Indications du test Contexte épidémiologique et

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ECHINOCOCCUS
WESTERN BLOT
Technique d'immunoblot pour
usage diagnostique in vitro
IgG
#ECH-WB24G: 24 tests
#ECH-WB12G: 12 tests
#ECH-WB96G: 96 tests
NOTICE D'UTILISATION
AUTORISE
Indications du test
ECHINOCOCCUS Western Blot IgG est un test qualitatif de diagnostic
sérologique par immunoblot de l'échinococcose alvéolaire et de
l'hydatidose.
Il est proposé :
• comme test de confirmation d’un résultat positif ou douteux obtenu par
des tests quantitatifs classiques de dépistage (HAI, ELISA).
• comme test sérologique de différenciation de l'échinococcose
alvéolaire et de l'hydatidose.
Contexte épidémiologique et clinique
Les échinococcoses sont des zoonoses dues aux larves de cestodes, vers
plats parasites de l’intestin de carnivores sauvages ou domestiques,
appartenant au genre Echinococcus. Quatre espèces de ce genre sont
responsables de maladies humaines chroniques et redoutables. E.granulosus,
présent sur tous les continents, est responsable de l’hydatidose, fréquente dans
les zones où une surveillance vétérinaire fait défaut. Il provoque de lourdes
pertes économiques car l’endémie touche aussi les herbivores domestiques [4,
10, 16]. E.multilocularis, qui circule dans l’hémisphère nord, est l’agent de
l’échinococcose alvéolaire. E.vogeli et E.oligarthus sont eux responsables
d’échinococcoses polykystiques en Amérique latine où elles font figure de
parasitoses émergeantes [5]. En outre, des co-infections à E.granulosus et
E.multilocularis sont décrites en Europe centrale, en Russie, et en Chine [4,
11].
L’homme, comme les autres omnivores ou herbivores hôtes intermédiaires,
s’infecte en ingérant les œufs éliminés par les carnivores dans le milieu
extérieur ou sur leur pelage. L’œuf libère une larve qui migre vers le foie ou un
autre organe. Parfois, les échinococcoses ont une évolution spontanément
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abortive, laissant persister une positivité sérologique des années durant [2, 8].
L’infection a toutefois souvent un pronostic très sombre. Chez l’homme,
Echinococcus sp. se multiplie et subit des réorganisations pour donner des larves
de structure complexe, dont les modalités du développement (endogène/exogène)
et l’organisation intra viscérale sont différentes d’une espèce à l’autre [16].
L’embryon d’E.granulosus se localise au foie dans 65% des cas ou
continue sa migration vers le poumon et d’autres organes (hydatidoses
cardiaques, osseuses, spléniques, ou du système nerveux central). Ses cellules
bourgeonnent en vésicules filles et protoscolex à l'intérieur de la vésicule initiale
qui s’emplit aussi d’un liquide limpide. Au moins dans ses localisations
hépatiques, la larve est cernée par un infiltrat de cellules puis par une capsule
fibreuse continue (tableau de kyste). Les troubles cliniques sont polymorphes et
dépendent de la localisation, de la taille et du nombre des kystes. Ils sont liés à
l’envahissement progressif de certains organes (os), ou à des compressions. Leur
rupture, accidentelle, peut donner lieu à des manifestations d’hypersensibilité
immédiate, déclenchées par le liquide intra kystique, et à la formation de kystes
secondaires, à partir de protoscolex extériorisés [10, 17].
E.multilocularis, le plus pathogène des échinocoques, a un tropisme
marqué pour le foie. Ses cellules prolifèrent de façon exogène. La larve infiltre
progressivement l’organe et engendre une intense réaction granulomateuse puis
une fibrose diffuse et non focalisée. De ce fait, les cellules parasitaires peuvent
aussi essaimer à distance [10, 16]. Cliniquement, l’échinococcose alvéolaire
simule un hépatocarcinome.
E.vogeli et E.oligarthus prolifèrent de façon endogène, et à un moindre
degré de façon exogène [16]. Ils forment des poches liquidiennes qui restent
généralement reliées au kyste primitif donnant un aspect macroscopique en
grappe de raisin [5]. La localisation hépatique primitive est plus fréquente que
les atteintes isolées pulmonaire, mésentérique, cardiaque, oculaire ou que les
atteintes multiviscérales. Le pronostic des échinococcoses polykystiques est
proche de celui de l’échinococcose alvéolaire [5, 6].
L’examen parasitologique direct, invasif, n’est pas toujours possible. La
ponction d’un kyste hydatique est totalement contre indiquée à cause du risque
d’accident anaphylactique [10, 17]. Le diagnostic, orienté par des anomalies
biologiques non spécifiques (échinococcose alvéolaire, en particulier) et surtout
morphologiques (échographie, scanner), repose sur la sérologie. Le
sérodiagnostic est nécessaire pour une prise en charge médicale précoce des
patients [2, 7]. Dans ces circonstances, certains peuvent en effet bénéficier
d’actes chirurgicaux curateurs [2], en association ou non avec une
chimiothérapie antiparasitaire qui est d’autant plus efficace que la masse
parasitaire est moins importante [15, 17, 18].
Parmi les techniques sérologiques classiques, la plus couramment utilisée
est l’HAI et la plus sensible est l’ELISA [17]. Les fréquentes réactions croisées
3
(avec d’autres helminthiases et au cours de diverses pathologies, hépatiques, en
particulier) observées lorsque des extraits parasitaires somatiques non purifiés
sont utilisés [2, 7] ont conduit à l’utilisation de tests ELISA faisant appel à des
antigènes purifiés (peptides de synthèse, polysaccharide spécifique
d’E.multilocularis, antigènes recombinants). Ces derniers manquent parfois de
sensibilité [2, 3, 7, 14].
La spécificité et la sensibilité de l'immunoblot ont conduit à proposer cette
technique en confirmation des tests de dépistage et comme test de différenciation
des deux principales échinococcoses humaines : hydatidose et échinococcose
alvéolaire [1, 9, 11, 12, 13].
Principe du test :
Origine et description des bandelettes :
Les antigènes (larves de E.multilocularis entretenues sur Meriones unguiculatus)
après séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide, ont été fixés par
électro-transfert sur la surface de bandelettes de nitrocellulose (technique de
Western Blot).
Les bandelettes sont fournies prêtes à l'emploi, numérotées et prédécoupées.
Déroulement du test :
Chaque sérum à tester est incubé séparément avec une bandelette. Les anticorps
anti-Echinococcus éventuellement présents dans les prélèvements se fixent
sélectivement sur les antigènes de Echinococcus présents sur les bandelettes. Le
lavage élimine les anticorps non fixés. Chaque bandelette est ensuite incubée
avec le conjugué Phosphatase Alcaline-anti-IgG humaines qui se lie aux
anticorps anti-Echinococcus éventuellement fixés. Le lavage élimine le conjugué
non fixé. Lors de la dernière étape, les immuncomplexes réagissent avec le
substrat : les antigènes reconnus par les anticorps anti-Echinococcus de classe
IgG éventuellement présents dans les échantillons sont révélés sous forme de
bandes transversales violettes. La réaction de coloration est arrêtée par un lavage
à l'eau distillée. Les bandelettes sont séchées ; leur coloration est stable plusieurs
années à l'abri de la lumière.
Lecture :
La présence des bandes 7 et/ou 26-28kDa est spécifique du genre Echinococcus.
Elle permet d'interpréter le test comme positif et de conclure à la présence
d'anticorps IgG anti-Echinococcus dans l'échantillon testé.
La recherche de bandes spécifiques dans la zone intermédiaire (7 à 28 kDa)
permet de différencier avec certitude une échinococcose alvéolaire d'une
hydatidose dans plus de deux tiers des cas.
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Réactifs fournis dans la trousse
Nota : Les volumes et quantités indiqués (en italique) correspondent au
conditionnement de 12 tests #ECH-WB12G. Ceux indiqués en caractères gras
correspondent au conditionnement 96 tests #ECH-WB96G.
R1 : Une (1) pochette de 24 (12, 4x24) BANDELETTES SENSIBILISEES
Bandelettes de nitrocellulose, numérotées et prédécoupées mais attachées
par leur extrémité supérieure à la souche. Les bandelettes ont été
sensibilisées par électro-transfert d’antigènes larvaire de Echinococcus
multilocularis séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
R2 : Un (1) flacon contenant 30 (16, 120) ml de DILUANT ECHANTILLONS
(Prêt à l'emploi - solution rose)
Solution tampon + surfactant + NaN3 (inf. 0.1%).
R3 : Un (1) flacon contenant 60 (30, 240) ml de TAMPON DE LAVAGE
CONCENTRE 10X
(A diluer 10 fois dans de l'eau distillée - solution incolore)
Solution tampon + surfactant + NaN3 (inf. 0.1%).
R4 : Un (1) flacon contenant 30 (16, 120) ml de CONJUGUE ANTI-IgG
(Prêt à l'emploi - solution bleue)
Solution tampon + sérum polyclonal de chèvre anti-IgG humaines
conjugué à la phosphatase alcaline + NaN3 (inf. 0.1%) + stabilisants.
R5
Un (1) tube contenant 200 (200, 400) µl de SERUM DE CONTROLE
POSITIF
(Prêt à l'emploi - pastille rouge sur le bouchon)
Solution tampon + pool de sérums humains positif en sérologie E.
multilocularis + NaN3 (inf. 0.1%) + stabilisants.
R6 : Un (1) flacon contenant 30 (16, 120) ml de SUBSTRAT
(Prêt à l'emploi - flacon opaque marron)
Solution tampon + NBT + BCIP + stabilisants.
•
•
Standards colorés (protéines recombinantes) situés dans la pochette (R1) à
droite des bandelettes permettant d'estimer de haut en bas la distance de
migration et correspondant aux Poids Moléculaires suivants (kDa) : Bleu :
250, Bleu : 150, Bleu : 100, Rose : 75, Bleu : 50, Vert : 37, Rose : 25,
bleu : 20 , bleu : 15, jaune (peu visible) : 10.
Le coffret contient également, à titre d’exemple, la reproduction scanner
d'immunoblots provenant de sérums positifs (voir pages 18 et 19 de la
présente notice).
5
Matériel nécessaire mais non fourni
- Gants en latex. Pincette pour manipuler les bandelettes
- Cuves d'incubation multicanaux en polypropylène adaptées aux miniblots (Réf.
LDBIO # WBPP- 08 ou équivalent)
- Agitateur oscillant pour immunoblots
- Système d'aspiration pour les liquides permettant de vider les cuves
d'incubation
- Cutter ou scalpel
- Règle plate transparente
- Papier absorbant de type Whatman
- Papier aluminium
- Eau distillée ou désionisée de bonne qualité
- Pipettes automatiques, micropipettes et pointes à usage unique (volumes de
25µl, 1.2ml et 2ml)
- Éprouvettes graduées, récipients adaptés, pissette de laboratoire.
- Chronomètre
- Ruban adhésif transparent de bonne qualité
- Tubes et matériel pour le prélèvement des échantillons.
Conditions de conservation
Tous les réactifs du coffret doivent être conservés entre 2 et 8°C. Ils sont
valables jusqu'à la date de péremption indiquée sur le couvercle de la boîte et les
étiquettes des flacons.
Une fois dilué, le tampon de lavage est stable 2 mois, conservé entre 2 et 8°C.
Précautions spéciales d'emploi
Sécurité
- pour usage in vitro exclusivement.
- Le contrôle positif est un sérum d'origine humaine. Il a subi un dépistage
négatif, concernant les anticorps anti-VIH 1 et 2, les anticorps anti-VHC et l'Ag
HBs, mais doit cependant être manipulé comme un produit potentiellement
infectieux.
- Manipuler selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire et considérer tout réactif
et tout échantillon comme potentiellement toxique et/ou infectieux.
- Le substrat contient un mélange NBT et BCIP toxiques par contact (peau et
muqueuses) et inhalation.
- Les réactifs contiennent de l'azide de sodium susceptible de former des sels
métalliques explosifs avec le plomb ou le cuivre. Rincer à l'eau tout rejet à
l'évier.
- Porter des vêtements protecteurs (blouse, gants, lunettes).
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- Ne pas boire, manger ou fumer dans le laboratoire.
- Ne pas pipeter avec la bouche. Refermer les flacons après usage.
- Éliminer les déchets (prélèvements, pointes, tubes, liquides de lavage, réactifs
usagés...) conformément aux bonnes pratiques en usage dans la profession et aux
règlements en vigueur dans le Pays.
Précautions
- Ne pas toucher les bandelettes avec les doigts, porter des gants et utiliser une
pincette.
- Ne pas utiliser de réactif après la date de péremption.
- Conserver les réactifs dans le coffret fourni.
- Ne pas utiliser ensemble des réactifs de lots différents.
- Les réactifs doivent être bien mélangés avant usage.
- Ne pas utiliser de réactif provenant d’un flacon présentant des signes de fuite.
- Ne pas laisser inutilement les réactifs hors du réfrigérateur.
- Bien mélanger le tampon de lavage concentré avant dilution.
- La qualité de l'eau est importante pour obtenir un bon tampon de lavage.
- Ne pas utiliser de solution trouble ou précipitée.
- N'utiliser que des cônes de pipette à usage unique.
- Éviter toute contamination inter-puits.
- Attention à la formation d'aérosols.
- Établir un plan de distribution précis avant de commencer la manipulation.
- L’omission de distribution d’un échantillon ou la distribution d’un volume
inapproprié peut faire considérer comme négatif le résultat du test quelque soit
son statut réel.
Prélèvement des échantillons
Prélever de manière aseptique les échantillons de sang sur tube sec (25µl de
sérum sont nécessaires pour l'analyse).
Laisser coaguler le sang, centrifuger et décanter le sérum. Le conserver à 2-8°C.
Le congeler à -20 ± 5°C s'il ne doit pas être utilisé dans les 72h.
Éviter de congeler et décongeler les sérums plusieurs fois.
Préparation des réactifs
Tampon de lavage : Pour 4 tests diluer dans un flacon propre 10ml de tampon
de lavage concentré 10x (R3) dans 90ml d'eau distillée ou désionisée (le tampon
dilué se conserve 2 mois à 2-8°C).
7
Mode opératoire
1/
Préparer un plan de distribution des échantillons. Il est vivement conseillé
d'y inclure le contrôle positif (R5). L'utilisation de ce contrôle permet de valider
techniquement la manipulation et de fournir un modèle précis pour
l'identification finale des bandes antigéniques révélées.
2/
Distribuer 1.2ml de tampon échantillon (R2) dans chacun des puits selon
le plan établi.
3/
Mettre des gants. Ne pas toucher les bandelettes. Utiliser une pincette pour
les manipuler. A l'aide d'un cutter (ou scalpel) et d'une règle plate transparente
propre et sèche, découper le nombre de bandelettes (R1) nécessaire en prenant
garde de conserver le trait de positionnement sur la bandelette. Pour cela,
maintenir fermement les bandelettes plaquées par la règle et les découper du coté
de la souche (Les numéros étant visibles au travers de la règle par transparence).
4/
Distribuer les bandelettes numérotées à l'aide des pincettes selon le plan de
distribution établi. Laisser les bandelettes se réhydrater dans le tampon pendant
environ 5 minutes, face vers le haut (N° visible) et totalement recouvertes par le
tampon.
5/
Distribuer échantillons et contrôle positif, selon le plan de distribution, à
raison de 25µl par puits. Agiter doucement la cuve après chaque dépôt pour bien
mélanger l’échantillon.
Incuber sur un agitateur oscillant pendant 90mn ± 5mn à 18-25°C.
6/
Lavage : Aspirer le contenu des puits à l'aide d'une pompe aspirante et
répartir environ 2 à 3ml de tampon de lavage dilué dans chacun d'eux en évitant
de retourner les bandelettes. Agiter doucement la cuve horizontalement puis
réaspirer le contenu des puits.
Répartir à nouveau environ 2 à 3ml de tampon de lavage dilué en évitant
de retourner les bandelettes. Incuber 3 à 5mn sur l'agitateur. Aspirer le liquide.
Répéter cette dernière opération 2 fois.
7/
Distribuer 1.2ml de conjugué anti-IgG (R4) dans chacun des puits.
Les bandelettes doivent être totalement recouvertes et face vers le haut (numéros
visibles). Incuber sur un agitateur oscillant pendant 60mn ± 5mn à 18-25°C
8/
Lavage : procéder comme pour l'étape 6.
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9/
Distribuer 1.2ml de substrat NBT/BCIP (R6) dans chacun des puits. Les
bandelettes doivent être face vers le haut (N° visible) et totalement recouvertes
par le tampon.
Incuber sur un agitateur oscillant, à 18-25°C et à l'abri de la lumière
directe (recouvrir les cuves d'un papier aluminium).
Observer le développement de la coloration toutes les 5 minutes. Il dure
généralement entre 20 et 60 minutes mais il n'y a pas de règle absolue.
L'arrêt est décidé lorsque les bandes éventuellement présentes sont bien
contrastées par rapport à la couleur que prend la bandelette (gris - rosé).
L'arrêt se fait par l'aspiration du substrat avec la pompe et la distribution de 2ml
d'eau distillée dans le puits. Répéter une fois ce dernier lavage.
Remarque : Des sérologies très faibles peuvent demander jusqu'à 90mn pour se
positiver du fait des très faibles concentrations d'anticorps retrouvées dans les
prélèvements. La révélation peut être poursuivie tant que la couleur du fond de la
bandelette ne s'assombrit pas au point de rendre la lecture difficile (La qualité
des lavages a une influence fondamentale sur cette coloration et sur le contraste
des bandes).
10/ Saisir les bandelettes par leur extrémité numérotée à l'aide de la pincette
(cette manipulation est plus aisée si les puits sont pleins d'eau) et les déposer,
numéro visible, sur un papier absorbant de type Whatman. Les laisser sécher à
l'air. La couleur des bandelettes s'éclaircit naturellement en séchant (la lecture ne
doit s'effectuer qu'après séchage complet).
11/ Transférer les bandelettes sur la feuille de papier qui servira à les archiver.
Les maintenir avec la règle plate et les coller par le haut à l'aide du ruban adhésif
transparent. Éviter de les manipuler avec les doigts.
Interprétation
◊
Étalonnage des poids moléculaires
•
La juxtaposition de la bandelette d'un échantillon et du standard de
poids moléculaire (PM) coloré fourni dans la trousse (pochette R1) permet
d'estimer le PM des bandes antigéniques révélées (il faut auparavant le découper
à l'aide d'une règle et d'un scalpel comme une bandelette ordinaire et le
manipuler avec une pincette).
•
Le contrôle positif R5 (sérum positif E.multilocularis) présente la
plupart des bandes décrites dans la notice. Utilisé dans la même série que les
échantillons il fournit une bandelette témoin qui indique très précisément, en
ajustant les traits de positionnement, la position des bandes spécifiques à chacune
des échinococcoses.
9
•
La reproduction d'immunoblots de sérums positifs vis à vis de E.
multilocularis et de E.granulosus, est incluse dans la présente notice à titre
d'exemple (voir pages 18 et 19).
◊
Description des bandes présentes (voir p 18 et 19)
• La zone de lecture se situe sur la moitié inférieure de la bandelette, entre 7 et
26-28 kDa. La bande 26-28 kDa est appelée ainsi car elle peut se présenter
sous différents aspects : simple bande fine (à 26 ou 28 kDa), double bande (26
et 28 kDa) ou large bande couvrant toute la zone de 26 à 28 kDa.
• Les bandes extrêmes 7 et 26-28 kDa sont utilisées au diagnostic du genre
Echinococcus (voir ci-dessous : § Interprétation I).
• Les bandes intermédiaires, situées entre 7 et 26-28 kDa sont utilisées, quand
elles sont présentes, au diagnostic d’espèce, granulosus ou multilocularis
(voir ci dessous : § Interprétation II)
Interprétation I :
diagnostic du genre Echinococcus :
Rechercher la présence des bandes 7 et/ou 26-28 kDa pour chacun des
échantillons testés à l'aide des outils d'étalonnage décrits ci-dessus (ces bandes
sont caractéristiques et généralement très facilement repérables).
La présence des bandes extrèmes 7 et/ou 26-28 kDa permet d'interpréter le test comme positif et de conclure à la présence d'anticorps IgG
anti-Echinococcus dans l'échantillon testé.
Interprétation II :
diagnostic différentiel d'espèce
E.granulosus versus E.multilocularis :
Il est fait par la recherche des bandes spécifiques de l'une ou l'autre espèce dans
la zone intermédiaire entre 7 et 26 kDa (voir les exemples pages 18 et 19).
•
Bandes communes aux deux espèces : 12, 15, 20, 24, kDa
•
Bandes fines uniquement retrouvées avec E.multilocularis : 16, 17, 18, kDa
•
Bande retrouvée uniquement avec E.granulosus : une bande large diffuse à
17 kDa.
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5 Profils différents peuvent être retrouvés. (voir p 18 et 19)
Les profils P1, P2 et P3 (retrouvés dans 70% des cas) permettent le
diagnostic d’espèce :
•
PROFIL P1 :
Uniquement bande 7 kDa isolée.
•
PROFIL P2 :
= E.granulosus
= E.granulosus
Bande 7 kDa + bande large diffuse 17 kDa.
(NB : la bande 26-28 kDa est très souvent également présente.)
•
PROFIL P3 :
= E.multilocularis
Bande 26-28 + les bandes fines 16 et/ou 18 kDa.
(NB : la plupart des autres bandes 7, 12, 15, 17, 20, 24 kDa sont
très souvent également présentes.)
Les 2 derniers profils P4 et P5 (retrouvés dans 30% des cas) ne
permettent pas de différencier les 2 espèces E.granulosus et
E.multilocularis.
•
PROFIL P4 :
uniquement bande 26-28 kDa isolée.
ABSENCE de bande intermédiaire
•
PROFIL P5 :
association bandes 7 + 26-28 kDa
ABSENCE de bande intermédiaire
=
E.multilocularis
ou
E.granulosus
Remarque 1 : La présence isolée de l'une ou plusieurs des bandes
intermédiaires (12, 15, 16, 17, 18, 20, 24 kDa) ne peut pas être considérée
comme spécifique. Ces bandes ne sont jamais retrouvées isolées dans le cas
d'une échinococcose mais toujours associées à la bande 7kDa et/ou 26-28 kDa.
Remarque 2 : Des bandes au dessus et plus rarement en dessous de la
zone 7-28 kDa sont très souvent présentes. Elles ne doivent pas être utilisées
dans l'interprétation du test.
11
Remarque 3 : exceptionnellement la bande 16kDa est apparue plus large
que d’habitude chez un patient infecté par E.multilocularis. Prendre garde de ne
pas confondre cette bande avec la bande large 17kDa spécifique de
E.granulosus.
Limites du test
• Les résultats sérologiques doivent être interprétés en fonction des
renseignements épidémiologiques et cliniques ainsi que des résultats
d’imagerie médicale (échographie, scanner) afin d'établir le diagnostic
d'échinococcose alvéolaire ou d'hydatidose.
• Un résultat sérologique négatif n'écarte pas le diagnostic d'une
échinococcose.
• Le test ne permet pas de différencier une co-infection par
E.multilocularis et E.granulosus.
Problèmes rencontrés
"Les bandes sont pâles et peu contrastées" :
Certains sérums très peu chargés en anticorps peuvent donner de tels résultats.
"Des zones d'ombre se voient, plus ou moins colorées, légèrement diffuses" :
La bandelette n'était pas totalement immergée dans l'un des réactifs et n'a pas
incubé correctement sur toute sa longueur. Des taches peuvent être également
présentes à l’endroit du dépôt de l’échantillon si la cuve n’a pas été agitée après
la distribution.
"Le bruit de fond est important, rendant la lecture très difficile" :
Les lavages ont été insuffisants ou la dernière incubation a été trop longue.
S'assurer du bon déroulement technique du test, du respect des temps de lavage,
de la qualité de l'eau. Diminuer le temps de la dernière incubation.
Exceptionnellement, certains sérums peuvent réagir ainsi de façon non
spécifique. Le résultat de l'immunoblot ne peut alors être rendu. Ce bruit de fond
non spécifique peut également ne concerner qu'une partie de la bandelette,
rendant les résultats ininterprétables sur cette partie seulement.
"Un précipité apparaît dans la solution lors de la dernière étape de révélation"
Le substrat peut effectivement partiellement précipiter (flocons noirs) dans le
tampon en fin de révélation. Ce phénomène n'altère pas la qualité de la révélation
qui doit être poursuivie normalement. Le lavage final à l'eau distillée élimine les
particules solides éventuellement présentes.
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Contrôle de qualité
Le sérum de contrôle fourni avec le coffret doit systématiquement être inclus
dans toute série d'immunoblots. Présentant un profil de type P3, il permet :
•
de valider techniquement le bon déroulement du test (les bandes doivent
apparaître très nettement sur la bandelette),
•
d'étalonner précisément la position exacte des bandes 7-28kDa spécifiques
pour aider à l'interprétation des résultats.
Performances
•
Sensibilité :
Une étude multicentrique [9] réalisée dans deux laboratoires spécialisés
indépendants et portant sur 112 sérums de patients (51 hydatidoses et 61
échinococcoses alvéolaires identifiées avec certitude) a donné les résultats
suivants :
ECHINOCOCCUS WB IgG : profils obtenus
Neg.
P1
P2
P3
P4
P5
Hydatidose (n=50)
1
12
22
0
1
14
Echinococcose
alvéolaire (n=61)
2
0
0
41
7
11
Total (n=111)
3
12
22
41
8
25
Fig. 1 - Sensibilité du test et profils obtenus
Remarque : 1 sérum d'hydatidose est non interprétable (coloration aspécifique de toute la bandelette)
- Sensibilité du test
•
= 97.3% vis à vis du genre Echinococcus
= 98 % vis à vis de l'espèce E.granulosus
= 96.7 % vis à vis de l'espèce E.multilocularis
Diagnostic d’espèce : E.granulosus versus E.multilocularis
Le tableau ci-dessus (fig.1) permet de calculer un pouvoir discriminant entre les
deux espèces de 69.4% (profils P1, P2 et P3).
•
Spécificité - Réactions croisées :
147 échantillons sériques correspondant à 147 patients ont été testés avec la
trousse ECHINOCOCCUS WB IgG par les deux laboratoires précédents.
Ont été inclus des sérums de patients atteints de : neurocysticercose T.solium
13
(42), bilharziose Schistosoma.(42), fasciolose F.hepatica (10), filariose (6),
trichinose (6), toxocarose (6), anguillulose (4), E.histolytica (4), leishmaniose
(4), paludisme P.falciparum (3), maladies autoimmunes FR (8), ANA (12).
139 sérums sont négatifs, démontrant sur cette population une spécificité de 95%.
Les 8 réactions croisées ont été exclusivement observées dans le cadre de :
•
la cysticercose : présence d'une bande isolée à 7 kDa chez 5/42 patients.
•
maladies autoimmunes : présence d'une bande fine isolée à 28 kDa chez
1/8 patients (FR+) et 2/8 patients ANA+.
NB : Fasciolose : la présence d'une bande isolée très large (25-30 kDa) a été
retrouvée sur 4/10 patients testés mais elle ne peut être confondue avec la bande
spécifique 26-28.
Les résultats sérologiques doivent être interprétés en fonction des
renseignements épidémiologiques et cliniques ainsi que des résultats
d’imagerie médicale (échographie, scanner).
•
Corrélations avec d’autres techniques:
Les sérums des patients atteints d'une échinococcose inclus dans l'étude
précédente ont fait l'objet d'un diagnostic préalable à l'aide de diverses
techniques sérologiques. Ont été utilisés en dépistage : un test
d'hémagglutination indirecte du commerce (HAI), un test ELISA utilisant un
antigène hydatique brut d'origine ovine (ELISA Ag E.g), un test ELISA utilisant
un antigène larvaire brut E.multilocularis (ELISA Ag E.m) et un test
d'immunofluorescence indirecte utilisant des coupes à la congélation de
protoscolex de E.granulosus (IFI Ag E.g).
Le tableau ci-dessous résume les résultats obtenus.
HAI
ELISA ELISA
IFI
ImmunoAg E.g Ag E.m Ag E.g
blot
Hydatidose
82%
79%
56%
100%
98%
Echinococcose
alvéolaire
68%
92%
86%
n.a.
97%
Fig.2 - Sensibilité comparée de 5 techniques sérologiques utilisées dans l'étude.
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14
•
Interférences :
Bien qu’aucune interférence particulière n’ait été relevée avec des sérums
hémolysés, ictériques ou lipidiques, il est conseillé d’interpréter les résultats
provenant de l’utilisation de tels échantillons avec prudence.
•
Reproductibilité :
Reproductibilité inter-lots :
10 sérums positifs (5 E.granulosus et 5 E.multilocularis) ont été testés 2 fois
dans la même série avec des réactifs provenant de 2 lots différents (antigènes de
lots de production différents) : La corrélation sérum à sérum vis à vis des bandes
spécifiques 7-28kDa est très satisfaisante.
Reproductibilité intra-séries :
10 sérums positifs (5 E.granulosus et 5 E.multilocularis) ont été testés 2 fois
dans la même série avec des réactifs provenant du même lot de fabrication : La
corrélation sérum à sérum vis à vis des bandes spécifiques 7-28kDa est totale.
15
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17
RESUME DU MODE OPERATOIRE
Nota Bene : ne pas pratiquer le test sans avoir préalablement lu
la présente notice dans son intégralité.
1/
Etablir un plan de distribution.
_______________
2/
Distribuer 1.2ml de R2 (tampon échantillons rose) dans chacun des puits. Agiter doucement la cuve.
Placer une bandelette numérotée R1, face vers le haut, dans
chacun de puits. Attendre 1mn puis agiter doucement la cuve
pour immerger la bandelette.
Distribuer les échantillons (25µl - sérum) et le contrôle positif
R5 (25µl). Agiter doucement la cuve après chaque dépôt.
Incubation 90 mn sur agitateur.
_______________
3/
4/
5/
6/
Laver 3 fois avec R3 dilué au 1/10
Distribuer 1.2ml de R4 (conjugué anti-IgG bleu), agiter doucement la cuve, incubation 60 mn sur agitateur.
_______________
7/
8/
Laver 3 fois avec R3 dilué au 1/10
Distribuer 1.2ml de R6 (substrat – flacon opaque), agiter doucement la cuve. Incubation 20 – 60 mn sur agitateur.
Arrêt de la réaction par 2 lavages à l’eau distillée
_______________
9/
10/
11/
Transférer les bandelettes sur un papier filtre. Laisser sécher à
l’air 15 mn
comparer le profil de l’immunoblot de chaque échantillon
avec celui du contrôle positif R5.
Rechercher les bandes extrêmes (diagnostic du genre) puis les
bandes intermédiaires (diagnostic d’espèce).
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18
ECHINOCOCCUS WB IgG
Exemples d’immunoblots obtenus
(échantillons négatif et positifs)
Poids
Moléculaires
(kDa)
DEFINITION DES PROFILS
SPECIFIQUES
EXEMPLES
E.m
P1
P2
E.g or E.m
P4 P5
NEG
P3
P2
P1
P4
ZONE NON SPECIFIQUE
P3
E.g
26-28
17
18
16
N.S.
7
1/ Diagnostic du genre :
•
présence des bandes extrêmes 7 et/ou 26-28 kDa
2/ Diagnostic d’espèce :
•
•
•
Profils P1 ou P2 : Echinococcus granulosus (E.g)
Profil P3 :
Echinococcus multilocularis (E.m)
Profils P4 ou P5 : E.multilocularis ou E.granulosus
Remarque : la première bande à gauche (E.m, profil P3) correspond au témoin positif (R5) fourni dans le coffret.
19
Exemples complémentaires d’échantillons positifs
en immunoblot et provenant de patients infectés par
E.multilocularis et E.granulosus.
26-28
17
7
18
16
E. multilocularis
E. granulosus
Ces échantillons ont été spécialement choisis pour être des positifs
faibles : tous les profils E.m sont incomplets (à l’exception la première
bandelette n° 13).
Il est intéressant de noter l’opposition des profils habituellement
retrouvés pour chacune des espèces :
E.multilocularis: La bande 26-28 kDa apparaît souvent sous la
forme d’une double bande et elle est la plus intense.
E.granulosus: à l’inverse, la bande la plus intense est la bande 7
kDa.
Mais cette règle n’est pas absolue (ex. La bande E.m No 24)
F152—ECHWBG-f-03/11/2011 v7
20
Index
n° page
Indication
1
Contexte clinique
1-3
Principe du test
3
Réactifs fournis avec la trousse
4-5
Matériels nécessaires non fournis
5
Conditions de conservation
5
Précautions spéciales d'emploi
Sécurité
Précautions
5-6
6
Prélèvement des échantillons
6
Préparation des réactifs
6
Mode opératoire
7-8
Interprétation
8-11
Limites du test
11
Problèmes rencontrés
11-12
Contrôle de qualité
12
Performances
12-14
Bibliographie
15-16
Résumé du mode opératoire
17
Exemple d’immunoblot (positifs et négatif)
18 - 19
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