DAKO ChemMateä Detection Kit Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse

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ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB,
Rabbit/Mouse
Code No./ Code/ Code-Nr. K 5007
2nd edition/ 2ème édition/ 2. Ausgabe
For use with DakoCytomation TechMate™ and Autostainer Instruments.
The kit contains reagents sufficient for 500 tests.
A utiliser avec les instruments TechMate™ et Autostainer DakoCytomation.
Le kit contient une quantité de réactifs suffisante pour 500 essais.
Zur Verwendung zusammen mit den DakoCytomation TechMate™- und Autostainer-Geräten.
Der Kitinhalt ist für 500 Tests ausreichend.
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K 5007/EFG/HGW/26.09.03 p. 1/47
Contents/ Table des matières/ Inhalt
Page/ Page/ Seite
ENGLISH
GENERAL INSTRUCTIONS
Intended Use ................................................................................................................................ 5
Introduction................................................................................................................................... 5
Reagents ...................................................................................................................................... 5
Materials provided.................................................................................................................... 5
Precautions .................................................................................................................................. 5
Storage......................................................................................................................................... 6
Quality Control.............................................................................................................................. 6
Interpretation of Results ............................................................................................................... 6
INSTRUCTIONS FOR DakoCytomation TechMate™ INSTRUMENTS
Summary and Explanation............................................................................................................ 7
Reagents ...................................................................................................................................... 8
A. Materials required but not provided..................................................................................... 8
B. Reagent preparation ........................................................................................................... 8
Specimen Collection and Preparation........................................................................................... 9
Procedure..................................................................................................................................... 9
A. Epitope retrieval in microwave oven.................................................................................. 10
B. Guideline for optimal dilution of primary antibodies and proteinase K pretreatment........ 10
C. Staining protocol............................................................................................................... 11
INSTRUCTIONS FOR DakoCytomation AUTOSTAINER INSTRUMENTS
Summary and Explanation.......................................................................................................... 13
Reagents .................................................................................................................................... 13
A. Materials required but not provided................................................................................... 13
B. Reagent preparation ......................................................................................................... 14
Specimen Collection and Preparation......................................................................................... 14
Procedure................................................................................................................................... 14
A. Epitope retrieval in microwave oven.................................................................................. 15
B. Guideline for optimal dilution of primary antibodies and proteinase K pretreatment................................................................................................................................ 15
C. Programming of the DakoCytomation Autostainer............................................................ 17
D. Staining protocol............................................................................................................... 18
Explanation of symbols............................................................................................................... 47
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FRANÇAIS
CONSIGNES GENERALES
Intérêt ......................................................................................................................................... 19
Introduction................................................................................................................................. 19
Réactifs ...................................................................................................................................... 19
Matériels fournis..................................................................................................................... 19
Précautions ................................................................................................................................ 20
Conservation .............................................................................................................................. 20
Contrôle qualité .......................................................................................................................... 20
Interprétation des résultats ......................................................................................................... 20
CONSIGNES D'UTILISATION des instruments TechMate™ DakoCytomation
Résumé et explications............................................................................................................... 21
Réactifs ...................................................................................................................................... 22
A.
Matériels nécessaires mais non fournis......................................................................... 22
B.
Préparation des réactifs................................................................................................. 22
Collecte et préparation des échantillons ..................................................................................... 23
Procédure................................................................................................................................... 23
A.
Restauration de l'épitope au four à micro-ondes ........................................................... 24
B.
Recommandations de dilution optimale pour le pré-traitement des anticorps
primaires et de la protéinase K ...................................................................................... 24
C.
Protocole d'immunomarquage....................................................................................... 25
CONSIGNES D'UTILISATION DES INSTRUMENTS AUTOSTAINER de DakoCytomation
Résumé et explications............................................................................................................... 27
Réactifs ...................................................................................................................................... 27
A.
Matériels nécessaires mais non fournis......................................................................... 27
B.
Préparation des réactifs................................................................................................. 28
Collecte et préparation des échantillons ..................................................................................... 28
Procédure................................................................................................................................... 29
A.
Restauration de l'épitope au four à micro-ondes ........................................................... 29
B.
Recommandations de dilution optimale pour le pré-traitement des
anticorps primaires et de la protéinase K....................................................................... 29
C.
Programmation de l'Autostainer de DakoCytomation .................................................... 31
D.
Protocole d’immunomarquage....................................................................................... 31
Explication des symboles ........................................................................................................... 47
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DEUTSCH
ALLGEMEINE ANLEITUNGEN
Zweckbestimmung...................................................................................................................... 33
Einleitung.................................................................................................................................... 33
Reagenzien ................................................................................................................................ 33
Packungsinhalt....................................................................................................................... 33
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen........................................................................................... 33
Lagerung .................................................................................................................................... 34
Qualitätskontrolle........................................................................................................................ 34
Interpretation der Ergebnisse ..................................................................................................... 34
ANLEITUNGEN FÜR DakoCytomation TechMate™-GERÄTE
Zusammenfassung und Erläuterung........................................................................................... 35
Reagenzien ................................................................................................................................ 36
A.
Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) ............ 36
B.
Reagenzienvorbereitung ............................................................................................... 36
Probengewinnung und -vorbereitung .......................................................................................... 37
Prozedur..................................................................................................................................... 37
A.
Epitopdemaskierung im Mikrowellengerät ..................................................................... 38
B.
Leitlinie für die optimale Verdünnung von primären Antikörpern und für die
Proteinase K-Vorbehandlung......................................................................................... 39
C.
Färbungsprotokoll.......................................................................................................... 40
ANLEITUNGEN FÜR DakoCytomation Autostainer-GERÄTE
Zusammenfassung und Erläuterung........................................................................................... 42
Reagenzien ................................................................................................................................ 43
A.
Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) ............ 43
B.
Reagenzienvorbereitung ............................................................................................... 43
Probengewinnung und -vorbereitung .......................................................................................... 43
Prozedur..................................................................................................................................... 44
A.
Epitopdemaskierung im Mikrowellengerät ..................................................................... 44
B.
Leitlinie für die optimale Verdünnung von primären Antikörpern und die
Proteinase K-Vorbehandlung......................................................................................... 44
C.
Programmieren des DakoCytomation Autostainer......................................................... 46
D.
Färbungsprotokoll.......................................................................................................... 46
Erläuterung der Symbole ............................................................................................................ 47
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ENGLISH
GENERAL INSTRUCTIONS
Intended Use
For in vitro diagnostic use.
ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, is intended for
use in immunocytochemistry together with the DakoCytomation TechMate™ and Autostainer
Instruments. The kit is employed in a two-step procedure where the first step is incubation of the
tissue with an optimally diluted primary rabbit or mouse antibody, and the second step is
incubation with the ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) reagent of the kit.
This reagent is a peroxidase-conjugated polymer, which also carries antibodies to rabbit and
mouse immunoglobulins. The reaction is visualized by the ChemMate™ DAB+ Chromogen also
included in the kit.
Introduction
ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, is for use on the
DakoCytomation TechMate™ and Autostainer Instruments. The instructions for the two
instruments differ and are, therefore, provided in separate sections.
Reagents
Materials provided
Bottle A
ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV)
100 mL, ready-to-use
Dextran coupled with peroxidase molecules and goat secondary
antibody molecules against rabbit and mouse immunoglobulins. In
buffered solution containing stabilizing protein and preservative.
Bottle B
ChemMate™ Substrate Buffer
250 mL
Buffered solution containing hydrogen peroxide and preservative.
Bottle C
ChemMate™ DAB+ Chromogen
5 mL, 50 x concentrated
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride in organic solvent.
The colour of this reagent may vary from strong violet to colourless
without having any influence on the performance of the kit.
Precautions
1.
2.
For professional users.
Bottle A, ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV), contains material of
animal origin and it cannot be excluded that trace amounts of human material could be
present due to manufacturing procedures. As with any product derived from biological
sources, proper handling should be used.
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3.
4.
5.
Do not expose Bottle C, ChemMate™ DAB+ Chromogen or the Substrate Working Solution
(CHROM) to strong light.
The reagents loaded on the TechMate™ Instruments should not be reused.
Bottle C, ChemMate™ DAB+ Chromogen contains 1.5% 3,3’-diaminobenzidine
tetrahydrochloride, and is labelled:
Harmful.
R40 Limited evidence of a carcinogenic effect.
R43 May cause sensitisation by skin contact.
R68 Possible risk of irreversible effects.
S35 This material and its container must be disposed of in a safe way.
S36/37 Wear suitable protective clothing and gloves.
As a main rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product.
Users must be carefully instructed in the proper working procedure, the dangerous
properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to the Material
Safety Data Sheet (MSDS) for additional information.
Storage
Store the kit at 2-8 °C. Do not use after expiration date stamped on the kit. Do not interchange kit
components from different lots. If reagents are stored under any conditions other than those
specified, the conditions must be verified by the user. The prepared Substrate Working Solution
(CHROM) should be stored at 2-8 °C and used within 5 days. If unexpected staining is observed
which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the product
is suspected, contact our Technical Services.
Quality Control
Each staining run should include a known positive control specimen to ascertain a proper
performance of all the applied reagents. If the positive control specimen fails to demonstrate
positive staining, labelling of test specimens should be considered invalid.
A negative control reagent should be used with each specimen to identify any non-specific
staining. If non-specific staining cannot be clearly differentiated from the specific staining, the
labelling of the test specimen should be considered invalid.
Interpretation of Results
The diaminobenzidine-containing Substrate Working Solution gives a brown colour at the site of
the target antigen recognized by the primary antibody.
The brown colour should be present on the positive control specimen at the expected localization
of the target antigen.
If non-specific staining is present, this will be recognized as a rather diffuse, brown staining on
the slides treated with the negative control reagent.
Nuclei will be stained blue by the hematoxylin counterstain.
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INSTRUCTIONS FOR DakoCytomation TechMate™ INSTRUMENTS
Summary and Explanation
ChemMate™ DAKO EnVision Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, has been
designed to give optimal staining on the TechMate™ Instruments when using the protocols
outlined in the instruction below.
The automatic immunostaining on the TechMate™ Instruments uses capillary action to draw up
reagents from Reagent Trays, code No. S 2039, to cover specimens mounted on special
Capillary Gap Microscope Slides. After a predetermined incubation time, reagents are removed
from specimens by absorption into Absorbent Pads, code No. S 2027 for TechMate™ 500/500
Plus/1000, and code No. S 2043 for TechMate™ Horizon.
Prior to staining on the TechMate™ Instruments, routinely fixed, paraffin-embedded tissue
sections should be subjected to epitope retrieval in microwave oven using ChemMate™ Target
Retrieval Solution, code No. S 2031, diluted 1:10. Please note that some primary antibodies
require proteinase K pre-treatment of tissue for optimal staining.
Endogenous peroxidase should be blocked with the Peroxidase-Blocking Solution, code No.
S 2023.
Owing to an effective washing procedure and the presence of carrier proteins in the
DakoCytomation reagents, extra blocking steps to reduce non-specific background staining are
unnecessary.
The ChemMate™ Buffer Kit, code No. K 5006, contains Wash Buffers 1, 2, 3 and Water Wash.
Wash Buffer 1 is used during the first part of the procedure. The formulation of this buffer
contributes to the blocking of non-specific binding of the primary antibody and the ChemMate™
DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) detection reagent to the tissue sections. Wash
Buffers 2 and 3 are identical and are used for the remaining part of the procedure. As Wash
Buffers 2 and 3 do not contain sodium azide, they are used especially in conjunction with
washing after incubation with the ENV detection reagent. Water Wash is used for washing steps
at the end of the staining protocols.
Primary antibodies are not provided with the kit. We recommend the use of concentrated
DakoCytomation primary antibodies. Please see the guideline for optimal dilutions in Table 2.
The ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) detection reagent in the kit
consists of a dextran backbone to which a large number of peroxidase (HRP) molecules and
secondary antibody molecules have been coupled. A unique chemistry is used for the coupling
reaction, which permits the binding of up to 100 HRP molecules and up to 20 antibody molecules
per backbone. The secondary antibody coupled to the dextran backbone has been raised in
goats. It reacts equally well with rabbit and mouse immunoglobulins, thus only one detection
reagent is required for rabbit and mouse primary antibodies. The ENV detection reagent is
provided ready-to-use in a dropper bottle.
The substrate system consists of two components, ChemMate™ DAB+ Chromogen, a
concentrated diaminobenzidine (DAB) solution, and the ChemMate™ Substrate Buffer containing
hydrogen peroxide. Before use, the DAB+ Chromogen must be diluted in the Substrate Buffer.
The substrate system produces a brown colour at the site of the target antigen.
ChemMate Hematoxylin, code No. S 2020, is recommended for counterstaining as it provides a
clear blue, nuclear staining.
The stained tissue sections may be mounted with either aqueous or organic-solvent-based
mounting medium.
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Reagents
A. Materials required but not provided
DakoCytomation TechMate™ Instrument
ChemMate™ Capillary Gap Microscope Slides, code Nos. S 2024 (75 µm),
S 2025 (100 µm), S 2026 (155 µm)
ChemMate™ Buffer Kit, code No. K 5006
ChemMate™ Peroxidase-Blocking Solution, code No. S 2023
ChemMate™ Proteinase K, code No. S 2019 (if necessary)
ChemMate™ Proteinase K Diluent, code No. S 2032 (if necessary)
Primary rabbit or mouse antibodies from DakoCytomation or other source
Suitable negative control reagent for primary antibody
ChemMate™ Antibody Diluent, code No. S 2022 (for dilution of concentrated antibodies)
ChemMate™ Hematoxylin, code No. S 2020
ChemMate™ Target Retrieval Solution, Concentrated x 10, code No. S 2031
ChemMate™ Incubation Container, code No. S 2030
ChemMate™ Slide Holder, code No. S 2029
ChemMate™ Absorbent Pads, code No. S 2027 for TechMate™ 500/500 Plus/1000, or
ChemMate™ Absorbent Pads, code No. S 2043 for TechMate™ Horizon
ChemMate™ Reagent Trays, code No. S 2039
General laboratory reagents for dewaxing paraffin-embedded tissue sections
Mounting medium (aqueous or organic-solvent-based) and coverslips
B. Reagent preparation
Substrate Working Solution (CHROM)
The DAB-containing Substrate Working Solution (CHROM) is prepared by mixing thoroughly 50
parts of ChemMate™ Substrate Buffer (Bottle B) with 1 part of ChemMate™ DAB+ Chromogen
(Bottle C). Prepare only the volume required for the number of slides that shall be stained.
Please see Table 1 below. One well corresponds to two slides that have been paired.
Use CHROM within 5 days (store in darkness at 2-8 °C).
Table 1.
1
5
10
(1 tray)
20
(2 trays)
30
(3 trays)
750 µL
4 mL
8 mL
16 mL
24 mL
15 µL
80 µL
160 µL
320 µL
480 µL
Number of wells
(each containing approx. 750 µL)
For the preparation of reagents not provided with the kit, please see the instructions included
with the individual reagent.
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Specimen Collection and Preparation
The specimens may be routinely fixed, paraffin-embedded tissue sections and frozen tissue
sections.
A variety of fixatives may be used for specimen preservation. Specimens should not be fixed in
neutral buffered formalin for more than 24 hours and preferably for a shorter time.
The optimal thickness of paraffin-embedded sections is approximately 4 µm.
The optimal thickness of frozen sections is 4-6 µm.
All specimens should be mounted on ChemMate™ Capillary Gap Microscope Slides and placed
in the slide holder "face to face" in pairs. As the slides have already been coated with adhesive,
the user is advised not to treat the slides further, as this may have a detrimental effect.
Three types of Capillary Gap Microscope Slides are available:
1. Slides with grey, 75 µm thick painted areas. These are for paraffin-embedded tissue
sections and should be paired with similar slides.
2. Slides with blue, 100 µm thick painted areas. These are for frozen sections and smears and
should be paired with similar slides.
3. Slides with yellow, 155 µm thick painted areas. These slides should not be mounted with
tissue sections. They are for use with tissue sections which have been mounted on ordinary,
non-capillary gap slides. Simply pair the ordinary slide with the yellow slide to create a proper
capillary gap.
NOTE: Ordinary slides must have a width of no more than 25 mm to be able to fit into the slide
holder.
Specimens should be mounted on that part of the slide which is farthest from the painted label
end of the slide. It is important that specimens be placed on the same side of the slide that holds
the painted label area. As the tissue sections are placed "face to face" during the staining
procedure, the sections should be mounted on the slides as flat and wrinkle-free as possible.
Too many wrinkles or clumps will inhibit the capillary action and may cause inconsistent staining
results.
Paraffin sections should be mounted from a pre-heated water bath containing distilled or
deionized water. The water bath should contain no additives (such as gelatin, poly-L-lysine etc.).
Sections should be dried by heating, generally at a temperature not above 60 °C for a minimum
of 60 minutes (e.g. overnight). To ensure proper adherence of sections to slides it is important to
drain the water from beneath the sections prior to the oven drying process.
Procedure
Before running protocols on the DakoCytomation TechMate™ Instruments, please read carefully
the Operator's Manual for the dedicated TechMate™ Instrument.
Prior to starting the TechMate™ Instrument, slides must be organized for the staining run:
Routinely fixed, paraffin-embedded tissue sections:
After deparaffinization and hydration to buffer (water), tissue sections should be subjected to
epitope retrieval in microwave oven (see section A below). A few epitopes do not tolerate the
treatment in microwave oven. Please refer to the instructions for the individual DakoCytomation
primary antibody.
In addition to being heated in a microwave oven, a few epitopes require a short enzyme digestion
on the TechMate™ Instrument. Please refer to Table 2 and to the instructions for ChemMate™
Proteinase K, code No. S 2019. Those specimens that require enzyme digestion should be
grouped together.
If no specimens require enzyme digestion, use protocol ENVP for all slides (this protocol is
performed in approximately 2 ¼ hours).
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If some specimens require enzyme digestion, use protocol ENVPE for all slides (this protocol is
performed in approximately 2 ¼ hours). For those specimens that do not require enzyme
digestion, simply replace the proteolytic enzyme in the well with Proteinase K Diluent, code No.
S 2032, or Washing Buffer 2 or 3 from ChemMate™ Buffer Kit, code No. K 5006.
A. Epitope retrieval in microwave oven
It is recommended to follow carefully the instructions below in order to ascertain reproducible
epitope retrieval. To standardize the treatment, it is recommended to load the slide holder fully
with slides, even if only one slide may hold tissue; this ensures an identical heating of sections in
every run.
At the termination of the epitope retrieval step, slides must be left in the buffer for at least 20
minutes at room temperature. During this cooling, the TechMate™ Instrument can be prepared
for the staining run.
Microwave oven procedure
1. Place the deparaffinized tissue sections in a ChemMate™ Slide Holder, code No. S 2029.
Transfer the ChemMate™ Slide Holder to a ChemMate™ Incubation Container, code No.
S 2030, filled with 200 mL of ChemMate™ Target Retrieval Solution, code No. S 2031, diluted
1:10.
2. Place the Container in the microwave oven with the lid at an angle (e.g. diagonally). Use an
800 watt microwave oven on high setting.
Microwave for 5 minutes after the buffer has come to a boil.
Add 50 mL of deionized water to replace the evaporated water.
Microwave for another 5 minutes.
Remove the Container from the oven and let it cool at room temperature for at least 20
minutes.
3. Exchange the buffer with deionized water and leave for a short time. Now the slides are ready
to be loaded into the TechMate™ Slide Holder.
NOTE: Boiling of the buffer is normal and desirable. Not all 800 watt microwave ovens are similar
in heat transfer. Therefore, to secure a local standardization, the microwave oven should be
tested with slides without tissue the first time to find the total microwaving time necessary for
obtaining 5 minutes of actual boiling.
B. Guideline for optimal dilution of primary antibodies and proteinase K pretreatment
Table 2 provides a dilution guideline for DakoCytomation concentrated primary antibodies used
with the ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, and
applied on formalin-fixed, paraffin-embedded sections.
The primary antibodies should be diluted in ChemMate™ Antibody Diluent, code No. S 2022.
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Table 2. Guideline for optimal dilution of primary antibodies and proteinase K pre-treatment
Code No.
Primary Antibody
Proteinase K
Pre-treatment
A 0010
Rabbit Anti-Human Synaptophysin
YES
1:50-1:100
A 0082
Rabbit Anti-Human Von Willebrand Factor
YES
1:250-1:500
A 0098
Rabbit Anti-Human Progesterone Receptor
-
A 0191
Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains
YES
A 0193
Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains
YES
1:500-1:1000
A 0251
Rabbit Anti-Human Thyroglobulin
-
1:400-1:1200
Z 0311
Rabbit Anti- S100
YES
1:250-1:500
Z 0334
Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein
-
1:400-1:1200
A 0430
Rabbit Anti-Human Chromogranin A
-
1:1000-1:2000
A 0452
Rabbit Anti-Human CD3, T Cell
A 0562
Rabbit Anti-Human Prostate-Specific Antigen
-
1:1000-1:4000
A 0576
Rabbit Anti-Human Calcitonin
-
1:100-1:200
M 0613
Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen, Clone E29
-
1:40-1:80
M 0630
Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight, Clone 34βE12
YES
1:25-1:50
M 0631
Mouse Anti-Human Cytokeratin 8, Low Molecular Weight, Clone 35βH11
-
1:20-1:40
M 0634
Mouse Anti Human Melanosome, Clone HMB-45
-
1:50-1:100
M 0635
Mouse Anti-Human Muscle Actin, Clone HHF35
-
1:20-1:40
M 0701
Mouse Anti-Human CD45, Leucocyte Common Antigen, Clones 2B11 + PD7/26
-
1:50-1:100
M 0725
Mouse Anti-Vimentin, Clone V9
-
1:10-1:20
M 0742
Mouse Anti-Human CD45R0, Clone UCHL1
-
1:50-1:100
M 0751
Mouse Anti-Human CD30, Clone Ber-H2
YES
M 0755
Mouse Anti-Human CD20cy, Clone L26
-
1:50-1:200
M 0760
Mouse Anti-Human Desmin, Clone D33
-
1:50-1:100
YES
Optimal Dilution
for TechMate™
Instruments
1:5-1:10
1:2000-1:4000
1:50-1:100
1:3-1:6
M 0785
Mouse Anti-Human Collagen IV, Clone CIV 22
YES
1:5-1:10
M 0821
Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clone MNF116
YES
1:50-1:100
M 0851
Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin, Clone 1A4
-
1:50-1:100
M 0873
Mouse Anti-Human Neuron-Specific Enolase, Clone BBS/NC/VI-H14
-
1:200-1:800
M 0876
Mouse Anti-Human CD68, Clone PG-M1
-
1:50-1:100
M 0879
Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone PC10
-
1:1000-1:2000
M 0887
Mouse Anti-Human BCL2 Oncoprotein, Clone 124
-
1:2-1:6
M 7001
Mouse Anti-Human p53 Protein, Clone DO-7
-
1:25-1:100
M 7047
Mouse Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone 1D5
-
1:5-1:10
M 7050
Mouse Anti-Human CD79α, Clone JCB117
-
1:50-1:100
M 7072
Mouse Anti-Human Carcinoembryonic Antigen, Clone II-7
-
1:10-1:20
C. Staining protocol
The protocols ENVP and ENVPE, and templates for reagent positions on the instrument can be
viewed on the TechMate™ screen before and during the run. The protocols list number of steps,
step name and incubation times for the individual steps. The templates give the positions of the
reagents and absorbent pads on the TechMate™ Instrument. It is recommended to fill in an
Antibody Positioning Sheet for slide pairs which should be treated individually with reagents,
e.g. primary antibodies, from the 10-well trays. Please refer to the Operator's Manual.
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1. Load reagents into the 10-well trays on the TechMate™ Instrument according to Reagent
Template and Antibody Positioning Sheet. Take care to load proper reagents and proper
volumes. Pay particular attention to the loading of primary antibodies.
2. Prior to loading slides into the slide holder it is recommended to pre-wet the slides with
Wash Buffer 2 from the ChemMate™ Buffer Kit, code No. K 5006. This can be done
conveniently by leaving the slides in pairs, and organized according to the Antibody
Positioning Sheet, for a few minutes in a 10-well tray containing Wash Buffer 2. This prewetting will ensure adequate fluid flow in the capillary gap.
3. After pre-wetting, place the slide pairs in the TechMate™ Slide Holder according to the
Antibody Positioning Sheet. Please make sure that the slides are in alignment.
4. Just before the run, place the TechMate™ Slide Holder on Pad2 in the TechMate™
Instrument to drain Wash Buffer 2 from the capillary gap. Observe carefully the draining of
slides in order to control that all slides have been correctly paired and that the alignment of
slide pairs has been done properly.
5. Place the TechMate™ Slide Holder in the Wash Buffer (e.g. Wash Buffer 1 or Wash Buffer
2) used in the first step of the protocol to be run, in order to fill the capillary gaps with Wash
Buffer.
6. Place the TechMate™ Slide Holder in HOME position before starting the run.
Please refer to Chapter 5 "RUNNING A SINGLE PROTOCOL" in the Operator's Manual.
NOTE: The final steps in the protocols are washing in Water Wash (from ChemMate™ Buffer Kit,
code No. K 5006), designated H2O on the template and in the protocol. If the user prefers to
prepare the specimens for mounting in aqueous mounting medium, the HOME position can be
loaded with water after initiation of the run. On TechMate™ Horizon, the H2O position is equal to
the HOME position.
The volumes to be loaded into the trays for the individual reagents are given below.
These volumes fit with the protocols used for this kit.
Wash Buffers 1, 2 or 3 (BUF1, 2, 3)
20 mL per 10-well tray
Water Wash (H2O)
Peroxidase-Blocking Solution (HP-BK)
Substrate Working Solution (CHROM),
prepared from this kit
750 µL per individual well
Diluted Proteinase K (ENZ)
Hematoxylin (HEMA)
Primary antibody (AB1)
8 drops (320 µL) per individual well
EnVision™/HRP (ENV),
Bottle A in this kit
8 drops (320 µL) per individual well
(104958-002)
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INSTRUCTIONS FOR DakoCytomation AUTOSTAINER INSTRUMENTS
Summary and Explanation
ChemMate™ DAKO Envision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, has been
adapted for use on the DakoCytomation Autostainer Instruments according to the template
outlined below.
Prior to staining on the Autostainer Instruments, some routinely fixed, paraffin-embedded tissue
sections should be subjected to epitope retrieval in microwave oven using the Target Retrieval
Solution specified in Table 3 or the instructions for the primary antibody. Please note that some
primary antibodies require additional proteinase K pre-treatment of tissue for optimal staining.
Endogenous peroxidase should be blocked with Peroxidase-Blocking Solution, code No. S 2023.
Owing to an effective washing procedure and the presence of carrier proteins in the
DakoCytomation reagents, extra blocking steps to reduce non-specific background staining is
unnecessary.
The DakoCytomation Wash Buffer, Concentrated x 10, for Immunocytochemistry, code No.
S 3006, is recommended.
Primary antibodies are not provided with the kit. We recommend the use of concentrated
DakoCytomation Antibodies. Please see the guideline for optimal dilution in Table 3.
The ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) detection reagent in the kit
consists of a dextran backbone to which a large number of peroxidase (HRP) molecules and
secondary antibody molecules have been coupled. A unique chemistry is used for the coupling
reaction, which permits the binding of up to 100 HRP molecules and up to 20 antibody molecules
per backbone. The secondary antibody coupled to the dextran backbone has been raised in
goats. It reacts equally well with rabbit and mouse immunoglobulins, thus only one detection
reagent is required for rabbit and mouse primary antibodies. The ENV detection reagent is
provided in a dropper bottle and has to be poured into an Autostainer Reagent Vial, code No.
S 3425, before use.
The substrate system consists of two components, ChemMate™ DAB+ Chromogen, a
concentrated diaminobenzidine (DAB) solution, and the ChemMate™ Substrate Buffer containing
hydrogen peroxide. Before use, the DAB+ Chromogen must be diluted in the Substrate Buffer.
The substrate system produces a brown colour at the site of the target antigen. The mixed
chromogen solution should be poured into an Autostainer Reagent Vial, code No. S 3425, before
use.
DakoCytomation Hematoxylin, code No. S 3301, is recommended for counterstaining on the
Autostainer Instruments as it provides a clear blue, nuclear staining.
The stained tissue sections may be mounted with either aqueous or organic-solvent-based
mounting medium.
Reagents
A. Materials required but not provided
DakoCytomation Autostainer Instrument
DakoCytomation Wash Buffer, Concentrated x 10, for Immunocytochemistry,
code No. S 3006
ChemMate™ Peroxidase-Blocking Solution, code No. S 2023
ChemMate™ Proteinase K, code No. S 2019 (if necessary)
ChemMate™ Proteinase K Diluent, code No. S 2032 (if necessary)
Primary rabbit or mouse antibodies from DakoCytomation or other source
Suitable negative control reagent for primary antibody
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ChemMate™ Antibody Diluent, code. No. S 2022 (for dilution of concentrated antibodies)
DakoCytomation Hematoxylin, for use with the Autostainer Instrument, code No. S 3301
DakoCytomation Target Retrieval Solution, code No. S 1699 or S 1700, DakoCytomation Target
Retrieval Solution, High pH, code No. S3307 or S3308, or ChemMate™ Target Retrieval
Solution, Concentrated x 10, code No S 2031
ChemMate™ Incubation Container, code No. S 2030
ChemMate™ Slide Holder, code No. S 2029
DakoCytomation Autostainer Reagent Vials (100 vials), code No. S 3425
Microscope slides
General laboratory reagents for dewaxing paraffin-embedded tissue sections
Mounting medium (aqueous or organic-solvent-based) and coverslips
B. Reagent preparation
The DAB-containing Substrate Working Solution (CHROM) is prepared by mixing thoroughly
20 µL ChemMate™ DAB+ Chromogen (Bottle C) and 1 mL ChemMate™ Substrate Buffer (Bottle
B). Prepare only the volume required for the number of slides that shall be stained. Use CHROM
within 5 days (store in darkness at 2-8 °C).
For preparation of reagents not provided with the kit, please see the instructions included with
the individual reagent.
Specimen Collection and Preparation
The specimens may be routinely fixed, paraffin embedded tissue sections and frozen tissue
sections.
A variety of fixatives may be used for specimen preservation. Specimens should not be fixed in
neutral buffered formalin for more than 24 hours and preferably for a shorter time.
The optimal thickness of paraffin-embedded sections is approximately 4 µm.
The optimal thickness of frozen sections is 4-6 µm.
The specimens should be mounted on microscope slides. The sections should be mounted on
the slides as flat and wrinkle-free as possible. Too many wrinkles will have an impact on the
staining results.
NOTE: The microscope slides must have a width of no more than 26 mm to be able to fit into the
slide holder.
Paraffin sections should be mounted from a pre-heated water bath containing distilled or
deionized water. The water bath should contain no additives (such as gelatin, poly-L-lysine etc.).
Sections should be dried by heating, generally at a temperature not above 60 °C for a minimum
of 60 minutes (e.g. overnight). To ensure proper adherence of sections to slides it is important to
drain the water from beneath the sections prior to the oven drying process.
Procedure
Before staining according to the template on the DakoCytomation Autostainer instruments,
please read carefully the Operators Manual for the dedicated Autostainer Instrument.
Prior to starting the Autostainer Instrument, slides and reagents must be placed according to the
Slide Layout Map and the Reagent Layout Map.
Routinely fixed, paraffin-embedded tissue sections
After deparaffinization and hydration to buffer (water), tissue sections should be subjected to
epitope retrieval in microwave oven (see section A below). A few epitopes do not tolerate the
treatment in microwave oven. Please refer to the instructions for the individual DakoCytomation
primary antibody.
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In addition to being heated in microwave oven, a few epitopes require a short enzyme digestion
on the Autostainer Instrument. Please refer to Table 3 and to the instructions for ChemMate™
Proteinase K, code No. S 2019.
A. Epitope retrieval in microwave oven
Please see the INSTRUCTIONS FOR DakoCytomation TechMate™ INSTRUMENTS.
B. Guideline for optimal dilution of primary antibodies and proteinase K pretreatment
Table 3 provides a dilution guideline for DakoCytomation concentrated primary antibodies used
with the ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, and
applied on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues on the Autostainer Instruments.
The primary antibodies should be diluted in ChemMate™ Antibody Diluent, code No. S 2022.
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Table 3.
Guideline for optimal dilution of primary antibodies and proteinase K pre-treatment
Optimal Dilution for
Autostainer
Instruments
Target
Retrieval
Buffer
Proteinase K
PreTreatment
S 2031
Yes
1:100-1:150
A 0082
S 2031
Yes
1:250-1:500
A 0098
S 1700
-
A 0191
S 2031, see
method in
brochure on
Kappa/Lambda
on TechMate™
Instruments
Yes
1:400-1:1000
A 0193
S 2031, see
method in
brochure on
Kappa/Lambda
on TechMate™
Instruments
Yes
1:400-1:1000
A 0251
S 2031
Yes
1:2500-1:3000
A 0430
S 2031
-
1:1000-1:2000
Code No.
Primary Antibody
A 0010
1:25-1:50
A 0452
S 2031
Yes
A 0562
S 2031
-
1:1000-1:4000
A 0576
S 2031
-
1:5000-1:6000
M 0613
Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen, Clone 29
S 2031
-
1:100-1:500
M 0630
Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight,
Clone 34βE12
S 2031
Yes
1:50-1:100
M 0631
Mouse Anti-Human Cytokeratin 8, Low Molecular Weight,
Clone 35βE11
S 2031
Yes
1:50- 1:100
M 0634
Mouse Anti-Human Melanosome, Clone HMB-45
S 2031
-
1:50-1:100
M 0635
S 2031
-
1:40-1:50
M 0701
Mouse Anti-Human CD45, Leucocyte Common Antigen,
Clones 2B11 + PD7/26
S 2031
-
1:100-1:200
M 0725
S 2031
-
1:100-1:200
M 0742
S 2031
-
1:100-1:300
M 0751
S 1700
Yes
M 0755
S 2031
-
1:750-1:1000
M 0760
S 2031
-
1:75-1:150
M 0785
S 2031
Yes
1:25-1:50
M 0821
S 2031
Yes
1:50-1:100
M 0851
S 2031
-
1:50-1:100
M 0873
Mouse Anti-Human Neuron-Specific Enolase, Clone
BBS/NC/VI-H14
S 2031
-
1:800-1:1000
M 0876
S 2031
-
1:50-1:100
M 0887
S 2031
-
1:6-1:10
M 7001
S 2031
-
1:25-1:60
M 7047
S 1700
-
1:50-1:100
M 7050
S 2031
-
1:50-1:150
M 7072
S 2031
-
1:10-1:50
M 7240
Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen, Clone MIB-1
S 1700
-
1:200-1:400
Z 0311
Rabbit Anti-S100
S 2031
Yes
1:250-1:500
Z 0334
S 2031
-
1:400-1:1200
(104958-002)
1:50-1:100
1:5-1:10
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C. Programming of the DakoCytomation Autostainer
Prior to the first application of the ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit,
Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, code No. K 5007, on the Autostainer, a new template has to be
made. Please refer to the template below and to the Operator’s Manual for the dedicated
Autostainer Instrument.
Template: CMK5007
Before loading slides according to the PROGRAM STAINING RUN SCREEN, the following
reagents have to be added to the reagent list. Please refer to Table 4 below for name, template
step and incubation time, and to the Operator’s Manual for the dedicated Autostainer Instrument.
Table 4. Necessary additions to the reagent list
Reagent
Code No.
Template Step
Incubation
Time
ChemMate™ Peroxidase-Blocking Solution
S 2023
End. Enz. Block
5 minutes
ChemMate™ Proteinase K Solution
S 2019 +S 2032
Pretreatment
under Antibody
10 minutes
Primary antibodies not already in the Autostainer list
Individual
Antibody
25 minutes
ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit (EnVision)
K 5007
Labelled polymer
30 minutes
ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit (DAB)
K 5007
Substrate
3 minutes
Hematoxylin for the use with the Autostainer Instruments
S 3301
Auxiliary
1 minute
Blueing Buffer (=Autostainer Buffer)
S 3006
Auxiliary
5 minutes
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D. Staining protocol
Load the Template (CMK5007) for ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit,
Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, into the PROGRAM STAINING RUN SCREEN. Specify the
number of slides in the run, and load the reagents with incubation times into the template. The
positioning of the slides will then be shown in the Slides Layout Map Screen, and the
positioning and volume of the reagents to be loaded on the Autostainer Instrument will be shown
in the Reagent Layout Map Screen. Please also refer to the Operator’s Manual.
Prior to loading the slides according to the Slides Layout Map, it is recommended to pre-wet the
slides for 5 minutes in the DakoCytomation Wash Buffer, code No. S 3006. Load reagents into
the Autostainer Reagent Vials, code No. S 3425, and position the vials in the reagent rack
according to the Reagent Layout Map. Take care to load proper reagents and proper volumes.
Pay particular attention to the loading of the vials with primary antibodies. Prime the water and
buffer pumps. Start the program.
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FRANÇAIS
CONSIGNES GENERALES
Intérêt
Pour diagnostic in vitro.
Le kit ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, est destiné
à une utilisation en immunocytochimie avec les instruments TechMate™ et Autostainer de
DakoCytomation. Ce kit s'utilise selon une procédure en deux étapes dont la première est une
incubation du tissu avec un anticorps primaire de lapin ou de souris à la dilution optimale et la
seconde une incubation avec le réactif ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, lapin/souris (ENV)
du kit. Ce réactif est un polymère conjugué à la peroxydase qui comporte aussi des anticorps
dirtigés contre les immunoglobulines de lapin et de souris. La visualisation de la réaction
s'effectue avec ChemMate™ DAB+ Chromogen, également inclus dans le kit.
Introduction
Le kit ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, est
destiné à une utilisation avec les instruments TechMate™ et Autostainer de DakoCytomation.
Les consignes d'utilisation des deux instruments sont différentes et sont donc décrites dans deux
sections distinctes.
Réactifs
Matériels fournis
Flacon A
100 mL, prêt à l'emploi.
Dextran couplé à des molécules de peroxydase et des molécules
d'anticorps secondaire caprin contre des immunoglobulines de
lapin et de souris. En solution tamponnée contenant une protéine
stabilisatrice et un conservateur.
Flacon B
ChemMate™ Substrate Buffer™
250 mL
Solution tamponnée contenant du peroxyde d'hydrogène et un
conservateur.
Flacon C
5 mL, 50 x concentré
3,3'-diaminobenzidine tétrahydrochlorure dans un solvant
organique.
La couleur de ce réactif peut varier du violet foncé à l'incolore sans
aucune influence sur les performances du kit.
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Précautions
1.
2.
3.
4.
5.
Pour utilisateurs professionnels.
Le flacon A, ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV), renferme des
matières d'origine animale et il ne peut pas être exclu qu'il renferme également des traces
de matières humaines dues au processus de fabrication ; ce réactif doit donc être manipulé
comme potentiellement infectieux.
Ne pas exposer le flacon C, ChemMate™ DAB+ Chromogen ou la solution de substrat
(CHROM) à une lumière forte.
Les réactifs chargés dans les instruments TechMate™ ne doivent pas être réutilisés.
Le flacon C, ChemMate™ DAB+ Chromogen contient du 3,3’-diaminobenzidine
tétrahydrochlorure 1,5 % et il est étiqueté :
Dangereux
R40 Evidence limitée d'effet carcinogène.
R43 Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau.
R68 Risque possible d'effets irréversibles.
S35 Ne se débarrasser de ce produit et de son récipient qu'en prenant toute précaution
d'usage.
S36/37 Porter un vêtement de protection et des gants appropriés.
En règle générale, la manipulation de ce produit est interdite à toute personne de moins de
18 ans. Les utilisateurs doivent être parfaitement formés aux procédures de manipulation
correctes du produit et informés des ses propriétés dangereuses et des consignes de
sécurité nécessaires. Veuillez consulter la Fiche de sécurité produit (Material Safety Data
Sheet/MSDS) pour tout renseignement complémentaire.
Conservation
Conserver le kit entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption indiquée sur le
kit. Ne pas mélanger des composants de kits différents. Si les réactifs ont été conservés dans
des conditions autres que celles préconisées, ces conditions doivent être vérifiées par
l'utilisateur. La solution de substrat (CHROM) préparée doit être conservée entre 2 et 8 °C et
utilisée dans les 5 jours. Si une coloration imprévue est observée qui ne peut pas s'expliquer par
des variations dans les procédures du laboratoire et si le réactif paraît défectueux, contacter nos
services techniques.
Contrôle qualité
Chaque technique d'immunomarquage doit inclure un spécimen de contrôle positif connu pour
vérifier les performances correctes de tous les réactifs utilisés. Si le spécimen de contrôle positif
ne montre pas une coloration positive, le marquage des spécimens de l'essai doit être considéré
comme invalide.
Un réactif de contrôle négatif doit être utilisé avec chaque spécimen pour identifier toute
coloration non spécifique. S'il est impossible de différencier clairement une coloration non
spécifique de la coloration spécifique, le marquage des spécimens analysés doit être considéré
comme invalide.
Interprétation des résultats
La solution de substrat contenant la diaminobenzidine donne une couleur brune sur le site de
l'antigène cible reconnu par l'anticorps primaire.
Cette couleur brune doit être présente sur le spécimen de contrôle positif sur le site prévu de
l'antigène cible.
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Un marquage non spécifique se reconnaît par une coloration brune relativement diffuse sur les
lames traitées avec le réactif de contrôle négatif.
Les noyaux seront marqués en bleu par une coloration de contraste à l'hématoxyline.
CONSIGNES D'UTILISATION des instruments TechMate™
DakoCytomation
Résumé et explications
Le ChemMate™ DAKO EnVision Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse est conçu pour
assurer une coloration optimale sur les instruments TechMate™ lors des protocoles décrits dans
les consignes ci-dessous.
L'immunomarquage automatique sur les instruments TechMate™ se fait par en attirant le réactif
par capillarité depuis les Reagent Trays, code S 2039, pour recouvrir les spécimens montés sur
des lames de microscope spéciales à capillaire creux. Après un temps d'incubation prédéfini, les
réactifs sont éliminés des spécimens par absorption par les Absorbent Pads, code S 2027 pour
le TechMate™ 500/500 Plus/1000, et code S 2043 pour le TechMate™ Horizon.
Avant leur coloration sur les instruments TechMate™, les coupes incluses en paraffine
normalement fixées doivent être soumises à une restauration de l'épitope dans un four à microondes avec la ChemMate™ Target Retrieval Solution, code S 2031, diluée à 1:10.
Note: pour un marquage optimal, certains anticorps primaires nécessitent un pré-traitement des
tissus à la protéinase K.
La peroxydase endogène doit être bloquée avec la Peroxidase-Blocking Solution, code S 2023.
Grâce à une procédure de lavage efficace et à la présence de protéines porteuses dans les
réactifs DakoCytomation, il n'est pas nécessaire d'effectuer d'autres étapes de blocage pour
réduire le bruit de fond non spécifique.
Le ChemMate™ Buffer Kit, code K 5006, contient des Tampons de lavage 1, 2, 3 et un lavage à
l'eau (Water Wash). Le tampon de lavage 1 est utilisé pendant la première partie de la
procédure. La formulation de ce tampon contribue à bloquer la liaison non spécifique de
l'anticorps primaire et du réactif ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) sur
les coupes de tissus. Les tampons 2 et 3 sont identiques et sont utilisés pour le reste de la
procédure. Les tampons 2 et 3 ne contenant pas d'azide de sodium, ils sont utilisés plus
spécialement conjointement au lavage après incubation avec le réactif de détection ENV.
L'eau de lavage (Water Wash) est utilisée pour les étapes de lavage à la fin des protocoles
d'immunomarquage.
Les anticorps primaires ne sont pas fournis avec le kit. Nous recommandons d'utiliser les
anticorps primaires concentrés DakoCytomation. Veuillez consulter les recommandations de
dilution optimales dans le tableau 2.
Le réactif ChemMate™ DAKO EnVision™,EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) inclus dans le
kit est constitué d'un squelette de dextran sur lequel ont été couplées un grand nombre de
molécules de peroxydase (HRP) et d'anticorps secondaires. Une réaction chimique unique est
utilisée pour la réaction de couplage qui permet la liaison de jusqu'à 100 molécules d'HRP et 20
molécules d'anticorps par squelette. L'anticorps secondaire couplé au squelette de dextran est
d'origine caprine. Il réagit aussi bien avec les immunoglobulines de lapin et de souris, et donc, un
seul réactif de détection est nécessaire pour les anticorps primaires de lapin et de souris.
Le réactif de détection ENV est fourni prêt à l'emploi dans un flacon compte-gouttes.
Le système de substrat est composé de deux éléments, la solution ChemMate™ DAB+
Chromogen, une solution de diaminobenzidine (DAB) concentrée, et le ChemMate™ Substrate
Buffer qui contient du peroxyde d'hydrogène. Le DAB+ Chromogen doit être dilué dans le
tampon substrat avant utilisation. Le système de substrat donne une couleur brune sur le site de
l'antigène cible.
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ChemMate Hematoxylin, code S 2020, est recommandée pour la coloration de contraste car
elle donne une coloration bleu clair du noyau.
Les coupes de tissus marquées peuvent être montées avec un milieu de montage aqueux ou à
base de solvant organique.
Réactifs
A. Matériels nécessaires mais non fournis
Instrument DakoCytomation TechMate™
ChemMate™ Capillary Gap Microscope Slides codes S 2024 (75 µm),
S 2025 (100 µm), S 2026 (155 µm)
ChemMate™ Buffer Kit code K 5006
ChemMate™ Peroxidase-Blocking Solution, code S 2023
ChemMate™ Proteinase K, code S 2019 (si nécessaire)
ChemMate™ Proteinase K Diluent, code S 2032 (si nécessaire)
Anticorps primaires de lapin ou de souris DakoCytomation ou d'autres fournisseurs
Réactif de contrôle négatif approprié pour l'anticorps primaire
ChemMate™ Antibody Diluent, code S 2022 (pour diluer les anticorps concentrés)
ChemMate™ Hematoxylin, code S 2020
ChemMate™ Target Retrieval Solution, Concentrated x 10, code S 2031
ChemMate™ Incubation Container, code S 2030
ChemMate™ Slide Holder, code S 2029
ChemMate™ Absorbent Pads, code S 2027 pour le TechMate™ 500/500 Plus/1000, ou code
S 2043 pour le TechMate™ Horizon
ChemMate™ Reagent Trays, code S 2039
Réactifs de laboratoire généraux pour déparaffiner les coupes incluses en paraffine
Milieu de montage (aqueux ou à base de solvant organique) et lamelles de protection
B. Préparation des réactifs
Solution de substrat (CHROM)
La solution de substrat contenant du DAB (CHROM) se prépare en mélangeant intimement 50
parties de ChemMate™ Substrate Buffer (flacon B) avec 1 partie de ChemMate™ DAB+
Chromogen (flacon C). Préparez uniquement le volume requis pour le nombre de lames à
marquer. Voir le tableau Table 1 ci-dessous. Chaque puits correspond à deux lames appariées.
Le CHROM doit être utilisé dans les 5 jours (conserver dans l'obscurité entre 2 et 8 °C).
Tableau 1.
Nombre de puits
(chacun contenant environ 750 µL)
1
5
10
(1 plateau)
20
(2 plateaux)
30
(3 plateaux)
ChemMate™ Subsrate Buffer
750 µL
4L
8 mL
16 mL
24 mL
15 µL
80 µL
160 µL
320 µL
480 µL
Pour la préparation des réactifs non fournis avec le kit, veuillez consulter le mode d'emploi de
chaque réactif.
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Collecte et préparation des échantillons
Les spécimens peuvent être des coupes de tissus normalement fixées incluses en paraffine et
des coupes de tissus congelées.
Différents fixateurs peuvent être utilisés pour les conserver. Les spécimens ne doivent pas être
fixés dans du formol tamponné neutre pendant plus de 24 heures et de préférence pour
une durée encore plus réduite.
L'épaisseur optimale des coupes incluses en paraffine est d'environ 4 µm
L'épaisseur optimale des coupes congelées est de 4 à 6 µm
Tous les spécimens doivent être montés sur des ChemMate™ Capillary Gap Microscope Slides
et placées dans le porte-lames "face à face" par paires. Les lames étant déjà recouvertes
d'adhésif, un traitement supplémentaire n'est pas conseillé plus car cela pourrait avoir un effet
préjudiciable.
Trois types de lames de microscope à capillaire creux sont disponibles :
1. Lames avec zones peintes en gris de 75 µm d'épaisseur. Ces lames sont destinées aux
coupes de tissus incluses en paraffine et doivent être appariées avec des lames similaires.
2. Lames avec zones peintes en bleu de 100 µm d'épaisseur. Ces lames sont destinées aux
coupes de tissus congelées et aux frottis et doivent être appariées avec des lames similaires.
3. Lames avec zones peintes en jaune de 155 µm d'épaisseur. Ces lames ne doivent pas être
montées avec des coupes de tissus. Elles sont destinées aux coupes de tissus déjà montées
sur des lames ordinaires sans capillaires creux. Il suffit de coupler la lame ordinaire et la
lame jaune pour obtenir un capillaire creux correct.
REMARQUE: La largeur des lames ordinaires ne doit pas être supérieure à 25 mm pour pouvoir
les placer dans le porte-lames.
Les spécimens doivent être montés sur la partie de la lame la plus éloignée de l'extrémité peinte
portant l'étiquette. Il est important de placer les spécimens sur le côté de la lame où se trouve
l'étiquette peinte. Les coupes de tissus étant placées "face à face" pendant la procédure
d'immunomarquage, elles doivent être montées sur les lames le plus à plat et avec le moins de
plissements possible. Des plissements ou des amas excessifs inhibent la capillarité et peuvent
provoquer un marquage irrégulier.
Les coupes incluses en paraffine doivent être montées après un séjour dans un bain d'eau
distillée ou déionisée préalablement chauffée. Le bain d'eau ne doit contenir aucun additif (tel
que la gélatine, la poly-L-lysine etc...). Les coupes doivent être séchées à la chaleur,
généralement à une température ne dépassant pas 60 °C pendant un minimum de 60 minutes
(par exemple pendant la nuit). Pour assurer une bonne adhérence des coupes sur les lames, il
est important d'évacuer l'eau qui se trouve dessous avant le processus de séchage au four.
Procédure
Avant d'exécuter un protocole sur les instruments TechMate™ de DakoCytomation, lire
attentivement le Manuel d'utilisation de l'instrument TechMate™ concerné.
Avant de mettre en marche l'instrument TechMate™, les lames doivent être organisées pour la
procédure d'immunomarquage :
Coupes de tissus normalement fixées incluses en paraffine :
Après déparaffinisation et hydratation avec le tampon (eau), les coupes de tissus doivent être
soumises à une procédure de restauration de l'épitope au four à micro-ondes (voir la section A
ci-dessous). Quelques épitopes ne supportent pas le traitement au four à micro-ondes.
Se reporter aux consignes pour l'anticorps primaire DakoCytomation concerné.
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En plus du réchauffement au four à micro-ondes, certains épitopes nécessitent une courte
digestion enzymatique sur l'instrument TechMate™. Se reporter au Tableau 2 et aux consignes
pour la ChemMate™ Proteinase K code S 2019. Les spécimens qui nécessitent une digestion
enzymatique doivent être regroupés.
Si aucun spécimen ne nécessite une digestion enzymatique, le protocole ENVP peut être utilisé
pour toutes les lames (ce protocole dure environ 2 ¼ heures).
Si certains spécimens demandent une digestion enzymatique, exécutez le protocole ENVPE
pour toutes les lames (ce protocole prend environ 2 ¼ ). Pour les spécimens qui ne nécessitent
pas de digestion enzymatique, il suffit de remplacer l'enzyme protéolytique dans le puits par du
ChemMate™ Proteinase K Diluent, code S 2032, ou le tampon de lavage 2 ou 3 du ChemMate™
Buffer Kit, code K 5006.
A. Restauration de l'épitope au four à micro-ondes
Il est recommandé de suivre soigneusement les consignes ci-dessous pour garantir une
restauration de l'épitope reproductible. Pour standardiser le traitement, il est recommandé de
charger entièrement le porte-lames avec les lames, même si une seule comporte une coupe;
cela assure un réchauffement identique des coupes à chaque analyse.
A la fin de l'étape de restauration de l'épitope, les lames doivent rester dans le tampon au moins
20 minutes à température ambiante. Pendant cette étape de refroidissement, l'instrument
TechMate™, peut être préparé pour l'immunomarquage.
Procédure au four à micro-ondes
1. Placer les coupes de tissu déparaffinées dans un ChemMate™ Slide Holder, code S 2029.
Transférer le ChemMate™ Slide Holder dans un ChemMate™ Incubation Container, code
S 2030, rempli de 200 ml de ChemMate™ Target Retrieval Solution code S 2031, diluée à
1:10.
2. Placer le bac dans le four à micro-ondes avec le couvercle en diagonale. Utiliser un four de
800 W sur réglage fort.
Chauffer au micro-ondes pendant 5 minutes après avoir porté le tampon à ébullition.
Ajouter 50 ml d'eau déionisée pour remplacer l'eau évaporée.
Chauffer au micro-ondes pendant 5 minutes supplémentaires.
Retirer le bac du four et laisser refroidir à température ambiante pendant au moins 20
minutes.
3. Remplacer le tampon par de l'eau déionisée et laisser pendant un moment. Les lames sont
maintenant prêtes à être chargées dans le TechMate™ Slide Holder.
REMARQUE: Il est normal et souhaitable que le tampon bout. Tous les fours à micro-ondes de
800 W ne transfèrent pas la chaleur de la même manière. Donc, pour garantir une
standardisation locale, le four doit être testé avec des lames sans coupes de tissus la première
fois, pour déterminer le temps nécessaire pour obtenir 5 minutes d'ébullition effective.
B. Recommandations de dilution optimale pour le pré-traitement des anticorps
primaires et de la protéinase K
Le tableau 2 indique des recommandations de dilution pour les anticorps primaires concentrés
DakoCytomation utilisés avec le ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB,
Rabbit/Mouse et pour une application sur des coupes incluses en paraffine et fixées au formol.
Les anticorps primaires doivent être dilués dans le ChemMate Antibody Diluent, code S 2022.
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Tableau 2.
Recommandations de dilution optimale pour le pré-traitement des anticorps
primaires et de la protéinase K.
Code
Anticorps primaire
Prétraitement
protéinase K
Dilution optimale
pour les
instruments
TechMate™
A 0010
OUI
1:50-1:100
A 0082
OUI
1:250-1:500
A 0098
-
A 0191
OUI
1:2000-1:4000
A 0193
OUI
1:500-1:1000
A 0251
-
1:400-1:1200
Z 0311
Rabbit Anti- S100
OUI
1:250-1:500
1:5-1:10
Z 0334
-
1:400-1:1200
A 0430
-
1:1000-1:2000
A 0452
A 0562
-
1:1000-1:4000
A 0576
-
1:100-1:200
M 0613
-
1:40-1:80
M 0630
OUI
1:25-1:50
M 0631
-
1:20-1:40
M 0634
-
1:50-1:100
M 0635
-
1:20-1:40
M 0701
-
1:50-1:100
M 0725
-
1:10-1:20
M 0742
-
1:50-1:100
M 0751
OUI
M 0755
-
1:50-1:200
M 0760
-
1:50-1:100
M 0785
OUI
1:5-1:10
M 0821
OUI
1:50-1:100
M 0851
-
1:50-1:100
M 0873
-
1:200-1:800
M 0876
-
1:50-1:100
M 0879
-
1:1000-1:2000
M 0887
-
1:2-1:6
M 7001
-
1:25-1:100
M 7047
-
1:5-1:10
M 7050
-
1:50-1:100
M 7072
-
1:10-1:20
OUI
1:50-1:100
1:3-1:6
C. Protocole d'immunomarquage
Les protocoles ENVP et ENVPE, et les matrices des positions des réactifs sur l'instrument
peuvent être visualisés sur l'écran TechMate™ avant et pendant l'analyse. Les protocoles
indiquent le nombre et le nom des étapes, et les temps d'incubation pour chaque étape.
Les matrices donnent les positions des réactifs et des tampons absorbants sur l'instrument
TechMate™. Il est recommandé de remplir une Feuille de positionnement de l'anticorps pour
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les paires de lames devant être traitées individuellement avec les réactifs, par exemple les
anticorps primaires des plateaux à 10 puits. Veuillez consulter le Manuel d'utilisation.
1.
Charger les réactifs dans les plateaux à 10 puits sur l'instrument TechMate™ selon la
matrice du réactif et la feuille de positionnement de l'anticorps. Veiller à charger les réactifs
et les volumes corrects. Faire particulièrement attention au chargement des anticorps
primaires.
2.
Avant de charger les lames dans le porte-lames, il est recommandé de les pré-humidifier
avec du tampon de lavage 2 du ChemMate™ Buffer Kit, code K 5006. Cela peut se faire
facilement en laissant les lames en paires disposées selon la Feuille de positionnement de
l'anticorps, pendant quelques minutes dans un plateau à 10 puits contenant du tampon de
lavage 2. Ce mouillage assure un flux adéquat de liquide dans le capillaire en creux.
3.
Après le mouillage, placer les paires de lames dans le porte-lames TechMate ™selon la
Feuille de positionnement de l'anticorps. S'assurer que les lames sont alignées.
4.
Juste avant l'analyse, placer le TechMate™ Slide Holder sur le tampon absorbant 2 dans
l'instrument TechMate™ pour égoutter le tampon de lavage 2 du capillaire en creux.
Surveiller soigneusement l'égouttage des lames pour vérifier que toutes les lames sont
appariées correctement et si l'alignement est correct.
5.
Placer le TechMate™ Slide Holder dans le tampon de lavage (par exemple tampon de
lavage 1 ou 2) utilisé pour la première étape du protocole pour remplir les capillaires en
creux de la solution tampon.
6.
Placer le TechMate™ Slide Holder sur la position HOME avant de commencer le traitement.
Consulter le Chapitre 5 "EXECUTION D'UN SEUL PROTOCOLE " dans le Manuel d'utilisation.
REMARQUE: Les étapes finales des protocoles sont le lavage dans le Water Wash (eau de
lavage) (du ChemMate™ Buffer Kit, code K 5006), désigné par H2O sur la matrice et dans le
protocole. Si l'utilisateur préfère préparer les spécimens pour un montage sur un milieu aqueux,
la position HOME peut être chargée avec de l'eau après le lancement de l'analyse. Sur le
TechMate™ Horizon, la position H2O est égale à la position HOME.
Les volumes à charger sur les plateaux pour chaque réactif sont indiqués ci-dessous.
Ces volumes correspondent aux protocoles utilisés pour ce kit.
Tampons de lavage 1, 2 ou 3 (BUF1, 2, 3)
20 mL par plateau de 10 puits
Eau de lavage (H2O)
Solution de blocage de peroxydase (HP-BK)
préparée à partir de ce kit
750 µL par puits
Protéinase K diluée (ENZ)
500 µL par puits
Hématoxyline (HEMA)
750 µL par godet
Anticorps primaire (AB1)
8 gouttes (320 µL) par puits
EnVision™/HRP (ENV)
Flacon A dans ce kit
8 gouttes (320 µL) par puits
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CONSIGNES D'UTILISATION DES INSTRUMENTS AUTOSTAINER de
DakoCytomation
Résumé et explications
ChemMate™ DAKO Envision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, a été adapté pour
une utilisation sur les instruments Autostainer DakoCytomation selon la matrice décrite cidessous.
Avant leur coloration sur les instruments Autostainer™, certaines coupes incluses en paraffine
normalement fixées doivent être soumises à une restauration des épitopes dans un four à
micro-ondes avec la solution de démasquage spécifiée dans le tableau 3 ou les consignes pour
l'anticorps primaire. Note : pour un marquage optimal, certains anticorps primaires nécessitent
en plus un pré-traitement des tissus à la protéinase K.
La peroxydase endogène doit être bloquée avec la Peroxidase-Blocking Solution, code S 2023.
Grâce à une procédure de lavage efficace et à la présence de protéines porteuses dans les
réactifs DakoCytomation, il n'est pas nécessaire d'effectuer d'autres étapes de blocage pour
réduire le bruit de fond non spécifique.
Il est recommandé d'utiiser le DakoCytomation Wash Buffer, concentré x 10, pour
immunocytochimie code S 3006.
Les anticorps primaires ne sont pas fournis avec le kit. Nous recommandons d'utiliser les
anticorps concentrés DakoCytomation. Se reporter aux recommandations de dilution optimales
dans le tableau 3.
Le réactif de détection ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV) inclus dans le
kit est constitué d'un squelette de dextran sur lequel ont été couplées un grand nombre de
molécules de peroxydase (HRP) et d'anticorps secondaire. Une réaction chimique unique est
utilisée pour la réaction de couplage qui permet la liaison de jusqu'à 100 molécules d'HRP et 20
molécules d'anticorps par squelette. L'anticorps secondaire couplé au squelette de dextran est
d'origine caprine. Il réagit aussi bien avec les immunoglobulines de lapin et de souris, et donc, un
seul réactif de détection est nécessaire pour les anticorps primaires de lapin et de souris.
Le réactif de détection ENV est fourni dans un flacon compte-gouttes et il doit être versé dans un
Autostainer Reagent Vial, code S 3425 avant utilisation.
Le système de substrat est composé de deux éléments, la solution ChemMate™ DAB+
Chromogen, une solution de diaminobenzidine (DAB) concentrée, et le ChemMate™ Substrate
Buffer qui contient du péroxyde d'hydrogène. Le DAB+ Chromogen doit être dilué dans le
tampon substrat avant utilisation. Le système de substrat donne une couleur brune sur le site de
l'antigène cible. La solution de chromogène mélangée doit être versée dans un Autostainer
Reaget Vial code S 3425 avant utilisation.
DakoCytomation Hematoxylin, code S 3301, est recommandée pour la coloration de contraste
sur les instruments Autostainer car elle donne une coloration bleu claire du noyau.
Les coupes de tissus marquées peuvent être montées avec un milieu de montage aqueux ou à
base de solvant organique.
Réactifs
A. Matériels nécessaires mais non fournis
Instrument DakoCytomation Autostainer™
DakoCytomation Wash Buffer, concentratéd 10x, pour immunocytochimie,
code S 3006
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ChemMate™ Peroxidase-Blocking Solution, code S 2023
ChemMate™ Proteinase K, code S 2019 (si nécessaire)
ChemMate™ Proteinase K Diluent, code S 2032 (si nécessaire)
Anticorps primaires de lapin ou de souris DakoCytomation ou d'autres fournisseurs
Réactif de contrôle négatif approprié pour l'anticorps primaire
ChemMate™ Antibody Diluent, code S 2022 (pour diluer les anticorps concentrés)
DakoCytomation Hematoxylin,our utilisation avec l'instrument Autostainer, code S 3301
DakoCytomation Target Retrieval Solution, code S 1699 ou S 1700, DakoCytomation Target
Retrieval Solution, pH élevé, code S3307 ou S3308, ou ChemMate™ Target Retrieval Solution,
concentrated 10x, code S 2031
ChemMate™ Incubation Container, code S 2030
ChemMate™ Slide Holder, code S 2029
Autostainer Reagent Vials DakoCytomation (100 flacons), code S 3425
Lames de microscope
Réactifs de laboratoire généraux pour déparaffiner les coupes incluses en paraffine
Milieu de montage (aqueux ou à base de solvant organique) et lamelles de protection
B. Préparation des réactifs
La solution de substrat (CHROM) se prépare en mélangeant intimement 20 µL de ChemMate
DAB+ Chromogen (flacon C) et 1 mL de ChemMate™Substrate Buffer (flacon B). Préparer
uniquement le volume requis pour le nombre de lames à marquer. Le CHROM doit être utilisé
dans les 5 jours (conserver dans l'obscurité entre 2 et 8 °C)
Pour la préparation des réactifs non fournis avec le kit, consulter le mode d'emploi de chaque
réactif.
Collecte et préparation des échantillons
Les spécimens peuvent être des coupes de tissus normalement fixées incluses en paraffine et
des coupes de tissus congelées.
Différents fixateurs peuvent être utilisés pour les conserver. Les spécimens ne doivent pas être
fixés dans du formol tamponné neutre pendant plus de 24 heures et de préférence pour une
durée encore plus réduite.
L'épaisseur optimale des coupes incluses en paraffine est d'environ 4 µm.
L'épaisseur optimale des coupes congelées est de 4 à 6 µm.
Les coupes de tissus doivent être montées sur des lames de microscope. Les coupes doivent
être montées sur les lames le plus à plat et avec le moins de plissements possible.
Des plissements excessifs affectent le marquage.
REMARQUE: La largeur des lames de microscope ne doit pas être supérieure à 26 mm pour
pouvoir les placer dans le porte-lames.
Les coupes incluses en paraffine doivent être montées après un séjour dans un bain d'eau
distillée ou déionisée préalablement chauffée. Le bain d'eau ne doit contenir aucun additif (tel
que la gélatine, la poly-L-lysine etc...). Les coupes doivent être séchées à la chaleur,
généralement à une température ne dépassant pas 60 °°C pendant un minimum de 60 minutes
(par exemple pendant la nuit). Pour assurer une bonne adhérence des coupes sur les lames, il
est important d'évacuer l'eau qui se trouve dessous avant le processus de séchage au four.
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Procédure
Avant d'exécuter la procédure d'immunomarquage selon la matrice sur les instruments
Autostainer de DakoCytomation, lire attentivement le Manuel d'utilisation de l'instrument
Autostainer ™ concerné.
Avant de mettre en marche l'instrument Autostainer, les lames et les réactifs doivent être placés
selon la matrice de positionnement des lames et la matrice de positionnement des réactifs.
Coupes de tissus normalement fixées incluses en paraffine
Après déparaffinisation et hydratation avec le tampon (eau), les coupes de tissus doivent être
soumises à une procédure de restauration de l'épitope au four à micro-ondes (voir la section A
ci-dessous). Quelques épitopes ne supportent pas le traitement au four à micro-ondes. Se
reporter aux consignes pour l'anticorps primaire DakoCytomation concerné.
En plus du réchauffement au four à micro-ondes, certains épitopes nécessitent une courte
digestion enzymatique sur l'instrument Autostainer. Se reporter au Tableau 3 et aux consignes
pour la ChemMate™ Proteinase K, code S 2019.
A. Restauration de l'épitope au four à micro-ondes
Veuillez consulter les CONSIGNES POUR LES INSTRUMENTS TechMate™ de
DakoCytomation
B. Recommandations de dilution optimale pour le pré-traitement des anticorps
primaires et de la protéinase K
Le tableau 3 indique des recommandations de dilution pour les anticorps primaires concentrés
de DakoCytomation utilisés avec le ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit,
Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse et pour une utilisation avec des coupes incluses en paraffine
fixées au formol sur les instruments Autostainer.
Les anticorps primaires doivent être dilués dans le ChemMate™Antibody Diluent, code S 2022.
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Tableau 3. Recommandations de dilution optimale pour le pré-traitement des anticorps primaires
et de la protéinase K
Code
Anticorps primaire
Tampon de
démasquage
Prétraitement
protéinase K
A 0010
Dilution optimale
pour les instruments
Autostainer
S 2031
Oui
1:100 – 1:150
A 0082
S 2031
Oui
1:250 – 1:500
A 0098
S 1700
-
A 0191
S 2031, voir
méthode dans
brochure sur
Kappa/Lambda
sur instruments
TechMate™
Oui
1:400 – 1:1000
A 0193
S 2031, voir
méthode dans
brochure sur
Kappa/Lambda
sur instruments
TechMate™
Oui
1:400 – 1:1000
1:25 – 1:50
A 0251
S 2031
Oui
1:2500 – 1:3000
A 0430
S 2031
-
1:1000 – 1:2000
A 0452
S 2031
Oui
A 0562
S 2031
-
1:50 – 1:100
1:1000 – 1:4000
A 0576
S 2031
-
1:5000 – 1:6000
M 0613
S 2031
-
1:100 – 1:500
M 0630
Clone 34βE12
S 2031
Oui
1:50 – 1:100
M 0631
Clone 35βE11
S 2031
Oui
1:50 – 1:100
M 0634
S 2031
-
1:50 – 1:100
M 0635
S 2031
-
1:40 – 1:50
M 0701
S 2031
-
1:100 – 1:200
M 0725
S 2031
-
1:100 – 1:200
M 0742
S 2031
-
1:100 – 1:300
M 0751
S 1700
Oui
M 0755
S 2031
-
M 0760
S 2031
-
M 0785
S 2031
Oui
1:25 –1:50
M 0821
S 2031
Oui
1:50 – 1:100
M 0851
S 2031
-
1:50 – 1:100
M 0873
BBS/NC/VI-H14
S 2031
-
1:800 – 1:1000
M 0876
S 2031
-
1:50 – 1:100
M 0887
S 2031
-
M 7001
S 2031
-
M 7047
S 1700
-
1:50 – 1:100
M 7050
S 2031
-
1:50 – 1:150
1:5 – 1:10
1:750 – 1:1000
1:75 – 1:150
1:25 – 1:60
M 7072
S 2031
-
1:10 – 1:50
M 7240
S 1700
-
1:200 – 1:400
Z 0311
Rabbit Anti-S100
S 2031
Oui
1:250 – 1:500
Z 0334
S 2031
-
1:400 – 1:1200
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C. Programmation de l'Autostainer de DakoCytomation
Avant la première application du ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB,
Rabbit/Mouse, code K 5007, sur l'instrument Autostainer, une nouvelle matrice doit être créée.
Se reporter à la matrice ci-dessous et au Manuel d'utilisation de l'instrument Autostainer
concerné.
Matrice: CMK5007
Avant de charger les lames selon l'ECRAN DU PROGRAMME D'IMMUNOMARQUAGE, les
réactifs suivants doivent être ajoutés à la liste de réactifs. Se reporter au tableau 4 ci-dessous
pour connaître le nom, l'étape de la matrice et le temps d'incubation et au Manuel d'utilisation
de l'instrument Autostainer concerné.
Tableau 4. Ajouts nécessaires à la liste de réactifs
Réactif
Code
Etape de matrice
Temps
d'Incubation
S 2023
Fin. Enz. Block
5 minutes
S 2019 +S 2032
Prétraitement
sous anticorps
10 minutes
Anticorps primaires non déjà présents dans la liste
Autostainer
Individuel
Anticorps
25 minutes
K 5007
Marquage du
polymère
30 minutes
K 5007
Substrat
3 minutes
Hématoxyline pour utilisation avec les instruments
Autostainer
S 3301
Auxiliaire
1 minute
Tampon bleu (=Tampon Autostainer)
S 3006
Auxiliaire
5 minutes
D. Protocole d’immunomarquage
Charger la matrice (CMK5007) pour le kit de détection ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection
Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, dans l'ECRAN PROGRAMME D'IMMUNOMARQUAGE.
Spécifier le nombre de lames dans l'analyse, et charger les réactifs avec les temps d'incubation
dans la matrice. Le positionnement des lames s'affichera alors à l'écran Matrice de
positionnement des lames et le positionnement et le volume des réactifs à charger dans
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l'instrument Autostainer sera indiqué dans l'écran Matrice de positionnement des réactifs.
Se reporter aussi au Manuel d'utilisation.
Avant de charger les lames selon la Matrice de positionnement des lames, il est recommandé
de les pré-humidifier pendant 5 minutes dans le DakoCytomation Wash Buffer, code S 3006.
Charger les réactifs dans les Autostainer Reagent Vials, code S 3425, et positionner ces derniers
dans le rack selon la Matrice de positionnement des réactifs. Veiller à charger les réactifs et
les volumes corrects. Faire particulièrement attention au chargement des flacons contenant
anticorps primaires. Amorcer les pompes à tampon et à eau. Lancez le programme.
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DEUTSCH
ALLGEMEINE ANLEITUNGEN
Zweckbestimmung
Zur Verwendung für In-vitro-Untersuchungen.
ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, ist zusammen
mit den DakoCytomation TechMate™- und Autostainer-Geräten zur Verwendung in der
Immunzytochemie bestimmt. Der Kit wird in einem zweistufigen Verfahren eingesetzt, bei dem
der erste Schritt in der Inkubation des Gewebes mit einem optimal verdünnten primären
Kaninchen- oder Mausantikörper besteht und der zweite Schritt in der Inkubation mit dem
ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV)-Reagenz des Kits. Bei diesem
Reagenz handelt es sich um ein Peroxidase-konjugiertes Polymer, das auch Antikörper gegen
Kaninchen- und Mausimmunglobuline trägt. Die Reaktion wird mithilfe von ChemMate™ DAB+
Chromogen visualisiert, das ebenfalls zum Lieferumfang des Kits gehört.
Einleitung
ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, ist für die
Verwendung zusammen mit den DakoCytomation TechMate™- und Autostainer-Geräten
bestimmt. Die Anleitungen für die beiden Geräte weichen voneinander ab und werden daher
getrennt aufgeführt.
Reagenzien
Packungsinhalt
Flasche A
100 mL, gebrauchsfertig
Mit Peroxidasemolekülen und sekundären
Ziegenantikörpermolekülen gegen Kaninchen- und
Mausimmunglobuline gekoppeltes Dextran. In Pufferlösung mit
stabilisierendem Protein und Konservierungsmittel.
Flasche B
250 mL
Pufferlösung mit Wasserstoffperoxid und Konservierungsmittel.
Flasche C
5 mL, 50-fache Konzentration
3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid in organischem
Lösungsmittel.
Die Farbe dieses Reagenz kann von intensivem Violett bis zu
farblos variieren, ohne die Kit-Leistungen zu beeinflussen..
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
1.
2.
Für geschultes Fachpersonal.
Flasche A, ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV), enthält Materialien
tierischer Herkunft und es kann nicht ausgeschlossen werden, dass aufgrund des
Herstellungsverfahrens Spuren menschlichen Materials vorliegen können. Wie bei allen aus
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biologischen Materialien gewonnenen Produkten müssen die ordnungsgemäßen
Handhabungsverfahren eingehalten werden.
3.
Flasche C, ChemMate™ DAB+ Chromogen oder die Substrate Working Solution (CHROM)
dürfen nicht intensivem Licht ausgesetzt werden.
4.
In die TechMate™-Geräte eingefüllte Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden.
5.
Flasche C, ChemMate™ DAB+ Chromogen, enthält 1,5 % 3,3’-DiaminobenzidinTetrahydrochlorid und trägt die Kennzeichnung:
Gesundheitsschädlich
R40 Verdacht auf krebserzeugende Wirkung.
R43 Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich.
R68 Irreversibler Schaden möglich.
S35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden.
S36/37 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen.
Personen unter 18 Jahren ist es grundsätzlich nicht gestattet, mit diesem Produkt zu
arbeiten. Benutzer müssen sorgfältig in die richtigen Arbeitsverfahren eingewiesen und über
die gefährdenden Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsvorschriften
informiert werden. Weitere Angaben sind dem Sicherheitsdatenblatt zu entnehmen.
Lagerung
Kit bei 2 – 8 °C lagern. Nicht nach dem auf dem Kit angegebenen Verfallsdatum verwenden.
Komponenten von Kits unterschiedlicher Chargen dürfen nicht gegeneinander ausgetauscht
werden. Falls die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt
werden, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. Die angesetzte Substrate Working
Solution (CHROM) muss bei 2-8°C gelagert und innerhalb von 5 Tagen aufgebraucht werden.
Wenn unerwartete Anfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden
nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Produkt besteht, ist bitte
Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen.
Qualitätskontrolle
Jeder Färbungsdurchgang muss eine bekanntermaßen positive Kontrollprobe enthalten, um eine
korrekte Leistung aller angewendeten Reagenzien zu gewährleisten. Wenn die positive
Kontrollprobe keine positive Anfärbung erbringt, muss die Markierung der Testproben als
ungültig angesehen werden.
Es sollte bei jeder Probe ein Negativkontrollreagenz verwendet werden, um unspezifische
Anfärbung zu identifizieren. Wenn eine unspezifische Färbung nicht von der spezifischen
Färbung unterschieden werden kann, muss die Markierung der Testprobe als ungültig
angesehen werden.
Interpretation der Ergebnisse
Die Diaminobenzidin enthaltende Substrate Working Solution ergibt an der Stelle des
Zielantigens, das von dem primären Antikörper erkannt wurde, eine braune Farbe.
Die braune Färbung muss bei der positiven Kontrollprobe an der erwarteten Position des
Zielantigens vorliegen.
Wenn eine unspezifische Anfärbung vorliegt, wird dies auf den mit dem Negativkontrollreagenz
behandelten Objektträgern als eine eher diffus erscheinden braune Anfärbung wahrgenommen.
Zellkerne werden von der Hämatoxylin-Gegenfärbung blau eingefärbt.
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ANLEITUNGEN FÜR DakoCytomation TechMate™-GERÄTE
Zusammenfassung und Erläuterung
ChemMate™ DAKO EnVision Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, wurde darauf
ausgelegt, dass bei Befolgung der in der nachstehenden Anleitung beschriebenen
Verfahrensprotokolle mit den TechMate™-Geräten eine optimale Anfärbung erreicht wird.
Die automatisierte Immunanfärbung mit den TechMate™-Geräten verwendet Kapillarwirkung,
um Reagenzien aus den Reagent Trays, Code-Nr. S 2039, aufzuziehen und Proben
einzudecken, die auf speziellen Kapillarspalt-Mikroskopobjektträgern fixiert wurden. Nach einer
vorher festgelegten Inkubationszeit werden die Reagenzien von den Proben durch Absorption in
saugfähige Absorbent Pads, Code-Nr. S 2027 für TechMate™ 500/500 Plus/1000, und Code-Nr.
S 2043 für TechMate™ Horizon, entfernt.
Vor dem Anfärben mit den TechMate™-Geräten müssen nach Routineverfahren fixierte,
paraffineingebettete Gewebeschnitte mit Hilfe von ChemMate™ Target Retrieval Solution,
Code-Nr. S 2031, im Verhältnis 1:10 verdünnt, im Mikrowellengerät einer Epitopdemaskierung
unterzogen werden. Es ist zu beachten, dass einige primäre Antikörper für eine optimale
Färbung eine Vorbehandlung des Gewebes mit Proteinase K benötigen.
Endogene Peroxidase muss mit der Peroxidase-Blocking Solution, Code-Nr. S 2023, blockiert
werden.
Aufgrund eines effektiven Waschverfahrens und des Vorhandenseins von Trägerproteinen in
den DakoCytomation-Reagenzien sind zusätzliche Blockierungsschritte zur Reduzierung nicht
spezifischer Hintergrundfärbung nicht erforderlich.
Der ChemMate™ Buffer Kit, Code-Nr. K 5006, enthält Wash Buffers 1, 2 und 3 und Water
Wash. Wash Buffer 1 wird während des ersten Teils der Färbeprozedur eingesetzt. Die
Formulierung dieses Puffers trägt zur Blockierung einer unspezifischen Bindung des primären
Antikörpers und des ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Kaninchen/Maus (ENV)Nachweisreagenz an die Gewebeschnitte bei. Waschpuffer 2 und 3 sind identisch und werden
für den restlichen Teil des Verfahrens verwendet. Da Waschpuffer 2 und 3 kein Natriumazid
enthalten, werden sie insbesondere in Verbindung mit dem Waschen nach der Inkubation mit
dem ENV-Nachweisreagenz angewendet. Water Wash wird für die Waschschritte am Ende der
Färbungsprotokolle eingesetzt.
Primäre Antikörper gehören nicht zum Lieferumfang des Kits. Es wird die Verwendung
konzentrierter primärer Antikörper von DakoCytomation empfohlen. Siehe Richtwerte für
optimale Verdünnungen in Tabelle 2.
Das zum Kit gehörende ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV)Nachweisreagenz besteht aus einem Dextran-Rückgrat, an das eine große Zahl Peroxidase
(HRP)-Moleküle und sekundäre Antikörpermoleküle gekoppelt wurden. Der Kopplungsreaktion
liegt ein einzigartiger Chemismus zugrunde, der die Bindung von bis zu 100 HRP-Molekülen und
bis zu 20 Antikörpermolekülen pro Rückgrat ermöglicht. Der sekundäre Antikörper, der an das
Dextran-Rückgrat gekoppelt ist, wurde in Ziegen herangezogen. Er reagiert gleich gut mit
Kaninchen- und Mausimmunglobulinen, so dass nur ein Nachweisreagenz für primäre
Kaninchen- und Mausantikörper benötigt wird. Das ENV-Nachweisreagenz wird gebrauchsfertig
in einer Tropfenzählerflasche geliefert.
Das Substratsystem besteht aus zwei Komponenten, ChemMate™ DAB+ Chromogen, einer
konzentrierten Diaminobenzidin (DAB)-Lösung und ChemMate™ Substrate Buffer mit
Wasserstoffperoxid. Vor dem Gebrauch muss das DAB+-Chromogen in dem Substratpuffer
verdünnt werden. Das Substratsystem erzeugt an der Stelle des Zielantigens eine braune
Färbung.
Zur Gegenfärbung wird ChemMate Hematoxylin, Code-Nr. S 2020, empfohlen, da es eine
eindeutige blaue Anfärbung des Zellkerns erbringt.
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Die angefärbten Gewebeschnitte können entweder mit einem wässrigen oder einem auf
organischem Lösungsmittel basierendem Eindeckmedium auf Objektträgern vorgesehen
werden.
Reagenzien
A. Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs)
DakoCytomation TechMate™-Gerät
ChemMate™ Capillary Gap Microscope Slides, Code-Nr. S 2024 (75 µm),
S 2025 (100 µm), S 2026 (155 µm)
ChemMate™ Buffer Kit, Code-Nr. K 5006
ChemMate™ Peroxidase-Blocking Solution, Code-Nr. S 2023
ChemMate™ Proteinase K, Code-Nr. S 2019 (falls erforderlich)
ChemMate™ Proteinase K Diluent, Code-Nr. S 2032 (falls erforderlich)
Primäre Kaninchen- oder Mausantikörper von DakoCytomation oder aus anderer Bezugsquelle
Geeignetes Negativkontrollreagenz für den primären Antikörper
ChemMate™ Antibody Diluent, Code-Nr. S 2022 (zur Verdünnung konzentrierter Antikörper)
ChemMate™ Hematoxylin, Code-Nr. S 2020
ChemMate™ Target Retrieval Solution, zehnfach konzentriert, Code-Nr. S 2031
ChemMate™ Incubation Container, Code-Nr. S 2030
ChemMate™ Slide Holder, Code-Nr. S 2029
ChemMate™ Absorbent Pads, Code-Nr. S 2027 für TechMate™ 500/500 Plus/1000 oder
ChemMate™ Absorbent Pads, Code-Nr. S 2043 für TechMate™ Horizon
ChemMate™ Reagent Trays, Code-Nr. S 2039
Allgemeine Laborreagenzien zum Entwachsen paraffineingebetteter Gewebeschnitte
Eindeckmedium (wässrig oder auf der Basis organischer Lösungsmittel) und Deckgläser
B. Reagenzienvorbereitung
Die DAB enthaltende Substrate Working Solution (CHROM) wird durch gründliches Mischen von
50 Teilen ChemMate™ Substrate Buffer (Flasche B) mit 1 Teil ChemMate™ DAB+ Chromogen
(Flasche C) angesetzt. Nur das für die anzufärbende Anzahl Objektträger benötigte Volumen
ansetzen. Siehe Tabelle 1 unten. Eine Kavität der Mikrotiterplatte entspricht zwei einander paarig
zugeordneten Objektträgern. CHROM innerhalb von 5 Tagen verwenden (im Dunklen bei 2-8 °C
lagern).
Tabelle 1
Anzahl Kavitäten
(mit jeweils ca. 750 µL Inhalt)
1
5
10
(1 Platte)
20
(2 Platten)
30
(3 Platten)
750 µL
4 mL
8 mL
16 mL
24 mL
15 µL
80 µL
160 µL
320 µL
480 µL
Für das Ansetzen der nicht zum Lieferumfang des Kits gehörenden Reagenzien ist den
Anleitungen der jeweiligen Packungsbeilagen zu folgen.
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Probengewinnung und -vorbereitung
Bei den Proben kann es sich um routinemäßig fixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte und
Gefrierschnitte handeln.
Es kann eine Vielfalt von Fixativen für die Probenkonservierung verwendet werden. Proben
dürfen nicht länger als 24 Stunden und vorzugsweise über einen kürzeren Zeitraum in neutralem
gepuffertem Formalin fixiert werden.
Die optimale Dicke paraffineingebetteter Gewebeschnitte beträgt circa 4 µm.
Die optimale Dicke von Gefrierschnitten beträgt circa 4-6 µm.
Der Einschluss aller Proben muss auf ChemMate™ Capillary Gap Microscope Slides erfolgen
und die Proben sind im Objektträgerhalter in Paaren mit zueinander weisenden Vorderseiten zu
platzieren. Da die Objektträger bereits mit Haftmittel überzogen worden sind, wird von einer
weiteren Behandlung der Objektträger abgeraten, weil sich dies nachteilig auswirken könnte.
Die folgenden drei verschiedenen Typen von Kapillarspalt-Objektträgern sind erhältlich:
1. Objektträger mit grauen Bereichen, Auftragsdicke 75 µm. Sie sind für paraffineingebettete
Gewebeschnitte bestimmt und müssen mit ähnlichen Objektträgern in Paaren verwendet
werden.
2. Objektträger mit blauem Bereich, Auftragsdicke 100 µm. Sie sind für Gefrierschnitte und
Abstriche bestimmt und müssen mit ähnlichen Objektträgern in Paaren verwendet werden.
3. Objektträger mit gelbem Bereich, Auftragsdicke 155 µm. Auf diese Objektträger dürfen keine
Gewebeschnitte aufgebracht werden. Sie sind zur Verwendung für Gewebeschnitte
bestimmt, die auf normalen Objektträgern ohne Kapillarspalt fixiert worden sind. Normalen
Objektträger einfach mit dem gelben Objektträger zu einem Paar anordnen, um einen
geeigneten Kapillarspalt zu erzeugen.
HINWEIS: Normale Objektträger dürfen nicht breiter als 25 mm sein, damit sie in den
Objektträgerhalter passen.
Die Proben müssen auf dem Teil des Objektträgers fixiert werden, der sich am weitesten vom
etikettierten Objektträgerende entfernt befindet. Es ist wichtig, dass Proben auf der gleichen
Seite des Objektträgers platziert werden, auf der sich die mit Auftrag versehene Region befindet.
Da die Gewebeschnitte während der Färbeprozedur mit aufeinander zuweisenden Vorderseiten
angeordnet werden, müssen die Schnitte auf den Objektträgern so flach und faltenfrei wie
möglich fixiert werden. Zu vielen Falten oder Klumpen hemmen die Kapillarwirkung und können
zu widersprüchlichen Färberesultaten führen.
Paraffinschnitte müssen aus einem vorgewärmten Wasserbad heraus fixiert werden, das
destilliertes oder entionisiertes Wasser enthält. Das Wasserbad darf keine Zusätze (wie
Gelatine, Poly-L-Lysin usw.) enthalten. Die Gewebeschnitte müssen durch Erwärmen getrocknet
werden, normalerweise bei einer Temperatur von nicht mehr als 60°C über eine Mindestdauer
von 60 Minuten (z.B. über Nacht). Um gutes Haften der Schnitte an den Objektträgern zu
gewährleisten, ist es wichtig, vor der Trocknung im Mikrowellengerät das Wasser unter den
Gewebeschnitten ablaufen zu lassen.
Prozedur
Vor Ausführen der Protokolle auf den DakoCytomation TechMate™-Geräten ist das
Bedienerhandbuch für das spezifische TechMate™-Gerät sorgfältig durchzuarbeiten.
Vor dem Einschalten des TechMate™-Geräts müssen die Objektträger für den
Anfärbungsvorgang vorbereitet werden:
Routinemäßig fixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte:
Nach der Entparaffinierung und Rehydrierung in Puffer (Wasser) müssen die Gewebeschnitte
einer Epitopdemaskierung im Mikrowellengerät unterzogen werden (siehe Abschnitt A unten).
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Einige Epitope tolerieren die Behandlung im Mikrowellengerät nicht. Siehe Anleitungen für die
jeweiligen primären Antikörper von DakoCytomation.
Zusätzlich zur Erwärmung in einem Mikrowellengerät erfordern einige Epitope eine kurze
Enzymverdauung im TechMate™-Gerät. Siehe Tabelle 2 und die Anleitungen für ChemMate™
Proteinase K, Code-Nr. S 2019. Proben, die eine Enzymverdauung benötigen, müssen als
Gruppe zusammengefasst werden.
Wenn keine der Proben eine Enzymverdauung benötigt, wird Protokoll ENVP für alle
Objektträger angewendet (dieses Protokoll erfordert eine Durchführungszeit von ungefähr 2 ¼
Stunden).
Wenn einige Proben eine Enzymverdauung benötigt, wird Protokoll ENVPE für alle Objektträger
angewendet (dieses Protokoll erfordert eine Durchführungszeit von ungefähr 2 ¼ Stunden).
Bei den Proben, die keine Enzymverdauung benötigen, wird lediglich das proteolytische Enzym
in der Kavität durch Proteinase K Diluent, Code-Nr. S 2032, oder Waschpuffer 2 oder 3 aus dem
ChemMate™ Buffer Kit, Code-Nr. K 5006, ersetzt.
A. Epitopdemaskierung im Mikrowellengerät
Die im Folgenden gegebenen Anleitungen sollten sorgfältig befolgt werden, um eine
reproduzierbare Epitopdemaskierung zu gewährleisten. Zum Standardisieren des Verfahrens
wird empfohlen, den Objektträgerhalter auch dann vollständig mit Objektträgern zu beladen,
wenn nur ein Objektträger eine Gewebeprobe enthält. Dies sorgt für eine identische Erwärmung
der Gewebeschnitte bei jedem Durchgang.
Bei Beendigung des Schritts der Epitopdemaskierung müssen die Objektträger mindestens
20 Minuten bei Raumtemperatur im Puffer belassen werden. Während dieses Abkühlens kann
das TechMate™-Gerät für den Färbevorgang vorbereitet werden.
Verfahren im Mikrowellengerät
1. Die entparaffinierten Gewebeschnitte in einem ChemMate™ Slide Holder, Code-Nr. S 2029
platzieren. Den ChemMate™ Slide Holder in einen ChemMate™ Incubation Container, CodeNr. S 2030 transferieren, der mit 200 ml, im Verhältnis von 1:10 verdünnter ChemMate™
Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 2031, befüllt wurde.
2. Den Behälter mit dem Deckel angewinkelt (z.B. diagonal) in das Mikrowellengerät stellen.
Ein 800-Watt-Mikrowellengerät auf höchster Stufe verwenden.
Nachdem der Puffer zum Kochen gebracht wurde, weitere 5 Minuten lang im
Mikrowellengerät erhitzen.
50 mL entionisiertes Wasser hinzugeben, um verdampftes Wasser zu ersetzen.
Weitere 5 Minuten im Mikrowellengerät erhitzen.
Den Behälter aus dem Mikrowellengerät entfernen und bei Raumtemperatur mindesten 20
Minuten abkühlen lassen.
3. Puffer gegen entionisiertes Wasser austauschen und kurze Zeit stehen lassen.
Die Objektträger können jetzt in den TechMate™ Slide Holder eingesetzt werden.
HINWEIS: Aufkochen des Puffers ist normal und erwünscht. Nicht alle 800-WattMikrowellengeräte haben die gleiche Wärmeübertragungsleistung. Daher muss das
Mikrowellengerät zur Sicherstellung einer lokalen Standardisierung beim ersten Mal mit
Objektträgern ohne Gewebeproben getestet werden, um die für ein 5 Minuten dauerndes
tatsächliches Kochen erforderliche Gesamtverweilzeit im Mikrowellengerät festzustellen.
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B. Leitlinie für die optimale Verdünnung von primären Antikörpern und für die
Proteinase K-Vorbehandlung
Tabelle 2 enthält eine Leitlinie für das Verdünnen konzentrierter primärer Antikörper von
DakoCytomation, die zusammen mit dem ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit,
Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse verwendet und für formalinfixierte, paraffineingebettete
Gewebeschnitte genutzt werden.
Die primären Antikörper müssen mit ChemMate™ Antibody Diluent, Code-Nr. S 2022, verdünnt
werden.
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Tabelle 2. Leitlinie für die optimale Verdünnung von primären Antikörpern und die Proteinase KVorbehandlung
Proteinase KVorbehandlung
Optimale
Verdünnung
für TechMate™Geräte
Code-Nr.
Primärer Antikörper
A 0010
JA
1:50-1:100
A 0082
JA
1:250-1:500
A 0098
-
A 0191
JA
1:2000-1:4000
A 0193
JA
1:500-1:1000
A 0251
-
1:400-1:1200
Z 0311
Rabbit Anti- S100
JA
1:250-1:500
1:5-1:10
Z 0334
-
1:400-1:1200
A 0430
-
1:1000-1:2000
A 0452
A 0562
-
1:1000-1:4000
A 0576
-
1:100-1:200
M 0613
-
1:40-1:80
M 0630
JA
1:25-1:50
M 0631
-
1:20-1:40
M 0634
-
1:50-1:100
M 0635
-
1:20-1:40
M 0701
-
1:50-1:100
M 0725
-
1:10-1:20
M 0742
-
1:50-1:100
M 0751
JA
M 0755
-
1:50-1:200
M 0760
-
1:50-1:100
M 0785
JA
1:5-1:10
M 0821
JA
1:50-1:100
M 0851
-
1:50-1:100
M 0873
-
1:200-1:800
M 0876
-
1:50-1:100
M 0879
-
1:1000-1:2000
M 0887
-
1:2-1:6
M 7001
-
1:25-1:100
M 7047
-
1:5-1:10
M 7050
-
1:50-1:100
M 7072
-
1:10-1:20
JA
1:50-1:100
1:3-1:6
C. Färbungsprotokoll
Die Protokolle ENVP und ENVPE und die Templates (Schemata) für die Reagenzpositionen im
Gerät können vor und während des Testdurchgangs auf dem TechMate™-Bildschirm
eingesehen werden. Die Protokolle führen die Anzahl, den Namen und die Inkubationszeiten für
die individuellen Schritte auf. Die Schemata geben die Positionen der Reagenzien und
absorptionsfähigen Pads im TechMate™-Gerät an. Für Objektträgerpaare, die individuell mit
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Reagenzien behandelt werden sollten, z.B. primäre Antikörpern, wird empfohlen, anhand der
Platten mit 10 Kavitäten ein Antibody Positioning Sheet (Lageplan der Antikörperanordnung)
auszufüllen. Siehe Bedienerhandbuch.
1.
Reagenzien gemäß Schema und Antibody Positioning Sheet in die Mikrotiterplatten mit 10
Kavitäten des TechMate™ Geräts einbringen. Darauf achten, die richtigen Reagenzien und
Volumina einzufüllen. Besondere Sorgfalt ist beim Einfüllen der primären Antikörper
geboten.
2.
Vor dem Einsetzen der Objektträger in den Objektträgerhalter wird empfohlen, die
Objektträger mit Waschpuffer 2 aus dem ChemMate™ Buffer Kit, Code-Nr. K 5006,
vorzubefeuchten. Hierzu werden die in Paaren und nach dem Antibody Positioning Sheet
angeordneten Objektträger einige Minuten lang in einer Mikrotiterplatte mit 10 Kavitäten
belassen, die Waschpuffer 2 enthält. Dieses Vorbefeuchten gewährleistet einen
angemessenen Flüssigkeitsstrom im Kapillarspalt.
3.
Nach dem Vorbefeuchten die Objektträgerpaare gemäß dem Antibody Positioning Sheet in
den TechMate™ Slide Holder setzen. Darauf achten, dass die Objektträger korrekt
ausgerichtet sind.
4.
Unmittelbar vor dem Testdurchgang den TechMate™ Slide Holder auf „Pad2“ in das
TechMate™-Gerät setzen, um Waschpuffer 2 aus dem Kapillarspalt abzulassen. Das
Ablaufenlassen der Objektträger sorgfältig beobachten, um zu prüfen, dass alle Objektträger
richtig in Paaren angeordnet worden sind und die Ausrichtung der Objektträgerpaare korrekt
vorgenommen wurde.
5.
TechMate™ Slide Holder in den Waschpuffer (z.B. Waschpuffer 1 oder Waschpuffer 2)
setzen, der im ersten Schritt des anzuwendenden Protokolls benutzt wurde, um die
Kapillarspalten mit Waschpuffer zu füllen.
6.
TechMate™ Slide Holder in die Position „HOME“ stellen, bevor der Testdurchgang gestartet
wird.
Siehe Kapitel 5 des Bedienerhandbuchs.
HINWEIS: Die abschließenden Schritte der Protokolle bestehen aus Waschen in Water Wash
(aus dem ChemMate™ Buffer Kit, Code-Nr. K 5006) - in Template und Protokoll als „H2O“
bezeichnet. Falls bevorzugt wird, die Proben in einem wässrigen Eindeckmedium für das
Fixieren vorzubereiten, kann die „HOME“-Position nach Initiieren des Testdurchgangs mit
Wasser befüllt werden. Beim TechMate™ Horizon entspricht die „H2O“-Position der „HOME“Position.
Für die einzelnen Reagenzien sind die in die Mikrotiterplatten einzufüllenden Volumina wie unten
erläutert. Diese Volumina entsprechen den für diesen Kit verwendeten Protokollen.
Wash Buffer 1, 2 oder 3 (BUF1, 2, 3)
20 mL je Mikrotiterplatte mit 10 Kavitäten
Water Wash (H2O)
Peroxidase-Blocking Solution (HP-BK)
Substrate Working Solution (CHROM),
aus Komponenten dieses Kits angesetzt
750 µL je einzelner Kavität
Diluted Proteinase K (ENZ)
500 µλ je einzelner Kavität
Hematoxylin (HEMA)
750 µL je einzelner Kavität
Primärer Antikörper (AB1)
8 Tropfen (320 µL) je einzelner Kavität
EnVision™/HRP (ENV),
Flasche A in diesem Kit
8 Tropfen (320 µL) je einzelner Kavität
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ANLEITUNGEN FÜR DakoCytomation Autostainer-GERÄTE
Zusammenfassung und Erläuterung
ChemMate™ DAKO Envision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, wurde auf die
Verwendung mit den DakoCytomation Autostainer-Geräten gemäß der unten aufgezeigten
Template abgestimmt.
Vor dem Anfärben unter Verwendung der Autostainer-Geräte müssen einige routinemäßig
fixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte mithilfe der in Tabelle 3 angegebenen Target
Retrieval Solution oder der Anleitung für den primären Antikörper im Mikrowellengerät einer
Epitopdemaskierung unterzogen werden. Es sollte beachtet werden, dass einige primäre
Antikörper für eine optimale Anfärbung die zusätzliche Proteinase K-Vorbehandlung des
Gewebes benötigen.
Endogene Peroxidase muss mit Peroxidase-Blocking Solution, Code-Nr. S 2023, blockiert
werden.
Aufgrund eines effektiven Waschverfahrens und dem Vorhandensein von Trägerproteinen in den
DakoCytomation-Reagenzien sind zusätzliche Blockierungsschritte zur Reduzierung nicht
spezifischer Hintergrundfärbung nicht erforderlich.
Es wird DakoCytomation Wash Buffer, Concentrated x 10, for Immunocytochemistry, Code-Nr.
S 3006, empfohlen.
Primäre Antikörper gehören nicht zum Lieferumfang des Kits. Es wird die Verwendung
konzentrierter Antikörper von DakoCytomation empfohlen. Siehe Richtwerte für optimale
Verdünnungen in Tabelle 3.
Das zum Kit gehörende ChemMate™ DAKO EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV)Nachweisreagenz besteht aus einem Dextran-Rückgrat, an das eine große Zahl Peroxidase
(HRP)-Moleküle und sekundäre Antikörpermoleküle gekoppelt wurden. Der Kopplungsreaktion
liegt ein einzigartiger Chemismus zugrunde, der die Bindung von bis zu 100 HRP-Molekülen und
bis zu 20 Antikörpermolekülen pro Rückgrat ermöglicht. Der sekundäre Antikörper, der an das
Dextran-Rückgrat gekoppelt ist, wurde in Ziegen herangezogen. Er reagiert gleich gut mit
Kaninchen- und Mausimmunglobulinen, so dass nur ein Nachweisreagenz für primäre
Kaninchen- und Mausantikörper benötigt wird. Das ENV-Nachweisreagenz wird in einer
Tropfenzählerflasche geliefert und muss vor dem Gebrauch in ein Autostainer Reagent Vial,
Code-Nr. S 3425, gefüllt werden.
Das Substratsystem besteht aus zwei Komponenten, ChemMate™ DAB+ Chromogen, einer
konzentrierten Diaminobenzidin (DAB)-Lösung, und ChemMate™ Substrate Buffer mit
Wasserstoffperoxid. Vor dem Gebrauch muss das DAB+-Chromogen in dem Substratpuffer
verdünnt werden. Das Substratsystem erzeugt an der Stelle des Zielantigens eine braune
Färbung. Die angesetzte Chromogenlösung muss vor dem Gebrauch in ein Autostainer Reagent
Vial, Code-Nr. S 3425, gefüllt werden.
Zur Gegenfärbung wird DakoCytomation Hematoxylin, Code-Nr. S 3301, empfohlen, da es eine
eindeutige blaue Anfärbung des Zellkerns erbringt.
Die angefärbten Gewebeschnitte können entweder mit einem wässrigen oder einem auf
organischem Lösungsmittel basierendem Eindeckmedium auf Objektträgern vorgesehen
werden.
(104958-002)
K 5007/EFG/HGW/26.09.03 p. 42/47
Reagenzien
A. Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs)
DakoCytomation Autostainer-Gerät
DakoCytomation Wash Buffer, Concentrated x 10, for Immunocytochemistry,
Code-Nr. S 3006
ChemMate™ Peroxidase-Blocking Solution, Code-Nr. S 2023
ChemMate™ Proteinase K, Code-Nr. S 2019 (falls erforderlich)
ChemMate™ Proteinase K Diluent, Code-Nr. S 2032 (falls erforderlich)
Primäre Kaninchen- oder Mausantikörper von DakoCytomation oder aus anderer Bezugsquelle
Geeignetes Negativkontrollreagenz für den primären Antikörper
ChemMate™ Antibody Diluent, Code-Nr. S 2022 (zur Verdünnung konzentrierter Antikörper)
DakoCytomation Hematoxylin, zur Verwendung mit dem Autostainer-Gerät, Code-Nr. S 3301
DakoCytomation Target Retrieval Solution, Code-Nr. S 1699 oder S 1700, DakoCytomation
Target Retrieval Solution, pH, 9,9 Code-Nr. S3307 oder S3308, oder ChemMate™ Target
Retrieval Solution, Concentrated x 10, Code-Nr S 2031
ChemMate™ Incubation Container, Code-Nr. S 2030
ChemMate™ Slide Holder, Code-Nr. S 2029
DakoCytomation Autostainer Reagent Vials (100 Fläschchen), Code-Nr. S 3425
Objektträger
Allgemeine Laborreagenzien zum Entwachsen paraffineingebetteter Gewebeschnitte
Eindeckmedium (wässrig oder auf der Basis organischer Lösungsmittel) und Deckgläser
B. Reagenzienvorbereitung
Die DAB enthaltende Substrate Working Solution (CHROM) wird durch gründliches Mischen von
20 µl ChemMate™ DAB+ Chromogen (Flasche C) mit 1 ml ChemMate™ Substrate Buffer
(Flasche B) angesetzt. Nur das für die anzufärbende Anzahl Objektträger benötigte Volumen
ansetzen. CHROM innerhalb von 5 Tagen verwenden (im Dunklen bei 2-8 °C lagern).
Für das Ansetzen der nicht zum Lieferumfang des Kits gehörenden Reagenzien ist den
Anleitungen den jeweiligen Packungsbeilagen zu folgen.
Probengewinnung und -vorbereitung
Bei den Proben kann es sich um routinemäßig fixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte und
Gefrierschnitte handeln.
Es kann eine Vielfalt von Fixativen für die Probenkonservierung verwendet werden. Proben
dürfen nicht länger als 24 Stunden und vorzugsweise über einen kürzeren Zeitraum in neutralem
gepuffertem Formalin fixiert werden.
Die optimale Dicke für paraffineingebettete Gewebeschnitte beträgt circa 4 µm.
Die optimale Dicke für Gefrierschnitte beträgt circa 4-6 µm.
Die Proben müssen auf Objektträgern aufgebracht sein. Die Schnitte müssen so flach und
faltenfrei wie möglich auf den Objektträgern aufgebracht werden. Zu viele Falten beeinträchtigen
die Anfärbungsergebnisse.
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HINWEIS: Objektträger dürfen nicht breiter als 26 mm sein, damit sie in den Objektträgerhalter
passen.
Paraffinschnitte müssen aus einem vorgewärmten Wasserbad heraus fixiert werden, das
destilliertes oder entionisiertes Wasser enthält. Das Wasserbad darf keine Zusätze (wie
Gelatine, Poly-L-Lysin usw.) enthalten. Die Gewebeschnitte müssen durch Erwärmen getrocknet
werden, normalerweise bei einer Temperatur von nicht mehr als 60 °C über eine Mindestdauer
von 60 Minuten (z.B. über Nacht). Um gutes Haften der Schnitte an den Objektträgern zu
gewährleisten, ist es wichtig, vor der Trocknung im Mikrowellengerät das Wasser unter den
Gewebeschnitten ablaufen zu lassen.
Prozedur
Bevor Färbeverfahren nach der Template der DakoCytomation Autostainer-Geräte durchgeführt
werden, ist das Bedienerhandbuch für das jeweilige Autostainer-Gerät sorgfältig
durchzuarbeiten.
Vor dem Einschalten des Autostainer-Geräts müssen Objektträger und Reagenzien gemäß des
Slide Layout Map (Lageplan der Objektträgeranordnung) und des Reagent Layout Map
(Lageplan der Reagenzienanordnung) angeordnet werden.
Routinemäßig fixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte
Nach der Entparaffinierung und Hydratrion in Puffer (Wasser) müssen die Gewebeschnitte einer
Epitopdemaskierung im Mikrowellengerät unterzogen werden (siehe Abschnitt A unten). Einige
Epitope tolerieren die Behandlung im Mikrowellengerät nicht. Siehe Anleitungen für die jeweiligen
primären Antikörper von DakoCytomation.
Zusätzlich zur Erwärmung in einem Mikrowellengerät erfordern einige Epitope eine kurze
Enzymverdauung im Autostainer-Gerät. Siehe Tabelle 3 und die Anleitungen für ChemMate™
Proteinase K, Code-Nr. S 2019.
A. Epitopdemaskierung im Mikrowellengerät
Siehe ANLEITUNGEN FÜR DakoCytomation TechMate™-GERÄTE.
B. Leitlinie für die optimale Verdünnung von primären Antikörpern und die
Proteinase K-Vorbehandlung
Tabelle 3 enthält eine Leitlinie für das Verdünnen konzentrierter primärer Antikörper von
DakoCytomation, die zusammen mit dem ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit,
Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse verwendet und für formalinfixierte, paraffineingebettete
Gewebeschnitte genutzt und mit den Autostainer-Geräten verarbeitet werden.
Die primären Antikörper müssen in ChemMate™ Antibody Diluent, Code-Nr. S 2022, verdünnt
werden.
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Tabelle 3. Leitlinie für dieoptimale Verdünnung von primären Antikörpern und die Proteinase KVorbehandlung
Target
Retrieval
Buffer
Proteinase KVorbehandlung
Optimale
Verdünnung für
Autostainer-Geräte
Code-Nr.
Primärer Antikörper
A 0010
S 2031
Ja
1:100 – 1:150
A 0082
S 2031
Ja
1:250 – 1:500
A 0098
S 1700
-
A 0191
S 2031, siehe
Methode in
Broschüre zu
Kappa/Lambda
bei TechMate™Geräten
Ja
1:400 – 1:1000
A 0193
S 2031, siehe
Methode in
Broschüre zu
Kappa/Lambda
bei TechMate™Geräten
Ja
1:400 – 1:1000
A 0251
S 2031
Ja
1:2500 – 1:3000
A 0430
S 2031
-
1:1000 – 1:2000
A 0452
S 2031
Ja
A 0562
S 2031
-
1:25 – 1:50
1:50 – 1:100
1:1000 – 1:4000
A 0576
S 2031
-
1:5000 – 1:6000
M 0613
S 2031
-
1:100 – 1:500
M 0630
Clone 34βE12
S 2031
Ja
1:50 – 1:100
M 0631
Clone 35βE11
S 2031
Ja
1:50 – 1:100
M 0634
S 2031
-
1:50 – 1:100
M 0635
S 2031
-
1:40 – 1:50
M 0701
S 2031
-
1:100 – 1:200
M 0725
S 2031
-
1:100 – 1:200
M 0742
S 2031
-
M 0751
S 1700
Ja
M 0755
S 2031
-
M 0760
S 2031
-
M 0785
S 2031
Ja
M 0821
S 2031
Ja
1:50 – 1:100
M 0851
S 2031
-
1:50 – 1:100
M 0873
BBS/NC/VI-H14
S 2031
-
1:800 – 1:1000
M 0876
S 2031
-
1:50 – 1:100
M 0887
S 2031
-
M 7001
S 2031
-
M 7047
1:100 – 1:300
1:5 – 1:10
1:750 – 1:1000
1:75 – 1:150
1:25 –1:50
1:25 – 1:60
S 1700
-
1:50 – 1:100
M 7050
S 2031
-
1:50 – 1:150
M 7072
S 2031
-
1:10 – 1:50
M 7240
S 1700
-
1:200 – 1:400
Z 0311
Rabbit Anti-S100
S 2031
Ja
1:250 – 1:500
Z 0334
S 2031
-
1:400 – 1:1200
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C. Programmieren des DakoCytomation Autostainer
Vor der ersten Anwendung des ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit, Peroxidase/DAB,
Rabbit/Mouse,Code-Nr. K 5007, auf dem Autostainer muss eine neue „Template“ erstellt werden.
Für das spezifisch genutzte Autostainer-Gerät ist auf die unten angeführte Template und auf das
Bedienerhandbuch Bezug zu nehmen.
Template: CMK5007
Nachdem die Objektträger gemäß des Bildschirms PROGRAM STAINING RUN SCREEN
eingesetzt werden, müssen die folgenden Reagenzien in die Reagenzienliste aufgenommen
werden. Siehe Tabelle 4 unten bezüglich der Bezeichnung, des Template-Schritts und der
Inkubationszeit und Bedienerhandbuch für das jeweilige Autostainer-Gerät.
Tabelle 4. Notwendige Ergänzungen der Reagenzienliste
Reagenz
Code-Nr.
Template-Schritt
Inkubationszeit
S 2023
End. Enz. Block
5 Minuten
S 2019 +S 2032
Pretreatment
under Antibody
10 Minuten
Primäre Antikörper, die nicht bereits in der AutostainerListe enthalten sind
Individual
Antibody
25 Minuten
K 5007
Labelled polymer
30 Minuten
K 5007
Substrate
3 Minuten
Hämatoxylin zur Verwendung mit den AutostainerGeräten
S 3301
Auxiliary
1 Minute
Puffer für Blauanfärbung (=Autostainer Puffer)
S 3006
Auxiliary
5 Minuten
D. Färbungsprotokoll
Die Template (CMK5007) für den ChemMate™ DAKO EnVision™ Detection Kit,
Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, über den Bildschirm „PROGRAM STAINING RUN“ eingeben.
Die Anzahl Objektträger im Testdurchgang angeben und die Reagenzien mit Inkubationszeiten in
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die Template eingeben. Die Anordnung der Objektträger wird dann auf dem Bildschirm „Slides
Layout Map“ angezeigt und die Positionen und das Volumen der in das Autostainer-Gerät
einzusetzenden Reagenzien wird auf dem Bildschirm „Reagent Layout Map“ dargestellt. Siehe
auch Bedienerhandbuch.
Vor dem Einsetzen der Objektträger gemäß der Slides Layout Map wird empfohlen, die
Objektträger 5 Minuten lang in DakoCytomation Wash Buffer, Code-Nr. S 3006, zu benetzen.
Die Reagenzien in die Autostainer Reagent Vials, Code-Nr. S 3425, einfüllen und die Fläschchen
gemäß der Reagent Layout Map im Reagenziengestell anordnen. Darauf achten, die richtigen
Reagenzien und Volumina einzufüllen. Besondere Sorgfalt ist beim Befüllen der Fläschchen mit
primärem Antikörper geboten. Wasser- und Pufferpumpen anlaufen lassen. Programm starten.
Explanation of symbols/ Explication des symboles/ Erläuterung der Symbole
Catalogue number
Référence du catalogue
Bestellnummer
Temperature limitation
Limites de température
Use by
Utiliser jusque
Zulässiger Temperaturbereich
Verwendbar bis
In vitro diagnostic medical
device
Dispositif médical de diagnostic
in vitro
In-Vitro-Diagnostikum
Contains sufficient for <n> tests
Consult instructions for use
Consulter les instructions
d’utilisation
Gebrauchsanweisung beachten
Contenu suffisant pour <n> tests
Manufacturer
Fabricant
Inhalt ausreichend für <n>
Ansätze
Hersteller
Batch code
Code du Lot
Harmful
Chargenbezeichnung
Gesundheitsschädlich
Nocif
The DAKO EnVision™ Systems are covered by U.S. Patent 5,543,332 and European Patent 594,772.
Les systèmes DAKO EnVision™ sont couverts par les brevets U.S. 5.543.332 et européens 594.772.
Die DAKO EnVision™-Systeme sind durch das US-amerikanische Patent 5,543,332 und das Europäische Patent 594,772 geschützt.
Produced by/ Produit par/ Hergestellt von:
DakoCytomation Denmark A/S
Produktionsvej 42
DK-2600 Glostrup
Denmark/ Danemark/ Dänemark
Tel. +45 44 85 95 00
Fax +45 44 85 95 95
www.dakocytomation.com
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DAKO ChemMateä Detection Kit Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse

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