /Slam………………...50
III-3 Test d'Immunofluorescence ……………………………………………………….52
III-4 Diagnostic moléculaire par RT-PCR………………………………………………53
III-4-1 Extraction du génome viral…………………………………................................53
III-4-2 Transcription inverse et amplification génique du gène de la glycoprotéine
E1……………………………………….. …………........................................................54
III-4-3 Amplification des protéines de structure C-E2-E1………………………………56
III-4-4 Révélation des produits d’amplification…………………....................................57
III-5 Séquençage du virus de la rubéole……………………………………………........57
III-5-1 Souches marocaines et la souche d’Afrique du sud..............................................57
III-5-2 Amplification des protéines de structure SP-ORF………………………………58
III-5-3 Logiciels Bioinformatiques……………………………………...........................59
IV- Séquençage de tout le génome (9762 nts) du virus de la rubéole : souche
vaccinale HPV77………………………………………………………………………..61
IV-1 Amorces pour séquencer la protéine non structurale NSP-ORF …………………62
IV-2 Amorces pour séquencer la région structurale C-E2-E1…………………………...64
CHAPITRE III: RESULTATS ET DISCUSSION…………………………………...65
I-Séroprévalence du virus de la rubéole chez les femmes en âge de procréer au
Maroc………………………………………………........................................................66
II- Mesure de l’avidité des IgG………………………………………………………….68
III- Immunofluorescence (IF)……………………………………………………………69
IV-Analyse moléculaire …………………………………………………………………71
IV-1 Analyse des souches Marocaines……………………………………......................71
IV-2 Analyse des souches Africaines……………………………………………………76
V- Détection du virus de la rubéole par amplification génétique des protéines de
structure C-E2-E1………………………………………………………………………78
V-1 Analyse de l’alignement des séquences peptidiques des souches du génotype 1g…79
V-2 Analyses phylogénétiques ………………………………………………………….82
VI- Génotypage du génome entier du virus de la rubéole : souche vaccinale
HPV77…………………………………………………………………………………...90
Discussion……………………………………………………………………………..94
I- Séroprévalence de la rubéole chez les femmes en âge de procréer au Maroc……94
A- Séroprévalence du virus de la rubéole chez les femmes en âge de procréer………..95
B- Choix de la stratégie vaccinale…………………………………................................96
II- Analyse de l’avidité des IgG chez les femmes enceintes ………………………...102
III- Caractérisation moléculaires du virus de la rubéole au Maroc et identification
du nouveau génotype en Afrique …………………………………………………….104
Conclusion générale…………………………...............................................................111
Références Bibliographiques
LISTE DES ABRÉVIATIONS
AA : Acide Aminé
ADN : Acide Désoxyribonucléique
Ala : Alanine
Arg : Arginine
ARN : Acide Ribonucléique
ARNm : Acide Ribonucléique Messager
Asp : Aspartate
BET : Bromure d’Ethidium
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CPA : Cellules Présentatrice d’Antigène
CTL : Lymphocyte T Cytotoxique
Cys : Cystéine
DEA : Diethylamine
DELM : Direction d’Epidémiologie et de Lutte contre les Maladies.
DMEM : Dulbecco’s’ Medium Essential Media
DO : Densité Optique
ECP : Effet Cytopathogène
EIA: Enzymatic Immuno Assay
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
GCG: Genetics Computer Group
Gln: Glutamine
Glu: Glutamate
Gly: Glycine
IF: Immunofluorescence.
IgG : Immunoglobuline G
IgM : Immunoglobuline M
IRC : Infection par la Rubéole Congénitale
Lys : Lysine
Leu : Leucine
NSP : Protéine Non Structurale
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
ORF : Open Reading Frame
PBS : Phosphate Buffer Saline
PCR : Polymérase Chaîne Réaction
PEV : Programme Elargi de Vaccination
PNI : Programme National d’Immunisation.
ROR : Rougeole Oreillon Rubéole
RPM : Rotation Par Minute
RR : Rougeole Rubéole
RT : Transcription Reverse
Ser : Serine
SLAM : Signaling Lymphocytes Activation Molecule
SRC : Syndrome de la Rubéole Congénitale
SVF : Sérum de Veau Fœtal.
VAERS: Vaccine Adverse Events Reporting System
VR: Virus de la Rubéole
Thr : Thréonine
Try : Tryptophane
INTRODUCTION
INTRODUCTION
La rubéole est une infection virale bénigne survenant généralement dans l’enfance.
Cependant, lorsque l’infection survient chez une femme enceinte, au cours des premiers
mois de la grossesse, le risque de malformations congénitales est important (Cutts et al.,
1997).
Plus de 29 000 cas sont déclarés par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) qui vise
une éradication en 2010 (OMS, 2007). Grâce à la politique de vaccination, la maladie
devient, de plus en plus rare, dans les pays occidentaux. Elle a, cependant, presque
disparu aux Etats-Unis, depuis 2002.
Au Maroc, l’épidémiologie de la rubéole reste, par ailleurs, mal connue, puisque la
maladie est à déclaration non obligatoire. Des études, très limitées et conduites à l’échelle
régionale (Rabat et Meknès), ont concerné la séroprévalence des anticorps IgG chez les
femmes enceintes et les femmes en âge de procréer.
Une susceptibilité de 14,8% à 33,5%, (Nejmi et al., 1972 ; Nejmi et al., 2000) a été
rapportée. Mais, en l’absence de données épidémiologiques de la maladie, il est difficile
de savoir si ceci reflète une augmentation de la réceptivité qui peut être liée aux
changements démographiques ou à une variation cyclique de l’incidence. L’incidence de
la rubéole varie en fonction de l’âge et de la zone géographique (Six et al., 2003).
Cependant, le programme de vaccination ne prend pas en considération les femmes en
âge de procréer. La diminution de l’incidence de la maladie et du nombre des cas de
SRC, au Maroc, ne serait possible que si la circulation du virus est interrompue par une
vaccination de masse des femmes en âge de procréer et des petites filles en âge de
scolarisation et par une vaccination systématique des enfants par le vaccin combiné RR
ou ROR. Les femmes enceintes, durant la campagne de vaccination de masse, ne
pourront être vaccinées, qu’après leur accouchement, avec ou sans sérologie préalable.
La décision de commencer la vaccination des femmes en âge de procréer peut être
précédée par des études sérologiques qui peuvent déterminer l'ampleur de la susceptibilité
de l’infection chez les femmes et permettre d’évaluer l’incidence des cas de SRC (Cutts
et al., 1997 ; Vynnycky et al., 1996).
En 1988, l’OMS avait lancé l’initiative de l’élimination de la rougeole et le contrôle de la
rubéole, d’ici 2010. Dans le but de réduire le nombre des cas de rougeole et d’adhérer à
l’initiative de l’élimination de la rougeole et du contrôle de la rubéole lancée alors par
l’OMS, le PNI (Programme National d’Immunisation) a introduit, en octobre 2003, une
deuxième dose du vaccin combiné (Rougeole Rubéole), chez les enfants en âge de
scolarisation. En procurant, certes, un faible coût et une simplification de la gestion du
programme, cette vaccination reste, cependant, d’efficacité incertaine, puisqu’elle
n’inclut pas les femmes en âge de procréer qui représente le groupe à risque pour
l’infection.
L’immunisation induite par une infection naturelle ou par une vaccination entraîne
l’apparition d’une immunité qui semble persister durant toute la vie (Plotkin et al., 1999).
Toutefois, cette immunité est relative et non absolue. Le risque de réinfection et de
virémie dépend du niveau d’anticorps sériques (Robinson et al., 1995).
Actuellement, il existe des moyens de diagnostic efficaces, le seul problème étant de les
utiliser correctement. En fait, beaucoup de notions fausses entraînent des conclusions
inexactes. En effet, un titre d’anticorps faible ne signifie pas systématiquement que le
sujet n’est pas protégé et un titre d’anticorps élevé n’est pas synonyme d’une primoinfection (Icenogle et al., 2003).
C’est ainsi, qu’il a été démontré que seul le test d’avidité peut aider à situer le moment de
l’infection et résoudre le problème d’interprétation, surtout chez la femme enceinte
(Grangeot, 2005). Généralement, une avidité faible correspondrait à une primo infection
récente et une avidité forte correspondrait soit à une réinfection soit à une infection
ancienne (Picone et al., 2005).
La mesure de l’avidité des IgG de la rubéole est plus sensible que le test IgM, pour la
détection différentielle entre une infection primaire et une réinfection. Par conséquent, il
est plus approprié que l'analyse d'avidité des IgG du virus de la rubéole soit employée
comme une analyse complémentaire dans le cas de diagnostic d’une rubéole chez une
femme enceinte en présence de signes cliniques (Rasool et al., 2005). L'utilisation des
deux analyses est reconnue comme avantageuse, et, serait, alors, préconisée, dans le cas
où le sérum est positif en IgM (Hofmann et al., 2005).
L’épidémiologie moléculaire est un outil important dans l’analyse comparative des
séquences nucléotidiques de la maladie. Elle est appliquée à l’étude de la dissémination
de la maladie dans une population donnée.
L’épidémiologie moléculaire contribue aussi à évaluer les campagnes de vaccination de
masse, en comparant les séquences nucléotidiques des génotypes ayant circulé avant et
après la vaccination. La surveillance de la maladie permettra alors de classer les souches
en tant que souches endémiques ou importées.
Les études génétiques du virus de la rubéole sont réalisées, pour la plupart, par le
séquençage de la totalité ou de certaines portions de la région codant la protéine
d’enveloppe E1. L’épidémiologie moléculaire mondiale de la rubéole confirme que les
virus du génotype I (clade 1) ont une grande homogénéité, avec une possibilité
d’évolution, alors que les virus du génotype II (clade 2), ayant une très grande variation
génétique, circulent largement dans le continent asiatique (Zheng et al., 2003 b).
Grouper les virus des génotypes du virus de la rubéole s’avère être très délicat, en raison
du pourcentage élevé en GC qui rend alors l’analyse difficile.
En effet, la région nucléotidique, précédemment utilisée (601 nts), n’était pas suffisante
pour différencier entre les deux génotypes. Cependant, la région combinée 739 nts (601
et 512) a donné des groupements appropriés pour le nouveau génotype (Caidi et al., in
press).
Il serait alors évident, pour un diagnostic moléculaire de routine, soit, de se limiter, au
séquençage de la région 739 nts du gène E1 et de confirmer l’usage du nouveau génotype
par le séquençage de la région codant pour les protéines de structure C-E2-E1 soit, au
séquençage d’autres régions dans le génome. Ce qui conduit, à penser à séquencer tout le
génome du virus, lorsque les résultats du séquençage des différentes régions du génome
donnent des résultats discordants.
Ainsi, lors de l’identification des nouveaux génotypes du virus de la rubéole, au lieu
d’essayer, à chaque fois qu’un nouveau génotype apparaît, de choisir un fragment d’un
gène ou d’un autre, il serait donc préférable de séquencer tout le génome.
OBJECTIFS
Pour documenter la rubéole au Maroc, une étude de la séroprévalence des anticorps IgG
anti-rubéole chez les femmes en âge de procréer, est réalisée. Le but du travail consiste, à
déterminer le statut immunitaire chez les femmes en âge de procréer, d’estimer le nombre
de cas de Syndrome de la Rubéole Congénitale (SRC), en appliquant des modèles
mathématiques et de proposer une stratégie de vaccination dans le pays.
L’importance de la rubéole, du point de vue santé publique, tient à ses effets tératogènes
chez la femme enceinte. Beaucoup de notions fausses entraînent des conclusions
inexactes.
L'un des principaux objectifs est de soulever l’importance du test d’avidité afin de mieux
résoudre le problème d’interprétation, chez la femme enceinte, puisque, la détection des
IgM, seule, ne peut différencier entre une infection primaire et une réinfection. Par
conséquent, il est plus approprié que l'analyse d'avidité des IgG du virus de la rubéole soit
employée comme une analyse complémentaire dans le cas de diagnostic d’une rubéole
chez une femme enceinte en présence de signes cliniques.
L'utilisation des deux analyses (IgM et avidité) est reconnue comme avantageuse, et,
serait, alors, préconisée, dans le cas où le sérum est positif en IgM.
L’épidémiologie moléculaire, outil important dans l’analyse comparative des séquences
nucléotidiques du virus et appliquée à l’étude de la dissémination de la maladie, contribue
à évaluer les campagnes de vaccination de masse, en comparant les séquences
nucléotidiques des génotypes ayant circulé avant et après la vaccination. La surveillance
de la maladie permettra alors de classer les souches en tant que souches endémiques ou
importées.
Le but du travail, consiste à la première caractérisation moléculaire des souches de la
rubéole endémiques qui circulent au Maroc, en Ouganda, en Côte d’Ivoire et en Afrique
du Sud. Ce travail permet de combler les lacunes de l’épidémiologie moléculaire du
virus de la rubéole dans le continent Africain.
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1
GÉNÉRALITÉS
I- VIRUS DE LA RUBÉOLE
La rubéole est une maladie virale aiguë éruptive de l’enfant et du jeune adulte, c’est la
rubéole acquise. Elle est souvent asymptomatique et peut passer inaperçue.
La gravité de la rubéole repose sur la transmission du virus au fœtus, lorsque l’infection
survient, en début de grossesse. Elle est, alors, à l’origine de la rubéole et du syndrome de
la rubéole congénitale (SRC) (Didier Ingrand, 2003). L’homme est le seul réservoir
connu du virus. Le virus de la rubéole est transmis par voie respiratoire et sa réplication
se fait dans la muqueuse du nasopharynx et dans les ganglions lymphatiques locaux. La
période d’incubation dure entre 14 à 23 jours et, le virus est présent, dans la gorge, une
semaine avant et jusqu'à deux semaines après le début de l'éruption (Benenson, 1990 ;
Gerson, 1995).
I-1 STRUCTURE DU VIRUS
Le virus rubéoleux appartient à la famille des Togaviridae et au genre Rubivirus dont il
n’existe qu’un sérotype. Comme tous les Togaviridae, le virus de la rubéole est un virus à
enveloppe, dont le diamètre total est de 60 à 70 nm. Il est constitué d’un noyau central ou
core entouré d’une enveloppe porteuse de spicules d’hémagglutinine de 5 nm de long. La
capside, ayant un diamètre de 40 nm et étant de forme icosaédrique (Figure 1), renferme
un ARN génomique linéaire de polarité positive. La structure du virion de la rubéole n'a
pas été déterminée, car la structure cristallographique du virus, en dépit de ce qui a été
fait pour d’autres virus comme le cas des Alphavirus, n’a pas été déterminée (Zheng et
al., 2003b).
2
Figure 1a : Structure du virus de la rubéole (microscopie électronique Gx100000)
Capsid protein
RNA
Figure 1b : Structure du virus de la rubéole (schématique).
I-2 GÉNOME
Le génome des Togaviridae est linéaire, simple brin, de polarité positive et de taille
comprise entre 10 à 12 kilobases (9672 nts). Il contient deux cadres ouverts de lecture
(Open Reading Frame, ORFs). L’extrémité 5’ est méthylée et l’extrémité 3’ est
polyadénylée. La région proximale 5’ (42-6388) code pour la polyprotéine p200,
3
précurseur de la protéine non structurale NSPs-ORF p150 et p90 (Figure 2) (Cooray et
al., 2006).
Figure 2 : Organisation du génome du virus de la rubéole
La région proximale 3’ (6509-9700 nts) code pour les protéines structurales SP-ORFs, la
protéine de capside C et les deux glycoprotéines E1 (57Kb) et E2 (42-47 Kb). Les
Togaviridae utilisent une stratégie subgénomique, pour synthétiser les protéines virales.
L’ARN subgénomique code pour la protéine de capside C et les protéines El et E2. Après
glycosylation (gE1 et gE2), les protéines E1 et E2 hérisseront de spicules l'enveloppe
lipidique émanant des membranes cellulaires (Ramanuja et al., 2001).
L'utilisation des anticorps monoclonaux a révélé des épitopes de neutralisation localisés
dans les protéines El et E2, alors que l’activité hémagglutinante est portée par la seule
glycoprotéine E1. Toutefois, le virus de la rubéole n'exprime qu'un seul sérotype et deux
génotypes (ou clades), ce qui explique sa faible variabilité génomique. Cependant, l’une
des caractéristiques significatives du génome du virus de la rubéole est son contenu élevé
en GC (70%), comparativement à d’autres virus à ARN (Didier lngrand, 2003).
I-3 REPLICATION DU GÉNOME
Au sein de la cellule, le virus synthétise ses protéines virales et amplifie son génome.
L'acide nucléique viral comprend l'information nécessaire à la synthèse des composants
structuraux et non structuraux. Cette synthèse est entièrement réalisée par la machinerie
4
habituelle de la cellule. Le virus de la rubéole requiert, pour sa réplication, une ARN
polymérase ARN dépendante. L'ARN des virus est transcrit directement par les
ribosomes cellulaires, pour donner des protéines dont l'ARN polymérase ARN
dépendante et des protéines de structure (Huraux et al., 2003).
Le cycle de multiplication du virus se décompose en quatre étapes (Figure 3) qui sont
l’attachement du virus à la membrane cellulaire, la pénétration du virion à l’intérieur de
la cellule, la réplication du virion et, enfin, la libération des virions.
Figure 3 : Cycle de réplication du virus de la rubéole (Bienvenu et Delecroix, 2004)
Pour les virus enveloppés, l’entrée dans la cellule nécessite une étape d’attachement
suivie d’une étape de fusion avec la membrane cellulaire permettant de libérer le génome
infectieux dans le cytoplasme (Anne-Lise et Delecroix 2004). La pénétration du virus se
5
fait par fusion/lyse. Ainsi, le virus fusionne sa membrane avec la membrane de la cellule
hôte et expulse à l'intérieur du cytoplasme cellulaire sa capside (décapsidation partielle).
La traduction de l’ARN (+) contenu dans le virus va permettre une réplication
particulière, la traduction des protéines non structurales (polymérases) et la formation du
brin ARN (–) qui servira comme matrice à l’ARN subgénomique et à la transcription en
ARN (+) (Anne-Lise and Delecroix, 2004 ; Lokman et al., 2006). La libération du virus
se fait par bourgeonnement cytoplasmique, la membrane cellulaire se remaniant, les
protéines virales s'y insèrent.
I-4 PROTÉINES DU VIRUS
I-4-1 PROTÉINE C
L’analyse de la séquence peptidique de la région N terminale de la protéine C montre
qu’elle est hydrophile, riche en résidus proline et arginine et qu’elle interagit avec l’ARN
(Frey, 1994). La protéine C joue un rôle important dans la réplication du virus, sa
phosphorylation modifiant la multiplication du virus (Lokman et al., 2006).
La région principale dans la protéine C est située dans les résidus amino acides 28 à 56
qui contient le résidu Ser 46 qui semble jouer un rôle dans la régulation de la
phosphorylation de la protéine de capside. L’importance de la phosphorylation de la
capside, dans la réplication du virus, a été démontrée en utilisant des mutants à capside
déphosphorylée. L’effet cytopathique, suite à la déphosphorylation, est moindre (Law et
al., 2003).
La protéine C contient aussi deux résidus de Cystéine (Cys-152 et Cys-197) responsables
de la dimérisation de la protéine. Cependant, la mutation de Cys-152 en Ser-152 empêche
la dimérisation de la protéine, sans pour autant altérer les autres fonctions de la protéine
(Jia-Yee et al., 1996).
6
I-4-2 PROTÉINES D’ENVELOPPE
La glycoprotéine E1 du VR porte les déterminants impliqués dans la fonction de
l’hémagglutination (Waxham et Wolinsky, 1985). L’hémagglutinine est présente sur
l’enveloppe virale sous forme de spicules. C’est par son intermédiaire que se fait la
réaction entre le virus et les récepteurs cellulaires, ce qui permet la fixation et la
pénétration du virus. Les anticorps anti-hémagglutinines ont une action neutralisante et
protectrice et peuvent être mis en évidence par une réaction d’inhibition de
l’hémagglutination. Les deux glycoprotéines E1 et E2 forment un hétéro dimère où la
protéine E1 est la plus exposée et la plus immuno-dominante en tant que réponse
humorale induite par le virus (Frey et al., 1998).
Par l’utilisation d’anticorps monoclonaux, l’implication de différents sites de la séquence
E1 a été mise en évidence, dans la fusion membranaire (Ala-81, Tyr-109) et dans la
neutralisation du virus (Asp-209, Pro-239), le domaine antigénique étant situé dans la
séquence peptidique Met-177, Pro-207 (Figure 3).
Figure 3 : Séquence peptidique de la glycoprotéine E1, montrant les différents domaines.
7
Le rôle de la glycoprotéine E2 reste encore mal connu. Cependant, la réponse
immunitaire humorale est connue pour être induite par la protéine E2 (Shigetaka et al.,
1997). Par ailleurs, bien que le rôle biologique de la glycoprotéine E2 ne soit pas bien
défini, des épitopes spécifiques et, probablement, au moins un domaine neutralisant, lui
ont été attribués (Cordoba et al., 2000 a ; Law et al., 2001). Cependant, le hétérodimère
E2 /E1 semble jouer un rôle dans la réplication virale. De ce fait, la mutation de la Cys
470 et de la Leu471, dans le domaine transmembranaire de la protéine E1, en altérant la
formation du complexe E2 /E, altère, par conséquent, la réplication du virus (Jiansheng
and Shirley, 1999)
II- MALADIE
II-1 HISTORIQUE
C’est à la suite d’une épidémie de rubéole qui a touché, en 1940, plusieurs milliers de
personnes en Australie, qu’un ophtalmologiste Norman Gregg, en 1941, fut attiré par
l’apparition inhabituelle d’un grand nombre de cataractes congénitales. En contactant
d’autres ophtalmologistes australiens, 78 cas, auparavant très rares, ont alors été recensés.
L’examen desdits cataractes montre alors que toutes les couches du cristallin étaient
atteintes, à l’exception de la couche la plus externe, signifiant une atteinte précoce, lors
du développement. L’interrogatoire, effectué auprès des mères des enfants atteints, a
permis de faire le lien entre les cataractes et l’épidémie de la rubéole survenue quelques
mois plus tôt.
Ce n’est, qu’en 1962, que le test de neutralisation a été développé et que le virus de la
rubéole a été isolé sur cultures cellulaires (Robert-Gnasia, 2004). En 1964, une grande
épidémie, survenue aux États-Unis, a causé plus de 12.5 millions de rubéole post natale,
entraînant des malformations chez 20 000 enfants et 11 000 cas de morts fœtales.
L’hémagglutinine (E1) ne fut identifiée qu’en 1965. À partir de 1969, la première souche
vaccinale (souche HPV77) a donc été développée aux États-Unis.
8
II-2 MANIFESTATIONS CLINIQUES
La primo-infection rubéoleuse débute, après une période d'incubation silencieuse de 16 à
18 jours, par une éruption maculopapuleuse.
D'emblée généralisée et d'évolution fugace (2 à 3 jours), non prurigineuse et constituée de
petits éléments roses pâles, elle s'accompagne, généralement, d'une fièvre modérée (+38+38,5°C) et de multiples adénopathies mobiles, non douloureuses, en particulier,
cervicales postérieures (Guérin, 2000 ; Ingrand, 2003).
Ces manifestations, spontanément résolutives, en quelques jours, entraînent une immunité
durable qui n'empêche pas, cependant, la survenue de réinfections exogènes
asymptomatiques. L’éruption commence, d’abord, au niveau du visage, pour s’étendre,
rapidement, au reste du corps. Elle est morbiliforme (petites lésions maculopapuleuses,
d’un rose plus clair que dans le cas de la rougeole), le premier jour, pour devenir
scarlatiniforme, le deuxième jour, essentiellement au niveau du visage. La coalescence
des lésions entraîne la formation d’un érythème diffus (Ray, 1993).
Cette description, commune, ne doit pas faire oublier que 50 % des primo-infections
rubéoleuses n'ont pas d'expression clinique, et que, l'éruption, lorsqu'elle est présente,
peut revêtir de très nombreux aspects non spécifiques (polymorphe, purpurique,
scarlatiniforme, morbiliforme) (Merrer et al., 1999). De ce fait, seul le diagnostic
virologique et, en particulier, sa composante sérologique, apportera les preuves de
l'infection rubéoleuse.
À l'exception de la rubéole congénitale, les complications de la rubéole sont limitées et,
lorsqu’elles existent, elles se retrouvent, plus fréquemment, présentes chez l'adulte que
chez l'enfant (Ingrand, 2003).
L’arthrite, complication fréquente de la maladie et, plus particulièrement, chez les
femmes, guérit, habituellement, sans séquelles. D’autres complications plus graves telles
que l’hémorragie secondaire à une thrombocytopénie ou une vasculite (1 cas sur 3000) ou
encore une encéphalite (1 cas sur 5000) sont très rares (Gershon, 1995).
9
Cependant, la maladie reste sans gravité particulière, chez les personnes ayant une
déficience congénitale ou acquise. L’infection entraînerait l’apparition d’une immunité de
type cellulaire et l’apparition de plusieurs types d’anticorps sériques tels que les IgG et
les IgM (Chernesky et al., 1995).
II-3 ÉPIDÉMIOLOGIE DE LA MALADIE
La rubéole est une maladie infectieuse, certes, bénigne chez l’enfant mais, gravissime
chez la femme enceinte, en raison du risque élevé d’embryofoetopathie.
La progression de la maladie, dans une population non vaccinée, entraîne une
augmentation de l’incidence et une diminution du nombre de sujets susceptibles.
L’incidence varie en fonction de l’âge et de la zone géographique (Six et al., 2003). Dans
les pays tropicaux, l’infection survient à un âge plus précoce, avec des variations
régionales importantes. Dans les pays en développement, 45 % des femmes en âge de
procréer sont réceptives au virus. En France, 5% (30 000 à 50 000) des femmes n’ont pas
d’anticorps et sont susceptibles de développer une primo-infection. En l’absence d’un
programme de vaccination, la rubéole se présente comme une infection fréquente
touchant les enfants de 3 à 15 ans (50 % des infections rubéoliques ont lieu avant 10 ans
et 80 % avant l’âge de 15 ans) (Bolognese, 1993).
La rubéole sévit de façon endémique avec une recrudescence saisonnière (fin hiver-début
printemps) et des épidémies apparaissent tous les 6 à 9 ans. Actuellement, du fait d’une
vaccination massive des enfants, la rubéole évolue par poussées épidémiques hivernoprintanières, en touchant surtout les adolescents et les adultes jeunes ; les enfants non
vaccinés, constituent alors ainsi un risque pour les femmes enceintes.
La morbidité de la rubéole est difficile à estimer car, d’une part, la maladie est souvent
inapparente et ne donne pas forcément lieu à une consultation médicale et, d’autre part, la
difficulté du diagnostic clinique n’évalue pas à juste titre le nombre de cas survenus. En
France, dans les années 1980-1990, le nombre annuel de cas cliniques s’élevait entre 300
et 500 000 (Bouvet, 1986). Au Canada, des taux d’incidence de 2 cas pour 100 000
habitants, au cours des 12 dernières années, de 30 cas pour les 2 dernières années et de,
seulement un à deux cas de SRC par année, entre 1996 à 2000, ont été rapportés.
10
L’importation des cas de rubéole et l’immigration d’individus ayant une réceptivité à la
rubéole et provenant de régions qui n’ont pas de programme de vaccination sont des
problèmes importants pour les pays dotés du programme d’immunisation contre la
rubéole (Charbonneau and De Wals, 1997).
Au Maroc, l’épidémiologie de la rubéole reste mal connue, puisque la maladie est à
déclaration non obligatoire. Cependant, des études très restreintes, à l’échelle régionale
(Rabat et Meknès), concernant la séroprévalence des anticorps IgG chez les femmes
enceintes et les femmes en âge de procréer, ont montré une susceptibilité variant de
14,8% à 33,5%, (Nejmi et al., 1972 ; Nejmi et al., 2000). En l’absence de données
épidémiologiques de la maladie, il est difficile de savoir si ceci reflète une augmentation
ancienne de la réceptivité qui peut être liée aux changements démographiques, ou à une
variation cyclique de l’incidence.
II-4 TRANSMISSION
Le virus se propage, par l’intermédiaire de contacts interhumains directs et uniquement
par voir respiratoire. Après pénétration et lors d’une virémie transitoire, le virus diffuse
vers les ganglions lymphatiques régionaux où s’effectue la multiplication virale. Sept à
neuf jours après l’infection, les virus, présents dans la circulation sanguine, sont
acheminés vers les différents tissus. La virémie maximale est atteinte entre le 10ème et le
17ème jour, pour se terminer au moment de l'éruption maculopapuleuse qui, survient, en
général, entre le 16 ème et le 18 ème jour, après l’infection. Pendant ce temps, le virus est
excrété, massivement dans les secrétions nasopharyngées où il est présent, pendant les
deux semaines qui cernent l'éruption. De ce fait, la personne infectée est contagieuse 7
jours avant à 7 jours après l’éruption.
L'homme, étant le seul réservoir connu, la
transmission interhumaine se fait alors directement par inhalation de particules
infectantes (Ingrand, 2003).
Dans le cas de l’infection de la femme enceinte, au cours de la virémie, le virus infecte le
placenta et peut se transmettre au fœtus. Bien que la majorité des transmissions est
observée au cours d'une primo-infection rubéoleuse chez la femme enceinte, de très rares
11
cas de transmission de la mère à l’enfant ont été décrites, suite à des réinfections
maternelles (Robinson et al., 1994 ; Ingrand, 2003).
II-5 IMMUNITÉ
Une infection par le virus de la rubéole ou par le virus atténué vaccinal entraîne
l’apparition d’une immunité qui persisterait durant toute la vie (Plotkin et al., 1999).
Toutefois, cette immunité est relative et non absolue. En cas d’exposition, une personne
immunisée peut se réinfecter, ce qui se traduit par une multiplication du virus au niveau
des voies respiratoires supérieures et, plus rarement, par une virémie. La plupart des
réinfections sont asymptomatiques. Le risque d’une réinfection et d’une virémie dépend
du niveau d’anticorps sériques (Robinson et al., 1995).
Figure 4 : Diagramme de l’évolution du taux sérique des anticorps IgG et IgM en cas d’infection
ou de réinfection (Didier, 2003).
12
Le risque de la réinfection est d’autant plus faible que le niveau d’anticorps est élevé. Ce
risque est plus faible chez les personnes immunisées par le virus sauvage que par une
souche atténuée d’un vaccin. Le niveau des anticorps sériques diminue avec le temps et
peut atteindre des concentrations plus faibles que la limite de sensibilité des tests de
dépistage de l’immunité (Figure 4). La qualité de la réponse immunitaire et la persistance
des anticorps varient en fonction de la souche vaccinale. Ainsi, dix années après la
vaccination, une séronégativité est apparue chez 7% des individus ayant été vacciné avec
la souche HPV-77, chez 3% à qui il a été administré la souche Cendehill et chez 1%
ayant reçu la souche RA27/3 (Plotkin et al., 1999).
Le risque d’infection fœtale et du SRC est excessivement faible, lorsqu’une mère
immunisée est exposée durant le premier trimestre de la grossesse. Il semble, toutefois,
que le risque est élevé lorsque l’immunité est induite par une vaccination, vaccination
d’autant plus effectuée à un jeune âge avec un vaccin immunogène et lorsque le niveau
d’anticorps est bas. Il reste, cependant, impossible d’établir de façon précise le risque
d’une réinfection, en fonction du taux d’anticorps sériques (Robinson et al., 1995 ;
Plotkin et al., 1999).
II-5-1 IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE
La réponse cellulaire apparaît indispensable à l’élimination de l’infection. Elle fait
intervenir des lymphocytes T cytotoxiques et des lymphocytes T auxiliaires CD4+ (Th).
La souche vaccinale RA27/3 déclenche des réactions immunitaires humorales et
cellulaires identiques à celles observées après une infection naturelle. La production des
IgM, des IgG, et des IgA est alors activée. Cependant, la quantité des anticorps, suite à
ces réponses, est légèrement inférieure à celle émise lors d’une infection naturelle. Après
la vaccination, les anticorps IgM apparaissent dans le sang et persistent, pendant deux
mois, avant que les IgG n’apparaissent (Plotkin et al., 1998).
Bien que la prolifération des lymphoblastes, des cellules T cytotoxique et de la sécrétion
de cytokine est évidente, elle reste, cependant, de courte durée et peu concluante. Les
peptides comportant la protéine de la capside C du VR et, plus particulièrement, la
13
séquence immuno dominante allant de l’acide aminé en position C255 jusqu'à l’acide
aminé en position C280, sont présentes, à la surface des cellules représentant l’antigène
(CPAg), avec les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH classe II)
(Fields, 1996). Quant à la protéine E2, elle peut également contenir des épitopes
susceptibles d’être efficacement présentés par les molécules du CMH. De plus, un
peptide de 82 acides aminés de la protéine E1 semble être l'inducteur le plus actif de la
réponse proliférative des cellules lymphocytes CD4+ (Mitchell, 1999). Comme dans
toutes les infections virales, les CD8+ interviennent majoritairement pour l’élimination
des cellules infectées, du fait de la présence de la molécule CMH II sur toutes les cellules
de l’organisme. En effet, les CD8+ sont détectées dans le sang, au moment de l’éruption.
Cette réaction immunitaire s'est avéré être HLA/A2 liée (Toyoda, 1999).
La souche vaccinale atténuée RA27/3 conserve plusieurs épitopes immuno dominants sur
chacune des trois protéines structurales virales, spécifiquement. Les résidus 275-285 et
402-422 sont préservés sur la glycoprotéine de l'enveloppe E1, les résidus 54-72 sur la
glycoprotéine de l'enveloppe E2 et les résidus 14-29 sur la protéine de la capside
(Toyoda, 1999).
II-5-2 IMMUNITÉ HUMORALE
Les lymphocytes B, activés par les lymphocytes T auxiliaires (Th) spécifiques des
protéines virales, prolifèrent et secrètent des anticorps qui neutralisent les particules
virales ou participent, par des mécanismes de cytotoxicité dépendant des anticorps, à la
lyse des cellules infectées. Les anticorps sont détectés juste après le début de l’éruption
cutanée (Fields, 1996).
Le pic des IgM est atteint entre le 10 ème et le 17ème jour puis, le déclin est observé, au
moment de l’éruption maculopapuleuse. Les anticorps du sérum s’attachent rapidement à
l’hémagglutinine, protéine de surface. Cette réaction sert en tant que principe de base
pour le test de l’inhibition d’hémagglutination (IHA), réaction à la fois aisée et sensible,
représentant l’essai sérologique le plus utilisé pour le diagnostic de la rubéole (Gold,
1996).
14
La molécule E1, joue un rôle déterminant dans le processus de l’immunité humorale, par
l’intermédiaire de plusieurs sites impliqués dans l'attachement du virus à la membrane de
la cellule hôte (Fields, 1996). La molécule E2, quant à elle, bien que, encore mal étudiée,
a pu être liée à l’infection du VR, puisque une fraction de la glycoprotéine E2 a été isolée
(Schwarzer, 1997). Des épitopes E2, cachés sous la protéine E1, dans le complexe dimère
E1-E2, et non facilement accessibles par le système immunitaire, ont été mis en évidence
(Soldani et al., 1990 ; Shigetaka et al., 1997).
La plupart des infections par le virus de la rubéole induisent une immunité à long terme.
Cependant, peu d'informations sont disponibles, en ce qui concerne la quantité d'anticorps
produite in vivo, en réponse à chacune des protéines structurales du virus, après infection
ou après vaccination. Ainsi, les deux glycoprotéines E1 et E2 induisent une immunité à
vie. La glycoprotéine E1 reste la principale région extérieure contenant des épitopes
identifiés dans la neutralisation et l’hémagglutination des anticorps d’inhibition,
propriétés faisant de cette protéine un candidat majeur dans les vaccins synthétiques
(Bosma et al., 1996 ; Cordoba et al., 2000 b).
II-6 VACCINATION
L’objectif principal de la vaccination est de prévenir l’infection rubéoleuse pendant la
grossesse. Les souches vaccinales RA 27/3, HPV/77 et Cendehill ont été développées,
après l’isolement du virus rubéoleux sur cultures cellulaires, vers la fin des années 1960.
Seul le vaccin utilisant la souche atténuée RA27/3 est sélectionné, en raison de son
immunogénicité. Il est administré soit, sous forme vaccin trivalent (ROR) puisque
combiné avec le vaccin de la rougeole et celui des oreillons (ROR VAX ®), soit, sous
forme vaccin monovalent (RUDI VAX ®). L'immunogénicité des deux vaccins est
identique, six semaines, après la vaccination.
Le vaccin trivalent ROR contient la souche Edmonston 749D, pour le virus de la
rougeole, la souche Wistar RA27/3M, pour le virus de la rubéole et la souche Jeryll
Lynn, pour le virus des oreillons. Les taux de séroconversion et les taux d’anticorps,
après administration vaccinale, sont comparables à ceux observés pour le ROR VAX®.
Actuellement, en dehors du Japon, la souche RA27/3 est la seule utilisée pour la
15
préparation des vaccins rubéoleux qu’il soit sous forme monovalente ou combinée (Best,
1991).
II-6-1 SÉROCONVERSION SELON LES VACCINS
Lors d’une infection naturelle, le taux des anticorps contre la rubéole, est de quatre à huit
fois plus élevé, lorsqu’ils résultent d’une vaccination (Bakshi et Cooper, 1990).
De toutes les souches vaccinales, la souche RA 27/3M est la plus immunogène. Les essais
cliniques montrent une séroconversion dans 95% à 100 % des cas et de 56 % et 96 % des
cas, après une vaccination, respectivement avec la souche RA 27/3M et la souche
Cendehill. Suite à une vaccination avec la souche atténuée HPV-77, le taux de
séroconversion est de 90 % chez les adultes et de 97 % chez les enfants (Best, 1991).
II-6-2 PERSISTANCE DES ANTICORPS
L’administration du vaccin contenant la souche RA 27/3M montre une sérologie négative
dans 1% des cas, après une période s’échelonnant entre 10 à 21 ans et dans 4% des cas
après 14 ans alors qu’un taux d’anticorps faible a été décelé dans 5% des cas, après 10 à
21 ans (Best, 1991) et six à 16 ans (Vaccine Safety, 1994).
Cependant, une sérologie négative a été révélée, chez les personnes immunisées, 10 à 21
ans après l’administration, dans 7% des cas, lorsque le vaccin comportait la souche
HPV-77 et dans 3% des cas, lors d’une vaccination avec la souche Cendehill (Best,
1991).
II-6-3 PROTECTION CONFERÉE PAR UN FAIBLE TAUX D'ANTICORPS
La protection contre la rubéole, conférée par un taux d'anticorps faible, n'est, cependant,
pas bien connue (Vaccine Safety, 1991). La réinfection est peu fréquente, lors d’une
immunité acquise par la maladie ou lorsque les titres d'anticorps sont supérieurs à 15
UI.mL-1, après la vaccination. Par ailleurs, la réinfection est plus fréquente chez les
individus vaccinés et ayant des d’anticorps titres faibles inférieurs à 15 UI.mL-1 (O’Shea
et al., 1983). Les taux d'anticorps, évalués par les tests actuellement disponibles, sont des
preuves d'immunité (CDC, 1990). En Grande-Bretagne, la revaccination des femmes
16
ayant un taux d'anticorps inférieur à 15 UI.mL-1, en hémolyse radiale, est une pratique
courante (Best, 1991).
II-6-4 RÉINFECTION SELON LES VACCINS
Les premières études sur les vaccins ont montré l’évidence que la réinfection se
produisait chez 50 % des personnes vaccinées avec la souche HPV-77 et la souche
Cendehill, chez 67 % des personnes vaccinées avec la souche atténuée Cendehill, chez
47% des individus vaccinés avec la souche HPV-77, chez 7% des vaccinées avec la
souche RA 27/3 (Fogel, 1978) et chez 10% (5/102) de jeunes filles, durant la quatrième
année, après l’administration du vaccin comportant la souche RA 27/3 (Cusi, 1993).
Le phénomène de la réinfection et ses conséquences sérologiques ont été évalués, de
façon extensive, au cours des épidémies et/ou au moment des épreuves cliniques, sur des
volontaires déjà immunisés, avec de fortes doses de virus atténués administrés par voie
nasale ou en sous-cutanée. En effet, lors d’une réinfection, tandis que les IgG augmentent
de façon importante, les IgM augmentent peu ou pas du tout, alors que lors d’une primoinfection, les IgM présentent une augmentation considérable (Miller et al., 1990).
La réinfection par le virus de la rubéole est possible et, se produit, le plus souvent chez
les personnes qui acquièrent leur immunité après la vaccination plutôt que chez les
individus qui font la maladie naturellement. L'investigation des individus exposés à des
cas de rubéole, durant les épidémies, montrent une réinfection chez 50 % des personnes
vaccinées et, seulement, chez 5 % de celles qui ont fait l'infection naturellement (Miller,
1990).
La réinfection est habituellement asymptomatique (Bakshi et al., 1990) et s'accompagne
rarement d'une virémie (Morgan-Capner, 1989).
II-6-5 VACCINATION RUBÉOLIQUE AU MAROC
Les efforts du programme de vaccination, contre la rubéole, au Maroc, sont,
actuellement, concentrés, sur la mise en application du plan national, pour l’élimination
de la rougeole, le contrôle de la rubéole et de la rubéole congénitale. Le calendrier
vaccinal contre la rubéole, au Maroc, est différent, selon qu’il s’agisse du secteur public
17
ou du secteur privé, en ce sens que, le vaccin ROR est disponible dans le secteur privé,
depuis 1989.
En 1987, le ministère de la santé a procédé à une restructuration du Programme Elargi de
Vaccination (PEV) et le renomma Programme National d’Immunisation (PNI).
Les
objectifs du PNI furent alors d’atteindre une couverture vaccinale uniforme supérieure ou
égale à 95%, selon le lieu de résidence (urbain ou rural) et selon la localisation (national,
région, province/préfecture, circonscription sanitaire, secteur et localité) de toutes les
maladies cibles de la vaccination, puis, d’obtenir avec les autres pays de la région, la
certification de l’éradication de la poliomyélite, en 2008 et de l’éliminer de la rougeole et
du contrôler la rubéole, en 2010.
Dans le but de réduire le nombre des cas de rougeole et d’adhérer à l’initiative de
l’élimination de la rougeole et du contrôle de la rubéole lancée par l’OMS, le PNI a
introduit, dès octobre 2003, une deuxième dose du vaccin combiné (Rougeole - Rubéole),
chez les enfants à l’âge de 6 ans (âge de la rentrée scolaire) (Tableau 1). Ainsi, une
couverture vaccinale, supérieure à 90%, a été réalisée, aussi bien pour la première dose
que pour la deuxième dose vaccinale (PNI, 2005).
âge de l’enfant
à la naissance
6 semaines
10 semaines
14 semaines
9 mois
18 mois
6 ans (rentrée scolaire)
Vaccins
BCG + VPO (zéro) + HB1
DTC1 + VPO1 + HB2
DTC 2 + VPO2
DTC 3 + VPO3
VAR + HB3
DTC + VPO (premier rappel)
RR (vaccin contre la rougeole et la
rubéole)
Tableau 1 : Calendrier national de vaccination dans le secteur public au Maroc (BCG :
Bacille Calmette Guérin, DTC : Diphtérie Tétanos Coqueluche, VPO : Vaccin Polio Oral,
HB: Hépatite B, RR : Rougeole Rubéole, VAR : Vaccin Anti Rougeole)
18
II-6-6 EFFETS DE LA REVACCINATION
La revaccination des sujets qui n'ont pas développé d’anticorps, après une première
vaccination (échec primaire), a permis d'induire une séroconversion dans 70% à 80% des
cas (MMWR, 1985). En effet, la revaccination, chez les enfants, provoque une élévation
significative du titre des anticorps, tandis que, chez les adultes séronégatifs ayant été déjà
vaccinés, durant l'enfance, la revaccination provoque une séroconversion, dans
pratiquement, tous les cas (Cote et al., 1993). Aucun effet indésirable n’a, par ailleurs, été
mentionné, après une revaccination.
II-6-7 PHARMACOVIGILANCE DES VACCINS DE LA RUBÉOLE
Aux États-Unis, une surveillance a été établie, en 1978, sous l'égide du CDC (Centers for
Diseases Control), appelée système de contrôle des réactions secondaires aux
vaccinations (Monitoring system of adverse events following immunization, MSAEFI).
En 1986, un programme national d'indemnisation des accidents vaccinaux a contribué à
améliorer les connaissances sur les accidents post-vaccinaux (Evans, 1995 ; Glezen,
1996). En 1990, un nouveau système de déclaration des réactions vaccinales (VAERS)
(Vaccine adverse events reporting system), permettant à toute personne de faire une
déclaration d'effets secondaires, a été instauré. Ainsi, il a été mis, à la disposition des
médecins, des formulaires de déclaration contenant une liste des événements qui
devraient être systématiquement rapportés. Malgré cet ensemble de mesures, le système
VAERS n'était guère plus performant (Rosenthal et Chen, 1995).
En dehors des effets indésirables habituels (fièvre, éruption cutanée, œdème au point
d'injection), des effets spécifiques ont été décrits, sans, toutefois, remettre en cause les
stratégies vaccinales. Des effets secondaires, comme des réactions imputables à certains
vaccins, peuvent, lorsqu’ils sont graves, entraîner une contre-indication, s'ils surviennent
sur des sujets à risque bien identifiés. De telles réactions ont été à l'origine du retrait du
vaccin incriminé ou d'une modification de la stratégie vaccinale, entraînant, même une
modification du calendrier vaccinal, sans que leur imputabilité au vaccin ait été
démontrée.
19
Par ailleurs, une association, entre la vaccination antirubéolique et l'apparition des
symptômes articulaires, chez l'enfant et chez l'adulte, a été mise en évidence. Ainsi, des
cas d'arthrite chronique, associés à la vaccination contre la rubéole et soumis au
Programme Américain d'Indemnisation des Accidents Vaccinaux, ont été rapportés
(Weibel et Benor, 1996).
Une relation cause à effet a alors été retenue entre certains cas, avec un délai d'apparition
compris entre une à six semaines, après la vaccination. Dans une étude prospective
randomisée, menée, durant une année, sur 546 femmes vaccinées avec la souche RA27/3,
il a été observé une augmentation significative des cas de manifestations articulaires
aiguës (30% versus 20% dans le groupe placebo) et une augmentation faible des
manifestations chroniques (Jonville-Bera et al., 1997). Toutefois, une relation cause à
effet a montré, l'absence de l’augmentation du risque d’arthropathies chroniques ou de
pathologies neurologiques, au moins un an, après la vaccination. Une éventuelle
augmentation des cas du syndrome de Guillain Barré, après une campagne de vaccination
de masse contre la rougeole/rubéole, n’a pas été identifiée (Das et al., 1997).
II-7 LE SYNDROME DE LA RUBÉOLE CONGÉNITALE
La rubéole est une maladie infectieuse due à un virus à ARN, bénigne dans sa forme
acquise, mais, dont la gravité réside dans l'atteinte fœtale, lorsque l’infection survient
chez une femme enceinte au cours du premier trimestre de la grossesse. Le lien, entre
l'augmentation de la fréquence des cataractes congénitales et l'épidémie de la rubéole
maternelle survenue en Australie en 1940, a été établi en 1941. D'autres atteintes
oculaires, des anomalies auditives, neurologiques et/ou encore cardiaques, ont été,
également, par la suite, rapportées.
Ainsi, deux types d’infections sont à distinguer. Il s’agit d’une part, de l’infection
rubéoleuse congénitale (IRC) qui affecte le fœtus, avec ou sans manifestations cliniques
de l’embryon et, d’autre part, du syndrome de la rubéole congénitale (SRC) qui, dans ce
cas, affecte l’embryon du fœtus infecté.
20
II-7-1 INFECTION DU FOETUS
Lorsque la mère contracte la rubéole, le fœtus, lui-même, est infecté dans une proportion
qui varie selon la période de la grossesse. Au Royaume-Uni, 95% des femmes, ayant eu
une rubéole confirmée durant la grossesse, ont présenté une éruption alors que 5% sont
restées asymptomatiques. Par ailleurs, 4% d’entre elles ont eu un avortement spontané et
54 % ont vu leur grossesse interrompue (Miller et al., 1990).
Les tests sérologiques, effectués chez les mères et chez les nouveaux-nés, montrent que
les fœtus étaient infectés à 80%, à 67%, et à 25%, lorsque l’infection rubéoleuse, chez les
mères, survenait, durant la grossesse, respectivement, durant les 12 premières semaines,
autour de la 13ème semaine et, enfin, entre la 23ème semaine et la 26ème semaine
(Miller et al., 1982).
II-7-2 APPARITION DU SRC CHEZ LE FOETUS INFECTÉ
Il est important de retenir qu'une infection fœtale sans séquelle est possible quel que soit
le moment où elle se produit (CDC, 1990). Après une infection in utero, le virus peut
persister, chez l'enfant, durant des mois voire même des années, après la naissance. Les
mécanismes par lesquels le virus cause des malformations congénitales et des anomalies
d'apparition tardive sont encore mal compris (Frey et al., 1997).
Les anomalies, les plus fréquemment, rencontrées chez les nouveaux-nés sont, par ordre
décroissant, la perte d'audition, la déficience intellectuelle, les malformations cardiaques
et les pathologies oculaires (Frey et al., 1997). L'infection fœtale serait associée, de façon
constante, à des anomalies congénitales (cardiaques ou auditives), si elle survient dans les
dix premières semaines de la grossesse. Par ailleurs, la fréquence de ces manifestations
diminue, après dix semaines, bien que, plus du tiers des enfants, présente un problème de
surdité en tant que seule manifestation clinique. Cependant, le nouveau-né pourrait ne
présenter aucune anomalie apparente, si l'infection se produit après la 16ème semaine de
la grossesse (Miller et al., 1982).
Même si la majorité des enfants infectés in utero sont normaux à la naissance, il se peut
que, plusieurs d’entre eux présentent, plus tard, une ou plusieurs manifestations associées
21
à l'embryopathie rubéolique. Ainsi, des enfants, nés sans déficit auditif, deviennent
sourds, à l'âge de 7 ans. Vingt pour cent des individus nés avec un SRC ont un diabète,
après l'âge de 35 ans, 5% ont des problèmes thyroïdiens et 10% ont des problèmes visuels
comme le glaucome (Dudgeon, 1986).
II-7-3 RÉINFECTION ET SYNDROME DE LA RUBÉOLE CONGÉNITALE
Il a été longtemps considéré qu'une réinfection, chez une femme enceinte, ne représentait
aucun risque pour le fœtus. Or, des cas de SRC, chez des nouveaux-nés présentant toutes
les caractéristiques d'un SRC, ont été rapportés (Robinson et al., 1994) alors que la mère
avait eu antérieurement plusieurs tests de dépistage sérologiques démontrant la présence
des anticorps (Robinson et al., 1994).
Il apparaît alors qu’il n'est pas nécessaire que la mère soit symptomatique, pour que le
fœtus soit infecté (Das et al., 1990).
De plus, la virémie étant rare, après une réinfection, entraîne encore plus rarement des
anomalies chez le fœtus (Robinson et al., 1994). Les dommages cellulaires générés par le
virus dans les tissus fœtaux infectés sont encore mal connus. En effet, le virus est peu
lytique in vitro, comme en témoigne l'absence de l’effet cytopathogène (ECP), en
microscopie optique, sur des cellules permissives à sa multiplication. Par ailleurs, in vivo,
une faible réaction inflammatoire (infiltrats de quelques lymphocytes) et un défaut de
vascularisation, à l'origine des manifestations cliniques, sont observés. Celles-ci
pourraient être aggravées par un effet viral direct sur la mitose cellulaire dont le temps de
réalisation est allongé.
III- SURVEILLANCE DE LA RUBÉOLE
La surveillance de la rubéole constitue une priorité pour les pays ayant décidé d’éradiquer
cette maladie. Cette décision est généralement associée à l’éradication de la rougeole,
puisque rubéole et rougeole sont des maladies éruptives, élément clé de leur éradication.
Au milieu des années 1990, les programmes de vaccination contre la rubéole ont fait
l’objet d’un intérêt grandissant.
22
En 1995-1996, le Comité d’Organisation des Études Épidémiologiques du Programme
des Vaccins et Vaccinations de l’OMS, actuellement connu sous le nom de Département
des Vaccins et Produits Biologiques, a lancé une étude à l’échelle mondiale sur la
situation du syndrome de rubéole congénitale (SRC) et l’emploi du vaccin antirubéoleux.
L’enquête a montré que, près de 50 pays en développement avaient réalisé des efforts
considérables, afin d’évaluer le fardeau représenté par le SRC alors que d’autres avaient
réclamé des conseils à propos des méthodes de surveillance du SRC (Cutts et al., 1997).
En 1996, 78 pays (28% pays en développement) avaient introduit le vaccin contre la
rubéole dans leurs programmes nationaux de vaccination. Cependant, ces pays n’avaient
pas tous mis en œuvre le programme de surveillance de la rubéole et du SRC (Robertson
et al., 1997). Depuis 1999, les 113 pays, qui s’étaient fixé l’objectif d’éradiquer la
rougeole, ont alors établi un réseau mondial de laboratoires travaillant sur cette maladie
infectieuse et pensent fortement à la possibilité d’inclure le vaccin antirubéoleux dans
leurs programmes nationaux de vaccination puisqu’ils considèrent l’éradication de la
rubéole comme un objectif approprié de la vaccination.
III-1 RUBÉOLE EN AFRIQUE
Les cataractes congénitales représentent 3% à 19 % des causes de cécité de l’enfant en
Afrique (Foster, 1988), bien que les estimations de la contribution du SRC aux cataractes
ne soient pas fiables.
Il a été rapporté que 10% à 20% de patients atteints de cataracte congénitale avaient
d’autres signes compatibles avec une rubéole congénitale, en Tanzanie, que 12 % de
patients porteurs de cardiopathies congénitales avaient des troubles compatibles avec une
rubéole congénitale (Maselle et al., 1988) alors qu’au Nigéria, 22% d’enfants ayant une
cardiopathie
avaient des manifestations autres que celles de la rubéole congénitale
(Antia, 1974). Au Zimbabwe, 18 cas de rubéole congénitale ont été détectés, après une
épidémie consécutive à un afflux de réfugiés venus de zones rurales affectées par la
guerre, en 1978 (Axton et al., 1979). En Afrique du Sud, 10% des avortements légaux du
Centre Hospitalier Universitaire de Johannesburg étaient causés par une rubéole
confirmée (Kopenhager et al., 1996). Des cas sporadiques ont été rapportés au Kenya
(Sachdeva, 1973), en Ouganda (Dudgeon, 1986) et au Sénégal (Fall, 1975). En Côte
23
d’Ivoire et en Afrique de l’Ouest, une faible proportion des surdités a été attribuée au
SRC, 3 % au Nigéria (Obiako, 1987) et 2 % en Gambie (McPherson et al., 1985).
III-2 ESTIMATION DE LA CHARGE DE MORBIDITÉ DUE AU SRC
Le fardeau que représente le SRC peut
être évalué, à partir des données de la
surveillance et des enquêtes sur la séroprévalence de la rubéole, en fonction de l’âge chez
les femmes enceintes et/ou les femmes en âge de procréer.
III-2-1 ENQUÊTES SÉROLOGIQUES
Certes, de nombreuses enquêtes sérologiques sur la rubéole existent mais leurs données
doivent être interprétées avec prudence. La majorité des études sont transversales, en ce
qui concerne la conception, bien que le profil sérologique obtenu varie avec le temps
(Clarke et al., 1980). Les méthodes de détection des IgG spécifiques varient d’une étude
à l’autre tout comme le titre considéré comme positif. Plusieurs études recouraient au
test d’inhibition de l’hémagglutination (IH) qui constitue le test de référence (Cradock,
1991). D’autres études encore ont eu recours à l’hémolyse sur gel, à l’hémolyse radiale
ou à des tests immunoenzymatiques.
Bien qu’il y ait généralement une concordance entre tous ces tests, les résultats obtenus
ne peuvent, cependant, être comparables (Cradock, 1991). Ainsi, le test IH considère,
comme seuil de positivité, le titre de 1:8 alors que les autres tests préfèrent le titre de 1:16
ou encore le titre de 1:20.
III-2-2 ENQUÊTES SÉROLOGIQUES DE LA POPULATION STRATIFIÉE
SUR L’ÂGE.
Dans certaines circonstances et lorsque les ressources financières et techniques le
permettent, un pays peut envisager la réalisation d’une enquête sérologique de la
population stratifiée sur l’âge.
Les études sérologiques d’une population stratifiée sur une large tranche d’âge permettent
d’estimer l’âge spécifique d’acquisition des anticorps contre la rubéole et de concevoir
24
des modèles destinés à évaluer les conséquences des différentes stratégies de lutte contre
la rubéole et le SRC (Icenogle et al., 2003). Ainsi, des résultats estimatifs, avec des
intervalles de confiance, de la proportion d’individus susceptibles de contracter la
maladie, pour chaque tranche d’âge étudiée, ont pu être obtenus.
De telles données, interprétées conjointement avec la modélisation mathématique,
permettent alors d’estimer l’âge moyen de l’infection par le virus de la rubéole et de
prévoir l’impact des différentes stratégies de vaccination sur l’incidence du SRC
(Anderson et May 1991 ; Massad et al., 1994).
III-2-3 ENQUÊTES SÉROLOGIQUES CHEZ LES FEMMES EN ÂGE DE
PROCRÉER
Les études sérologiques représentent un complément extrêmement utile dans la
surveillance clinique et dans la lutte contre la maladie. Elles peuvent, être mises en place
par les responsables du programme de vaccination, en collaboration avec des
épidémiologistes. Des études sérologiques assez simples peuvent être effectuées à partir
des échantillons prélevés chez les femmes en âge de procréer qui se présentent aux
centres de consultations prénatales, peuvent être utiles pour la détermination du statut
immunitaire. Puisque le risque majeur de la rubéole, en terme de santé publique, est
l’infection des femmes enceintes, beaucoup de pays ont réalisé des enquêtes
sérologiques, pour déterminer la proportion des femmes en âge de procréer et qui restent
réceptives à la rubéole.
Dans de nombreux pays, le SRC reste encore un problème non documenté. Les méthodes
adaptées au recueil des informations dans ce domaine sont :
- les recherches prospectives ou rétrospectives, dans les registres hospitaliers, des
malformations compatibles avec le SRC chez les nourrissons,
- le suivi, de la réceptivité à la rubéole, chez les femmes enceintes et/ou le dépistage
TORCHES (Toxoplasmose, Rubéole, Cytomégalovirus, Herpes, Syphilis), pendant la
grossesse,
- les études sérologiques des cas témoins, dans des institutions pour les enfants sourds
et/ou aveugles,
25
- l’intégration des études sur le SRC, dans des enquêtes chez les handicapés,
- la surveillance de la rubéole acquise pour déterminer la proportion des femmes en âge
de procréer pendant les épidémies,
- et, enfin, la surveillance active du SRC après une épidémie.
Une concertation, au niveau national, entre des épidémiologistes, des pédiatres, des
obstétriciens et des directeurs de laboratoires, permettra de choisir les méthodes les plus
appropriées.
III-3 STRATÉGIES DE CONTRÔLE
Tous les pays qui ont mis en place des programmes de contrôle de la rubéole par la
vaccination se sont fixé le même but qui est de réduire au minimum les cas du syndrome
de la rubéole congénitale et/ou même les éliminer.
Lorsque le vaccin antirubéoleux a été mis sur le marché, en 1969, les États-Unis
émergeaient de la dernière grande épidémie qui avait atteint le pays en 1964-1965.
Durant cette période, 12,5 millions des cas de rubéole ont été déclarés, 20 000 enfants
seulement nés avec un syndrome de rubéole congénitale, dont 1000 cas dans la ville de
New York (Miller, 1991). Jusqu'à cette date, les cycles épidémiques survenaient tous les
six à neuf ans (Lindegren et al., 1991).
III-3-1 STRATÉGIES PRÉCONISÉES
Si le but de la vaccination est la réduction du nombre des cas de rougeole et/ou
l’élimination de la rubéole, les épidémiologistes Américains et Britanniques ont
préconisé des stratégies différentes. De leur côté, les autorités canadiennes de la santé
publique ont hésité, durant près de dix ans, entre les deux approches (Furesz et al., 1985).
Selon les Britanniques, la protection conférée par le virus naturel était préférable à celle
requise par le vaccin puisqu’il n'y avait aucune certitude que l'immunité induite par la
vaccination avait un effet durable ; dans ce sens, les femmes vaccinées à un âge jeune,
pouvaient être réceptives des années après. Ainsi, la stratégie consisterait à laisser le virus
circuler librement dans la population, afin d'avoir un maximum de filles qui contractent la
26
rubéole durant l'enfance et à vacciner les adolescentes et les femmes adultes en âge de
procréer.
Cependant, cette vaccination dite sélective a dû être abandonnée, après dix-huit années,
car les cas de SRC continuaient à apparaître, puisque entre 1987-1988, 60 enfants sont
nés avec un SRC (Miller, 1990).
Ainsi, depuis 1988, la stratégie a changé et les jeunes enfants sont aussi vaccinés. Il a
alors été noté une diminution importante des cas d'infections, chez les femmes enceintes,
suite au ralentissement de la transmission du virus dans la population (Miller et al.,
1991). Les taux de réceptivité des femmes enceintes ont été alors rigoureusement suivis
et, les résultats des tests prénataux compilés par âge et parité, depuis plusieurs années,
dans plusieurs régions.
Ainsi, le registre de Manchester, ayant une population annuelle de 40 000 parturientes, a
permis d'évaluer à 1% la proportion des femmes enceintes et réceptives à la rubéole, en
1990. En 1984-1987, 10% des hommes testés, dans la même région, avait un test négatif
(Miller, 1991). Il s’est alors avéré que, dans la majorité des régions du Royaume-Uni, le
taux de réceptivité chez les femmes en âge de procréer est inférieur à 2%, depuis 1990
(Berkeley et al., 1991).
Aux États-Unis, la stratégie préconisée, au début des années 70, consistait à vacciner en
routine tous les enfants âgés de un an, avec un rattrapage à l'âge prépubertaire, l’objectif
étant d’interrompre la circulation du virus dans la population et de protéger indirectement
les femmes adultes. Rapidement, le cycle des épidémies s’est modifié, sans, pour autant,
avoir un effet important sur l'incidence de la rubéole chez les personnes de plus de 15 ans
(Lindegren et al., 1991) et, par conséquent, sur l'incidence des cas de SRC (Bart et al.,
1985 ; Bart et al., 1986).
À partir de 1980, des recommandations plus strictes ont été émises pour la vaccination
des adolescentes et des femmes plus âgées. Durant les années qui ont suivi, les taux de
rubéole et de SRC ont diminué (Cochi et al., 1989). Or, en 1991, une recrudescence des
éclosions de la rubéole est survenue dans certaines régions des Etats-Unis. Parmi les 1401
cas rapportés, 28% étaient âgés de plus de 20 ans. Durant la même année, 31 enfants sont
27
nés avec un syndrome de la rubéole congénitale à la suite d’une infection naturelle chez
les mères. En 1993, 190 cas de rubéole ont été déclarés. L'histoire vaccinale était
disponible pour 97 d'entre eux dont 45 % avaient déjà été vaccinés. Aucun cas de SRC
indigène n'a été signalé (CDC, 1994).
III-3-2 STRATÉGIE DE L’ÉLIMINATION DE LA RUBÉOLE AU MAROC
L'élimination complète des cas indigènes de la rubéole congénitale n’est possible que si
la transmission du virus dans la population est interrompue. Les données
épidémiologiques
indiquent,
qu’au
Maroc,
le
programme
d'immunisation
Rougeole/Rubéole a entraîné une diminution importante de la circulation du virus
sauvage de la rougeole. Cependant, en ce qui concerne la rubéole, elle reste encore non
documentée et, la couverture vaccinale du vaccin ROR, dans le secteur privé, reste mal
connue dans la population vaccinée.
Par ailleurs, il est probable qu’une interruption complète de la transmission soit réalisée,
dans un futur proche, si une couverture vaccinale largement répandue est maintenue et
que plus de 85% des cohortes de naissances soient immunisées (Anderson et al., 1983).
Toutefois, l'introduction d'une deuxième dose du vaccin bivalent RR (rougeole/rubéole),
dans le programme habituel de vaccination, au Maroc, à l’âge de la rentrée scolaire, est
non justifiée. L'utilisation du vaccin bivalent RR, dans un programme de vaccination à
deux doses, procure un coût marginal faible et une simplification de la gestion du
programme dont l’efficacité reste, cependant, incertaine.
IV- DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA RUBÉOLE
IV-1 DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE
Le temps entre le début de l’éruption et la collecte des échantillons est important. En
effet, la recherche des anticorps IgM est le critère de diagnostic de laboratoire de
référence, bien que, 50 % des patients sont IgM négatifs, le jour de l'éruption (Tableau 2).
Puisque la rubéole postnatale est une maladie bénigne et de courte durée, il est
souhaitable, d’obtenir un échantillon de sérum 5 à 7 jours, après le début de l’éruption
28
lorsque la plupart des patients sont IgM positifs. Les cas de SRC sont IgM positifs,
pendant des mois, et, la durée, entre le début de l’éruption et la collecte de prélèvements,
est alors moins critique (Icenogle et al., 2003).
Critère de
diagnostic
Temps où la plupart
des cas sont positifs
(%)
Exemple où plus de
90% des cas sont
positifs
Temps Approximatif
pour 50% de déclin
Rubéole postnatal e
Virus dans la gorge par Jour d’éruption (90%)
culture, IgM dans le
sérum par ELISA
2 jours avant éruption
4 jours après éruption
IgG dans le sérum par
(ELISA), Virus dans le Jour d’éruption (50%)
sang (par culture)
5 jours après éruption
6 semaines après éruption
8 jours après éruption
1 jour après éruption
IgM dans sérum (par Jour d’éruption (50%)
ELISA)
5 jours avant éruption
3 mois
IgG dans le sérum (par à la naissance (80%)
ELISA)
1 mois
6 mois
Syndrome de
la
rubéole Congénitale
3 jours après éruption
Virus dans la gorge (50%)
(par culture)
Tableau 2 : Apparition des marqueurs biologiques de l'infection par le virus de la
rubéole (Icenogle et al., 2003)
Des différentes étapes sont à suivre dans le cas d’investigation d’un cas suspect de
rubéole postnatale ou dans le cas d’une rubéole congénitale (Figure 6).
En fait, beaucoup de notions erronées parviennent de conclusions inexactes. Par exemple,
un titre faible d'anticorps (Ac) ne signifie pas systématiquement que le sujet est mal
protégé et un titre élevé d’anticorps n'est pas synonyme de primo-infection récente. La
date de l’infection rubéoleuse peut se faire sur des sérums itératifs, mais, là encore,
l’interprétation des résultats devrait se faire avec beaucoup de prudence. En effet, une
séroconversion n'est pas toujours corrélée à une primo-infection et une augmentation des
anticorps peut être observée dans de nombreuses situations. Le diagnostic de la primo-
29
infection rubéoleuse est, en fait, essentiellement basé sur la détection des IgM
spécifiques. Les IgM peuvent être détectés dans de multiples circonstances. La mesure de
l'avidité des IgG rubéoleuses peut aider à dater l'infection (Grangeot, 2005) et à résoudre
le problème de l’interprétation.
Échantillon viral
Préparation des 3 aliquots
Passage sur culture
cellulaire
Extraction d’ARN
Infection des cellules
RT-PCR
(Détéction, 185bp)
Extraction de l’ARN
-
+
Détection du virus par RT-PCR
(185 bp fragment) Après 2
passages négatifs
Détection du virus par IF
après 2 passages
Si IF+ ou PCR +, préparation du virus
stock
Congélation d’ aliquot
Amplification en
utilisant des sondes
pour RT-PCR niché ou
PCR en temps réel
Virus stock
analyse moléculaire
Extraction d’ARN et
amplification d’un
fragment pour séquençage
(RT-PCR une seule étape)
Figure 5 : Étapes à suivre dans le cas d’une investigation d’un cas de rubéole
30
IV-1-1 DIAGNOSTIC INDIRECT
Dans le cas d’une primo-infection, les anticorps apparaissent au moment de l’éruption et
s’élèvent rapidement jusqu’à un titre maximal. Mais, il existe une grande variabilité
individuelle des paramètres, le délai entre l’apparition des anticorps et le développement
d’un titre maximal variant entre 3 jours à 21 jours.
IV-1-2 IgM SPÉCIFIQUES
La détection des IgM anti-rubéoleux montre qu’il s’agit d’une primo-infection. La
recherche peut se faire, par le test d’inhibition d’hémagglutination HI, sur les IgM
sériques séparées des IgG, par la méthode d’ultracentrifugation ou par la méthode de
chromatographie. Cependant, la technique d'immunocapture ELISA, plus simple, plus
rapide et plus sensible, est la plus préconisée, actuellement, bien qu’elle reste
insuffisante, dans le diagnostic de la rubéole chez la femme enceinte et le nouveau-né.
IV-1-2-1 Chez la femme enceinte
Le diagnostic de la rubéole chez la femme enceinte permet la distinction entre une primoinfection dangereuse pour le fœtus et une réinfection en principe sans danger puisque pas
de virémie et donc pas de passage trans-placentaire. Dans le cas où une infection primaire
par le virus de la rubéole est suspectée chez les femmes enceintes, un résultat faux négatif
ou faux positif peut conduire à des décisions cliniques incorrectes. Ainsi, un deuxième
prélèvement serait préférable, pour résoudre le problème des faux positifs ou des faux
négatifs. Par ailleurs, lorsque le diagnostic sérologique d'une infection récente n'est pas
fiable (par exemple, quand le premier échantillon a été collecté tardivement, après le
début de l’éruption), la mesure de l’avidité des IgG est nécessaire pour indiquer si
l'infection est récente ou non (Grangeot, 2005).
IV-1-2-2 Chez le nouveau-né
Le taux des anticorps dans le sang du cordon à la naissance est égal ou supérieur à celui
de la mère car il s’agit des IgG d’origine maternelle et fœtale et des IgM qui, ne passant
pas le placenta, sont obligatoirement d’origine fœtale.
31
Les anticorps diminuent, ensuite progressivement, au cours des premiers mois, puisqu’il
y aura disparition des IgG d’origine maternelle et des IgM d’origine fœtale disparaissent.
Aux alentours du 6ème mois, les IgG, correspondant aux anticorps nouvellement
synthétisés par l’enfant, augmentent. Ainsi, il a été démontré que, presque tous les cas
postnataux de la rubéole sont IgM positifs et IgG positifs, après le 8ème jour d’éruption,
selon la méthode ELISA. Pour les enfants les plus congénitalement infectés, les IgM ont
été détectés, de 6 mois à un an, après la naissance (Icenogle et al., 2003).
Du fait que les symptômes cliniques de la rubéole postnatale et du SCR sont nettement
différents, il n'est pas étonnant qu'il y ait des différences significatives dans les réactions
immunes, chez les patients présentant chaque maladie. Par la méthode dit Western blot,
les sérums des individus présentant le SRC ont souvent une distribution non habituelle
des anticorps aux glycoprotéines virales en comparaison avec celle des cas de la rubéole
postnatale (Icenogle et al., 2003).
La sérologie de la rubéole, en permettant donc de déterminer le statut immunitaire du
sujet, permet aussi de savoir si le sujet est protégé contre l’infection.
IV-1-3 MESURE DE I'AVIDITÉ DES IgG SPÉCIFIQUES
L’avidité des IgG est la force de liaison entre un antigène multivalent et les IgG
spécifiques correspondants (Picone et al., 2005). La détermination de l’avidité ou affinité
fonctionnelle permet de distinguer entre une primo-infection et une infection ancienne,
voire même de dater approximativement une infection (Thomas et al., 1991).
La réaction antigène-anticorps, réversible (Ac + Ag <=> AcAg), est caractérisée par une
constante Ka (Ka = [AcAg] / [Ac] [Ag]) intrinsèque d’un site anticorps donné prenant en
compte l’ensemble des forces d’attraction et de répulsion mises en jeu pour un site
antigène donné.
En pratique, la réaction immunitaire s’accompagne toujours de la production d’une
population hétérogène d’anticorps. L’avidité des anticorps augmente progressivement,
pendant la réponse immunitaire. C’est le phénomène de maturation de la réponse
32
immunitaire qui, en règle générale, est, plus élevée, au cours de la réponse secondaire que
durant la réponse primaire.
Les méthodes les plus utilisées pour mesurer l'avidité des IgG, reposent sur l'utilisation
des agents dénaturant les protéines dans une technique immunoenzymatique. Les agents
dénaturants sont, soit, ajoutés au diluant du sérum pour empêcher la formation de
complexes antigène-anticorps (principe de dilution) soit, ajoutés, dans le liquide de
lavage, après la formation des complexes (principe d'élution). À l'heure actuelle, c'est
l’urée à différentes molarités (4 à 8 M) qui est l'agent dénaturant le plus utilisé. D’autres
dénaturants comme le DiEthylAmine DEA est également utilisé (Hofmann et al., 2005).
II existe de nombreuses possibilités pour calculer l'avidité dans des réactions utilisant des
dénaturants des protéines (Thomas et al., 1992).
Cependant, la méthode la plus largement utilisée consiste à mesurer l'absorbance ou la
densité optique (DO) sur une seule dilution de sérum (deux réactions par sérum), avec ou
sans agent dénaturant. L'avidité est alors calculée selon la formule :
DO en présence de l’agent dénaturant x 100
DO sans agent dénaturant
Une faible avidité correspond, généralement, à une infection récente. Une forte avidité
correspondra soit, à une infection ancienne soit, à une réinfection. Lors d'une stimulation
polyclonale non spécifique du système immunitaire, l'index d'avidité est élevé. Les
résultats s’expriment en pourcentage. Un résultat inférieur à 20-30 % indique une avidité
faible alors que pour une forte avidité des IgG, le résultat est supérieur à 50%.
La mesure de l’avidité n'est réellement possible que chez les patients immunocompétents
(Cooper et al., 1995). Par ailleurs, l'avidité ne peut être mesurée, si la concentration des
IgG est trop faible. Les mesures d'avidité, effectuées sur des sérums ayant des
concentrations IgG anti-virus de la rubéole inférieure à 25 UI.mL-1, doivent être
interprétées avec beaucoup de prudence (Hedman et al., 1993).
IV-2 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DU VIRUS DE LA RUBÉOLE
L’isolement du virus, à partir des prélèvements cliniques, permet d’identifier des
33
isolements représentatifs de chacune des chaînes de transmission au cours de la phase
d’élimination ou de chacune des épidémies, pendant la phase de lutte. L’isolement du
virus de la rubéole (VR), effectué sur la lignée cellulaire Vero, est confirmé par Immuno
Fluorescence (IF) indirecte ou par Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR), l’effet cytopathogène étant peu important. L’isolement peut également être
pratiqué sur des cellules Vero/Slam, dans les laboratoires qui isolent aussi le virus de la
rougeole sur culture cellulaire. La technique RT-PCR, utilisée pour amplifier les
séquences nucléotidiques du VR directement à partir des prélèvements cliniques, est très
sensible et constitue, l’outil de choix, dans des études d’épidémiologie moléculaire.
La multiplication du virus de la rubéole sur des lignées cellulaires permissibles peut être
utilisée, pour le diagnostic de la maladie postnatale et le SRC/IRC. Le prélèvement
nasopharyngé, effectué le jour de l'éruption, est le prélèvement idéal pour l’isolement
viral. La présence du virus dans la gorge diminue rapidement. À partir du 4 ème jour,
après le début de l’éruption, seulement, 50 % des cas sont positifs.
Le virus peut être cultivé sur plusieurs types cellulaires telles que la lignée cellulaire Vero
(rein de callitriche africain), la lignée SIRC (cornée de lapin), la lignée RK-13 (rein de
lapin) et la lignée BHK-21 (Baby Hamster Kidney). L’effet cytopathogène (ECP) est
différent d’une lignée à une autre.
Récemment, une lignée des cellules Vero a été modifiée, pour exprimer un récepteur
aussi bien pour le virus de la rougeole que celui du virus de la rubéole (Vero/Slam).
Cette lignée cellulaire, donnant un ECP convenable. De plus, les cellules ne sont pas
transformées par le virus Epstein Barr.
Actuellement, l'utilisation des techniques RT-PCR et IF, utilisant des anticorps
monoclonaux du virus de la rubéole, permet la détection de l'ARN et des protéines
virales, dans les cultures cellulaires, en absence d’effet cytopathogène.
L'ARN est extrait, à partir de l’isolat de la monocouche cellulaire, par des techniques
standard. Des amorces spécifiques sont alors utilisées pour amplifier n'importe quel gène
34
du virus. Le séquençage des acides nucléiques amplifiés peut fournir des informations
utiles, comme par exemple, si le virus est de type vaccinal ou sauvage.
IV-3 DETECTION PAR IMMUNO-FLUORESENCE
L'analyse par immunofluorescence (IF) est un test facultatif, pour la détection des
anticorps IgG et IgM du virus de la rubéole. C'est une analyse indirecte des protéines (C,
E1 et E2) du virus, en utilisant des anticorps monoclonaux disponibles sur le marché.
Les cellules, exprimant les protéines du virus de la rubéole et réagissent alors avec le
sérum et les anticorps spécifiques du virus,
sont alors détectés avec les anticorps
humains anti-IgG (ou IgM) de la chèvre marqué à la fluorescéine.
Les étapes de lavage devraient être faites soigneusement pour éviter tout résultat non
spécifique. Les sérums humains négatifs sont utiles pour confirmer un résultat douteux.
Un test positif est déterminé par la visualisation directe par microscopie à fluorescence.
La fluorescence ne devrait être présente que sur la périphérie de la monocouche de
cellules (Icenogle et al., 2003).
IV-4 DÉTECTION PAR RT-PCR
La réaction d’amplification par polymérisation en chaîne (PCR) sert à copier l'ADN. Elle
comporte plusieurs cycles qui se répètent dont chacun se compose de trois étapes.
La solution de rinçage contient les molécules d'ADN qui doivent être copiés, les
polymérases qui copient l'ADN, les amorces et les nucléotides qui, fixés aux amorces,
sont chauffés à +95°C. Cette étape est dite réaction de dénaturation ou de fusion.
La diminution de la température permettant aux amorces de se lier à l’ADN est un
processus dit d'hybridation. Les résultants ne sont stables que si l'amorce et le segment
d'ADN sont complémentaires c’est à dire lorsque les paires de bases de l'amorce et du
segment d'ADN s'assortissent. Les polymérases commencent alors à s’attacher aux
nucléotides complémentaires renforçant ainsi la liaison entre les amorces et l'ADN.
35
Au cours de l’étape dite de prolongation, la température est augmentée à+72°C. A
chaque fois que les trois étapes se répètent, le nombre de molécules copiées d'ADN
double brin augmente. Après 20 cycles environ, un million de molécules sont alors
copiées à partir d’un
segment d'ADN bicaténaire. La température et la durée des
différentes étapes se réfèrent au protocole le plus communément utilisé.
La technique RT-PCR ou transcription inversée est utilisée pour la détection de la plupart
des virus à ARN. Ainsi, l’emploi d’une enzyme appelée Reverse Transcriptase sert à
convertir la cible d'ARN en ADN. L'amplification directe de l'ARN du virus de la
rubéole, à partir d'un échantillon clinique, par RT-PCR, est préconisée, pour déterminer
si un patient est ou pas infecté.
Les protocoles de la RT-PCR nichée, bien qu’ils soient difficiles à maintenir, restent,
cependant, une technique sensible pour la détection du VR. Néanmoins, quand le sérum
du patient n’est pas disponible, la détection directe de l'ARN du virus de la rubéole par
RT-PCR peut être nécessaire, puisqu'elle est plus rapide que l’isolement viral sur les
lignées cellulaires.
La PCR est une méthode utilisée pour amplifier les séquences spécifiques de l'ADN d'un
mélange complexe d’ADN. À partir d'une molécule simple, plus d’un milliard de copies
du produit PCR sont produites. Cependant, la capacité d'amplifier plus d'un milliard fois
les copies augmente, également, la possibilité d'amplifier de fausses séquences d'ADN.
La spécificité de la PCR est donc déterminée par la spécificité des amorces utilisées.
IV-5 SÉQUENÇAGE ET ANALYSE DES SÉQUENCES
Le séquençage des souches de la rubéole est basé sur le séquençage des gènes les plus
variables du génome. La plupart des études génétiques sur le virus sauvage de la rubéole
ont été réalisées par le séquençage de la totalité ou de certaines portions de la région
codante pour la protéine d’enveloppe E1. Le séquençage d’autres régions du génome du
virus pour l’épidémiologie moléculaire a été, certes, envisagé, bien qu’aucun argument
n’indique qu’il faut séquencer des régions autres que la région de la protéine E1.
36
Les premières analyses moléculaires ont commencé par le séquençage du fragment de
512 nucléotides de la protéine E1. Après la découverte du génotype 1F, le fragment 512
ne permettait pas de donner une valeur crédible pour le regroupement des virus du
génotype 1F. Le fragment 512 est alors remplacé par le fragment 601 (8868-9469), dans
la même région variable de la protéine E1. L’analyse phylogénétique (Figure 7) a permis
alors le même groupement des autres génotypes que le fragment nucléotidique 512
(8771-9282), avec une bonne crédibilité pour les souches du génotype 1F.
8258 nts
9700 nts
1.0
0.5
739 w
8731
9469
512 w
8771
9282
601 w
9469
8869
-0.0
0
500
1,000
Figure 7 : Plot similarité de la région codante E1 des 37 virus de référence
Après la découverte du nouveau génotype 1g, le fragment 601 n’a pas permis de
regrouper, séparément, les virus du génotype 1B et les virus du génotype 1g. Il convient
donc de désigner des amorces spécifiques pour le nouveau fragment, afin de rester dans
la même région variable codant la protéine E1. Le choix s’est basé sur le fait de
rassembler le fragment 601 et le fragment 512 (Caidi et al., in press). Cette région est
donc obtenue par l’association de la séquence 601 et de la séquence 512, toutes deux
couramment utilisées. En effet, l’analyse phylogénétique des séquences du virus du
génotype 1B et des séquences du virus du génotype 1g se regroupent, alors, séparément,
en respectant le regroupement des autres génotypes. Cette région constituée de 739
37
nucléotides (8731-9469) est, recommandée par l’OMS, depuis 2005, pour l’analyse du
virus de la rubéole en routine, en biologie moléculaire (Figure 7).
Différents programmes bioinformatiques (logiciels), disponibles pour l’analyse
phylogénétique sont utilisables. Le programme informatique, reposant sur le principe du
« maximum de parcimonie/Maximum Parsimony », à partir d’un ensemble de séquences
nucléotidiques alignées, consiste à reconstituer l’arbre phylogénétique, en minimisant le
nombre de mutations génétiques (score de parcimonie) apparues, au cours de l’évolution.
La méthode du maximum de vraisemblance/Maximum likelihood, quant à elle, se base,
non seulement, sur le nombre des substitutions entre les séquences, mais, également, sur
toutes les informations données par une séquence, pour induire la phylogénie la plus
vraisemblable.
D’autres méthodes sont acceptables, à condition que l’analyse soit pratiquée sur la série
des séquences des souches de référence déjà acceptées par GenBank. L’utilisation des
virus de référence, dans l’analyse (Tableau 3), doit permettre d’éliminer les ambiguïtés de
la caractérisation du virus. L’analyse doit être réalisée avec, au moins, la région
recommandée (739 nucléotides). Les groupes phylogénétiques les plus importants des
virus de la rubéole, et, qui diffèrent par 8% à 10% de leurs séquences nucléotidiques, ont
été distingués puis désignés sous le nom de clades 1 et 2.
Le calcul de la distance génétique permet d’établir la proximité ou l’éloignement entre
deux génotypes différents (Tableau 3). La distance génétique D est définie par
l’expression D = n/N où n est le nombre de mutations observés et N la longueur
nucléotidique de la séquence à analyser. La distance génétique est représentée par le
nombre et/ou le type de mutations qui séparent deux génotypes.
38
Tableau 3 : Distance génétique moyenne inter et intragénique ; comparaison faite avec 22 virus de référence en se
basant sur la séquence des régions des protéines structurales (SP-ORFs) de 3186 nucléotides.
39
Les termes de clade et de génotype sont utilisés pour décrire les caractéristiques
génétiques des virus sauvages. Cette terminologie rapproche la nomenclature du virus de
la rubéole de la nomenclature utilisée pour décrire les caractéristiques génétiques des
virus de la rougeole. Des virus de référence et, de distribution mondiale (Figure 8), ont
été acceptés pour 7 groupes intra clades appelés génotypes et désignés par des lettres
majuscules (1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 2A et 2B) (Figure 9).
Figure 8 : Distribution mondiale des génotypes du virus de la rubéole 1985-2004
(MMWR, 2005)
Un génotype provisoire ne sera accepté que s’il comporte au moins deux souches de
référence et que les relations phylogénétiques entre le génotype provisoire et les autres
génotypes sont clairement définies. Ainsi, le génotype 1a est considéré provisoire car la
phylogénie de ce groupe de virus est non seulement complexe mais, encore mal connue.
Le génotype 1a, quant à lui, tout en incluant les premières souches vaccinales obtenues
des virus des années 60, a été, cependant, rarement observé (relevée épidémiologique
hebdomadaire, 2005). Pour ce qui est du génotype 1g, également considéré comme
provisoire, il ne possède pas de séquences de référence et la relation entre le génotype 1g.
40
Pays
Génotype
Souche
Nom de la souche
Année d’isolement
GenBank (N° d’accès)
Bahamas
Bolivie
Brésil
1E
1C
1B
1g
1a
1D
1E
1E
1F
2B
1C
1C
1D
1G
1B
1E
1E
1E
1C
1D
2B
1B
1B
1E
2B
1C
1D
1E
1C
1a
1E
1a
1D
1D
1C
1D
1E
2C
2B
1D
2B
1E
1g
1B
1g
2B
1E
1C
1D
1E
1B
Rvi/Freeport.BHS/97
RVs/BOL/02
RVs/RiodeJaneiro.BRA/97
RVs/RiodeJaneiro.BRA/99
Rvi/Vancouver.CAN/85
Rvi/Vancouver.CAN/87
Rvi/BC.CAN/97
Rvi/Shandong.CHN/02
Rvi/Anhui.CHN/99
Rvi/Anhui.CHN/00
Rvi/ECU/99
Rvi/SLV/02
Rvs/S.Tigray.ETH/25.04
RVs/Guragie1.ETH/15.04
Rvi/Stuttgart.DEU/95
Rvi/Stuttgart.DEU/99
Rvi/Thessaloniki.GRC/99
Rvi/NY.USA/97
Rvi/Washington.USA/00
Rvi/HonKong.CHN/87
Rvi/IND/95
Rvi/ISR/88
Rvi/Lodi.ITA/4.91
Rvi/Pavia.ITA/28.97
Rvi/Milan.ITA/42.94
Rvi/Akita.JPN/90
Rvi/Tokyo.JPN/90
Rvi/MYS/01
Rvi/MEX/97
Rvs/MNG/00
Rvi/MAR/04
RVs/MMR/01
RVs/MMR/01/2
Rvi/Auckland.NZL/91
Rvi/PAN/99
Rvi/Cal.USA/97
RvsEdinburgh.GBR/25.03
Rvi/Moscow.RUS/97
RVs/ZAF/03
RViKOR/96
Rvi/KOR/95
Rvi/SUR/98
Rvi/UGA/20.01
Rvi/Witshire.GBR/93
RVs/Manchester.GBR/00
RVs/Kent.GBR/21.03
Rvi/Mass.USA/7.00
Rvi/Cal.USA/91
Rvi/Cal.USA/88
Rvi/Fla.USA/21.97
Rvi/NY.USA/15.99
FRI
B82
B32BR97
BRAZ99
ML
PL
DES
T14 CH 02
AH2
TS34 CH 00
CUE
QUI ELS 02
ETH04-612
ETH04-576
INS
G432
Thess102GRE 99
NY-97
WA-00
C31
BAS
I-34 IS 88
385OPV
6488
5298MI
JPA5
NC JP 90
M-1 MAL 01
ANI
MO29
386D
MK
BTD
JC2
P-31 PAN99
SALCAUS 97
O3-28
C74
RVS
AN3
AN1
633
U588
BOW/wilt
00-128
O3-12
MA-98
SUR USA 91
NOR-CA
CAS
97
02
97
99
85
87
97
02
99
00
99
02
04
04
95
99
99
97
00
87
95
88
91
97
94
90
90
01
97
00
02
01
02
91
99
97
03
97
03
96
95
98
01
93
00
03
98
91
88
97
98
AY326359
Canada
Chine
Ecuador
Salvador
Ethiopie
Allemagne
Grèce
Guyana.usa
Honduras USA
HonKong
Inde
Israël
Italie
Japan
Malysie
Mexico
Mangolia
Maroc
Myanmar
N.Zélande
Panama
Philippines
Roumanie
Russie
Afrique du Sud.
Corée du Sud.
Suriname
Ouganda
Royaume Uni
Ukraine
Etats Unies
AJ890442
AJ890443
L16232
AY039114
AY326358
AY968210
AY326350
AY968218
AY326357
AY968211
AF039133
AF551761
AB003342
AF039134
AY968209
AY161354
AY161370
AB003354
AY968214
AY968221
AY326352
AB080729
en cours
AB080199
AY280706
AY326333
AY968217
AY968206
AY247019
AY326346
AY326345
En cours
AF039128
AY968212
AY326356
Tableau 4 : Souches de références des différents génotypes (WHO, 2004)
41
et le génotype 1B n’est pas bien définie. Le regroupement des virus de génotype 1B et du
génotype 1g est plus sensible au choix de la séquence de nucléotides utilisée que pour les
virus des génotypes 1C, 1D, 1E, 1F, 2A, 2B ou 2c. Le génotype 2c a été considéré
comme provisoire pour la seule raison qu’il n’existe pas de virus de référence.
Figure 9 : Arbre phylogénétique des séquences des virus de référence en se basant sur la
séquence de nucléotides 8731-9469
42
Les arbres phylogénétiques des virus types établis, en se basant sur les différentes régions
séquencées, expliquent la raison pour laquelle la séquence de 739 nucléotides du gène E1
a été recommandée. En effet, ce fragment contient la région codante entière des protéines
C, E2 et E1. En utilisant le logiciel GCG et le logiciel ClustalX , la région 601 n’a pas
permis de regrouper correctement le virus 1B et le virus 1g et la séquence nucléotidique
512 n’a pas permis de donner une bonne crédibilité pour le génotype 1F. Le fragment
combiné 739 a, par contre, permis d’obtenir un regroupement correct des virus de
référence du génotype 1B et une forte crédibilité des clades pour les virus du génotype
1F. Tandis qu’avec le logiciel Baysian, la région codante 601 du gène E1 a permis de
grouper les génotypes 1B et 1g séparément.
Les propositions concernant les nouveaux génotypes doivent être soumises aux banques
des souches pour les évaluer (Weekly epidemiological record, 2005).
43
MATÉRIEL
MATÉRIEL ET MÉTHODES
44
I-ÉTUDE DU STATUT IMMUNITAIRE CHEZ LES FEMMES EN ÂGE DE
PROCRÉER : UN EXEMPLE DE MODELE CATALYTIQUE
I- 1 POPULATION ÉTUDIÉE
Afin de déterminer le risque d’infection par le virus chez les femmes en âge de procréer
(15-39 ans), une étude sérologique de la séroprévalence des anticorps spécifiques
Immunoglobulines G (IgG) a été réalisée, à l’échelle nationale, avec le soutien financier
de l’UNICEF et la collaboration du ministère de la santé.
L’étude a été menée sur les sérums stockés au laboratoire d’Immunologie, dans le cadre
d’une étude menée sur l’anémié. Les sérums ont été choisis de sorte à représenter les
différentes tranches d’âge et le milieu de résidence, rural et Urbain.
Le groupe des femmes a été choisi, en se basant sur l’étude statistique conduite en 1997
sur la santé de la mère et de l’enfant (PAPCHILD), stratifiant la population dans le
milieu rural et dans le milieu urbain. Ainsi, 967 sérums sont analysés, pour la recherche
des immunoglobulines G (IgG). En guise du contrôle de qualité, 10% des sérums positifs
et 10% des sérums négatifs ont été testés au Centre des Maladies Infectieuses (Centers for
Diseases Control and Prevention à Atlanta USA).
Les résultats obtenus sont traités par le logiciel informatique Epi Info 6. Le Chi Carré de
Pearson a déterminé l'association entre la susceptibilité à l’infection par le virus de la
rubéole et l'âge. Des méthodes catalytiques (Cutts et al., 1997) ont permis, d’évaluer le
taux d'infection chez les femmes enceintes et d’estimer l'incidence des cas de SRC, au
Maroc.
I-2 PRÉLÈVEMENTS
Trois à cinq millilitres de sang sont prélevés sur tube sec, par ponction veineuse. Les
sérums, obtenus après centrifugation, sont transférés dans des tubes secs, puis, acheminés,
au laboratoire de virologie de l’Institut National d’Hygiène, dans des glacières isothermes à
+4°C, dans les 24 heures à 48 heures qui suivent le prélèvement. Les sérums sont conservés
à -20°C, jusqu'à leur analyse.
45
I-3 TESTS SÉROLOGIQUES
La recherche des IgG anti-rubéole a été réalisée par
Laboratories
TM
). Il s’agit d’un test
le kit commercial (Wampole
ELISA indirect permettant la détection et la
quantification des IgG anti-rubéole. La procédure suivie pour la réalisation de l’analyse
est celle recommandée par le fabriquant.
Le sérum est dilué au 1/40 dans le tampon de dilution du kit utilisé. La dilution se fait
directement sur la plaque. Après 30 minutes d’incubation, à température ambiante, la
plaque est lavée trois fois avec la solution de lavage diluée puis, incubée avec le conjugué
anti-IgG humain. Après un temps d’incubation de 20 minutes, à température ambiante, le
substrat ou Tétraméthyl benzidine dichlorure est ajouté. Après un temps d’incubation de
10 minutes, la réaction est arrêtée par l’addition de l’acide sulfurique H2SO4, 1N. La
densité optique DO est lue à 450/620 nm.
Selon les caractéristiques du fabricant, un résultat est considéré comme positif, si le taux
des IgG est ≥8,6 UI.mL-1, négatif si le taux des IgG est ≤ 6.2 UI.mL-1 et indéterminé si
le taux des IgG est ≥ 6,2 UI.mL-1 et ≤ 8,6 UI.mL-1.
II- MESURE DE L’AVIDITÉ DES IgG
II-1 POPULATION ETUDIÉE
L’étude a été réalisée chez 100 femmes enceintes qui se sont présentées au Centre
Hospitalier Universitaire (CHU) de Rabat avec une suspicion d’infection par le virus.
L’étude s’est déroulée de 2004 à 2006. Les sérums sont analysés par la technique ELISA
IgM, pour confirmer s’il y’a une infection récente ou pas. Seuls, les sérums positifs en
IgM sont analysés par le test d’avidité des IgG.
II-2 PRÉLÈVEMENTS
Trois à cinq millilitres de sang sont prélevés sur tube sec, par ponction veineuse. Les
sérums, obtenus après centrifugation, sont transférés dans des tubes secs, puis, acheminés,
au laboratoire de virologie de l’Institut National d’Hygiène, dans des glacières isothermes à
46
+4°C, dans les 24 heures à 48 heures qui suivent le prélèvement. Le sérum peut être
conservé à +4°C, pendant 7 jours ou conservés à -20°C, jusqu'à leur utilisation.
II-3 TESTS SÉROLOGIQUES
II-3-1 Test ELISA IgM
La recherche des IgM anti-rubéole est réalisée par le kit commercial ((Wampole
Laboratories
TM
). Il s’agit d’un test indirect permettant la détection des anticorps anti-
IgM, par test ELISA.
Le sérum est dilué au 1/41 dans le tampon de dilution du kit. Á 250 µl d’échantillon
dilué, un volume égal de RF-absorbant (anticorps de mouton dirigés contre le fragment
Fc de l’IgG humain) est ajouté. Le mélange, ainsi obtenu, est, alors incubé, pendant 15
minutes, à la température ambiante. A partir de ce mélange, 100 µL sont ajoutés les puits
de la plaque ELISA contenant ou non l’antigène de la rubéole. Après une incubation, á
température ambiante, pendant 30 minutes, la plaque est lavée 3 fois avec une solution de
lavage diluée, puis, une fois encore, incubée avec le conjugué anti-IgM humain. Après
30 minutes d’incubation, la plaque est, de nouveau lavée. Une solution colorée
(Tétraméthylbenzidine dichlorure), considérée comme substrat, est ajoutée. La réaction
est arrêtée, après 10 minutes d’incubation, avec une solution d’acide sulfurique H2SO4,
1N. La densité optique est lue à 450/620 nm.
Selon les caractéristiques du fabricant, un résultat est considéré comme positif, si le taux
des IgG est ≥8,6 UI.mL-1, négatif si le taux des IgG est ≤ 6.2 UI.mL-1 et indéterminé si
le taux des IgG est ≥ 6,2 UI.mL-1 et ≤ 8,6 UI.mL-1.
II-3-2 DÉTERMINATION DE LA DILUTION OPTIMALE POUR MESURER
L’AVIDITÉ DES IgG ANTI-RUBÉOLE
Un panel de 20 sérums est testé. Plusieurs dilutions sont effectuées, de sorte à avoir un
titre d’anticorps IgG de 20 UI.mL-1. En utilisant des kits Wampole, une série de dilutions
de sérum est réalisée, afin de trouver la dilution qui, après une multiplication par le
facteur de 9,091, donne un titre ≤ 20 UI.mL-1. Une reproductibilité à 99% est notée,
47
pour tous les sérums ayant une dilution de 1:125 et, par conséquent, tous les sérums sont
testés à cette dilution.
Les sérums sont alors déposés, sur une plaque de microtitration, en double. Après une
incubation d’une heure, quatre cycles de rinçage sont effectués. Puis, une solution
dénaturante (DEA) à 35 mM est ajoutée, à la solution de lavage, pour les puits servant à
mesurer l’avidité des IgG. Après un temps de contact de 5 minutes, un dernier lavage se
fait avec la solution de lavage du Kit. Les anticorps spécifiques sont ainsi détectés et
l’index d’avidité calculé selon la formule ci-dessous.
IA (Index d’avidité) (%) = DO avec solution dénaturante (35mM DEA) x 100
DO sans solution dénaturante
II-5 INTERPRETATION
Les sujets, dont l’index d’avidité (IA) du sérum est inférieur à 30%, présentent une
primo-infection, puisque le taux d’avidité des IgG est considéré comme faible. Les sujets,
dont les sérums présentent un index d’avidité (IA) supérieur à 50%, quant à eux,
possèdent une immunité ancienne avec, cependant, une possible réinfection, le taux
d’avidité des IgG étant élevé. Enfin, les individus, dont l’index d’avidité est compris
entre 30% et 50%, sont considérés comme indéterminés ou avec une avidité modérée.
Le traitement des données est réalisé par le logiciel informatique Epi Info 6. Le Chi Carré
de Pearson permet de déterminer l'association entre l’âge et l’index d’avidité.
III- ANALYSE MOLÉCULAIRE DES SOUCHES DE LA RUBÉOLE
CIRCULANT AU MAROC, EN AFRIQUE DU SUD, EN OUGANDA ET EN
CÔTE D’IVOIRE
Pour chaque cas suspect de la rubéole, deux types de prélèvements sont effectués. Le
prélèvement sanguin pour la confirmation de l’infection à travers le titrage des anticorps,
et le prélèvement urinaire ou nasopharyngé pour l’isolement du virus éventuellement
présent. Seuls les cas IgM positifs témoignant d’une infection récente, sont passés sur
culture cellulaire pour l’isolement viral.
48
III-1 PRÉLÈVEMENTS
Les urines sont collectées dans les sept premiers jours, après le début de l’éruption
cutanée. 50 mL d’urine sont récoltés dans un tube stérile puis, centrifugés à 2500 g,
pendant 15 minutes, à la température de +4°C. Le culot recueilli est suspendu dans 2 mL
de milieu de culture DMEM, à 0% de sérum de veau fœtal (SVF), additionné d’une
solution d’antibiotiques (Pénicilline 100 UI.mL-1 et Streptomycine 100 µg. mL-1).
Pour les prélèvements nasopharyngés, ils sont effectués, dans les 4 premiers jours, après
le début de l’éruption. Un grattage du fond de la gorge, grâce à un écouvillon stérile, est
effectué. L’écouvillon est, ensuite, conservé dans un tube stérile contenant un milieu de
transport viral. Dés la réception des échantillons, le tube contenant la suspension virale
est, alors, centrifugé à 2500 g, pendant 15 minutes, à la température de +4°C. Le culot est
récupéré dans 1 mL de milieu DMEM, à 0% de SVF. L’ensemble est conservé à -80°C.
Les prélèvements urinaires et nasopharyngées ainsi traités, sont soumis à une
décontamination par filtration sur filtre de 0,2 µm de porosité, avant leur inoculation sur
les cultures cellulaires. Les échantillons obtenus sont préalablement conservés à -80°C,
jusqu’à leur analyse.
L’étude comporte un total de 51 prélèvements urinaires. Trente d’entre eux ont été
collectés, durant des épidémies de rougeole qui ont sévi, au Maroc, de 2002 à 2005.
Parmi les 20 autres prélèvements (urinaires, nasaux, pharyngés ou de gorge),
13
prélèvements sont des aspirations nasales collectées, en Ouganda, en 2001, 6
prélèvements sont parvenus d’Afrique du Sud, en 2002 et, le dernier, est un cas de SRC,
détecté, en New Hampshire, aux Etats-Unis, en 2005. Le prélèvement du SRC provenait
d’un nouveau- né dont la mère, originaire de la Côte d’Ivoire, vivait, dans les camps de
réfugiés, aux Etats-Unis (Tableau 5).
49
Nom de la souche
Maroc 33/ 02
Pays
Maroc
Année
2002
Âge
(an)
7
Maroc 364/04
Maroc
2004
7
Maroc354/04
Maroc
2004
Maroc 353/05
Maroc
Maroc 386/04
Types de
Prélèvements
Urine
***JCP
IgM
*Hybridation
2 jours
P
P
Urine
2 jours
P
P
5
Urine
2 jours
P
P
2005
10
Urine
2
P
P
Maroc
2004
10
Urine
2
P
P
Rvi.UGA/01
Ouganda
2001
2
Aspiration nasale
7
NF
P
Sud
Afrique du Sud
2002
DNC
DNC
NF
NF
P
P
Côte d’Ivoire
2004
21 jours
du
Afrique
**RviNH.USA/05
Urine
Urine et
aspiration nasale
Tableau 5 : Description des échantillons testés par RT-PCR et Hybridation, DNC :
données non collectés, NF : non fait, P : positive, *sondes spécifiques utilisés pour
amplifier le fragment de 185 paires de bases (8851- 8997, E1 région codante), ** : cas de
SRC isolé en New Hampshire, ***Jours entre le début de l’éruption et la collecte des
prélèvements (JCP)
III-2 INOCULATION ET PASSAGE DES ÉCHANTILLONS SUR CULTURE
CELLULAIRE VERO ET VERO /SLAM
Les prélèvements de gorge et les prélèvements nasopharyngés sont des prélèvements de
choix pour l’isolement viral. Les prélèvements sont acheminés dans du milieu de
transport (VTM, MEM (Milieu Essential Minimum) ou PBS (Phosphate Buffer Saline)
1% FBS).
Pour les prélèvements des cas de SRC originaires de la Côte d’Ivoire,
l'échantillon d’urine et les prélèvements de gorge ont été conservés congelés.
Toutes les manipulations effectuées sur des cultures cellulaires se sont déroulées, sous
une hotte à flux laminaire verticale. Les cellules utilisées proviennent des lignées Vero et
Vero/Slam. La lignée cellulaire Vero/Slam peut exprimer un récepteur pour le virus de la
rougeole et le virus de la rubéole et donne un bon effet cytopathogène (ECP).
Les cellules Vero constituent une lignée continue du rein de singe. Les cellules sont
6
ensemencées, à raison de 10 cellules.mL-1, dans 10 mL de milieu de croissance (MEM,
bicarbonate de Na à 7,5%, SVF 10%), dans des flacons de culture de 75 cm2. Lorsque les
cellules sont confluentes, elles sont dispersées, à l’aide d’une solution à 2,5% de trypsine,
50
à raison de 2 mL par flacon. Le flacon, contenant les cellules ainsi constituées, est incubé
à +37°C, pendant 1 à 2 minutes.
Dés que les cellules commencent à se décoller, 5 mL du milieu de croissance (DMEM
contenant 10% SVF) sont ajoutés. Après une agitation manuelle et énergique, les cellules
sont décollées et dispersées. Par la suite, 1 mL de la suspension cellulaire ainsi obtenue
est déposé, dans les flacons de culture de 25 cm2 qui, sont ensuite incubés à +37°C,
jusqu'à une prochaine confluence des cellules.
Les prélèvements de gorge et/ou d’urine sont inoculés dans des flacons de 25 cm2 (ou sur
une plaque de culture de 12 puits) contenant des cellules Vero et 1 mL de milieu MEM
0% SVF. Les boîtes de culture sont, ensuite, incubées à +37°C, afin de permettre au virus
de s’adsorber aux cellules. Après le temps de contact de 1 heure, 10 mL de milieu dit
d’entretien (DMEM, 2% de SVF, pénicilline 100U.mL-1, streptomycine 100µg. mL-1)
sont ajoutés dans le flacon. Un changement de milieu est nécessaire tous les 2 à 3 jours,
pour permettre au virus de s’accroître.
Cellules Vero 72 heures après infection
Cellules Vero 7 jours après infection
La lecture des flacons et/ou boîtes ainsi préparés se fait chaque jour et pendant une
semaine. Un deuxième passage est souhaitable. L’effet cytopathogène (ECP) étant
souvent rare, la présence ou l’absence du virus est donc systématiquement affirmée ou
infirmée par la technique d’immunofluorescence (IF).
51
III-3 TEST D'IMMUNO-FLUORESENCE (IF)
La confirmation du résultat de la culture cellulaire se fait nécessairement par la technique
immunofluorescence (IF), pour la mise en évidence de la nucléoprotéine virale dans les
cellules infectées. Cette technique est réalisée systématiquement, qu’il y ait ou pas effet
cytopathogène.
L’immunofluorescence associe la culture du virus sur cellules in vitro à la révélation de la
multiplication virale, par une réaction d’immunofluorescence. Le principe de la technique
repose sur le fait que dans le cytoplasme des cellules infectées, il y’a une synthèse d’un
antigène viral dont la présence est révélée á l’aide d’anticorps fluorescents in situ, après
fixation des cellules.
Pour ce qui est de l’inoculation des isolats, des cellules Vero sont cultivées, sur une lame
de culture (Laboratoire Tek, 177445), à 50% de confluence sur DMEM (Dulbecco’s
Minimal Essential Media) contenant 10% de SVF. Une solution d’antibiotiques est ajouté
au milieu de culture (Gentamicine ou Pénicilline /Streptomycine). Ainsi, 100 µL du
spécimen sont inoculés (en général, il s’agit du surnageant de la culture cellulaire
préalablement inoculé pendant semaine) et 100 µL du milieu de culture sont ajoutés au
puits qui constitue le contrôle négatif.
o
Après une heure d’incubation, à +37 C (afin de permettre l’adsorption du virus aux
cellules), 200 µL du milieu à 5% de SVF sont ajoutés, dans chaque puits de la lame, pour
la survie des cellules. Si les monocouches des cellules Vero sont confluentes à plus de
50%, il faut diminuer la quantité de SVF, pour ralentir la multiplication des cellules. Les
cellules ainsi constituées sont, ensuite, incubées, durant 3 jours, à la température de
+37°C, sous une atmosphère enrichie à 5% de CO2. Un contrôle positif (virus vaccinal de
préférence) est impératif pour chaque test.
La fixation des cellules se fait par le para formaldéhyde à 2%. Les Cellules sont, ensuite,
perméabilisées avec du méthanol, à -20°C. Les anticorps de chèvre IgG anti-souris
(Fluor d'Alexa, d’origine Molecular-Probes) sont préparés à une dilution au 1/200.
52
Le mélange des anticorps spécifiques de souris des trois antigènes viraux est dirigé contre
la protéine E1 (1-6), la protéine E2 (26-24) et la protéine C (2-36).
Toutes les protéines sont diluées à une dilution de 1/1000 (la dilution est faite dans la
solution d’arrêt de la réaction). Un volume de 100 µL d'anticorps fluorescents anti-souris
IgG de chèvre (Fluor d'Alexa (H + L)) est préparé à une dilution au 1/200 puis ajouté
après le lavage final par une solution au PBS.
Une solution d’iodure de propidium (0,5 à 1 µg.mL-1) est ajoutée dans le tampon. L’excès
du PBS est éliminé avec du papier filtre (Chem Wipe). La révélation est réalisée à l’aide
de 100 µL d’immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à l’isothiocyanate marqué
par la fluorescéine (FITC).
Une goutte d’huile d’émulsion (Zeiss, Axiovert BlueH 485 Filter) est déposée entre lame
et lamelle pour la visualisation microscopique. La lecture se fait dans une chambre noire
à l’aide d’un microscope à fluorescence. Le FITC absorbe à 495 nm avec un pic
d’émission à 525 nm. Les anticorps seront verts, les noyaux souillés par de l’iodure de
propidium seront rouges.
Il ne devrait y avoir aucun bruit de fond dans les puits de cellules non infectées. Le bruit
de fond, noté aux bordures des puits, ne devrait pas fausser la lecture.
III-4 DIAGNOSTIC MOLÉCULAIRE PAR RT-PCR
III-4-1 EXTRACTION DU GÉNOME VIRAL
L’ARN est extrait par deux méthodes, l’une basée sur la précipitation des acides
nucléiques à l’isopropanol, Tri-Reagents (Molecular Research Center (MRC),
Cincinnati, Ohio MRC) et l’autre utilisant le kit QIAmp Kit (Qiagen, Valencia, CA)
Un volume de 250 µL de l’échantillon est ajouté à 750 µL de la solution d’extraction du
kit. Le mélange est incubé, pendant 5 minutes. Ensuite, 0,2 mL de chloroforme est ajouté,
l’ensemble est alors centrifugé à 12 000 g, à +4oC, pendant 8 minutes. Le surnageant est
récupéré dans un eppendorf (1,5 mL) puis, après l’addition de l’isopropanol, une
incubation est réalisée, pendant 10 minutes. Puis, après une centrifugation de 12000 g, à
53
la température de +4°C, pendant 8 minutes, le culot, remis en suspension avec 1 mL
d’éthanol 75%, est centrifugé, à 7500 g et à +4°C, pendant 15 minutes. Le culot est de
nouveau récupéré 50 µL d’H2O traité au DEPC (DiEthylPyroCarbonate). L’ARN alors
extrait est, soit conservé à -80°C, soit immédiatement transcrit en ADN complémentaire
(ADNc) par transcription inverse (RT).
Dans le cas de la deuxième méthode, basée sur l’utilisation du kit QIAmp Kit, 140 µL de
l’échantillon biologique est traité avec 560 µL du tampon de lyse AVL. Après deux
lavages avec la solution tampon AW 1 (500 µL) et la solution tampon AW2 (500 µL)
puis deux centrifugations l’une à 8000 RPM (6000 g) et l’autre à 14 000 RPM (12000 g)
respectivement, l'ARN est ensuite dissous dans 60 µL du tampon d’élution AVE.
III-4-2 TRANSCRIPTION INVERSE ET AMPLIFICATION GÉNIQUE (RTPCR) DU GÉNE DE LA GLYCOPROTÉINE E1
L’amplification est réalisée en deux étapes (RT-PCR nichée). Le but de l’étape RT (Rétro
Transcription) est de transcrire l’ARN viral en ADN complémentaire (ADNc).
L’ADNc sera synthétisé, à partir de l’ARN extrait à l’aide d’un oligo (dT).
Dans la première étape, les amorces utilisées servent à amplifier le fragment de 950
nucléotides (8812- 9762) dans la région codante la glycoprotéine E1. L’amorce sens est
5’CAACACGCCGCACGGACAAC3’ RV11 nts 8812-8831 et l’amorce anti-sens est
5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTCTATACAGCAACAGGTGC3’ nts 9745-9762.
Pour chaque réaction de la première étape, un mélange, comprenant 5µL du tampon RT
10X (Invitrogen Kit), 1 µL du mélange dNTP 50X, 0,5 µL d’ARN ase inhibiteur, 25 µL
du thermo stabilisateur, 10 µL d’une solution GC-melt et 1 µL du mélange enzyme 50X,
est alors constitué. A ce mélange réactionnel, un volume de 1 à 5 µL d’ARN et un
volume de 1 µL de chaque amorce à une concentration de 45 µM sont additionnés, le
volume final, étant de 50 µL, ajusté avec de l’eau (nucléase libre).
Les paramètres des cycles de la RT, lors de la première étape, sont de 1 heure à +50°C,
de 5 minutes à +94°C, suivis de 40 cycles comportant chacun 30 secondes à +94°C, 30
54
secondes à +65°C et 2 minutes à +68°C. À la fin des 40 cycles, une étape supplémentaire,
dite d’élongation, est réalisée, pendant 7 minutes, à la température de +72°C.
Durant la deuxième étape dite étape d’amplification par PCR (Polymerase Chain
Reaction), un segment d’ADN est répliqué puis amplifié de manière spécifique. La
réplication implique deux amorces nucléotidiques situées chacune à une extrémité à
amplifier. Les amorces hybrident alors les brins opposés de la séquence matrice et sont
orientées de telle sorte que la synthèse de l’ADNc par la polymérase se fasse dans la
région génomique située entre les deux amorces. Des cycles successifs d’amplification
sont réalisés, du fait que les nouveaux brins synthétisés sont eux-mêmes complémentaires
des amorces et donc capables de s’hybrider avec elles.
Les amorces de la PCR servent à amplifier un fragment de 730 paires de bases qui
contient aussi le fragment de 601paires de bases (nts 8869-9469). L’amorce sens est
5’ACGGACAACTCGAGGTCC3’ nts 8816-8840 (EA3) et l’amorce anti-sens est
5’TGGTGTGTGTGCCATAC3’ nts 9529-9545 (765)
Pour chaque réaction de la deuxième étape, un mélange, comprenant 5µL du tampon RT
10X (Invitrogen Kit), 1 µL du mélange dNTP 50X, 0,5 µL d’ARN ase inhibiteur, 25 µL
du thermo stabilisateur, 10 µL d’une solution GC-melt et 1 µL du mélange enzyme 50X,
est alors constitué. A ce mélange réactionnel, un volume de 1 à 5 µL d’ARN et un
volume de 1 µL de chaque amorce à une concentration de 45 µM sont additionnés, le
volume final, étant de 50 µL, ajusté avec de l’eau (nucléase libre).
Les paramètres des cycles de la RT, lors de la deuxième étape, sont de 2 minutes à +94°C
suivis de 40 cycles comportant chacun 30 secondes à +94°C, 30 secondes à +65°C et 2
minutes à +68°C. À la fin des 40 cycles, une étape supplémentaire dite d’élongation est
réalisée, pendant 7 minutes, à la température de +72°C.
En plus de la PCR classique, la PCR en temps réel est utilisé, dans un but diagnostic,
pour les souches originaires de Côte d’Ivoire et d’Ouganda. Les amorces utilisées sont
pour l’amorce sens RV11 (nts 8812-8831 : 5’CAACACGCCGCACGGACAAC3’) et
pour l’amorce anti-sens RV12 (nts 8812-8997 : 5’CCACAAGCCGCGAGCAGTCA 3’).
55
Une solution, contenant 0,5 µL de chaque amorce (20µM), 12,5 µL du Syber green qPCR
Super Mix, 0,5µL de la solution Dye (Invitrogen) et 12,5 µL d’eau, est alors préparée
puis distribuée à raison de 15 µL du mélange, le volume final étant de 20 µL.
Les paramètres des cycles de la PCR, sont de 1 heure à +50°C, de 5 minutes à +94°C
suivis de 35 à 40 cycles comportant chacun 30 secondes à +94°C, 30 secondes à +65°C et
2 minutes à +68°C. À la fin des 35 cycles, une étape supplémentaire dite d’élongation est
réalisée, pendant 2 minutes, à la température de +72°C.
Toutes les réactions se font en double. Afin de tester la sensibilité de la réaction, des
concentrations différentes à 0,25 ng, à 2,5 ng et à 25 ng du produit PCR sont testées. La
fluorescence, mesurée, pendant l’élongation, permet le contrôle du produit PCR. Le
produit de la PCR à temps réel est analysé avec le logiciel ABI Prisme 7000 (Applied
Biosystems).
III-4-3 AMPLIFICATION DES PROTÉINES DE STRUCTURE C-E2-E1
Le but de l’amplification est de confirmer le nouveau génotype et donc de valider les
souches africaines (Côte d’Ivoire et Ouganda) en tant que souches types.
De même que pour le protocole utilisé lors de la RT-PCR, le fragment amplifié, dans ce
cas, contient 3186 nucléotides.
Pour amplifier la protéine C, les amorces utilisées sont pour l’amorce sens CDC#6 (nts
6428-6449 : 5’TAACCAGGTCATCACCCACCG3’) et pour l’amorce anti-sens SPR3
(nts 7480-7500 : 5’CCACCACCACCGGCATTACG3’).
Pour amplifier la glycoprotéine E1, les amorces utilisées sont pour l’amorce sens EA5
(5’AACCCCCCCGCCTATGGCGA3’ nts 8240-8259) et pour l’amorce anti-sens Rub3’
(5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTCTATACAGCAACAGGTGC3’ nts 9745-9762).
Pour amplifier la glycoprotéine E2, les amorces utilisées sont pour l’amorce sens
CDC#63 (nts 7334-7361 : 5’TTCGGTGCCCCCCAGGCCT3’) et pour l’amorce antisens EA2 (nts 9512-9528 : 5’TGGTGCGGCCATTTGCT3’).
56
III-4-4 RÉVÉLATION DES PRODUITS D’AMPLIFICATION
Les produits d’amplification sont révélés par électrophorèse, en gel d’agarose à 1,5%
contenant 0,5 mg.mL-1 de bromure d’éthidium dans un tampon Tris-Borate-EDTA (TBE),
pour déterminer les fragments ADN, en lumière ultra- violets (UV). Les témoins positifs,
les témoins négatifs et le marqueur de poids moléculaire d’ADN contenant des fragments
de longueur connue migreront à côté des échantillons amplifiés.
Dans chaque puits, un mélange de 6 µL du produit PCR et 2 µL d’une solution tampon de
charge (Loading gel, Dye X6 : 0,5 de bleu de bromophénol et 0,5 % de xylène cyanol) est
déposé. La migration électrophorétique s’effectue dans TBE 0,5X, à 110 Volts, pendant
40 minutes. Á la suite de la migration, les différents fragments amplifiés apparaissent
fluorescents, après visualisation aux UV.
III-5 SÉQUENÇAGE DU VIRUS DE LA RUBÉOLE
III-5-1 SOUCHES MAROCAINES ET LA SOUCHE D’AFRIQUE DU SUD
Pour les souches originaires du Maroc, l’amplification, par RT-PCR (Invitrogen), du
fragment de 601 nts du gène de la région codante de la glycoprotéine E1 a été
effectuée à l’aide du kit SuperScipt III. Par ailleurs, lors de la première PCR, les
amorces
utilisées
sont
pour
l’amorce
sens
RV11
(nts
8812-8831 :
5'AACACGCCGCACGGACAAC3’) et pour l’amorce anti-sens RUB3 '(nts 97459762 : 5'TATACGCAACAGGTGC3’). Pour la deuxième PCR, les amorces utilisées
sont pour l’amorce sens EA3 (nts 8816-8840 : 5'ACGGACAACTCGAGGTCC3’) et
pour l’amorce anti-sens 767 (nts 9529-9545 : 5'TGGTGTGTGTGCCATAC3’).
Pour le virus de l’Afrique du Sud, le couple d’amorces utilisées, lors de la première PCR,
est EA1 (5’CCGCCTCAAGTTCCATACAG3’nts 8721-8740) / 86
(5’ACCACACACGGTATG3’nts 9530-9545) et, lors de la deuxième PCR, RV11/EA1
(5'GGGTCAAGTTCCATACAGA3’/5’CCGCCTCAAGTTCCATACAG3’, 8721-8740)
/ (5’CCGCCTCAAGTTCCATACAG3’nts 8721-8740).
57
Pour amplifier les 601 paires de base (pb), les amorces utilisées dans le mélange
réactionnel sont EA3 (sens), SPF9 (sens) et EA2 (anti-sens).
III-5-2 AMPLIFICATION DES PROTÉINES DE STRUCTURE “SP-ORF””
Les amorces sens, utilisées, pour le séquençage des protéines de structure SP-ORF, sont :
-
SPF1 (5’TGTTTCGCCGCATCTGGTGG3’ nts 6551-6571),
-
SPF2 (5’CGCCGCCACAACAGCCTCAA3’ nts6810-6830),
-
SPF3 (5’GGGACCCTGCGCTCATGTAC3’ nts7075-7093),
-
SPF4 (5’TTCCTTGCCGGGCTCTTGCT3’ nts 7360-7380),
-
SPF5 (5’CAGGGCACTCATGTCTG3’ nts 7641-7657),
-
SPF6 (5’TGTCCACCACCGCCCAGT3’ nts7888-7904),
-
SPF7 (5’GGTCCCGTGGGTCCTGATAT3’ nts 8146-8165),
-
SPF8 (5’TGTCTCGTGCGAGGGCTTG3’ nts 8425-8434),
-
RV11 (5’CAACACGCCGCACGGACAAC3’ nts 8812-8831),
-
764 (5’ACTCCACATACGCGCTGGA3’ nts 9121-9139),
-
et, SPF10 (5’CGCCGCCCTCCTCAACA 3, nts 9418-9434.
Quant aux amorces anti-sens utilisées, pour le séquençage des protéines de structure, il
s’agit des :
-
SPR1 (5’GACGAACCTTGCCCAACCAG3’ nts 6886-6905),
-
SPR2 (5’CGGCCGTCCAACTAACATGC3’ nts 7133-7153),
-
SR3 (5’CCACCACCACCGGCATTACG3’ nts 7480-7500),
-
SPR4 (5’GCCGGGCGTGGGTCTGTTCTT3’ nts 7814-7834),
-
SPR5 (5’TTATAGTCCTGGGTGCCCTGG3’ nts 8146-8166),
-
SPR6 (5’CGCGCGACACACGGTAAGGT3’nts 8481-8500),
-
SPR7 (5’CCCACAAGTCACCACTGCCAA3’ nts 8786-8805),
-
SPR8 (5’CGCGCGGACTCTCGGATACTG3’ nts 9092-9111),
-
SPR9 (5’ACAACTCCTCCCGCCGCCACT3’ nts 9434-9457),
-
762 (5’GATATGTCGTTGTCCACGCCCCT3’ nts 9739-9762).
Pour la purification de l’ADN, un volume de 800 µL de DEPC (DiEthylPyrocarbonate),
est ajouté à chaque colonne, puis, après une agitation énergique dont le but est d’hydrater
58
le gel, l’ensemble est laissé reposer, pendant 1 heure. Les colonnes, égouttées sur un
portoir, sont, ensuite, placées dans un tube puis, centrifugées, à 750 g, pendant 3 minutes,
afin d’éliminer l’excédant d’eau.
La totalité du produit d’amplification (RT-PCR) est alors purifié sur des minicolonnes
CentriSep (Wizard® minicolonne), afin d’éliminer les amorces et les nucléotides
résiduels. La purification est réalisée sur des bandes prélevées du gel ou sur le produit
PCR. Un volume égal du tampon de purification (Binding solution) est ajouté au produit
de la PCR.
Pour chaque échantillon, une minicolonne Wizard ® est préparée. L’incubation se fait,
durant une minute, à température ambiante et la centrifugation est réalisée à 10000 g,
pendant une minute. Les colonnes sont, ensuite, lavées avec 700 µL du tampon de lavage
puis centrifugées à 10000 g, pendant une minute. L’opération de rinçage est répétée une
seconde fois, mais, avec 500 µL, à 10 000g et pendant 5 minutes.
Les minicolonnes sont transférées dans un nouveau microtube auquel sont ajoutés 50 µL
d’eau ultrapure. Une centrifugation à 10000 g, pendant une minute, est réalisée, dans le
but de récupérer le fragment d’ADN purifié. L’ADN purifié est alors conservé à -20°C,
jusqu’à son utilisation.
Le mélange réactionnel pour le séquençage est constitué de 1 µL d’ADNC purifié, 10 µL
d’eau, 8 µL de la solution Big Dye (Big Dye, Perkin-Elmer) et 1 µL de chaque amorce.
Dans les tubes, contenant le mélange réactionnel et dans lesquels les colonnes sont
placées, l’échantillon d’ADN est ajouté. L’ensemble est alors centrifugé, à 750 g, pendant
3 minutes, afin de récupérer l’échantillon d’ADN.
Le produit de la réaction est analysé par un séquenceur automatique ABI 3100 (PerkinElmer). Les séquences sont ensuite analysées par les logiciels Sequencher version 4.0 et
GCG (Accelrys) (The Genetics Computer Group Package, version 10.1).
III-5-3 LOGICIELS BIO-INFORMATIQUES
Le logiciel SequencherTM, conçu pour le Microsoft R Windows et le Macintosh, sert pour
l’analyse des séquences. Excellent outil pour importer et exporter des séquences, il
59
permet une analyse rapide et facile des séquences.
Sequencher est un logiciel de bio-informatique, produit par la société Gene Codes
Corporation (spécialisée dans la bioinformatique et l'analyse de séquence d'ADN). Ce
logiciel est destiné à générer artificiellement des portions d'ADN, appelées contigs, qui,
une fois réassemblées, formeront des fragments plus longs.
Cette application est couramment utilisée par les laboratoires pour l'étude des mutations
génétiques, du séquençage et de la détection des anomalies.
Le logiciel accepte les électrophorégrammes des différents contigs issus des séquenceurs
des gènes et, permet de les comparer les uns aux autres, afin de corriger les séquences.
L'analyse phylogénétique est effectuée par différents logiciels tels que le logiciel Bioedit
et le logiciel GCG, version 10 (Accelrys, SanDiego, CA) qui utilise le programme
‘’Maximum Parsimony’’ PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony). Les arbres
phylogénétiques sont établies par les logiciels GCG, MrBayes 3,0 (Huelsenbeck et al.,
2001) et par le programme ClustalX version 1,8, en utilisant l’algorithme NeighborJoining, Bootstrap 100 générations (ou replicates).
Le logiciel bioinformatique Group Computer Genetics (GCG) est un logiciel de la société
Accelrys. Développé à l'Université du Wisconsin, il est constitué de plus de 150
programmes permettant de manipuler et d'analyser des séquences d'acides nucléiques et
des protéines. Les bases de données actuellement disponibles sont GenBank et SwissProt.
La construction des arbres est basée sur les méthodes de parcimonie qui consistent à
trouver l'arbre qui minimise le nombre de mutations, de délétions ou d’insertions
ponctuelles pour passer d'une séquence à l'autre. C'est une méthode très lente, si l'on
génère tous les arbres possibles pour en calculer la parcimonie.
La construction des arbres se fait, également, en utilisant les méthodes de vraisemblance
qui sont, généralement, plus probabilistes. En se basant sur le taux de substitution pour
chaque élément de base (nucléotide pour des séquences d'ADN), au cours du temps,
l’estimation de la vraisemblance de la position et de la longueur des branches de l'arbre,
est possible.
60
Quant au Logiciel bioinformatique ClustalW/X, c’est un programme d'alignement
multiple pour des séquences nucléiques ou protéiques. Il détermine le meilleur
alignement possible de l'ensemble des séquences en entrée et les disposent de manière à
distinguer les identités, les similitudes et les différences entre les acides de chaque
séquence.
La construction des arbres est basée sur le critère de la distance entre les différents
génotypes. La distance entre les génotypes est constituée par le nombre de nucléotides.
Ensuite, la méthode Neighbour-Joining est utilisée, pour en déduire l'arbre. Le logiciel
génère alors un arbre phylogénétique par le menu Tree, option Draw N-J Tree
Le logiciel bioinformatique MrBayes est un programme qui, disposant d'une interface
graphique, utilise une base de donnée locale (primeurs, ARN 16s, ARN 18s) qui lui
permet de faire un alignement des séquences en fonction des structures. L’un des
avantages de ce programme est de pouvoir déplacer les gaps, visuellement, sans décaler
la séquence. De plus, il permet d'ajouter des masques sur l'alignement et de proposer des
sorties des séquences sous différents formats (Fasta, Phylip, Nexus, GeneBank).
La construction d'arbres est basée sur le maximum de vraisemblance, méthode statistique
donnant les meilleurs résultats puisqu’elle repose sur des modèles comme la méthode du
Neighbor-Joining. Le programme est également basé sur les chaînes de Markov. Il génère
les arbres comme un puzzle (mêmes modèles et calcul de vraisemblance).
IV- SÉQUENÇAGE DE TOUT LE GÉNOME (9762 NTS) DU VIRUS DE LA
RUBÉOLE : SOUCHE VACCINALE HPV77
Comme il a été déjà mentionné, la plupart des études génétiques sur le virus de la rubéole
sont réalisées par le séquençage de la totalité ou de certaines portions de la région codant
la protéine d’enveloppe E1.
Le séquençage d’autres régions du génome, pour l’épidémiologie moléculaire, est
envisagé, bien qu’aucun argument n’indique qu’il faut séquencer des régions autres que
la région E1 ou encore d’autres régions du génome du virus comme le gène codant la
glycoprotéine E2 ou la protéine de capside C ou, encore, la région non structurale. En
61
effet, la région non structurale reste difficile à séquencer vu le pourcentage élevé en GC
qui rend l’analyse difficile.
L’idée de séquencer tout le génome repose sur la confusion rencontrée, non seulement,
lors de l’analyse génétique des protéines de structure C-E2-E1 mais, aussi, pour ce qui est
de la définition de la reconnaissance du nouveau génotype.
L’analyse individuelle de la protéine de capside montre le même problème, en ce qui
concerne le groupement du génotype 1g et du génotype 1B, avec l’utilisation du fragment
601 nts du gène E1.
La décision de séquencer tout le génome permettra de résoudre alors les problèmes de
l’analyse, dans le cas de la reconnaissance des nouveaux génotypes, pour les études
ultérieures de l’épidémiologie moléculaire du virus de la rubéole.
Le choix de la souche vaccinale HPV77 est arbitraire. L’objectif essentiel consiste,
surtout, à standardiser la méthode et à choisir des amorces spécifiques pour séquencer les
gènes codant les protéines non structurales NSP-ORF. Le choix des amorces est réalisé
par le programme GCG (Genetics Computer Group), en se basant sur le pourcentage en
GC et sur la température de fusion.
La technique consiste à amplifier la région non structurale NSP-ORF et la région
structurale SP-ORF. Pour amplifier la région codant les protéines de structure SP-ORFs,
les amorces utilisées sont CDC#6 pour l’amorce sens et Rub 3’ pour l’amorce anti-sens.
Pour la région non structurale, l’amplification de 6762 nts consiste à amplifier 4 régions
différentes (Annexe 1).
Quant aux amorces, utilisées pour le séquençage du génome du virus de la rubéole,
récemment identifiées, elles viennent d’être publiées (Caidi et al., 2005).
IV-1 AMORCES POUR SÉQUENCER LA PROTÉINE NON STRUCTURALE
‘’NSP-ORF’’
Les amorces sens, utilisées, pour le séquençage de la protéine non structurale NSP-ORF,
sont :
62
-
1 F (5’CAATGGAAGCTATCGGACCTCGCTTAGGAC3’ nts 1-30),
-
Rub395 (5’GCACGCAAACTCGCCACCGCC3’ nts 395-413),
-
Rub860 (5’CACTGCGGGCACCAGGCGCGCGTG3’ nts 860-884),
-
Rub1367 (5’GAGGAGTGGGAACAGGACGC3’ nts 1367-1387),
-
Rub1763 (5’ CCGTGGCTCACCCTTGA 3’ nts 1763-1780),
-
Rub2102 (5’TTGGCACTCTCGGTGCG 3’ nts 2102-2119),
-
Rub2639 (5’CGGCGCCTCGCCCCATGCCC3’ nts 2639-2659),
-
Rub2993 (5’GCGGGGCTCGCTGCCAGGCGC 3’ nts 2993-3014),
-
Rub3583 (5’CGCGCCCTGAGCGAAGCCCGC3’ nts 3583-3604),
-
Rub4018 (5’GACGCCATGGCCCGGGCGGCC3’ nts 4018-4039),
-
Rub4643 (5’GCCCAGGGTATGAGCGTCGGC3’ nts 4643-4664),
-
Rub5167 (5’CCGCACTGCTGTGGCCCGCC3’ nts 5167-5187),
-
CDC85 (5’CCGACCGCTACGCGCGCCGCT3’ nts 5328-5351),
-
Rub5747 (5’CCCTTGCGCCGAAGACT3’ nts 5747-5762),
-
CDC14 (5’GCGCCAATCTCCACG3’ nts 6366-6380),
-
Rub7072 (5’CGCTGGGACCCTGCGCTCAT3’ nts 7072-7092).
Quant aux amorces anti-sens utilisées, pour le séquençage de la protéine non structurale
NSP-ORF, il s’agit de :
-
Rub387 (5’CGTCCTGTGGAGGCACAGTG3’ nts 387-407),
-
Rub878 (5’ GGCAACCTCCCATGAGAGTTCGGCC3’ nts 878-903),
-
Rub1119 (5’GCGTTCTTGAACTTGAACACG3’ nts 1119-1148),
-
Rub1607 (5’CTCGGCGAACAGCCACGG3’ nts 1607-1625),
-
Rub2013 (5’GGCTCGCCGAGCAAGCGCTGC3’ nts 2013-2034),
-
Rub2333 (5’GTGGCGCGGGCGGGCTGGG3’ nts 2333-2352),
-
Rub3220 (5’GCGGTCGCGCTCGAGCCAC3’ nts 3220-3239),
-
Rub3821 (5’CCTCGAGCACTACGCCCCAC3’ nts 3821-3841),
-
Rub4550 (5’GGTCGACCTGGCGGCCGTC3’ nts 4550-4571),
-
Rub5030 (5’CATGTACCGCACTTCTCGTTC3’ nts 5030-5049),
-
Rub5370 (5’AGGCTCTGGGCGGTACACA3’ nts 5370-5390),
-
Rub5666 (5’CGACCTCGATGGCGTTGGTGG3’ nts 5666-5687),
-
CDC6 (5’CGTACGCGCCCCCCAACTCC3’ nts 6821-6838),
63
-
CDC65 (5’GACGCCGTCGCATCCTCCTCCA3’ nts 7441-7459),
-
CDC64 (5’ACGGGCACGCGTGTCCCCCC3’ nts 7460-7479).
IV-2 AMORCES POUR SÉQUENCER LA RÉGION STRUCTURALE C-E2-E1
Les amorces sens, utilisées, pour le séquençage de la région structurale C-E1-E2, sont :
-
SPF1 (5’TGTTTCGCCGCATCTGGTGG3’ nts 6551-6571),
-
SPF2 (5’CGCCGCCACAACAGCCTCAA3’ nts 6810-6830),
-
SPF3 (5’GGGACCCTGCGCTCATGTA C3’ nts 7075-7093),
-
SPF4 (5’ TTCCTTGCCGGGCTCTTGCT 3’ nts 7360-7380),
-
SPF5 (5’CAGGGCACTCATGTCTG3’ nts 7641-7657),
-
SPF6 (5’TGTCCACCACCGCCCAGT3’ nts 7888-7904),
-
SPF7 (5’GGTCCCGTGGGTCCTGATAT3’ nts 8146-8165),
-
SPF8 (5’TGTCTCGTGCGAGGGCTTG3’ nts 8425-8434),
-
RV11 (5’CAACACGCCGCACGGACAAC3’ nts 8812-8831),
-
764 (5’ACTCCACATACGCGCTGGA3’ nts 9121-9139),
-
SPF10 (5’CGCCGCCCTCCTCAAC3’ nts 9418-9434).
Quant aux amorces anti-sens utilisées, pour le séquençage de la région structurale C-E1E2, il s’agit de :
-
SPR1 (5’GACGAACCTTGCCCAACCAG3’ nts 6886-6905),
-
SPR2 (5’CGGCCGTCCAACTAACATGC3’ nts 7133-7153),
-
SR3 (5’CCACCACCACCGGCATTACG3’ nts 7480-7500),
-
SPR4 (5’GCCGGGCGTGGGTCTGTTCTT3’ nts 7814-7834),
-
SPR5 (5’TTATAGTCCTGGGTGCCCTGG3’ nts 8146-8166),
-
SPR6 (5’CGCGCGACACACGGTAAGGT3’nts 8481-8500),
-
SPR7 (5’CCCACAAGTCACCACTGCCAA3’ nts 8786-8805),
-
SPR8 (5’CGCGCGGACTCTCGGATACTG3’ nts 9092-9111),
-
SPR9 (5’ACAACTCCTCCCGCCGCCACT3’ nts 9434-9457),
-
762 (5’GATATGTCGTTGTCCACGCCCCT3’ nts 9739-9762).
64
RÉ
RÉSULTATS ET DISCUSSION
65
I- SÉROPRÉVALENCE DU VIRUS DE LA RUBÉOLE CHEZ LES FEMMES EN
ÂGE DE PROCRÉER AU MAROC
Dans le but d’évaluer la séroprévalence du virus de la rubéole, chez les femmes en âge de
procréer, au Maroc, 967 sérums sont analysés, pour rechercher les immunoglobulines
IgG. Les individus ayant un titre en IgG≥8,6UI.mL-1 sont considérés comme positifs.
Parmi les résultats obtenus, 10% des sérums considérés positifs et 10% des sérums
considérés négatifs, sont, testés une seconde fois, dans le cadre du contrôle de qualité, au
laboratoire spécialisé du Centre des Maladies Infectieuses (CDC, Atlanta, USA). Les
résultats étaient en parfait accord avec les résultats rapportés par le laboratoire de
l’Institut National d’Hygiène (INH, Rabat, Maroc).
Le traitement des résultats est effectué à l’aide du logiciel informatique Epi Info 6.
L’analyse statistique est réalisée par le test χ2 de Pearson, pour déterminer l’association
entre la susceptibilité à l’infection et l’âge.
La proportion reflétée globale des femmes séropositives, âgées de 15 ans à 39 ans (toutes
tranches d’âge confondues) et, quel que soit le milieu de résidence, est de 83,5%
(806/967) (Tableau 6). Le taux des femmes ayant une sérologie en IgG négative est de
16,5% (161/967).
En prenant en considération le facteur milieu, aucune différence statistiquement
significative (test χ2, p=0,87) n’est observée, entre le taux de positivité de 85,0%
(427/502), en milieu urbain et, de 81,5% (379/465), en milieu rural (Tableau 6).
Par ailleurs, lors de l’analyse de la susceptibilité des femmes d’être infectées,
les
résultats rapportés (Tableau 6) ne montrent, en milieu rural, pas de différence statistique
entre les tranches d’âge étudiées. Cependant, en milieu urbain, une différence
statistiquement significative (p<0.0001) est mentionnée non seulement, entre les tranches
d’âge 15-19 ans et 35-39 ans mais, également, entre les tranches d’âge 15-19 ans et 30-34
ans (p<0,0001).
66
Tranche
d’âge
(ans)
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
Total
Urbain
Total
Rural
p
Total
IgG (-) (%)
IgG (+)(%)
Total
IgG (-) (%)
IgG (+) (%)
72
25
(32%)
47
(68%)
102
26
(25,5%)
76
(74,5%)
0,187
75-78
110
19
(17,3%)
91
(82,7%)
81
15
(18,6%)
66
(81,4%)
0,820
76-87
136
17
(12,5%)
119
(87,5%
120
23
(19,2%)
97
(80,8%)
0,142
79-88
105
10
(9,6 %)
95
(90,4%)
96
14
(14,6%)
82
(85,4%)
0,269
83-92
79
4
5,2%
75
(94,8%)
66
8
(12,0%)
58
(88,0%)
0,124
86-95
502
75
(14.9%)
427
(85%)
465
86
(18,4%)
379
(81,5%)
174
(17,9%
)
191
(19,7%
)
256
(26,4%
)
201
(20,7%
)
145
(14,9%
)
967
(99,9%
Tableau 6: Séroprévalence des IgG anti-rubéole chez les femmes en âge de procréer par
tranche d’âge et par milieu de résidence Maroc, 2002
Des données statistiques nationales (Tableau 7), relatant les distributions des naissances
(528553), au Maroc, en fonction de l’âge des mères, durant l’année 2003, révèlent des
pourcentages de nouveaux-nés de 9,08% (48018/528553), 23,6% (125793/528553),
25,7% (135 602/528553) , 21,9% (115 808/528553) et 14,0% (74 313/528553) provenant de
mères dont les tranches d’âge sont respectivement de 15-19 ans, 20-24 ans, 25-29 ans,
30-34 ans et 35-39 ans.
Nouveaux-nés
Groupe d’âge
(ans)
(%) nouveaux nés
Mères susceptibles (%)
susceptibles
15-19
20-24
48 014 (9,08%)
125 793 (23,70%)
28,70%
17,90%
13 780
22 516
25-29
135 602 (25,60%)
15,80%
21 425
30-34
115 808 (21,90%)
11,60%
13 433
35-39
74 313 (14,00%)
8,80%
6 539
TOTAL
77693
Tableau 7 : Nombre estimé des nouveaux-nés atteints de mères infectées, par tranche
d’âge
Par application de la distribution des naissances au pourcentage des mères susceptibles
dans chaque tranche d’âge, le nombre de nouveaux-nés susceptibles par tranche d’âge est
67
IC
alors calculé et reparti dans le tableau 7 (Annexe 4 et Annexe 5). Ainsi, 77693 nouveauxnés susceptibles naissent de mères dont l’âge varie entre 15 à 39 ans.
II- MESURE DE L’AVIDITÉ DES IgG
Cent (100) femmes enceintes se sont présentées entre 2004-2006, au Centre Hospitalier
Universitaire de Rabat (CHU), pour suspicion d’infection rubéolique, durant le premier
trimestre de leur grossesse. Les sérums sont collectés entre 20 jours à un mois qui suit la
date d’apparition de l’éruption.
Cinquante deux femmes (52%) étaient positives pour les anticorps IgM et IgG (Tableau
8). Pour différencier entre une infection récente susceptible d’infecter le fœtus et une
infection ancienne, une confirmation par le test d’avidité est effectuée.
Femmes avec
suspicion de
la rubéole
IgM(+) IgG (+)
IgM (-)IgG (+)
52
48
52%
48 %
faible
< 30%
40
76,9%
Index d’avidité (%)
Modéré
élevé
30-50%
> 50%
4
8
7,7%
15,4%
Tableau 8 : Résultats du test d’avidité des IgG chez les femmes enceintes avec suspicion
d’infection par le virus de la rubéole
Quarante femmes (76,9%) présentaient un index d’avidité inférieur à 30%, 4 femmes
(7,7%) un index d’avidité modéré compris entre 30 à 50 % et 8 femmes (15,4%) un index
d’avidité supérieur à 50% (Tableau 8).
Index d’Avidité
Nombre
Femmes
%
Âge (ans)
IgM
UI.mL-1
20 -35
> 35
p value
Faible < 30 %
Modéré 30-50%
40
4
76,9%
7,7%
> 20
> 20
31
2
9
2
<0,0001
0,479
Elevé > 50%
8
15,4%
< 15
4
4
0,309
Tableau 9: Avidité des IgG et titre des IgM sériques
Dans le cas d’une primo-infection, le taux des IgM est élevé (>20 UI.mL-1) alors que
dans le cas d’une réinfection, le taux des IgM est <15 UI.mL-1. Il s’avère que la
68
réinfection affecte aussi les femmes dont l’âge est compris entre 20 à 35 ans que celles
âgées de plus de 35 ans (Tableau 9).
III-IMMUNOFLUORESCENCE (IF)
La confirmation du résultat de la culture cellulaire se fait, systématiquement en absence
ou en présence de l’effet cytopathogène, par immunofluorescence (IF), pour la détection
des antigènes du virus dans les cellules infectées (cellules Vero).
C’est une analyse indirecte des protéines (C-E2-E1), en employant des anticorps
monoclonaux. Seuls les virus originaires d’Ouganda et de Côte d’Ivoire se sont révélés
positifs par la technique IF. La positivité est caractérisée par une fluorescence verte de la
nucléoprotéine virale (Figure10 a). Le contrôle négatif (cellules non infectées) est
présenté par les noyaux souillés par de l’iodure de propidium (couleur rouge). Le contrôle
positif utilisé est la souche sauvage FTherien (Figure 10 b).
A. Rvi/Ouganda.2001/Cellules Vero(Ouganda)
B. Rvi/NH.USA/2005 (Côte d’Ivoire)
Figure 10 a : Immunofluorescence ; souche A originaire Ouganda et souche B originaire
de Côte d’Ivoire
69
C : Contrôle Positif (FTherien)
D : Contrôle Négatif (cellules Vero non infectées)
Figure 10 b : C contrôle positif (souche sauvage FTherien) et D contrôle négatif (cellules
Vero non infectées) Gx200.
L’isolement du virus sur la lignée cellulaire comporte plusieurs inconvénients puisque sur
50 prélèvements dont la sérologie anti-IgM est positive, seules 2 souches virales (4%) ont
été confirmées positifs par l’IF. La discordance entre les résultats du test sérologique et
l’isolement sur la lignée cellulaire peut être due à des problèmes pratiques tels que :
- le conditionnement de l’échantillon biologique. En effet, le virus étant thermolabile, il
doit alors être transporté à une température de +4°C.
- la date du prélèvement par rapport au début de la maladie. Pour optimiser l’isolement du
virus, le prélèvement doit être réalisé dans un délai maximal de 2 jours, sinon le même
jour, par rapport à la date du début de l’éruption cutanée
- le délai de l’inoculation des prélèvements sur la lignée Vero ou Vero /Slam, par rapport à
la date du prélèvement. En effet, l’inoculation de l’échantillon, dans les 24 heures de son
prélèvement, permet d’augmenter les chances d’isoler le virus. De plus, la
congélation/décongélation de l’échantillon initial contribue à diminuer le titre viral.
Le test d’immunofluorescence directe reste, cependant, un test facultatif pour le
diagnostic de routine. Par ailleurs, la confirmation par l’IF est parfois utile, dans le cas
d’une forte suspicion d’infection par le virus et dans le cas où le test sérologique IgM est
négatif.
70
IV-ANALYSE MOLÉCULAIRE
IV-1 ANALYSE DES SOUCHES DU MAROC
Trente et un (31) prélèvements urinaires sont collectés, durant les épidémies de rougeole,
entre 2001 et 2005. Sept (7) sont positifs par hybridation pour un fragment de 185
nucléotides, 5 par
RT-PCR niché (Nested) pour un fragment de 601 (8869-9469)
nucléotides du gène codant la glycoprotéine E1 (Tableau 5).
L’analyse moléculaire, par les différents logiciels bioinformatiques (GCG, Bioedit),
montre que les virus sont identiques les uns aux autres, avec une identité de 99% et une
variation nucléotidique inférieure à 2%. Cependant, une variation nucléotidique de 4%
est notée, entre les souches marocaines et la souche vaccinale RA27/3.
L’analyse phylogénétique, incluant les séquences des souches marocaines et les souches
de référence reconnues par l’OMS, rapporte que les souches marocaines appartiennent au
Génotype 1E (Figure 11 et Figure 12).
Le génotype 1E, étant considéré comme un génotype international récemment émergé,
regroupe les virus des continents d’Afrique, de l’Europe, de l’Asie et de l’Amérique. Des
virus appartenant à ce génotype ont été isolés aux Etats-Unis, en Suriname, en
Allemagne, en Chine, au Canada, en Russie, au Bahamas et en Malaisie, entre 1997 et
2002.
L’analyse de l’alignement des séquences peptidiques des souches marocaines avec le
consensus 1E a révélé 17 substitutions (Figure13), la substitution de l’acide aminé à la
position E229 (Leu-Phe), E1 232 (Pro-Leu), E1 248 (His-Tyr), E1 256 (Pro-Ala), E1 260
(Arg-Gln) et les autres mutations, mentionnées en positions E1 263, E1 264, E1 265, E1
266, E1 269, E1 298, E1 335, E1 340, E1 361, E1 369, E1 373, E1 385.
La comparaison de l’alignement des séquences peptidiques des souches marocaines, avec
les 28 séquences des virus de référence, montre que 8 acides aminés sont spécifiques des
souches marocaines et n’apparaissent chez aucune autre souche (Phe229, Leu232,
Ala256, Gln260, Val264, Thr269, Gly270, Pro340) (Figure 14). Toutes les mutations
semblent être conservées.
71
1E
Clade 1
1D
1F
2B
1A
2A
1C
1A
Clade 1
1B
Figure 11: Arbre phylogénétique du virus sauvage de la rubéole en se basant sur les 601
nucléotides du gène E1. Les séquences des souches marocaines (2002-2005) ont été
comparées avec 27 souches de référence. L’arbre a été établi par le programme Clustal X
version 1.8 utilisant l’algorithme Neighbor-Joining, méthode, Bootstrap100 générations.
72
Clade 2
Clade 1
Clade 2
Clade 1
Figure 12 : Arbre Phylogénétique des séquences de la région codante E1 des virus
sauvages de la rubéole originaires d’Afrique. La comparaison est faite avec 22 virus de
référence. L’arbre est construit avec le logiciel MrBayes 3.0, 200,000 ngens. L’arbre est
construit en utilisant 601 nts (8869-9469). Les valeurs de la crédibilité (de 0,80 à 1,00)
sont marquées sur l’arbre. Les souches, provisoirement acceptées, sont colorées en bleu,
les souches Africaines en rouge et les souches vaccinales en noir avec asterix.
73
204
RV/Mor353_05
253
*--------- ---------- -----f--l- ------*--- ----------
RV/Mor386_04
*--------- ---------- ---------- ------*--- ----y-----
RV/Mor364_04
*--------- ---------- ---------- ------*--- ----------
RV/Mor33_02
*--------- ---------- ---------- ------*--- ----------
RV/Mor354_04
*---------
Consensus 1E
*VHYELHRQS AVPVGPWEPE LPRPRLGLPG LSAPFP-LLA ACGGHARASP
254
---------- ---------- ------*--- ----------
303
RV/Mor353_05
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
RV/Mor386_04
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
RV/Mor364_04
---------- ---------- ---------- ---------- ----r-----
RV/mor33_02
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
RV/Mor354_04
--a---q--r vrt--g---- ---------- ---------- ----------
Consensus 1E
APPGRRRRPP AAHCPWARRG VGHACHRLSG AQVRTPHTRW TVRPCYRRNA
304
353
RV/Mor353_05
---------- ---------- ---------- ------p--- ----------
RV/Mor386_04
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
RV/Mor364_04
---------- ---------- ---------- -a-------- ----------
RV/Mor33_02
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
RV/Mor354_04
---------- ---------- ---------- ------p--- ----------
Consensus 1E
RVDPRPHHQR PLAPTGPLGA EIQDRSPGCP ATRVSATPQC ACDRVLPVRY
354
RV/Mor353_05
403
---------- ---------r ---------- ---------- ----------
RV/Mor386_04
-------r-- ---------- ---------- ---------- ----------
RV/Mor364_04
---------- -----p---- ---------- ---------- ----------
RV/Mor33_02
---------- -----p---- ---------- -c-------- ----------
RV/Mor354_04
---------- ---------r ---------- ---------- ----------
Consensus 1E
PRAGGRPCPR GGQLPSHCQW RGCRRLPPWE VRHRRPPQHP PALPSQLRGR
Figure 13 : Comparaison de l’alignement des séquences peptidiques des souches
marocaines avec le consensus 1E.
74
Figure 14 : Alignement des séquences peptidiques des souches marocaines et des 28
souches de référence a révélé 8 AA spécifiques pour les souches marocaines (Phe229 ;
Leu232 ; Ala256 ; Glu260 ; Val264 ; Thr269, Gly270 ; Pro340).
75
IV-2 ANALYSE DES SOUCHES AFRICAINES
Vingt prélèvements ont été investigués dans cette étude. Treize aspirations nasales ont été
collectées d’Ouganda durant des épidémies de rougeole de l’année 2002. Six
prélèvements d’urine provenant de l’Afrique du Sud sont collectés durant des épidémies
de rougeole de l’année 2001, et un cas de SRC de Côte d'Ivoire provenant d’une mère
infectée dans les camps des réfugiés en New Hampshire aux États-Unis d’Amérique en
2005.
Trois prélèvements (16%) étaient positifs soit par RT-PCR niché directement du
prélèvement, soit après deux passages sur culture cellulaire (Vero et Vero/SLAM). Les
séquences obtenues ont été comparées avec 22 souches de référence.
L’analyse phylogénétique du fragment 739 nts du gène E1 a montré que la souche
d’origine d’Ouganda se groupe avec la souche isolée en Israël en 1992 (Figure 15).
Toutes les deux appartiennent au génotype provisoire 1g. Avant l’usage du nouveau
fragment 739 nts, la souche ougandaise se groupait avec les virus de génotype 1B en se
basant sur les 601 nucléotides de la région codante de la glycoprotéine E1 (Figure 11).
Le virus importé de Côte d'Ivoire appartient au même génotype. Le virus d’origine de
l’Afrique du Sud, se groupe avec ceux du génotype 2B (génotype II récemment nommé
Clade 2). Un tel génotype est qualifié comme génotype du continent Asiatique. Les virus
de ce groupe sont originaires de la Chine et de l’Inde.
Les deux souches Africaines (Rvi/UGA.20.01 et Rvi/NH.USA. 05) appartenant au
génotype 1g sont homogènes et présentent un taux de variabilité maximale de 0,86 %.
Elles sont reliées à la souche de référence originaire d’Israël (Rvi/EinVered.ISR.92).
La souche Rvi /UGA.20.01 originaire d’Ouganda se groupait avec les souches du
génotype 1B avant l’identification du nouveau génotype. Les souches du génotype 1B et
du génotype 1g présentent un taux de variabilité maximale de 0,98 % en utilisant le
Programme Bioinformatique (GCG), version 10,1.
Pour la validation du nouveau génotype 1 g ; nous avons procédé à l’analyse complète de
toute la région génomique codante pour les protéines de structure SP-ORF, C-E2-E1.
76
Figure 15: Arbre phylogénétique du virus sauvage de la rubéole en se basant sur les 739
nucléotides du gène E1. Les séquences des souches Africaines ont été comparées aux 23
souches de référence. L’arbre a été établi par le programme Clustal X version 1.8,
utilisant l’algorithme Neighbor-Joining, méthode, Bootstrap100 générations.
77
V- DÉTECTION DU VIRUS DE LA RUBÉOLE PAR AMPLIFICATION
GÉNETIQUE DES PROTÉINES DE STRUCTURE C-E2-E1.
L’amplification par RT-PCR de la séquence de 3186 nts a été réalisée sur des cultures
cellulaires des prélèvements urinaires et /ou de gorge. Les résultats ont montré que les
prélèvements sont positifs et présentent la bande correspondant au fragment attendu de
3350 nts (Figure16).
1
3350 pb
2
3
1
2
3
3350 pb
A
1 = Virus sauvage FTherien
2 = Rvi/USA.NH_05
3 = Marqueur de poids moléculaire
B
1 = Virus sauvage FTherien
2 = Rvi/UGA_01
3 = Marqueur de poids moléculaire
Figure 16: Résultats de la PCR des protéines de structure (C-E2-E1) des souches
d’origine du Côte d’Ivoire et d’Ouganda. Amplification du fragment de 3350 paires de
bases (pb).
78
V-1 ANALYSE DE L’ALIGNEMENT DES SÉQUENCES PÉPTIDIQUES DES
SOUCHES DU GÉNOTYPE 1g.
L'analyse
de l'alignement des séquences peptidiques des trois isolats des virus du
génotype 1g a indiqué quelques changements en comparaison avec le consensus du
génotype 1g (Figue 17). Leu (C9), Gly (C10), Gly(C24), Glu (C33), Lys (C86),
Gly(C87), Leu (E2, 18), Ser (E2,25), Gln (E2,50), Arg (E2,85) Thr (E2,100),
Ala(E2,111) Ser (E2,117), Ile (E2,149), Leu(E1,175), Phe (E1,282), Glu (E1,325),
Gly(E1,388), Thr (E1,400), Asp (E1,434) Val (E1,454).
L'analyse de l'alignement des séquences peptidiques de la région structurale de 37 virus
de référence a montré des acides aminés spécifiques pour les virus du Génotype 1g. Leu
(C,9), Gly (C,24), Glu (C;33), Lys (C;86), Leu (E2;18), Gln(E2;50), Thr (E2;100), Thr
(E2;111), Il (E2,195), Phe (E1;282), Glu (E1;323), Gly (E1;378), Thr (E1;390), Asp
(E1;434).
La plupart des changements des acides aminés semblent être conservés. Une mutation au
niveau du site de glycosylation NST (409-411) ; Thr (E2, 111) ; mutation du Ser au Thr
(pour la souche Ougandaise) et Ser en Ala (pour la souche d’Israël) (Figure 18).
Le site de la glycosylation se compose de 3 acides aminés dont la disposition est Asn-X
(tout acide aminé sauf Pro)-Ser/Thr.
Six sites sont connus tout le long de la région codante pour les protéines structurales CE2-E1 du VR; NAS au niveau des acides aminés, 353-355 ; NLS, 371-373 ; NST, 409411 ; NDS, 426-431 ; NGT, 658-660 ; NVT, 759-761.
79
Protéine C (Protéine de Capside)
Glycoprotéine E2
Consensus 1g
Met9 Glu10 Arg24 Gln33 Glu86 Ser87 Ser97 Pro18 Tyr25 His50 Lys85 Ala100
Rvi_uga_01
Gly Leu
His
Arg
Rvi_nh_usa_05
Gln
Thr
Rvi einvered_isr_92 Leu Gly Gly Glu
Lys
Leu
-
E2 Glycoprotein
E1 Glycoprotein
Consensus 1g
Thr111 Pro117 Thr195 Ser175 Ser282 Lys325 Ala388 Ser400 Glu434 Ala454
Rvi_uga_01
Ser
Rvi_nh_usa_05
Val
Rvi einvered_isr_92 Ala
Ile
Leu
Phe Glu
Gly
Thr
Asp
-
Figure 17 : substitution de quelques acides aminés entre les souches d’origine
d’Ouganda, (UGA-01), Israël (ISR-92) et le cas de SRC d’origine de Côte d’Ivoire en
comparaison avec le consensus 1g.
Sept substitutions au niveau de la protéine de capside C, 7 au niveau de la glycoprotéine
E2 et 8 au niveau de la protéine E1 (Figure 18). Des substitutions ont été donc retrouvées
dans les 3 protéines structurales. Ces régions de dissimilitudes au niveau de la protéine C
et de la glycoprotéine E2 peuvent mieux caractériser ces deux protéines.
80
1
50
---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- -----------------lg ---------- ---g------ --e------- ---------MASTTPITME DLQKALEAQS RALRAELAAG ASQSRRPRPP RQRDSSTSGD
MASTTPITME DLQKALEAQS RALRAELAAG ASQSRRPRPP RQRDSSTSGD
51
100
rvi_uga_20.01_1g
---------- ---------- ---------- ------g--- ------l--rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_einvered.isr_92_1g
---------- ---------- ---------- -----k---- ---------Consensus1g
DSGRDSGGPR RRRGNRGRGQ RRDWSRAPPP PEERQESRSQ TPAPKPSRAP
Consensus1B
DSGRDSGGPR RRRGNRGRGQ RRDWSRAPPP PEERQESRSQ TPAPKPSRAP
301
350
rvi_uga_20.01_1g ---------- ---------- ----h----- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------q
rvi_einvered.isr_92_1g
---------- -------l-- ---------- ---------- ---------Consensu1g GLQPRADMAA PPTPPQPPRA HGQHYGHHHH QLPFLGHDGH HGGTLRVGQH
Consensus1B GLQPRADMAA PPTLPQPPRA HGQHYGHHHH QLPFLGHDGH HGGTLRVGQH
351
400
rvi_uga_20.01_1g ---------- ---------- ---------- ----r----- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------t
rvi_einvered.isr_92_1g
---------- ---------- ---------- ---------- ---------Consensus1g HRNASDVLPG HWLQGGWGCY NLSDWHQGTH VCHTKHMDFW CVEHDRPPPA
Consensus 1B HRNASDVLPG HWLQGGWGCY NLSDWHQGTH VCHTKHMDFW CVEHDRPPPA
401
450
rvi_uga_20.01_1g ---------- ------s--- ---------- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_einvered.isr_92_1g
---------- a--------- ---------- ---------- ---------Consensus1g TPTPFTTAAN TTPAATPATV PAPCHAGLND SCGGFLSGCG PMRLRHGADT
Consensus1B TPTPLTTAAN STPAATPATA PAPCHAGLND SCGGFLSGCG PMRLRHGADT
451
500
rvi_uga_20.01_1g ---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_einvered.isr_92_1g ---------- ---------- ---------- ---------- ----i----Consensus1g RCGRLICGLS TTAQYPPTRF GCAMRWGLPP WELVVLTARP EDGWTCRGVP
Consensus1B RCGRLICGLS TTAQYPPTRF GCAMRWGLPP WELVVLTARP EDGWTCRGVP
751
800
rvi_uga_20.01_1g
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
------l--- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_einvered.isr_92_1g
---------- ---------- ---------- ---------- ---------Consensus1g
LSVAGVSCNV TTEHPFCNTP HGQLEVQVPP DPGDLVEYIM NYTGNQQSRW
851
900
rvi_uga_20.01_1g
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_einvered.isr_92_1g
---------- ---f------ ---------- ---------- ---------Consensus1g
PGPGEVWVTP VIGSQARKCG LHIRAGPYGH ATVEMPEWIH AHTTSDPWHP
901
950
rvi_uga_20.01_1g
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_einvered.isr_92_1g
------e--- ---------- ---------- ---------- ---------Consensus1g
PGPLGLKFKT VRPVVLPRAL APPRNVRVTG CYQCGTPALV EGLAPGGGNC
951
1000
rvi_uga_20.01_1g ---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_einvered.isr_92_1g
---------- ---------g ---------- -t-------- ---------Consensus1g HLTVNGEDVG AFPPGKFVTA ALLNTPPPYQ VSCGGESDRA SARVIDPAAQ
Consensus1B HLTVNGEDVG AFPPGKFVTA ALLNTPPPYQ VSCGGESDRA SARVIDPAAQ
1001
1050
rvi_uga_20.01_1g ---------- ---------- ---------- ---------- ---------rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
---------- ---------- ---------- -----v---- ---------rvi_einvered.isr_92_1g
---------- -----d---- ---------- ---------- ---------Consensus1g SFTGVVYGTH TTAVSETRQT WAEWAAAHWW QLTLGAICAL LLAGLLACCA
Consensus1B SFTGVVYGTH TTAVSETRQT WAEWAAAHWW QLTLGAICAL LLAGLLACCA
rvi_uga_20.01_1g
rvi_nh.usa_3.05_1g_crs
rvi_einvered.isr_92_1g
Consensus 1g
Consensus 1B
Protéine
de Capside C
300 AA
7 AA
La glycoprotéine E2
282 AA
7AA
La glycoprotéine E1
480 AA
8 AA
Figure 18: Alignement des séquences peptidiques des souches Africaines du nouveau génotype
1g (Ouganda et de la Côte d’Ivoire), en comparaison avec la souche isolée en Israël et en
comparaison avec le Consensus 1B et 1g.
81
Afin d’évaluer l’effet des mutations observées au niveau du site de glycosylation (E2,
111) des souches du génotype 1g, ces souches ont été testées avec le sérum des sujets
vaccinés. Les souches ont été adaptées à la lignée cellulaire Vero/Slam.
Les résultats du test de neutralisation ont montré que les deux souches sont neutralisées
par le sérum post vaccinal à un titre plus élevé (800 PFU) que celui de la souche R27/3
(200PFU). Ce qui suggère que la mutation en position E2, 111 n’affecte pas le pouvoir
neutralisant des anticorps vaccinaux.
V-2 ANALYSES PHYLOGÉNÉTIQUES
Les arbres phylogénétiques des virus de référence établis en utilisant différentes régions
du gène E1 montrent pourquoi la région 739 nucléotides a été recommandée (Figure 7).
Ce fragment contient la région codante entière des protéines C, E2 et E1 et sert de
référence pour évaluer les autres régions.
En utilisant différents logiciels pour la construction des arbres phylogénétiques, la
séquence nucléotidique 601 (8869-9469) n’a pas permis de grouper correctement les
virus 1B et 1g et le fragment 512 (8771-9282) n’a pas donné une bonne crédibilité pour
le génotype 1F. La séquence combinée 739 (8731-9469) a permis d’obtenir un
groupement correct des virus de référence du génotype 1B et 1g, et une bonne crédibilité
pour les virus du génotype 1F (Figure 15).
Les souches d’origine d’Ouganda et de Côte d’Ivoire comparées avec la souche isolée en
Israël dans les années 90 se groupent dans le nouveau génotype 1g, qui était considéré
comme provisoire par manque de souches types. Le présent travail consistait donc à
mieux identifier le nouveau génotype et de le valider par l’étude détaillée de toutes les
protéines structurales C-E2-E1 en se référant aux
recommandations de l’OMS,
Septembre 2004. L’analyse phylogénétique des souches Africaines montre une
diversification des génotypes dans le continent Africain ; avec circulation du génotype 1E
au Maroc (Afrique du Nord), génotype 2B en Afrique du Sud et le génotype 1g en
Ouganda (Afrique de l’Est) et en Côte d’Ivoire (Afrique de l’Ouest) (Figure 19).
82
Figure 19: Distribution des génotypes du VR en Afrique. Le génotype 1E est présent au
Maroc, génotype 1g en Côte d’Ivoire et Ouganda et le génotype 2B en Afrique du Sud.
Critères de définition pour reconnaître un nouveau génotype
Pour qu’un nouveau génotype soit reconnu, il doit contenir, au minimum, deux virus
soumis à une banque de gènes reconnue par l’OMS et la disponibilité des séquences de la
totalité des protéines de structure (SP-ORF) (région codant les protéines C, E2 et E1)
pour les 2 virus types de ce génotype.
De plus, l’analyse phylogénétique des virus types du nouveau génotype doit être
comparée à celle des virus de référence reconnus mondialement, ledit génotype devra
montrer que :
83
- les virus types du nouveau génotype sont regroupés séparément des autres génotypes,
avec un intervalle de confiance de 80-90%, en utilisant la méthode de Bootstraping
(Bretelles). Ce regroupement doit être retrouvé, en utilisant au moins 2 logiciels
bioinformatiques pour la construction des arbres phylogénétiques ;
- l’arbre phylogénétique, obtenue avec les séquences de la région SP-ORF des virus du
nouveau génotype et des autres virus de référence, doit être le même lors de l’analyse
individuelle des séquences codant les protéines C, E2 et E1 séparément ;
- la distance intra et inter-génique pour les virus du nouveau génotype doit correspondre à
celle des génotypes déjà existants.
En effet, l’analyse phylogénétique individuelle du gène codant la glycoprotéine E2
(Figure 21) et du gène codant la glycoprotéine E1 (Figure 22) montre un même
groupement génétique pour les souches du génotype 1 g et une séparation totale du
génotype 1B. La même conclusion est notée, lors de l’analyse phylogénétique de toute la
région C-E2-E1 (Figure 20). Par contre, pour le gène de la protéine de capside C,
l’analyse phylogénétique montre la même ambigüité que celle montrée lors de
l’utilisation
du fragment 601 nts du gène E1, c'est-à-dire que les virus des deux
genotypes 1B et 1g restent regroupés.
La confirmation de l’ensemble des résultats est confortée par l’utilisation des
logiciels « Maximum Parsimony » (Figure 23) et « Neighbor-Joining » (Figure 24), le
groupement des génotypes 1B et 1g restant encore regroupé.
84
Figure 20: Arbre phylogénétique du virus sauvage de la rubéole en se basant sur toute la
protéine structurale (C-E2-E1) SP - ORF (3186 nts). Les séquences des souches
Africaines ont été comparées aux 23 souches de référence. L’arbre a été établi par le
programme Clustal X version 1.8, utilisant l’algorithme Neighbor-Joining, méthode,
Bootstrap100 générations.
85
Figure21: Arbre phylogénétique du virus sauvage de la rubéole en se basant sur les 846
nucléotides du gène E2. Les séquences des souches Africaines ont été comparées aux 23
souches de référence. L’arbre a été établi par le programme Clustal X version 1.8,
utilisant l’algorithme Neighbor-Joining, méthode, Bootstrap100 générations.
86
Figure22: Arbre phylogénétique du virus sauvage de la rubéole en se basant sur les 1440
nucléotides du gène E1. Les séquences des souches Africaines ont été comparées aux 23
souches de référence. L’arbre a été établi par le programme Clustal X version 1.8,
utilisant l’algorithme Neighbor-Joining, méthode, Bootstrap100 générations
87
Figure23: Arbre phylogénétique des virus de la rubéole en se basant sur les 900
nucléotides du gène C. Les séquences des souches Africaines ont été comparées aux 23
souches de référence. L’arbre a été établi par le programme GCG utilisant l’algorithme
PAUP Maximum Parsimony méthode.
88
Figure24: Arbre phylogénétique du virus sauvage de la rubéole en se basant sur les 900
nucléotides du gène de capside C. Les séquences des souches Africaines ont été
comparées aux 23 souches de référence. L’arbre a été établi par le programme Clustal X
version 1.8, utilisant l’algorithme Neighbor-Joining, méthode, Bootstrap100 générations.
89
VI- GÉNOTYPAGE DU GÉNOME ENTIER DU VIRUS DE LA RUBÉOLE :
SOUCHE VACCINALE HPV77.
L’amplification a été réalisée en deux étapes. L’amplification de la région codante les
protéines structurales (PS - ORFs) de 3186 nucléotides, et l’amplification de la région
codante les protéines non structurales NSP-ORFs de 6762 nucléotides.
Vu le pourcentage élevé en GC dans la NSP-ORF, l’amplification a été réalisée sur 4
régions chevauchantes l’une par rapport à l’autre. Les résultats de la PCR sont
représentés sur la figure 25.
NSP-ORF (~6762 nts)
SP-ORF
(~3186nts)
PolyA
M
P150
M 1234 5
P90
E2
M
C
E1
1
2
M= Marqueur de poids
moléculaire
M=Marqueur
de poids
moléculaire
3000
1= 1F , Rub2013R
2700
2500
2300
2000
1= NC
2= Rub1367F, Rub3821R
3= Rub2993F, Rub5666R
2= 6F, Rub3’R
4= Rub5167F, 64R
5= NC
NSP-ORF
Figure 25 : Electrophorèse des produits PCR. Amplification de la région non
structurale (6700 nts) et de la région structurale (3186 nts) du virus. La migration est
faite sur gel d’agarose à 1.5%.
Sept virus de référence ont été utilisés pour la comparaison: RVI_Toyama.JP_67 (TO366);
RVI_Bel_63
RVI_Beijing_CHN_79
(Cen_Bel_63);
(BRDI);
RVI_Beijing_CHN_80
RVI_Con_USA_64
(FTherien);
(BRDII);
RVI_USA_64
(RA27/3). Deux souches appartiennent au génotype II ou clade, (RVI_Beijing_CHN_80
90
et la souche RVI_Beijing_CHN_79) et autres cinq souches appartiennent au génotype I
ou clade 1.
Toutes ces souches sont des souches vaccinales, les seules où les séquences de tout le
génome sont disponibles sauf pour la souche vaccinale HPV77. La souche vaccinale
HPV77 est la première souche qui était mise sur le marché aux Etats-Unis. Deux ans
après, elle a été retirée du marché vu les complications d’arthrites sévères qu’elle a causé.
Depuis, cette souche a été remplacée par la souche vaccinale Wistar R27/3.
Le séquençage de tout le génome de la souche HPV77 (Annexe 3) permettra de mieux
étudier la souche pour des études futures dans ce domaine. L’objectif principal consistait
surtout à standardiser la technique de séquençage et à désigner des amorces spécifiques
pour le séquençage de tout le génome, dans le cas de la reconnaissance d’éventuel
nouveau génotype.
Le choix des amorces a été réalisé par Le logiciel bioinformatique GCG (Genetics
Computer Group Package (Accelrys, SanDiego, CA), en se basant sur le pourcentage en
GC dans chaque région ainsi que sur la température de fusion (Tm).
L’alignement des séquences peptidiques des sept virus a montré des aa spécifiques pour
la souche HPV77 en comparaison avec le Consensus : Leu14; Arg42; Ser171; Glu299;
Tyr350; Leu429; Leu522; Gly537; Pro584; Arg596; Arg598; Gly713; Thr717; Cys718;
Arg862; Arg1129; Val1167; Cys1207; Gly1572; Ala2191; Ser2197; Arg2252; Tyr2345;
Pro2387; Met2390; His2424; Gly2425; Ser2430; His2644; Ser2667; Trp2668; Val2709;
Arg2777; Arg2779; Arg2781; Tyr2798; Phe2810; Arg3022; Tyr3123; Tyr3232.
L’analyse génétique pourra donc mieux comprendre et étudier la souche HPV77.
L’analyse génétique permettra donc de mieux comprendre et d’étudier la souche HPV77.
L’analyse phylogénétique de tout le génome et des autres régions du génome révèle un
groupement identique (Figure 26a/A) à celui rapporté par l’analyse de toute la région
codant la protéine structurale PS-ORF (Figure 26a/B) et un groupement différent si
l’intérêt se porte sur le séquençage de la région codant pour la protéine non structurale
NSP-ORF (Figure 26b/C) ou sur le séquençage du gène codant la protéine de la capside
C (Figure 26b /D).
91
A
B
Figure 26 a : Arbres phylogénétiques en se basant sur les séquences de ; A : sur la base de
tout le génome (9762 nts) ; B : sur la base des séquences de toute les protéines de structure SPORF (C-E2-E1) (3186 nts).
92
C
D
Figure 26b: Arbres phylogénétiques en se basant sur les séquences ; C : sur la base des
séquences de la protéine non structurale NSP-ORF (6700 nts) ; D : arbre construit sur la
base des 900 nts du gène de la protéine de capside C. Les arbres sont construits utilisant
PAUP ‘’Maximum Parsimony ‘’ programme.
93
DISCUSSION
I-SEROPRÉVALENCE DE LA RUBÉOLE CHEZ LES FEMMES EN AGE DE
PROCRÉER AU MAROC ET CHOIX D’UN MODELE D’UNE STRATÉGIE
VACCINALE
A-SEROPRÉVALENCE DE LA RUBÉOLE CHEZ LES FEMMES EN ÂGE DE
PROCRÉER AU MAROC
Pour documenter la rubéole, au Maroc, une étude de la séroprévalence des anticorps IgG
anti-rubéole, chez les femmes en âge de procréer et habitant le milieu rural et le milieu
urbain, a été entreprise.
Ainsi, il s’est avéré que sur un total de 967 sérums, 83,5% des femmes sont séropositives
(IgG positifs) (Tableau 5). Par ailleurs, aucune différence significative (p=0,87) n’est
observée dans les séropositivités des femmes issues du milieu rural (81,5%) et celles
issues du milieu urbain (85 %).
Lorsque l’âge des femmes est pris en considération, une différence statistiquement
significative est rapportée, uniquement en milieu urbain, entre les tranches d’âge 15-19
ans et 30-34 ans (p<0,0001) et entre les tranches d’âge 15-19 ans et 35-39 ans
(p<0,0001).
Au Maroc, plusieurs limites demeurent des obstacles pour la vaccination contre la
rubéole, chez les femmes en âge de procréer. D’abord et, d’ores et déjà, il faut prendre en
considération la non accessibilité et/ou la non proximité des centres de santé. De plus, du
moment où la vaccination contre la rubéole n'est pas exigée pour les adultes, les stratégies
à tenir pour s’assurer de l’état immunitaire des femmes restent très complexes. En outre,
puisque le vaccin de la rubéole n’était disponible que dans le secteur privé,
l'immunisation des enfants n’était, ainsi, pas acquise et les risques de transmission aux
adultes, et, donc par conséquent, aux femmes en âge de procréer, subsistent. La
conséquence immédiate est alors une augmentation des cas de SRC (Roberston et al.,
1997 ; Hinman et al., 2002).
94
Les premières données du statut immunitaire, vis-à-vis du virus de la rubéole des femmes
en âge de procréer, rapportées, à l’échelle nationale, montrent une grande susceptibilité à
l’infection chez les plus jeunes, puisque le taux de protection de 94,8% et de 88,0% est
signalé chez les femmes âgées de plus de 35 ans, respectivement en milieu urbain et en
milieu rural. Le virus circulant plus facilement dans une population plus dense, en milieu
urbain expliquerait la protection. Cependant, 17,5% des femmes étant susceptibles à
l’infection par le virus, cette dernière indique, quant à elle, un grand risque de développer
le SRC, au Maroc.
Au Maroc, 67% des naissances se produisent chez les femmes jeunes, la tranche d’âge
20-29 ans étant la tranche la plus susceptible à l’infection par le virus de la rubéole
(Direction de Population, Politique de santé de l’enfant au Maroc, 2005) (Tableau 6). Un
tel résultat aiderait, à développer une stratégie de vaccination contre la rubéole, dans le
but d’éliminer et/ou de diminuer le nombre de cas de SRC.
Par ailleurs, l’estimation du nombre de cas de SRC, au Maroc, rapportés entre 1990 et
2002, a été effectuée, en se basant, non seulement, sur les données cliniques de
l'incidence des cas de SRC, mais, également, sur les signes cliniques de l’atteinte oculaire
par la cataracte (Sharon et al., 2005). Pour essayer d’expliquer, d’une part, les cas adultes
suspects de SRC, entre 1965 et 1997 et les cas suspects de SRC mentionnés, entre 1990 et
2002, une étude a été menée, dans les deux grandes villes du Maroc (Casablanca, Rabat),
en utilisant les registres du Ministère des Handicapés et les registres médicaux des
naissances.
Ainsi, une estimation de 8,1 cas à 12,7 cas de SRC par 100 000 naissances a été notifiée
(Sharon et al., 2005) alors que des études plus anciennes rapportaient des valeurs plus
élevées comprises entre 52 à 144 cas de SRC par 100 000 naissances, en appliquant des
modèles mathématiques (Cutts et al., 1996).
C’est ainsi, qu’au Maroc, et surtout en milieu rural, la plupart des nouveaux-nés, naissant
à la maison et éloignés de toute surveillance médicale (Azelemat, 1997), sont sévèrement
affectés et difficilement recensés, surtout que des cas de SRC pouvant se manifester par
des signes non sévères, rarement déclarés (Shiff et al., 1970 ; Isacsohn et al., 1979).
95
La séroprévalence des anticorps contre le virus de la rubéole, chez les femmes en âge de
procréer, est variable et des valeurs de 96,2% (Doroudchi et al., 2001) et de 90,1%
(Dromigny et al., 2003) de séropositivité sont relevées, respectivement, en Iran et au
Sénégal.
Le plan d’action, concernant l’élimination de la rubéole et du SRC, exige,
impérativement, l'assurance d’une couverture vaccinale des enfants et des femmes en âge
de procréer (Clare et al., 2001). Cependant, les niveaux de susceptibilité ne pronostiquant
pas, nécessairement, le même risque de SRC, en raison de la variation de l’intensité de
l’infection (incidence parmi les susceptibles), de la densité de la population, de la
migration et de bien d’autres facteurs encore (Cutts et al., 1997), l'interruption de la
transmission ne sera réalisée que si un taux élevé de couverture est maintenu et une
immunisation effective de 85 % des cohortes de naissances est atteinte (Anderson et al.,
1983).
Ainsi, la prévention de l'infection par le virus de la rubéole, au Maroc, chez les femmes
enceintes n’est alors possible que par la vaccination, et, principalement, par une
vaccination de masse des jeunes filles et/ou des enfants. Une telle stratégie permettrait
d’interrompre la circulation du virus et, par conséquent, diminuerait l’incidence des cas
de SRC.
Ces données générées en 2002 et ont fait l’objet d’un rapport détaillé adressé au
Ministère de la santé, et par ailleurs, soutenu la stratégie d’inclure le vaccin de la rubéole
dans le calendrier vaccinal en 2003 chez les enfants a l’âge de la rentrée scolaire et
d’inclure très prochainement la vaccination des femmes en âge de procréer.
B- CHOIX D’UN MODELE DE STATEGIE VACCINALE
L’importance de la rubéole, du point de vue santé publique, tient à ses effets tératogènes
chez la femme enceinte. Ce n’est que, récemment, que le fardeau représenté par la rubéole,
dans les pays en développement, suscita un intérêt particulier, bien après que des études
épidémiologiques aient révélé l’émergence de cas de rubéole congénitale.
96
C’est ainsi que, l’intérêt réservé, non seulement, à la maladie, mais, aussi, à la stratégie de
la vaccination, s’est récemment accru pour différentes raisons (Cutts et al., 1997).
La couverture vaccinale des nourrissons contre la rougeole est actuellement supérieure à
80%, dans la majorité des pays en développement, ce qui prouve qu’un programme efficace
de lutte contre la rubéole est réalisable.
Par ailleurs, la rubéole survient, généralement, plus tardivement que la rougeole, ce qui
explique sa faible contagiosité. Le taux de reproduction de base (Ro) ou nombre moyen des
cas secondaires attendus, après l’introduction d’un cas dans une population totalement
réceptive, est estimé à 6 à 7 pour la rubéole contre 12 à 18 pour la rougeole (Anderson et
al., 1983).
De plus, le vaccin ROR (Rougeole-Oreillons-Rubéole) est disponible dans le secteur
privé, même dans les pays qui n’ont pas de programme national de lutte contre la maladie
(Topal et al., 1991). Il est donc impératif de revoir les principes et les stratégies de la lutte
contre la rubéole et le SRC.
La décision d'un pays pour
introduire le vaccin dépend du taux de la couverture
vaccinale contre la rougeole. Seuls, les pays ayant une couverture vaccinale élevée,
peuvent
prétendre
utiliser
les
vaccins
combinés
rougeole/rubéole
(RR)
ou
rougeole/rubéole/oreillons (ROR).
En 2002, 57% des pays (63/110) seulement ont introduit, le vaccin de la rubéole, dans
leur programme d'immunisation (Zheng et al., 2003). Au Maroc, pays comptant plus de
30 millions d’habitants, le vaccin contre la rubéole n’a été introduit dans le secteur public
qu’en 2003, chez les enfants âgé de 6 ans, dès la rentrée scolaire (PNI, Ministère de la
Santé). Une couverture vaccinale contre la rougeole supérieure à 90%, avec un statut
immunitaire de 82%, a pu être atteinte (Caidi et al., 2004).
La décision de vacciner les femmes en âge de procréer doit être précédée par des études
sérologiques afin de déterminer l'ampleur de la susceptibilité de l’infection chez les
femmes et permettre d’évaluer l’incidence des cas de SRC (Cutts et al., 1997 ; Vynnycky
et al., 1996). En effet, le taux de naissance, au Maroc, est, approximativement, estimé à
677 000. La majorité des naissances provient des femmes âgées entre 24 et 29 ans (67
97
453) en milieu urbain et chez les femmes âgées entre 20 et 24 ans (70 091) en milieu
rural (Demographic Yearbook, 2003) (Annexe 4).
De nombreux facteurs influencent le choix d’une stratégie de vaccination contre la
rubéole. La vaccination de tous les nourrissons pourrait parvenir, à éradiquer la rubéole
congénitale, dans trois à quatre décennies et la rubéole chez les petites filles, dans deux à
trois décennies (Plotkin et al., 1994). Quant à la vaccination des femmes adultes, elle
parviendrait à éradiquer la maladie, immédiatement après la vaccination, à condition que
la couverture vaccinale de 100% soit atteinte (Plotkin et al., 1994). Quelle que soit la
stratégie choisie, il est toujours important d’atteindre et de maintenir une couverture
vaccinale élevée du groupe cible.
Il est alors apparu, de part l’expérience de plusieurs pays, qu’il est essentiel d’inclure la
vaccination des femmes en âge de procréer dans toute stratégie (Fogel et al., 1979 ;
Miller et al., 1987 ; Orenstein et al., 1985). Il est, aussi, important de définir la tranche
d’âge la plus susceptible, en tenant compte du profil de fertilité spécifique du pays,
puisque ceci influencera le coût, toutes les femmes en âge de procréer devant être
considérées. Pour éviter
le risque
de vacciner les femmes enceintes, la stratégie
habituelle consiste à vacciner les femmes après leur accouchement.
Dans plusieurs pays industrialisés, la sérologie prénatale couplée à une vaccination
postnatale des femmes séronégatives s’est avérée difficile à mettre en œuvre (Miller et
al., 1987 ; Orenstein et al., 1985). Il serait plus convenable de vacciner toutes les femmes
à leur accouchement, sans sérologie préalable. Il faut comparer le coût du vaccin
supplémentaire à celui de la sérologie et la possibilité d’obtenir une couverture vaccinale
d’autant plus élevée, sans dépistage sérologique. Cependant, cette stratégie ne protègerait
pas les femmes qui attendent leur premier enfant (Cutts et al., 1997). Le vaccin devrait
donc être proposé à toutes les femmes, à l’âge de la puberté, en recourant à toutes les
occasions possibles (CDC, MMWR, 1990).
Les éventuelles stratégies vaccinales contre la rubéole présentent toutes des avantages et
des inconvénients (Tableau 10).
98
Stratégies
Avantages
Vaccination sélective des Protection directive des futures mères
adolescentes
avant la première grossesse.
Peu coûteux si les services de santé
scolaire existent déjà
Inconvénients
Pas d’effet sur la transmission de la
rubéole.
Impact sur la rubéole congénitale
différé d’au moins de 10 ans.
Poursuite de la transmission de la
rubéole parmi les enfants non vaccinés.
Vaccination sélective des
adolescentes
et
des
femmes pendant le postpartum
Vaccination sélective des
adolescentes et de toutes
les femmes en âge de
procréer
Vaccination des enfants
seulement
Combinaison
de
la
vaccination des enfants,
des écolières et de toutes
les femmes en âge de
procréer.
Campagnes de masse
pour les enfants de 1 à 14
ans et vaccination
systématique des enfants
par rougeole –brubéole
(RR) ou ROR
Campagnes de masse
pour les femmes en âge
de procréer et les enfants
de 1 à 14 ans et
vaccination systématique
des enfants par RR ou
ROR
Protection immédiate de toutes les
femmes en âge de procréer sans risque
de vaccination accidentelle pendant la
grossesse.
S’est montrée efficace (par exemple en
Australie)
Pas d’effet sur la transmission de la
rubéole.
Les femmes enceintes pour la première
fois ne sont pas touchées pendant 10 ans
Si sérologie prénatale plus vaccination
postnatale des femmes séronégatives,
couverture élevée difficile à atteindre.
Protection immédiate de toutes les Coût plus élevé de la vaccination
Nécessité des services
de conseils aux
femmes en âge de procréer.
a
S’est montrée efficace (par exemple en femmes enceintes
Israël)
En principe, une couverture élevée Protection indirecte des femmes en âge
pourrait
finalement
éliminer
la de procréer NON garantie
transmission de la rubéole
Délai très long pour obtenir un impact
visible. Stratégie non recommandée.
Impact potentiel immédiat sur la rubéole Coûteux à maintenir.
Nécessité de services
congénitale.
a de conseils aux
femmes
enceintes
A long terme, possibilité d’éliminer la
Couverture élevée difficile à obtenir
rubéole.
dans chaque groupe cible.
Interrompt
potentiellement
la Laisse un réservoir des personnes
transmission de la rubéole, au moins à réceptives plus âgées.
court terme (par exemple à Sao Paulo).
Risque de résurgence de la rubéole chez
les adolescents/adultes, donc risque de
rubéole congénitale.
Stratégie non recommandée
Si elle est mise en œuvre efficacement, Plus coûteux
peut éliminer la rubéole (par exemple à Nécessité de services de conseils aux
a
Cuba)
femmes enceintes
La transmission de la rubéole peut se
poursuivre chez les adultes masculins.
Stratégie recommandée
Tableau 10 : Avantages et inconvénients des différentes stratégies de vaccination contre
a
la rubéole (WHO/V & B/00.03). : il faut conseiller aux femmes d’éviter une grossesse
b
pendant les 3 mois qui suivent la vaccination et ne pas vacciner les femmes enceintes. :
rougeole- oreillons- rubéole
99
La vaccination sélective des adolescentes protègerait uniquement les personnes vaccinées
mais n’aurait que peu d’effet sur la transmission de la maladie. Aussi, dans les pays qui
ne peuvent pas garantir une couverture vaccinale élevée et régulière pour les enfants,
cette stratégie a l’avantage de ne pas déplacer l’âge moyen de l’infection vers l’âge de la
procréation. Elle exigerait, cependant, un taux élevé de scolarisation des filles et une
bonne liaison entre les établissements scolaires et les autorités sanitaires (Cutts et al.,
1997). Le fait que certains pays se limitent à la seule vaccination des enfants reste,
cependant, un phénomène préoccupant.
La vaccination est, actuellement, envisagée dans les programmes nationaux dans 38 %
des pays. Aussi, pour les pays qui utilisent déjà le vaccin et pour ceux qui l’envisagent,
un certain nombre de recommandations sont à prendre en considération.
La couverture vaccinale doit être rigoureusement suivie chez tous les groupes cibles.
Pour les enfants jusqu’à deux ans, il suffit d’incorporer les informations relatives à la
rubéole dans le système d’enregistrements et de mesures en place pour le programme
élargi de vaccination (PEV). Pour les petites filles en âge de la scolarité, la coopération
des autorités de santé scolaire et du ministère de l’éducation est nécessaire. Le suivi
systématique des femmes en âge de procréer étant plus difficile, il serait probablement
nécessaire d’instaurer le système du carnet de vaccination pour toute la vie, comme pour
le vaccin antitétanique (Tan, 1987).
Les pays qui ont un programme national de vaccination contre la rubéole doivent
s’assurer que leur stratégie inclut la protection des femmes en âge de procréer. La
situation locale et la capacité ou non d’atteindre une couverture vaccinale élevée
permettraient de déterminer s’il vaut mieux recourir à une campagne de masse unique ou
à une vaccination systématique des femmes en âge de procréer, avec ou sans sérologie
préalable.
Les enquêtes périodiques destinées à déterminer la prévalence des personnes handicapées
(cécité et surdité) peuvent inclure des investigations pour le SRC. Il faut, cependant,
réaliser des enquêtes chez les enfants qui survivent à une infection antérieure par le virus
de la rubéole, bien que l’incidence réelle du SRC est sous estimée puisqu’au moins 50 %
100
des enfants aveugles meurent dans les 12 mois qui suivent la naissance, dans les pays en
développement (Cohen et al., 1985). La contribution du SRC à ces anomalies peut être
évaluée, en recherchant les autres manifestations cliniques du syndrome, le résultat
restant, par ailleurs toujours sous évalué. Une comparaison des cas témoins de la
prévalence des IgG contre la rubéole peut fournir des données de confirmation. Ainsi,
chez des enfants âgés de 6 mois à 4 ans et présentant une surdité de perception, 13%
avaient des manifestations de rubéole congénitale (Peckham, 1985). Parmi ces cas, 24 %
d’entre eux avaient des IgG contre la rubéole contre 9% des témoins suggérant que 15 %
des cas de surdité étaient liés au SRC (Peckham, 1985).
Une surveillance sérologique de la réceptivité, si les ressources le permettent, est plus que
nécessaire. En effet, une surveillance sérologique longitudinale est un apport utile à la
surveillance clinique, dans le but de suivre l’impact du programme sur la réceptivité dans
les différentes tranches d’âge, surtout, chez les femmes en âge de procréer. La méthode la
plus simple consisterait à mesurer la réceptivité chez les femmes enceintes, lors de la
consultation prénatale (Chaturvedi et al., 1976) et, idéalement, à combiner cette action à
la vaccination des femmes séronégatives après leur accouchement.
Dans les pays qui aspirent à éliminer la rubéole, le suivi des modifications de la
séroprévalence, en fonction de l’âge et du sexe, apporte des éléments de base à de
nouvelles stratégies de vaccination (Intaraprasert et al., 1988). Cependant, ces modèles
sont adaptés au contexte des pays industrialisés et n’incluent pas les autres approches
possibles comme la vaccination de masse initiale dans les différentes tranches d’âge.
L’efficacité des diverses approches dans des pays en développement, comprenant des
conditions démographiques et épidémiologiques très variées, devrait être modélisée.
Il faudrait s’informer au préalable sur le coût des différentes stratégies de façon à inclure
cet élément important dans la modélisation.
En effet, avant la vaccination antirubéolique, le gouvernement devrait s’assurer qu’il
dispose des moyens aussi bien économiques que logistiques nécessaires pour appliquer, à
long terme, un tel programme de lutte contre la rubéole et la rubéole congénitale.
101
Au Maroc, le vaccin combiné (ROR) est disponible dans le secteur privé depuis des
années. L’introduction du vaccin (RR), depuis 2003, dans le programme national, est
limitée aux enfants en âge de la scolarité. Ce programme ne prend pas en considération
les femmes en âge de procréer. La diminution de l’incidence de la maladie et du nombre
des cas de SRC, au Maroc, ne serait possible que si la circulation du virus est interrompue
par une vaccination de masse des femmes en âge de procréer et des petites filles en âge
de scolarisation et une vaccination systématique des enfants par le vaccin combiné RR ou
ROR. Les femmes enceintes, durant la campagne de vaccination de masse, seront
vaccinées, après leur accouchement, avec ou sans sérologie préalable.
Seules des stratégies de vaccination bien conduites et bien ciblées, en fonction de
l’épidémiologie sur les enfants des deux sexes et sur les femmes en âge de procréer,
permettraient d’atteindre les objectifs de l’élimination du SRC.
II- LA MESURE DE L’AVIDITÉ DES IgG CHEZ LES FEMMES ENCEINTES
L’avidité des IgG est la force de liaison entre un antigène multivalent et les IgG
spécifiques correspondants. Une faible avidité correspond généralement à une infection
récente, une forte avidité correspond soit à une réinfection soit à une infection ancienne
(Picone et al., 2005). L’observation d’une séroconversion est souvent corrélée à une
infection primaire. Cependant, en ce qui concerne la sérologie de la rubéole, le seuil de
positivité des IgG (ou des anticorps totaux) varie en fonction du kit commercial utilisé. Il
est, généralement, élevé et se situe entre 10 et 15 UI.mL-1, par le test ELISA et de 25
UI.mL-1, par le test EIA (Picone et al., 2005).
L’objectif du test repose sur le diagnostic de l’infection primaire par le virus de la rubéole
susceptible d’infecter le fœtus chez la femme enceinte. En effet, à la suite d’un contage et
en présence de signes cliniques évocateurs ou lorsque les résultats des examens
systématiques invoquent une infection primaire (séroconversion, augmentation du taux
des anticorps, présence des IgM spécifiques) chez une femme enceinte, la détermination
du test d’avidité pourrait résoudre les problèmes d’interprétation chez les femmes
enceintes en présence des IgM spécifiques.
102
La synthèse des résultats de l’étude montre une avidité élevée chez les femmes les plus
âgées, ceci consignant une réinfection possible par le virus de la rubéole. Le risque de
transmission intra-utérine de virus causée par une réinfection maternelle est extrêmement
faible (suite à une vaccination ou à une infection naturelle) (Aboudy et al., 1997). Très
peu de cas de rubéole congénitale après une réinfection maternelle ont été documentés
(Thomas et al., 1992 ; Aboudy et al., 1997 ; Bottiger et Jensen, 1997).
Les données expérimentales confirment que les anticorps IgM sont, également détectés,
dans les cas d’une réinfection par le virus de la rubéole, avec une avidité élevée, mais, il
faut noter que, la détection des IgM seule, ne peut pas différencier entre une infection
primaire et une réinfection. (Gutierrez et al., 1999 ; Rasool et al., 2005).
En effet, des études antérieures sur la sensibilité et la spécificité des tests IgM ont prouvé
que, la sensibilité du test IgM, pour le diagnostic de l’infection primaire, est de 76.9%
(Tipples et al., 2004). Ainsi, la possibilité d’une réinfection, avec un taux des IgG faible,
une avidité des IgG élevée et des IgM sériques absents serait envisageable (Cusy et al.,
1993). Dans le cas d’une immunisation, suite à une infection naturelle ou après une
vaccination, les anticorps anti-IgG sont présents, l’avidité des IgG est élevée et les IgM
sont absents. (Reis et al., 2004).
Par ailleurs, l'évaluation du test IgM et du test d’avidité des IgG dans le cadre du
diagnostic différentielle entre une réaction immune primaire et une réaction secondaire au
virus de rubéole, montre que la sensibilité du test IgM par ELISA et/ou par EIA est,
respectivement, de 97.9% et de 77.4 % alors que la sensibilité du test d’avidité des IgG
du virus de la rubéole est de 100 %. Le test de l'avidité des IgG révèle des valeurs
prédicatives positives et négatives plus élevées que le test IgM EIA (Rasool et al.,
2005).
Le test de l’avidité des IgG est donc plus sensible que le test des IgM, pour différencier
entre une infection primaire et une réinfection par le virus de la rubéole. Par conséquent,
l'analyse de l’avidité des IgG, lorsque le test IgM s’avère positif chez une femme enceinte
et présentant des signes cliniques, est recommandé en tant qu’analyse complémentaire de
routine (Rasool et al., 2005).
103
L'utilisation des deux analyses est clairement reconnue comme avantageuse, et, serait
alors, préconisée, dans le cas oú le sérum est positif en IgM (Hofmann et al., 2005).
Cependant, la mesure de l’avidité des IgG n’est réellement possible que chez les patientes
immunocompétentes (Dussaix et al., 1996 ; Hedman et al., 1993).
III-CARACTÉRISATION MOLÉCULAIRE DU VIRUS DE LA RUBÉOLE
CIRCULANT AU MAROC, EN CÔTE D'IVOIRE, EN OUGANDA ET EN
AFRIQUE DU SUD
La plupart des études génétiques du virus de la rubéole ont été réalisées par le séquençage
de la totalité ou de certaines portions de la région codant la protéine d’enveloppe E1.
Actuellement, différentes régions du gène E1 sont utilisées pour la caractérisation
génétique. La région de 739 nucléotides (8731-9469) est recommandée dans les analyses
d’épidémiologie moléculaire de routine (Caidi et al., in press). Cette région est obtenue
par l’association de deux séquences couramment utilisées et désignées l’une par une
séquence de 601 nucléotides (8869-9469) et l’autre par une séquence de 512 nucléotides
(8771-9282) (Figure 7).
L'analyse phylogénétique est basée sur deux fragments nucléotidiques de la protéine E1
601 bases paires et/ou 739 bases paires (8869-9469 nts et 9731-9469 nts), l’étude ayant
commencé bien avant que la région 739 n’ait été recommandée par l’OMS.
L'analyse phylogénétique de la région 601 nts du génome a été antérieurement rapportée
pour des virus de la rubéole d’Amérique (Frey et al., 1997) et a regroupé les virus en 2
génotypes, le génotype I (récemment appelé clade 1) et le génotype II (ou clade 2). Des
variations génétiques, de 2 à 5% entre les différents génotypes du clade 1 et de 9 à 10%
entre les génotypes du clade 1 et les génotypes du clade 2, sont observées (Tableau 3).
La nouvelle terminologie permettra de mieux décrire la caractérisation génétique du virus
sauvage de la rubéole comme il a été fait pour le virus de la rougeole.
Ainsi, sept groupes intraclade, appelés ultérieurement génotypes, ont été acceptés et
conçus avec des lettres majuscules 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 2A et 2B (OMS, 2004).
104
Pour ce qui est des virus du clade 1, le génotype 1C, trouvé, lors d’une épidémie au
Japon, est supposé être un génotype importé des Etats-Unis d’Amérique, bien qu’il n’y
ait pas eu de données épidémiologiques pour appuyer l’hypothèse (Reef et al., 2004). Le
génotype 1D était présent au Canada en 1987 et aux Etats-Unis en 1988. Le génotype 1E,
identifié pour la première fois en 1997, semble être, actuellement, présent dans le monde
entier (Reef et al., 2004).
Quant aux virus du clade 2, ils ont été décelés, seulement, en Asie. Le génotype 2A, isolé,
en Chine, en 1979 et 1980, n’a pas réapparu depuis. Le génotype 2B est le génotype le
plus répandu par rapport aux autres génotypes du clade 2. Le génotype 2c, observé en
Russie, seulement, est considéré comme provisoire.
L'information, actuellement disponible, en ce qui concerne l'épidémiologie moléculaire
du virus de la rubéole, reste encore très limitée (Zheng et al., 2003 a).
Dans la plupart des pays Africains, y compris le Maroc, l’Ouganda, la Côte d'Ivoire et
l'Afrique du Sud, la rubéole demeure une maladie non contrôlée et non documentée.
L’intérêt de ce travail est de combler les lacunes en ce qui concerne l’épidémiologie
moléculaire du virus de la rubéole dans le continent Africain.
Ainsi, 50 échantillons sont collectés et analysés, de 2001 à 2005, durant des épidémies de
la rougeole au Maroc, en Ouganda et en Afrique du Sud, dont un cas de SRC originaire
de Côte d'Ivoire.
Le génome du virus de la rubéole (RV) peut être amplifié, à partir des échantillons
cliniques tels que des prélèvements nasaux pharyngés et des prélèvements urinaires. La
connaissance du génotype du virus indigène circulant au Maroc aidera, non seulement, à
décrire les voies de transmission du virus, mais, permettra, également de contribuer aux
efforts d'évaluation de l'efficacité des campagnes de vaccination futures, dans le pays.
Le génome du virus n’a été amplifié que dans 16% (8/50) des cas. Parmi les 31
échantillons originaires du Maroc, 22 (71%) d’entre eux ont été collectés deux jours
après l’éruption cutanée et les 9 (29%) autres ont été collectés quatre jours après le début
de l’éruption. Ces derniers échantillons, considérés négatifs par RT-PCR et par
hybridation, confirment qu’un retard dans le prélèvement des échantillons, destinés pour
105
l’isolement viral ou pour une analyse moléculaire, peut avoir comme conséquence la
dégradation par des nucléases (Flavia et al., 2003).
L’analyse moléculaire des souches circulant au Maroc, de 2001 à 2005, montre qu’il
n’existe qu’un seul génotype associé à la transmission épidémique du virus dans le pays.
Il s’agit du génotype 1E (Clade 1) (Figure 11). Un tel génotype est connu en tant que
génotype international. Le génotype du Maroc est identique au génotype qui circule en
Europe, ceci venant, certainement, du fait des voyages fréquents entre le Maroc et le
continent européen. Les virus des autres pays voisins d’Afrique du Nord n’étant pas
encore identifiés, il n’est pas connu si le même génotype circule aussi dans ces pays.
D'autres virus dans ledit génotype ont été isolés aux Etats-Unis d’Amérique, dans le
Suriname, en Allemagne, en Chine, en Ukraine, au Canada, aux Bahamas et en Malaisie.
Des virus du même type, originaires de Grèce et de Grande Bretagne et plus récemment
rapportés, existent, certes, mais, n'apparaissent pas sur l’arbre phylogénétique (Zheng et
al., 2003 c).
Les virus originaires d’Ouganda et de Côte d’Ivoire se regroupent dans le génotype 1g.
Le virus d’Ouganda a été considéré pendant des années comme génotype IB, génotype
contenant des virus d'Europe et d'Israël, de 1980 à 1990. Le génotype 1B et les génotypes
1C, 1D et 1F sont limités à certaines zones géographiques. Plus précisément, le génotype
1B a été trouvé en Europe et le long de la côte orientale de l’Amérique du Sud. Le
génotype 1C, quant à lui, a été isolé, en Amérique centrale et le long de la côte
occidentale de l’Amérique du Sud. Pour le génotype 1F, il a été retrouvé en Chine. Le
génotype 1D a été observé dans les pays d’Asie. D'autres virus encore proviennent de la
grande Bretagne et d’Allemagne.
Pour ce qui est des autres souches africaines, l’analyse moléculaire révèlent, dans ce cas,
que les virus des deux clades (1 et 2) circulent en Afrique. En effet, la souche originaire
de l’Afrique du Sud s’associe aux souches du génotype 2B (clade 2) (Figure 15).
L'Afrique est actuellement le troisième continent dans lequel les virus du clade 1 et du
clade 2 sont isolés.
106
En raison du nombre limité des prélèvements, et puisque c'est la première étude
moléculaire du virus de la rubéole en Afrique du sud, il n’est pas certain que le génotype
2B ait été récemment importé d'Asie en Afrique du sud ou que le génotype 2B soit un
virus indigène du pays pendant des années
Ainsi, il a été démontré que le clade 1 est largement distribué dans le monde alors que le
clade 2 est limité au continent Asiatique (Reef et al., 2000). Cette tendance a été
confirmée dans l'arbre phylogénétique, en utilisant soixante trois isolats (Frey et al.,
1997).
En outre, l’épidémiologie moléculaire mondiale de la rubéole confirme que les virus du
génotype I (clade 1) ont une grande homogénéité, avec une possibilité d’évolution, alors
que le génotype II (clade 2), ayant une très grande variation génétique, circule largement
dans le continent asiatique (Zheng et al., 2003 b).
Grouper les virus du génotype 1g et du génotype 1B est plus délicat que le regroupement
de n’importe quelle autre génotype. De plus, la région nucléotidique, précédemment
utilisée (601 nts), n’était pas suffisante pour différencier entre les deux génotypes.
Cependant, la région combinée 739 nts (601 et 512) a donné des groupements appropriés
pour le génotype 1B et le génotype 1g et une grande crédibilité de clade pour les virus qui
forment le génotype 1F.
Le seul virus de référence dans le génotype 1g a été la souche isolée en Israël (ISR_92). Il
était donc indispensable d’ajouter d’autres virus types pour confirmer l’usage du nouveau
génotype. En effet, un génotype temporaire ne sera accepté comme nouveau génotype
que si au moins trois souches se regroupent dans le même génotype, avec, cependant, la
disponibilité des séquences de la région codant les protéines de structure SP-ORF (3186
nts).
Il en est de même pour le génotype 1a. Il a été considéré comme provisoire parce que la
phylogénie de ce groupe de virus était complexe et mal comprise. En effet, le génotype
1a, fut d’abord subdivisé en plusieurs groupes puis, plus récemment, en deux groupes
selon la nouvelle nomenclature des génotypes du virus de la rubéole (MMWR, 2005).
Ainsi, il a fallu cinq virus de référence (SEL USA 97, T14CH02, MAL1MAL0, NCJP90,
107
SAI JP94), en raison de sa grande diversité. Plus fréquemment rencontré, dans le monde
entier, avant 1984, le génotype 1a, identifié au Canada, en 1985, avait pratiquement
disparu, pour réapparaître très récemment, en Mongolie et au Myanmar (Shigetaka,
2004).
En ce qui concerne le génotype 1g, il est considéré comme provisoire car, d’une part, il
ne possédait pas de virus types et que d’autre part, la relation entre le génotype 1B et le
génotype 1g n’était pas bien définie. Aussi, en appliquant différents logiciels
bioinformatiques, pour construire l’arbre phylogénétique, la région 601 nts ne donnait pas
de résultats concordants, bien que ce fragment reste efficace pour regrouper les autres
virus des génotypes 1C, 1D, 1E, 1F, 2A, 2B, ou 2c.
De la même manière, l’application des logiciels bioinformatiques, dans la construction de
l’arbre phylogénétique, montrait que le fragment de 512 nts s’avérait faible pour
identifier le nouveau génotype 1F.
Ainsi, pour valider l’usage du nouveau génotype 1g, la région de 3186 nucléotides codant
pour les protéines structurales SP-ORF (C-E2-E1) a été analysée pour le virus d’Ouganda
et le virus de la Côte d’Ivoire. La comparaison a été faite avec le virus originaire
d’Israël.
En effet, lors de l’analyse phylogénétique de la région structurale C-E2-E1 des souches
du génotype 1g, il a été constaté que l’analyse individuelle du gène E2 (Figure 21), du
gène E1 (Figure 22) et de toute la région codant pour les protéines structurales SP-ORF
(C-E2-E1) (Figure 20) donnait le même regroupement génétique et que le génotypes 1B
et le génotype 1g se regroupent séparément et forment donc deux génotypes
distincts comme il a été démontrée avec la région 739 nts du gène E1 (Figure 15).
Cependant, l’analyse phylogénétique de la protéine de la capside C (Figures 23, Figure
24) a montré le problème déjà rencontré lors de l’utilisation du fragment 601 nts du gène
E1. Ainsi, le génotype 1B et le génotype 1g se regroupent dans un autre et seul génotype
1B/1g mais non identifié comme étant un génotype 1B et/ou un génotype 1g. Des études
moléculaires antérieures ont montré la même difficulté, lors de la désignation et la
reconnaissance des autres génotypes.
108
L’utilisation des différents programmes, pour la construction de l’arbre phylogénétique
(Figures 23, Figure 24), le regroupement du génotype 1g et du génotype 1B, en se
réalisant, posait la même confusion. Ceci s’explique par le pourcentage élevé en GC qui
rendait l’analyse difficile (Lee et al., 2002 ; Takkinen et al., 1988).
Il serait alors évident, pour un diagnostic moléculaire de routine, soit de se limiter, au
séquençage de la région 739 nts du gène E1 et de confirmer l’usage du nouveau génotype
par le séquençage de la région codant pour les protéines de structure C-E2-E1 soit, au
séquençage d’autres régions dans le génome. Ce qui a conduit à penser à séquencer tout
le génome du virus lorsque les résultats du séquençage des différentes régions du génome
donnent des résultats discordants.
En effet, l’analyse phylogénétique des séquences de tout le génome du virus et des autres
régions du génome a donné des regroupements différents. L’arbre phylogénétique de tout
le génome (Figure 26aA) a donné un regroupement identique au regroupement obtenu
lors de l’analyse de toute la région codant pour les protéines de structure C-E2-E1 (Figure
26aB). Ainsi, un regroupement différent est observé, selon qu’il s’agisse du séquençage
de la région de la protéine non structurale (NSP-ORF) (Figure 26bC) ou du séquençage
du gène codant la protéine de capside C (Figure 26bD).
Lors de l’identification des nouveaux génotypes du virus de la rubéole, au lieu d’essayer
à chaque fois qu’un nouveau génotype apparaît, de choisir un fragment d’un gène ou
d’un autre, il serait donc préférable de séquencer tout le génome.
En effet, le séquençage du fragment 512 nts (8771-9282) du gène codant pour la
glycoprotéine E1 était largement utilisé pour l’analyse moléculaire de routine du virus de
la rubéole, jusqu’à l’apparition du génotype 1F. Après, il s’est avéré que ce fragment
n’était pas suffisant pour séparer le génotype 1F des autres génotypes. C’est ainsi, qu’il a
alors été décidé de remplacer la région de 512 nts (8871-9282) par la région 601 nts
(8869-9469) nts toujours du gène codant E1. Après l’apparition du nouveau génotype 1g,
les 601 nts ne permettaient pas de regrouper le génotype 1g et le génotype 1B.
109
Cette étude a permis également de mieux identifier les différentes protéines de structure
(SP-ORF) du virus de la rubéole. Vingt acides aminés, trouvés le long de la protéine CE2-E1, sont considérés comme spécifiques pour le génotype 1g. Vingt acides aminés est
la taille normale du peptide synthétique pour la production d'anticorps chez les animaux.
Si un tel peptide est considéré spécifique pour les virus du génotype 1g, les anticorps
seraient utilisés par le Western Blot. Ainsi, les souches seraient mieux caractérisées
comme différentes du point de vue antigénique.
En outre, la protéine C et la protéine E2 contiennent aussi des régions d’une grande
dissimilitude au niveau de SP-ORF du virus de la rubéole du génotype 1g, 7 substitutions
dans la protéine de capside C, 8 dans la glycoprotéine E2 et 7 dans la glycoprotéine E1.
Les régions de dissimilitude dans la glycoprotéine E2 contribueraient aux différences
spécifiques d'immunogénicité. En effet, l’utilisation des anticorps monoclonaux ont
localisé des régions à activité hémagglutinante et des virus neutralisant aussi bien dans
dan la glycoprotéine E1 et dans la glycoprotéine E2 (Cordoba et al., 1997 ; Cordoba et
al., 2000a). Cependant, le rôle biologique de la glycoprotéine E2 n'est pas encore bien
défini bien que des épitopes spécifiques et probablement au moins
un domaine
neutralisant lui ont été rapporté (Law et al., 2001 ; Cordoba et al., 2000a).
110
CONCLUSION GÉNÉRALE
111
CONCLUSION GÉNÉRALE
La rubéole est une infection virale bénigne survenant généralement dans l’enfance.
Cependant, lorsque la femme contracte la maladie, au cours des premiers mois de la
grossesse, le fœtus peut présenter à la naissance des malformations congénitales sévères
connues sous le nom du syndrome de la rubéole congénitale (SRC). Seules des stratégies
de vaccination, bien conduites et ciblées, aussi bien sur les enfants que sur les femmes en
âge de procréer, permettront d’atteindre les objectifs d’élimination du SRC.
Afin de déterminer la susceptibilité de la rubéole chez les femmes en âge de procréer, au
Maroc, 967 échantillons sont testés pour rechercher les immunoglobulines G (IgG)
spécifiques du virus de la rubéole (VR). Ainsi, 83,5 % des femmes sont séropositives
(IgG positifs). La grande susceptibilité à l’infection par le virus chez ces femmes indique
un grand risque au SRC.
Dans le but de réduire le nombre des cas de rougeole et d’adhérer à l’initiative de
l’élimination de la rougeole et du contrôle de la rubéole lancée par l’OMS, le PNI
(Programme National d’Immunisation) a introduit, en octobre 2003, une deuxième dose
du vaccin combiné (Rougeole /Rubéole) chez les enfants en âge de scolarisation. La
vaccination, en procurant un faible coût marginal et une simplification de la gestion du
programme, reste d’efficacité incertaine, puisqu’elle n’inclut pas les femmes en âge de
procréer qui représentent le groupe à risque pour l’infection.
L’immunisation, induite par une infection naturelle ou par une vaccination, entraîne
l’apparition d’une immunité qui semble persister durant toute la vie. Toutefois, cette
immunité est relative et non absolue, puisqu’une réinfection possible peut être mal
interprétée, d’un point de vue clinique, chez une femme enceinte.
Pour différencier entre une infection primaire susceptible d’infecter le fœtus et une
réinfection, un test d’avidité (IA) des IgG est effectué sur 100 femmes enceintes ayant
une suspicion d’infection. Ainsi, 52% des femmes sont positives en IgM et IgG, 76,9%
d’entre elles présentent un IA faible (< à30%), 7,6% un IA modéré (30 à 50 %) et 15,4%
112
un IA élevé (> à 50). Le test de l’avidité des IgG, révélant des valeurs prédicatives plus
élevées que le test IgM EIA, est recommandé en tant qu’analyse complémentaire de
routine.
L’analyse moléculaire des souches de la rubéole circulant, au Maroc, de 2001 à 2005,
montre que le génotype 1E, associé à la transmission épidémique du virus, est reconnu
comme génotype international. Les souches ougandaises et ivoiriennes se regroupent
parmi le génotype 1g alors que la souche originaire de l’Afrique du Sud se regroupe avec
les souches du génotype 2B. Ces données permettront de combler les lacunes concernant
l’étude épidémiologique moléculaire du virus de la rubéole dans le continent africain.
La caractérisation moléculaire du nouveau génotype 1g, réalisée pour la première fois, est
effectuée par séquençage de la région (3186 nucléotides) codant pour les protéines
structurales SP-ORFs (C-E2-E1). La comparaison est faite avec
le virus originaire
d’Israël, pour valider l’usage des souches du génotype 1g.
Lors de l’identification des nouveaux génotypes du virus de la rubéole, il serait évident,
pour un diagnostic moléculaire de routine, soit, de se limiter, au séquençage de la région
739 nts du gène E1 et de confirmer l’usage du nouveau génotype par le séquençage de la
région codant pour les protéines de structure C-E2-E1 soit, au séquençage de tout le
génome.
113
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ABOUDY, Y., FOGEL, A., BARNEA, B., MENDELSON, E., YOSEF, L., FRANK, T.,
SHALEV, E. (1997). Subclinical rubella reinfection during pregnancy followed by
transmission of virus to the fetus. J. Infect. 3 4(3):273-6.
ANDERSON, RM., MAY, RM. (1983). Vaccination against rubella and measles:
quantitative investigations of different policies, J Hyg Camb 90, p. 259-325.
ANDERSON, R.M., MAY, RM. (1991). Infectious diseases of humans: dynamics and
control. Oxford, Oxford University Press.
ANTIA, AU. (1974). Congenital heart disease in Nigeria. Archives of disease in
childhood, 49: 36-39
AZELMAT, M. (1997). National Survey on Mother and Child Health (PAPCHILD).
Studies and Health Information Service, Directorate of planning and finances, Ministry of
Health of Morocco, Arab League Project to Promote the Child, Arab league, Cairo,
Egypt, 1999.
AXTON, JHM., NATHOO, KJ., MBENGERANWA, OL. (1979). Simultaneous rubella
and measles epidemics in an African community. Central African journal of medicine,
25(11):242-245.
BAKSHI, Saroj., COOPER., S. L.Z. (1990). Pediatric vaccination: Update. Rubella and
mumps vaccines. Pediat Clin N Amer, 37, p.651-668.
BART, KJ., ORENSTEIN, WA., PREBLUD, SR., HINMAN, AR., LEWIS, JR FL.,
WILLIAMS, NM. (1985). Elimination of rubella and congenital rubella from the United
States. Pediatric Infect Dis; 4:14--21.
BART, KJ., ORENSTEIN, WA., HINMAN, AR. (1986). The virtual elimination of rubella
and mumps from the United States and the use of combined measles, mumps and rubella
vaccines (MMR) to eliminate measles. Dev. Biol. Stand.; 65:45-52
BENENSON, A.S. (1990). Control of Communicable Disease in Man, Washington, DC,
American Public Health Association.
BERKELEY, MI., MOFFAT, D., RUSSELL, L (1991). Surveillance of antibody of rubella
virus in Grampian: closing the immunity gap. Br Med J, p. 1174-1176.
BEST, JM. (1991). Rubella vaccines: past, present and future. Epidemiol Infect.107p.17-
30.
BIENVENU Anne-Lise., DELECROIX Elisabeth. (2004). La rubéole en 2004.DES de
Bactériologie Virologie Hygiene. Faculté de Médecine, Paris VII.
BOLOGNESE, RJ. (1973). Evaluation of possible transplacental infection with rubella
vaccination during pregnancy. Am. J. Obstet .Gynecol 117:939-4.
BOSMA, TJ., BEST, JM., CORBETT, KM., BANATVALA, JE., STARKEY, WG. (1996).
Nucleotide sequence analysis of a major antigenic domain of the E1 glycoprotein of 22
rubella virus isolates. Gen Virol; 77:2523-30.
BOTTIGER B and JENSEN IP. (1997). Maturation of rubella IgG avidity over time after
acute rubella infection. Clin Diagn Virol. Aug; 8(2):105-11.
BOUVET E. (1986). Rougeole, rubéole et oreillons : données épidémiologiques
mondiales et prophylaxie. Immunol Méd; 14 : 12-8.
BURGESS, MA. (1992). Rubella Re-infection what risk to the fetus. Med J Aust;
156:824-5.
CAIDI, H., BENNIS, F., MOUAN, N., EL AOUAD, R. (2004). Evaluation of the response
to vaccination against poliomyelitis and measles vaccines in malnourished children in
Morocco. Mediterranean Health Journal Vol, 10, N0 415.
Centre for Disease Control and Prevention. (1998). Measles-Mumps and Rubella vaccine
use and strategies for elimination of Measles, Rubella, and Congenital rubella syndrome
and control of Mumps. Recommendation of the Advisory Committee of Immunization.
Practices (CCIP). Morbid.Mortal.Wkly.Rep. 47, RR-8
Centre for Disease Control and Prevention. (1994). Rubella and Congenital rubella
syndrome-Unites States, January 1, 1991-May 7, MMWR 43, p.391-401.
Centre for Disease Control and Prevention. (1990). Rubella prevention:
recommendations of the Immunization practices Advisory Committee (ACIP). Morbidity
and Mortality Weekly Report. 9 (RR-15):1-18.
Centre for Disease Control and Prevention. (1985). Current Trends Elimination of
Rubella and Congenital Rubella Syndrome, United States MMWR, February 08, / 34(5);
65-6.
CHARBONNEAU, Suzanne and DE WALS Philippe. (1997). Programme d’élimination de
la rubéole au Québec. ISBN 2-550-32486-2
CHATURVEDI, UC., TRIPATHI, BN., MATHUR, A., SINGH, UK., MEHROTRA, RM.
(1976). Role of rubella in congenital malformations in India. Journal of hygiene
(Cambridge), 76:33-40.
CHERNESKY, M.A. (1995). Rubella virus. Dans Manual of clinical microbiology, 6ème
Edition. Washington, ASM Press.
CLARE, A., DYKEWICZ, Deanna Kruszon-Moran., GERALDINE, MCQUILLAN, M.,
WALTER, W.W. (2001). Rubella Seropositivity in the United States, 1988-1994. Clinical
Infectious Disease; 33:1279-86
CLARKE, M., SCHILD, GC., BOUSTRED, J., MCGREGOR, IA., WILLIAMS K. (1980).
Epidemiological studies of rubella virus in a tropical African community. Bulletin of the
World Health Organization, 58:931-935.
CLAUS, S., HOFMANN, J., UBERLA, K., LIEBERT, UG. (2006). Rubella virus
pseudotypes and a cell-cell fusion assay as tools for functional analysis of the rubella
virus E2 and E1 envelope glycoproteins. J. Gen. Virol. Oct; 87. 3029-37.
COCHI, SL., EDMONDS, LD., DYER, K. (1989). Congenital rubella syndrome in the
United States, 1970-1985. Amer. Journal. Epidemiol, 129, p.349-361.
COCKBURN, WC. (1969). World aspects of the epidemiology of rubella. American
Journal of Diseases of Children, 118: 112-122.
COHEN, N. (1985). Prevalence and determinants of nutritional blindness in Bangladeshi
children. World health statistics quarterly; 38:317-330.
COOPER, L.Z., PREBLUD, S.R., ALFORD, JR C.A. (1995). Rubella In: Infectious
Diseases of the fetus and newborn infant. Remington J.S and Klein J.O (Eds) WB
Saunders Company, pp.268-311. Rev. Inf. .Dis. Suppl 1, S2-S10 1985.
COORAY, S., WARRENER, L., JIN, L. (2006). Improved RT-PCR for diagnosis and
epidemiological surveillance of rubella. J.Clin.Virol. 35(1):73-80
CORDOBA, P., GRUTADAURIA, S., CUFFINI, C., ZAPATA, M. (2000ª). Neutralizing
monoclonal antibodies to the E1 glycoprotein epitope of rubella virus mediates virus
arrest in Vero cells. Viral Immunol; 13(1): 83-92
CORDOBA, P., ALEJANDRA, Lanoel., SERGIO, Grutaduria, and ZAPATA Marta,.
(2000b). Evaluation of Antibodies against a Rubella Virus Neutralizing Domain for
Determination of Immune Status. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Nov.
p.964-966.
CORDOBA, P., SERGIO, Grutadaura., CUFFINI, Cecilla., ZAPATA, Marta. (1997).
Presence of a Neutralizing Domain in Isolates of Rubella Virus in Cordoba, Argentina.
Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, July, p. 493-495
COTE, TR., SIVERTSON, D., HORAN, JM., LINDEGREN, ML., DWYER, DM. (1993).
Evaluation of a two-dose measles mumps and rubella vaccination schedule in a cohort of
college athlete. Publ Health Rep, 108, p. 431-435.
CRADOCK, Watson. (1991). Laboratory diagnosis of rubella: past, present and future.
Epidemiology and Infection. 107:1-5
CUSI, MG., VALENSIN, PE., CELLESI, C. (1993). Possibility of reinfection after
immunization with RA27/3 live attenuated rubella virus. Arch. Virol.129(1-4):337-40.
CUSI, MG., VALASSIN M., BIANCHI, S., WUNNER, W., VALENSIN, PE. (1995).
Evaluation of rubella virus E2 and C proteins in protection against rubella virus in a
mouse model. Virus Res. 37:199.
CUTTS, FT., VYNNYCKY, E. (1996). Modelling the incidence of congenital rubella
syndrome in developing countries. Int J Epidemiol; 28:1176-84
CUTTS, FT., ROBERSTON, SE., DIAZ-ORTEGA, JL., SAMUEL, R. (1997). Control of
rubella and congenital rubella syndrome (CRS) in developing countries, Part 1: Burden of
disease from CRS. Bull World Health Organization; 75:55-68
DAS, BD., LAKHANI, P., KURTZ, JB., HUNTER, N., WATSON, BE., CARTWRIGHT,
KA., CAUL, EO., ROOME, AP. (1990). Congenital rubella after previous maternal
immunity. Arch. Dis. Child; 65, p.545-546.
DOROUDCHI, M., SAMSAMI, A., DEHAGHAN, Emad., K and GHADERI, AA. (2001).
Seroepidemiological survey of rubella immunity among three populations in Shiraz,
Islamic Republic of Iran. Bull of Mediterranean Health Eastern Region Vol 7.N=1/2.
DUDGEON, JA. (1986). A global view of immunization tactics and strategies for the
control of rubella. In: Gruenbera EM, Lewis C, Goldston S, eds. vaccinating against brain
syndromes: the camping against measles and rubella. London, Oxford University press.
140-157.
DROMIGNY, JA., NABETH, P., and PERRIER, Gros Claude. (2003). Evaluation of the
Seroprevalence of rubella in the region of Dakar (Senegal). Tropical Medicine &
International Health Vol 8 issue 8 page 704-August.
DUSSAIX, E., CHANTOT, S., HARZIC, M., GRANGEOT-KEROS, L. (1996). CMV-IgG
avidity
and
CMV-IgM
concentration
in
both
immunocompromised
and
immunocompetent patients. Pathol Biol; 44:405-10
EXPANDED PROGRAMME ON IMMUNIZATION. (1994). Rubella outbreak, Oman.
Weekly epidemiological record, 347:1694, 69 (45): 333 33.6
EVANS, MR. (1995). Children who miss immunization: implications for eliminating
measles. BMJ. May 27; 310(6991):1367-8
FALL, M., KUAKUVI, N., DIADHIOU, F., MARTIN, LS. (1975). Rubéole congénitale (à
propos d’un cas observé au CHU de Dakar). Bulletin de la société médicale d’Afrique
noire de langue Française, 20(4) :404-410.
FAYE, A., EGGERDING, JULIUS, Peters., RICHARD, K., LEE and CLARK, B. (1991).
Detection of Rubella Virus Gene Sequences by Enzymatic Amplification and Direct
Sequencing of Amplified DNA. Journal of Clinical Microbiology, May, p .945-952.
FLAVIA, F. Donadio., MARILADA, SIQUEIRA, M., ANDREW, Vyse., LI, Jin.,
SOLANGE, A.Oliveira. (2003). The genomic analysis of rubella virus detected from
outbreak and sporadic cases in Rio de Janeiro state, Brazil. Journal of Clinical Virology
27. 205-209.
FIELDS, Bernard. (1996). Ed. Fields Virology 3
rd
edition. Philadelphia: Lippincott-
Raven Publishers. 1: 1177-1313, 899-931.
FOGEL, A., GERICHTER, CB., HANDSHER, R., BERNHOLTZ-BARNEA, B.(1979). The
impact of rubella epidemics on pregnant women, proof for the necessity of pre-marital
screening and vaccination. Developments in biological standardization, 43:349-353.
FOGEL, A., GERICHTER, CB., BARNEA, B., HANDSHER, R., HEEGER, E. (1978).
Response to experimental challenge in persons immunized with different rubella
vaccines, J. Pediatric, 92, p, 26-29.
FOSTER, A. (1988). Childhood blindness. Eye, 2(suppl): S27-S36.
FREY, TK. (1997). Neurological aspects of rubella virus infection. Intervirology. 40(23):167-75.
FREY, TK. (1994). Molecular biology of rubella virus. Adv Virus. Res; 44: 69–160.
FREY, Teryl K., ABERNATHY, Emily., BOSMA, Trent., et al. (1998). Molecular Analysis
of Rubella Virus Epidemiology across Three Continents, North America, Europe and
Asia 1961-1997. Journal of Infectious Disease; 178:642-50.
FURESZ, J., VARUGHESE, P., ACRES, SE. (1985). Rubella immunization strategies in
Canada. Rev Infect Dis; 7(Suppl.1):S191-193.
GUERIN, Nicole. (2000). Actualités
sur les vaccins Rougeole, Rubéole et Oreillons.
Revue Française des Laboratoires, octobre, No 326.
GERSHON, A.A. (1995). Rubella virus. G.L. Mandell 4ème Ed, Principles and practice of
infectious diseases, New York, Churchill Livingstone. Groupe d'étude canadien sur
l'examen médical périodique.
GOLD, Eli. 1996. Almost extinct Diseases: Measles, mumps, rubella, and pertussis.
Pediatrics in Review. American Academy of Pediatrics., 17: 120-125.
GREEN, M., DORSETT, P.H. (1986). Rubella virus antigens: localization of epitopes
involved in hemagglutination and neutralization by using monoclonal antibodies. J. Virol.
57, 893.
GUNASEKERA, DP., GUNASEKERA, PC. (1996). Rubella immunization-learning from
developed countries. Lancet, 347:1694-1695.
GUTIERREZ, J., RODRIGUEZ, MJ., ORY, F.D., PIEDROLA, G., MAROTO, MC.
(1999). Reliability of low-avidity IgG and of IgA in the diagnosis of primary infection by
rubella virus with adaptation of a commercial test. J. Clin. Lab. Anal. 13, 1–4.
HEDMAN, K., LAPPALAINEN, M., SODERLUND, M., HEDMAN, L. (1993). Avidity of
IgG in serodiagnosis of infectious diseases. Rev Med Microbiol; 4:123–9.
HOBMAN, TC., LUNDSTROM, ML., MAURACHER, CA., WOODWARD, L., GILLAM,
S., FARQUHAR, MG. (1994). Assembly of rubella virus structural proteins into virus-like
particles in transfected cells. Virology. 1994 Aug 1; 202(2):574-85.
HOFMANN, J., LIEBERT, UG. (2005). Significance of avidity and immunoblot analysis
for rubella IgM positive samples in pregnant women. Journal of Virological Methods
130, 66-71.
HOFMAN, Renz., MEYER, M S., VON HAESELER, A., LIEBERT, U.G. (2003).
Phylogenetic analysis of rubella virus including new genotype I isolate. Virus Research
96, 123-128.
HINMAN, AR., IRONS, B., LEWIS, M and Kandola K. (2001). Economic analyses of
rubella and rubella vaccine: a global review. Bull World Health Organization 2002;
80:264-70
HUELSENBECK, JP., RONQUIST, F.
2001. MRBAYES: Bayesian inference of
phylogenetic trees. Bioinformatics 2001; 17(8): 754-5.
HURAUX, JM., NICOLAS, JC., AGUT, H and PEIGUE-LAFEUILLE, H. (2003). Traité
de Virologie Médicale Editions ESTEM .Virus de la rubéole.
ICENOGLE, Joseph and BELLINI, William. (2003). Measles and Rubella viruses.
Manual of Clinical Microbiology 8th Edition, P 1396.
INGRAND, Didier, (2003). Diagnostic anténatal des infections rubéoliques. Revue
Française des laboratoires, Mai; N0 =353.
INTARAPRASERT,
S.,
PRASERTSAWAT,
PO.,
PHIROMSAWAT,
S.
(1988).
Postpartum rubella immunization: Ramathibodi experience in March-April 1986. Journal
of the Medical Association of Thailand, 71 (suppl.1):94-97.
ISACSOHN, M., NISHMI, M., SWARTZ, TA. (1979). Rubella in Jeruzalem.2. Clinical
and Serological finding in children with congenital rubella syndrome. Isr J Med Sci;
15:17-22.
JIANSHENG, Y and SHIRELY, G. (1999). Mutational analysis, using a Full-Length
Rubella virus cDNA clone, of Rubella virus E1 transmembrane and cytoplasmic domains
required for virus release. J. Virol. P.4622-4630.
JIA –YEE, L., DOROTHY, H and SHIRLEY, G. (1996). Dimerization of rubella Virus
Capsid Protein is not required for Virus Particle Formation. Virology 216, 227. N=0051
JONVILLE-BERA, AP., AUTRET, E., GALY-EYRAUD, C., HESSEL, L. (1996). Aseptic
meningitis following mumps vaccine. A retrospective survey by the French Regional
Pharmacovigilance
centers
and
by
Pasteur-Merieux
Serums
&
Vaccins.
Pharmacoepidemiol Drug Saf. Jan; 5(1):33-7.
KOPENHAGER, T., KORT, H., BLOCH, B. (1996). An analysis of the first 200 legal
abortions at the Johannesburg General Hospital. South African medical journal, 1978, 27
may: 858-860.
LAW, LM., DUNCAN, R., ESMAILI A., NAKHASI, HL., HOBMAN, TC. (2001). Rubella
virus E2 signal peptide is required for perinuclear localization of Capsid protein and virus
assembly. Journal of Virology, 75. 1979.
LILIANE, Grangeot-Keros. (2005). Les difficultés d’interprétation de la sérologie de la
rubéole. Revue Française des laboratoires, Mars, N0 371.
LIU, Z., YANQ, D., QIU, Z., LIM, KT., CHONQ, P., GILLAM, S. (1996). Identification of
domains in rubella virus genomic RNA and Capsid protein necessary for specific
interaction. J. Virology. April; 70 (4): 2184-90.
LOKMAN, J., CAROLINA, S., WEN-PIN, T., MATTHEW, R., DAVID, T., KREY, K and
HOBMAN, C. (2006). Analyses of phosphorylation Events in Rubella Virus Capsid
Protein: Role in Early Replication Events. J. Virol. P.6917-6925
LOZZI, L., RUSTICI, M., CORTI, M., CUSI, M.G., VALENSIN, P.E., BRACCI, L.,
CANTUCCI, A., LINDEGREN, ML., FEHRS, LJ., HADLER, SC., HINMAN, AR. (1991).
Update: Rubella and Congenital Rubella Syndrome, 1980-1990. Epidemiol Rev, 13,
p.341-348.
MACPHERSON, B., HOLBOROW, CA. (1985). A study of deafness in West Africa: The
Gambian hearing health project. International Journal of pediatric otorhinolaryngology,
10:115-135.
MASELLE,
SY.,
HAUKENES, G., RUTAHINDURWA,
A.
(1988). Preliminary
observations on rubella infection in Tanzania and the challenge for its control. East
African medical journal, 65(5): 319-324.
MASSAD, E., BURATTINI, MN., DE AZEVEDO NETO, RS., YANG, HM., COUTINHO,
FA., ZANETTA, DM. (1994). A model-based design of a vaccination strategy against
rubella in a non-immunized community of Sao Paulo State, Brazil. Epidemiology and
infection, 112:579-594.
MERRER, J., PERIN-DUREAU, F., APPERE, C., PALMER, P., SANTOLLI, F., DE
JONGHE, B. (1999). Formes sévères d’encéphalites au décours d’une infection
rubéoliques : arguments pour une meilleure couverture vaccinale. Presse Med. 298, 395397.
MEERA, Ramanujam., HOFMANN, Jorg., HIRA, L., NAKHASI, Chintamani., ATREYA,
D. (2001). Effect of site-directed Asparagine to isoleucine substitutions at the N-linked
E1 glycosylation sites on rubella virus viability. Virus Research 81, 151–156.
MILLER, E., WAIGHT, PA., VURDIEN, JE., WHITE, JM., JONES, G., MILLER, BH.,
TOOKEY, PA., PECKHAM, CS. (1991). Rubella surveillance to December 1990: a joint
report from the PHLS and National Congenital Rubella Surveillance Programme. CDR
(Lond. Engl. Rev). Mar 29; 1(4):R33-7.
MILLER, E. (1990). Rubella reinfection. Arch Dis Childhood, 65, p. 820-821.
MILLER, E., CRADOCK-WATSON, JL., POLLOCK, TM. (1982). Consequences of
confirmed maternal rubella at successive stages of pregnancy. Lancet, 2:781-784.
MILLER, CL., MILLER, E., WAIGHT, PA. (1987). Rubella susceptibility and the
continuing risk of infection in pregnancy. British Medical Journal, 294:1277-1278.
MITCHELL, L. Ann. 1999. Identification of rubella virus T-cell epitopes recognized in
anamnestic response to RA27/3 vaccine: associations with boost in neutralizing antibody
titer. Vaccine, 17: 2356-2365.
MIN-HSIN, Chen and ICENOGLE, Joseph. (2004). Rubella Capsid Protein Modulates
Viral Genome Replication and Virus Infectivity. Journal of Virology. Apr, p.4314-4322.
MORGAN- CAPNER, P., MILLER, E., VURDIEN, JE., RAMSAY, MEB.
(1991).
Outcome of pregnancy after maternal reinfection with rubella. Commun Dis Rep; 1:R57R59.
MORGAN-CAPNER, P. (1989). Diagnosing rubella May be difficult in patients without
symptoms. Br Med J, 299, p. 338-339.
NEJMI, S., NAZIH, A., OMRI, B. (1972). Enquête immunologue sur la rubéole chez la
femme Marocaine de la région de Rabat. Maroc Med; 52: 420–25.
NEJMI, S., L’KASSMI, H. (2003). Profil immunitaire de la femme Marocaine vis-à-vis de
la rubéole et de la toxoplasmose: Enquête Immunologique sur la rubéole chez la femme
Marocaine de la région de Rabat et de Meknès. Meknès, Morocco: Proc of the Fifth
National Congress of Neonatology, Oct 20–22, 2000: 77–80.
NURAY, Oksuz Kanbur., ORHAN, Derman., TEZAE, Kutluk. (2003). Age Specific
Rubella Seroprevalence of an Unvaccinated Population of Adolescents in Ankara, Turkey
Jpn.J.infect.Dis, 56, 23, 25,
OBIAKO, MN. (1987). Profound childhood deafness in Nigeria: a three year survey. Ear
and hearing, 8: 74-77
ORENSTEIN, WA., BART, KJ., HINMAN, AR., PREBLUD, SR., GREAVES, WL.,
DOSTER, SW., STETLER, HC., SIROTKIN, B. (1984). The opportunity and obligation to
eliminate rubella from the United States. Journal of the American Medical Association,
251:1988-1994.
ORENSTEIN, WA., PREBLUD, SR., BART KJ, HINMAN AR. (1985). Methods of
assessing the impact of congenital rubella infection. Reviews of infectious diseases, 7
(suppl.1): S22-S28.
O'SHEA, S., BEST, JM., BANATVALA, JE. (1983). Viraemia, virus excretion and
antibody responses after challenge to volunteers with low levels of antibody to rubella
virus. Infect Dis, 148, p.639-647.
PECKHAM, C. 1985. Congenital rubella in the United Kingdom before 1970: the
prevaccine era. Reviews of infectious diseases, 7(suppl.1); S11-S16.
PICONE, O., GRANGEOT-KEROS, L. (2005). Rubéole et grossesse. EMC- Gynécologie
Obstétrique
PLOTKIN, SA. (1994). Rubella vaccine. In: Plotkin SA, Mortimer EA, eds. Vaccine, 2
nd
edition. London, W.B. Saunders.
PLOTKIN, Stanley A., ORENSTEIN, WALTER, A.
(1998). Vaccines. 3rd edition.
Philadelphia: W.B. Saunders Company. 222-293, 409-441 and 508-531.
PLOTKIN, SA. (1999). Rubella vaccine. In: Vaccines. 3rd Edition. Ed Plotkin-Orenstein,
Saunders Company, Philadelphia: 409-439).
RASOOL, Hamkar., SMAYEH, Jalilvand., TALAT, Mokhtari., KERAMAT, Nouri et al.
(2005). Assessment of IgM enzyme immunoassay and IgG avidity assay for
distinguishing between primary and secondary immune response to rubella vaccine.
Journal of Virological Methods 130. 59-65.
RAY C (1993). Rubéole. In "Principes de Médecine Interne" TR Harrison. Ed Médecine
Sciences Flammarion: 707-709.
REBIÈRE, I., JACOB, S. (1995). Infections rubéoleuses en cours de grossesse et rubéoles
congénitales confirmées au laboratoire, Réseau Rénarub. Réseau National de Santé
Publique, Saint-Maurice.
REEF, SE., REDD, SB., ABERNATHY, E., ZIMMERMAN, L., ICENOGLE, JP. (2006).
The epidemiological profile of rubella and congenital rubella syndrome in the United
States, 1998-2004: the evidence for absence of endemic transmission. Clin Infect Dis.
Nov 1; 43 Suppl 3:S126-32
REEF, Susan., FREY, Tery., THEALL, K., ABERNATHY, Emily., ICENOGLE, J and
WHARSTON, Melinda. (2002). The Changing Epidemiology of Rubella in the 1990s. On
the Verge of Elimination and New Challenges for Control and Prevention. JAMA,
January 23/30, vol287, No.4
REEF, SE., PLOTKIN, S., CORDERO, JF et al. (2000). Preparing for elimination of
congenital rubella syndrome (CRS): summary of a workshop on CRS elimination in the
Unites States. Clin. Inf. Dis; 31:85-95.
REEF, SE. (1998). Rubella and congenital rubella syndrome. Bull World Health Organ.
76 Suppl 2:156-7.
REIS, M.M., TESSARO, M.M., CRUZ, Silva., GIORDANO, S. A. and AZEVEDO, P.A.
(2004). Avidity of IgG for Rubella: An Evaluation of the Need for Implementation
at the Materno-Infantil Presidente Vargas Hospital in Porto Alegre, Rio Grande do Sul,
Brazil. BJID; 8.
ROBERT-GNANSIA, E. (2004). Syndrome de la rubéole congénitale. Encyclopédie
Orphanet.
ROBERTON, Susan., FEATHERSTONE, David., GACIC-DOBO, Marta and BRADLEY,
S. Hersh. (2003). Rubella and congenital rubella syndrome: global update.Rev Panam
Salud Publica/Pan Am J public health 14(5).
ROBINSON, Karen., MOSTRATOS, Richard., GRENCIS, K. (1995). Generation of
rubella virus-neutralizing antibodies by vaccination with synthetic peptides. FEMS
Immunology and Medical Microbiology 10, 191-198.
ROBINSON, JL., LEE, BE., PREIKSAITIS, JK.,
PLITT, S., TIPPLES, GA. (2006).
Prevention of congenital rubella syndrome--what makes sense in 2006? Epidemiol Rev.
2006; 28:81-7. Epub. Jun 14.
ROSENTHAL, S and CHEN, R. (1995). The reporting sensitivities of two passive
surveillance systems for vaccine adverse events. Am J Public Health. 85(12):1706-9.
RUDOLPH, AJ., DESMOND, MM. (1972). Clinical manifestations of the Congenital
Rubella syndrome. Int Ophthalmol Clin; 12:3-19.
ROBERSTON, SE., CUTTS, FT., SAMUEL, R., DIAZ-ORTEGA, JL. (1997). Control of
rubella and congenital rubella syndrome (CRS) in developing countries, Part 2:
Vaccination against rubella. Bull World Health Organization; 75:66-80.
ROBINSON, J., LEMAY, M., VAUDRY, W. (1994). Congenital rubella after anticipated
maternal immunity: Two cases and a review of the literature. Pediatr Infect Dis J, 13, p.
812-815.
SACHDEVA, R. (1973). Congenital rubella syndrome at Mombasa. East African Journal,.
50(3): 146-152.).
SCHLUTER, WW., REEF, SE., REDD, SC., DYKEWICZ, CA.(1998). Changing
epidemiology of congenital rubella syndrome in the United States. J Infect Dis. Sep;
178(3):636-41
SCHWARZER, Simone. 1997. Safety and characterization of the immune response
engendered by two combined measles, mumps, and rubella vaccines. Vaccine. 16: 298304.
SHARON, Bloom., RGUIG, Ahmed., BERRAHO, Amina., ZNIBER, Layla et al. (2005).
Congenital rubella syndrome burden in Morocco: a rapid retrospective assessment.
Lancet; 365:135-41.
SHIFF, GM., SUTHERLAND, J., LIGHT, I. 1970. Congenital Rubella Syndrome In:
Thalhammer O, ed. perinatal infections. Proc Int Symp Vienna. Stuttgart: George Thieme
Verlag, 31-36.
SHIGETAKA, Katow. (2004). Molecular epidemiology of rubella virus in Asia: Utility
for reduction in the burden of disease due to congenital rubella syndrome. Pediatrics
International. 46, 207-213.
SHIGETAKA, Katow., HIROKO, Minahara., MASSO, Fukushima. (1997). Molecular
Epidemiology of Rubella by Sequences of the Rubella Virus E1 Gene in Three East
Asian Countries. The journal of Infectious Diseases; 176:602-16.
SHIGETAKA, Katow., HIROKO, Minahar., TAEKO, Ota MASSAO, Fukushima. (1997).
Identification of strain-specific nucleotide sequences and E1 and NS4 genes of rubella
virus vaccine strains in Japan. Vaccine; volume 15 Number 14.
SOLDANI, P., SPREAFICO, A., NERI, P. (1990). Structure of rubella E1 glycoprotein
epitopes established by multiple peptide synthesis. Arch. Virol. 110, 271.
SIX, C., BOURAOUI, L., LEVY-BRUHL, D. (2003). La rubéole chez la femme enceinte et
le nouveau-né en France métropolitaine : les données 2001 du réseau Rénarub BEH, N, 2.
SMITHELLS, R. (1990). Congenital rubella in Great Britain 1971-1988. Health trends,
22(2):73-76.
TAKKINEN, K., VIDRGREN, J., KSTRAND, E., HELLMAN, U., TALKKINEN, C.,
WERNSTEDT, Pettersson, RF. (1988). Nucleotide sequence of the rubella virus protein
gene reveals an unusually high G/C content. Journal of General Virology. Vol 69, 603612.
TAN, KL. (1987). Intra-uterine infections. Annals of the Academy of Medicine,
Singapore. 16(4):707-712.
THOMAS, HI., MORGAN-CAPNER, P.
(1991). Rubella Specific IgG1 avidity: a
comparison of methods. J. Viol. Meth. 31:219-228.
THOMAS, HI., MORGAN-CAPNER, P., ENDERS, G., O'SHEA, S., CALDICOTT, D.,
BEST, JM. (1992). Persistence of specific IgM and low avidity specific IgG1 following
primary rubella. J. Viol. Meth. 39: 149-155.
TIPPLES, G., HAMKAR, R., MOHKTARI-AZAD, T., GRAY, M., BALL, J., HEAD, C.,
RATNAM, S. (2004). Evaluation of rubella IgM enzyme immunoassays. J. Clin. Virol.
30, 233–238.
TOOKEY, PA., PECKHAM, CS. (1999). Surveillance of congenital rubella in Great
Britain, 1971-96. BMJ. Mar 20; 318(7186):769-70.
TOPAL, B., KANRA, G., CEYHAN, M. (1991). Serological evaluation of 52 children
immunized with the combined measles, mumps and rubella vaccine. Turkish journal of
pediatrics, 33:13-18.
TOYODA, Mika. (1999). Expression of interleukin-2 receptor a and CD45RO antigen on
T lymphocytes cultured with rubella virus antigen, compared with humoral immunity in
rubella vaccinees. Vaccine. 17: 2051-2058.
TRENT, J. Bosma., KAREN, M., CORBETT, Siobhan., O’SHEA, Jangue., BANATVALA,
Jennifer., BEST, M. (1995). PCR for detection of rubella virus RNA in clinical samples.
Journal of Clinical Microbiology, May, p.1075-1079.
TZENG, Wen-Pin., FREY, Teryl K. (2005). Rubella virus protein modulation of viral
genomic and subgenomic RNA synthesis. Virology; Vol 337; n0=2.
VACCINE SAFETY COMMITTEE, INSTITUTE OF MEDECINE. (1991). Adverse
effects of Pertussis and rubella vaccines, Washington, D.C, National academy Press.
Vaccine.
VYNNYCKY, E., GAY, NJ., CUTTS, FT. (2003). The predicted impact of private sector
MMR vaccination on the burden of Congenital Rubella Syndrome. Vaccine. Jun 20;
21(21-22):2708-19.
VYSE, AJ., JIN, L. (2002). An RT-PCR assay for detection of rubella virus genome in
salivia samples. Mol. Cell. Probes; 16 (2): 93-97.
WAXHAM, M.N., WOLINSKY, J.S. (1985). Detailed immunological analysis of the
structural polypeptides of rubella virus using monoclonal antibodies. Virology 143, 153.
WEIBEL, RE., BENOR, DE. (1996). Chronic arthropathy and musculoskeletal symptoms
associated with rubella vaccines. A review of 124 claims submitted to the National
Vaccine Injury Compensation Program. Arthritis Rheum. Sep; 39(9):1529-34.
WOLINSKY, J.S. (1996). Rubella. In: Fields Knipe, BN., Howley, DM., Chanock, PM.,
Menick, RM and Roizman, B. Virology 3nd. Philadelphia, Pa: Lipincott -Raven: 899929.
ZHENG, Du-Ping., HONG, Zhu., REVELLO, Maria G., GIUSEPPE, Gerna and FREY,
Teryl. (2003 a). Phylogenetic Analysis of Rubella Virus Isolated during a Period of
Epidemic Transmission in Italy, 1991-1997. JID.187
ZENG, Du-Ping., ZHOU, Y.M., ZHAO, K., HAN, Y and Teryl, K.Frey. (2003 b).
Characterization of genotype II Rubella virus strains. Archives of Virology 148:18351850.
ZHENG, Du-Ping., TERY, K. Frey., ICENOGLE, Joseph., SHIGETAKA, Katow.,
ABERNATHY, Emily., KI-JOON, Song., WEN-BO, Xu. (2003 c). Global Distribution of
Rubella Virus Genotypes. Emerging Infectious Diseases. Vol 9, No.12. December.
ANNEXES
Annexe 1: carte génétique du virus de la rubéole avec les séquences des amorces utilisées
dans cette étude et dans d’autres études.
CDC#1 (SwaI)
CDC#21/#114 (HIII + SP6);
CDC#22 (HIII+T7)
CDC#28(AflII+T7)
*
*
*
CDC49
CDC19
A*
*
*
*
*
*1caatggaagctatcggacctcgcttaggactcccattcccATGGAGAAgCTCCTAGATGAGGTTCTTGCCCCCGGTGGGCCTTATAACTTAAC
CGTCGGC
M
E
K
L
L
D
E
V
L
A
P
G
G
P
Y
N
L
T
V
G
Rub90F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
101AGTTGGGTAAGAGACCACGTCCGATCAATTGTCGAGGGCGCGTGGGAAGTGCGCGATGTTGTTACCGCTGCCCAAAAGCGGGCCATCGTAGCCGTGATAC
S
VCDC50
R D
W
H
V
R
S
I
V
E
G
A
W
E
V
R
D
V
V
T
A
A
Q
K
R
A
I
V
A
V
I
P
Rub264
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
201CCAGACCTGTGTTCACGCAGATGCAGGTCAGTGATCACCCAGCACTCCACGCAATTTCGCGGTATACCCGCCGCCATTGGATCGAGTGGGGCCCTAAAGA
R
P
V
F
T
Q
M
Q
V
S
D
H
P
A
L
H
A
I
S
R
Y
T
R
R
H
W
I
E
W
G
P
K
E
Rub385
F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
301AGCCCTACACGTCCTCATCGACCCAAGCCCGGGCCTGCTCCGCGAGGTCGCTCGCGTTGAGCGCCGCTGGGTCGCACTGTGCCTCCACAGGACGGCACGC
A
L
H
V
L
I
D
P
S
P
G
L
L
R
E
V
A
R
V
E
R
R
W
V
A
L
C
L
H
R
T
A
R
Rub395
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
401AAACTCGCCACCGCCCTGGCCGAGACGGCCgGCGAGGCGTGGCACGCTGACTACGTGTGCGCGCTGCGTGGCGCACCGAGCGGCCCCTTCTACGTCCACC
K
L
A
T
A
L
A
E
T
A
S
E
A
W
H
A
D
Y
V
C
A
L
R
G
A
P
S
G
P
F
Y
V
H
P
CDC27
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CTGAGGACGTCCCGCACGGCGGTCGCGCCGTGGCGGACAGATGCTTGCTCTACTACACACCCATGCAGATGTGCGAGCTGATGCGTACCATTGACGCCAC
E
D
P CDC51
H G
V
G
R
A
V
A
D
R
C
L
L
Y
Y
T
P
M
Q
M
C
MRub607
R T
E
I
D
A
T
CDC75
CDC76
*
*
*
*
G
AAT
*
*
*
*
*
CCTGCTCGTGGCGGTTGACTTGTGGCCGGTCGCCCTTGCGGCCCACGTCGGCGACGACTGGGACGACCTGGGCATTGCCTGGCATCTCGACCATGACGGC
L
L
V
A
V
D
L
W
P
V
A
L
A
A
H
V
G
D
D
W
D
D
L
G
I
A
W
H
L
D
H
D
G
CDC133
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGTTGCCCCGCCGATTGCCGCGGAGCCGGCGCTGGGCCCACGCCCGGCTACACCCGCCCCTGCACCACACGCATtTACCAAGTCCTGCCGGACACCGCCC
G
C
P
A
D
C
R
G
A
G
A
G
P
T
P
G
Y
T
R
P
C
T
T
R
I
Y
Q
V
L
P
D
T
A
H
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ACCCCGGGCGCCTCTACCGGTGCGGGCCCCGCCTGTGGACGCGCGATTGCGCCGTGGCCGAACTCTCATGGGAGGTTGCCCAACACTGCGGGCACCAGGC
P
G
R
L
Y
R
C
G
P
R
L
W
T
R
D
C
A
V
A
E
L
S
W
E
V
A
Q
H
C
G
H
Q
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCGCGTGCGCGCCGTGCGATGCACCCTCCCTATCCGCCACGTGCGCAGCCTCCAACCCAGCGCGCGGGTCCGACTCCCGGACCTCGTCCATCTCGCCGAG
R
V
R
A
V
R
C
T
L
P
I
R
H
V
R
S
L
Q
P
S
A
R
V
R
L
P
D
L
V
H
L
A
E
CDC30
Rub1086
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GTGGGCCGGTGGCGGTGGTTCAGCCTCCCCCGCCCCGTGTTCCAGCGCATGCTGTCCTACTGCAAGACCCTGAGCCCCGACGCGTACTACAGCGAGCGCG
V
G
R
W
R
W
F
S
L
P
R
P
V
F
Q
R
M
L
S
Y
C
K
T
L
S
P
D
A
Y
Y CDC33
S E
R
V
Rub1132
F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TGTTCAAGTTCAAGAACGCCCTGaGCCACAGCATCACGCTCGCGGGCAATGTGCTGCAAGAGGGGTGGAAGGGCACGTGCGCCGAGGAAGACGCGCTGTG
F
K
F
K
N
A
L
C
H
S
I
T
L
A
G
N
V
L
Q
E
G
W
K
G
T
C
A
E
E
D
A
L
C
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCATACGTAGCCTTCCGCGCGTGGCAGTCTAACGCCAGGTTGGCGGGGATTATGAAAGGCGCGAAGcgcTGCGCCGCCGACTCTTTGAGCGTGGCCGGC
A
Y
V
A
F
R
A
W
Q
S
N
A
R
L
A
G
I
M
K
G
A
K
R
C
A
A
D
S
L
S
V
A
G
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TGGCTGGACACCATTTGGGACGCCATTAAGCGGTTCtTCGGTAGCGTGCCCCTCGCCGAGCGCATGGAGGAGTGGGAACAGGACGCCGCGGTCGCCGCCT
W
L
D
T
I
W
D
A
I
K
R
F
L
G
S
V
P
L
A
E
R
M
E
E
W
E
Q
D
A
A
V
A
A
F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TCGACCGCGGCCCCCTCGAGGACGGCGGGCGCCACTTGGACACCGTGCAACCCCCAAAATCGCCGCCCCGCCCTGAGATCGCCGCGACCTGGATCGTCCA
D
R
G
P
L
E
D
G
G
R
H
L
D
T
V
Q
P
P
K
S
P
P
R
P
E
I
A
A
T
W
I
V
H
CDC23
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
1601CGCAGCCAGCGcAGACCGCCATTGCGCGTGCGCTCCCCGCTGCGACGTCCCGCGCGAACGTCCTTCCGCGCCCGCCGGCCcGCCGGATGACGAGGCGCTC
A
A
S
E
D
R
H
C
A
C
A
P
AA
CDC117
R
C
V
P
R
CDC116
E
R
P
S
A
P
A
G
Q
P
D
D
E
A
L
CDC110 (Not I +HA)
CDC132(NotI + cMyc)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ATCCCGCCGTGGCTGTTCGCCGAGCGCCGTGCCCTCCGCTGCCGCGAGTGGGATTTCGAGGCTCTCCGCGCGCGCGCCGATACGGCGGCCGCGtCCGCCC
I
P
P
W
L
F
A
E
R
R
A
L
R
C
R
E
W
D
F
E
A
L
R
A
R
A
D
T
A
A
CDC119
A
P
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCtGGCTCCcCGCCCCGCGCGGTACCCCACCGTGCTCTACCGCCACCCCGCCCACCACGGCCCGTGGCTCACCCTTGACGAGCCGGGCGAGGCTGACGC
PCDC118
A P
R
P
A
R
Y
P
T
V
L
Y
R
H
P
A
H
H
G
P
W
L
T
L
D
E
P
G
E
A
D
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGCCCTGGTCTTATGCGACCCACTTGGCCAGCCGCTCCGGGGCCCTGAACGCCACTTCGCCGCCGGCGCGCATATGTGCGCGCAGGCGCGGGGGCTCCAG
A
L
V
L
C
D
P
L
G
Q
P
L
R
G
P
E
R
H
Rub1845
F
A
A
G
A
H
M
C
A
Q
A
R
G
L
Q
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCTTTTGTCCGTGTCGTGCCTCCACCCGAGCGCCCCTGGGCCGACGGGGGCGCCAGAGCGTGGGCGAAGTTCTTCCGCGGCTGCGCCTGGGCGCAGCGCT
A
F
R V V P P P E R P W A D G G A R A W A K F F R G C A W A Q R L
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TGCTCGGCGAGCCAGCAGTTATGCACCTCCCATACACCGATGGCGACGTGCCACAGCTGATCGCACTGGCTTTGCGCACGCTGGCCCAACAGGGGGCCGC
L
V
G
E
P
A
V
M
H
L
P
Y
T
D
G
D
V
P
Q
L
I
A
L
A
L
R
T
L
A
Q
Q
G
A
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CTTGGCACTCTCGGTGCGTGACCTGCCCGGGGGTGCAGCGTTCGACGCAAACGCGGTCACCGCCGCCGTGCGCGCTGGCCCCCGCCAGTCCGCGGCCGCG
L
A
L
S
V
R
D
L
P
G
G
A
A
F
D
A
N
A
V
T
A
A
V
R
A
G
P
R
Q
S
A
A
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TCACCGCCACCCGGCGACCCCCCGCCGCCGCGCCGCGCACGGCGATCGCAACGGCACTCGGACGCTCGCGGCACTCCGCCCCCCGCGCCTGCGCGCGACC
S
P
P
P
G
D
P
P
P
P
R
R
A
R
R
S
Q
R
H
S
D
A
R
Rub2255R
G
T P
P
P
A
P
A
R
D
P
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCCGCCGCCCGCCCCCAGCCCGCCCGCGCCACCCCGCGCTGGTGACCCGGTCCCTCCCATTCCCGCGGGGCCGGCGGATCGCGCGCGTGACGCCGAGCT
P
P
P
A
P
S
P
P
A
P
P
R
A
G
D CDC24
P V
P
P
I
P
A
G
P
A
D
R
A
R
D
A
E
L
Rub2450
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGAGGTCGCCTGCGAGCCGAGCGGCCCCCCCACGTCAACCAGGGCAGACCCAGACAGCGACATCGTTGAAAGTTACGCCCGCGCCGCCGGACCCGTGCAC
E
V
A
C
E
P
S
G
P
P
T
S
T
R
A
D
P
D
S
D
I
V
E
S
Y
A
R
A
A
G
P
V
H
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CTCCGAGTCCGCGACATCATGGACCCACCGCCCGGCTGCAAGGTCGTGGTCAACGCCGCCAACGAGGGGCTACTGGCCGGCTCTGGCGTGTGCGGTGCCA
L
R
V
R
D
I
M
D
P
P
P
G
C
K
V
V
V
N
A
A
N
E
G
L
L
A
G
S
VRub2603R
C G
G
A
I
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TCTTTGCCAACGCCACGGCGGCCCTCGCTGCAAACTGCCGGCGCCTCGCCCCATGCCCCACCGGCGAGGCAGTGGCGACACCCGGCCACGGCTGCGGGTA
F
A
N
A
T
A
A
L
A
A
N
C
R
R
L
A
P
C
P
T
G
E
A
V
A
T
P
G
H
G
C
G
Y
CDC56
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CACCCACATCATCCACGCCGTCGCGCCGCGGCGTCCTCGGGACCCCGCCGCCCTCGAGGAGGGCGAAGCGCTGCTCGAGCGCGCCTACCGCAGCATCGTC
T
H
I
I
H
A
V
A
P
R
R
P
R
D
P
A
A
L
E
E
G
E
A
L
L
E
R
A
Y
R
I CDC131
V
S
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCGCTAGCCGCCGCGCGTCGGTGGGCGTGTGTCGCGTGCCCCCTCCTCGGCGCTGGCGTCTACGGCTGGTCTGCTGCGGAGTCCCTCCGAGCCGCGCTCG
A
L
A
A
A
R
R
W
A
C
V
A
C
P
L
L
G
A
G
V
Y
G
W
S
A
A
E
S
L
R
A
A
L
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGGCTACGCGCACCGAGCCCGTCGAGCGCGTGAGCCTGCACATCTGCCACCCCGACCGCGCCACGCTGACGCACGCCTCCGTGCTCGTCGGCGCGGGGCT
A
T
R
T
E
P
V
E
R
V
S
L
H
I
C
H
P
D
R
A
CDC121
T
L
T
H
A
S
V
L
V
G
A
G
L
CDC120
*
*
*
*
A A*
*
*
*
*
*
CGCTGCCAGGCGCGTCAGTCCTCCTCCGACCGAGCCCCTCGCATCTTGCCCCGCCGGTGACCCGGGCCGACCGGCTCAGCGCAGCGCGTCGCCCCCAGCG
A
A
R
R
V
S
P
P
P
T
E
P
L
A
S
C
P
A
G
D
P
G
R
P
A
Q
R
S
A
S
P
P
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ACCCCCCTTGGGGATGCCACCGCGCCCGAGCCCCGCGGATGCCAGGGGTGCGAACTCTGCCGGTgCACGCGCGTCACCAATGACCGCGCCTATGTCAACC
T
P
L
G
D
A
T
A
P
E
P
R
G
C
Q
G
C
E
L
C
R
Y
T
R
V
T
N
D
R
A
Y
V
N
L
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TGTGGCTCGAGCGCGACCGCGGCGCCACCAGCTGGGCCATGCGCATTCCCGAGGTGGTTGTCTACGGGCCGGAGCACCTCGCCACGCATTTTCCATTAAA
W
L
E
R
D
R
G
A
T
S
W
A
M
R
I
P
E
V
V
V
Y
G
P
E
H
L
A
T
H
F
P
L
N
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCACTACAGTGTGCTCAAGCCCGCGGAGGTCAGGCCCCCGCGAGGCATGTGCGGGAGTGACATGTGGCGCTGCCGCGGCTGGCATGGCATGCCGCAGGTG
H
Y
S
V
L
K
P
A
E
V
R
P
P
R
G
M
C
G
S
D
M
W
R
C
R
G
W
H
G
M
P
Q
V
CDC52
*
*
*
*
*
*
*
*
*
A
*
CGGTGCACCCCCTCCAACGCTCACGCCGCCCTGTGCCGCACAGGCGTGCCCCCTCGGGCGAGCACGCGAGGCGGCGAGCTAGACCCAAACACCTGCTGGC
R
C
T
P
S
N
A
H
A
A
L
C
R
T
G
V
P
P
R
A
S
T
R
G
G
E
L
D
P
N
T
C
W
L
CDC53
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TCCGCGCCGCCGCCAACGTTGCGCAGGCTGCGCGCGCCTGCGGCGCCTACACGAGTGCCGGGTGCCCCAAGTGCGCCTACGGCCGCGCCCTGAGCGAAGC
R
A
A
*
A
N
V
A
*
Q
A
A
*
R
A
C
*
G
A
Y
T
*
S
A
G
*
C
P
K
*
C
A
Y
G
*
R
A
L
*
S
E
A
*
CCGCACTCATGAGGACTTCGCCGCGCTGAGCCAGCGGTGGAGCGCGAGCCACGCCGATGCCTCCCCTGACGGCACCGGAGATCCCCTCGACCCCCTGATG
R
T
H
E
D
F
A
A
L
S
Q
R
W
S
A
S
H
A
D
A
S
P
D
G
T
G
D
P
L
D
P
L
M
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GAGACCGTGGGATGCaCCTGTTCGCGCGTGTGGGTCGGCTCCGAGCATGAGGCCCCGCCCGACCAaCTCCTGGTGTCCCTTCACCGTGCCCCAAATGGTC
E
T
V
G
C
A
C
S
R
V
W
V
G
S
E
H
E
A
P
P
D
H
L
L
V
S
L
H
R
A
P
N
G
P
CDC128
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGTGGGGCGTAGTGCTCGAGGTGCGTGCGCGCCCCGAGGGGGGCAACCCCACCGGCCACTTCGTCTGCGCGGTCGGCGGCGGCCCACGCCGCGTCTCGGA
W
G
V
V
L
E
V
R
A
R
P
E
G
CDC107
G
N
P
T
G
H
F
V
C
A
CDC106
CDC139
V
G
G
G
P
R
R
V
S
D
CDC138 (Flag)
ATCC
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCGCCCCCACCTCTGGCTTGCGGTCCCCCTGTCTCGGGGCGGTGGCACCTGTGCCGCGACCGACGAGGGGCTGGCCCAGGCGTACTACGACGACCTCGAG
R
P
CDC57
H
A
CDC109
CDC108 (2 stop +C)
L W L A V P L S R G G G T
A A T D E G L A Q A Y Y D D L E
A * CDC136 *
* A
AAC
*CDC77
*
*
*
*
*
Rub4037
CDC137
GTGCGCCGCCTCGGGGATGACGCCATGGCCCGGGCGGCCCTCGCATCAGTCCAACGCCCTCGCAAAGGCCCTTACAATATCAGGGTATGGAACATGGCCG
CDC78
V
R
R
L
G
D
D
A
M
A
R
A
A
L
A
S
V
Q
R
P
R
Rub4047
K
G
P
Y
N
I
R
V
W
N
M
A
A
CDC153
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CAGGCGCTGGCAAGACTACCCGCATCCTCGCTGCCTTCACGCGCGAAGACCTTTACGTCTGCCCCACCAATGCGCTCCTGCACGAGATCCAGGCCAAACT
G
A
G
K
T
T
R
I
L
A
A
F
T
R
E
D
L
Y
V
C
P
T
N
A
L
L
H
E
I
Q
A
K
L
Rub4284F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCGCGCGCGCGATATCGACtTCAAGAACGCCGCCACCTACGAGCGCCGGCTGACGAAACCGCTCGCCGCCTACCGCCGCATCTACATCGATGAGGCGTTC
R
A
R
D
I
D
I
K
N
A
A
T
E CDC84
R R
Y
L
T
K
P
L
A
A
Y
R
R
I
Y
I
D
E
A
F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ACTCTCGGCGGCGAGTACTGCGCGTTCGTTGCCAGCCAAACCACCGCGGAGGTGATCTGCGTCGGTGATCGGGACCAGTGCGGCCCACACTACGCCAATA
T
L
G
G
E
Y
C
A
F
V
A
S
Q
T
T
CDC105
A
E
V
I
C
V
G
D
R
D
Q
C
G
P
H
Y
A
N
N
Rub4387R
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ACTGCCGCACCCCCGTCCCTGACCGCTGGCCTACCGAGaGCTCaCGCCACACTTGGCGCTTCCCCGACTGCTGGGCGGCCCGCCTGCGCGCGGGGCTCGA
C
R
T
P
V
P
D
R
W
P
T
E
R
S
R
H
T
W
R
F
CDC123
P
D
C
W
A
A
R
L
R
A
G
L
D
CDC122
*
*
*
A G
*
*
*
*
*
*
TTATGACATCGAGGGCGAGCGCACCGGCACCTTCGCCTGCAACCTTTGGGACGGCCGCCAGGTCGACCTTCACCTCGCCTTCTCGCGCGAAACCGTGCGC
Y
D
I
E
G
E
R
T
G
T
F
A
C
N
L
W
D
G
R
Q
V
D
L
H
L
A
F
S
R
E
T
V
R
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCCTTCACGAGGCTGGCATACGCGCATACACCGTGCGCGAGGCCCAGGGTATGAGCGTCGGCACCGCCTGCATCCATGTAGGCAGAGACGGCACGGACG
R
L
H
E
A
G
I
R
A
Y
T
V
R
E
A
Q
G
M
S
V
G
T
A
C
I
H
V
G
R
D
G
T
D
V
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TTGCCCTGGCGCTGACACGCGACCTCGCCATCGTCAGCCTGACCCGGGCCTCCGACGCACTCTACCTCCACGAGCTCGAGGACGGCTCACTGCGCGCTGC
A
L
A
L
T
R
D
L
A
I
V
S
L
T
R
A
S
D
A
L
Y
L
H
E
L
E
D
G
S
L
R
A
A
Rub4856F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGGGCTCAGCGCGTTCCTCGACGCCGGGGCACTGGCGGAGCTCAAGGAGGTTCCCGCTGGCATTGACCGCGTTGTCGCCGTCGAGCAGGCACCACCACCG
G
L
S
A
F
L
D
A
G
A
L
A
E
L
K
E
V
P
A
G
I
D
R
V
V
A
V
E
Q
A
P
P
P
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TTGCCGCCCGCCGACGGCATCCCCGAGGCCCAAGACGTGCCGCCCTTCTGCCCCCGCACTCTGGAGGAGCTCGTCTTCGGCCGTGCCGGCCACCCCCATT
L
P
P
A
D
G
I
P
*
*
E
A
D
P Rub4930R
P F C
V
Rub5019F
*
*
*
Q
*
P
R
T
L
E
*
E
L
V
F
*
G
R
A
G
*
H
P
H
Y
*
ACGCGGACCTCAACCGCGTGACTGAGGGCGAACGAGAAGTGCGGTACATGCGCATCTCGCGTCACCTGCTCAACAAGAATCACACCGAGATGCCCGGAAC
A
D
L
N
R
V
T
E
G
E
R
E
R Rub5030R
Y M R
V
I
S
R
H
L
L
N
K
N
H
T
E
M
P
G
T
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGAACGCGTTCTCAGTGCCGTTTgCGCCGTGCGGcgCTACCGCGCGGGCGAGGATGGGTCGACCCTCCGCACTGCTGTGGCCCGCCAGCACCCGCGCCCT
E
R
V
L
S
A
V
C
A
V
R
R
Y
R
A
G
E
D
G
S
T
L
R
T
A
V
A
R
Q
H
P
R
P
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TTTCGCCAGATCCCACCCCCGCGCGTCACTGCTGGGGTCGCCCAGGAGTGGCGCATGACGTACTTGCGGGAACGGATCGACCTCACTGATGTCTACACGC
F
R
Q
I
P
P
P
R
V
T
A
G
V
A
Q
E
W
R
M
T
Y
L
R
E
R
I
D
L
T
D
V
Y
T
Q
CDC85
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
AGATGGGCGTGGCCGCGCGGGAGCTCACCGACCGCTACGCGCGCCGCTATCCTGAGATCTTCGCCGGCATGTGTACCGCCCAGAGCCTGAGCGTCCCCGC
M
G
V
A
A
R
E
L
T
D
R
Y
A
R
R
T
PCDC152I
Y
F
A
G
M
C
T
A
Q
Rub5370R
L
S V
S
P
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CTTCCTCAAAGCCACCTTGAAGTGCGTAGACGCCGCCCTCGGCCCCAGGGACACCGAGGACTGCCACGCCGCTCAGGGGAAAGCCGGCCTTGAGATCCGG
F
L
K
A
T
L
K
C
V
D
A
A
L
G
P
R
D
T
E
D
C
H
A
A
Q
G
K
A
G
L
E
I
R
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCGTGGGCCAAGGAGTGGGTTCAGGTTATGTCCCCGCATTTCCGCGCGATCCAGAAGATCATCATGCGCGCCTTGCGCCCGCAATTCCTTGTGGCCGCTG
A
W
A
K
E
W
V
Q
V
M
S
P
H
F
R
A
I
Q
K
I
I
M
R
A
L
R
P
Q
F
L
V
A
A
G
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCCATACGGAGCCCGAGGTCGATGCGTGGTGGCAGGCCCATTACACCACCAACGCCATCGAGGTCGACTTCACTGAGTTCGACATGAACCAGACCCTCGC
H
T
E
P
E
V
D
A
W
W
Q
A
H
Y
T
T
N
A
I
E
V
D
F
T
E
F
D
M
N
Q
T
L
A
Rub5747F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TACTCGGGACGTCGAGCTCGAGATTAGCGCCGCTCTCTTGGGCCTCCCTTGCGCCGAAGACTACCGCGCGCTCCGCGCCGGCAGCTACTGCACCCTGCGC
T
R
D
V
E
L
E
I
S
A
A
L
L
G
L
P
C
A
E
D
Y
R
A
L
R
A
G
S
Y
C
T
L
R
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GAACTGGGCTCCACTGAGACCGGCTGCGAGCGCACAAGCGGCGAGCCCGCCACGCTGCTGCACAACACCACCGTGGCCATGTGCATGGCCATGCGCATGG
E
L
G
S
T
E
T
G
C
E
R
T
S
G
E
P
A
T
L
CDC80
L
H
N
T
T
V
A Rub5860R
M C M
A
M
R
M
V
CDC79
*
*
*
AAT
*
*
*
*
*
*
TCCCCAAAGGCGTGCGCTGGGCCGGGATTTTCCAGGGTGACGATATGGTCATCTTCCTCCCCGAGGGCGCGCGCAGCGCGGCACTCAAGTGGACCCCCGC
P
G V R W A G I F Q G D D M V I F L P E G A R S A A L K W T P A
CDC161
*
*
* (cMyc)
*
*
*
*
*
*
/CDC160 (cMyc)
CGAGGTGGGCTTGTTTGGCTTCCACATCCCGGTGAAGCACGTGAGCACCCCTACCCCCAGCTTCTGCGGGCACGTCGGCACCGCGGCCGGCCTCTTCCAT
E
K
V
G
L
F
G
F
H
I
P
T
CDC125
V
TA
S
T
P
CDC124
T
P
S
F
C
G
H
V
G
T
A
A
G
L
F
H
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GATGTCATGCACCAGGCGATCAAGGTGCTTTGCCGCCGTTTCGACCCAGACGTGCTTGAAGAACAGCAGGTGGCCCTCCTCGACCGCCTCCGGGGGGTCT
D
V
M
H
Q
A
CDC86
I
K
V
L
C
R
R
F
D
P
D
V
L
E
E
Q
Q
V
A
L
L
D
R
L
R
G
V
Y
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ACGCGGCTCTGCCTGACACCGTTGCCGCCAATGCTGCGTACTACGACTACAGCGCGGAGCGCGTCCTCGCTATCGTGCGCGAACTTACCGCGTAcgCGCG
A
A
L
P
D
T
V
A
A
N
A
A
Y
Y
D
Y
S
A
E
R
V
L
A
I
V
R
E
L
T
A
Y
A
R
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGGGCGCGGCCTCGACCACCCGGCCACCATCGGCGCGCTCGAGGAGATTCAGACCCCCTACGCGCGCGCCAATCTCCACGACGCCGACTAACGCCCCTGT
G
R
G
L
D
H
P
A
T
I
G
A
L
E
E
I
Q
T
P
Y
A
R
A
N
L
H
D
A
D
CDC6
CDC5
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
ACGTGGGGCCTTTAATCTTACCTACTCTAACCAGgtcatcacccaccgttgtttcgccgcatctggtgggtacccaacttttgccattcgggagagcccc
A
CDC157/CDC156(TA
A2)
CDC159/CDC158
A
CDC11
CDC42
A
CDC58
CDC94 (Hiss-tag+GGG)
CDC72
*
*
*
*
*
*
*
*
agggtgcccgaATGGCTTCTACTACCCCCATCACCATGGAGGACCTCCAGAAGGCCCTCGAGGCACAATCCCGCGCCCTGCGCGCGGAACTCGCCGCCGG
Rub6507F
CDC16(SpeI+Kozac+2 stops+G
M
A
S
T
T
P
I
T
CDC103 (His-tag)
M
E
D
L
Q
K
A
L
E
A
Q
S
R
A
L
R
A
E
L
A
A
G
CDC69
*
* TA
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCCTCGCAGTCGCGCCGGCCGCGGCCGCCGCGACAGCGCGACTCCAGCACCTCCGGAGATGACTCCGGCCGTGACTCCGGAGGGCCCCGCCGCCGCCGC
A
S
Q
AGCGCT
CDC74/CDC73
S
CDC147 (RBI)
CDC61peI+Kozac)
G
G
G
G
T
G
S
G
D
G
R
D Rub6676R
G G
CDC146 (RBI)
P
CDC149 (RBII)
CDC62(SpeI+Kozac)
CDC151 (RBIII)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGCAACCGGGGCCGTGGCCAGCGCAGGGACTGGTCCAGGGCCCCGCCCCCCCCGGAGGAGCGGCAAGAAACTCGCTCCCAGACTCCGGCCCCGAAGCCAT
NCDC148
R (RBII)
G R
G
CDC70
G
Q
G
R
D
G
G
W
S
R
A
P
P
P
P
G
E
E
R
Q
E
T
R
S
Q
T
P
A
P
K
P
S
CDC150 (RBIII)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCGGGCGCCGCCACAACAGCCTCAACCCCCGCGCATGCAAACCGGGCGTGGGGGCTCTGCCCCGCGCCCCGAGCTGGGGCCACCGACCAACCCGTTCCA
R
A
P
P
Q
Q
P
Q
P CDC67
R M
P
Q
T
G
R
G
G
S
A
CDC71
P
R
P
E
L
G
P
P
T
N
P
F
Q
CDC37
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
AGCAGCCGTGGCGCGTGGCCTGCGCCCGCCTCTCCACGACCCTGACACCGAGGCACCCACCGAGGCCTGCGTGACCTCGTGGCTTTGGAGCGAGGGCGAA
A
A
V
A
R
G
L
R
P
P
L
H
D
P
D
T
E
A
P
T
E
A
C
V
T
S
W
L
W
S
CDC38
E
G
E
Rub7072F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGCGCGGTCTTTTACCGCGTCGACCTGCATTTCACCAACCTGGGCACCCCCCCACTCGACGAGGACGGCCGCTGGGACCCTGCGCTCATGTACAACCCTT
G
A
V
F
Y
R
V
D
L
H
F
T
N
L
G
T
P
P
L
D
E
D
G
R
W
D
A CDC68
L M
P
Y
N
P
C
CDC39
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCGGGCCCGAGCCGCCCGCTCACGTCGTCCGCGCGTACAATCAACCTGCCGGCGACGTCAGGGGCGTTTGGGGTAAAGGCGAGCGCACCTACGCCGAGCA
G
P
E
P
P
A
H
V
V
CDC66
R
A
Y
N
Q
P
A
G
D
V
R
G
V
W
G
K
G
E
R
T
Y
A
E
Q
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GGACTTCCGCGTCGGCGGCACGCGCTGGCACCGACTGCTGCGCATGCCAGTGCGCGGCCTCGACGGCGACAGCGCCCCGCTTCCCCCCCACACCACCGAG
D
F
R
V
G
G
T
R
CDC97(RI + 2 stops)
CDC100
W
H
R
L
L
R
M
P
V
R
G
L
D
G
D
S
A
P
L
P
P
H
T
T
E
CDC63
CDC40
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCATTGAGACCCGCTCGGCGCGCCATCCTTGGCGCATCCGCTTCGGTGCCCCCCAGGCCTTCCTTGCCGGGCTCTTGCTCGCCACGGTCGCCGTTGGCA
CDC#9(RI)
R I E T R
CDC12(RI+ 2stop)
CDC41(His-tag+Stop+RI)
S
A
R
H
P
W
R
I
R
F
G
A
P
Q
A
F
L
A
G
L
L
L
A
T
V
A
V
G
T
CDC104(His-tag+GGG)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCGCGCGCGCCGGGCTCCAGCCCCGCGCTGATATGGCGGCACCTCCTACGCTGCCGCAGCCCCCCTGTGCGCACGGGCAGCATTACGGCCACCACCACCA
CDC45
CDC95
CDC65/CDC65-BBRDII
CDC64
A
R
A
G
L
Q
P
R
A
D
M
A
A
P
P
T
L
P
Q
P
P
C
A
H
G
Q
H
Y
G
H
H
H
H
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TCAGCTGCCGTTCCTCGGGCACGACGGCCATCATGGCGGCACCTTGCGCGTCGGCCAGCATTACCGAAACGCCAGCGACGTGCTGCCCGGCCACTGGCTC
Q
L
P
F
L
G
H
D
G
H
H
G
G
T
L
R
V
G
Q
H
Y
R
N
A
S
D
V
L
P
G
H
W
L
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CAAGGCGGCTGGGGTTGCTACAACCTGAGCGACTGGCACCAGGGCACTCATGTCTGTCATACCAAGCACATGGACTTCTGGTGTGTGGAGCACGACCGAC
Q
G
G
W
G
C
Y
N
L
S
D
W
H
Q
G
T
H
V
C
H
T
K
H
M
D
F
W
C
V
E
H
D
R
P
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CGCCGCCCGCGACCCCGACGCCTCTCACCACCGCGGCGAACTCCACGACCGCCGCCACCCCCGCCACTGCGCCGGCCCCCTGCCACGCCGGCCTCAATGA
P
P
A
T
P
T
P
L
T
T
A
A
N
S
T
T
A
A
T
P
A
T
A
P
A
P
C
H
A
G
L
N
D
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CAGCTGCGGCGGCTTCTTGTCTGGGTGCGGGCCGATGCGCCTGCGCCACGGCGCTGACACCCGGTGCGGTCGGTTGATCTGCGGGCTGTCCACCACCGCC
S
C
G
G
F
L
S
G
C
G
P
M
R
L
R
H
G
A
D
T
R
C
G
R
L
I
C
G
Rub7869R
L
S
T
T
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CAGTACCCGCCTACCCGGTTTGGCTGCGCTATGCGGTGGGGCCTTCCCCCCTGGGAACTGGTCGTCCTTACCGCCCGCCCCGAAGACGGCTGGACTTGCC
Q
Y
P
P
T
R
F
G
*
*
C
A
M
R
W
*
G
L
P
P
*
W
E
L
V
*
V
L
T
A
R
*
P
E
D
G
*
W
T
C
R
*
*
*
GCGGCGTGCCCGCCCATCCAGGCGCCCGCTGCCCCGAACTGGTGAGCCCCATGGGACGCGCGACTTGCTCCCCAGCCTCGGCCCTCTGGCTCGCCACAGC
G
V
P
A
H
P
G
A
R
C
P
E
L
V
S
P
M
G
R
CDC98
A
T CDC101
C S P
A
S
A
L
W
L
A
T
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GAACGCGCTGTCTCTTGATCACGCCCTCGCGGCCTTCGTCCTGCTGGTCCCGTGGGTCCTGATATTTATGGTGTGCCGCCGCGCCTGTCGCCGCCGCGGC
N
A
L
S
L
D
H
A
L
A
A
F
V
L
L
V
P
W
V
L
I
F
M
V
C
R
R
A
C
R
R
R
G
CDC47
CDC87
CDC105 (His-tag + GGG)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCCGCCGCCGCCCTCACCGCGGTCGTCCTGCAGGGGTACAACCCCCCCGCCTATGGCGAGGAGGCTTTCACCTACCTCTGCACTGCACCGGGGTGCGCCA
A
A
A
A
L
T
A
V
V
L
Q
G
Y
N
P
P
A
Y
G
E
A CDC46(SpeI+Kozac+ATGGCT)
F T Y L C T A
E
P
CDC96(His-tag + GGG)
G
C
A
T
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CTCAAGCACCTGTCCCCGTGCGCCTCGCTGGCGTCCGTTTTGAGTCCAAGATTGTGGACGGCGGCTGCTTTGCCCCATGGGACCTCGAGGCCACTGGAGC
Q
A
P
V
P
V
R
L
A
G
V
R
F
E
S
K
I
V
D
G
G
C
F
A
P
W
D
L
E
A
T
G
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CTGCATTTGCGAGATCCCCACTGATGTCTCGTGCGAGGGCTTGGGGGCCTGGGTACCCGCAGCCCCTTGCGCGCGCATCTGGAATGGCACACAGCGCGCG
C
I
C
E
I
P
T
D
V
S
C
E
G
L
G
A
W
V
P
A
A
P
C
A
R
I
W
N
G
T
Q
R
A
Rub8541F/Rub8544F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TGCACCTTCTGGGCTGTCAACGCCTACTCCTCTGGCGGGTACGCGCAGCTGGCCTCTTACTTCAACCCTGGCGGCAGCTACTACAAGCAGTACCACCCTA
C
T
F
W
A
V
N
A
Y
S
S
G
G
Y
A
Q
L
A
S
Y
F
N
P
G
G
S
Y
Y
K
Q
Y
H
P
T
CDC134
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCGCGTGCGAGGTTGAACCTGCCTTCGGACACAGCGACGCGGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTCGCCCTTGCTAGCTACGT
A
C
E
*
V
E
P
A
*
F
G
H
*
S
D
A
*
A
C
W
G
*
F
P
T
*
D
T
V
*
M
S
V
F
*
A
L
A
*
S
Y
V
*
CCAGCACCCTCACAAGACCGTCCGGGTCAAGTTCCATACAGAGACCAGGACCGTCTGGCAACTCTCCGTTGCCGGCGTGTCGTGCAACGTCACCACTGAA
Q
H
P
H
K
T
V
R
V
K
F
H
T
E
T
R
T
V
W
Rub8767R
Q
L
S
V
A
G
V
S
CDC130
C
N
V
T
T
E
CDC129
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CACCCGTTCTGCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCCGGGGACCTGGTTGAGTACATTATGAATTACACCGGCAATCAGC
H
P
F
C
N
T
P
H
G
Q
L
E
V
Q
V
P
P
D
P
G
D
L
V
E
Y
I
M
N
Y
T
G
N
Q
Q
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
AGTCCCGGTGGGGCCTCGGGAGCCCGAATTGCCACGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGC
S
R
W
G
L
G
S
P
N
C
H
G
P
D
W
A
S
P
V
C
Q
R
H
S
P
D
C
S
R
L
V
G
A
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CACGCCAGAGCGCCCCCGGCTGCGCCTGGTCGACGCCGACGACCCCCTGCTGCGCACTGCCCCTGGACCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGC
T
P
E
R
P
R
L
R
L
V
D
A
D
D
P
L
L
R
T
A
P
G
P
G
E
V
W
CDC135
V
T
Rub9147F
P
V
I
G
CDC140
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
TCTCAGGCGCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCATGCTACCGTCGAAATGCCCGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACC
S
Q
A
R
K
C
G
L
H
I
R
A
G
P
Y
G
H
A
T
V
E
M
P
E
W
CDC32
Rub9162R
I
H
A
H
T
T
S
D
P
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCTGGCATCCACCGGGCCCCTTGGGGCTGAAGTTCAAGACAGTTCGCCCGGTGGCCCTGCCACGCACGTTAGCGCCACCCCGCAATGTGCGTGTGACCGG
W
H
P
P
G
P
L
G
L
K
F
K
T
V
R
P
V
A
L
P
R
T
L
A
P
P
R
N
V
R
V
T
G
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GTGCTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTTGCCCCCGGGGGAGGCAATTGCCATCTCACCGTCAATGGCGAGGACCTCGGCGCCGTCCCC
C
Y
Q
C
G
T
P
A
L
V
E
G
L
A
P
G
G
G
N
C
H
L
T
V
N
G
E
D
L
G
A
V
P
Rub9500R
CDC141
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCTGGGAAGTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTCAGCTGCGGGGGCGAGAGCGATCGCGCGACCGCGCGGGTCATCGACC
P
G
K
F
V
T
A
A
L
L
N
T
P
P
P
Y
Q
V
S
C
G
G
E
DCDC31
R A
S
T
R Rub9513R
V I D
A
P
Rub9505F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
CCGCCGCGCAATCGTTTACCGGCGTGGTGTATGGCACACACACCACTGCTGTGTCGGAGACCCGGCAGACCTGGGCGGAGTGGGCTGCTGCCCATTGGTG
A
A
Q
S
F
T
G
V
V
Y
G
T
H
T
T
A
V
S
E
T
R
Q
T
W
A
E
W
A
A A (2 Hstop+RI)
W W
CDC13
CDC88 (His-tag + RI)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
GCAGCTCACTCTGGGCGCCATTTGCGCCCTCCCACTCGCTGGCTTACTCGCTTGCTGTGCCAAATGCTTGTACTACTTGCGCGGCGCTATAGCGCCTCGC
Q
L
T
L
*
G
A
I
*
C
A
L
*
P
L
A
G
CDC20
*
L
L
A
C
C
Rub9662R
A
K
C
L
Y
Y
L
R
G
A
I
A
P
R
CDC10 (RI)
*
*
*
*
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
TAGtgggcccccgcgcgaaacccgcactaggccactagatccccgcacctgttgctgtataga
CDC36 (RI)
TCTAGAGCTTGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAG
Annexe 2: Séquences des souches Marocaines et Africaines du virus sauvage de la
rubéole.
a/ Séquences des souches Marocaines du virus sauvage de la rubéole.
name Mor386_D
Descrip
REFORMAT of: 386_Mor.seq check: 4818 from: 1 to: 710 October
25, 2004 09:28
type
DNA
long name /beryl2/bioesa/seqs/386-mor.seq
checksum
3439
creation date 01/10/2005 15:29:44
Strand 1
Comments
REFORMAT of: 386_Mor.seq check: 4818 from: 1 to: 710 October 25,
2004 09:28
Sequence
TGAGTACATTATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTTGGGAGCCCGAA
TTGCCACGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGTCAGCGCCATTCCCCTGACTGCTCGCG
GCTTGTGGGGGCTACGCCAGAGCGTCCCCGGCTCCGCCTGGTCGACGCCGACGACCCCCT
GCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCTCAGGC
GCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCATGCTACCGTCGAAATGCC
CGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACCCCTGGCACCCACCGGGCCCCTTGGGGCT
GAAATTCAAGACCGTTCGCCCGGTTGCCCTGCCACGCGCGTTAGCGCCACCCCGCAATGT
GCGTGTGACCGGGTGTTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTCGCCCCCGG
GGGGGGCAATTGCCATCTCACTGTCAATGGCGAGGATGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAA
ATTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTCAGTTGCGGGGGCGA
G
Name Mor364_D
Descrip
REFORMAT of: contig364Mor.txt check: 6617 from: 1 to: 848
December 21, 2004
Type
DNA
Long name /beryl2/bioesa/seqs/mor364.seq
Checksum
2253
Creation-date 01/10/2005 15:54:13
Strand 1
Comments
REFORMAT of: contig 364Mor.txt check: 6617 from: 1 to: 848 December
21, 2004 13:50
Sequence
TGAGTACATTATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTTGGGAGCCCGAA
TTGCCACGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGTCAGCGCCATTCCCCTGACTGCTCGCG
GCTTGTGGGGGCCACGCCAGAGCGTCCCCGGCTCCGCCTGGTCGACGCCGACGACCCCCT
GCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCTCAGGC
GCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCACGCTACCGTCGAAATGCC
CGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACCCCTGGCACCCACCGGGCCCCTTGGGGCT
GAAATTCAAGACCGTTCGCCCGGTTGCCCTGCCGCGCGCGTTAGCGCCACCCCGCAATGT
GCGTGTGACCGGGTGTTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTTGCCCCCGG
GGGGGGCAATTGCCACCTCACTGTCAATGGCGAGGATGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAA
GTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTCAGTTGCGGGGGCGA
G
Name Mor33_D
Descrip
REFORMAT of: Mor33-601b.txt check: 1710 from: 1 to: 694
January 6, 2004 10:
Type
DNA
Long name /beryl2/bioesa/seqs/mor33-601b.seq
Checksum
3403
Creation-date 01/11/2005 08:31:46
Strand 1
Comments
REFORMAT of: Mor33-601b.txt check: 1710 from: 1 to: 694 January 6,
2004 10:53
Sequence
TGAGTACATTATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTTGGGAGCCCGAA
TTGCCACGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGTCAGCGCCATTCCCCTGACTGCTCGCG
GCTTGTGGGGGCCACGCCAGAGCGTCCCCGGCTCCGCCTGGTCGACGCCGACGACCCCCT
GCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCTCAGGC
GCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCATGCTACCGTCGAAATGCC
CGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACCCCTGGCACCCACCGGGCCCCTTGGGGCT
GAAATTCAAGACCGTTCGCCCGGTTGCCCTGCCACGCGCGTTAGCGCCACCCCGCAATGT
GCGTGTGACCGGGTGTTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTTGCCCCCGG
GGGGGGCAATTGCCACCTCACTGTCAATGGCGAGGATGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAA
GTTTGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTCAGTTGCGGGGGCGA
G
Name Mor354_D
Descrip
REFORMAT of: contig354Mor2004.txt check: 5475 from: 1 to:
859 December 21,
type
DNA
Long name /beryl2/bioesa/seqs/mor354.seq
Checksum
2263
Creation-date 12/21/2004 13:53:28
Strand 1
Comments
REFORMAT of: contig354Mor2004.txt check: 5475 from: 1 to: 859
December 21, 2004 13:49
Sequence
TGAGTACATTATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTTGGGAGCCCGAA
TTGCCACGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGTCAGCGCCATTCCCCTGACTGCTCGCG
GCTTGTGGGGGCCACGCCAGAGCGTCCCCGGCTCCGGCTGGTCGACGCCAACGACCCCGG
GTGCGCACGTGCCCGGGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCTCAGGC
GCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCATGCTACCGTCGAAATGCC
CGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACCCCTGGCACCCACCGGGCCCCTTGGGGCT
GAAATTCAAGACCGTTCGCCCGGTTGCCCTGCCACGCGCGTTAGCGCCCCCCCGCAATGT
GCGTGTGACCGGGTGTTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTTGCCCCCGG
GGGGGGCAATTGCCATCTCACTGTCAACGGCGAGGATGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAA
GTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTCAGTTGCGGGGGCGA
G
Name Mor364_D
Descrip
REFORMAT of: contig364Mor.txt check: 6617 from: 1 to: 848
December 21, 2004
Type
DNA
Long name /beryl2/bioesa/seqs/mor364.seq
Checksum
2253
Creation-date 12/10/2005 15:54:13
Strand 1
Comments
REFORMAT of: contig353Mor.txt check: 6617 from: 1 to: 848 December
21, 2005 13:50
Sequence
TGAGTACATTATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTTGGGAGCCCGAA
TTGCCACGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGTCAGCGCCATTCCCCTGACTGCTCGCG
GCTTGTGGGGGCCACGCCAGAGCGTCCCCGGCTCCGCCTGGTCGACGCCGACGACCCCCT
GCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCTCAGGC
GCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCACGCTACCGTCGAAATGCC
CGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACCCCTGGCACCCACCGGGCCCCTTGGGGCT
GAAATTCAAGACCGTTCGCCCGGTTGCCCTGCCGCGCGCGTTAGCGCCACCCCGCAATGT
GCGTGTGACCGGGTGTTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTTGCCCCCGG
GGGGGGCAATTGCCACCTCACTGTCAATGGCGAGGATGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAA
GTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTCAGTTGCGGGGGCGA
G
b/ Séquence de la souche de l’Afrique du Sud
Name RVs_SAfrica_03
Descript
M-2042
Type
DNA
Long name /beryl2/bioesa/seqs/SA2042.seq
Checksum
6926
Creation-date 12/18/2003 09:43:30
Strand -1
Comments
M-2042
Sequence
TGAGTATATCATGAATTACACCGGCAACCAACAGTCCCGGTGGGGCCTCGGGAGCCCGAA
CTGCCACGGCCCCGACTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAGCGCCACTCTCCCGACTGTTCGCG
GCTCGTGGGGGCCACGCCAGAGCGCCCCCGGCTGCGCCTCGTCGATGCTGACGACCCCCT
TCTGCGCACCGCCCCGGGGCCGGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCCCAGGC
GCGCAAGTGCGGACTTCACATACGCGCCGGACCGTACGGCCACGCCACCGTCGAAATGCC
TGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGATCCCTGGCACCCGCCCGGCCCCTTGGGGCT
CAAGTTCAAGACAGTCCGCCCGGTGGTCCTACCACGCGCGTTAGCGCCCCCTCGCAACGT
GCGCGTAACTGGCTGCTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAGGGCCTTGCCCCAGG
AGGAGGAAACTGCCATCTCACCGTCAACGGCGAGGACGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAA
GTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTGAGTTGCGGGGGTGA
G
c/Sequence (PS-ORF, C-E2-E1) de la souche d’origine d’Ouganda
Name RVi_UGA_20.01_1G_
Descrip
32SPseqs.msf MSF: 3260 Type: N July
Check: 154
Type
DNA
Long name /beryl2/sst4/32SPseqs.msf{u588_ug_01}
Checksum
3669
Creation-date 04/19/2005 14:17:52
Strand 1
19,
2004
09:59
Sequence
ATGGCCTCCACTACCCCCATCACCATGGAGGACCTCCAGAAGGCCCTCGAGGCACAATCC
CGCGCCTTGCGCGCGGAACTCGCCGCCGGCGCCTCGCAGTCGCGCCGGCCGCGGCCGCCG
CGACAGCGCGACTCCAGCACCTCCGGAGACGACTCCGGCCGTGACTCCGGAGGGCCCCGC
CGCCGCCGCGGCAACCGGGGCCGTGGCCAGCGCAGGGACTGGTCCAGGGCCCCGCCTCCC
CCCGAAGAGCGGCAAGAAGGGCGCTCCCAGACCCCGGCCCCGAAGCCATTGCGGGCCCCG
CCGCAACAGCCTCAACCCCCGCGCATGCAAACCGGGCGTGGGGGCTCTGCCCCGCGCCCC
GAGCTGGGGCCACCGACCAACCCGTTCCAGGCAGCCGTGGCGCGTGGCCTGCGCCCGCCT
CTCCACGACCCTGACACCGAGGCACCCACTGAGGCCTGCGTGACCTCATGGCTTTGGAGC
GAGGGCGAAGGCGCGGTTTTCTACCGCGTCGACCTGCATTTCACCAACCTGGGCACCCCT
CCACTTGACGAGGACGGCCGCTGGGACCCTGCGCTCATGTACAACCCTTGCGGGCCCGAG
CCGCCCGCTCACGTCGTCCGCGCGTACAATCAACCTGCCGGCGACGTCAGGGGCGTTTGG
GGTAAAGGTGAGCGCACCTACGCCGAGCAGGATTTCCGCGTCGGTGGCACGCGCTGGCAC
CGACTGCTGCGCATGCCAGTGCGCGGCCTCGACGGCGACAGCGCCCCGCTCCCCCCCCAC
ACTACCGAGCGCATTGAGACCCGCTCGGCGCGCCATCCTTGGCGCATCCGTTTTGGTGCC
CCCCAGGCCTTCCTTGCCGGGCTCTTGCTCGCCGCGGTCGCCGTTGGCACCGCGCGTGCC
GGGCTCCAGCCCCGCGCTGACATGGCGGCACCTCCCACGCCGCCGCAGCCCCCTCGTGCG
CACGGGCAGCATCACGGCCACCACCACCATCAGCTGCCGTTCCTTGGGCACGACGGCCAT
CATGGCGGCACCTTGCGCGTCGGCCAGCACCACCGAAACGCCAGCGACGTGCTGCCCGGT
CACTGGCTCCAAGGCGGCTGGGGTTGCTACAACCTGAGCGACTGGCACCAGGGCACTCAT
GTCTGTCATACCAGGCACATGGACTTCTGGTGCGTGGAGCACGACCGACCGCCGCCCGCG
ACCCCGACGCCTTTCACCACCGCGGCGAACACCACGCCCGCCGCCACCTCCGCCACTGTG
CCGGCCCCTTGCCACGCCGGCCTCAATGACAGCTGCGGCGGCTTCTTGTCTGGGTGCGGG
CCGATGCGCCTGCGCCACGGCGCTGATACCCGGTGCGGCCGGTTGATCTGCGGGCTGTCC
ACCACCGCCCAGTACCCGCCTACCCGGTTCGGCTGCGCTATGCGGTGGGGCCTGCCCCCT
TGGGAACTGGTTGTCCTCACCGCCCGCCCCGAAGACGGCTGGACTTGCCGCGGCGTGCCC
GCCCATCCAGGCACCCGCTGCCCCGAACTGGTGAGCCCCATGGGACGCGCGACTTGTTCC
CCAGCCTCGGCCCTCTGGCTCGCCACGGCGAACGCGCTGTCTCTCGATCACGCCCTCGCG
GCCGTnGTCCTGCTGGTCCCGTGGATCCTGATATTCATGGTGTGCCGCCGCGCTTGTCGC
CGCCGCGGCGCCGCCGCCGCCCTCACCGCGGTCGTCCTGCAGGGGTATACCCCCCCCGCC
TACGGTGAGGAGGCCTTCACCTACCTCTGCACTGCACCGGGGTGCGCCACTCAGGCACCT
GTCCCCGTGCGCCTAGCCGGCGTCCGCTTTGAGTCCAAGATCGTCGACGGCGGCTGCTTT
GCCCCATGGGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATTTGCGAGATCCCCACCGACGTCTCG
TGCGAGGGCTTGGGGGCCTGGGTACCTACAGCCCCATGCGCGCGCATCTGGAACGGCACA
CAGCGCGCCTGCACCTTTTGGGCTGTCAACGCCTACTCCTCTGGCGGGTACGCGCAGCTG
GCCTCCTACTTCAACCCTGGCGGCAGTTACTACAAGCAGTACCACCCCACCGCGTGCGAG
GTTGAACCAGCCTTCGGACACAGCGACGCGGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTG
ATGAGCGTGTTCGCCCTCGCCAGCTATGTCCAGCACCCTCACAAGACCGTCCGGGTCAAG
TTCCATACAGAGACCAGGACCGTCTGGCAACTCTCCGTCGCCGGCGTGTCATGCAACGTC
ACCACCGAGCACCCCTTCTGCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCC
GACCCTGGGGACCTGGTTGAGTACATCATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGG
GGCCTCGGGAGCCCGAATTGCCATGGCCCCGACTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAGCGCCAT
TCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACGCCGGAGCGTCCCCGGCTGCGCCTGGTC
GATGCCGACGACCCCTTGCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCC
GTCATAGGCTCTCAGGCGCGTAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCAC
GCTACCGTCGAAATGCCCGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGATCCTTGGCACCCA
CCGGGCCCCTTGGGGCTGAAGTTCAAGACAGTTCGCCCGGTGGTCCTGCCACGCGCGTTG
GCGCCACCCCGCAATGTGCGTGTGACCGGGTGCTACCAGTGCGGCACTCCCGCGCTGGTG
GAAGGCCTTGCCCCCGGGGGAGGGAATTGCCATCTCACTGTCAATGGCGAGGACGTCGGC
GCCTTCCCTCCTGGGAAGTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAA
GTCAGCTGCGGGGGTGAGAGCGATCGCGCGAGCGCGCGGGTCATTGACCCCGCCGCGCAA
TCGTTTACCGGCGTGGTGTATGGCACACACACCACTGCCGTGTCGGAGACCCGGCAGACC
TGGGCGGAGTGGGCCGCTGCCCATTGGTGGCAGCTCACTCTGGGCGCTATTTGCGCCCTC
CTACTCGCTGGCTTACTCGCTTGCTGTGCCAAATGCTTGTACTACTTGCGCGGCGCTATT
GCGCCGCGCTAG
d/Séquence
d’Ivoire.
(PS :
3186
nts,
C-E2-E1)
de
Souche
d’origine
de
Côte
Name RVi_NH.USA_3.05_1G_CRS
Descrip
REFORMAT of: nh.txt check: 1182 from: 1 to: 3192 April 19,
2005 16:01
Type
DNA
Long name /beryl2/sst4/reformat_65.reformat
Checksum
1182
Creation-date 04/19/2005 16:01:35
Strand 1
Comments
REFORMAT of: nh.txt check: 1182 from: 1 to: 3192 April 19, 2005
16:01
Sequence
ATGGCCTCTACTACCCCCATCACCATGGAGGACCTTCAGAAGGCCCTCGAGGCACAATCC
CGCGCCTTGCGCGCGGAACTCGCCGCCGGCGCCTCGCAGTCGCGCCGGCCGCGGCCGCCG
CGACAGCGCGACTCCAGCACCTCCGGAGACGACTCCGGCCGCGACTCCGGGGGGCCCCGC
CGCCGTCGCGGCAACCGGGGCCGTGGCCAGCGCAGGGACTGGTCCAGGGCCCCGCCTCCC
CCCGAAGAGCGGCAAGAAAGTCGCTCCCAGACCCCGGCCCCGAAGCCATCGCGGGCCCCA
CCGCAACAGCCCCAACCCCCGCGTATGCAAACCGGGCGTGGGGGCTCTGCCCCGCGCCCC
GAGCTGGGGCCACCGACCAACCCGTTCCAGGCGGCCGTGGCGCGTGGCCTGCGCCCGCCT
CTCCACGACCCTGACACTGAGGCACCCACTGAGGCCTGCGTAACCTCATGGCTTTGGAGC
GAGGGCGAAGGCGCGGTCTTCTACCGCGTCGACCTGCACTTCACCAACCTAGGCACCCCT
CCACTCGACGAAGACGGCCGCTGGGACCCTGCGCTCATGTACAACCCTTGCGGGCCCGAG
CCGCCCGCTCACGTCGTCCGCGCGTATAACCAACCTGCCGGCGACGTCAGGGGCGTTTGG
GGTAAAGGTGAGCGCACCTACGCCGAGCAGGACTTCCGCGTCGGTGGCACCCGCTGGCAC
CGACTGCTGCGCATGCCAGTGCGCGGCCTCGACGGCGACAGCGCCCCGCTCCCCCCCCAC
ACCACCGAGCGCATCGAGACCCGCTCGGCGCGCCATCCTTGGCGCATCCGCTTCGGTGCC
CCCCAGGCCTTCCTTGCCGGGCTCTTGCTCGCCGCGGTGGCCGTTGGCACCGCGCGCGCC
GGGCTCCAGCCCCGCGCTGACATGGCGGCACCTCCCACACCGCCGCAGCCCCCTCGTGCG
CACGGGCAGCATTACGGCCACCACCACCATCAGCTGCCGTTCCTCGGGCACGACGGCCAT
CATGGCGGCACCTTGCGCGTCGGCCAGCAACACCGAAACGCCAGCGACGTGCTGCCCGGC
CACTGGCTCCAAGGCGGCTGGGGTTGCTACAACCTGAGCGACTGGCACCAGGGCACTCAT
GTCTGTCACACCAAGCACATGGACTTCTGGTGCGTGGAGCACGACCGACCGCCGCCTACC
ACCCCGACGCCTTTCACCACCGCGGCGAACACCACGCCCGCCGCCACCCCCGCCACCGTG
CCGGCCCCCTGCCACGCCGGCCTCAACGACAGCTGCGGCGGCTTCTTGTCTGGGTGCGGG
CCGATGCGCCTGCGCCACGGCGCTGACACCCGGTGCGGCCGGTTGATCTGCGGGCTGTCC
ACCACCGCCCAGTACCCGCCTACCCGGTTCGGCTGCGCTATGCGGTGGGGCCTGCCCCCT
TGGGAACTGGTTGTCCTCACCGCCCGCCCCGAAGACGGCTGGACTTGCCGCGGCGTGCCC
GCCCATCCAGGCACCCGCTGCCCCGAATTGGTGAGCCCCATGGGACGCGCGACTTGTTCC
CCAGCCTCGGCTCTCTGGCTCGCGACGGCGAACGCGCTGTCCCTTGATCACGCCCTCGCG
GCCGTTGTCCTGCTGGTCCCGTGGGTCCTGATATTCATGGTGTGCCGCCGCGCTTGTCGC
CGCCGCGGCGCCGCTGCCGCCCTCACCGCGGTTGTCCTGCAGGGGTATACCCCCCCCGCC
TACGGCGAGGAGGCCTTCACCTACCTCTGCACTGCACCGGGGTGCGCCACTCAGGCCCCT
GTCCCCGTGCGCCTCGCCGGCGTCCGCTTTGAGTCCAAGATTGTCGACGGCGGCTGCTTT
GCCCCATGGGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATTTGCGAGATCCCCACCGACGTCTCG
TGCGAGGGCTTGGGGGCCTGGGTACCCACAGCCCCATGCGCGCGCATCTGGAACGGCACA
CAGCGCGCCTGCACCTTTTGGGCCGTTAACGCCTACTCCTCGGGCGGGTATGCGCAGCTG
GCCTCTTACTTCAACCCTGGCGGCAGTTACTACAAGCAGTACCACCCCACCGCGTGCGAG
GTCGAACCAGCCTTCGGACACAGCGACGCGGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTG
ATGAGCGTGTTCGCCCTTGCCAGCTATGTCCAGCACCCTCACAAGACCGTCCGGGTCAAG
TTCCATACAGAGACCAGGACCGTCTGGCAACTCTCCGTCGCCGGCGTGTTATGCAACGTC
ACCACCGAGCACCCCTTCTGCAACACGCCGCACGGACAACTTGAAGTCCAGGTCCCGCCC
GACCCCGGGGACCTGGTTGAGTATATCATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGG
GGCCTCGGGAGCCCGAATTGCCATGGCCCCGACTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCAT
TCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACGCCAGAGCGTCCCCGGCTGCGCCTGGTC
GATGCCGACGACCCCTTGCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTGACGCCT
GTCATAGGCTCTCAGGCGCGTAAGTGCGGGCTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCAC
GCTACCGTCGAAATGCCCGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGTGATCCTTGGCACCCA
CCGGGCCCCTTGGGGCTGAAGTTCAAGACAGTTCGCCCGGTGGTCCTGCCACGCGCGTTG
GCGCCACCCCGCAATGTGCGTGTGACCGGGTGCTACCAGTGCGGCACTCCCGCGCTGGTG
GAAGGCCTTGCCCCCGGGGGAGGGAATTGCCATCTCACTGTCAATGGCGAGGACGTCGGC
GCCTTTCCCCCTGGGAAGTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAA
GTCAGCTGCGGGGGTGAGAGCGATCGCGCGAGCGCGCGGGTCATTGACCCCGCCGCGCAA
TCGTTCACCGGCGTGGTGTATGGCACACACACCACTGCTGTGTCGGAGACCCGGCAGACC
TGGGCGGAGTGGGCCGCTGCCCATTGGTGGCAGCTCACTCTGGGCGTTATCTGCGCCCTC
CTACTCGCTGGCTTACTCGCTTGCTGTGCCAAATGCTTGTACTACTTGCGCGGCGCTATA
GCGCCGCGCTAG
Annexe 3 : Séquence de la souche (vaccinale) HPV77 : 9762 nts.
Name hpv77whole
Descrip
REFORMAT of: hpvwholelabcc.txt check: 5968 from: 1 to: 9703
August 1, 2005
Type
DNA
Long name /beryl1/hcaidi/sequences/hpv77whole.rsf
Checksum
5968
Creation-date 08/01/2005 18:06:55
Strand 1
Comments
REFORMAT of: hpvwholelabcc.txt check: 5968 from: 1 to: 9703 August
1, 2005 18:05
Sequence
CAATGGGAGCTATCGGACCTCGCTTAGGACTCCCATTCCCTGGGAGAAACTCCTAGATGA
GGTTCTTGCCCCCGGTGGGCCTTATAACTTAACCGTCGGCAGTTGGGTAAGAGACCACGT
CCGCTCAATTGTCGAGGGCGCGTGGGAAGTGCGCGATGTTGTTACCGCTGCCCAAAAGCG
GGCCATCGTAGCCGTGATACCCAGACCTGTGTTCACGCAGATGCAGGTCAGTGATCACCC
AGCACTCCACGCAATTTCGCGGTATACCCGCCGCCATTGGATCGAGTGGGGCCCTAAAGA
AGCCCTACACGTCCTCATCGACCCAAGCCCGGGCCTGCTCCGCGAGGTCGCTCGCGTTGA
GCGCCGCTGGGTCGCACTGTGCCTCCACAGGACGGCACGCAAACTCGCCACCGCCCTGGC
CGACGAGGCCGGCGAGGCGTGGCACGCTGACTACGTGTGCGCGCTGCGTGGCGCACCGAG
CGGCCCCTTCTACGTCCACCCCGAGGACGTTCCGCACGGCGGTCGCGCCGTGGCGGACAG
ATGCTTGCTCTACTACACACCCATGCAGATGTGCGAGCTGATGCGCACCATTGACGCCAC
CTTGCTCGTGGCGGTTGACTTGTGGCCGGTCGCCCTTGCGGCCCACGTCGGCGATGACTG
GGACGACCTGGGCATTGCCTGGCATCTCGACCATGACGGCGGTTGCCCCGCCGATTGCCG
TGGAGCCGGCGCTGGGCCCACGCCCGGCTACACCCGCCCCTGCACCACACGCATCTACCA
AGTCCTGCCGGACACCGCCCACCCCGGGCGCCTCTACCGGTGCGGGCCCCGCCTGTGGAC
GCGCGACTGCGCCGTGGCCGAACTCTCATGGGAGGTTGCCCAACACTGCGGGCACAAGGC
GCGCGTGCGCGCCGTGCGATGCACCCTCCCTATCCGCCACGTGCGCAGCCTCCAACCCAG
CGCGCGGGTCCGACTCCCGGACCTTGTCCATCTCGCCGAGGTGGGCCGGTGGCGGTGGTT
CAGCCTCCCCCGCCCCGTGTTCCAGCGTATGCTGTCCTACTGCAAGACCCTGAGCCCGGA
CGCGTACTATAGCGAGCGCGTGTTCAAGTTCAAGAACGCCCTGAGCCACAGCATCACGCT
CGCGGGCAATGTGCTGCAAGAGGGGTGGAAGGGCACGTGCGCCGTAGAAGACGCGCTGTG
CGCGTACGTGGCCTTCCGCGCGTGGCAGTCTAACGCCAGGCTGGCGGGGATTATGAAAAG
CGCGAAGCGCTGCGCCGCCGACTCCTTGAGCGTGGCCGGCTGGCTGGACACCATTTGGGA
CGCCATTAAGCGGTTCTTCGGCAGCGTGCCCCTCGCCGAGCGCATGGAGGAGTGGGAACA
GGACGCCGCGGTCGCCGCCTTCGACCGCGGCCCCCTCGAGGACGGCGGGCGCCACTTGGA
CACCGTGCAACCCCCCAAATCGCCGCCCCGCCCTGAGATCGCCGCGACCTGGATCGTCCA
CGCCGCCAGCGCAGACCGCCATTGCGCGTGCGCCCCCCGCTGCGACGTCCCACGCGAACG
TCCCTCCGCGCCTGCCGGCCCGCCGGATGACGAGGCGCTTATCCCGCCGGTGCTGTTCGC
CGAGCGCCGTGCCCTCCGCTGCCGCGAGTGGGATTTCGAGGCTCTCCGCGCGCGCGCCGA
TACGGCGGCCGCGCCCGCCCCGCTGGCTCCACGCCCTGCGCGGTACCCCACCGTGCTCTA
CCGCCACCCCCCCCACCACGGTCCGTGGCTCACCCTTGACGAGCCAGGCGACGCTGACGC
GGCCCTGGTCTTATGCGACCCACTTGGCCAGCCGCTCCGGGGCCCTGAACGCCACTTCGC
CGCCGGCGCGCATATGTGCGCGCAGGCGCGGGGGCTCCAGGCTTTTGTCCGTGTCGTGCC
TCCACCCGAGCGCCCCTGGGCCGACGGGGGCGCCAGAGCGTGGGCGAAGTTCTTCCGCGG
CTGCGCCTGGGCGCAGCGCTTGCTCGGCGAGCCGGCAGTCATGCACCTCCCATACACCGA
TGGCGACGTGCCACAGCTGATCGCACTGGCCTTGCGCACGCTGGCCCAACAGGGGGCCGC
CTTGGCACTCTCGGTGCGCGACCTGCCCGGGGGTGCGGCGTTCGACGCACATGCGGTCAC
CGCCGCCGTGCGCGCTGGCCCCGGCCAGTCCGCGGCCACGTCACCGCCGCCCGGCGACCC
CCCGCCGCCGCGCCGCGCACGGCGATCGCAACGGCACTTGGACGCCCGCGGCACTCCGCC
CCCCGCGCCTGCGCGCGACCCGCCGCCGCCCGCCCCCAGCCCGCCCGCGCCACCCCGCGC
GGGTGACCCGGTCCTTCCCACTTCCGCGGGGCCGGCGGATCGCGCGCGTCACGCCGAGCT
GGAGGTCGCTTACGAACCGAGCGACCCCCCCACGCCAACCAAGGCAGACCCAGACAGCGA
CATCGTTGAAAGTTACGCCCGCGCCGCCGGACCCGTGCACCTCCGAGTCCGCGACATCAT
GGACCCACCGCCCGGCTGCAAGGTCGTGGTTAACGCCGCCAACGAGGGGCTGCTGGCCGG
CTCCGGCGTGTGCGGTGCCATCTTTGCCAACGCCACGGCGGCCCTCGCTGCAGACTGCCG
GCGCCTCGCCCCATGCCCCACCGGCGAGGCAGTGGCGACACCCGGCCACGGCTGCGGGTA
CACCCACATCATCCACGCCGTCGCGCCGCGGCGTCCTCGGGACCCCGCCGCCCTCGAGGA
GGGCGAAGCGCTGCTCGAGCGCGCCTACCGCAGCATCGTCGCGCTAGCCGCCGCGCGTCG
GTGGGCGTGTGTCGCGTGCCCCCTCCTCGGCGCTGGCGTCTACGGCTGGTCTGCTGCGGA
GTCCCTCCGAGCCGCGCTCGCGGCTACGCGCGCCGAGCCCGCCGAGCGCGTGAGCCTGCA
CATCTGCCACCCCGACCGCGCCACGCTGACGCACGCCTCCGTGCTCGTCGGCGCGGGGCT
CGCTGCCAGGCGCGTCAGTCCTCCTCCGACCGAGCCCCTCGCATCTTGCCCCGCCGGCGA
CCCGGGCCGACCGGCTCAGCGCAGCGCGTCGCCCCCAGCGACCCCCCTTGGGGATGCCAC
CGCGCCCGAGCCCCGCGGATGCCAGGGGTGCGAACTCTGCCGGTACACGCGCGTCACCAA
TGACCGCGCCTATGTCAACCTGTGGCTCGAGCGCGACCGCGGCGCCACCAGCTGGGCGAT
GCGCATTCCCGAGGTGGTCGTCTACGGGCCGGAGCACCTCGCCACGCATTTTCCATTAAA
CCACTACAGTGTGCTCAAGCCCGCGGAGGTCAGGCCCCCGCGAGGCATGTGCGGGAGTGA
CATGTGGCGCTGCCGCGGCTGGCAAGGCATGCCGCAGGTGCGGTGCACCCCCTCCAACGC
TCACGCCGCCCTGTGCCGCACAGGCGTGCCCCCTCGGGTGAGCACGCGAGGCGGCGAGCT
AGACCCAAACACCTGCTGGTTCCGCGCCGCCGCCAACGTTGCGCAGGCTGCGCGCGCCTG
CGGCGCCTACACGAGTGCCGGGTGCCCCAAGTGCGCCTACGGCCGCGCCCTGAGCGAAGC
CCGCACTCATGAGGACTTTGCCGCGCTGAGCCAGCGGTGGAGCGCGAGCCACGCCGATGC
CTCCCCTGACGGCACCGGAGATCCCCTCGACCCCCTGATGGAGACCGTGGGATGCGCCTG
TTCGCGCGTGTGGGTCGGCTCCGAGCACGAGGCCCCGCCCGACCACCTCCTGGTGTCCCT
CCACCGTGCCCCCAATGGTCCGTGGGGCGTAGTGCTCGAGGTGCGTGCGCGCCCCGAGGG
GGGCAACCCCACCGGCCACTTCGTCTGCGCGGTCGGCGGCGGCCCACGCCGCGTCTCGGA
CCGCCCCCACCTTTGGCTCGCGGTCCCCCTGTCTCGGGGCGGTGGTACCTGTGCCGCGAC
CGACGAGGGGCTGGCCCAGGCGTACTACGACGACCTCGAGGTGCGCCGCCTCGGGGATGA
CGCCATGGCCCGGGCGGCCCTCGCATCAGTCCAACGCCCTCGCAAAGGCCCCTACAATAT
CAGGGTATGGAACATGGCCGCAGGCGCTGGCAAGACTACCCGCATCCTCGCCGCCTTCAC
GCGCGAAGACCTTTACGTCTGCCCCACCAATGCGCTCCTGCACGAGATCCAGGCCAAACT
CCGCGCGCGCGATATCGACATCAAGAACGCCGCCACCTACGAGCGCGCGCTGACGAAACC
GCTCGCCGCCTACCGCCGCATCTACATTGATGAGGCGTTCACTCTCGGCGGCGAGTACTG
CGCGTTCGTTGCCAGCCAAACCACCGCGGAGGTGATCTGCGTCGGTGATCGGGACCAGTG
CGGCCCACACTACGCCAATAACTGCCGCACCCCCGTCCCTGACCGCTGGCCTACCGAGCG
CTCACGCCACACTTGGCGCTTCCCCGACTGCTGGGCGGCCCGCCTGCGCGCGGGGCTCGA
TTATGACATCGAGGGCGAGCGCACCGGCACCTTCGCCTGCAACCTTTGGGACGGCCGCCA
GGTCGACCTTCACCTCGCCTTCTCGCGCGAAACCGTGCGCCGCCTTCACGAGGCTGGCAT
ACGCGCATACACCGTGCGCGAGGCCCAGGGTATGAGCGTCGGCACCGCCTGCATCCATGT
AGGCAGAGACGGCACGGACGTTGCCCTGGCGCTGGTACGCGACCTCGCCATCGTCAGCCT
GACCCGGGCCTCCGACGCACTCTACCTCCACGAGCTCGAGGACGGCTCACTGCGCGCTGC
GGGGCTCAGCGCGTTCCTCGACGCCGGGGCACTGGCGGAGCTCAAGGAGGTTCCCGCCGG
CATTGACCGCGTTGTCGCCGTCGAGCAGGCACCACCACCGTTGCCGCCCGCCGACGGCAT
CCCCGAGGCCCAAGACGTGCCGCCCTTCTGCCCCCGCACTCTGGAGGAGCTCGTCTTCGG
CCGTGCTGGCCACCCCCATTACGCGGACCTCAACCGCGTGACTGAGGGCGAACGAGAAGT
GCGGTATATGCGCATCTCGCGTCACCTGCTCAACAAGAATCACACCGAGATGCCCGGAAC
AGAACGCGTTCTCAGTGCCGTTTGCGCCGTGCGGCGCTACCGCGCGGGCGAGGATGGGTC
GACCCTCCGCACTGCTGTGGCCCGCCAGCACCCGCGCCCTTTCCGCCAGATCCCACCCCC
GCGCGTCACTGCTGGGGTCGCCCAGGAGTGGCGCATGACGTACTTGCGGGAACGGATCGA
CCTCACTGATGTCTACACGCAGATGGGCGTGGCCGCGCGGGAGCTCACCGACCGCTACGC
GCGCCGCTATCCTGAGATCTTCGCCGGCATGTGTACCGCCCAGAGCCTGAGCGTCCCCGC
CTTCCTCAAAGCCACCTTGAAGTGCGTAGACGCCGCCCTCGGCCCCAGGGACACCGAGGA
CTGCCATGCCGCTCAGGGGAAAGCCGGCCTTGAGATCCGGGCGTGGGCCAAGGAGTGGGT
TCAGGTTATGTCCCCGCATTTCCGCGCGATCCAGAAGATCATCATGCGCGCCCTGCGCCC
GCAATTCCTTGTGGCCGCTGGCCATACGGAGCCCGAGGTCGATGCGTGGTGGCAGGCTCA
CTACACCACCAACGCCATCGAGGTCGACTTCACTGAGTTCGACATGAACCAGACCCTCGC
TACTCGGGACGTCGAGCTCGAGATTAGCGCCGCTCTCTTGGGCCTCCCTTGCGCCGAAGA
CTACCGCGCGCTCCGCGCCGGCAGCTACTGCACCCTGCGCGAACTGGGCTCCACTGAGAC
CGGCTGCGAGCGCACAAGCGGCGAGCCCGCCACGCTGCTACACAACACCACCGTGGCCAT
GTGCATGGCCATGCGCATGGTCCCCAAAGGCGTGCGCTGGGCCGGGATTTTCCAGGGTGA
CGATATGGTCATCTTCCTCCCCGAGGGCGCGCGCAGTGCGGCACTCAAGTGGACCCCCGC
CGAGGTGGGCTTGTTCGGCTTCCACATCCCGGTGAAGCATGTGAGCACCCCAACCCCCAG
CTTCTGCGGGCACGTCGGCACCGCGGCCGGCCTCTTCCATGATGTCATGCACCAGGCGAT
CAAGGTGCTTTGCCGCCGTTTCGACCCAGATGTGCTCGAAGAACAGCAGGTGGCCCTCCT
CGACCGCCTCCGGGGGGTCTACGCGGCTCTGCCTGACACCGTTGCCGCCAATGCTGCGTA
CTACGACTACAGCGCGGAGCGCGTCCTCGCTATCGTGCGCGAACTTACCGCGTACGCGCG
GGGGCGCGGCCTCGACCACCCGGCCACCATCGGCGCGCTCGAGGAGATTCAGACCCCCTA
CGCGCGCGCCAATCTCCACGACGCTGACTAACGCCCCTGTACGTGGGGCCTTTAATCTTA
CCTACTCTAACCAGGTCATCACCCACCGTTGTTTCGCCGCATCTGGTGGGTACCCCACTT
TTGCCACTCGGGAGAGCCCCAGGGTGCCCAAATGGCTTCCACTACCCCCATCACCATGGA
GGACCTTCAGAAGGCCCTCGAGGCACAATCGCGCGCCCTGCGCGCGGGTCTCGCCGCCGG
CGCCTCGCAGTCGCGCCGGCCGCGGCCGCCGCGACAGCGCGACTCCAGCACCTCCGGAGA
TGACTCCGGCCGTGACTCCGGAGGGCCCCGCCGCCGCCGCGGCAACCGGGGCCGTGGCCA
GCGCAAGGACTGGTCCAGGGCCCCGCCCCCCCCCGAAGAGCGGCAAGAAAGTCGCTCCCA
GACTCCGGCCCCGAAGCCATCGCGGGCGCCGCCACAACAGCCTCAACCCCCGCGTATGCA
AACCGGGCGTGGGGGCTCTGCCCCGCGCCCTGAGCTGGGGCCGCCGACCAACCCGTTCCA
GGCAGCCGTGGCGCGTGGCCTGCGCCCGCCTCTCCATGACCCTGACACCGAGGCACCCAC
TGAGGCCTGCGTGACCTCATGGCTTTGGAGCGAGGGCGAAGGCGCGGTCTTCTACCGCGT
CGACCTGCATTTTACCAACCTGGGCACCCCCCCACTCGACGAGGACGGCCGCTGGGACCC
TGCGCTCATGTACAACCCTTGCGGGCCTGAGCCGCCCGCTCACGTCGTCCGCGCGTACAA
CCAACCTGCCGGCGACGTCCGGGGCGTATGGGGTAAAGGCGAGCGCACCTACGCCGAGCA
GGATTTCCGCGTCGGCGGCACGCGCTGGCACCGACTGCTGCGCATGCCAGTGCGCGGCCT
CGACGGCGACACGGCCCCGCTTCCCCCTCACACCACCGAGCGCATTGAGACCCGCTCGGC
GCGCCGTCCTTGGCGCATCCGCTTCGGTGCCCCCCAGGCCTTCCTCGCCGGGCTCTTGCT
CGCCGCGGTCGCCGTTGGCACCGCGCGCGCCGGGCTCCAGCCCCGCGCTGATATGGCGGC
ACCCCCTATGCCGCCACAGCCCCCCCGTGCGCACGGGCAGCATTATGGTCACCACCACCA
TCAGCTGCCGTTCCTCGGGCACGACGGCCATCACGGCGGCACCTTGCGCGTCGGCCAGCA
TCACCGAAACGCCAGCGACGTGCTGCCCGGCCACTGGCTCCAAGGCGGCTGGGGTTGCTA
CAACCTGAGCGACTGGCACCAGGGCACTCATGTCTGTCACACCAAGCACATGGACTTCTG
GTGTGTGGAGCACGACCGACCGCCGCCCGCGACCCCGACGTCTCTCACCACCGCGGCGAA
CTACATTGCCGCCGCCACCCCCGCCACTGCGCCGCCCCCCTGCCACGCCGGCCTCAATGA
CAGCTGCGGCGGCTTCTTGTCTGGGTGCGGGCCGATGCGCCTGCGCCACGGCGCTGACAC
CCGGTGCGGTCGGTTGATCTGCGGGCTGTCCACCACCGCCCAGTACCCGCCTACCCGGTT
TGGCTGCGCCATGCGGTGGGGCCTCCCCCCCTGGGAACTGGTCGTTCTTACCGCCCGCCC
CGAAGACGGCTGGACTTGTCGTGGCGTGCCCGCCCATCCAGGTACCCGCTGCCCCGAACT
GGTGAGCCCCATGGGACGTGCGACTTGCTCCCCAGCCTCGGCCCTCTGGCTCGCCACAGC
GAACGCGCTGTCTCTTGACCACGCGTTCGCGGCCTTTGTCCTGTTGGTCCCGTGGGTCCT
GATATTTATGGTGTGCCGCCGCGCCTGTCGCCGCCGCGGCGCCGCCGCCGCCCTCACCGC
AGTCGTCCTGCAGGGGTACAACCCCCCCGCCTATGGCGAGGAGGCTTTCACCTACCTCTG
CACTGCACCGGGGTGCGCCACTCAAACACCTGTCCCCGTGCGCCTCGCCGGCGTCGGCTT
CGAGTCTAAGATTGTGGACGGCGGCTGCTTTGCCCCATGGGACCTCGAGGCTACTGGAGC
CTGCATTTGCGAGATCCCCACTGATGTTTCGTGCGAGGGCTTGGGGGCCTGGGTACCCAC
AGCCCCTTGCGCGCGCATCTGGAATGGCACACAGCGCGCGTGCACCTTCTGGGCTGTCAA
CGCCTACTCCTCTGGCGGGTACGCGCAGCTGGCCTCTTACTTCAACCCTGGCGGCAGCTA
CTACAAGCAGTACCACCCCACCGCGTGCGAGGTTGAACCTGCCTTCGGACACAGCGACGC
GGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTCGCCCTCGCTAGCTACGT
CCAGCACCCTCACAAGACCGTCCGGGTCAAGTTTCATACAGAGACTAGGACCGTCTGGCA
ACTCTCCGTAGCCGGCGTGTCGTGCAACGTCACCACTGAACACCCGTTCTGCAACACGCC
GCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCTGGGGACCTGGTCGAGTACATTAT
GAATTACACCGGCAACCAACAGTCCCGGTGGGGCCTCGGGAGCCCGAATTGTCATGGCCC
CGATTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGC
CACGCCAGAGCGTCCCCGGCTGCGCCTGGTCGACGCCGACGACCCCCTGCTGCGCACTGC
CCCCGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCTCAGGCGCGCAAGTGCGG
ACTCCACATACGTGCTGGACCGTACGGCCATGCTACCGTCGAAATGCCCGAGTGGATCCA
CGCCCACACTACCAGCGACCCCTGGCACCCACCGGGCCCCTTGGGGCTGAAGTTCAAGAC
AGTTCGCCCGGTGGCCCTGCCACGCGCGTTAGCGCCACCTCGCAATGTGCGTGTGACCGG
CTGCTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTTGCCCCAGGGGGAGGGAACTG
CCATCTTACCGTCAATGGCGAGGACGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAAGTTCGTCACCGC
CGCCCTCCTCAACACTCCCCCGCCCTACCAAGTCAGCTGCGGGGGTGAGAGCGATCGCGC
GAGCGCGCGGGTCATTGACCCCGCCGCGCAATCGTTTACCGGCGTGGTGTATGGCACACA
CACCACTGCTGTGTCGGAGACCCGGCAGACCTGGGCGGAGTGGGCTGCTGCTCATTGGTG
GCAGCTCACTCTGGGCGCCATTTGCGCCCTCCTACTCGCTGGCTTACTCGCTTGCTGTGC
CAAATGCTTGTACTACTTGCGCGGCGCTATAGCACCGCGCTAG.
Annexe 4: United Nations : Demographic Historical supplement-Nations Unies:
Annuaire démographique, supplement rétrospectif
Live births by age of mother, sex and urban/rural residence: 1948-1997.
Naissance vivantes selon l’âge de la mère, le sexe et la résidence,
urbaine/rurale:1984/1997
All ages
Tous âges
-1
1-4
5-9
10-14
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
11626232
303583
1891227
1872850
1082720
722320
907526
956745
840388
640961
12665000
2357400
[=>]
[0-4]
1881700
1566900
1279300
1071000
903600
769800
648500
12959000
2412100
[=>]
[0-4]
1925400
1603300
1309000
1095900
924600
787700
663500
13033000
2462600
[=>]
[0-4]
1953000
1623300
1334600
1113600
920700
777400
652300
13725000
2602000
[=>]
[0-4]
2058000
1716000
1407000
1173000
960000
810000
679000
14140000
2661800
[=>]
[0-4]
2120200
1760200
1451600
1203400
990500
838200
706600
14580000
2752600
[=>]
[0-4]
2191400
1818300
1503400
1244500
1015300
858900
724300
15050000
2841300
[=>]
[0-4]
2262000
1876900
1551900
1284600
1048000
886600
747600
15310000
2924300
[=>]
749400
15153806
333874
15704000
2946000
16165000
18794000
[0-4]
2314500
1916500
1595100
1318000
1055500
883300
2129962
2446711
2086570
1449887
1044782
903917
879478
808534
[=>]
[0-4]
2393000
1977000
1643000
1360000
1095000
908000
766000
2968000
[=>]
[0-4]
2488000
2047000
1700000
1408000
1140000
937000
789000
3182000
[=>]
[0-4]
2972000
2427000
2009000
1662000
1366000
1091000
911000
20449551
3110382
[=>]
[0-4]
2930793
2580134
2234831
1997699
1557797
1147529
843463
26069000
3313000
[=>]
[0-4]
3260000
3277000
2954000
2535000
2162000
1822000
1482000
26019280
3173689
[=>]
[0-4]
3255752
3206068
2842094
2534732
2049059
1935781
1575187
27111000
3282000
[=>]
[0-4]
3247000
3312000
3102000
2697000
2296000
1951000
1614000
5809172
152247
920916
955045
616109
370937
406634
434767
390269
332918
6331000
1181100
[=>]
[0-4]
941800
785200
640000
534200
452500
387000
327700
6478000
1208500
[=>]
[0-4]
963700
803400
654900
546600
463000
396000
335300
6518000
1233200
[=>]
[0-4]
977000
812800
668800
557900
462100
390400
329800
6864000
1305000
[=>]
[0-4]
1029000
858000
707000
590000
480000
405000
343000
7063000
1332600
[=>]
[0-4]
1060800
881400
726400
601100
494400
420000
356900
7283000
1377800
[=>]
[0-4]
1096200
910300
752100
621000
507100
430100
366300
7518000
1422200
[=>]
[0-4]
1131600
939700
776400
641000
523500
444000
378100
7651000
1463700
[=>]
378700
7585905
171929
7852000
1480000
8090000
1494000
9405000
1613000
10236078
1577129
12792000
1691000
12944517
1614133
[0-4]
1157400
958500
798700
659400
528600
443700
1074706
1243140
1101701
744199
498509
401632
386781
388889
[=>]
[0-4]
1198000
989000
823000
680000
548000
455000
386000
[=>]
[0-4]
1244000
1026000
853000
705000
570000
471000
397000
[=>]
[0-4]
1486000
1214000
1006000
832000
682000
546000
458000
[=>]
[0-4]
1492263
1323818
1100678
997446
787171
566134
397216
[=>]
[0-4]
1640000
1682000
1500000
1216000
1016000
859000
723000
[=>]
[0-4]
1657177
1616822
1409093
1247455
980472
922654
804010
13310000
1676000
[=>]
[0-4]
1637000
1693000
1589000
1329000
1078000
918000
775000
5817060
151336
970311
917805
466611
351383
500892
521978
450119
308043
6334000
1176300
[=>]
[0-4]
939900
781700
639300
536800
451100
382800
320800
6481000
1203600
[=>]
[0-4]
961700
799900
654100
549300
461600
391700
328200
6515000
1229400
[=>]
[0-4]
976000
810500
665800
555700
458600
387000
322500
6861000
1297000
[=>]
[0-4]
1029000
858000
700000
583000
480000
405000
336000
7077000
1329200
[=>]
[0-4]
1059400
878800
725200
602300
496100
418200
349700
7297000
1374800
[=>]
[0-4]
1095200
908000
751300
623500
508200
428800
358000
7532000
1419100
[=>]
[0-4]
1130400
937200
775500
643600
524500
442600
369500
7659000
1460600
[=>]
[0-4]
1157100
958000
796400
658600
526900
439600
370700
7567901
161945
1055256
1203571
984869
705688
546273
502285
492697
419645
7852000
1466000
[=>]
[0-4]
1195000
988000
820000
680000
547000
453000
380000
8075000
1474000
[=>]
[0-4]
1244000
1021000
847000
703000
570000
466000
392000
9389000
1569000
[=>]
[0-4]
1486000
1213000
1003000
830000
684000
545000
453000
10213473
1533253
[=>]
[0-4]
1438530
1256316
1134153
1000253
770626
581395
446247
13277000
1622000
[=>]
[0-4]
1620000
1595000
1454000
1319000
1146000
963000
759000
13074763
1559556
[=>]
[0-4]
1598575
1589246
1433001
1287277
1068587
1013127
771177
13801000
1606000
[=>]
[0-4]
1610000
1619000
1513000
1368000
1218000
1033000
839000
3411671
97046
484867
490422
340673
250092
284319
286167
266669
215353
312142
5357163
119173
690500
820153
751342
575808
399108
313829
317963
8733507
1107522
[=>]
[0-4]
1086955
1088973
1050623
994031
776229
553469
386159
13149000
1321000
[=>]
[0-4]
1429000
1456000
1558000
1506000
1300000
1068000
857000
13356246
1437766
[=>]
[0-4]
1439798
1510606
1423889
1401058
1218714
1142618
937313
13993000
1360000
[=>]
[0-4]
1412000
1506000
1602000
1606000
1437000
1183000
954000
1692215
49104
242040
242010
177760
121340
126050
133043
129005
113404
2620771
60780
351267
409184
368784
277735
186856
141883
138745
148371
4378706
560813
[=>]
[0-4]
549846
543092
514555
503000
402287
287076
188741
6616000
671000
[=>]
[0-4]
729000
762000
828000
770000
649000
516000
430000
6632953
730558
[=>]
[0-4]
724473
758074
702787
694510
585698
543467
480283
7084000
690000
[=>]
[0-4]
718000
787000
861000
843000
730000
583000
469000
1719456
47942
242827
248412
162913
128752
158269
153124
137664
101949
2736392
58393
339233
410969
382558
298073
212252
171946
179218
163771
4354801
546709
[=>]
[0-4]
537109
545881
536068
491031
373942
266393
197418
6533000
650000
[=>]
[0-4]
700000
694000
730000
736000
651000
552000
427000
6723293
707208
[=>]
[0-4]
715325
752532
721102
706548
633016
599151
457030
6909000
670000
[=>]
[0-4]
694000
719000
741000
763000
707000
600000
485000
Annexe 5
Elsevier Editorial System(tm) for Journal of Clinical Virology
Manuscript Number: JCV-S-06-00221
Title: phylogenetic analysis of rubella viruses found in Morocco, Uganda, Ivory Coast and South
Africa from 2001 to 2004.
In press (Accepted on January 2007)
Phylogenetic analysis of rubella viruses found in Morocco, Uganda Ivory Coast and
South Africa from 2001 to 2004
Hayat Caidi1,3, Emily S. Abernathy2, Abdelaziz Benjouad3, Sheilagh Smit4, S.D.K Sempala 5,
Rajae El Aouad1 and Joseph Icenogle2.
1
National Institute of Health-Morocco, 2 Centers for Disease Control and Prevention
(CDC) Atlanta, Georgia, 3University Mohamed V Faculty of Sciences, Rabat-Morocco,
4
National Institute for Communicable Diseases (NICD)-South Africa, 5 Uganda Virus
Institute, Kampala, Uganda,
Abstract
Background: Rubella virus (RV) causes a mild disease, with rash and fever. Maternal
infection during the first trimester of pregnancy can lead to severe birth defects known as
congenital rubella syndrome (CRS). Objectives: In Africa, including Morocco, Uganda,
Ivory Coast and South Africa, rubella remains poorly controlled. Identifying indigenous
rubella genotypes can allow monitoring and elimination of the indigenous viruses in each
country. Study design: Fifty samples collected between 2001 and 2004 during measles
outbreaks in Morocco, Uganda and South Africa and two samples from a CRS case
imported from Ivory Coast into the United States were analysed. RT-PCR and nested RTPCR amplification and sequencing of RNA coding for the E1 gene were done. Results:
Seven strains were analyzed. The viruses were assigned to three genotypes (1E, 1g and
2B). The Ugandan, Ivorian and Moroccan viruses were Clade 1 viruses, while the South
African virus was a Clade 2. Conclusions: Africa is now the third continent from which
both Clade 1 and Clade 2 viruses have been identified. As this is the first molecular
epidemiologic study of RV from Africa, these results will help provide a basis for
monitoring of control and elimination of African rubella viruses.
Key words: Rubella; genotype; molecular characterization; sequences.
1- Introduction
Rubella virus (RV) infection during the
early stages of pregnancy can lead to
serious birth defects, which are referred
to as congenital rubella syndrome
(CRS). Concentration on comprehensive
rubella
vaccination
has
recently
increased in developing countries in
conjunction with measles elimination
efforts, particularly in the Americas and
Europe (MMWR, 2005a, PAHO’s
Immunization Unit, 2006). As part of the
surveillance component of these efforts,
an understanding of the worldwide
molecular epidemiology is necessary
(Wkly Epi Rep, WHO, 2005b).
RV was isolated in 1961, and rubella
vaccines became available in the late
1960s. Despite of the success of rubella
vaccination programs, RV remains
endemic in many regions of the world,
primarily because of low vaccine use
(Zheng D-P et al., 2003a). Rubella is
endemic in Africa and vaccination is
available only in the private sector. In
Morocco, for example, rubella vaccine
has been offered only in the private
sector since 1987, and no surveillance
data for the incidence of RV or CRS are
available (Sharon et al., 2005). No
rubella outbreaks have been documented
in South Africa, but many cases are
detected as a result of surveillance for
measles (Republic of SA Health Dept. ,
2005).
In Ivory Coast, a rubella
outbreak was identified in 2004 and was
linked to four refugee transit centers,
resulting in 34 confirmed rubella cases
(MMWR, 2005b).
RV is the sole member of the genus
Rubivirus in the family Togaviridae. The
genome is a single stranded RNA of
positive polarity that is 9762 nucleotides
(nts) in the length. In the virion, the
genome RNA is contained in a
quasispherical capsid composed of the C
protein, which is in turn surrounded by a
lipid bilayer envelope in which two
glycoproteins, E1 and E2, are embedded.
The genome contains two open reading
frames (ORFs): the 5’proximal ORF (the
nonstructural protein ORF or NS-ORF)
and the 3’ proximal ORF (the structural
protein ORF or SP-ORF) (Zheng, D-P et
al., 2003c). Most
previous
phylogenetic studies have focused on all
or part of the E1 for genotyping of RV
(Hofmann. J et al., 2003; Shigetaka. K
et al., 1997; Shigetaka. K et al., 2004).
A number of previous studies looking
at rubella from countries in the
Americas, Europe and Asia have been
published (Reef SE et al., 2002; Zheng
D-P et al., 2003b; Frey TK et al., 1998;
Icenogle, JP et al., in press). In 2005 a
systematic nomenclature for wild-type
RV was published by the WHO (Reef
SE et al., in press). A 739 nucleotides
region within the coding region for the
E1 protein was set as the standard region
to
sequence
for
molecular
epidemiological purposes. RVs were
classified into 2 virus clades formerly
called genotypes 1 and 2 (Zheng, DP et
al., 2003b). This was a departure form
the terminology previously used. The
systematic nomenclature divided rubella
viruses into 2 clades (1 and 2), 7
genotypes (designated by clade and a
letter designation, (, 1B, 1C, 1D, 1E, and
1F2A, 2B), and 3 provisional genotypes
(1a, 1g and 2c,). Genotype 1a and 1g are
provisional because the relationship
between these groups of viruses and
other genotypes is not completely
characterized (WHO, Wkly Epidemiol
Rec, 2005a; Icenogle J.P et al., in press).
At least one virus of genotype 1 g has
been described in previous publication
(WHO, Wkly Epidemiol Rec, 2005a).
Genotype 2c is provisional because
reference viruses for this genotype have
not yet been fully characterized. The
WHO terminology for describing rubella
phylogeny will be used in the rest of this
paper.
In this report, we have analyzed the
first rubella sequences obtained from
Africa. This data contributes important
genetic baseline information on a region
of the world from which no data has
previously been available.
2- Materials and Methods
2-1 Specimen
A total of 52 samples were used in
this study, most associated with measles
outbreaks. Thirteen samples, all nasal
aspirants, were collected in Uganda in
2001. Six urine samples were collected
in South Africa in 2002 and 31 urine
samples came from Morocco during
2002 and 2004. Two samples from one
patient were from New Hampshire,
USA, as part of a CRS case evaluation.
Epidemiological evidence suggested that
the mother of the CRS case had been
infected with rubella early in her
pregnancy in Ivory Coast (MMWR,
2005b).
2-2 laboratory methods
Specimens were inoculated onto Vero
cells. Since clinical isolates of RV rarely
exhibit
cytopathic
effect
(CPE),
detection of virus was done by RNA
extraction and reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR).
RNA was extracted from infected cells
using the Guanidinium acid-phenol
technique
(Tri-Reagent,
Molecular
Research Center, Cincinnati, Ohio). RTPCR using the Titanium One Step kit
(BD Bioscience, San Jose, CA) was used
to amplify either 601 nucleotides (nts)
(8869-9469) or 739 nts (8731-9469) of
the E1 coding region. Primers used to
amplify the 601 nts region were RV8812
(5’caacacgccgcacggacaac) (Best JM et
al.,
2005)
and
RV3’
(5’_ttttttttttttttttttctatacagcaacaggtgc)
(Purgachev KV et al., 1997). Primers
used to amplify the 739 region were
RV8656 (5’ccccaccgacaccgtgatgag) and
RV3’.
In cases where an isolate could not be
obtained, RNA was extracted directly
from the clinical sample using either 250
µl of samples and Tri-Regent for Liquid
Samples (LS) (MRC) or 140 µl of
samples and the QIAmp Viral Mini Kit
(Qiagen, Valencia, CA).
Due to the small amounts of rubella
RNA present in clinical samples, nested
set RT-PCR reactions were necessary to
amplify sufficient DNA for sequencing
directly from the samples. Two pairs of
primers were chosen to amplify a 722
nts fragment (8823-9545) and the
Titanium One-Step RT-PCR kit was
used with one modification: the oligo
(dT) primer was omitted from the
reaction and replaced with RNAse-free
water. 5 µl of extracted RNA was added
to the 50µl reaction mix containing
45µM of primers RV8812 and RV3’, 3
µl of the first round mixture was
transferred to the second round reaction
(PCR) containing 45µl M of primers
RV8823 (5’acggacaactcgaggtcc) and
RV9545 (5’tggtgtgtgtgccatac). Aliquots
of 5 µl were run on a 1.5% agarose gel
and visualized by ethidium bromide
staining after electrophoresis.
2-3 Sequencing and data Analysis
RT-PCR products were purified using
the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System (Promega). Templates were
sequenced using fluorescent dye
terminators (BigDye, Perkin-Elmer) and
the reaction products were analyzed
using an ABI 3100 (Perkin-Elmer)
automatic sequencer. Sequence data
were analyzed with version 10.1 of the
Genetics Computer Group Package
(GCG) (Accelrys).
Phylogenetic
analyses were performed using the
PAUP Search program and the Bayesian
analysis program, MrBayes 3.0.
3- Results
Out of a total of 52 clinical samples
from 51 patients collected for this study,
eight (15%) tested positive, either by
direct RNA extraction and nested set
RT-PCR or by culture followed by RNA
extraction and RT-PCR. Only the
Uganda and Ivory Coast specimens
contained infectious virus and were RTPCR positive after inoculation in cell
culture. Four out of 31 Morocco and one
out of 6 South Africa urine specimens
contained sufficient amounts of rubella
RNA to produce the size of fragment
required for sequencing by nested set
RT-PCR using RNA extracted directly
from the specimen (Table 1).
Sequences obtained from the samples
used in this study, were compared with
the 22 approved reference virus
sequences and three sequences that
represent the additional two provisional
genotypes, thereby including all the
genotypes of Clades 1 and 2 (Figure 1).
Analysis of the 601 nts sequences
showed that the seven African sequences
fell into three different genotypes
(Figure 1A). The Uganda sequence
branched with an Israeli virus
(RVi/EinVered.ISR/92[1g]) which has
been shown to group with other
sequences obtained from European
viruses from 1991-1998 (Zheng D-P et
al., 2003b). This group was recently
designated as provisional genotype 1g
(WHO, Wkly Epidemiol Rec, 2005a)
and the Israeli virus was included in the
analysis to represent this proposed
genotype. The virus imported to the US
from Ivory Coast also fell on the
genotype 1g branch. The four Moroccan
sequences grouped with genotype 1E.
The other viruses in the 1E genotype are
widely geographically distributed and all
date from 1997 and after, prompting the
description of this group as a recently
emerged international genotype (Zheng,
DP et al., 2003b. The South African
sequence grouped with Genotype 2 B
viruses, which also includes viruses from
China, India and Israel. The seven
African
sequences
come
from
geographically distant locations within
the African continent with Morocco
located in the north, South Africa in the
South, Uganda in the center and Ivory
Coast in the west. Africa now is the third
continent from which both clade 1 and
clade 2 viruses have been identified
(Figure 2).
The sequences of 739 nts (8731-9469)
of WHO approval sequence region were
obtained for the two isolates (UGA/01
and Lebanon.NH.USA/04) and were
compared with the same sequences as
the 601 tree. There was no RNA
remaining from the Morocco and South
African viruses, so the additional
sequence data was unobtainable. The
resulting tree (Figure1B) shows that, as
with the 601 nts tree, the Uganda and
Ivorian sequences group with the
representative
1g
virus
(EinVered.ISR/92).
4- Discussion
This is the first report of the genetic
characterization of wild-type RVs from
the African continent. Molecular typing
of (RV) can be a valuable aid in tracking
transmission pathways and the collection
of baseline data about endemic viruses is
an important first step in this process.
The difficulties of collecting clinical
specimens include improper collection
techniques
and
inadequate
transportation. In addition, collection of
specimens for RV is difficult, in part due
to the mildness of the illness, as patients
do not feel ill enough to seek medical
help. The only specimen collected in
Africa that yielded infectious virus was
the nasal aspirant collected in Uganda.
Unfortunately, urine, which is a common
clinical sample collected for measles
isolation, is not the optimal sample for
RV isolation (William, JB et al., 2003),
the best results come from throat swabs
(Zimmerman L et al., 2002, Willaim B
et al., 2003). However, maximum viral
shedding is up to four days after rash
onset and the viral load is low (Best JM
et al., 1989, Bosma TJ et al., 1989;
Zimmerman, L et al., 2002). Delay in
collecting a specimen may result in
clearance of the virus by the host’s
immune system and degradation of any
viral genome by nucleases (Flavia F.
Donadio, et al., 2003). For these reasons,
the rate of identification of virus from
clinical samples was low in this study.
Phylogenetic analysis of rubella
sequences showed that two and possibly,
three genotypes of RV, were circulating
in Africa during 2001 to 2004.
Genotype 1E was identified in Morocco
in connection with measles outbreaks,
one in 2002 and three in 2004. The fact
that the same genotype was found in two
different years suggests that endemic
transmission was occurring. Genotype
1E has been found in several European
countries including Italy (1997),
Germany (1999), and the UK (1999,
traced to importations from Greece). In
light of the frequency of travel between
Europe and Morocco, it is not surprising
to find the same genotype in both
regions. Genotype 1E began appearing
in many geographically distant regions
(South America, the Caribbean, China,
the USA and Malaysia in addition to
Europe) beginning in 1997 and the
source of this virus is unknown.
Genotype 1g was present in the two
central African countries of Uganda and
Ivory Coast in two different years which,
again, suggests this genotype was
circulating in this part of the continent.
A single specimen in a single year in
southern Africa was found to be
genotype 2B. In addition, very little
epidemiological information is available
about the specimen. Therefore, there is
not enough evidence to state that
genotype 2B is circulating in Africa. A
single isolate of a genotype 2B virus was
identified in the United States in 2000
and this case was epidemiologically
determined to be an importation from
India (Reef, SE et al., in press) and this
could be the case with the South African
case, as well. This highlights the need
for collection of epidemiological data
along with the clinical samples and the
need for collections of samples to
continue over time. A comparison of
phylogenetic trees made with the 601
and 739 windows for the two African
isolates documented that they were
genotype 1g. The clustering of viruses
from genotype 1B and 1g is more
sensitive to the sequence window used
than that of viruses from genotypes 1C,
1D, 1E,1F, 2A, 2B or 2c (WHO, Wkly
Epidemiol Rec, 2005a).
In June of 2004 the WHO Steering
Committee on Research Related to
Measles and Rubella Vaccines and
Vaccination met to identify issues that
need to be addressed to improve the
global control of rubella and CRS. One
of the issues discussed was the need to
collect genetic baseline data on rubella
viruses from many countries and
populations. The viruses described in
this report are a first step in the
determination of the endemic genotypes
of rubella found on the African
continent.
This
molecular
epidemiological data has already proved
useful in the investigation of a CRS case
in the United States (Reef et al., in
press). The knowledge that a 1g virus
had been isolated in Uganda and that this
virus was closely related to the virus
isolated from the CRS case provided
support that this was a case imported
from Africa.
Implementation of
integrated measles/rubella protocols in
which measles negative cultures of
Vero/SLAM cells would be screened for
the presence of rubella virus will
hopefully allow the routine collection of
rubella viruses in WHO Measles/Rubella
Laboratory Networks labs. This report
Table 1: Wild-type rubella viruses from Africa
Sequenced for this study.
WHO
name
and
genotyp
e
Rvs/Ber
kane.M
OR/24.
02[1E]
Rvs/Ouj
da.MO
R/23.04
[1E]
Rvs/Tar
oudant.
MOR/2
2.04[1E
]
Rvs/Tet
ouan.M
OR/29.
04[1E]
Rvi/UG
A/20.01
[1g]
Rvs/We
stonaria
.SOA/4
7.03[2B
]
Rvi/Leb
anon.N
H.USA/
44.04[1
g]
Country
Age
Speci
men
DOC
Results
Morocco
7
urine
2 days
Positive
Morocco
7
urine
2 days
Positive
Morocco
5
urine
2 days
Positive
Morocco
10
urine
2 days
Positive
Uganda
2
9 days
unknow
n
South
Africa
5
nasal
aspirat
e
urine
UK
Positive
Ivory
Coast
Birth
Throat
swab,
urine
2.5
month
s
Positive
shows that measles negative samples can
be used to isolate and identify rubella
viruses.
As more rubella molecular
epidemiology data becomes available, it
can be used to establish transmission
pathways as has been done for other
viruses such as measles and polio and,
thereby, contribute to effective rubella
and CRS control.
B
A
Figure 1: Phylogenetic analysis of
sequences of portions of the E1 coding
region of wild-type rubella viruses from
four African countries. The unrooted trees
were made using the MrBayes 3.0 with
200,000 ngens and burnin of 400. Nodes
with clade credibility values of 0.80 and
above are indicated on the trees. The 22
WHO accepted reference strains are in
black, temporary strains are in blue, and
African sequences are in red. Vaccine
strains are in black with asterix. The tree A
was constructed using 601 nucleotides
(8869-9469) and contains all 7 African
viruses in addition to the reference strains.
The tree B was constructed using 739
nucleotides (8731-9469) and contains the
two 1g African viruses in addition to the
reference strains.
Conflict of interest statement
We declare that we have no conflict of interest.
Acknowledgments
: We would like to thank our colleagues
at the INH (National Institute of
Hygiene), the Epidemiology Department
References
Best, JM., Castillo, Solórzano. Spika, JS.,
Icenogle, J., Glasser, JW., Gay, NJ.,
Andrus, J., Arvin, AM. 2004. Reducing the
global burden of congenital Rubella
syndrome: Report of the world Health
MoH in Morocco, Uganda and South
Africa for their assistance.
organization
steering
committee
on
Research Related to Measles and Rubella
vaccines and vaccination, June. J. Infect. Dis
2005 Dec, 1; 192 (11):1890-7
Best, JM., O’Shea S. 1989. Rubella virus
in: Schmidt NJ, Emmons RW, editors.
Diagnostic procedures for viral, Rickettsial
ans Chlamydial infections. 6th Ed.
Washington DC: American Public Health
Association 731-95
Bosma, TJ., Best, JM., Corbett, KM.,
Banatvala, JE., Starkey, WG. 1996.
Nucleotide sequence analysis of a major
antigenic domain of the E1 glycoprotein of
the 22 rubella virus isolates. Gen Virol;
77:2523-30.
Centers for Disease Control and
Prevention. 2005a. Global Measles and
Rubella Laboratory Network, January 2004June 2005. MMWR Morb Mortal Wkly
Rep; 54:1100-4
Centers for Disease Control and
Prevention. 2005 b. Achievements in public
health: elimination of rubella and congenital
rubella syndrome-Unites States, 1969-2004,
MMWR; 54:279-82.
Flavia, F Donadio., Marilada, M., Siqueira,
Andrew, Vyse., Li, Jin., Solange,
A.Oliveira. 2003. The genomic analysis of
rubella virus detected from outbreak and
sporadic cases in Rio de Janeiro state,
Brazil. Journal of Clinical Virology 27.
205-209.
Frey, TK., Abernathy, ES., Bosma, TJ.,
Starkey, WG., Corbett, KM., Best, JM.
1998. Molecular analysis of rubella virus
epidemiology across three continents, North
America, Europe, and Asia, 1961-1997 J
Infect Dis; 178 (3): 642-50
Hofman, J., M, Renz., S, Meyer., A.Von,
Haeseler., UG, Liebert. 2003. Phylogenetic
analysis of rubella virus including new
genotype I isolate. Virus Research 96. 123128.
Icenogle, J.P., Frey, T.K., Abernathy, E.,
Reef, S.E., Schnur, D., and Stewart, J.A.
Genetic Analysis of Rubella Viruses Found
in the United States between 1966 and 2004:
Evidence that Indigenous Rubella Viruses
have been Eliminated. Clin Infect Dis. In
Press
Pan American Health Organization.
Rubella WATCH. 2006. Rubella and CRS
elimination. PAHO’s Immunization Unit,
April-May.
Pugachev, KV., Abernathy, ES., Frey,
TK. 1997. Genomic sequence of the RA27/3
vaccine strain of rubella virus. Arch Virol
1997; 142:1165–80.
Reef, SE., Tery, K Frey., K, Theall.,
Emily, Abernathy., J, Icenogle and
Melinda Wharston. 2002. The Changing
Epidemiology of Rubella in the 1990s. On
the Verge of Elimination and New
Challenges for Control and Prevention.
JAMA, January 23/30, vol287, No.4.
Reef, SE., Redd, SB., Abernathy, E et al.,
in press. The epidemiology of rubella and
CRS in the United States: the absence of
endemic transmission. Clin Infect Dis, In
Press.
Republic of SA Health Department.
Statistical Notes, January 2005
Sharon, Bloom., Ahmed, Rguig., Amina,
Berraho.,
Layla,
Zniber.,
Naima,
Bouazzaoui., Khalid, Zhaghloul., Susan,
Reef., Ahmed, Zidouh., Mark, Papania.,
Jane, Seward. 2005. Congenital rubella
syndrome burden in Morocco: a rapid
retrospective assessment. Lancet; 365-41
Shigetaka, Katow., Hiroko, Minahara.,
Masso,
Fukushima.1997.
Molecular
Epidemiology of Rubella by Sequences of
the Rubella Virus E1 Gene in Three East
Asian Countries. The journal of Infectious
Diseases; 176:602-16.
Shigetaka Katow. 2004. Molecular
epidemiology of rubella virus in Asia:
Utility for reduction in the burden of disease
due to congenital rubella syndrome.
Pediatrics International. 46, 207-213.
Weekly Epidemiological Record. 2005 a.
Standardization of the nomenclature for
genetic characteristics of wild-type
rubella viruses. Weekly Epi Rec N.14, 80,
125-132.
Weekly Epidemiological Record. Measles
mortality
reduction
and
regional
elimination strategic plan 2001-2005.
Geneva, Switzerland: World Health
Organization; 2005b. WHO/V&B/01/13.
William J. Bellini and Joseph Icenogle.
Measles and Rubella viruses in: Manual
of clinical Microbiology, 8th Edition,
volume 2. p: 1395-1397, 2003.
Zheng, Du-Ping., Hong, Zhu., Maria, G.
Revello., Giuseppe, Gerna., and Teryl K.
Frey. 2003a. Phylogenetic Analysis of
Rubella Virus Isolated during a Period of
Epidemic transmission in Italy, 1991–1997.
JID: 187 (15 May), 1587
Zheng, Du-Ping., Tery, K. Frey., Joseph,
Icenogle., Shigetaka, Katow., Emily, S.
Abernathy., Ki-Joon, Song., Wen-Bo, Xu
et al. 2003b. Global Distribution of Rubella
Virus Genotypes. Emerging Infectious
Diseases. Vol 9, No.12, December.
Zheng, Du-Ping., YM, Zhou., K.Zhao, Y.,
R. Han and TK, Frey. 2003c.
Characterization of genotype II Rubella
virus strains. Archives of Virology
148:1835-1850.
Zimmerrman, Laura., Susan, Reef. 2002.
Rubella: Chapter 11, VPD surveillance
Manual, 3rd Edition, 11-1
EASTERN MEDITERRANEAN HEALTH JOURNAL
Date: 20 August 2006, EMHJ.8/314
R4/27/8, Manuscript No.: 06/434
In press (Accepted on December 2006)
Rubella Seroprevalence among women 15-39 years
of age, Morocco, 2002
1,4
Hayat Caidi, 2Sharon Bloom, 3Mustapha Azilmaat, 4Abdelaziz Benjouad,
2
1
Susan Reef and 1Rajae El Aouad.
National Institute of Hygiene Rabat-Morocco,
2
National Immunization Program,
Centers for Disease Control and Prevention, CDC Atlanta
4
3
Ministry of Health,
University Mohamed V, Faculty of Sciences, Rabat Morocco
Abstract
Background: Rubella causes a mild rash illness in children and adults. However, rubella
infection during pregnancy can result in devastating consequences including
miscarriages, fetal death, premature delivery, and a spectrum of birth defects known as
the congenital rubella syndrome (CRS). Objective: This study was designed to determine
the age –specific rubella seroprevalence of women in childbearing age in Morocco and to
contribute the development of a rubella strategy in the country. Study design: A
serological study was conducted in 2002 among women 15-39 years of age by testing for
rubella IgG antibodies. Results: Of 967 women, 16.7% were found to be susceptible to
rubella. Significantly higher susceptibility among women 15-19 years old was observed.
An estimated 85.474 live births occur annually to rubella susceptible women. No
statistical significance rate of seroprevalence in women in rural or urban areas, 81.3%
and 83.2% respectively. Conclusion: Our findings may be useful to suggest vaccination
women aged <35 years in Morocco. Substantial risk of rubella infection exists for
Moroccan women of childbearing age. Prevention of CRS will require either surveillance
or vaccination or a combination of both.
Key words: Rubella, congenital rubella syndrome, Morocco, seroprevalence, women of
childbearing age WCBA.
Introduction:
Rubella is a mild rash illness in adults
and children and up to 50 % of cases are
asymptomatic. However, if a pregnant
woman is infected during her pregnancy,
particualry during the first trimester of
pregnancy, serious consequences such as
miscarriage, fetal death/stillbirth or a
combination of serious, debilitating birth
defects known as congenital rubella
syndrome may occur. [20, 23]. The
clinical manifestations of CRS include
hearing impairment, heart defects, ocular
abnormalities and mental retardation.
Worldwide, it is estimated that over
100,000 infants are born with CRS
annually [14].
The main goal of any rubella
vaccination program is to eliminate or
reduce rubella infection in pregnant
women and the consequential congenital
rubella syndrome (CRS) in their babies
[2]. A country’s decision to begin infant
or childhood rubella vaccination often
relates to the level of its measles control
and planned enhanced measles control
activities [4]. In the 2000’s WHO
meeting on CRS, one of the
recommendations was for countries who
are undertaking measles elimination
should consider rubella elimination by
using measles-and rubella-containing
vaccine through the childhood program.
In addition, countries should ensure
immunity among women of childbearing
age [9].
In 2003, Morocco introduced MR
(measles-rubella) vaccine into their
routine childhood program.
Children
aged 6 years (school entry) were to
receive MR vaccine. Routine measles
coverage in Morocco is estimated at
94% in 2005 [10]. Estimated MR
coverage is greater than 90%. While
Morocco does not collect rubella and
CRS surveillance data, at least three
Seroprevalence studies in Moroccan
women of childbearing age undertaken
between 1970 and 1999 showed that
14.8 to 33.5% were seronegative [16,
17]. A retrospective chart review
performed by one of the authors
estimates an average annual CRS rate of
8.5 per 10,000 live births between 19902000 [21]. MMR vaccine has been
increasingly used in the private sector of
Moroccan cities since 1987, but as of
2002, nationwide only about 5% of the
birth cohort was vaccinated against
rubella
(Aventis-Pasteur,
written
communication, 2003). To provide the
Moroccan Ministry of Health with a
current profile of rubella risk among
women of childbearing age, we
performed a serological study on an
existing collection of sera from year
2000
nationally
representative
serosurveys for anemia.
Methodology
To access the seroprevalence of
rubella in Morocco, sera was used from
a UNICEF-sponsored, Ministry of
Health Project conducted in year 2000
with the primary goal estimating the
prevalence and risk factors for irondeficiency anemia and goiter among
women of reproductive age. The
sampling of women in UNICEFsponsored study used the same sampling
scheme as what was used in the 1997
National Survey of the Health of Mother
Child Survey (PAPCHILD) [1].
In the original 2000 study, 1524
WCBA aged 15 to 45 years were
enrolled. Of these women, 967 sera
(63.5 %) were available for testing of
rubella specific Immunoglobin G (IgG).
All testing was conducted at the National
Laboratory in Rabat, Morocco. The
Wampole
IgG
enzyme
linked
immunoassay was used to detect rubellaspecific IgG antibodies, according to the
manufacturer’s
specifications.
For
quality assurance, 10 % of the negative
and positive sera retested at CDCAtlanta
Measles-Mumps-Rubella
laboratory. The 10% of positive and
negative sera retested at CDC were
consistent with results in Morocco. The
limit of detection of the test is 6.2 IU/ml.
Individuals having an IgG titer of >= 8.6
IU/ml were defined as seropositive.
Titers of 6.2 and 8.6 IU/ml were
classified as equivocal. In this analysis,
women with equivocal or negative test
results were considered susceptible
which yielded a maximum estimate of
rubella susceptibility for the purpose of
developing a vaccination strategy.
Five-year age strata (15-19, 20-24, 2529, 30-34, and 35-39) were used to
describe susceptibility levels. Data were
analyzed in Epi Info 6. The Pearson chisquare test was used to examine the
association between susceptibility and
age.
We estimated the number of CRS cases
by fitting various catalytic models to the
seroprevalence data via the method of
maximum likelihood. Using the agespecific force of infection from this
model, together with demographic data
such as woman population by age we
calculated a number of women infected
with rubella per year. Using data on birth
distribution by age of mother, we
determined an annual number of women
infected while pregnant. Adjusting to
gestation period – specific risks, we
estimated a number of CRS cases per
year.
Results
Of the 967 women aged 15-39 years,
170 (17.5%) had negative or equivocal
test results. (Table1). The differences in
susceptibility among the oldest (35-39)
and youngest age group (15-19) was
statistically significant (p<0, 0001).
Comparing WCBA by geographic
location, there was no statically
significant difference in any of the age
groups (Table 1). A review of the
national statistics on birth distributions
by maternal age for the year 2003
revealed that 9,08 % of all births in
Morocco occurred among women aged
15-19 years, 23,8 % among those aged
20-24 years, 25,7% among those aged
25-29 years, 21,9 % among aged 30-35
years, and 14 % among those aged 35
years or older (Table2). Applying this
distribution of births to the proportion of
women in each age group defined by our
study as being susceptible, we estimated
the susceptible births by the age of the
mother. 21,425 of births to susceptible
mothers occurred among women aged
25 to 29 years. The Moroccan annual
birth cohort is approximately 677,000,
and almost half of births occur among
women aged 20 to 29 years of age
(Ministry of Health, Morocco). And
according to Glasser’s Estimates for
CRS cases in Morocco (personal
communication, CDC, NIP), 916
children were estimated to be born with
CRS each year, 555 urban and 361 rural
(Table 3).
Age
Total (%)
Urban
Rural
group
(Years)
15-19
174
Total
% positive
Total
% positive CI 95%
72
68 %
102
74,5 %
65-78
81,4 %
76-87
(17,18)
20-24
191 (19,7) 110
82,7 %
81
25-29
256 (26,7) 136
87,5 %
120
80,8 %
79-88
30-34
201 (20,7) 105
91,4 %
96
85,4 %
83-92
35-39
145 (17,9) 78
94,8 %
66
88 %
86-95
Table 1: Seroprevalence of rubella IgG
antibodies Among WCBA by age group and
location of residence, Morocco 2002
Age group
Live births*
(%)
years)
Susceptible Susceptible
Mothers
pregnant
women
(%)
15-19
48,014 (9,08)
28,7
13,780
20-24
125,793 (23,8) 17,9
22,516
25-29
135,602 (25,6) 15,8
21,425
30-34
115,808 (21,9) 11,6
13,433
35-39
74,313 (14)
6,539
8,8
Total 77,693
Table 2: Estimated number of births to
susceptible mothers by age, United
Nations:
Demographic Yearbook. *Total live births for
all ages is 528, 553
Age group
Infected pregnant women
Urban
Rural
15-19
580
339
20-24
666
435
25-29
330
267
30-34
365
225
35-39
397
206
Table 3: Estimated number of infected
pregnant women by age and by region. Number
of CRS estimated annually is 916; 555 Urban
and 361 rural according to Glasser’s estimates
for Morocco.
Discussion
Our findings showed a high level of
susceptibility (15-28%) among women
aged 15-29 years. In these age groups,
more than 48,014 % of the births occur.
This study represents the first national
level data on the rubella seroprevalence
and will serve as a baseline since MR
vaccine has been introduced into the
population.
The
population
of
women
of
childbearing age susceptible to rubella
indicates a high risk of CRS in Morocco.
We found that up to 17.5 % of women of
childbearing age were susceptible to
rubella. In addition to susceptibility data,
we used all available data evidence such
as distribution of birth by maternal age,
the larger proportion of women of
childbearing age and also the early age
of marriage in rural and urban areas in
an attempt to develop an optimal rubella
vaccination strategy in Morocco. In fact,
69.7% of all births occur among women
aged 20-34 years old, which age group is
more susceptible of rubella exposure.
Studies conducted in many countries
have shown a various seroprevalence of
rubella antibodies among women of
childbearing age; 96.2 % in Chiraz, Iran
[15]. 90.1 % serological results were
demonstrated in the evaluation of the
seroprevalence of rubella in Senegal [13]
Achieving elimination of rubella and
CRS will require vaccination coverage
of children and adults of childbearing
age [5]. Moreover, different levels of
susceptibility do not necessarily predict
the same risk of CRS, because of the
variation in the force of infection,
population density, migration and birth
patterns, and other factors [7]. Likewise,
there is 19% consanguinity in Morocco
[2], and consanguinity has been seen to
be associated with an increased risk of
birth defects, some of which resemble
the syndrome [11]. In addition,
comparison of susceptibility levels is
difficult due to different designs and
timing of studies in relation to previous
outbreaks, variability of testing and titer
cutoff
points
used
to
define
susceptibility.
In Morocco, several barriers still
remain to conducting rubella vaccination
coverage in persons of childbearing age.
A major barrier is limited access to
preventive health care by rubellasusceptible populations. Because rubella
vaccination is not mandated and
provided for adults, targeted and more
complicated strategies are needed to
ensure that adults of childbearing age are
rubella-immune. In addition, rubella
vaccine is available only in private
sector, so childhood immunization
coverage does not remain high,
transmission patterns may shift towards
adults including WCBA; this may result
in CRS cases [12, 19]. Although, in
general, the presence of specific
antibody correlates with protection, there
are differences between tests in the level
(cut-off in IU/ml) at which results are
reported as “positive”. Even when the
same cut-off is used, differences
between commercial kits can be
demonstrated, which reflect different
antigen preparations and test parameters
used. It is recognized that reinfection can
occur in individuals with pre-existing
antibody above accepted cut-off levels
and is more common after immunization
than after natural infection [11].
Antibody levels greater than 15 IU/ml
are usually considered to be protective
against re-infection [23].
Our findings highlight the need for the
country to establish surveillance of
trends in susceptibility to rubella and
CRS incidence and perhaps introduce
rubella vaccination among women of
childbearing age. Overall, in Morocco,
MMR vaccination in the private sector is
likely to lead to long-term increases in
the burden of CRS among females who
do not have access to the private sector
[22]. Eliminating rubella and CRS in
Morocco will not occur until national
rubella vaccination programs are
expanded to include rubella vaccination
coverage for children and women of
childbearing age. Substantial risk of
rubella infection exists for Moroccan
women of childbearing age. Prevention
of CRS will require either surveillance
or vaccination or a combination of both.
As is the first National level data on
seroprevalence of rubella Among
WCBA, our results will provide aid for
future studies in this domain.
Conflict of interest
The Authors declare no conflict of interest.
Aknowledgments: the authors would
like to thank Dr Joseph Icenogle, Mrs
Emily Abernathy, NCID, Centers for
Diseases Control and Prevention and Dr
REFERENCES
Imad Cherkaoui, Ministry of Health
National Institute of Hygiene, RabatMorocco.
1- Azelmat M. 1997 National Survey on
Mother and Child Health (PAPCHILD).
Studies and Health Information Service,
Directorate of Planning and Finances,
Ministry of
Health of Morocco, Arab League Project
to Promote the Child, Arab League,
Cairo, Egypt, 1999.
International Journal of Epidemiology,
1996, 28:1176-84
2- Anamarijia J, Marko D, Vanja Slavic V.
7- Cutts FT, Roberston SE, Diaz-Ortega JL
and Samuel R. Control of rubella and
congenital rubella syndrome (CRS) in
developing countries, Part 1: Burden of
disease from CRS. Bulletin World
Health Organization, 1997, 75:55-68
Simulation model of rubella, the effects
of vaccination strategies. Applied
Mathematics and Computation, 2004,
153: 75-96.
8- Davidkin I, Peltola H, Pauli L, Valle M.
3- Bouazzaoui L. Consanguinité et santé
9- Département des vaccins et produits
biologiques. Lutte contre la rubéole et le
publique au Maroc. Bulletin. Academie
Naturelle de Medecine, 1994, 178: 101327.
4- Centers for Diseases control. Measles-
Mumps and Rubella vaccine use and
strategies for elimination of Measles,
Rubella,
and
Congenital
rubella
syndrome and control of Mumps.
Recommendation of the Advisory
Committee of Immunization. Practices
(CCIP). Morbidity Mortality Weekly
Report, 1998, 47 (8).
5- Clare A, Dykewicz D, Kruszon-Moran G,
McQuillan M, Walter and Williams W.
Rubella Seropositivity in the United
States, 1988-1994. Clinical Journal of
Infectious Disease, 2001, 33:1279-86
6- Cutts FT, Vynnycky E. Modelling the
incidence
syndrome
of
congenital
rubella
in developing countries.
Duration of rubella immunity induced by
two dose measles. Vaccine, 1994, 12
(1):41-5.
syndrome de rubéole congénitale (SRC)
dans les pays en développement.
Organisation mondiale de la Santé
Genève, WHO/V&B/00.03, 2001.
10- Direction de la Population. National
Program of Immunization, Ministry of
Health Morocco. 2005
11- Durkin MS, Khan NZ, Davidson LL et
al. Prenatal and postnatal risk factors for
mental retardation among children in
Bangladesh. American Journal of
Epidemiology, 2000, 152: 1024-33.
12- Hinman AR, Irons B, Lewis M and
Kandola K.
Economic analyses of
rubella and rubella vaccine: a global
review.
Bulletin
World
Health
Organization, 2002, 80:264-70.
13- Drmigny JA, Nabeth P, Perrier J.D,
Claude
G.
Evaluation
of
the
Seroprevalence of rubella in the region
of Dakar (Senegal). Tropical Medecine
& International Health, 2003, 8 (8): 704.
14- Manoel de Nobrega, Luc Luis,
Maurice, Yara Juliano Weck. Study of
the hearing loss in children and
adolescents, comparing the periods of
1990-1994 and 1994-2000. International
Journal
of
Pediatric
Otorhinolaryngology, 2005, 69, 829-838
15- Doroudchi M, Samsami A, Dehaghan K,
Emad
and
Ghaderi
A.
developing
countries,
Part
2:
Vaccination against rubella. Bulletin
World Health Organization, 1997,
75:66-80.
21- Sharon Bloom, Rguig Ahmed, Berraho
Amina, Zniber Layla, Bouazzaoui Naima,
Zhaghloul Khalid, Reef Susan, Zidouh
Ahmed, Papania Mark, Seward Jane.
Congenital rubella syndrome burden in
Morocco:
a
rapid
retrospective
assessment. Lancet, 2005; 365-41
22- Vynnycky E, Gay N.J, Cutts FT. The
Seroepidemiological survey of rubella
immunity among three populations in
Shiraz, Islamic Republic of Iran.
Bulletin of Mediterranean Health
Eastern Region, 2001, 7 (1/2).
predicted impact of private sector MMR
vaccination on the burden of Congenital
Rubella Syndrome. Vaccine, 2003, 21:
2708-2719.
16- Nejmi, S, Nazih A, Omri B. Enquête
immunologue sur la rubéole chez la
femme Marocaine de la région de Rabat.
Maroc Médicale, 1972, 52: 420–25.
17- Nejmi S, L’kassmi H. Profil
immunitaire de la femme Marocaine visà-vis de la rubéole et de la
toxoplasmose: Enquête Immunologique
sur la rubéole chez la femme Marocaine
de la région de Rabat et de Meknès.
Meknès, Morocco: The Fifth National
Congress of Neonatology, 2003, 20–22:
77–80.
Gorska P, Gniadek G, Slusarczyk J, Rawicz
18- Nuray Oksuz, Kanbur Orhan, Derman
Tezae, Kutluk. Age Specific Rubella
Seroprevalence of an Unvaccinated
Population of Adolescents in Ankara,
Turkey. Japanese Journal of Infectious
Disease, 2003, 56, 23: 25.
19- Roberston Susan E, Featherstone David
A, Gacic-Dobo Marta and Bradley S. Hersh.
Rubella
and
congenital
rubella
syndrome: global update. Review
Panama Saluda Public. Pan American
Journal Public Health, 2003, 14(5).
20- Roberston SE, Cutts FT, Samuel R and
Diaz-Ortega JL. Control of rubella and
congenital rubella syndrome (CRS) in
23- Wysokinska T, Janaszek W, Bucholc B,
M.
The
prevalence
of
anti-rubella
antibodies in women of childbearing age
in Poland. Vaccine 22. 1899-1902. 2004.