2008

Chimie Analytique II
–
Spectrophotométrie d’absorption moléculaire
Etude et dosage de la vitamine B6
Daniel Abegg – Nicolas Calo – Emvuli Mazamay – Pedro Surriabre
Université de Genève, Science II, Laboratoire 144 – Groupe 4
29 décembre 2008
Résumé
Dans cette expérience, nous avons déterminé grâce à des méthodes graphiques et numériques que la constante de dissociation entre la forme neutre et acide de la pyridoxine
est en moyenne 4.64. Nous avons aussi dosé la concentration de cette molécule dans une
préparation commerciale pour trouver qu’elle était d’environ 40 mg comme indiqué sur
la boite du médicament.
Introduction
L’absorbance d’un composé se définit comme le rapport entre l’intensité de la lumière
incidente et celle de la lumière émise. Selon la loi de Lambert-Beer, elle est proportionnelle à la concentration de la substance et à son cœfficient d’extinction molaire et varie
en fonction de la longueur d’onde λ. A une certaine valeur de λ, cette absorbance est
maximale, il s’agit du pic d’absorption. La capacité à absorber la lumière dépend de la
structure du composé (type de liaison, cycle aromatique), ce qui permet de différencier
la forme protonée de la forme neutre d’une espèce.
La pyridoxine se présente sous trois formes : acide, neutre et basique (figure 1) qui ont
des spectres et des pics d’absorption différents. Le but de ce TP est de déterminer les
longueurs d’onde des maximum d’absorption des formes acide et neutre. Ces valeurs
permettront de calculer les coefficients d’extinction molaire des deux espèces mentionnées
et de déterminer la constante acide-base du composé. Grâce à ces données, un dosage de
la pyridoxine dans des tablettes pharmaceutiques sera effectué.
1
.
OH
OH
OH
HO
OH
K1
O
K2
OH
forme neutre
forme acide
.
OH
N
H
N
H
N
H
O
forme basique
Fig. 1 – Les trois formes de la pyridoxine avec les constantes de dissociations
Méthodologie et résultats
Les spectres (annexe 1) sont mesurés, après que calibrage du blanc (tampon pH 4.04)
a été fait, pour deux solutions de pyridoxine 9.97 10-5 M, l’une dans un tampon de pH
1.56 et l’autre à pH 6.45. Ceci nous permet de déterminer les deux longueurs d’ondes qui
seront utilisée par la suite : 291 nm et 324 nm.
Cœfficients d’extinction molaire
A
lc
=
λ [nm]
Absorbance
[l/(cm mol)]
AH+
2
291
0.8481
8505.8
324
0.0017
17.0
AH
291
0.2143
2149.3
324
0.6866
6886.1
Tab. 1 – La forme acide est dans un tampon à pH 1.6 et la forme neutre à pH 6.45. La
concentration de la pyridoxine est de 9.97 10-5 M.
Méthodes de calculs de la constante de dissociation pK1
Des solutions de pyridoxine 9.95 10-5 M à pH différent (entre 1.56-6.45) sont préparées
(table 9) et leur spectre est mesurés (table 2 et annexe 2).
2
Méthode 1
Cette méthode est basée sur l’additivité de la loi de Lambert-Beer.
[AH+
2]
+
324
A324 = l 324
AH [AH] + AH+ [AH2 ]
291
A
=l
291
AH
[AH] +
291
AH+
2
2
324 291
291 324
[AH+
AH [AH] + A324 291
AH+ [AH+
A291 324
2]
2] = A
AH [AH] + A
AH+
2
2
[AH] =
A324 291
− A291 324
AH+
AH+
2
2
324 291
A291 324
AH
AH − A
[AH+
2]
A324 291
− A291 324
[AH] [H+ ]
AH+
AH+
−pH
2
2
K =
= 10
+
291 324
324 291
[AH2 ]
A AH − A AH
1
Méthode 2
La deuxième méthode utilise la loi d’action de masse et l’approximation que seul l’espèce
neutre absorbe à la longueur d’onde 324 nm.
[AH] =
A324
324
AH l
A324
[AH] [H+ ]
[H+ ] [AH]
324
AH l
K =
=
= 10−pH +
A324
(C0 − [AH])
[AH2 ]
C0 − 324
1
AH
pH Abs291 nm
1.56
0.8481
2.50
0.8397
3.15
0.8160
4.04
0.7013
4.78
0.6157
5.46
0.3071
6.45
0.2143
Abs324 nm
0.0017
0.0139
0.0342
0.1619
0.3863
0.6010
0.6866
pK1méthode 1
–
4.24
4.45
4.56
4.80
4.67
–
[AH]
2.47 10−7
2.02 10−6
4.97 10−6
2.35 10−5
5.61 10−5
8.73 10−5
9.97 10−5
pK1méthode 2
–
4.18
4.44
4.66
5.02
5.51
–
Tab. 2 – Les valeurs de pK1 de la pyridoxine au différents pH selon deux méthodes de
calculs.
3
Méthode 3
Il existe une troisième méthode pour déterminer le pKa. Selon la formule suivant.
pK1 = pH − log
[AH]
[AH+
2]
Un graphique (figure 2) des concentrations des espèces, calculées selon la méthode 2, en
fonction du pH est tracé. Pour annuler le second terme de l’équation, on se place là où les
concentrations de la base et de l’acide sont égales soit au point d’intersection des courbes.
Le pH à ce point sera donc le pKa cherché.
0.0001
AH
9e−05
AH2+
8e−05
7e−05
Ci
6e−05
5e−05
4e−05
3e−05
2e−05
1e−05
2
3
4
pH
5
6
Fig. 2 – Concentration de la forme acide et base de la pyridoxine en fonction du pH
Valeurs de pK1
méthode 1
moyenne
4.54
écart type
0.21
intervalle 95%
0.19
méthode 2
4.76
0.52
0.45
méthode 3
4.64
–
–
valeurlitérature [2]
4.84
0.01
–
Tab. 3 – Les valeurs de pK1 de la pyridoxine selon 3 différentes méthodes de calcul
Dosage quantitatif de la pyridoxine dans une préparation pharmaceutique
La concentration en pyridoxine (vitamine B6 ) d’une tablette de chez Streuli annoncée à
40 mg sera analysée selon deux méthodes : une courbe de calibrage externe et interne
(méthode des additions connus)
4
Droite de calibration externe
Des solutions à différente concentration de pyridoxine sont préparées (pH 1.56) et leur
absorbance est mesurée à la longueur d’onde de 291 nm.
Cpyridoxine [M]
Absorbance
10-5
0.0716
2 10-5
0.1459
4 10-5
0.3061
6 10-5
0.4523
8 10-5
0.6155
10-4
0.7606
Tab. 4 – Absorbance de la pyridoxine à différente concentration à λ =291 nm dans un
tampon pH 1.56
Trois tablettes sont broyées, solubilisé dans le tampon à pH 1.56, filtrées et remplient à
250 ml. Puis ces solutions sont diluées par un facteur de 10 et leur absorbance est mesurée
à la longueur d’onde de 291 nm
tablette 1
tablette 2
tablette 3
masse des tablettes [g]
0.2032
0.2002
0.1986
Tab. 5 – Masse des trois tablettes de pyridoxines a analyser en g.
Droite de calibration externe
0.8
0.7
Absorbance291 nm
0.6
0.5
0.4
f (x) = 7692.49x − 0.005
R2 = 0.99
0.3
0.2
0.1
0
1e−05
2e−05
3e−05
4e−05
5e−05
6e−05
C pyridoxine [M]
7e−05
8e−05
9e−05
0.0001
Fig. 3 – Droite de calibration externe de la pyridoxine
5
tablette 1
tablette 2
tablette 3
moyenne
écart type
intervalle 95%
Absorbance
0.6619
0.6190
0.6186
0.63
0.02
0.03
Cpyridoxine [M]
8.67 10−5
8.12 10−5
8.11 10−5
8.30 10−5
3.23 10−6
3.66 10−6
npyridoxine [mol]
2.17 10−4
2.03 10−4
2.03 10−4
2.08 10−4
8.09 10−6
9.15 10−6
massepyridoxine [mg]
44.59
41.72
41.69
42.67
1.66
1.88
Tab. 6 – Résultats de l’analyse de la pyridoxine dans les tablettes de Streuli selon la
méthode dans la droite de calibration externe.
Méthode des additions connues
Cette méthode se base sur une droite de calibration interne. Les solutions contenant la
pyridoxine des tablettes se verront ajouter une petite quantité (volume connu) de pyridoxine de la solution stock (9.95 10-5 M). Le volume ajouté est considéré comme négligeable.
Les solutions de pyridoxine dans les fioles des 250 ml sont diluées par dix, puis 400µl
sont prélevé et diluées dans 25 ml. de tampon pH 1.56 et finalement le différents volumes
de solution stock sont ajouté.
najouté [mol]
Vajouté [L]
tablette 1
tablette 2
tablette 3
0
1.00 10−7
0
1.00 10−4
–
0.1361
0.1057
0.127
0.0988
0.1304
2.00 10−7
2.00 10−4
0.1672
0.1664
0.1627
3.00 10−7
3.00 10−4
0.2109
0.2016
0.1819
4.00 10−7
4.00 10−4
0.2456
0.2236
0.2173
4.75 10−7
4.75 10−4
0.252
–
0.2301
Tab. 7 – Volume ajouté de pyridoxine dans la solution de pyridoxine a analyser ainsi que
les absorbances mesurées.
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
pastille 2
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.3
Absorbance291 nm
0.3
pastille 1
Absorbance291 nm
Absorbance291 nm
0.3
0
0
1e−07 2e−07 3e−07 4e−07 5e−07
C pyridoxine [M]
pastille 3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
1e−07 2e−07 3e−07 4e−07 5e−07
0
1e−07 2e−07 3e−07 4e−07 5e−07
C pyridoxine [M]
Fig. 4 – Droites de calibration interne de la pyridoxine
pastille 1
pastille 2
pastille 3
f (x) = 3.290 106 x + 0.105
f (x) = 3.104 106 x + 0.103
f (x) = 2.995 106 x + 0.105
6
C pyridoxine [M]
Pour connaı̂tre la concentration de la pyridoxine il faut calculer le point où l’absorbance
est égale à zéro (y = 0). Ceci nous donnent la concentration, en valeur absolue, de
pyridoxine de l’échantillon.
tablette 1
tablette 2
tablette 3
moyenne
écart type
intervalle 95%
npyridoxine diluée [mol]
3.20 10−7
3.31 10−7
3.51 10−7
3.34 10−7
1.57 10−8
1.77 10−8
npyridoxine [mol]
2.00 10−4
2.07 10−4
2.19 10−4
2.09 10−4
9.79 10−6
1.11 10−5
massepyridoxine [mg]
41.12
42.55
45.09
42.92
2.01
2.28
Tab. 8 – Concentration de pyridoxine dans les tablette de Streuli selon la méthode des
additions connus
Discussion
Les deux longueurs d’onde choisies sont 291 et 324 nm car elles correspondent aux maximums d’absorption des espèces ce qui donnera une sensibilité opptimale.
Lors des mesures, on se place à pH 1.56 car à celui-ci, seul la forme acide existe.
Un point isobestique correspond à une longueur d’onde où les cœfficients d’extinctions molaires sont égaux pour toutes les espèces en solution (maximum deux espèces en équilibre).
En travailant à cette longueur d’onde ont peut ainsi estimer plus facilement les concentrations des solutés.
D’après les résultats obtenus, on constate que la méthode 2 est moins fiable que la
méthode 1. En effet les erreurs pour celle-ci sont plus grandes (environ le double) et une
approximation a été faite car l’absorbance de l’acide à 324 nm a été négligée (∼ 0.25% de
l’absorbance de l’espèce neutre à cette longueur d’onde).
La méthode 3 est de loin la moins précise car cette dernière repose sur l’approximation
de la méthode 2 et sur des régressions linéaire entre deux points sur des courbes. Par ce
fait nous ne pouvons pas calculer l’erreur mais elle ne peut être que plus importante.
La méthode 1 est la plus précise car elle ne fait intervenir aucune approximation.
Les pK obtenu sont plus ou moins proche de la valeur trouvé dans la littérature (4.84),
mais cette dernière n’a pas été faite dans les mêmes conditions (force ionique 0.15 M).
Les valeurs trouvées de concentration en pyridoxine dans les tablettes Streuli, selon les
méthodes sont presque identiques. On trouve comme indiqué sur l’emballage environ
40 mg. Les erreurs sont légèrement plus grandes pour la méthode de additions connues
car nous avions plus de manipulation (source d’erreur) et le volume de solution stock
a été négligé (environ 5% de volume en plus pour la solution la plus concentrée). Les
deux méthodes se valent, la calibration externe est plus adaptée si l’on a au préalable
7
une estimation de la concentration. D’un autre côté la méthode des additions connues
permet de déterminer la concentration d’un échantillon inconnu.
Conclusion
Dans cette expérience nous avons dans un premier temps déterminé le pK de la pyridoxine selon différentes méthodes et avons trouvé des valeurs aux environs de la valeur de
référence.
Par la suite sa concentration a été déterminée par une droite de calibration externe puis
interne (additions connues) et les résultats obtenus sont en accord avec la valeurs indiquée
sur la préparation pharmaceutique. Les deux méthodes ayant donnés les mêmes résultats,
elles sont toutes deux utilisables pour un tel dosage.
Annexe
pH
2.2
3.0
3.6
4.4
5.0
5.6
6.6
X ml Na2 HPO4
0.40
4.11
6.44
8.82
10.30
11.60
14.55
Y ml acide citrique
19.60
15.89
13.56
11.18
9.70
8.40
5.45
Tab. 9 – Valeur pour la préparation des tampons. 20 ml d’un mélange de X ml de
Na2 HPO4 à 0.2 M et de Y ml d’acide citrique à 0.1 M.[1]
Références
[1] M. Borkovec. Lab journal of analytical chemistry II : Spectrophotométrie d’absorption
moléculaire. Etude et dosage de la vitamine B6 , 2008.
[2] R.I. Allen, K.J. Box, J.E.A. Comer, C. Peake, K.Y. Tam. Multiwavelength spectrophotometric determination of acid dissociation constants of ionizable drugs. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 17 :699–712, 1998.
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