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UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU
--------------École Doctorale
Sciences et Technologies
--------------Laboratoire de Biologie et de génétique
moléculaires (Labiogene)
No d’ordre …………....
Thèse Présentée
Par Bolni Marius NAGALO
Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Ouagadougou
Option Sciences Biologiques Appliquées
Spécialité : Biologie moléculaire
Sécurité transfusionnelle au Burkina Faso: Séroprévalence
et incidence des virus de l’immunodéficience humaine(VIH),
des hépatites B & C (VHB et VHC) et de Treponema pallidum
chez les donneurs de sang.
Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury composé de :
Président : Jean Didier ZONGO, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou
Membres : Nicolas BARRO, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Rapporteur)
Jean Pierre ALLAIN, Professeur Titulaire, Université de Cambridge, UK (Rapporteur)
Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Directeur de thèse)
Idrissa SANOU, Professeur Agrégé, Université de Ouagadougou
Mahamoudou SANOU, Assistant, Université de Ouagadougou (Invité)
© Thèse de Doctorat Unique
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 1
Résumé de la thèse
La présente thèse avait pour but d’évaluer la séroprévalence et l’incidence des
virus de l’immunodéficience humaine, des hépatites B et C et de la syphilis chez les
donneurs de sang d’une part ainsi que la mise en place des nouvelles stratégies pour
recruter plus de donneurs réguliers, et d’autre part la faisabilité des tests moléculaires
dans le dépistage du VIH-1 dans les dons de sang au centre régional de transfusion
sanguine de Ouagadougou. A cet effet deux enquêtes rétrospectives et une étude pilote
ont été conduites dans les différents centres régionaux de transfusion sanguine du pays.
Les résultats de la première enquête épidémiologique chez les donneurs de sang de
Koudougou montrent que dans ce centre de transfusion sur un total de 4520 donneurs
de sang en 2009, 1348 (29,82%) étaient infectés par au moins un agent pathogène et
149 (3,30%) avaient contractés des multiples infections. Les séroprévalences du VIH,
de l’AgHBs, du VHC et de la syphilis étaient respectivement de 2,21%, 14,96%, 8,69% et
3,96%. Chez les donneurs de sang infectés par plusieurs pathogènes, les doubles et
triples infections les plus fréquentes étaient l’AgHBs-VHC (1,39%), AgHBs-syphilis
(0,66%) et AgHBs-VHC-syphilis (0,11%).
En 2009 sur 35.401 donneurs de sang bénévoles des centres régionaux de transfusion
sanguine de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et Fada N’Gourma, 7524 (24,4%) étaient
infectés par au moins un pathogène et 580 (1,9%) étaient positifs pour plusieurs
marqueurs sérologiques. Chez 3981 donneurs de sang réguliers, les taux d'incidences ont
été de 3270,2 ; 5874,1 et 6784,6 pour 100000 dons respectivement pour l'anti-VIH,
l'AgHBs et l'anti-VHC.
L’étude pilote a concerné 20 pools de plasmas de donneurs de sang du centre de
transfusion de Ouagadougou (10 pools de négatifs, 8 pools de positifs et 2 pools de
douteux au VIH-1). Tous les pools de positifs et de négatifs ont été confirmés positifs ou
négatifs par RT-PCR. Pour les deux pools de douteux, un pool a été confirmé négatif et un
autre positif par RT-PCR. Chaque don des pools de négatifs ou de positifs testé
individuellement a été trouvé négatif ou positif par RT-PCR.
Les virus responsables des hépatites B et C demeurent une préoccupation majeure pour
la sécurité transfusionnelle au Burkina Faso. La disponibilité en poches de sang ainsi que
le renforcement de la sécurité des produits sanguins passera d’une part, par le
recrutement de nouveau type de donneurs de sang (donneurs familiaux/remplacements)
et une sélection rigoureuse des donneurs et, d’autre part par l’utilisation de nouvelles
techniques plus sensibles et spécifiques qui seraient en mesure de garantir une sécurité
maximale en médecine transfusionnelle.
Mots clés : VIH, VHB, VHC, Syphilis, incidence, transfusion sanguine, donneurs.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Abstract
This thesis aimed to assess the prevalence and incidence of human immunodeficiency virus,
hepatitis B and C and syphilis among blood donors and to develop new strategies to recruit more
regular donors. We also evaluated the feasibility of NAT in HIV-1 diagnosis among blood donation
in the regional blood transfusion centre of Ouagadougou. Retrospective surveys study were
conducted in the 4 regional blood transfusion centres in the country.
The results of the first epidemiological survey among blood donors of Koudougou show that from
the total of 4520 blood donors in 2009, 1348 (29.82%) were infected with at least one pathogen
and 149 (3.30%) had serological evidence of multiple infections. The overall seroprevalence rate
of HIV, HBV, HCV and syphilis was 2.21%, 14.96%, 8.69% and 3.96%. Among blood donors with
multiples infections, the most common dual or triple combinations were HBsAg-HCV (1.39%),
HBsAg-Syphilis (0.66%) and HBsAg-HCV-Syphilis (0.11%), respectively.
In 2009, from the total of 31,405 first-time volunteer blood donors from regional blood
transfusion centres of Ouagadougou, Bobo-Dioulasso and Fada N’gourma, 7,524 (24.0%) were
infected with at least one pathogen and 580 (1.8%) had serological evidence of multiple
infections. The seroprevalence of HIV, HBV, HCV and syphilis in first-time volunteer donors was
1.8%, 13.4%, 6.3% and 2.1%, respectively. In 3,981 repeat donors, the incidence rate was 3270.2,
5874.1 and 6784.6 per 100,000 donations for anti-HIV-1, HBsAg and anti-HCV, respectively. These
numbers varied significantly according to populations where blood is collected and blood centers
in Burkina Faso.
The aim of the pilot study was to investigate the use of viral genome diagnosis of HIV-1 infection
in blood donors in the regional blood transfusion center in Ouagadougou, Burkina Faso. All
positive and negative ELISA tests were confirmed by RT-PCR. Findings of RT-PCR on individual
samples confirmed those obtained on pooled plasma samples. For the two undeterminable pools,
RT-PCR identified one as negative and the other as positive.
HBV and HCV remain the greatest threats to blood safety in Burkina Faso. Strict selection and
retention of voluntary, non-remunerated low-risk blood donors are recommended to
improve blood safety.
Keywords: HIV, HBV, HCV, syphilis, incidence, blood transfusion, donors.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 3
Sigles et abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
ADNccc : ADN circulaire fermé de façon covalente
Ag : Antigène
AgHBc : Antigène de la capside de l’hépatite B
AgHBe : Antigène « e » de l’hépatite B
AgHBs : Antigène de surface de l’hépatite B
AgHD : Antigène du virus de l’hépatite D
ARN : Acide ribonucléique
AXSYM : Test immunoenzymatique (technologie MEIA)
CERBA-LaBiogène: Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni- Laboratoire de
biologie et de génétique.
CMV : Cytomégalovirus
CNLS-IST : Conseil national de lutte contre le VIH/SIDA et les IST
CNTS: Centre National de Transfusion Sanguine
CRTS : Centre Régional de Transfusion sanguine
DO : Densité optique
DGV : Dépistage génomique viral
EBV : Epstein Barr- Virus
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Env : Enveloppe
Gag : Groupe antigène
Gp: Glycoprotéine
HTLV : Virus responsable de la leucémie(Herpesviridae)
BOLNI MARIUS NAGALO
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Ig: Immunoglobuline
INVS : Institut national de veille sanitaire
NANB : Hépatite non A non B
PSL : Produits sanguins labile
QBD : Qualification biologique du don
Real Time PCR : PCR en temps réel
RT/PCR : Transcription inverse/Réaction en chaîne par polymérase
VHA : Virus de l’hépatite A
VHB : Virus de l’hépatite B
VHC : Virus de l’hépatite C
VHD : Virus de l’hépatite D
VHE : Virus de l’hépatite E
VHG : Virus de l’hépatite G
VIH/SIDA : Virus de l’Immunodéficience Humaine/ Syndrome d’immunodéficience
acquise
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 5
Dédicaces
Cette œuvre est dédiée à mes parents,
spécialement à ma défunte mère Dao Aminata,
À papa Nagalo W Michel, à mes frères et sœurs,
À toute ma famille, à mes ami(e)s,
les présent(e)s comme les absent(e)s,
À mon épouse Murielle Compaore
Merci a tous pour votre soutien inconditionnel.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 6
Remerciements
Ce travail de thèse a été réalisé dans les Laboratoires du centre national de transfusion sanguine
du Burkina Faso (CNTS) et au Centre de recherche biomoléculaire Pietro Annigoni
CERBA/LABIOGENE, Université de Ouagadougou.
Je remercie le Professeur Jacques Simpore (Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou,
Recteur de l’université Saint Thomas d’Aquin, USTA), Directeur de cette thèse, membre du jury et
Directeur de plusieurs institutions académiques et caritatives : Laboratoire de Biologie
moléculaire et de génétique (Labiogène, UFR/SVT, Université de Ouagadougou) ; Centre de
recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) ; Laboratoire du centre médical Saint Camille
de Ouagadougou. Le Professeur Simpore est le principal promoteur de la présente thèse ; merci
pour votre soutien moral et financier, pour la qualité de l’encadrement scientifique et votre
disponibilité en dépit de vos multiples fonctions.
J’exprime ma profonde reconnaissance au Professeur Jean Didier Zongo (Professeur Titulaire,
Directeur du laboratoire de génétique et de biotechnologies, Université de Ouagadougou) codirecteur de cette thèse, pour son encadrement scientifique et sa disponibilité tout au long de ma
formation doctorale.
Je remercie le Professeur Jean Pierre Allain (Professeur Titulaire, Université de Cambridge)
pour avoir bien voulu juger et corriger cette thèse, contribuant ainsi à l’amélioration de sa
qualité ; je le remercie aussi pour sa précieuse contribution dans la rédaction de mes articles.
Je tiens à remercier le Professeur Patrick Goubau (Professeur Titulaire, Université Catholique de
Louvain, Belgique) qui a bien voulu lire et juger la présente thèse.
Je voudrais aussi exprimer ma profonde gratitude au Professeur Nicolas Barro (Professeur
Titulaire, Université de Ouagadougou) qui a bien voulu juger la présente thèse.
Je tiens aussi à remercier sincèrement le Professeur Idrissa Sanou qui a bien voulu consacrer de
son temps pour juger ce travail.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 7
Mes remerciements s’adressent également au Docteur Mahamoudou Sanou, ancien Directeur
général du CNTS sans qui la présente thèse n’aurait pas été possible.
Je remercie le Docteur Cyrille Bisseye qui m’a apporté son expertise technique au laboratoire et
une aide précieuse dans la préparation des articles de la présente thèse.
Je remercie également les cadres du CNTS, les Docteurs Nebié Yacouba, Alice Kiba/Koumaré,
Kisito Kienou ainsi que les directeurs régionaux des CRTS et toutes les équipes techniques qui
ont contribué de façon significative à la réalisation de mes travaux.
J’adresse mes remerciements au Professeur Sawadogo et aux Docteurs , Bationo, Nanema,
Traoré, ainsi qu’à mes ainés et promotionnaires de DEA.
J’adresse mes remerciements à l’ensemble de l’équipe du CERBA/Labiogene : Djénéba, Tani,
Florencia, Moctar, Désiré, Thérèse, Zoenabo, Bazié et Laure.
Je tiens également à exprimer ma plus profonde reconnaissance à mes parents, mes frères, ainsi
qu’à tous les membres de ma famille pour m'avoir toujours soutenu dans toutes mes entreprises.
Merci enfin à ma très chère et tendre épouse Murielle (Mumu), qui de tous a probablement
accepté la plus lourde tâche, celle de me supporter au quotidien, toujours avec entrain,
bienveillance, et amour, pendant toute la durée de ma thèse, et pour longtemps j’espère.
À la Conférence Épiscopale Italienne (CEI), pour leur soutien financier dans la réalisation de
nos travaux de recherches.
Au « Programme d’Appui et de développement des Centres d’Excellence Régionaux
(PACER2) » de l’UEMOA qui nous a soutenus au dernier moment pour que nous puissions
terminer
cette
thèse
de
doctorat,
nous
leur
BOLNI MARIUS NAGALO
traduisons
toute
notre
gratitude.
Page 8
Sommaire
Table des matières
Résumé de la thèse ............................................................................................................................................................2
Remerciements ...................................................................................................................................................................7
Introduction ...................................................................................................................................................................... 17
Objectifs de la thèse........................................................................................................................................................ 20
PREMIERE PARTIE: RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
Chapitre I : Sécurité transfusionnelle dans le monde. ..................................................................................... 22
I. Généralités................................................................................................................................................................. 22
I.1- Situation mondiale du don de sang. .......................................................................................................... 22
I.1.2- Systèmes de surveillance de l’utilisation du sang et des produits sanguins labiles (PSL).
.......................................................................................................................................................................................... 24
I.1.3- La transfusion sanguine au Burkina Faso ........................................................................................... 26
I.1.4- Profil sanitaire de la population au Burkina Faso. .......................................................................... 27
I.1.5- Organisation des activités transfusionnelles au Burkina Faso ................................................. 27
I.1.6- Données sur la transfusion sanguine au Burkina Faso ................................................................. 28
Chapitre II : Maladies transmissibles par transfusion sanguine ................................................................. 29
II.1. Les principales causes des contaminations post-transfusionnelles ........................................... 29
II.2. Les hépatites virales ......................................................................................................................................... 29
II.2.1. L’hépatite virale C (VHC). ......................................................................................................................... 30
II.2.1.1. Caractéristiques du virus de l’hépatite C ....................................................................... 30
II.2.1.2. Organisation génomique. ............................................................................................... 30
II.2.1.3-Réplication du VHC et variabilité virale ........................................................................ 32
II.2.1.4. Le génotype viral ............................................................................................................ 35
II.2.2.1. Génome du virus de l’hépatite B (VHB) ......................................................................... 39
II.2.2.2. Cycle de réplication du VHB ........................................................................................... 41
II.2.2.3. Evolution des marqueurs virologiques au cours d’une infection au VHB ........................ 43
II.2.2.4 Epidémiologie et répartition géographique du virus de l’hépatite B (VHB) ................ 47
II.2.3. Facteur delta : agent de l'hépatite D.................................................................................................... 49
II.2.4. Le virus de l'hépatite A (VHA) ................................................................................................................ 50
II.3. Le virus de l'immunodéficience humaine acquise (VIH/SIDA) ...................................................... 51
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 9
II.3.1. Caractéristiques virologiques du VIH................................................................................................. 52
II.3.2. Génome et propriété structurale du VIH............................................................................................ 53
II.3.3. Variabilité génétique des VIH ................................................................................................................. 55
II.3.4. Infectiosité du VIH ....................................................................................................................................... 56
II.3.5. Phase clinique de l’infection au VIH ..................................................................................................... 57
II.3.6. Le VIH/SIDA dans le monde .................................................................................................................... 58
II.4. Le virus T-lymphotrope humain type I et type II (HTLV-1 et 2) ................................................... 61
II.5. Les Contaminations bactériennes ............................................................................................................. 61
II.5.1. Treponema pallidum agent causal de la syphilis. ............................................................................ 62
II.5.1.2.Épidémiologie de la syphilis dans le monde .................................................................................. 63
II.6. Paludisme et transfusion sanguine .......................................................................................................... 64
Chapitre III : Méthodes de diagnostic des agents transmissibles par transfusion sanguine ........... 66
III. Diagnostic des hépatites virales ......................................................................................................................... 66
III.1. Le virus de l’hépatite C (VHC) ..................................................................................................................... 66
III.1.1- Le diagnostic indirect ............................................................................................................................... 66
III.1.2. Le diagnostic direct ................................................................................................................................... 67
III.2. Le virus de l’hépatite B (VHB) .................................................................................................................... 69
III.2.1. Diagnostic virologique.............................................................................................................................. 69
III.2.1.1. Les marqueurs directs................................................................................................... 69
III.2.1.2. Les marqueurs indirects ............................................................................................... 70
III.3.1. Diagnostic indirect ..................................................................................................................................... 72
III.3.1.1. L’Immunofluorescence indirecte .................................................................................. 72
III.3.1.2. Les techniques immunoenzymatiques .......................................................................... 73
III.3.1.3. Les tests rapides ............................................................................................................ 74
III.3.1.4. Tests de confirmations .................................................................................................. 76
III. 4. Détection des infections bactériennes syphilitiques........................................................................ 78
Chapitre IV : Techniques d’amplifications moléculaires et sécurité transfusionnelle ....................... 80
IV.1. La transfusion sanguine ................................................................................................................................ 80
IV.2. Risques transfusionnels ............................................................................................................................... 81
IV.3. Mesure du risque transfusionnel............................................................................................................... 83
IV.3.1. Différents types de donneurs de sang................................................................................................ 83
IV.3.1.1. Donneurs de sang de premier don ................................................................................ 83
BOLNI MARIUS NAGALO
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IV.3.1.2. Donneurs de sang régulier ............................................................................................ 83
IV.3.1.3. Donneur en séroconversion .......................................................................................... 83
IV.3.2. Calcul du taux d’incidence....................................................................................................................... 83
IV.3.3. Le risque résiduel ....................................................................................................................................... 84
IV.4. Biologie moléculaire et sécurité transfusionnelle .............................................................................. 85
IV.4.1. La Réaction en chaîne par polymérase et ses variantes (PCR) ................................................ 85
IV.4.1.1. Les étapes de la PCR ...................................................................................................... 86
IV.4.1.2. La transcription inverse par réaction en chaîne par polymérase (RT / PCR) ............ 86
IV.4.1.3. La RT/PCR quantitative : la charge virale ................................................................... 87
IV.4.1.4. La RT/PCR qualitative .................................................................................................. 89
IV.4.1.5. Réalisation d’une RT/PCR ............................................................................................ 89
IV.4.1.6. Synthèse de l'ADNc......................................................................................................... 89
IV.4.1.7. Efficacité de la PCR........................................................................................................ 91
IV.4.1.8. Autres techniques dérivées............................................................................................ 91
IV.4.1.8.1. La PCR multiplex ................................................................................................... 91
IV.4.1.8.2. La PCR en Temps réel (Real Time PCR) .............................................................. 92
DEUXIEME PARTIE: TRAVAUX EFFECTUES
Chapitre V : Matériels et méthodes.......................................................................................................................... 95
V.1. L’étude rétrospective ....................................................................................................................................... 95
V.1.1 Les donneurs de sang .................................................................................................................................. 95
V.1.3. Procédure de sélection des donneurs de sang ................................................................................. 96
V.1.3.1. Catégorisation des donneurs de sang ................................................................................................. 96
V.1.3.2. Sérologie des donneurs de sang ..................................................................................... 96
V.1.3.3. Stratégies de confirmation des marqueurs infectieux........................................................................ 97
V.2. Présentation des techniques de dépistages utilisées au cours de l’étude....................................... 97
V.2.1.Tests sérologiques du VIH, VHB, VHC et de la syphilis .................................................................... 97
V.2.1.1.La sérologie VIH-1/2 chez les donneurs de sang en 2009 ............................................................ 97
V.2.1.2. La sérologie des hépatites virales B et C des donneurs de sang en 2009 ............................... 99
V.2.1.3. La sérologie syphilitique des donneurs de sang en 2009 .......................................................... 102
V.3. Amplification de l’ARN viral du VIH-1 ................................................................................................... 104
BOLNI MARIUS NAGALO
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V.3.1. Constitution des pools de plasmas des donneurs de sang ....................................................... 104
V.3.2. Extraction de l’ARN viral (kit QIAamp viral ARN mini kit, Hilden, Allemagne) .............. 104
V.3.3. Obtention de L’ADNC ................................................................................................................................ 105
V.3.4. Préparation du gel d’agarose ............................................................................................................... 106
V.4. Analyses statistiques .......................................................................................................................................... 107
V.4.1. Le taux d’incidence ..................................................................................................................................... 107
Chapitre VI : Résultats et discussion ................................................................................................................... 110
VI. 1. Séroprévalences des maladies transmissibles par transfusion sanguine au Burkina Faso110
VI.1.1. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de Koudougou ......... 110
VI.1.1.1. Description de la cohorte du centre régional de transfusion sanguine de Koudougou 110
VI.1.1.2. Épidémiologie du VIH, du VHB, du VHC, de la syphilis chez les donneurs de premier don
des zones urbaine et rurales du Burkina Faso en 2009 ............................................................................ 110
VI.1.2. Prévalence des agents infectieux chez les donneurs de sang de Ouagadougou, BoboDioulasso et de Fada N’gourma. ........................................................................................................................ 111
VI.1.2.1. Description de la population d’étude ............................................................................................. 111
VI.1.2.2. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang volontaires de premier
don ............................................................................................................................................................................... 115
VI.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang de premier don et les
donneurs réguliers de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma................................... 118
VI.3. Contribution de la PCR à l’amélioration du diagnostic des agents infectieux au Burkina Faso :
RT-PCR du VIH-1 au centre de transfusion de Ouagadougou.................................................................... 120
VI. 4. Discussion ....................................................................................................................................................... 123
VI.4.1. Prévalences des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang au Burkina Faso ........ 123
VI.4.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang volontaires,
réguliers de trois centres régionaux de transfusion sanguine du Burkina....................................... 126
VI.4.3. Approvisionnement en sang sûr : Quel type de donneur recruter ? ....................................... 129
VI.4.4. Quel type de donneur pour quel coût ? .............................................................................................. 130
VI.4.5. Introduction du dépistage génomique viral en transfusion sanguine au CRTS de
Ouagadougou : diagnostic moléculaire du VIH-1 sur les pools de plasmas de donneurs de sang
....................................................................................................................................................................................... 131
VI.4.6. Coordination des activités transfusionnelles : Quelle approche ? ........................................... 134
Conclusion et perspectives .................................................................................................................................... 135
Références Bibliographiques .................................................................................................................................. 137
BOLNI MARIUS NAGALO
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Liste des figures
FIGURE 1 : DONS DE SANG POUR 1000 HABITANTS EN 2007 (ONUSIDA, 2009) ................................................... 25
FIGURE 2 : CARTE DU BURKINA FASO ................................................................................................................................. 26
FIGURE 3 : EVOLUTION DU NOMBRE DE POCHES COLLECTEES DE 2006 A 2009 AU CNTS. ........................................ 28
FIGURE 4 : A. STRUCTURE DU VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC) ; B. GENES DE STRUCTURE ET ORGANISATION
GENOMIQUE DU VHC. .................................................................................................................................................... 32
FIGURE 5 : (A) CYCLE DE VIE DU VHC................................................................................................................................ 34
FIGURE 6 : ARBRE PHYLOGENETIQUE REPRESENTANT LES DIFFERENTS GENOTYPES ET SOUS-TYPES DU VHC ET
DERIVE DE L’ANALYSE DES SEQUENCES D’UNE PARTIE DE LA REGION NS5B ......................................................... 36
FIGURE 7 : REPARTITION DE L'INFECTION PAR LE VHC DANS LE MONDE (OMS, 1997) ............................................. 38
FIGURE 8 : ORGANISATION DU GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE B (BLANCHET ,2007) ........................................... 40
FIGURE 9: ARBRE PHYLOGENETIQUE DES ORTHOHEPADNAVIRUS (KIDD-LJUNGGREN ET AL, 2002) ........................ 42
FIGURE 10 : VUE D’ENSEMBLE DU CYCLE DE REPLICATION VIRAL VHB (ADAPTE DE GANEM ET PRINCE, 2004) .... 43
FIGURE 11 : EVOLUTION DES MARQUEURS SEROLOGIQUES AU COURS DE L’INFECTION AU VHB
(HTTP://T2.GSTATIC.COM/IMAGES) ........................................................................................................................... 46
FIGURE 12: REPARTITION GEOGRAPHIQUE DU RISQUE DE CONTAMINATION PAR L'HEPATITE B EN
2005(WWW.WIKIPEDIA.ORG/WIKI/FICHIER.HBV_PREVALENCE_2005.SVG) .................................................... 48
FIGURE 13: REPARTITION GEOGRAPHIQUE DU RISQUE DE CONTAMINATION PAR L'HEPATITE A EN 2005 :
WWW.WIKIPEDIA.ORG/WIKI/FICHIER.HBA_PREVALENCE_2005.SVG) ................................................................ 51
FIGURE 14 : STRUCTURE DU VIH (HTTP://WWW.MUSEUM-GRENOBLE.FR) ................................................................. 53
FIGURE 15 : REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU GENOME DU VIH-1 (PETERLIN ET TRONO, 2003).................... 54
FIGURE 16 : PHYLOGENIE DES DIFFERENTS TYPES ET SOUS TYPES DU VIH (WIKIPEDIA.ORG/WIKI/FICHIER:HIVSIV-PHYLOGENETIC-TREE.SVG ..................................................................................................................................... 55
FIGURE 17 : CYCLE DE REPLICATION DU VIH (WWW.WIKIPEDIA.FR) ............................................................................. 57
FIGURE 18 : DETECTION DES ANTICORPS ET ANTIGENE PENDANT LA PHASE AIGÜE DU VIH-1(ADAPTE DE
MCMICHAEL ET AL, 2010) ........................................................................................................................................... 58
FIGURE 19 : REPARTITION MONDIALE A LA FIN 2005 DES ADULTES ET DES ENFANTS VIVANT AVEC LE VIH
(ONUSIDA/OMS, 2005) ............................................................................................................................................ 59
FIGURE 20: WESTERN BLOT CONFIRMÉ POSITIF (SOURCE: WESTERN BLOT BANDELETTE VIH .PDF) ...................... 77
FIGURE 21: SCHEMA DE L’INTERPRETATION D’UNE IMMUNO-EMPREINTE ................................................................... 78
FIGURE 22 : SCHEMA SIMPLIFIE D'AIDE A L'INTERPRETATION DES SEROLOGIES DE LA SYPHILIS ............................... 79
FIGURE 23 : DIFFERENTES ETAPES DE LA PCR (WWW.CHUPS.JUSSIER.FR)................................................................... 88
FIGURE 24: A. SCHEMA SIMPLIFIE DU PRINCIPE DE LA REACTION DE TRANSCRIPTION INVERSE EN PRESENCE
D'AMORCE POLYT ET B. LA SYNTHESE DU SECOND BRIN D'ADNC PAR LA TAQ POLYMERASE.............................. 90
FIGURE 25 : GEL D’AGAROSE A 2% DES POOLS DE PLASMAS ET DE QUELQUES ECHANTILLONS INDIVIDUELS ........ 122
BOLNI MARIUS NAGALO
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Liste des photographies
Photographie 1 A gauche spectrophotomètre lecteur de microplaques (Biorad, France) à droite
appareillage de l’automate l’AXSYM (Abbott, USA)………………………………………………………………………103
Photographie 2 Thermocycleur 9700 (Applied Biosystems, USA)………………………………………………..106
Photographie 3 A gauche une Cuve d’électrophorèse couplée à un générateur (CERBA/Labiogene)
à droite course électrophorétique des acides nucléiques du VIH-1 sur gel d’agarose à 2%...................107
BOLNI MARIUS NAGALO
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Liste des tableaux
TABLEAU I : CAS DE VIH PAR TRANCHE D’AGE EN 2007 COMPAREES AUX DONNEES DE 2008 (SOURCE PNM 2008
DU CNLS-IST, 2008) ................................................................................................................................................... 60
TABLEAU II: INTERPRETATION DES RESULTATS AVEC LE KIT AXSYM VIH AG/AB COMBO .................................. 99
TABLEAU III : CARACTERISTIQUES SOCIODEMOGRAPHIQUES DES DONNEURS DE SANG DE KOUDOUGOU EN 2009 112
TABLEAU IV : PREVALENCE DES MARQUEURS INFECTIEUX CHEZ LES DONNEURS DE SANG DE PREMIER DON EN ZONES
URBAINE ET RURALE DES LES 4 CENTRES DE TRANSFUSION SANGUINE DU BURKINA FASO EN 2009 ............. 113
TABLEAU V : CARACTERISTIQUES SOCIODEMOGRAPHIQUES DES DONNEURS VOLONTAIRES NON REMUNERES ET
INFECTIONS AU VIH, A LA SYPHILIS AU
VHB, ET AU VHC A KOUDOUGOU........................................................ 114
TABLEAU VI : REPARTITION DES DONNEURS DE SANG PAR CENTRE DE TRANSFUSION SANGUINE ......................... 116
TABLEAU VII : PREVALENCE DES MARQUEURS INFECTIEUX CONFIRMES ET DES CO-INFECTIONS CHEZ LES DONNEURS
VOLONTAIRES DE PREMIER DON ................................................................................................................................ 117
TABLEAU VIII : INCIDENCE DU VIH, DU VHB ET DU VHC CHEZ LES DONNEURS REGULIERS ET LES DONNEURS DE
PREMIER DON DANS LES TROIS CENTRES REGIONAUX DE TRANSFUSION SANGUINE AU
BURKINA FASO ......... 119
TABLEAU IX : RT-PCR SUR LES POOLS DE PLASMAS AU COURS DE L’ENQUETE PROSPECTIVE D’AOUT A DECEMBRE
2009 AU CRTS-O ....................................................................................................................................................... 121
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Introduction
La sécurité transfusionnelle est un problème de santé publique extrêmement préoccupant
pour les autorités sanitaires des pays d’Afrique subsaharienne. Et de ce fait, beaucoup
d'efforts ont été consentis à l’élaboration de mesures visant à réduire le risque de
transmission d'agents infectieux par transfusion sanguine. La mise en évidence de l’agent
causal du VIH/SIDA et de la transmissibilité du virus par le sang a vu émerger des tests
de dépistage de plus en plus sensibles et efficaces. A l’heure actuelle, le dépistage
systématique des virus de l’immunodéficience humaine acquise (VIH), des hépatites B et
C (VHB et VHC) et du tréponème pâle de la syphilis est effectué dans la plupart des
banques de sang du continent. En 2007, au Burkina Faso les prévalences des principaux
marqueurs viraux infectieux dépistés en transfusion étaient respectivement de 1,7%,
14,3% et 2,2% pour le VIH et les virus des hépatites B et C (VHB et VHC). Ces prévalences
sont comparables à celle trouvées dans la plupart des pays d’Afrique de l’ouest mais elles
demeurent élevées comparativement à celles des pays développés (Nagalo et al, 2011).
Cependant les prévalences élevées
dans les populations Africaines des maladies
transmissibles par le sang impliquent aussi l’existence d’un risque élevé de recruter des
donneurs de sang en phase de séroconversion et de transfuser des malades avec du sang
contaminé.
Ces artéfacts transfusionnels sont imputables à un risque résiduel qui persiste malgré la
grande sensibilité des tests de dépistage utilisés et la mise en place d’un système
rigoureux de rétention et de fidélisation des donneurs. Le risque résiduel est représenté
par des dons infectieux collectés pendant la fenêtre de silence sérologique qui correspond
à la phase de séroconversion du donneur; période au cours de laquelle les anticorps
témoins de l’infection ne sont pas détectables par les méthodes courantes de diagnostics
biologiques.
L’observation des séroprévalences élevées des principaux marqueurs dépistés en
transfusion est essentiellement due au mode de recrutement des donneurs de sang. En
effet plus de 2/3 des poches collectées dans les banques de sang d’Afrique subsaharienne
proviennent des donneurs de sang de premier don. Les donneurs de sang sont recrutés au
cours des cérémonies socioculturelles dans les villes et dans les campagnes et diverses
BOLNI MARIUS NAGALO
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méthodes sont mises en place pour fidéliser ces donneurs occasionnels afin de
promouvoir les dons réguliers (Mvere ,2002 ; Allain et al, 2009 ; Owusu-Ofori et al, 2010).
Au Burkina Faso comme dans la plupart des pays de l’Afrique au sud du Sahara, les
principaux problèmes rencontrés en transfusion sanguine sont : la pénurie chronique en
poches de sang et le coût engendré par le recrutement de donneurs volontaires non
rémunérés. La disponibilité en produits sanguins est encore plus critique pendant les
périodes d’hivernages (paludisme), les vacances scolaires de Noël, Pâques car une grande
partie des dons sont collectés en milieux scolaire et universitaire (Allain, 2011).
Il ressort clairement à travers toutes ces analyses que seule l’augmentation du nombre de
dons réguliers pourrait garantir une meilleure sécurité transfusionnelle. Des études ont
prouvé de part le monde que les prévalences des infections dues au VIH, aux hépatites
virales B et C et autres infections transmissibles par transfusion sont toujours plus faibles
chez les donneurs réguliers. La faiblesse de l’effectif des donneurs dans les banques de
sang d’Afrique subsaharienne engendre la nécessite de se tourner vers d’autres types de
donneurs de sang potentiels.
Longtemps
exclus
du
processus
de
don
de
sang,
les
donneurs
de
sang
familiaux/remplacements se rapprochent d’un point de vue épidémiologique des
donneurs volontaires non rémunérés (Allain, 2011). Et, la prévalence des infections parmi
les donneurs de sang pour la plupart de premier don et les donneurs
familiaux/remplacements est similaire à celle présente dans la population en générale.
De plus le recrutement des donneurs familiaux/remplacements ne nécessite pas la
mobilisation de plus de ressources que les collectes chez les donneurs volontaires non
rémunérés. La politique de collecte actuelle du centre national de transfusion sanguine
du Burkina devrait prendre en compte les donneurs familiaux/remplacements pour
répondre aux besoins grandissant en poches de sang chaque année. Mais également
promouvoir diverses stratégies de rétention et de fidélisation des donneurs de sang
familiaux/remplacements dans le but d’augmenter le nombre des donneurs réguliers afin
de contribuer à garantir la sécurité transfusionnelle et à assurer pour chaque patient qui
en a besoin, l’accès à du sang non infectieux.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Cette étude, se propose d’une part d’établir des données épidémiologiques sur les
prévalences, les incidences des principaux marqueurs infectieux dépistés en transfusion
sanguine au Burkina Faso. Pour permettre l’identification des nouvelles voies d’infections,
de connaître et de comprendre les modes de contaminations actuels de l’infection par le
VIH, le VHB, le VHC et la syphilis chez les donneurs de sang des centres régionaux de
transfusion sanguine du pays.
D’autre part de proposer des mesures alternatives pour combler la pénurie en poches
de sang dans les centres de santé du Burkina
par la possibilité d’enrôlement des
donneurs familiaux/remplacements puis de leur fidélisation (conversion en donneurs
réguliers) pour assurer aux patients une meilleure disponibilité des produits sanguins en
qualité et en quantité suffisante.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Objectifs de la thèse
L’objectif de cette thèse est :
Objectif général :
Contribution à l’amélioration de la sécurité transfusionnelle des produits sanguins
labiles dans les différents centres régionaux de transfusion sanguine du Burkina Faso.
Objectifs spécifiques :
(i)
Evaluer les prévalences des infections transmissibles par transfusion
sanguine et l’impact des facteurs sociodémographiques sur le risque
associé au don de sang chez les donneurs de sang.
(ii)
Déterminer l’incidence des virus du VIH, du VHB et du VHC chez les
donneurs de sang réguliers des centres régionaux de transfusion sanguine
de Ouagadougou, de Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma.
(iii)
Identifier des solutions alternatives pour palier aux difficultés
d’approvisionnement en sang sécurisé dans les centres de transfusion
sanguine du pays.
(iv)
Permettre une notification rapide du statut sérologique des donneurs de
sang en particulier les indéterminés (douteux ou zone grise) pour le VIH
au CRTS de Ouagadougou en utilisant les techniques d’amplifications
moléculaires (RT-PCR).
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PREMIERE PARTIE :
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
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Chapitre I : Sécurité transfusionnelle dans le monde.
I. Généralités
I.1- Situation mondiale du don de sang.
Chaque année plus de 85 millions de dons de sang sont recueillis auprès de donneurs,
tous types confondus (Castilla et al, 2005). La disponibilité et la sécurité du sang et des
produits sanguins pour les transfusions continuent d’être préoccupantes, en particulier
dans les pays à revenu faible ou intermédiaire, où demeure le risque de transmission du
VIH et d’autres infections, par exemple l’hépatite B, l’hépatite C et la syphilis au cours
d’une transfusion. Pour diminuer la charge du VIH due à des transfusions à risque, il faut
appliquer une stratégie intégrée, avec un service de transfusion sanguine coordonné au
niveau national ; mener une collecte de sang auprès de donneurs de sang sûr ; dépister les
infections transmissibles par transfusion comme le VIH dans tous les dons de sang ; et
dispenser une formation et un suivi appropriés aux soignants.
Le niveau minimal de dons requis pour qu’un pays satisfasse ses besoins les plus
essentiels en sang est estimé à 1% de la population. Ces besoins sont plus élevés dans les
pays qui ont des systèmes de santé plus avancés. La disponibilité du sang mesurée par les
dons pour 1000 habitants, varie beaucoup dans le monde, les niveaux les plus bas étant
relevés dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (3,1 pour 1000 habitants au
Burkina Faso). Le taux moyen de don du sang dans les pays à revenu élevé est 16 fois plus
important que dans les pays à faible revenu. Soixante-treize pays à revenu faible ou
intermédiaire indiquent qu’ils ont recueilli moins de 10 dons pour 1000 habitants (Figure
1).
En Afrique subsaharienne, les difficultés entravant la constitution des réserves en sang
sûr sont d’une part dues aux recrutements exclusif des donneurs volontaires non
rémunérés préconisé par l’OMS, au manque de donneurs sains ou à la présence de
donneurs non sûr, à l’utilisation inappropriée du sang et d’autre part aux modestes
ressources dont disposent les banques de sang. Cette pénurie en sang conduit non
seulement à de graves conséquences sanitaires, comme les décès dus aux hémorragies
BOLNI MARIUS NAGALO
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post-partum, mais contribue aussi
au risque accru de transmission du VIH ou des
hépatites virales car un stock insuffisant de produits sanguins entraine une baisse de
vigilance, le recours aux donneurs à risque et incite à transfuser du sang sans l’avoir testé
(OMS, 2009).
Le recrutement de donneurs de sang ne peut être sûr, moins coûteux et pratique que si
l’on recrute les donneurs au sein des groupes de population les moins exposés au risque
d’infection. Il s’avère être nécessaire pour les pays pauvres que de nouvelles stratégies
soient élaborées pour enrôler plus de donneurs de sang sûr et par la suite les encourager
à revenir régulièrement pour des dons de sang.
I.1.1- Les donneurs de sang en Afrique subsaharienne
Dans la plupart des pays de cette partie du monde, les donneurs de sang sont repartis en
3 catégories. Nous avons d’abord les donneurs rémunérés ou professionnels qui sont
essentiellement des personnes issus de milieux pauvres en Afrique, souvent en mauvaise
santé, mal nourries et vulnérables à
de nombreuses infections transmissibles par
transfusion sanguine. Les prévalences des marqueurs infectieux (VIH, AgHBs et anti-VHC)
sont plus élevées chez les donneurs rémunérés comparativement aux autres catégories de
donneurs de sang (Ahmed et al, 2007). Ce type de donneurs est de plus en plus exclu de la
politique du don de sang.
Ensuite, il ya les donneurs de sang familiaux/remplacements. L’exclusion de ce groupe de
donneurs de sang est intervenue en Afrique subsaharienne sur recommandation de l’OMS
et des bailleurs de fond (Allain, 2011). De nombreuses études ont montré que cette
catégorie de donneurs ne présentait pas plus de risque pour le don de sang que les
donneurs volontaires non rémunérés (Allain et al, 2010 ; Loua et Nze Nkoure, 2010 ;
Mbanya et al, 2010).
Les donneurs familiaux/remplacements représentent une alternative à la pénurie en
sang dans les régions reculées. En Afrique, ils font le plus souvent partie de la famille du
malade ou de son entourage et font des dons volontaires rarement rémunérés qui
peuvent être utilisés directement si le sang est compatible ou mis en réserve pour
d’autres patients.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Enfin, il ya les donneurs volontaires non rémunérés qui offrent leur sang par altruisme, de
leur plein gré et sont fortement recommandés par l’OMS. Ce sont des individus à majorité
jeunes , des étudiants ou scolaires qui font les dons soit directement au niveau des
centres de transfusion sanguine ou soit au cours des collectes mobiles (manifestations
socioculturelles etc.). Leur nombre ne suffit pas à satisfaire la demande en sang (9-11%)
en Afrique de l’Ouest (Allain, 2011) et contrairement à ce qui était attendu, les donneurs
volontaires non rémunérés ne garantissent pas une meilleure sécurité transfusionnelle.
En effet, les prévalences des marqueurs infectieux transmissibles par le sang sont
similaires chez les donneurs volontaires aussi bien que chez les donneurs
familiaux/remplacements comparativement à celles de la population générale (Allain,
2011). De plus le recrutement des donneurs volontaires non rémunérés nécessite la
mobilisation des moyens logistiques et matériels dont le coût est difficile à supporter par
les centres de transfusion. Dans les pays à revenus limités où parfois la disponibilité
continue en réactifs de dépistage, de personnels qualifiés et de ressources financières fait
défaut, Il faudrait peut être recourir à d’autres stratégies pour satisfaire une demande en
sang grandissante d’année en année.
I.1.2- Systèmes de surveillance de l’utilisation du sang et des produits sanguins
labiles (PSL).
Selon l’OMS, les données transmises par 96 pays indiquent que seuls 39% des hôpitaux
qui pratiquent des transfusions dans les pays à faible revenu, 62% dans les pays à revenu
intermédiaire et 80% dans les pays à revenu élevé ont un comité de transfusion. De plus,
40% des hôpitaux dans les pays à faible revenu, 71% dans les pays à revenu
intermédiaire et 92% dans les pays à revenu élevé comptent sur un système de
notification des manifestations indésirables de la transfusion. Il est de toute évidence
nécessaire de continuer à travailler pour garantir un approvisionnement sanguin sûr dans
le monde entier (OMS, 2009).
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Figure 1 : Dons de sang pour 1000 habitants en 2007 (ONUSIDA, 2009)
BOLNI MARIUS NAGALO
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I.1.3- La transfusion sanguine au Burkina Faso
Le Burkina Faso, est situé en Afrique de l’ouest. Il est limitrophe de six pays : le Mali au
Nord, le Niger à l’Est, le Benin au sud-est, le Togo et le Ghana au sud et la cote d’ivoire au
sud-ouest. Les habitants sont les Burkinabès et la capitale Ouagadougou est située au
centre du pays avec une population d’environ 1.800.000 habitants.
Figure 2 : Carte
du Burkina Faso
Le Burkina Faso est un pays ouest-africain, sahélien caractérisé par une fréquence élevée
de maladies endémo-épidémiques (paludisme, VIH/SIDA, méningites, carences martiales
etc.) responsables pour la plupart d’anémies. Le recours à la transfusion sanguine est
souvent fréquent pour le traitement des malades.
Avant 2005, il n’y avait pas une organisation bien structurée de la transfusion sanguine
au Burkina Faso. Seuls les deux centres Hospitaliers Universitaires de Ouagadougou et de
Bobo-Dioulasso disposaient chacun d’une banque de sang. Au niveau des centres
BOLNI MARIUS NAGALO
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régionaux de santé (CHR), la transfusion sanguine était assurée de manière informelle et
le laboratoire d’analyses biomédicales du CHR faisait office de banque de sang.
Les donneurs de sang étaient le plus souvent des proches du receveur ou des amis de la
famille du malade. Le dépistage des virus des hépatites B et C en transfusion sanguine au
Burkina n’a été possible qu’après les années 2000. Et les banques de sang de l’époque
utilisaient des tests rapides (TDR) pour le diagnostic des maladies transmissibles par
transfusion sanguine. Dans l’ensemble le secteur de la transfusion sanguine était marqué
par un manque de structures de coordination des activités transfusionnelles, avec des
équipements modestes et un personnel peu qualifié.
I.1.4- Profil sanitaire de la population au Burkina Faso.
Le profil sanitaire du Burkina est caractéristique des pays d’Afrique subsaharienne où le
système sanitaire est rudimentaire et ne possède que très peu de moyens :
Un taux de mortalité générale : 11,8% (RGGPH 06) et infanto juvénile : 141,9/1000.
Taux de mortalité maternelle : 307, 3 pour 100000 naissances vivantes
Décès dus à l’accès palustre chez les enfants de moins de 5 ans : 12,9%
Décès maternels imputables aux hémorragies 15% en 2007 et 26,1% en 2008.
En 2007, l’anémie représentait 7,39% des causes de décès à l’hospitalisation
(Annuaire stat 07).
En 2007, la prévalence du VIH dans la population générale était de 1,6%
(En 2008, le taux d’exclusion des poches de sang pour le VIH était de 2,5%).
I.1.5- Organisation des activités transfusionnelles au Burkina Faso
Le centre national de transfusion sanguine (CNTS) du Burkina Faso a vu le jour en
septembre 2000 par décret ministériel autorisant son ouverture. Avec pour objectif
général, assurer la couverture adéquate des besoins nationaux en produits sanguins dans
le respect de la sécurité du donneur et du receveur. Depuis l’effectivité de ses activités en
2006, la collecte des poches de sang par le CNTS n’a cessez d’augmenter passant de plus
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 27
de 20.000 dons en 2006 à près de 50.000 dons en 2009 (Figure 3). Cependant, l’ensemble
de ces dons ne couvre qu’une partie des besoins annuels en don de sang des zones
couvertes par les centres régions régionaux de transfusion sanguine.
Figure 3 : Evolution du nombre de poches collectées de 2006 à 2009 au CNTS.
I.1.6- Données sur la transfusion sanguine au Burkina Faso
En 2008, le CNTS comportait
4 centres régionaux de transfusion sanguine (CRTS)
fonctionnels. Le nombre de poche de sang collecté dans les zones de couvertures des
différents CRTS et hors de ces zones étaient respectivement de 37.761 soit 55,6 % et
30.207 soit 44,4% sur un total de 67.968 dons de sang. En cette même année le taux de
satisfaction des besoins cliniques en zone CRTS était de 78,9% avec un taux d’exclusion
pour marqueurs positifs de 25%, un taux de recrutement des donneurs bénévoles de
0,25% et un taux de fidélisation des donneurs de 18,06% (PS/CNTS-2011-2015).
Globalement environ 40% du sang utilisé en clinique a été collecté en dehors du système
de coordination national des CRTS directement dans les centres de santé. Ceci représente
environ 3,1 unités pour 1000 habitants montrant bien le déficit considérable du pays en
sang (Dahourou et al, 2010).
BOLNI MARIUS NAGALO
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Chapitre II : Maladies transmissibles par transfusion sanguine
II.1. Les principales causes des contaminations post-transfusionnelles
Dans les pays développés les risques les plus importants pour les transfusés sont la
surcharge volumique, les erreurs de transfusion et les contaminations bactériennes du
produit sanguin. A l’opposé en Afrique subsaharienne le risque de transmission d’une
maladie virale au cours d’une transfusion sanguine est relativement élevé au regard des
prévalences élevées des maladies transmissibles par le sang dans la population de
donneurs de sang (Vermeulen et al, 2009 ; Zou et al, 2011). La sécurité transfusionnelle
est mise à mal en Afrique subsaharienne essentiellement à cause des virus du VIH et des
hépatites B et C.
II.2. Les hépatites virales
Le terme d’hépatite virale est couramment utilisé pour désigner plusieurs maladies
cliniquement similaires mais qui sont distinctes sur le plan étiologique et
épidémiologique. Ce sont des maladies inflammatoires des tissus parenchymateux qui
s’expriment essentiellement au niveau du foie. Six virus ont été identifiés comme
responsables de la majorité des hépatites : il s'agit des virus A, B, C, D, E. Les modes de
transmission diffèrent selon les types de virus. Les virus des hépatites pénètrent dans
l’organisme soit par voie digestive (VHA), soit par voie sanguine (VHB et VHC), soit par
voie sexuelle (VHB surtout) (Snon et al ,1992 ; Cohen, 1999). Les virus A et B ont été
reconnus comme des entités entières depuis 1940, mais ils n’ont été formellement isolés
qu’en 1968 et 1973 respectivement. Il existait une troisième catégorie de virus
provoquant une forme d'hépatite qui n'était lié ni au virus A ni au virus B. Après une
période d'étude sur les hépatites, le virus responsable de la plupart des hépatites non A
non B (NANB) a été finalement identifié par Choo et al. (1989): il s’agit du virus de
l'hépatite C ou de l'hépatite post-transfusionnelle. Dans notre étude l’accent sera mis sur
les hépatites virales B et C (VHB et VHC).
BOLNI MARIUS NAGALO
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II.2.1. L’hépatite virale C (VHC).
Les virus responsables des hépatites A et B ont été décrits respectivement par Feinstone
et al. (1973) et Dane et al. (1970). Certaines hépatites virales persistaient alors qu’aucun
agent pathogène n'était identifié. Elles ne pouvaient être rattachées ni au virus A ni au
virus B. Pendant de nombreuses années, toutes les tentatives d’identification utilisant les
techniques conventionnelles de recherche des virus (culture, recherche d’effet
cytopathogène, microscopie électronique) se sont soldées par des échecs.
L’utilisation des techniques modernes de la biologie moléculaire a permis l’identification
du virus C (Choo et al, 1989) responsable des hépatites NANB à transmission parentérale.
En effet, la production d'une protéine virale PS5 (NS3/NS4a serine protéase) obtenue par
recombinaison génétique à partir d'un chimpanzé préalablement inoculé a permis à la
firme << Chiron >> de mettre au point un test pour la détection des anticorps sériques
(Choo et al, 1989). Des contrôles d’hybridation ont permis d’affirmer que ces anticorps
étaient dirigés contre une protéine codée par une autre partie du génome du virus de
l’hépatite NANB à transmission parentérale désormais appelée virus de l'hépatite C.
II.2.1.1. Caractéristiques du virus de l’hépatite C
C'est un virus à ARN de 50-60 nm de diamètre, enveloppé, très résistant à la chaleur dont
le génome est hautement variable. Il survit au moins deux jours à l’air libre. Son poids
moléculaire est voisin de 4.106 Da avec une densité de 1,09 à 1,11 en gradient de
saccharose. Par ses caractéristiques, il est apparenté à la famille des Flaviviridae dont les
membres les plus connus sont les virus de la fièvre jaune et de la dengue (type 2).
L’hépatite virale C, représente jusqu’à 85% de tous les cas d’hépatites posttransfusionnelles, et ne se propage, apparemment que par voie parentérale à partir de
donneurs atteints de formes subcliniques de l’infection.
II.2.1.2. Organisation génomique.
Le VHC contient un ARN simple brin de polarité positive d’environ 9400 nucléotides. Le
génome du virus peut être subdivisé schématiquement en 3 régions (région 5’ non
BOLNI MARIUS NAGALO
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codante, région correspondant au précurseur polypeptidique et la région 3’ non-codante).
La région 5’ non-codante mesure environ 329 à 341 nucléotides et contient les séquences
les plus conservées qui jouent un rôle majeur dans la réplication du génome et la synthèse
des protéines. En aval de la région 5', est situé le plus grand cadre de lecture ouvert
contenant 9379 nucléotides. Cette région comporte :
des gènes de structure :
Le gène C code pour la protéine C (capside), qui est composée de 114 acides aminés
avec une masse moléculaire de 13 000 Da et pourrait se lier à l’ARN génomique.
Les gènes E1 et E2/NS1 codent pour les protéines d'enveloppe ; la protéine E
comprendrait 198 acides aminés et aurait une masse moléculaire de 21 400 Da. Sa
portion C terminale pourrait interagir avec la membrane de la cellule hôte.
Les gènes non structuraux codent pour les protéines non structurales
(NS2…NS5) :
Le gène NS2 code pour une protéine très hydrophobe dont la fonction est Inconnue ;
elle serait souvent trouvée associer aux membranes cellulaires.
Le gène NS3 code pour la protéine NS3 ; celle-ci contient une hélicase qui
interviendrait dans la réplication de l'ARN génomique et une protéase qui serait
impliquée dans la fabrication des protéines non structurales à partir des polypeptides
précurseurs.
La protéine NS4 est très hydrophobe et serait liée à la membrane.
Le gène NS5 coderait pour plusieurs fonctions pour la plupart inconnues en dehors
d'une ARN polymérase ARN dépendante.
C’est surtout dans la région 3' que le virus C présente des homologies de lecture avec les
Flaviviridae notamment pour la région NS3 et NS5. En revanche, la région structurale 5'
paraît très différente.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Figure 4 : a. Structure du virus de l’hépatite C (VHC) ; b. Gènes de structure et organisation
génomique du VHC.
II.2.1.3-Réplication du VHC et variabilité virale
Le VHC est difficile à cultiver mais quelques clones qui se répliquent in vitro ont été
décrits par plusieurs études (Bartosch et al, 2003 ; Drummer et al, 2003 ; Hsu et al, 2003).
Les systèmes de réplications in vitro du VHC ont été longuement présentés dans la
minireview de Von Hahn et Rice (2008).
Toutefois, des analogies avec d’autres virus à RNA permettent d’établir l’hypothèse
suivante. Le VHC pénètre dans la cellule après s’être lié avec un récepteur de surface
cellulaire. Dans ce cas, il semblerait que la protéine de l’enveloppe virale E2 se lie
spécifiquement aux 7 protéines CD81, molécule de surface cellulaire largement exprimée
à la surface des cellules de nombreux organes, dont le foie. Une fois lié, le virus est inclus
par endocytose dans un endosome, à l’intérieur duquel le pH acide entraîne une altération
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 32
des protéines de l’enveloppe, responsable d’une fusion avec la membrane endosomiale.
Le RNA viral est ainsi relâché dans le cytoplasme, jouant le rôle de RNA messager pour la
réplication virale, cette dernière s’effectuant en association avec le réticulum
endoplasmique à l’intérieur duquel la synthèse de la polyprotéine d'abord, et, ensuite, ses
différents clivages protéolytiques décrits plus haut sont effectués. L'expression de la
réplicase (codée par la région NS5B) permet la transcription de l'ARN génomique dans
son complément (le brin négatif), de longueur unitaire, à partir duquel de nombreuses
copies de l’ARN génomique seront synthétisées par le même enzyme viral. Ces multiples
copies d'ARN viral génomique sont ensuite encapsidées et assemblées dans des nouvelles
particules virales, libérées à l’intérieur de vésicules sécrétoires.
Un grand nombre de variantes virales peut être retrouvé dans le plasma et dans le foie
d’un seul et unique individu infecté, à chaque moment donné. Le VHC existe donc chez cet
individu, comme pour la plupart des virus à ARN, sous forme de multiples variantes
virales, dont l'ensemble est appelé "quasi-espèce"(Kato et al, 1994 ; Pawlotsky et al,
1999 ; Okuda et al, 1999 ; Löve et al, 2004) ne différant parfois les unes des autres que par
un nucléotide sur l’ensemble du génome.
Durant la réplication, les mutations du génome viral se font au hasard et la viabilité de ces
nouvelles populations dépendra de la localisation de la mutation. En effet, une altération
de la structure des protéines virales ou du RNA peut affecter la réplication virale et donc
la transmission de l’information génétique aux molécules "filles". Il y aura donc des
variantes majoritaires bien adaptées aux facteurs extérieurs (système immunitaire,
facteurs intracellulaires, etc) et des variantes minoritaires plus ou moins défavorisées.
Par exemple, une souche virale qui possède une mutation au sein du segment
hypervariable (HVR-1) de la protéine de l’enveloppe E2, sera favorisée en terme de survie
à l’intérieur de l’hôte, car cette mutation évite la liaison d’anticorps neutralisant
préexistant, dirigés contre les protéines de l’enveloppe.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 33
A.
Figure 5 : (A) Cycle de vie du VHC
Attachement, internalisation, décapsidation, synthèse protéique/réplication, assemblage
et libération des virions (Stephen J. Polyak, Université de Washington, www.document)
(B) La protéine de capside du VHC entraine l’assemblage de gouttelettes lipidiques (LD).
Les gouttelettes lipidiques se fixent à la capside puis au NS5a et autres protéines non
structurales. (Nature Cell Biology, vol 9, No 9, sept 2007)
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 34
B.
II.2.1.4. Le génotype viral
En plus de la grande variabilité virale retrouvée au sein d’un même individu, il existe
également une importante hétérogénéité génétique à travers une population d’individus.
Une évaluation phylogénique, effectuée à travers de nombreuses zones géographiques,
suggère la présence de 6 principaux génotypes numérotés de 1 à 6 (Simmonds et al,
1993). A l’intérieur même d’un génotype, une souche virale peut être regroupée en soustypes, lesquels ont en commun 75% à 85% de leurs séquences nucléotidiques. Les
différents sous types identifiés par des lettres minuscules (environ 80 sous-types). La
distribution des génotypes et des sous génotypes du VHC est variable selon les régions
du globe et peut être utilisée comme marqueur épidémiologique de l'hépatite C.
Les génotypes 1 à 3 ont une distribution mondiale (Simmonds, 1995), alors que les
génotypes 5 et 6 sont communs aux pays d’Asie du Sud-est et à l’Afrique du Sud (PrabdialSing et al, 2011; Pybus et al, 2009). Le génotype 4 est prédominant en Afrique centrale
(Ndong-Atome et al, 2008; Cantaloube et al, 2008) et septentrionale (Kamal, 2011; Antaki
et al, 2010). Il a été montré une prédominance des géntoypes 1 et 2 en Afrique de l’Ouest
et notamment au Burkina Faso (Jeannel et al, 1998; Candotti et al, 2003). Les génotypes
du VHC seraient associés à certains modes de transmission.
BOLNI MARIUS NAGALO
Le génotype 1b serait
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associé à la transfusion sanguine (Keskin et al, 2010) alors que les génotypes 1a et 3a
seraient associés à la toxicomanie intraveineuse (Elasifer et al, 2010).
Figure 6 : Arbre phylogénétique représentant les différents génotypes et sous-types du VHC
et dérivé de l’analyse des séquences d’une partie de la région NS5B
La longueur des branches est proportionnelle à la distance génétique. Les amplicons sont issus de sérums
de patients donneurs de sang chroniquement infectés par le VHC de provenance géographiques diverses.
Les six groupes numérotés de 1 à 6 correspondent à la classification actuelle. Chaque génotype, à l’exception
du génotype 5, est subdivisé en de nombreux sous-types indiqués en lettres minuscules. Certaines souches
sont numérotées de 7 à 11 : elles ont été classées lors de leur découverte comme de nouveaux génotypes
mais ont été regroupées par la suite avec les génotypes 3 et 6.
D’après Simmonds (J. Hepatol, 1999).
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 36
II.2.1.5. Répartition géographique
Depuis la mise au point des moyens de dépistage du VHC, des études prospectives et
même rétrospectives ont permis d’étudier le virus dans l’espace (Esteba et al, 1999 ; Kew
et al, 1990). On sait aujourd’hui que le virus est ubiquitaire, (présent dans tous les
continents) avec cependant une prédominance dans certains pays industrialisés comme
le Japon (16%) (Snon et al, 1992).Ceci s’expliquerait par les habitudes de la modernité qui
favoriseraient la propagation du virus dans la population : toxicomanie à la seringue,
dialyse, greffes d’organes et transfusion. Environ 170 millions de personnes (3%) dans le
monde sont infectées par le VHC (SIDA infos services). Au début des années 2000, il y
avait environ 4 millions de porteurs chroniques aux Etats unis (Alter et al, 1999). En
Europe, la proportion de sujets atteints varie de 0,5 à 2% en fonction des pays avec un
gradient Nord-Sud. En Europe de l’Ouest, 5 millions de personnes sont touchées. En
Europe de l’Est, certains pays sont particulièrement touchés jusqu’à 3 à 4% (OMS, 2000).
L’infection est chronique chez 80% des personnes infectées.
En Afrique les prévalences du VHC confirmées par l’utilisation des tests NAT ont permis
de mettre en évidence des prévalences 5 fois inférieures à celles décrites par les tests
sérologiques usuels. Par conséquent les prévalences confirmées du VHC se situent autour
de 1% (Candotti et al, 2003 ; Vardas et al, 1999 ; Ampofo et al, 2002 ; Zeba et al, 2012).
L’Egypte apparaît comme ayant la haute prévalence : les anticorps Anti-VHC ont été
retrouvés chez 22% des nouvelles recrues de l’armée et chez 16,4 % des enfants avec
hépatomégalie (Abdoul et al, 1994). Ces prévalences élevées du VHC en Egypte seraient
associées aux traitements anti schistosomiases dispensés avec du matériel mal stérilisé
(Frank et al, 2000).
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 37
Figure 7 : Répartition de l'infection par le VHC dans le monde (OMS, 1997)
II.2.2. L’hépatite B (VHB)
L'hépatite B est une hépatite virale due à une infection par le virus de l'hépatite B (VHB)
et entrainant une inflammation du foie. Les symptômes de la maladie aiguë sont
essentiellement une inflammation du foie, avec ou sans ictère et des troubles digestifs
avec nausées et vomissements. A ce stade l’évolution est souvent bénigne même si
l’hépatite B est la forme la plus grave des hépatites virales, il existe aussi des formes
fulminantes rares à évolution mortelle. L'infection passe souvent inaperçue lors de
l'infection aigue et chez le patient porteur du virus. Dans près d'un cas sur dix, et chez
90% des enfants infectés par leurs mères, l'hépatite B aiguë ne guérit pas et devient une
infection chronique. Le porteur chronique n'a pas de symptôme apparent mais est
susceptible de contaminer son entourage. En cas d'hépatite chronique active, les
symptômes peuvent être une fièvre modérée, une grande fatigue, des troubles digestifs
(nausées, vomissements, douleurs abdominales), une jaunisse, des urines foncées ou des
selles décolorées. La Cirrhose du foie et le cancer du foie peuvent être la conséquence
d’une Hépatite B. La gravité potentielle de l’hépatite B est constituée par le risque
d’évolution vers une hépatite chronique B qui peut se compliquer d’une cirrhose du foie
BOLNI MARIUS NAGALO
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et d’un cancer du foie, une maladie mortelle avec un taux de réponse très faible à la
chimiothérapie actuelle.
La transmission du virus se fait par l'intermédiaire des liquides et sécrétions biologiques.
Les principaux modes de transmission sont les rapports sexuels, les injections chez les
toxicomanes, les transfusions sanguines à risque, la transmission de la mère à l'enfant lors
de l'accouchement et le contact étroit avec une personne infectée et particulièrement le
contact entre petits enfants en Afrique. Une fois dans le sang, le virus atteint le foie et se
multiplie dans ses cellules, les hépatocytes. Le système immunitaire détruit les cellules
infectées, entrainant une inflammation du foie.
II.2.2.1. Génome du virus de l’hépatite B (VHB)
Le génome VHB (Figure 8) se présente sous la forme d’un ADN court
circulaire
partiellement bicaténaire de 3.2 kb (Robinson et al, 1974; Summers et al, 1975). Cette
conformation circulaire est liée à la présence d’extrémités 5’ cohésives. (Sattler et
Robinson, 1979). Le traitement de l’ADN à la nucléase S1, qui dégrade les extrémités
monocaténaires, fait disparaître cette structure au profit d’une conformation linéaire. Les
deux brins de l’ADN génomique ne sont pas symétriques. Le brin (-) est de longueur
unitaire et lié de façon covalente à une protéine, la polymérase virale (Ganem et al, 1982;
Gerlich et Robinson, 1980; Molnar-Kimber et al, 1983 ; Bartenschlager et Schaller, 1988).
L’existence de ce lien a été démontrée indirectement par l’extraction organique d’un
complexe ADN-protéine. Le traitement de ce complexe avec de la protéinase K avant
l’extraction rendait l’ADN indétectable dans la phase organique. De plus, la migration sur
gel d’électrophorèse de l’ADN avant traitement à la protéinase K était plus courte après
digestion.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 39
Figure 8 : Organisation du génome du virus de l’hépatite B (Blanchet ,2007)
Les trois quarts du génome sont impliqués dans deux ORF (Open reading frame), dans des
phases de lecture différentes. Les ORF sont au nombre de quatre sur le génome et sont
portées par le brin (+). Ils codent pour les protéines d’enveloppe, l’antigène du core
(AgHBc), l’antigène e (AgHBe), la polymérase virale, et la protéine X (HBx). La plus grande
ORF est celle codant pour la polymérase virale, présente à l’extrémité 5’ du brin (-) du
génome (Bartenschlager et Schaller, 1988; Bosch et al, 1988). L’ORF preC/C possède deux
codons d’initiations. Le plus interne sert à la synthèse de l’AgHBc (Pasek et al, 1979). Celui
situé en amont permet la synthèse de l’AgHBe (Takahashi et al, 1980; Will et al, 1987) qui
est un marqueur de la réplication virale (Rigg et Schaller, 1992). L’ORF X code pour l’HBx,
une protéine de régulation complexe requise pour l’infection in vivo, et qui module
l’expression de gènes viraux et cellulaires (Rossner, 1992). Cette protéine est également
impliquée dans la pathogenèse liée au VHB (Bouchard et Schneider, 2004). L’ORF pre-S/S,
code pour les protéines d’enveloppe et chevauche l’ORF P dans la phase +1 (Valenzuela et
al, 1979). Les protéines d’enveloppe, nous le verrons plus tard, sont impliquées dans la
morphogenèse et l’infectiosité des virions du VHB mais également des virions du virus de
l’hépatite D. Comme mentionné plus haut, celles-ci sont au nombre de trois, la petite de 24
kd (S-AgHBs), la moyenne de 33 kd (M-AgHBs) (Machida et al, 1984; Persing et al, 1985;
BOLNI MARIUS NAGALO
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Stibbe et Gerlich, 1983), et la grande de 39 kD (L-AgHBs). La séquence ADN codant pour
les protéines d’enveloppe à été identifiée par alignement de la traduction de l’ADN du
VHB avec la séquence de l’extrémité N-terminale de S-AgHBs obtenue par la technique de
dégradation d’Edman (Valenzuela et al, 1979). Cet alignement a révélé que l’ORF codant
pour S-AgHBs était ouverte 400 nucléotides en amont de l’AUG de S-AgHBs (AUG-S) et
que cette région 5’, appelée pré-S, pouvait être divisée en deux sous-régions (pré-S1 et
pré-S2), chacune possédant un codon d’initiation (AUG). Cette information sur
l’organisation du génome a permis de comprendre l’origine de la présence des protéines
M-AgHBs et L-AgHBs, détectées préalablement à l’aide d’anticorps anti-AgHBs (Gerin et
al, 1969). Ces deux protéines sont présentes à des concentrations bien inférieures à celle
de S-AgHBs dans un sérum infectieux (15% des AgHBs totaux pour M-AgHBs, 1 à 2% pour
L-AgHBs). Malgré sa très faible concentration, L-AgHBs joue un rôle majeur dans la
propagation du VHB.
II.2.2.2. Cycle de réplication du VHB
La première étape du cycle infectieux du virus commence par son attachement aux
hépatocytes via
la grande protéine d’enveloppe Pre-S/S (Figure 10). Le mode
d’internalisation des virions reste à ce jour encore peu connu, mais il aboutit au
relarguage de la capside dans le cytoplasme et à son adressage sous sa forme assemblée
dans les paniers nucléaires de la cellule infectée (Rabe et al, 2003). Ces étapes
d’attachement et d’entrée sont très spécifiques du tissu et de l’espèce ciblés et sont à
l’origine du tropisme limité des Hepadnaviridae. La capside est démantelée dans le noyau,
et l’ADN viral partiellement bicaténaire est relargué (Rabe et al, 2003) puis réparé en
ADN circulaire fermé de façon covalente (ADNccc). Cet ADN est ensuite transcrit en
différents ARN dont la traduction donne naissance aux composants nécessaires à
l’assemblage de nouveaux virions. Ces composants sont : la polymérase virale,
responsable de la synthèse de l’ADN génomique, la protéine de capside, et les protéines
d’enveloppe virales.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 41
Figure 9: Arbre phylogénétique des Orthohepadnavirus (Kidd-Ljunggren et al, 2002)
Les souches sont représentées par le numéro d’accession dans la base de données Genbank. Les
souches appartenant aux différents génotypes du VHB (A à G) sont différenciées par des halos de
couleur. Le WMVHB ne peut pas être montré à cette échelle du fait d’un éloignement phylogénétique
trop important.
Le plus grand des transcrits, l’ARN pré génomique, de taille supérieure à celle du génome
(3.5 kb), est inclus dans les capsides lors de leur assemblage et sert de matrice à la
synthèse du brin (-) du génome du VHB par transcription inverse. Le brin (+) est ensuite
synthétisé à l’intérieur de la capside. Les nucléocapsides peuvent suivre deux voies
différentes. Une partie d’entre elles sont réacheminées vers le noyau de manière à
accroître la quantité d’ADNccc nucléaire. L’autre partie interagit avec les protéines
d’enveloppe du VHB à la face cytosolique du réticulum endoplasmique (RE) et
bourgeonne dans la lumière du RE sous forme de virions matures. Les virions sont
ensuite sécrétés dans le milieu extracellulaire par la voie constitutive de transport
vésiculaire (Ganem et Schneider, 2001).
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 42
Figure 10 : Vue d’ensemble du cycle de réplication viral VHB (adapté de Ganem et Prince,
2004)
II.2.2.3. Evolution des marqueurs virologiques au cours d’une infection au VHB
Les marqueurs directs spécifiques du VHB détectables dans le sérum sont les AgHBs et
HBe et l’ADN viral. L’Ag HBc est indétectable dans le sérum, sa localisation étant intra
hépatocytaire. Les marqueurs indirects de l’infection par le VHB sont les anticorps dirigés
contre les Ag viraux, dont les Ac anti-HBs, les anti-HBc, et les Ac anti HBe. La cinétique des
marqueurs virologiques détectables dans le sérum diffère selon qu’il s’agit d’une infection
aiguë spontanément résolutive ou d’une infection évoluant vers une hépatite chronique.
La connaissance des différents profils sérologiques permet de déterminer le stade de
l’infection dans la plupart des cas.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 43
Marqueurs directs
L’AgHBs
L’AgHBs est le principal marqueur d’une infection actuelle par le VHB. Il est dosé dans le
sérum à l’aide de tests sérologiques immunoenzymatiques de type ELISA. Le seuil de
détection est de 1 à 5 ng/ml en fonction des trousses utilisées. Des réactions faussement
négatives existent, du fait de mutants ou d’Ag masqués au sein de complexes.
La capacité d’un test ELISA à détecter l’AgHBs dépend des epitopes cibles des Ac utilisés
pour recouvrir la phase solide (Ac de capture) ou utilisés dans la phase liquide (Ac de
détection). Tous les réactifs qui utilisent dans les phases solide ou liquide un seul Ac
monoclonal peuvent théoriquement être mis en défaut par une mutation de la séquence
cible de cet Anticorps (Gerlich, 2004 ; Coleman, 1999 ; Moerman, 2004)
L’Ag HBc
L’AgHBc n’est pas détecté dans le sérum par les tests ELISA classiques. En effet, il y est
présent masqué au sein des particules virales et sous formes d’immuns complexes
classiques du fait d’un large excès d’Ac
anti-HBc. Sa détection nécessite une
ultracentrifugation et une méthode d’immunocapture, mais n’est pas réalisée en pratique
courante. Par ailleurs, l’AgHBc peut être mis en évidence dans les hépatocytes par
immunofluorescence ou immunohistochimie.
L’Ag HBe
L’AgHBe est un marqueur de multiplication virale. Il est dosé dans le sérum à l’aide de
tests sérologiques immunoenzymatiques de type ELISA.
L’ADN du VHB
L’ADN du VHB peut être quantifié dans le sérum, soit par des techniques d’hybridation
moléculaire, éventuellement associées à une amplification du signal, soit par des
techniques d’amplification par PCR classique ou en temps réel (Denis, 2004 ; Pawlotsky,
1997 ; 2000). Le seuil de détection des techniques d’hybridation se situe entre 1000 et
5000 copies de génome /ml de sérum, alors que les techniques les plus sensibles, qui font
appel à la PCR en temps réel, ont des seuils de détection pouvant descendre à 21
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 44
copies/ml. L’OMS a établi un étalon international permettant de standardisé les tests de
quantification de l’ADN du VHB (Saldanha, 2001).
Le suivi régulier de la charge virale est utile pour évaluer le niveau de réplication virale et
vérifier l’efficacité d’un traitement antiviral. Il est recommandé que le suivi virologique de
la charge virale d’un patient soit fait si possible à l’aide du même test.
En l’absence de réplication virale, L’ADN du VHB peut se maintenir sous la forme intégrée
ou non dans le génome des cellules infectées ; il n’est pas détectable dans le sérum.
Marqueurs indirects
Ac anti-HBs
Les Ac anti-HBs apparaissent progressivement au cours de l’élimination virale, 1 à 10
semaines après la disparition de l’AgHBs. Il s’agit d’Ac neutralisants. Leur apparition
signe soit la résolution d’une hépatite B, soit une protection post-vaccinale. Ils sont
recherchés dans le sérum par des techniques ELISA, avec un seuil de détection de 2 à 5
UI/L. Un titre d’anticorps supérieur à 10UI/L est considéré comme protecteur.
Ac anti- HBc
Les Ac anti-HBc apparaissent précocement dans le sérum, quelle que soit l’évolution de la
maladie. Ce ne sont pas des Ac protecteurs mais seulement les témoins d’une infection par
le VHB. Les Ac anti-HBc de classe IgM peuvent être spécifiquement recherchés. Leur
présence dans le sérum témoigne généralement du caractère aigu de l’infection. Toutefois
ils peuvent aussi être détectés, mais à des taux plus faibles, au cours de la phase de
clairance immune d’une hépatite chronique (White, 2003).
Ac anti-HBe
L’apparition des Ac anti-HBe est généralement en faveur d’une évolution favorable. ils
sont recherchés dans le sérum par des techniques ELISA.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 45
Profils sérologiques
Le diagnostic de l’hépatite aigue est fondé sur la présence dans le sang des l’AgHBs et des
Ac anti-HBc de type IgM dans un contexte cytolytique hépatique.
L’AgHBs est le premier marqueur détecté dans le sérum, il apparait pendant la période
d’incubation, en moyenne de deux semaines à trois mois après le contage. Cette phase
d’incubation correspond à la fenêtre immunologique silencieuse dont la durée est estimée
à 56 jours et pendant laquelle le VHB est indétectable par les tests sérologiques
classiques.
Les Ac anti-HBc totaux apparaissent 2 à 4 semaines après l’AgHBs, pendant la phase
aigue de la maladie. L’AgHBe
apparait peu de temps après l’AgHBs puis disparait
rapidement (sa persistance au-delà de 3 semaines après début des manifestations
cliniques serait un indicateur de passage à la chronicité). Lors de la phase aigue de
l’hépatite, environ 1013 virions sont produits par jour et la charge virale peut atteindre
1010 copies de génome/ml
de sérum. La recherche de ces deux marqueurs de
multiplication virale n’est pas utile au cours de l’hépatite aigue.
Figure 11 : Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’infection au VHB
(http://t2.gstatic.com/images)
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 46
Convalescence d’hépatite B aiguë
Dans le cas d’une hépatite B aigue spontanément résolutive, l’AgHBs persiste pendant 1 à
4 mois, puis disparait plusieurs semaines après normalisation des ALAT. Les IgM anti-HBc
disparaissent ensuite. On note aussi une séroconversion dans le système HBe et le niveau
d’ADN du VHB décroit progressivement jusqu'à devenir indétectable. Les Ac anti- HBs
apparaissent 2 à 8 semaines après la disparition de l’Ag HBs. Pendant la fenêtre
sérologique entre la disparition de l’AgHBs et l’apparition des Ac anti-HBs, les Ac anti-HBc
peuvent apparaitre isolement positifs. Le profil classique à distance d’une hépatite
résolue associe la présence des Ac anti-HBs et des Ac anti-HBc.
Hépatite fulminante due au VHB
La survenue d’une hépatite fulminante, lors d’une hépatite B aigue est marquée par la
présence d’IgM anti-HBc à des titres élevés. En revanche, les autres marqueurs (Ag HBs,
Ag HBe, Ac anti-HBs et ADN du VHB) sont inconstamment retrouvés dans le sérum.
II.2.2.4 Epidémiologie et répartition géographique du virus de l’hépatite B (VHB)
L'hépatite B est l'une des maladies humaines les plus fréquentes. Selon l'Organisation
mondiale de la santé (OMS) il y aurait 350 millions de porteurs du virus dans le monde. Sa
répartition s'explique par son mode de transmission et l'efficacité de la réduction des
risques est variable suivant le niveau socio-économique du pays.
La proportion de la population mondiale actuellement infectée par le virus est estimée,
suivant les différentes évaluations entre 3 et 6%, mais jusqu'à un tiers de la population a
déjà été exposé au virus. En 2005, environ 2 milliards de personnes étaient infectés avec
plus de 350 millions de porteurs chroniques pouvant transmettre le virus pendant des
années. Ces porteurs chroniques ont un risque élevé de décéder des suites d'une cirrhose
du foie ou d'un cancer du foie, ces deux maladies faisant environ un million de morts
chaque année.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Figure 12: Répartition géographique du risque de contamination par l'hépatite B en
2005(www.wikipedia.org/wiki/Fichier.HBV_prevalence_2005.svg)
Haute : prévalence supérieure à 8 %.
Moyenne : entre 2 et 7 %.
Basse : inférieure à 2 %.
Epidémiologie de l’hépatite B au Burkina Faso
Le Burkina Faso est situé dans une zone caractérisée par de fortes prévalences au VHB.
Dans certaines régions du pays les prévalences atteignent 20%. Des études ont montré
des prévalences de l’AgHBs située entre 7,9 et 12,1% respectivement chez les
professionnelles de la santé à Nanoro et chez les femmes enceintes des grandes villes de
Ouagadougou et de Bobo-Dioulasso (Pietra, 2008; Ilboudo et al, 2007; Nacro et al, 2000 ;
Simpore et al, 2006). Chez les donneurs de sang , des prévalences de 14,3% et 17% ont
été observées dans la zone rurale de Nouna et dans la ville de Ouagadougou (Collenberg
et al, 2006). Dans ces deux zones, les mêmes auteurs ont rapporté des prévalences en Ac
anti HBc de 69,6 % et de 76,4 % en zone rurale et urbaine. Ces prévalences sont
supérieures à celle de 49,0% trouvée par Pietra et al. (2008).
Les modes de vie des différentes communautés vivants au Burkina Faso pourraient
expliquer les fortes prévalences trouvées (Animisme, circoncision, tatouages ethniques et
vie communautaire). L’augmentation de la prévalence des marqueurs du VHB avec l’âge
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 48
peut s’expliquer avec le cumul des risques de contact avec le virus par transmission
parentérale et sexuelle au cours de la vie adulte.
Peu d’études se sont intéressées aux génotypes du VHB en circulation au Burkina Faso.
Une seule a montré la prédominance du génotype E au Burkina Faso (Mulders et al,
2004). Ce génotype est aussi le plus prévalent en Afrique subsaharienne et dans la région
ouest africaine (Candotti et al, 2007 ; Huy et al, 2006 ; Fujiwara et al, 2005).
II.2.3. Facteur delta : agent de l'hépatite D
L'agent de l'hépatite D est un virus défectif à ARN c’est-à-dire dépendant du virus B pour
sa réplication et son expression. L'agent delta survient par coïnfection avec le VHB ou
alors par surinfection d'un porteur du VHB. Ce nouveau virus est proche des viroïdes des
plantes, c’est le plus petit virus humain identifié à ce jour. Le virus Delta est endémique
dans certaines populations et notamment dans les forêts équatoriales de l’Afrique
Centrale et de l’Amazonie au Brésil où il est responsable d’épidémies d’hépatites
fulminantes. Il s’est également disséminé via la toxicomanie en Europe de l’Est et dans les
pays occidentaux. L'agent delta, tout en diminuant la réplication du VHB, aggrave
considérablement la maladie hépatique avec des formes fulminantes et de manière
beaucoup plus fréquente une accélération de la fibrose hépatique et la survenue de
cirrhoses et de carcinome hépatocellulaire. La détection de l'ARN delta permet de
dépister les infections actives. L'hépatite D est en quelque sorte une surinfection d’un
patient porteur chronique du VHB ou d’une co-infection au cours d’une hépatite aigüe.
Cette maladie est négligée en raison de son faible impact dans les pays développés et il
n’existe aucun vaccin. L'hépatite delta ne fait qu'incrémenter l'effet destructeur de
l'hépatite B. Son temps d'incubation est donc le même que celui du virus dont elle dépend.
Le facteur Delta se transmet de la même manière que l'hépatite B, par piqûre, transfusion,
tatouage, piercing et contact sexuel non protégé. Les porteurs de l'hépatite B ainsi que les
personnes souffrant d'une hépatite fulminante sont particulièrement sensibles au facteur
delta.
BOLNI MARIUS NAGALO
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II.2.4. Le virus de l'hépatite A (VHA)
Le virus de l'hépatite A (VHA) est un virus à ARN appartenant à la famille des
Picornaviridae. C'est un virus nu (non enveloppé), donc très résistant dans le milieu
extérieur et aux agressions physico-chimiques. Il se transmet par voie digestive orofécale
soit directe (manuportée) soit indirectement par l'eau souillée, contaminée par des selles
infectées par le virus d'où une plus forte incidence dans les pays où les réseaux d'eau
potable et les stations d'épuration sont de qualité insuffisante.
L’hépatite A est une
importante maladie infectieuse qui peut être prévenue par la vaccination. Les éclosions
d'hépatite A sont étroitement liées à la consommation d'eau contaminée par le VHA. Les
contacts familiaux ou sexuels avec une personne infectée et les voyages dans les pays où
l'hépatite A est endémique augmentent le risque de contracter la maladie. Parmi les cas
d'infection, environ 70 % des adultes et 30 % des jeunes enfants présentent des
symptômes cliniques tels que la fièvre, un malaise et la jaunisse. Le stade aigu de la
maladie dure habituellement plusieurs semaines et il n'existe pas de porteur chronique
du VHA.
La transmission du VHA par transfusion sanguine n'a pas encore été démontrée;
cependant, le VHA peut être transmis par l'injection de produits sanguins à des
hémophiles. Comme on utilise des mélanges de plasma venant de donneurs multiples
pour préparer les produits sanguins, et comme les solvants-détergents servant à
l'inactivation virale ne sont pas efficaces contre le VHA, le risque de transmission du VHA
par les produits sanguins, aussi faible soit-il, existe tout de même. Au Burkina Faso, les
unités de sang ne sont pas systématiquement soumises à des tests de dépistage des
anticorps anti-VHA.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Figure 13: Répartition géographique du risque de contamination par l'hépatite A en 2005 :
www.wikipedia.org/wiki/Fichier.HBA_prevalence_2005.svg)
Haute : prévalence supérieure à 8 %.
Moyenne : entre 2 et 7 %.
Basse : inférieure à 2 %.
II.3. Le virus de l'immunodéficience humaine acquise (VIH/SIDA)
L'infection par les virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et 2) et le syndrome
d'immunodéficience acquis (SIDA) causé par le VIH constituent d'importants problèmes
de santé publique dans le monde et principalement en Afrique subsaharienne. En 2007, la
prévalence du VIH (1 et 2) dans la population Burkinabé était de 1,7% (Collenberg et al,
2006). Des études ont montré des séroprévalences avoisinant 2% chez les donneurs de
sang de premier don des centres de transfusion du pays (Nagalo et al, 2011).L'infection
par le VIH cause une vaste gamme de maladies et son évolution clinique varie beaucoup,
allant de symptômes grippaux bénins au sida, syndrome potentiellement mortel qui
constitue le dernier stade de l'infection par le VIH.
Le VIH est transmis par les contacts sexuels, le partage d'aiguilles ou de seringues
contaminées, les transfusions de constituants sanguins et l'exposition nosocomiale à du
sang ou à des liquides organiques contaminés. Il peut également être transmis de façon
verticale de la mère à l'enfant. Parmi les facteurs qui peuvent contribuer à la transmission
du VIH par transfusion sanguine, notons la période de latence sérologique (courte période
virémique durant laquelle le donneur, à un stade très précoce de l'infection, obtient
BOLNI MARIUS NAGALO
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souvent un résultat négatif à un test de sélection des donneurs), la mauvaise sélection des
donneurs et les erreurs de diagnostic au laboratoire (problème de contrôle de qualité de
la plupart des laboratoires en Afrique subsaharienne). Cependant, l’une des principales
sources d’infections par transfusion sanguine demeure toutefois le sang recueilli durant la
période de latence sérologique du donneur.
Les techniques de laboratoire telles que les tests sérologiques détectant à la fois le VIH-1
et le VIH-2, le test de dépistage associant l'antigène p24 contre le VIH-1 et le test d'acide
nucléique pour le VIH (PCR du VIH-1) ont considérablement réduit la période de latence
sérologique. Cette période, qui était de 42 jours dans les années 80, alors qu'on avait
recours au titrage des anticorps, n'est plus que de 15 jours avec le test de dépistage de
l'antigène p24 contre le VIH-1/2 et de 11 jours avec le dépistage génomique viral (DGV).
En Afrique du sud, le risque de transmission du VIH par transfusion sanguine était estimé
à 1 pour 45.765 000 dons entre 2005 et 2009 (Vermeulen et al, 2009). Au Kenya il a été
montré que le risque était de zéro pour 12.435 dons avec le test de dépistage de l'antigène
p24 contre le VIH-1 (Basavaraju et al, 2010). L’introduction du DGV a permis une
réduction drastique du risque résiduel de la transmission du VIH-1 et du VHC en Afrique
du sud (Fang et al, 2003).
II.3.1. Caractéristiques virologiques du VIH
Le VIH est un virus à ARN enveloppé qui possède, une nucléocapside dense excentrée
quelquefois en forme de trapèze ou de barreau. En microscopie électronique, les deux
virus (VIH-1 et VIH-2) présentent une morphologie similaire. La nucléocapside est
constituée par des protéines internes du virus, la transcriptase inverse et de l’ARN viral.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Figure 14 : Structure du VIH (http://www.museum-grenoble.fr)
II.3.2. Génome et propriété structurale du VIH
Le génome du VIH est constitué uniquement de deux molécules d’ARN monocaténaires de
9,2 kb et de polarité positive, disposant à chaque extrémité d’une région R identique,
indispensable à la transcription inverse. Les ARN génomiques viraux ont une structure
d’ARNm (ils possèdent une coiffe en 5’ et sont polyadénylés en 3’). Il contient dans sa
capside des enzymes, la transcriptase inverse, l’intégrase, la protéase et la ribonucléase
ainsi que deux (2) molécules d’ARN identiques (enveloppées par la nucléocapside). Le
noyau viral est entouré d’une coquille de forme conique appelée p24, qui est la protéine
centrale majeure et est identique pour le VIH-1 et le VIH-2. Cet ensemble constitue la
capside qui est recouverte par deux enveloppes : la coquille protéique ou p17 et la
bicouche lipidique traversée par des protéines membranaires (gp 41 attachées à la
matrice p17 et aux gp120) qui font saillie à la surface de la particule virale. Ce sont ces
saillies et ces protéines d’enveloppe qui différencient le VIH-1 du VIH-2. Les protéines
correspondantes du VIH-2 sont les gp110/130 et gp36. Comme tous les rétrovirus, les
VIH-1 et VIH-2 sont produits par bourgeonnement à la surface des cellules infectées. Les
VIH-1 et 2 se différencient par les gènes vpu et vpx.
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La structure du virus.
La structure du VIH comprend de l’intérieur vers l’extérieur :
Une enveloppe constituée de glycoprotéines gp120, gp41 et d’une double couche de
phospholipides;
Une matrice formée de glycoprotéines gp17;
Une capside constituée de glycoprotéines gp24.
Le virus possède trois gènes codants pour les différentes protéines virales: Gag (groupe
antigène) qui code pour des protéines de la capside, Pol (polymérase) qui code pour des
enzymes nécessaires à sa réplication, Env (enveloppe) qui code pour des glycoprotéines.
Les gènes gag, pol, env sont régulés par des séquences terminales répétitives Long
Terminal Repeat (LTR) qui sont crées lorsque la transcriptase reverse synthétise l’ADN
proviral.
Figure 15 : Représentation schématique du génome du VIH-1 (Peterlin et Trono, 2003)
BOLNI MARIUS NAGALO
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II.3.3. Variabilité génétique des VIH
L’organisation génétique des VIH-1, VIH-2 et du SIV est similaire. Cependant, on note
l’absence du gène vpu au sein du génome des VIH-2 et SIV, et la présence d’un autre gène
vpx. De plus l’analyse comparative précise de chaque élément génétique de ces virus a
montré que le VIH-2 était proche du SIV macaque et du SIV mangabé qu’il ne l’était du
VIH-1 et de son homologue chez le chimpanzé SIV cpz (Barre-Sinoussi, 1996). La
structure antigénique du VIH-2 montre par rapport au VIH-1 des différences au niveau
des glycoprotéines d'enveloppe, des protéines du core et de la polymérase. Cependant les
homologies entre les protéines du core (p25, p18 et p55, p40 pour le VIH-1 et p26, p16 et
peut-être p55 pour le VIH-2) sont suffisantes pour qu'existent des réactions croisées avec
des réponses positives inconstantes par ELISA. En revanche, il n'a pas été trouvé de
réactions croisées entre les glycoprotéines d'enveloppe (gp110/120 et gp41 pour le VIH1 ; gp130/140 et gp105 pour le VIH-2). Le génome du VIH-2 est sensiblement plus long
que celui du VIH-1 (9600 protéines pour le VIH-2, contre 9200 pour le VIH-1 en ce qui
concerne l’ARN) (Barre-Sinoussi, 2001). Ces variations sont prédominantes dans
certaines régions du génome viral tel que le gène env. C’est le cas du domaine V3 de
l’enveloppe du VIH-1 qui possède d’importantes fonctions biologiques et immunologique.
Figure 16 : Phylogénie des différents types et sous types du VIH
(wikipedia.org/wiki/Fichier:HIV-SIV-phylogenetic-tree.svg
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II.3.4. Infectiosité du VIH
Un contact infectieux avec le VIH se produit généralement au niveau des muqueuses
gastro-intestinales ou génitales. Quoique les corécepteurs CXCR4 et CCR5 sont utilisés par
le VIH pour infecter une cellule, les virus utilisent presque exclusivement le récepteur
CCR5 lors de l’infection primaire (Leonard et Roy, 2006). Au fil de la progression de la
maladie, l’utilisation du récepteur CXCR4 par les souches virales s’observe chez environ la
moitié des individus (Wilkin et al, 2007). Or, la muqueuse gastro-intestinale est le plus
grand organe lymphoïde du corps humain et environ 70% de la population de
lymphocytes s’y trouve (Vossenkamper, 2011; Macdonald et al, 2011).
Ces cellules expriment fortement CD4, CCR5 ainsi que les marqueurs d’activation HLA-DR
et CD69 et sont donc très susceptibles à l’infection par le VIH (Biancotto et al, 2008; Dai et
al, 2009).
Ce sont les cellules de la muqueuse gastro-intestinale qui sont généralement les toutes
premières cellules qui vont rencontrer les virus transmis. Il va s’ensuivre une infection
massive et une réplication virale importante et, plus de 50% des cellules exprimant CD4
et CCR5 seront infectées et détruites dans les deux à trois premières semaines suivant
l’infection.
D’autres populations cellulaires sont présentes dans les muqueuses et sont susceptibles à
l’infection. C’est le cas des cellules de Langerhans, qui sont des cellules dendritiques
cutanées. Ces cellules sont très nombreuses dans les muqueuses cervicales et vaginales et
expriment un fort niveau de récepteurs CD4 et de CCR5 (Hladik et McElrath, 2008).
Les cellules dendritiques, quant à elles, sont des cellules présentatrices d’antigènes et le
VIH peut s’y attacher via le récepteur cellulaire DC-SIGN (CD209) (Izquierdo-Useros et al,
2007). Les cellules dendritiques sont de grandes voyageuses de par leurs fonctions de
présentation d’antigène et, vont malencontreusement propager l’infection vers d’autres
organes lymphatiques comme les ganglions lymphatiques, le thymus et la rate. Suite à
cette dissémination virale, la virémie devient alors très importante au niveau sanguin et le
sujet infecté est fortement contagieux.
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Figure 17 : Cycle de réplication du VIH (www.wikipedia.fr)
II.3.5. Phase clinique de l’infection au VIH
Une étude récente chez les patients en primo-infection a révélée que les premières
semaines suivant l’infection peuvent être réparties en phases cliniques qui sont définies
par une augmentation progressive de la spécificité des tests de diagnostic pour la
détection d’anticorps et d’antigènes dirigés contre le VIH-1 (Fiebig et al, 2003). La
période qui sépare l'infection et la première détection de l'ARN viral dans le plasma est
appelée phase éclipse (fenêtre silencieuse). La charge virale plasmatique augmente de
manière exponentielle pour culminer entre le 21e et le 28e jour après l’infection. Puis Elle
est suivie d’une lente diminution des taux plasmatiques d’ARN viral. La mise en évidence
des anticorps et des antigènes du VIH-1 se fait par des tests spécifiques. L’ARN viral peut
être mis en évidence dans les sérums des patients à partir du 10e jour de l’infection, en
deçà l’ARN est indétectable.
L’antigène p24 peut être mis en évidence par ELISA à partir du 15e jour suivant
l’infection. Les anticorps dirigés contre le VIH-1 sont détectés par ELISA à partir du 20e
BOLNI MARIUS NAGALO
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jour suivant l’infection. La détection des anticorps anti-VIH-1 par western-blot n’est pas
très spécifique pendant les 3 premières semaines suivant l’infection, elle le devient à
partir de la 4e semaine.
Figure 18 : Détection des anticorps et antigène pendant la phase aigüe du VIH-1(Adapté de
McMichael et al, 2010)
II.3.6. Le VIH/SIDA dans le monde
On estimait à 4,9 millions (fourchette : 4,3-6,6 millions) le nombre de personnes
nouvellement infectées par le VIH en 2005 (10 personnes par minute), soit l’équivalent à
l’année 2004. Cela reste néanmoins supérieur aux années précédentes. Parmi 14.000
nouveaux cas par jour, plus de 95% sont dans des pays à faibles et moyens revenus et sur
les 12.000 cas apparaissant chez les adultes (15-49 ans), 50% environ sont chez les 15-24
ans (ONUSIDA, 2005).
Aujourd’hui, ce sont environ 40,3 millions (fourchette : 36,7-45,3 millions) qui vivent avec
le VIH, ce qui représente 1,2% de la population mondiale âgée de 15 à 49 ans. Comme le
montre la figure 18, la répartition mondiale est la suivante :
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25,8 millions en Afrique subsaharienne
8,3 millions en Asie
1,8 million en Amérique Latine
1,9 million en Amérique du Nord, Europe Occidentale et Centrale
1,6 million en Europe orientale et Asie centrale
510.000 en Afrique du Nord et Moyen-Orient
300.000 dans les Caraïbes
74.000 en Océanie.
Figure 19 : Répartition mondiale à la fin 2005 des adultes et des enfants vivant avec le VIH
(ONUSIDA/OMS, 2005)
II.3.7. Épidémiologie du VIH/SIDA et des IST au Burkina Faso
Au Burkina Faso le SIDA est une préoccupation nationale et dès 1986 un comité national
de lutte contre le SIDA (CNLS/IST) à été mis en place pour combattre l’expansion de
l’épidémie à VIH au sein de la population. En fin 1998, le Burkina Faso a notifié 13.518 cas
de SIDA. En raison du faible accès aux services de santé, des difficultés de diagnostic et de
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la sous-notification générale, ces cas de SIDA reflètent mal l’ampleur de l’épidémie à VIH
dans le pays (SANOU, 1999). Selon le rapport ONUSIDA 2008, la prévalence moyenne de
l’infection à VIH dans la population adulte burkinabé était de 1,6% en fin 2007, dans un
intervalle (1,4-1,9), estimation faite à partir des logiciels EPP (Epidemiologic Projection
Package) et le Spectrum recommandés par l’OMS et l’ONUSIDA et utilisé par la plupart des
pays.
L’estimation de la population du Burkina Faso en 2010 était de 15.730.977
habitants (INSD, 2010).
Les autres données se présentent comme suit :
•
130.000 personnes vivant avec le VIH ;
•
120.000 adultes vivant avec le VIH, dont 61 000 sont des femmes ;
•
9.000 décès dus au SIDA ;
•
100.000 enfants estimés orphelins du fait du SIDA en 2007 au Burkina Faso.
Toujours selon ce rapport, les données indiquent un changement en faveur de
comportement propres à limiter la propagation du VIH. Le recours au préservatif au cours
des rapports sexuels avec un partenaire occasionnel a beaucoup augmenté chez les
femmes passant de 39% à 53% entre 1998-1999 et 2003.
Tableau I : Cas de VIH par tranche d’âge en 2007 comparées aux données de 2008 (Source
PNM 2008 du CNLS-IST, 2008)
Tranche d’âge
2006
2007
Cas
%*
Cas
%
Moins d’1 an
41
0,8
44
0,7
1-4 ans
51
1
73
1,0
5-14 ans
58
1,1
91
1,3
15 ans et plus
Total
4994 97,1 6804 97,0
5144
100
7012 100
*Pourcentage obtenu en divisant le total par tranche d’âge sur le total par année
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Parmi les 6.804 cas adultes infectés au VIH enregistrés en 2007, on dénombre 2.283
hommes et 4.521 femmes soit respectivement 33,55% et 66,45% des cas. Le sexe ratio est
de 0,5 (2.283/4521).Il faut noter également que la prévalence du VIH présente des
disparités selon les tranches d’âge. En effet, la tranche d’âge 25-29 ans présente la
prévalence la plus élevée tandis qu’entre 45 et 49 ans la prévalence s’annule. Par ailleurs,
toutes les tranches d’âge à l’exception des 15-19 ans et des 40- 49 ans enregistrent des
prévalences supérieures à la moyenne nationale qui est 2,3%.
II.4. Le virus T-lymphotrope humain type I et type II (HTLV-1 et 2)
Les infections par les virus T-lymphotropes humains de type I et II (HTLV-I et HTLV-II)
sont associées à la leucémie à cellules T de l'adulte, aux lymphomes et à la paraparésie
spastique tropicale. Cependant, la plupart des infections par le HTLV-I ou le HTLV-II sont
asymptomatiques; seulement 5 % des personnes infectées développent des signes
cliniques importants. L'infection par le HTLV-I est relativement courante dans certaines
régions géographiques (Japon et Caraïbes), tandis que l'infection par le HTLV-II est
prévalente dans certains segments de la population (p. ex., autochtones d'Amérique du
Nord et utilisateurs de drogues injectables). Très peu d’étude au Burkina Faso ont été
faites sur les HTLV. La seule étude disponible a trouvé une faible prévalence de HTLV-1 de
l’ordre de 0,5 à 1,5% respectivement en zone urbaine et rurale (Collenberg et al, 2006).
Au vu de la très faible prévalence de HTLV-1, son dépistage n’est pas primordial en
transfusion sanguine au Burkina Faso.
II.5. Les Contaminations bactériennes
Les constituants du sang peuvent être contaminés par des bactéries durant l'une des
nombreuses étapes de préparation, notamment la collecte, le traitement, le mélange et la
transfusion. Les sources de contamination sont la bactériémie du donneur, l'exposition
aux bactéries sur la peau du donneur par ponction veineuse, et la contamination des sacs
et de l'environnement dans les banques de sang et les hôpitaux. Les bactéries impliquées
dans les contaminations associées aux globules rouges sont habituellement des bacilles
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gram-négatifs tels que Yersinia enterocolitica et Pseudomonas fluorescens (Klein et al,
1997 ; Zavizion et al, 2003). Les bactéries à l'origine des contaminations associées aux
plaquettes, quant à elles, appartiennent principalement à des espèces telles que
Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli et Staphylococcus
epidermidis (Störmer et al, 2011). L'importance clinique d'une contamination bactérienne
par transfusion dépend en grande partie du type de bactérie, de la charge bactérienne et
de l'état physique du receveur. Les agents gram-négatifs produisent habituellement des
endotoxines et ils causent des réactions graves, tandis que les agents gram-positifs
entraînent souvent des réactions mineures. La charge bactérienne varie selon le temps
d'entreposage. Les unités de plaquettes entreposées plus de 3 jours et les unités de
globules rouges entreposées plus de 21 jours sont fortement associées à un risque accru
de contamination bactérienne. En outre, l'âge et les affections sous-jacentes des receveurs
peuvent grandement influer sur la sévérité de la contamination bactérienne.
Des mesures peuvent être entreprises pour prévenir et réduire la contamination
bactérienne et les réactions aux transfusions qui en découlent. Au Burkina Faso, les
contaminations bactériennes ne sont pas dépistées. Et peu de données existent sur les cas
de transmission post-transfusionnelle des maladies bactériennes au Burkina Faso.
Cependant, comme il n’est pas possible d’éliminer toutes les bactéries des constituants du
sang, il serait important de reconnaître les symptômes cliniques précoces associés à la
contamination bactérienne chez tous les donneurs potentiels afin de réduire les taux de
morbidité et de mortalité.
II.5.1. Treponema pallidum agent causal de la syphilis.
L'infection par Treponema pallidum, l'agent de la syphilis, peut être classée en différents
stades cliniques selon le pouvoir infectant et la progression de la maladie, à savoir :
primaire, secondaire, latente précoce, latente tardive et tertiaire. La syphilis primaire est
caractérisée par un ulcère génital indolore; environ le tiers des cas de syphilis primaire
non traités se transforment en syphilis secondaire. À ce stade, une éruption
maculopapuleuse symétrique apparaît sur la paume des mains et la plante des pieds;
environ le tiers des cas de syphilis secondaire non traités se transforment en infection
latente. En général, la syphilis latente est asymptomatique. Le tiers des cas latents non
BOLNI MARIUS NAGALO
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traités se transforment en syphilis tertiaire. À ce stade, le cœur et le système nerveux
central (SNC) sont habituellement touchés. Parmi les manifestations possibles, notons les
troubles cardiovasculaires et neuropsychiatriques et la cécité. L'infection durant la
grossesse peut causer un avortement spontané, la naissance d'un enfant mort-né ou
prématuré et la syphilis congénitale. En outre, la syphilis augmente le risque de devenir
infecté par le VIH et la syphilis tertiaire chez les personnes infectées par le VIH est difficile
à traiter. La syphilis est principalement transmise par les contacts sexuels avec une
personne infectée qui est au stade primaire, secondaire ou latent précoce de la maladie. T.
pallidum peut également être transmis de la mère au fœtus et d'un donneur infecté à un
receveur par du sang non testé ou une transfusion directe.
La transmission de la syphilis par transfusion est très rare depuis qu'on a instauré le test
sérologique de dépistage des anticorps dirigés contre T. pallidum, premier test de
dépistage des marqueurs d'une maladie infectieuse administré aux donneurs de sang. Au
Burkina, toutes les unités de sang sont soumises à un test de dépistage des marqueurs
sérologiques de la syphilis. Cependant, les centres de transfusion disposent d’une chaine
de froid appropriée qui permet la conservation des poches de sang à environ 4°C pendant
quelques jours avant la distribution, ce qui a pour avantage l’élimination du tréponème.
II.5.2.Épidémiologie de la syphilis dans le monde
La syphilis vénérienne connaît une recrudescence mondiale après l’espoir de son
éradication il y a un quart de siècle grâce à la pénicillothérapie. La syphilis reste l’une des
maladies infectieuses les plus répandues dans le monde entier, atteignant surtout les
sujets entre 15 et 30 ans (Traore, 2000). Selon l’OMS en 1999 il y avait 12,22 millions de
cas de syphilis dans le monde (OMS, 2001). Cette affection est plus fréquente dans les
villes qu’à la campagne, chez l’homme que chez la femme (Traore, 2000).
En Europe : On observe ces dernières années une recrudescence des cas de syphilis,
divisant l’Europe en deux blocs.
A l’ouest La syphilis est devenue relativement rare, avec 0,20 millions de cas en 1999
(OMS, 2001). Deux raisons expliquent cela, la période de grande liberté sexuelle des
années post 1968 est terminée, les grandes campagnes de lutte contre le SIDA, ont à
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partir de 1985 réussi à imposer le préservatif comme moyen de prévention contre le VIH,
servant de fait à la prévention de la syphilis. Ainsi, contracter aujourd’hui la syphilis
témoigne d’une sexualité à haut risque (homosexualité masculine à partenaires multiples,
usage de drogues dures) (Morel, 2001).
A l’est Surtout les Etats ex-soviétiques ou l’augmentation des taux est exponentielle
depuis les années 1990, les résultats dans certains pays de 1990 à 1996 sont les suivants:
Estonie de 0 à 50 personnes pour 100.000 habitants ;
Lituanie de 0 à 150 personnes pour 100.000 habitants ;
Fédération de Russie de 0 à 250 personnes pour 100.000 habitants.
En Asie : L’Asie a le plus grand nombre de nouveaux cas de syphilis dans la population
adulte. En 1999 ; 5,79 millions de cas de syphilis étaient recensés dans cette région du
monde (OMS, 2001).
En Afrique: L’Afrique sub-saharienne est très touchée avec 3,5 millions de cas en
1999 (OMS, 2001). Les prévalences de la syphilis chez les femmes enceintes dans
certains pays d’Afrique subsahariennes sont les suivantes:
2,5% au Burkina- Faso.
6,7% en république centrafricaine.
8,4% en Afrique du sud.
17,4% au Cameroun.
7,14% au Mali.
II.6. Paludisme et transfusion sanguine
En Afrique subsaharienne, le paludisme est l’une des causes les plus importantes de
mortalité et de morbidité infantile. Dans les pays endémiques d’Afrique subsaharienne la
mortalité palustre touche essentiellement les enfants et les femmes enceintes. Bien que la
maladie soit très répandue dans cette région, elle est peu testée ou tout simplement
ignorée en transfusion sanguine (Tagny et al, 2008). Les fortes prévalences parasitaires
en saison de transmission palustre allant de 33,5% au Bénin (Kinde-Gazard et al, 2000) à
51,5% au Nigéria (Epidi et al, 2008) élimineraient la majorité des dons de sang si la
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 64
maladie était prise en compte dans la transfusion. D’autres difficultés résident dans le
choix des tests de diagnostic. En effet, la détection des parasites est faite par microscopie
dans la plupart des pays où le paludisme a été dépisté en transfusion sanguine (Lara et al,
2007 ; Ali et al, 2005). Cette technique présente le désavantage d’être peu sensible pour
de faibles parasitémies (Achidi et al, 1995 ; Lara et al, 2007). Les tests de dépistage
sérologiques ne sont pas appropriés en zone d’endémie car la majorité des donneurs sont
adultes et semi-immuns (Akinboye et al, 1987 ; Achidi et al, 1995). Le paludisme demeure
donc la maladie négligée en transfusion sanguine dans les pays d’Afrique subsaharienne
(review par Owusu et al, 2010). Au Burkina Faso, il n’existe pas de données disponibles à
l’heure actuelle sur la transmission du paludisme en transfusion sanguine. Cependant en
saison de transmission palustre un traitement présomptif est associé à la distribution des
composants sanguins comme préconiser par différentes études (Kinde-Gazard, 2000 ;
Akinboye et al, 1987 ; Erhabor et al, 2007).
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Chapitre III : Méthodes de diagnostic des agents transmissibles par
transfusion sanguine
III. Diagnostic des hépatites virales
III.1. Le virus de l’hépatite C (VHC)
Le diagnostic des infections par le VHC, comme celui de toute infection virale repose sur
deux types de tests : les tests indirects qui mettent en évidence les anticorps dirigés
spécifiquement contre le virus (tests sérologiques) et les tests directs qui mettent en
évidence les constituants de la particule virale (PCR par exemple pour le VHC). Le
prélèvement sanguin permet de rechercher la présence d’anticorps anti-VHC. La
séroconversion a lieu dans 95 % des cas au cours du premier mois, dans 99% des cas au
cours des 3 premiers mois. La positivité de ce test signifie seulement que la personne a
été en contact avec le virus. Elle ne permet pas de savoir si le virus a été éliminé ou pas de
l’organisme. De même ce test restera positif en cas de guérison. En cas de résultat positif,
et si un doute persiste, un second test ELISA sera prescrit pour confirmation. Mais la
plupart du temps, on s’aidera d’un dosage qualitatif de la charge virale plasmatique par
PCR qui indique la présence de l’ARN du VHC sans en déterminer la quantité circulante.
III.1.1- Le diagnostic indirect
Il repose sur des tests qui utilisent les antigènes viraux permettant la détection spécifique
d’anticorps anti-VHC. Deux types de tests sont actuellement utilisés : les tests de
dépistage utilisés en première intention et les tests de validation (confirmation).
Tests de dépistage.
ELISA
Les protéines recombinantes ou les peptides de synthèse viraux sont fixés soit sur des
microplaques soit sur des billes de polystyrène. Les anticorps sont mis en évidence par
immunocapture suivie d’une révélation enzymatique colorimétrique. Aujourd’hui les tests
sérologiques de dépistage commercialisés sont des tests de troisième génération. Ils
incluent des protéines recombinantes et ou des peptides synthétiques codés à la fois par
BOLNI MARIUS NAGALO
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les régions structurales (capside et enveloppe) et les régions non structurales (NS3, NS4,
NS5). Plusieurs tests sont disponibles sur le marché : ELISA 3.0 VHC (orthodiagnostic
system), VHC 3.0 (abbott dignostic), Murex anti VHC (Murex diagnostic),Vironstika VHC ,
Microelisa VHC, et INNOTEST VHC ab IV (innogenetics).
Antigène du core du VHC (VHCcAg)
Des tests plus performants permettent le diagnostic du VHC
en recherchant
simultanément les anticorps anti-VHC et l’antigène de capside du virus (kit Monolisa HCV
Ag–Ab Ultra, Biorad). Ces tests sont une combinaison d’un test Elisa indirect pour la
détection des anticorps anti-VHC et d’un test sandwich pour la détection de l’antigène de
la capside du VHC. En effet, les puits de la microplaque sont revêtus par deux protéines
recombinantes correspondant à la région NS3 de génotype 1 et 3a, une protéine
recombinante correspondant à la région NS4, un peptide modifié correspondant à la
région de la capside et un anticorps monoclonal dirigé contre la capside de l’hépatite C.
Les anticorps anti-VHC, s’ils existent dans l’échantillon, sont liés aux antigènes fixés sur la
phase solide et détectés grâce au conjugué enzymatique C2 (un mélange d’anticorps antiIgG et de streptavidine marqués à la peroxydase) et la réaction est révélée par le TMB
(substrat de l’enzyme). L’antigène de capside, s’il existe dans l’échantillon, est capturé par
les anticorps monoclonaux de la phase solide et les anticorps monoclonaux biotinylés
d’un conjugué C1 ajouté dès le début de la réaction, et détecté grâce à l’affinité de la
biotine du C1 avec la streptavidine marquée à la peroxydase du C2. La manipulation est
réalisée selon les recommandations du fabricant.
III.1.2. Le diagnostic direct
L’importance des hépatopathies NANB dans la pathologie virale hépatique et notamment
post transfusionnelle a fortement stimulé la recherche de test de diagnostic sérologique et
moléculaire afin de pouvoir les identifier et mieux comprendre leur evolution.
L’amplification génomique par PCR introduite en 1985 par les chercheurs de la firme
<<Cetus>>permettant d’obtenir des molécules de copies d’ADN spécifiques constitue à ce
jour une véritable révolution dans ce diagnostic. Pour le VHC cette amplification nécessite
une première étape dite transcriptase reverse qui consiste en une transformation de
BOLNI MARIUS NAGALO
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l’ARN viral en ADN grâce à une transcriptase réverse. L’amplification génomique par PCR
comporte 3 étapes :
La première étape consiste en une détermination de l’ADN double brin par rupture
des ponts d’hydrogène à température élevée aboutissant à la libération d’ADN simple
brin.
-La deuxième étape réalisée à basse température permet le couplage aux deux brins
d’ADN issus de l’étape précédente, de deux amorces oligonucléotidiques complémentaires
; l’une de la région 5’ et l’autre de la région 3’ de la séquence cible.
-Pendant la troisième étape, l’utilisation d’une polymérase permet la synthèse d’un brin
complémentaire par extension à partir des amorces dans le sens 5’- 3’.
Il en résulte un dédoublement de la séquence initiale puisque les deux brins issus de
l’étape 1 sont copiés.
L’opération est ensuite recommencer avec pour chaque cycle :
•
Un temps de dénaturation de l’acide nucléique à 95 °C pendant 1 mn
•
Un temps d’hybridation avec les amorces à 37 °C pendant 1 mn
•
Un temps d’extension des amorces à 72 °C pendant 2 mn
L’amplification qui requiert environ 35 cycles est ensuite achevée par une extension de
10 mn à 72 °C.
Stratégies de confirmation du VHC en transfusion sanguine
Au Burkina Faso du fait du nombre élevé de faux positifs, le diagnostic du VHC requiert
une confirmation des résultats. Les tests utilisés pour le dépistage du VHC sont les tests
ELISA de 4ème génération. Si un échantillon est réactif aux anticorps ou antigènes du
VHC, la confirmation de la positivité de ce dernier passe par un second test sur le même
échantillon avec une technique alternative. Si l’échantillon est réactif au test alternatif,
l’échantillon est considéré positif au VHC. Si par contre si la reprise est négative,
l’échantillon est « accroché » (douteux au VHC), le donneur est appelé à revenir quelques
semaines plus tard pour un nouveau test sérologique. Compte tenu des moyens limités
dont disposent la banque de sang, les reprises sont souvent effectuées avec le test ELISA
ayant donné les résultats initiaux. L’utilisation du DGV n’est pas encore à l’ordre du jour.
Il permettrait de réduire de façon drastique le nombre de faux positifs chez les donneurs
de sang.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 68
III.2. Le virus de l’hépatite B (VHB)
Dans les pays développés comme la France, la recherche de l'antigène HBs et de
l'anticorps anti-HBc total, ainsi que le dosage des transaminases font partie des
dépistages obligatoires pour les sangs destinés à la transfusion sanguine. Actuellement au
Burkina, seul la recherche de l’AgHBs est systématiquement effectuée sur les dons de
sang.
III.2.1. Diagnostic virologique
Le diagnostic des différentes situations cliniques est effectué par la détection des
marqueurs virologiques de l'infection. Il s'agit soit de méthodes immunoenzymatiques de
type ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) réalisables dans des laboratoires non
spécialisés, soit de techniques moléculaires détectant, quantifiant ou caractérisant la
séquence de l'ADN du virus de l'hépatite B (VHB), et qui ne sont pratiquées pour le
moment que dans des laboratoires spécialisés. Les éléments pouvant être mis en évidence
dans le sérum sont soit des marqueurs directs de la présence virale, soit des marqueurs
dits indirects liés à la réponse immunitaire.
III.2.1.1. Les marqueurs directs
•
L'antigène HBs associé aux enveloppes virales est aisément mis en évidence dans le
sérum des patients par des techniques immunoenzymatiques de type ELISA.
•
L'antigène HBc n'est pas retrouvé tel quel dans le sérum.
Une protéine soluble, dérivée de la protéine de capside, porte un antigène appelé HBe qui
est détecté dans le sérum en cas de multiplication virale, également par des techniques
immunoenzymatiques de type ELISA.
•
L'ADN viral circulant associé aux particules virales infectieuses est mis en évidence
par des techniques d'hybridation moléculaire.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 69
III.2.1.2. Les marqueurs indirects
Ce sont les anticorps secrétés par le patient lorsqu'il rencontre les différents antigènes du
virus de l’hépatite B : les IgG anti-HBs, anti-HBc, anti-HBe et les IgM anti-HBc. Ils sont
aussi détectés par des méthodes immunoenzymatiques de type ELISA.
Rappel sur la méthode ELISA.
Elle repose sur l’utilisation d’un support solide (puits de microfiltration, billes,
microparticules). Ce dernier est recouvert soit d’antigènes viraux pour la détection
d’anticorps soit d’anticorps monoclonaux pour la détection des anticorps. Le sérum du
patient est mis au contact du support ainsi revêtu. Un complexe antigène-anticorps se
forme alors. La révélation de ce complexe est effectuée par une enzyme transformant un
substrat en un composé coloré ou émettant un signal. La détection de ce composé coloré
se fait grâce à un spectrophotomètre, un fluorimètre, ou un chimioluminomètre, selon le
type de signal émis. Les résultats sont généralement exprimés par un ratio qui
correspond au signal de l’échantillon sur le signal du seuil établi pour chaque trousse
utilisée.
Le ratio est proportionnel ou inversement proportionnel à la quantité de marqueur
présent dans le sérum, selon qu’il s’agit de techniques dites directes ou de techniques par
compétition. De nombreux réactifs aux performances sensiblement équivalentes, pouvant
être utilisés
sur des automates ou de façon manuelle (avec toutefois un minimum
d’équipement et beaucoup de soin) sont aujourd’hui disponibles pour la détection des
marqueurs du VHB. Les techniques sont décrites de façon précise dans chaque type de
coffret.
Tests moléculaires.
La détection/quantification de l’ADN du virus de l’hépatite B est le meilleur marqueur de
la réplication virale. Il peut être réalisé par hybridation de l’ADN viral à des sondes
spécifiques éventuellement associé à une amplification du signal, ou par amplification
génique du type Polymérase Chain Reaction (PCR). Ces techniques se classent de la façon
suivante par ordre de sensibilité croissante : hybridation, amplification du signal,
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 70
amplification génique. La mise en évidence d’une réplication virale est utilisée pour poser
l’indication thérapeutique au cours de l’hépatite chronique B. La quantification de l’ADN
viral est également indispensable au suivi du traitement par l’interféron alpha.
Prévalence de l’AgHBs.
Dans les pays en développement, l’AgHBs est le seul marqueur recherché couramment,
pour le diagnostic des infections et le dépistage des échantillons de sang à éliminer en
transfusion sanguine. Cependant les tests sérologiques diffèrent par leur sensibilité et
influent sur les prévalences de l’AgHBs. Des données concernant l’utilisation des
techniques d’hémagglutination et de l’ELISA montrent que la prévalence de l’AgHBs est
plus élevée lorsque le test sérologique est l’ELISA par rapport à l’hémagglutination (8%
Vs 14%). Les tests ELISA sont aussi plus sensibles que les tests de détection rapide (TDR)
pour la détection de l’AgHBs (Ola et al, 2009). Ces tests donnent des prévalences
respectives de 14% et 12% pour l’AgHBs. En général les prévalences élevées de l’AgHBs
en Afrique subsaharienne font qu’il n’apparait pas nécessaire de procéder à un test de
confirmation pour considérer un échantillon positif en transfusion sanguine (Allain,
2011). Au CNTS, l’AgHBs est détecté par des ELISA de 4ème génération et les résultats
sont confirmés en utilisant un second test ELISA de 4ème génération.
Les tests rapides (TDR)
A côté des méthodes ELISA, adaptées aux grandes séries, des tests individuels ont été
développés. Simples, ne nécessitant ni matériel particulier, ni électricité, ils reposent sur
des méthodes d’agglutination, d’immunofiltration, ou d’immunochromatographie. Un
résultat positif est donné par un point ou un trait coloré, ou une agglutination visible à
l’œil nu. Le temps de réalisation est de 10 min à deux heures selon les tests et le prix varie
entre 2.000 et 12.000 FCFA. Ces réactifs sont adaptés aux structures ayant peu de
moyens, et/ou recevant un nombre réduit de prélèvements.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 71
III. 3. Diagnostic biologique des virus responsables du VIH/SIDA
On distingue deux types de méthodes pour le diagnostic biologique de l’infection à VIH :
Le diagnostic indirect ou sérologique, fondé sur la détection des anticorps et reste dans la
majorité des cas l’approche diagnostic la plus pertinente et la plus accessible. Les
méthodes de référence pour la visualisation de la réaction antigène- anticorps sont
actuellement les méthodes immunoenzymatiques de type ELISA. La méthode ELISA dure
seulement quelques heures et donne des résultats reproductibles et est automatisable. Il
existe aussi des tests rapides, facilement réalisables et qui ne demandent pas de moyens
sophistiqués : les résultats sont obtenus plus rapidement que l’ELISA par simple lecture à
l’œil.
Cependant, aussi performants qu’ils sont pour les anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2 au
cours de la phase chronique de l’infection, ils n’offrent pas d’une manière générale le
même niveau de sensibilité que les tests ELISA de troisième et quatrième génération au
cours de la primo-infection. Leur avantage est leur usage dans les situations d’urgences et,
à cause du fait qu’il différencie généralement les VIH-1 et VIH-2. La plupart des tests de
dépistage comportent le risque de résultats faussement positifs, un risque qui persiste en
dépit des progrès les plus récents. Cette limite impose, en cas de positivité ou de
discordance, le recours à des tests de confirmations, notamment le Western blot.
Et le diagnostic direct, fondé sur la mise en évidence du virus par multiplication en
culture cellulaire par détection immunologique ou moléculaire. Il est surtout indiqué dans
les cas d’échec du diagnostic indirect en particulier pendant la fenêtre sérologique de la
primo infection.
III.3.1. Diagnostic indirect
III.3.1.1. L’Immunofluorescence indirecte
Des cellules lymphocytaires infectées par le virus sont déposées et fixées sur des lames de
microscope. Des cellules identiques non infectées servent de témoins et permettent
d‘éliminer les fixations non spécifiques. Le sérum à étudier est mis à incuber. Les
anticorps présents se fixent sur les cellules et sont révélés par une antiglobuline humaine
marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine. Une réaction positive se traduit par une
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 72
fluorescence observée également sur le témoin signe d’une fixation non spécifique
d’anticorps reconnaissant les éléments cellulaires et non le virus.
III.3.1.2. Les techniques immunoenzymatiques
La technique actuellement la plus utilisée pour la recherche des anticorps anti-VIH-1/2
est une technique immunoenzymatiques : ELISA. C’est une méthode simple, destinée au
dépistage de sérums. Dans cette réaction l’antigène viral est fixé par absorption physique
à un support solide (microplaque ou bille de polystyrène). On distingue quatre grands
groupes de techniques :
L’ELISA indirect
Le sérum à étudier est dilué au 1/50 puis incuber en présence du support sensibilisé :
microplaque ou bille, des complexes anticorps se forment et leur présence est révélée
dans un second temps, par l’adjonction d’un sérum antiglobuline humaine marqué par
une enzyme. Après une phase de lavage minutieux, le substrat de cet enzyme donnera une
réaction colorée d’autant plus intense que le sérum est riche en anticorps. Des témoins
positifs et négatifs inclus dans chaque réaction permettent de déterminer la valeur seuil
ou limite. Les sérums dont les densités optiques lues au spectrophotomètre sont
supérieures à cette valeur sont considérés comme positifs.
L’ELISA par compétition
Les échantillons à tester sont dilués au préalable à 1/1000. Les anticorps anti-VIH-1/2
entrent en compétition avec les anticorps du conjugué (sérum anti-VIH marqué par une
enzyme), vis à vis des antigènes viraux fixés sur le support solide. Plus la concentration
d’anticorps dans l’échantillon est élevée, moins l’antigène conjugué se fixera. Le substrat
chromogène donnera une réaction colorée qui sera inversement proportionnelle à la
concentration en anticorps. Les témoins permettent de calculer une valeur seuil. Les
sérums dont les densités optiques sont inférieures à cette valeur sont considérés comme
positifs.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 73
ELISA combiné Ag/Ac
Du fait de l’absence du dépistage moléculaire du VIH en transfusion sanguine au CNTS, la
détection du VIH-1/2 se fait en utilisant des tests ELISA de 4ème génération qui ont la
particularité de détecter à la fois les anticorps et les antigènes du VIH-1/2 et permettent
ainsi de réduire la période de silence immunologique (Vironostika combo VIH-1/2 Ag/Ab,
BIORAD etc.)
L’ELISA par sandwich
Les tests ELISA sandwich dits de 3ème génération ne nécessitent pas une dilution des
échantillons. Les antigènes du VIH sont fixés sur une phase solide. Les anticorps anti-VIH1/2 du sérum se fixent sur les antigènes de la phase solide, ils forment un complexe
antigène/anticorps. Un conjugué enzyme antigène est ajouté après lavage et il se lie à tout
anticorps anti-VIH-1/2 présents. On procède ensuite à un lavage pour éliminer le
conjugué non lié. On rajoute du substrat et une coloration apparaît proportionnellement
au taux d’anticorps présents.
L’ELISA Immunocapture
La phase solide est revêtue d’anticorps anti- IgG humaines. Si les IgG sont présentes dans
l’échantillon à tester, elles se lient aux anticorps. Après lavage, on rajoute un conjugué
enzyme antigène VIH qui se lie spécifiquement aux IgG anti-VIH. Après un second lavage,
on ajoute du substrat qui va se fixer sur le conjugué. Une coloration apparaît
proportionnellement aux taux d’anticorps présents.
III.3.1.3. Les tests rapides
La technique d’agglutination
Cette méthode est basée sur le principe d’agglutination passive des billes de polystyrène
ou des hématies humaines servant de support aux protéines virales du VIH (naturelles ou
produits de génie génétique). Mises en présence d’anticorps anti-VIH, elles forment un
réseau d’agglutination visible à l’œil nu. Ces tests peuvent être effectués sur une lame
(test au latex) ou sur plaque de micro-agglutination (hémagglutination passive avec
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 74
lecture de culot de sédimentation des hématies). Ils présentent un atout supplémentaire
sur l’ELISA car leur exécution très simple ne nécessite aucun appareillage. L’amélioration
de leur spécificité pourrait entraîner leur expansion.
Technique d’immunofiltration ou DOT BLOT
Elle utilise une membrane en papier ou de nitrocellulose comme support solide.
L’antigène est fixé sur un support solide et prend la forme d’un petit cercle ; il s’agit le
plus souvent d’un peptide synthétique ou recombinant. Une pièce en plastique soutient en
général le support solide et contient des tampons hydrophiles sous le papier pour
recueillir le sérum et les réactifs après addition. Il existe deux types d ‘« Immunodot » en
phase solide :
Immunodot sur carte
Les cartes plastifiées ont la forme d’un peigne dont les dents sont sensibilisées par des
antigènes peptidiques de synthèse du VIH-1 et VIH-2 au niveau de deux tâches séparées.
Le principe du test consiste à introduire la carte successivement dans les échantillons du
sérum (disposés dans les puits d’une plaque contenant tous les réactifs nécessaires
déposés dans différents compartiments de la plaque) dans une solution de lavage, dans le
conjugué marqué par une enzyme, une nouvelle fois dans une solution de lavage et enfin
dans le substrat chromogène. Il se forme une réaction colorée caractéristique d ‘un
résultat positif.
L’Immunodot sur membrane
Les antigènes du VIH-1 et VIH-2 immobilisés sur une membrane sont soit sous forme
d’une tâche unique, soit sous forme de deux tâches distinctes. Le sérum dilué ou non dilué
est ajouté directement sur la membrane.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 75
Les anticorps anti- VIH du sérum se lient aux antigènes présents sur la membrane. Le
complexe immun formé est traité au moyen d’un conjugué marqué à une enzyme. Un
substrat ajouté donne une tâche colorée caractéristique d’une réaction positive.
III.3.1.4. Tests de confirmations
Immunoprécipitation (RIPA)
Cette technique utilise un virus marqué par un isotope radioactif (en général la cystéine
35). Le lysat viral contenant les antigènes à l’état natif est incubé avec le sérum à tester.
Les complexes immuns formés sont alors captés sur un support d’affinité tel que des
billes de protéine asepharose. Les antigènes viraux retenus par les anticorps spécifiques
sont ensuite élués et séparés en fonction de leur poids moléculaire sur le gel de
polyacrylamide. La révélation est effectuée par autoradiographie. Cette technique met en
évidence préférentiellement des anticorps dirigés contre les protéines d’enveloppe et de
ce fait elle constitue un apport complémentaire d’informations pour les échantillons
sériques d’interprétation délicate en Western Blot. La RIPA est un test de confirmation
très sensible, réservé à des laboratoires agrées.
Le Western Blot
Après fragmentation d'une culture de virus, les protéines virales sont séparées par
électrophorèse en gel d'agarose dans lequel elles vont migrer en fonction de leur poids
moléculaire : les grosses molécules (gp 160, gp 120) migrant moins facilement que les
petites (gp 41, p 17). On transfère les protéines séparées en "buvardant" le gel (to blot =
buvarder) avec une feuille de nitrocellulose. Cette feuille est découpée en bandelettes.
On immerge une bandelette dans un petit bac contenant le sérum à contrôler : si ce sérum
contient des anticorps spécifiques du VIH, ils se fixent aux antigènes. La fixation des
anticorps est révélée par une technique ELISA identique à celle utilisée pour le test de
dépistage : on ajoute un anticorps anti-Ig humain marqué par une enzyme puis le substrat
de cette enzyme. Une bande colorée apparaît pour chaque protéine virale sur laquelle se
fixe un anticorps.
Cependant, il existe des algorithmes d’analyse alternatifs pour le sérodiagnostic du VIH.
Ils sont basés sur une combinaison d’essais de dépistage sans WB, réputé pour être une
technique difficile à réaliser et ne couvrant pas la fenêtre de silence sérologique très
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 76
critique en transfusion sanguine. Dans un algorithme de diagnostic en parallèle, les
sérums sont testés simultanément avec deux tests ELISA. Dans l’algorithme en série, tous
les échantillons sont testés avec un premier test hautement sensible. Les échantillons sont
considérés comme des vrais négatifs s’ils réagissent négativement dans le premier test.
Les échantillons réactifs dans cet essai sont soumis à un second EIA très spécifique. Les
algorithmes d’analyse en parallèle sont souvent utilisés en milieu hospitalier et en
transfusion sanguine.
Les algorithmes en série sont probablement plus efficaces et
pratiques lorsque la quantité d’échantillon est suffisante (prélèvement par ponction
veineuse par exemple) pour pouvoir faire des tests complémentaires lorsque le test initial
est positif.
Ces algorithmes ont un haut niveau d’exactitude et minimisent les coûts. La plupart
d’entre eux sont utilisés au Burkina Faso et se sont avérés très efficaces.
Figure 20: Western blot confirmé positif (Source: western blot bandelette VIH .pdf)
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 77
Figure 21: Schéma de l’interprétation d’une immuno-empreinte
III. 4. Détection des infections bactériennes syphilitiques
Dans le cadre de la qualification biologique des dons, le dépistage obligatoire des
anticorps anti-tréponémiques se fait par le TPHA uniquement, dans le but de prévenir une
éventuelle transmission de Treponema pallidum par les produits sanguins transfusés et
d’informer les donneurs dépistés. Les tests ELISA sont utilisés un peu partout et ont
l’avantage d’être automatisables. Ils se positivent très précocement au cours de la syphilis
(surtout les ELISA/IgM) (Schmidt et al, 2000) mais en cas de positivité, le recours à
d’autres tests, non tréponémiques (VDRL/RPR) et tréponémiques (TPHA, FTA,
éventuellement recherche des IgM), s’avère nécessaire pour faire le diagnostic
(Egglestone et al, 2000). La présence d’IgM permet de confirmer un diagnostic de syphilis
active. Cependant l’absence d’IgM ne permet pas d’exclure ce diagnostic avec certitude. La
recherche des IgM est particulièrement utile pour confirmer le diagnostic de syphilis
congénitale et de neurosyphilis. D’autres tests de diagnostic de la syphilis sont également
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 78
disponibles
sur
le
marché
:
tests
rapides
de
dépistage
(tests
immunochromatographiques), immunoblots.
Figure 22 : Schéma simplifié d'aide à l'interprétation des sérologies de la syphilis
(1) Ce groupe peut comporter également les patients ayant des réactions faussement positives en TPHA (moins
fréquemment décrites que les réactions faussement positives en VDRL), les syphilis latentes tardives dont le diagnostic
est parfois difficile, et les réactions croisées avec les tréponématoses non vénériennes (pian, béjel, pinta) chez les
patients originaires des zones d’endémies. Enfin, ce profil a pu être observé aussi chez certains patients en phase
primaire, bien que dans la majorité des cas le VDRL soit positif à ce stade.
(2) Lorsque les taux d’anticorps sont élevés (ex : VDRL> 8 unités, TPHA > 5120), le diagnostic est aisé surtout si les
signes cliniques sont évocateurs (syphilis secondaire par exemple). En l’absence de signes cliniques, lorsque les taux
d’anticorps sont faibles (voisins du seuil des techniques utilisées), l’interprétation des sérologies est plus délicate. Le
diagnostic reposera sur la notion de syphilis acquise antérieurement (< 1 an pour la syphilis latente précoce), de prise
d’antibiotiques (ou non), la comparaison avec d’éventuelles sérologies antérieures. Remarque : chez les patients traités
tardivement, les sérologies (tréponémiques et non tréponémiques) peuvent rester positives. Mais le suivi sérologique
devra mettre en évidence une diminution significative du VDRL (il est admis qu’une baisse du titre du VDRL de 4 fois en
6 mois est significative, par exemple de 32 unités à 8 unités, soit 2 dilutions).
(3) Le profil le plus fréquemment rencontré au stade de syphilis primaire est VDRL+ et TPHA+, mais au stade très
précoce de la syphilis primaire, on peut observer, plus rarement, le profil VDRL+, TPHA- (le FTA est positif dans ce cas
alors qu’il est négatif s’il s’agit d’anticorps anti-cardiolipidiques). Le diagnostic à ce stade sera basé d’abord sur la
clinique (chancre) et éventuellement la mise en évidence de tréponèmes au fond noir.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 79
Chapitre IV : Techniques d’amplifications moléculaires et sécurité
transfusionnelle
IV.1. La transfusion sanguine
Ces dernières années des progrès considérables ont été faits pour améliorer la qualité
des produits sanguins labiles obtenus dans le processus de transfusion sanguine. En
Afrique, ces améliorations se traduisent non seulement par l’introduction du dépistage
sérologique systématique des virus du SIDA (VIH-1 et VIH-2) et des hépatites B et C sur
les dons de sang, mais aussi par la recherche de la garantie d’une sécurité maximale en
transfusion sanguine qui repose sur des bases suivantes :
L’organisation des structures, des établissements de transfusion sanguine.
L’hémovigilance, qui constitue un système de recueil des données, d’analyses et
d’actions d’amélioration.
Les bonnes pratiques transfusionnelles à appliquer de manière pragmatique.
La formation des acteurs impliqués dans la chaine transfusionnelle.
Le développement des activités de référence et de recherches etc.
De nos jours, le risque de contamination par transfusion du virus du SIDA comme des
virus des hépatites B (VHB) et C (VHC) a considérablement diminué grâce à l’application
des mesures préventives et à l’amélioration de la sensibilité des réactifs de dépistage
sérologique. Cependant, il subsiste un risque résiduel, très faible, mais qui persiste et ce,
en dépit des mesures de sélection des donneurs et du dépistage des marqueurs
biologiques. Ce risque résiduel post-transfusionnel est essentiellement lié à la fenêtre
sérologique, période qui sépare l’infection de l’apparition des marqueurs sérologiques
(anti-VIH, anti-VHC et VHB etc.). La sécurité transfusionnelle reste un problème de santé
publique majeur dans le monde et demeure un élément clé de la lutte contre le VIH. En
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 80
2010, l’ONUSIDA estimait à 45 millions le nombre de nouvelles contaminations par le VIH
si les mesures n’étaient pas prises pour contrer l’expansion de l’épidémie.
Parmi ces nouveaux cas, 4 millions pourraient être imputables aux transfusions sanguines
ou à d’autres injections médicales. De nos jours, la transmission du VIH par cette voie- là
est toujours d’actualité pour la majorité des habitants de la planète.
Chaque année selon l’OMS, 80 millions d’unités de sang sont recueillies dans le monde, or
38 % seulement le sont dans les pays en voie de développement où vit la quasi-totalité de
la population mondiale. Et c’est justement dans ces pays en voie de développement que
les épidémies à VIH et autres infections transmissibles par transfusion sont les plus
importantes. Un autre problème en transfusion sanguine est l’émergence de nouveaux
variants viraux qui peuvent s’avérer difficile voir même impossible à détecter par les tests
dont disposent les unités de soins transfusionnelles. Récemment l’équipe du Professeur
Plantier, du CHU de Rouen a mis en évidence un nouveau variant du VIH-1 du groupe P
proche d’un virus identifié chez les gorilles (SIVgor) chez une femme d’origine
camerounaise. Ce nouveau variant se distingue des trois groupes déjà répertoriés (M, N,
O). Il a été admis que l’origine de ce nouveau groupe P est probablement liée à un passage
de virus SIV du gorille à l’Homme comme cela a été décrit dans le cas des VIH-1 de groupe
M et N à partir de contamination par manipulation de viande de chimpanzés infectés.
IV.2. Risques transfusionnels
La transmission sanguine du VIH se fait essentiellement par le contact avec le sang
contaminé ce qui inclut la transfusion sanguine notamment les donneurs en
seroconversion, les accidents d’exposition au sang, la toxicomanie par voie veineuse etc.
Au début de l’épidémie le taux de transmission par transfusion sanguine était très élevé
pratiquement 100%. En Afrique, les fortes prévalences du VIH font que ce risque est
encore plus important et est sous estimé, car il existe peu ou pas de suivi des patients
transfusés. Les dons de sang vont le plus souvent vont au bénéfice des femmes
(peripartum) et des enfants (cas de paludisme). Le manque de coordination des services
de transfusion sanguine dans plus de la moitié des pays Africains en est une des causes
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 81
(Kaba, 2004). Egalement font partie de ces causes, le fait que les tests de dépistage
sérologique de maladies virales ne sont pas généralisés, la disponibilité du sang : la
conservation, le recrutement de donneurs volontaires et bénévoles. Par ailleurs
l’indication des transfusions n’est souvent pas codifiée.
L’OMS prévoit pour l’horizon 2012 les objectifs suivants sur les dons de sang en Afrique :
L’analyse de la sécurité transfusionnelle par tous les états.
Un nombre supérieur ou égal à 75% des pays auront au moins formulés leur politique
de sécurité transfusionnelle.
100% des poches de sang testées pour les principaux marqueurs infectieux.
80% de donneurs sûr et réguliers dans les systèmes de transfusion sanguine.
La sécurité vis-à-vis des maladies transmissibles par les produits sanguins labiles est une
préoccupation permanente dans beaucoup de pays. Quatre mesures ont été adoptées
dans les pays développés comme la France en vue de réduire le risque de transmission
des virus majeurs (VIH-1/2, VHB, VHC, et des leucémies). La première mesure repose sur
une sélection clinique rigoureuse des candidats au don de sang au cours de l’entretien
médical. La seconde est l’introduction progressive de nouveaux tests de dépistages dans
la qualification biologique du don (QBD), qui a contribué à réduire le risque résiduel de
façon significative (Courouce et al, 1997, Schreiber et al, 2000). Enfin l’introduction de la
déleucocytation systématique des dérivés sanguins a permis d’éliminer le risque de
transmission des virus leucotropes, tels que ceux appartenant à la famille des
Herpesviridae et des HTLV. Par ailleurs la politique de transfusion a également été
adaptée et a entrainée une diminution du risque par diminution du nombre de
transfusions, particulièrement avec une indication incertaine.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 82
IV.3. Mesure du risque transfusionnel
IV.3.1. Différents types de donneurs de sang
IV.3.1.1. Donneurs de sang de premier don
Ce sont généralement des donneurs de sang volontaires non rémunérés. La plupart
d’entre eux sont connus et n’ont fait qu’un seul don de sang tout au long de l’année
généralement lors des cérémonies socioculturelles organisés par des associations
religieuses, de jeunes ou par des services publics et privés.
IV.3.1.2. Donneurs de sang régulier
Ces donneurs sont également des donneurs de sang connus volontaires non rémunères.
Cependant ils différents des donneurs de sang de premier don dans le total des dons
effectués au cours de l’année (supérieur ou égale à 2).
IV.3.1.3. Donneur en séroconversion
Le donneur en séroconversion est définit comme un donneur de sang connu qui durant la
période couvrant l’étude à effectué initialement un don séronégatif aux différents
marqueurs infectieux suivit d’un don dépisté positif à l’un des marqueurs recherchés en
transfusion. La période de séroconversion est celle qui sépare le dernier don négatif du
premier don infecté. Elle varie suivant l’agent responsable de l’infection.
IV.3.2. Calcul du taux d’incidence
Les taux d'incidences par centre pour les donneurs de sang réguliers ont été calculés à
partir de la base de donné du CNTS en fonction des formules établies par Schreiber et al,
(1996), Busch et al, (2005) et O'Brien et al, (2007). Pour chaque virus, les taux
d’incidences bruts
sont obtenus
à partir du rapport du nombre de donneurs en
séroconversion (cas d’incidences) sur le nombre total de personne-année à risque. Les
personnes-années ont été calculées en additionnant les intervalles de temps entre les
différents dons (inter-don) pour tous les donneurs de sang. Mais en ne considérant que la
moitié de l'intervalle pour les cas d'incidences en supposant que l'infection a été
BOLNI MARIUS NAGALO
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contractée par le donneur à la mi-période du temps qui sépare le dernier don négatif du
premier don positif pour un des marqueurs viraux dépistés en transfusion sanguine
(VIH,VHB,VHC).
Le taux d'incidence pour les donneurs de sang de premier don a été calculé en multipliant
l'incidence pour 100.000 dons par des facteurs de conversions déjà établis pour une
pathologie donnée dans la population de donneurs de sang. Les facteurs de conversions
pour le VIH et VHC ont été établis à partir des taux incidences trouvés dans la population
générale au Burkina Faso qui sont comparativement plus élevés que ceux calculés dans
d'autres pays ; où pour ces mêmes marqueurs les facteurs de séroconversions sont
respectivement égales à 2,4 et 3,2 pour le VIH et le VHC (Janssen et al, 1998 ; Dodd et al,
2002 ; Stramer et al, 2004). Les facteurs de conversions ont été calculés en divisant
séparément pour les donneurs réguliers et les donneurs de sang de premier don le
nombre des dons positifs par le nombre total des dons. Ensuite le ratio obtenu pour les
donneurs de sang de premier don est divisé à son tour par celui provenant des donneurs
réguliers.
IV.3.3. Le risque résiduel
Pour chaque agent infectieux, l’estimation du risque est basée sur la durée du passage
dans le sang du pathogène, la fréquence de l’infection dans la population et la fréquence
des infections asymptomatiques. Le risque résiduel pour tous les donneurs de sang est
calculé en multipliant les taux d'incidences pour 100.000 dons par les périodes couvrant
la fenêtre immunologique silencieuse (Schreiber et al, 1996 ; Petersen et al, 1993) ; en
admettant que les périodes de latences sérologiques sont égales à 21 jours pour le VIH,
55 jours et 70 jours respectivement pour le VHB et le VHC. Le risque résiduel du VIH peut
être également calculé en prenant en compte les tests de diagnostic moléculaire (Dodd et
al, 2002 ; O’Brien et al, 2007). Dans ce cas, on admettrait que la période d'éclipse du VIH
est de 12 jours. Le nombre d’infections supplémentaires détectés par PCR est calculé en
soustrayant le nombre d’infections non diagnostiquées par PCR du nombre d'infections
non dépistées par les tests sérologiques ELISA. Le nombre d'infections non dépistées
peut être calculé en divisant le nombre de cas non diagnostiqué/an par le risque
résiduel/don.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 84
IV.4. Biologie moléculaire et sécurité transfusionnelle
C’est la description en 1985 de la Polymérase Chain Reaction (PCR) par Mullis qui a
permis d’appliquer les techniques biomoléculaires à de nombreux domaines de la biologie
clinique. Ce sont des techniques puissantes qui ont émergé dans les années 1970 dans les
laboratoires de recherches. Leur intérêt réside dans l’extraordinaire capacité qu’elles ont
d’amplifier dans un temps très court, un million voire même un milliard de fois une
séquence d’acide nucléique viral dont on ne disposait au départ que d’une infime
quantité ; ce qui permet ensuite de les détecter par les procèdes courants de biologie
moléculaire.
En transfusion sanguine, le DGV ,a permis de réduire d’une manière conséquente la
fenêtre sérologique environ 90% pour le VHC , 50% pour le VIH et 45% pour le VHB. La
fenêtre sérologique peut être divisé en deux phases : <<l’éclipse >>comprise entre la
contamination et l’apparition de l’ARN viral, au cours de laquelle la réplication virale peut
être mise en évidence dans la cellule hôte mais non dans la circulation générale. Et la
phase “virémique”, comprise entre l’apparition du marqueur moléculaire et du marqueur
sérologique ; au cours de laquelle le génome viral devient détectable. On a ainsi pu
préciser les charges virales pendant la phase virémique, pour le VIH les charges virales
détectées vont de 102 à 107 copies/. La faisabilité du DGV en analyse de routine a été
démontrée par Coste et al. (2000) et une étude a permis de démontrer l’absence de
contamination des laboratoires par les produits d’amplification et ce malgré l’utilisation à
grande échelle des techniques de biologie moléculaire (Cornillot et al, 2000). Cependant
ces contaminations dépendent de la technique d’amplification utilisée.
IV.4.1. La Réaction en chaîne par polymérase et ses variantes (PCR)
La Réaction en chaîne par polymérise en Chaîne ou PCR pour « Polymerase Chain
Reaction » a été mise au point vers les années 1980 par Kary Mullis (Watson et al, 1994).
C’est une technique permettant d’amplifier une séquence recherchée. Son principe repose
sur l’utilisation de l’ADN polymérase, il s’agit d’une réplication in vitro de séquences
spécifiques d’ADN. Le matériel de départ est de l’ADN bicaténaire qui contient la séquence
à amplifier. La réaction en chaine de la polymérase (PCR) est une technique puissante,
BOLNI MARIUS NAGALO
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révolutionnaire, largement répandue et qui est utilisée pour amplifier l’ADN et produire
in vitro de grandes quantités d’une séquence d’acide nucléique.
Extraction de l’ARN Viral du VIH-1
L’ARN viral a été extrait à partir du Kit QIAGEN (QIAGEN, Hilden, Allemagne) en suivant
les recommandations du fabricant. Le kit permet d’extraire 100 µg d’ARN à partir de 150
µl de plasma. La sensibilité du test dépend du nombre de copies/ml initial d’ARN viral
dans le sang. La technique marche bien pour un nombre de copies/ml d’ARN ≥100 (Figure
18, McMichael et al, 2010, voire section matériels et méthode).
IV.4.1.1. Les étapes de la PCR
Pour faire la PCR, on utilise l’ADN polymérase d’une bactérie : Thermophilus aquaticus qui
vit à 75°C dans les eaux thermales. Cette polymérase (Taq polymérase) est toujours active
à 94-96°C. La réaction de la PCR comporte trois étapes qui constituent un cycle au cours
duquel la quantité d’ADN à amplifier est doublée. Ces cycles sont renouvelés entre 20 et
50 fois en fonction de la quantité d’ADN initial de départ et du but recherché. C’est une
succession d’étapes qui consistent à une :
Dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C ;
Hybridation avec une amorce, appariement des amorces, hybridation entre 56-64°C
Extension de l’amorce à 70-72°C par la Taq polymérase.
L’amplification est effectuée par la répétition des cycles qui assure une duplication
exponentielle de chaque brin.
IV.4.1.2. La transcription inverse par réaction en chaîne par polymérase (RT / PCR)
Les techniques d’amplification génique et d’hybridation amplifiée peuvent également être
utilisées à des fins quantitatives pour estimer le niveau de réplication virale du VIH dans
l’organisme. Cette quantification peut concerner le virus libre plasmatique (mesure de
l’ARN viral ou la charge virale) ou le virus intégré dans les cellules sanguines
mononuclées (ADN proviral). Les techniques de quantification de l’ARN viral plasmatique
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 86
sont utilisées à grande échelle pour le suivi des personnes infectées depuis la mise sur le
marché de trousses agrées.
IV.4.1.3. La RT/PCR quantitative : la charge virale
La PCR en temps réel permet de suivre cycle après cycle l’évolution de la réaction PCR et
la quantité d’ADN cible synthétisé, et ce grâce à un marqueur fluorescent. Elle est utilisée
pour mesurer la charge virale plasmatique du VIH. Celle-ci est exprimée en nombre de
copies/ml et en log (base 10) ou en unité internationale (UI). C'est le log10 du nombre de
copies/ml qui est utilisé pour évaluer la variation dans le temps de la charge virale. Une
variation supérieure ou égale à 0,5 est significative. La charge virale est définie en
mesurant la concentration de l'ARN virale dans le sang. La quantification de l'ARN
plasmatique du VIH est, avec la quantification des lymphocytes T4 ou CD4, les principaux
examens du suivi biologique de l’évolution de l’infection à VIH chez un patient (Hu et al,
2001; Schneider, 2003); Ils permettent de déterminer le moment où il devient nécessaire
de débuter un traitement antirétroviral et de suivre son efficacité et sa tolérance
(Chaplain et al, 2006 ; Belan et al, 2008). La charge virale, indique le nombre de virions
dans l'organisme (Dehée, 2003), par voie de conséquence la vitesse de réplication du VIH
dans l'organisme.
Par ailleurs, dans la progression normale de l’infection à VIH constatée chez la plupart des
patients, la charge virale augmente dès la contamination avant de régresser. Une charge
virale est généralement détectable au bout des 15 premiers jours suivant la
contamination. Ce test peut entrer dans le cadre du diagnostic et peut être utilisé dans
certains cas pour une détection précoce d'une séropositivité. Si une valeur positive est
significative, une charge virale indétectable n'est absolument pas significative. La
différence entre deux mesures de charge virale espacées dans le temps permet d'évaluer
la vitesse de réplication du VIH et par voie de conséquence la progression de l'infection
(Hu et al, 2001). Il y a un lien direct entre la charge virale et le niveau du déficit
immunitaire, occasionné principalement par la disparition des lymphocytes T CD4
(Frippiat et al, 1999).
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Figure 23 : Différentes étapes de la PCR (www.chups.jussier.fr)
Malheureusement, la RT/PCR quantitative a ses limites : de nombreux réactifs pour la
charge virale ont une limite de détection située entre 50 à 30 copies de particules virales
par millilitre. Cela signifie qu’une charge virale inférieure à 20 copies par millilitres donne
un résultat : indétectable.
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IV.4.1.4. La RT/PCR qualitative
La transcription inverse est un processus dans lequel l’ARN monocaténaire est transcrit
en ADN complémentaire (ADNc). Le couplage de la PCR à une étape de transcription
inverse constitue la RT/PCR. La RT/PCR est une technique qualitative adaptée à l’étude
directe des génomes viraux et des ARNm présents dans le plasma (Reynier et al, 1996;
Assal et al, 2003). Une autre technique, la PCR/ADN/VIH, permet la détection de l’ADN
proviral intégré au génome cellulaire. Pour les virus à ARN comme le VIH, les échantillons
d’ARN sont utilisés pour fabriquer un ADNc qui servira ensuite de matrice pour la PCR.
Les ADNc monocaténaires sont alors répliqués par l’ADN polymérase au cours d’un
premier cycle de température. D’autres cycles sont réitérés afin d’amplifier les ADNc
bicaténaires en grande quantité.
IV.4.1.5. Réalisation d’une RT/PCR
Pour réaliser une RT-PCR, il faut d’abord commencer par extraire les ARN ensuite les
recopier in vitro en ADNc simple brin. La synthèse du second brin d'ADNc ainsi que la PCR
sont effectués dans un deuxième temps par la Taq polymérase (ou par une autre ADN
polymérase thermorésistante).
IV.4.1.6. Synthèse de l'ADNc
La synthèse d'ADNc est catalysée par des transcriptases inverses (reverse transcriptase
RT en anglais). Ces enzymes sont des ADN polymérases ARN dépendantes, capables
d'utiliser un brin d'ARN comme matrice pour catalyser la synthèse du brin d'ADN
complémentaire. Cela correspond effectivement à l'«inverse» d'une réaction de
transcription de l'ADN en ARN.
Les transcriptases inverses sont issues de rétrovirus dont elles sont une des principales
caractéristiques (la transcriptase inverse du Virus du Myéloblastome Aviaire ou AMV,
celle du Virus de la Leucémie Murine ou Mo-MLV). Comme toutes les ADN polymérases,
BOLNI MARIUS NAGALO
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les transcriptases inverses ne peuvent pas initier seules la synthèse d'un brin d'ADN. Elles
ont besoin d'une amorce possédant une extrémité 3'-OH libre. Lorsque les ARN à
amplifier sont polyadénylés en 3' (ARNm eucaryotes par exemple), l'amorce choisie peut
être simplement une séquence polyT constituée d'une succession de désoxythymidines.
Dans ce cas, tous les ARNm sont a priori copiés en ADNc. il est aussi possible de réaliser
l'étape de transcription inverse directement avec les amorces spécifiques de l'ARN
d'intérêt, sans utiliser d'amorce polyT (non illustré). Dans ce cas, l'ADNc obtenu est
complémentaire du seul ARN d'intérêt.
Figure 24: a. Schéma simplifié du principe de la réaction de transcription inverse en
présence d'amorce polyT et b. La synthèse du second brin d'ADNc par la Taq polymérase
Selon les protocoles (nombreux et variés), il est recommandé d'inhiber la réaction de
transcription inverse et de détruire ou dénaturer l'hybride ARN/ADNc. Dans un premier
temps, la Taq polymérase catalyse la synthèse du second brin d'ADNc en utilisant le
premier brin comme matrice. Ensuite, la PCR permet d'amplifier le fragment d'ADNc.
Certaines ADN polymérases ADN dépendantes thermostables comme celle de Thermus
thermophilus (Tth), ont naturellement une activité transcriptase inverse en présence
d'ions manganèse. D'où l'idée d'effectuer la réaction de transcription inverse et la PCR
dans le même tube. Le produit final est un ADN dont l'un des brins est complémentaire de
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 90
l'ARN d'intérêt et l'autre brin à la même séquence que cet ARN d'intérêt (à la substitution
près de U par T).
IV.4.1.7. Efficacité de la PCR
La majorité des protocoles expérimentaux donne une efficacité de PCR entre 1,75 et 2.
Deux tendances s’affrontent alors, avec des arguments expérimentaux à l’appui. L’une
considère que cette efficacité est une constante par amplicon (fragment amplifié) dans un
protocole expérimental donné. L’autre estime qu’elle varie toujours significativement et
qu’elle nécessite d’être constamment remesurée. Le terme efficacité peut aussi avoir deux
significations selon les auteurs :
•
les premiers désignent l’ordre de l’exponentielle. L’équation de la cinétique s’écrit
donc :
[ADN] n= [ADN] initiale×En
•
les seconds désignent la fraction de molécule d’ADN servant effectivement de matrice.
L’équation devient alors :
[ADN] n= [ADN] initiale× (1 + E) n
Cette efficacité de la PCR est à prendre en compte car c’est un élément fondamental pour
obtenir une mesure quantitative ou établir un protocole de PCR, mais elle est
généralement négligeable pour un résultat qualitatif ou en PCR en point final.
IV.4.1.8. Autres techniques dérivées
IV.4.1.8.1. La PCR multiplex
Cette technique permet de rechercher les virus de structure proche, en amplifiant une
séquence commune aux virus recherchés à l’aide d’amorces. La révélation se fait avec des
sondes spécifiques de chacun des virus recherchés.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 91
IV.4.1.8.2. La PCR en Temps réel (Real Time PCR)
C’est une technique permettant de suivre, en temps réel, cycle par cycle, la formation des
produits amplifiés grâce à des sondes fluorescentes, hybridées et activées simultanément
à l’amplification. La PCR en temps réel est une technique de quantification de sensibilité
excellente ; elle permet de déterminer le taux d’ADN ou d’ARN spécifiques dans un
échantillon biologique.
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DEUXIEME PARTIE :
TRAVAUX EFFECTUES
BOLNI MARIUS NAGALO
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PREAMBULE
Pour atteindre l’objectif principal et les objectifs spécifiques de la présente thèse qui est
de contribuer à l’amélioration de la sécurité transfusionnelle des produits sanguins
labiles au Burkina Faso. Deux enquêtes socio-épidémiologiques et une étude pilote ont
été conduites chez les donneurs de sang des quatre principaux centres régionaux de
transfusion sanguine du pays à l’aide des moyens et de la méthodologie ci-dessous
décrits.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 94
Chapitre V : Matériels et méthodes
L’étude s’est déroulée à Ouagadougou (BURKINA FASO) :
Dans les centres régionaux de transfusion sanguine de Ouagadougou (CRTS-O), de
Bobo-Dioulasso (CRTS-B), de Fada N’gourma (CRTS-F) et de Koudougou (CRTS-K). Les
données relatives aux activités des 4 centres régionaux de transfusions sanguines ont
été acheminées et analysées dans le service de la coordination scientifique du CNTS.
Au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni-Laboratoire de Biologie
Moléculaire et de Génétique (CERBA-Labiogène) où toutes les étapes du diagnostic par
RT/PCR ont été effectuées.
V.1. L’étude rétrospective
V.1.1 Les donneurs de sang
De janvier à décembre 2009 ; 35.401 et 4.520 donneurs de sang ont été sélectionnés
respectivement dans les 3 premiers centres de transfusion sanguine du Burkina Faso
(Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et Fada N’gourma) et dans le nouveau centre régional de
transfusion sanguine de Koudougou. Les donneurs ont été recrutés après avoir répondu à
un panel de questions visant à exclure les polytransfusés, les femmes enceintes, les
personnes ayant eu un comportement à risque dans les deux semaines précédant le don
etc. Les individus des deux sexes ayant un âge compris entre 17 et 65 ans et un poids
supérieur à 50 kg, ont été retenus pour les dons de sang. Les informations
sociodémographiques des donneurs ont été enregistrées dans une base de données
adaptée à la transfusion sanguine (EDGEBLOOD, Inlog®, France). Le sang veineux des
donneurs a été recueilli dans des poches adaptées en suivant les procédures standards.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 95
L’étude rétrospective a été approuvée par le comité d’éthique du centre médical SaintCamille/CERBA à Ouagadougou.
V.1.2. Procédure de sélection des donneurs de sang
V.1.2.1. Catégorisation des donneurs de sang
Les informations sociodémographiques des donneurs de sang sélectionnés dans les 4
centres régionaux de transfusion sanguine du pays ont été centralisées dans la base de
données (EDGEBLOOD, Inlog®, France) du centre national de transfusion sanguine
(CNTS). Les donneurs ont été catégorisés en donneurs de premier don et en donneur
régulier :
Sont considérés comme donneurs de sang de premier don, les donneurs de sang
volontaires ayant à leur actif moins de deux dons de sang au cours de l’année 2009.
Les donneurs de sang réguliers sont ceux ayant faits un nombre de dons supérieur ou
égale à 2 au cours de l’année 2009.
Enfin les catégories de donneurs de sang ont été définies en fonction du lieu de don de
sang.
V.1.2.2. Sérologie des donneurs de sang
Tous les dons de sang sans exception collectés par les 4 centres de transfusion sanguine
du Burkina ont été dépistés pour la recherche de l’AgHBs et des anticorps anti-VIH, antiVHC et anti-treponema pallidum. Les tests utilisés sont des ELISA combo de 4ème
génération qui sont utilisés chez les donneurs de sang des pays à faibles revenus comme
le Burkina Faso pour palier à l’absence des tests moléculaires. Dans le cas du VIH-1/2, les
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 96
ELISA combo sont utiles dans la période de séroconversion quand seul l’antigène p24
peut être détecté par les tests sérologiques.
V.1.2.3. Stratégies de confirmation des marqueurs infectieux
Pour les anticorps anti-VIH, anti-VHC et l’AgHBs, la procédure consiste à utiliser d’abord
un test ELISA de 4ème génération. En l’absence de réaction, le sérum est considéré
comme négatif aux anticorps anti-VIH, anti-VHC et à l’AgHBs. En cas de réaction positive,
le sérum est considéré comme initialement réactif pour les anticorps contre les dits
marqueurs. Ensuite les échantillons positifs sont re-testés avec un second test ELISA
différent du premier. Les échantillons à nouveau réactifs sont considérés positifs pour le
(s) marqueur(s) concerné(s). Par contre si le second test ELISA est négatif (<<donneur
accroché>>), on ne conclue pas à la non-infection car le donneur peut être en phase de
séroconversion et un suivi de ce dernier est obligatoire. En cas de persistance d’une
discordance (premier positif et second négatif ou vice versa), un second prélèvement est
effectué après plus de 4 semaines de suivi et en l’absence de facteur de risque au VIH,
VHC, le donneur peut être considéré comme faussement réactif au dépistage.
V.2. Présentation des techniques de dépistages utilisées au cours de
l’étude
V.2.1.Tests sérologiques du VIH, VHB, VHC et de la syphilis
V.2.1.1.La sérologie VIH-1/2 chez les donneurs de sang en 2009
La séropositivité du VIH a été testée sur les plasmas des donneurs de sang en utilisant le
Kit ELISA Vironostika VIH Uni-Form II Ag/Ab (Biomérieux®, Boxtel, Hollande) et le kit
AXSYM VIH Ag / Ab COMBO II (Abbott, USA) en suivant les instructions du fabricant.
Principe du test Vironostika VIH Uni-Form II Ag/Ab
Le kit ELISA Vironostika VIH Uni-Form II Ag/Ab, est un test immunoenzymatique basé sur
le principe du « sandwich » en une étape. Un mélange d’antigène du VIH et d’anticorps
BOLNI MARIUS NAGALO
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anti-VIH combiné à de la peroxydase de Raifort (HRP) sert de conjugué, le tétramethyl
benzidine (TMB) et le peroxyde sont utilisés comme substrat. La coloration qui apparaît à
la fin du test indique la présence d’anticorps anti-VIH-1/2 ou d’antigène du VIH. L’absence
de coloration ou une coloration très claire indique l’absence d’anticorps ou d’antigène du
VIH. Les cupules microelisa sont recouvertes de plusieurs antigènes du VIH : gp160 du
VIH-1, de peptide ANT703 du VIH-1, de peptide d’env du VIH-2 (acides aminés 592 –603)
; et d’anticorps anti p24 VIH-1.
Interprétation des résultats :
Un résultat négatif signifie que l’échantillon testé ne contient pas d’anticorps anti-VIH1, anti-VIH2, anti-VIH-1 du groupe O ou d’antigène VIH-1 ou encore en dessous du
seuil de détection du Vironostika VIH Uni- Form II Ag/Ab.
Un résultat positif signifie que l’échantillon testé contient des anticorps anti-VIH-1,
anti-VIH2, anti- VIH-1 du groupe O et/ou des antigènes VIH-1 ou un facteur non
spécifique.
Limite du test :
Tous les tests immunoenzymatiques très sensibles peuvent donner des réactions non
spécifiques. C’est pourquoi, la spécificité des échantillons positifs reproductibles doit être
confirmée avec une méthode appropriée.
Principe du dosage AXSYM VIH Ag / Ab COMBO II
Le dosage AXSYM VIH Ag/Ab Combo est basé sur la technologie MEIA (Microparticle
Enzyme Immunoassays) et utilise des microparticules recouvertes d’antigènes
recombinants du VIH (E. coli) et d’anticorps (souris, monoclonaux) dirigés contre
l’antigène p24 du VIH, afin de capturer les anti-VIH-1/VIH-2 et l’antigène p24 du VIH
respectivement. Les anticorps / l’antigène capturés réagissent avec des antigènes
recombinants, des peptides et des anticorps monoclonaux anti-p24, tous marqués à la
biotine. Les complexes marqués à la biotine sont détectés par un complexe conjugué
d’anticorps anti-biotine : phosphatase alcaline.
BOLNI MARIUS NAGALO
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Interprétation des Résultats
Le protocole du dosage AXSYM VIH Ag/Ab Combo calcule la valeur seuil (CO) à partir de
la valeur moyenne des 3 répliques du calibrateur indice et mémorise le résultat. La valeur
seuil est déterminée en ajoutant 27,5 à la valeur moyenne du calibrateur indice.
Tableau II: Interprétation des résultats avec le kit AXSYM VIH Ag/Ab
Résultat
Annotation
Interprétation
Procédure de
Réanalyse
≥ 1,00
Réactive
Réactif (positif)
Réanalyse en double
0,90 à < 1
Grayzone
Zone grise (réactive)
Réanalyse en double
< 0,90*
Négatif
Négatif
Réanalyse inutile
Initial (S/CO)
*Si l’option 2 est sélectionnée pour le paramètre 80, négative se traduit par l’annotation“<
1.00 S/CO”.
“Valeur seuil (CO) = Echantillon / Valeur seuil. “
V.2.1.2. La sérologie des hépatites virales B et C des donneurs de sang en 2009
L’antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs), les anticorps dirigés contre le VHC ont été
détectés en utilisant respectivement les tests suivants : Hepanostika HBsAg Ultra
(Biomérieux®, Boxtel, Hollande), Monolisa® Ag HBs PLUS (Bio-Rad®, Marnes la Coquette,
France), et Hepanostika VHC Ultra (Beijing United Biomedical Co®, Ltd). Tous les plasmas
positifs pour le VIH, AgHBs et VHC ont été confirmés en utilisant un second test ELISA
(Bio-Rad®, Marnes la Coquette, France).
Principe du test Hepanostika HBsAg Ultra
Le kit ELISA Hepanostika HBsAg Ultra, est un test immunoenzymatique basé sur le
principe du « sandwich » en une étape utilisant trois anticorps monoclonaux sélectionnés
pour leur capacité à se lier aux différents sous-types de l’AgHBs actuellement reconnu par
l’OMS. La phase solide est constituée de 12 barrettes de 8 cupules en polystyrène
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 99
sensibilisées avec le premier anticorps monoclonal anti-HBs (murin, IgG2b). Les deux
autres anticorps monoclonaux sont couplés à la peroxydase.
Interprétation des résultats.
Echantillons négatifs.
Les échantillons dont la densité optique est inferieure à la valeur seuil sont considérés
négatifs d’après le kit d’analyse.
Echantillons indéterminés.
Toutefois, les résultats situés juste au dessous de la valeur seuil (VS- 10%) doivent être
interpréter avec prudence (il est conseillé de re-tester les échantillons correspondant en
double lorsque les systèmes utilisés et les procédures du laboratoire le permettent).
Echantillons positifs.
Les échantillons dont la densité optique est supérieure ou égale à la valeur seuil sont
considérer comme initialement positifs
et doivent être re-tester en double avant
l’interprétation finale. Apres répétition, l’échantillon est considérer positif d’après le test
si au moins une des mesures est positive, c’est-à-dire supérieure ou égale a la valeur seuil.
L’échantillon est considéré négatif selon le test si ces deux valeurs sont toujours
inferieures à la valeur seuil. Les échantillons qui ont été ré-tester en double et trouvés
négatifs selon le test, mais pour lesquels une des valeurs est proche de la valeur seuil (VS10%) doivent être considérés avec prudence (ces patients doivent être re-tester avec une
autre méthode ou sur un autre prélèvement
Valeur seuil : on fait la moyenne des DO des 4 contrôles négatifs (R3) + 0,040
D.O (R3) = 0.020+0.021+0.022+0.015 = 0.078/4 = 0.020 = DO (R3)
Valeur seuil (V.S) = 0.020 + 0.040 = 0.060.
Principe du test Hepanostika VHC Ultra
Le kit ELISA, Hepanostika VHC Ultra utilise un immunoabsorbant tapissant les puits de la
microplaque, composé de peptides synthétiques propres aux anticorps se fixant sur les
BOLNI MARIUS NAGALO
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segments antigéniques de nucléocapside, des régions NS3, NS4, NS du virus de l’hépatite
C. Pendant la réalisation du test, les contrôles et les échantillons sont ajoutés aux puits et
incubés. S’ils sont présents, les anticorps anti-VHC se fixeront sur l’immunoabsorbant.
Après une opération de rinçage pour éliminer les anticorps non fixés et les autres
composants du sérum, une préparation standardisée de peroxydase de rainfort et
d’anticorps de chèvre spécifiques pour les IgG humains sont ajoutées dans chaque puits.
On laisse ensuite cette préparation réagir avec les anticorps fixés
spécifiques aux
déterminants antigéniques présents dans l’immunoabsorbant. Apres fixation une seconde
opération de rinçage pour éliminer les anticorps couplés à la peroxydase de rainfort non
fixés; une solution de substrat contenant du peroxyde d’hydrogène et du TMB (3,3’, 5,5’tétramethylbenzidine)est ajouté dans chaque puits . La solution vire au bleu
proportionnellement au volume d’anticorps VHC présents dans les échantillons de sérum
ou de plasma testés. La réaction enzymatique pour une concentration en substrat donnée
est arrêtée par l’addition d’une solution d’acide sulfurique qui fait virer la couleur au
jaune. Les changements de couleur observés dans chaque puits sont alors mesurés par
spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm. Les échantillons dont les valeurs
d’absorbances sont égales ou supérieures à la valeur seuil sont initialement considérés
comme réactifs. Les échantillons qui présentent la première fois un résultat positif
doivent être soumis à un nouveau test en double. Si l’échantillon ne réagit pas à aucun des
deux nouveaux tests, il est considérer comme non réactif aux anticorps ant-VHC. Si
l’échantillon réagit à un ou aux deux nouveaux tests, il est considéré comme ayant une
réaction reproductible aux anticorps anti-VHC.
Echantillons négatifs.
Les échantillons dont les valeurs d’absorbances sont inferieures à la valeur seuil sont
considérés no réactifs (négatifs).
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 101
Echantillon positifs.
Les échantillons dont les absorbances sont égales ou supérieures à la valeur seuil sont
initialement considérés réactifs.
Les échantillons considérés positifs à un premier test doivent être confirmés par une
reprise. Si l’échantillon est positif au test de reprise, il est considéré contenant des
anticorps VHC donc réactif. Si au test de reprise l’échantillon est considéré négatif alors le
patient peut être considéré séronégatif au VHC.
Valeur seuil = 0.27 x PCx
Exemple : PCx = 1.345 + 1.362 + 1.391 = 4.098 / 3 = 1.366
V.S = 0.27 x 1.366 = 0.369
Avec PCx représentant la moyenne des contrôles positifs.
V.2.1.3. La sérologie syphilitique des donneurs de sang en 2009
La sérologie syphilitique des donneurs de sang a été testée par Rapid Plasma Reagin test
(RPR) (Cypress Diagnostics ®, Belgique). Les anticorps de la syphilis ont été confirmés par
un test d’agglutination de Treponema pallidum (TPHA, Cypress Diagnostics®, Belgique).
Principe du test RPR
Le kit Rapid Plasma Reagin test (RPR) (Cypress Diagnostics
®,
Belgique) est un test
qualitatif qui fait appel à des particules de charbon enduites d’un mélange d’antigènes
lipidiques qui se combinent aux anticorps de Treponema pallidum présents dans le
sérum ou le plasma du patient. Ces particules sont en suspension
dans un milieu
contenant des substances destinées à éliminer les réactions non spécifiques. Les réactions
positives sont indiquées par l’agrégation des particules. L’interprétation de l’agglutination
se fait à l’œil nu.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 102
Principe du test d’agglutination de Treponema pallidum (TPHA-VDRL)
C’est un test d’agglutination indirecte pour la détermination d’anticorps spécifique de
Treponema pallidum. En présence d’anticorps anti-T. pallidum, les érythrocytes de
volailles recouverts d’antigènes de T. pallidum réagissent dans les puits de la plaque de
microtitration en formant des agglutinations d’aspects caractéristiques. Les anticorps
dirigés contre des tréponèmes non pathogènes sont absorbés par un extrait de tréponème
de Reiter contenus dans la suspension cellulaire.
La présence d’une agglutination dans les puits indique un résultat positif à condition
qu’aucune agglutination ne soit présente dans le puits de contrôle. Le titre se définit
comme la dilution maximale où l’on observe encore une agglutination (puits 3,1 :80 ; puits
4,1 :160 etc.). Les échantillons réagissant avec les anticorps T. pallidum à des titres
≥
1 :80 doivent être considérer comme positifs. Le TPHA-VDRL un test de dépistage, les
échantillons positifs doivent être vérifiés par un test de confirmation.
Photographie 1 : A gauche spectrophotomètre lecteur de microplaques (Biorad, France) à droite
appareillage de l’automate l’AXSYM (Abbott, USA).
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 103
V.3. Amplification de l’ARN viral du VIH-1
V.3.1. Constitution des pools de plasmas des donneurs de sang
Les échantillons inclus dans cette partie de l’étude ont été sélectionné au préalable en
fonction de leurs réactivités à l’ELISA puis repartis en pools de 5 plasmas. Cent vingt
(120) des 151 échantillons sélectionnés ont été répartis en 20 pools en tenant compte
des densités optiques. Trente un (31) échantillons n’ayant pas été testés. Chaque pool
était constitué de 200 μl du plasma de chaque donneur soit 1 ml de plasma au total par
pool. Les pools étaient homogénéisés par agitation au vortex pendant 10 secondes. Le
système de poolage est interdit par la législation française. Au Burkina Faso, aucune
législation en la matière n’a encore été mise en place.
V.3.2. Extraction de l’ARN viral (kit QIAamp viral ARN mini kit, Hilden, Allemagne)
L’extraction se résume en quelques étapes principales qui sont :
Transférer 150µl de plasma de chaque pool dans des tubes Eppendorf.
Ajouter 450µl de RL dans chaque tube puis vortexer pendant quelques secondes et
incuber 15mn à température ambiante.
Ajouter 600µl de RBS dans chaque tube puis vortexer un moment.
Transférer 650µl de l’ensemble dans des tubes colonnes. Centrifuger à 12000 rpm
pendant 1mn.
Mettre le restant de la solution dans les tubes colonnes et centrifuger à 12000rpm
pendant 1mn.
Jeter les tubes collecteurs et mettre les tubes colonnes dans de nouveaux tubes
collecteurs.
Ajouter 500µl de HS puis centrifuger à 12000rpm pendant 1mn, ensuite mettre les
tubes colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs.
Ajouter 650µl de LS et centrifuger à 12000rpm pendant 1 mn et mettre les tubes
colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs.
Centrifuger à 14000 rpm 2mix (2 fois).
Mettre les colonnes dans de nouveaux tubes Eppendorf : ajouter 50µl RNase Free
Water à 8000rpm pendant 1mn. L’ARN est ainsi élué des colonnes.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 104
V.3.3. Obtention de L’ADNC
Rétrotranscription (VIH-1 RNA direct, Diatech, Italie)
Le Master-Mix utilisé pour la rétrotranscription était composé de:
-
1µl de H2Od-PCR
-
2µl de Taq buffer 10X
-
1µl de DNTP-Mix 110
-
5µl de Primer RT-K
-
0,5µl de MoMuLV-RT26 (Reverse transcriptase)
-
0,5µl de Rnasin 26
-
10µl d’ARN extrait
La rétrotranscription a été réalisée dans le thermocycleur dans les conditions suivantes :
-
42ºC pendant 25mn
-
94ºC pendant 5mn (pour dénaturer la transcriptase inverse)
Amplification
L’amplification du VIH-1 est faite en utilisant le couple d’amorces VIH-1-For :
5’AGCAGTACAAATGGCAGTGTTCATTCACAATT-3’
et
VIH-1-Rev :
5’-
TTTATCTTGTATTACTACTGCCCCTT-3’ qui détecte la région pol du VIH-1 (HXB2,
GenBank K03455). Le fragment d’ADN obtenu après amplification est de 233 paires de
base.
Le Master-Mix utilisé pour l’amplification était composé de :
-
66,5µl de H2Od-PCR
-
8µl de Taq buffer 10X
-
5µl de Primers VIH AMP
-
0,5µl de Taq polymerase (5U/ µl) (Diatech)
Un volume de 80µl de ce Master-Mix a été ajouté à l’ARN préalablement rétrotranscrit en
ADNc. L’amplification a consisté en 35 cycles de :
-
Dénaturation :
94ºC
40s
-
Hybridation :
60ºC
45s
-
Extension :
72ºC
60s
Une extension finale à 72°C pendant 15mn et un hold à 4°C ont terminé la RT-PCR.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 105
Après la réalisation de la PCR, l’ADN amplifié (les amplicons), a été mis à migrer par
électrophorèse sur gel d’agarose à 2%. La révélation sous UV et la photographie ont été
faite à l’aide de l’appareil Gene Flash de Syngene Bio Imaging muni d’une imprimante
Mitsubishi P93.
Photographie 2: Thermocycleur 9700 (Applied Biosystems, USA)
V.3.4. Préparation du gel d’agarose
Préparation du TBE (solution tampon Tris/Borate/EDTA) 1X à partir du TBE 10X :
tampon de course
Dilution 1/10 : 100ml de TBE10X +900ml H2Od solution de 100ml de TBE 1X
Préparation du gel d’agarose 2%
4g d’agarose +200ml de TBE 1X
Cuisson à micro onde (2mn, 460W)
Ajout de 16µl de Bromure d’Ethidium (10mg/ml)
Le gel est coulé délicatement dans la cuve à électrophorèse (BIORAD)
Dépôt des échantillons sur le gel en s’assurant que le tampon de migration
préalablement versé dans la cuve couvre de quelques millimètres le gel.
3 µl de bleu de migration
Par échantillon/puits
8 µl d’ADNc amplifié
3 µl du ladder dans le puits n°1
- Electrophorèse et Révélation sous UV : Course de l’électrophorèse : 120V pour
45minutes Révélation sous UV – Photo.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 106
Photographie 3 : A gauche une Cuve d’électrophorèse couplée à un générateur (CERBA/Labiogène) à
droite course électrophorétique des acides nucléiques du VIH-1 sur gel d’agarose à 2%
V.4. Analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été faites avec le logiciel Standard Statistical Package for
Social Sciences (SPSS) version 17 pour Windows et par le logiciel EPI Info version 6.04 dfr
(CDC, Atlanta, USA). Les odds ratios (OR) ont été calculés pour déterminer la prévalence
du VIH, du VHB, du VHC et de la syphilis et l’impact des facteurs sociodémographiques
sur le risque associé au don de sang dans les centres de transfusions sanguines au
Burkina Faso. Le seuil de signification statistique a été fixé à p < 0,05.
V.4.1. Le taux d’incidence
Le taux d'incidence chez les donneurs de sang réguliers a été calculé en fonction des
formules établies par Schreiber et al. (1996), Busch et al. (2005) et O'Brien et al. (2007).
En divisant le nombre de cas d'incidence au cours de la période couvrant l'étude par le
nombre total d'année/personne. Les années/personnes ont été calculées en additionnant
les intervalles de temps entre les différents dons (inter-don) pour tous les donneurs de
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 107
sang. Mais en ne considérant que la moitié de l'intervalle pour les cas d'incidences en
supposant que l'infection a été contractée par le donneur à la mi-période du temps qui
s’est écoulé entre le dernier don négatif et le premier don positif pour un des marqueurs
viraux dépistés en transfusion sanguine (VIH,VHB,VHC).
Le taux d'incidence pour les donneurs de sang de premier don a été calculé en multipliant
l'incidence pour 100.000 dons par des facteurs de conversions déjà établis pour chaque
pathologie virale présente dans la population de donneurs de sang étudiée. Les facteurs
de conversions pour le VIH et le VHC ont été établis à partir des taux incidences trouvés
dans la population générale au Burkina Faso qui sont comparativement plus élevés que
ceux calculés dans d'autres pays ; où pour ces mêmes marqueurs les facteurs de
séroconversions sont respectivement égales à 2,4 et 3,2 pour le VIH et le VHC (Janssen et
al, 1998, Dodd et al, 2002, Stramer et al, 2004). Les facteurs de conversions ont été
calculés en divisant séparément pour les donneurs réguliers et les donneurs de sang de
premier don le nombre des dons positifs par le nombre total des dons. Ensuite le ratio
obtenu pour les donneurs de sang de premier don est divisé à son tour par celui
provenant des donneurs réguliers.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 108
TROISIEME PARTIE :
RESULTATS ET DISCUSSION
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 109
Chapitre VI : Résultats et discussion
VI. 1. Séroprévalences des maladies transmissibles par transfusion sanguine au
Burkina Faso
VI.1.1. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de Koudougou
VI.1.1.1. Description de la cohorte du centre régional de transfusion sanguine de Koudougou
L’étude de Koudougou a concernée 4.520 donneurs de sang volontaires et non rémunérés.
L’âge des donneurs était compris entre 17 et 64 ans avec une tranche d’âge majoritaire
de 20 à 29 ans comprenant 2.730 (60,40 %) donneurs (tableau III). La cohorte de l’étude
était composée de 3418 (75,62 %) hommes et de 1102 (24,38 %) femmes soit un sex
ratio de 3/1 ; 419 (9,27%) individus étaient des donneurs réguliers, 1.944 (43,01%)
étaient du groupe sanguin O et 4.179 (92,46%) étaient rhésus D (RH) positifs.
La majorité des donneurs de sang ont été recrutés en zones urbaines 3.005 (66,48 %) ; et
les donneurs de sang réguliers se retrouvaient dans la tranche d’âge de 20 à 29 ans soit
269 (9,85 %) donneurs (tableau III).
VI.1.1.2. Épidémiologie du VIH, du VHB, du VHC, de la syphilis chez les donneurs de premier
don des zones urbaine et rurales du Burkina Faso en 2009
Les prévalences des anticorps anti-VIH chez les donneurs de sang de premier don étaient
presque similaires en zones urbaine et rurale dans les 4 centres de transfusion sanguine
(Tableau IV). Les différences significatives des prévalences de l’AgHBs et des anticorps
anti-VHC ont été trouvées chez les donneurs de sang de premier don des zones rurales
comparativement aux zones urbaines dans les centres de Ouagadougou (p = 0,006 et p
<0,001) et Bobo-Dioulasso (p < 0,001 et p = 0, 01). La syphilis, pathologie souvent
associée à l’infection au VIH, était significative plus élevée chez les donneurs de sang de
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 110
premier don des zones rurales comparativement aux zones urbaines dans tous les centres
de transfusion à l’exception de Koudougou (Tableau IV).
Prévalence des marqueurs infectieux au centre de transfusion de Koudougou
Les prévalences de l’AgHBs étaient élevées chez les donneurs de sang de premier don, de
sexe masculin (P < 0,001) et des zones rurales (P < 0,001) comparativement
aux
donneurs réguliers, de sexe féminin et ceux provenant des zones urbaines (tableau VI).
Des séroprévalences significatives du VHC ont été enregistrées chez les donneurs de la
tranche d’âge >20 ans (P < 0,001) et > 40 ans (P = 0,005) comparativement au groupe
d’âge de 30 a 40 ans (tableau V).
Mille trois cent quarante huit donneurs de sang volontaires non rémunérés (1.348) soit
29,82% étaient infectés par au moins un agent pathogène et 149 (3,30%) avaient des
infections multiples. La séroprévalence du VIH, AgHBs, VHC et de la syphilis était
respectivement de 2,21%; 14,96%; 8,69% et 3,96%. Chez les donneurs de sang, les
doubles ou triples infections les plus fréquentes étaient les suivantes : AgHBs-VHC
(1,39%), AgHBs-syphilis (0,66%) et AgHBs -VHC-syphilis (0,11%) (Tableau IV).
VI.1.2. Prévalence des agents infectieux chez les donneurs de sang de Ouagadougou,
Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma.
VI.1.2.1. Description de la population d’étude
Comme le montre le tableau VII, sur un total de 35.401 donneurs de sang ; 56,6% étaient
dans le groupe d'âge de 18 à 25 ans, l'âge médian des sujets de l'étude était de 24 ans (1767 ans). Parmi ceux-ci ; 74,9% des donneurs de sang étaient des hommes et 25,1%
étaient des femmes. La cohorte d’étude comportait 31.405 donneurs de sang de premier
don (88,7%) et 3.996 donneurs de sang réguliers (11,3%). Le pourcentage des donneurs
de sang réguliers était compris entre 7,9 et 12,8% selon les centres. Parmi les donneurs
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 111
réguliers 70,4% ; 22,4% ; 7,2% avaient fait respectivement deux, trois et quatre dons de
sang en 2009 (tableau VI). Les donneurs de sang ont été principalement recrutés dans les
écoles (31,8%), les centres de transfusions sanguines (27,7%) et les provinces (10,4%).
Tableau III : Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang de Koudougou en
2009
Type de donneurs
Caractéristiques
Total
Donneurs de sang
Donneurs
de premier don
réguliers
N (%)
N (%)
N (%)
Homme
3.418 (75,62)
3.073 (89,91)
345 (10,09)
Femme
1.102 (24,38)
1.028 (93,28)
74 (6,72)
< 20
1.177 (26,04)
1.100 (26,82)
77 (18,38)
20-29
2.730 (60,40)
2.461 (60,01)
269 (64,20)
30-40
424 (9,38)
363 (8,85)
61 (15,56)
> 40
189 (4,18)
177 (4,32)
12 (2 ,86)
Zone urbaine
3.005 (66,48)
2.624 (64,00)
383 (91,40)
Zone rurale
1.515 (33,52)
1.477 (36,02)
38 (9,01)
O
1.944 (43,01)
1.737 (89,35)
207 (10,65)
A
1.106 (24,47)
1.018 (92,04)
88 (7,96)
B
1.206 (26,68)
1.103 (91,46)
103 (8,54)
AB
264 (5,84)
243 (92,05)
21 (7,95)
Positif
4.179(92,46)
3.795(90,81)
384(9,19)
Négatif
341(7,54)
306(89,74)
35(10,26)
Sexe
Age
Lieu du don de sang
Groupe sanguin
Rhésus
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 112
Tableau IV : Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de premier don
en zones urbaine et rurale des les 4 centres de transfusion sanguine du Burkina Faso en
2009
Marqueurs infectieux
CRTS
VIH
AgHBs
VHC
Syphilis
zone
%
Urbaine (N = 1.474)
2,4
Rurale (N = 2.522)
2,7
16,2
9,9
5,5
Urbaine (N = 7.757)
1,0
10,9
4,2
0,5
Rurale (N = 435)
0,7
11,5
6,7
1,4
Urbaine (N = 4.710)
1,2
17,9
9,1
2,0
Rurale (N = 625)
0,8
19,8
10,2
3,4
Urbaine (N = 1.931)
2,0
13,9
8,6
3,8
Rurale (N = 1.112)
2,9
Ouagadougou
P*
%
13,0
0,69
Fada
P
5,9
<0,001
0,04
0,03
0,36
<0,001
20,1
0,7
9,0
0,3
4,6
* Valeur P : comparaison entre les prévalences des marqueurs en zones urbaine et rurale
N= nombre de donneurs de premier don
BOLNI MARIUS NAGALO
P
<0,001
0,01
0,24
0,13
%
2,4
0,70
0,37
Koudougou
%
0,006
0,54
Bobo
P
Page 113
Tableau V : Caractéristiques sociodémographiques des donneurs volontaires non rémunérés et infections au VIH, à la Syphilis au VHB, et au VHC à
Koudougou
Total
des donneurs de sang
N
VIH
positif
N (%)
Homme
3.418
78 (2,28)
1,15 (0,70-1,90)
0,575
309 (9,04)
1,77 (1,16-2,73)
0,005
549(16,06)
1,47 (1,19-1,82)
< 0,001
Femme
1.102
22 (2,00)
1,00
-
84 (7,62)
1,00
-
127(11,52)
1,00
< 20
1.177
23 (1,95)
1,67 (0,60-5,04)
0,297
124 (10,54)
1,15 (0,63-2,14)
0,622
168 (14,27)
20-29
2.730
65 (2,38)
2,04 (0,79-5,79)
0,118
176 (6,45)
1,01 (0,58-1,80)
0,971
30-40
424
5 (1,18)
1,00
-
21 (4,95)
1,00
> 40
189
7 (3,70)
3,22 (0,91-11,85)
0,037
21 (11,11)
Zone urbaine
3.005
49 (1,63)
1,00
-
Zone rurale
1.515
49 (3,23)
2,02 (1,33-3,07)
4.101
96 (2,34)
419
4 (0,95)
OR (IC, 95%)
P
Syphilis
positif
N (%)
AgHBs
positif
N (%)
Caractéristiques
OR (IC, 95%)
P
OR (IC, 95%)
P
VHC positif
OR (IC, 95%)
P
309 (9,04)
1,20 (0,93-1,56)
0,146
-
84 (7,62)
1,00
-
1,30 (0,91-1,86)
0,127
124 (10,54)
2,20 (1,37-3,75)
< 0,001
434 (15,90)
1,48 (1,07-2,06)
0,015
176 (6,45)
1,32 (0,81-2,17)
0,237
-
48 (11,32)
1,00
-
21 (4,25)
1,00
-
1,13 (0,43-2,86)
0,787
26 (13,76)
1,25 (0,73-2,14)
0,393
21 (11,11)
2,40 (1,22-4,71)
0,005
259 (8,62)
1,00
-
392 (13,04)
1,00
-
259 (8,62)
1,00
-
< 0,001
134 (8,84)
1,03 (0,82-1,29)
0,835
284 (18,75)
1,54 (1,30-1,82)
< 0,001
134 (8,84)
1,03 (0,82-1,29)
0,835
2,49 (0,88-7,98)
0,066
366 (8,92)
1,76 (0,90-3,56)
0,083
653 (15,92)
3,26 (2,09-5,13)
< 0,001
366 (8,92)
1,42 (0,93-2,18)
0,086
1,00
-
27 (6,44)
1,00
-
23 (5,49)
1,00
-
27(6,44)
1,00
-
N (%)
Sexe
Age
Lieu du don de sang
Type
de donneurs
Donneurs de premier
don
Donneurs réguliers
OR= Odds Ratio; IC= Intervalle de confiance ; Zone urbaine = Centre de transfusion, Communes urbaines, Ecoles et Universités, Les valeurs de P sont en gras,
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 114
VI.1.2.2. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang volontaires
de premier don
Le pourcentage de donneurs de sang bénévoles de premier don était
respectivement de 17% ; 23,1% et 23,9% à Bobo-Dioulasso, à Ouagadougou et à
Fada N’gourma. Les prévalences des anticorps anti-VIH, l’AgHBs, les anticorps
anti-VHC et l’anti-tréponème étaient respectivement de 1,8%, 13,4, 6.3 et 2,1%.
Les prévalences des marqueurs infectieux dépistés en transfusion sanguine
étaient nettement plus faibles dans le centre de transfusion de Bobo-Dioulasso (p
<0.001). En revanche, au centre régional de transfusion de Ouagadougou on a
retrouvé une prévalence significativement plus élevée d'anticorps anti-VIH. Des
prévalences significativement plus élevées de l’AgHBs et des anticorps anti-VHC
ont été trouvées chez les donneurs de sang de Fada N’gourma. Les comparaisons
des prévalences des quatre marqueurs dépistés (VIH, VHC, AgHBs et Syphilis)
étaient significatives avec des valeurs de p <0,001 entre les centres, sauf pour le
VIH entre Bobo-Dioulasso et Fada N’gourma (tableau VII). Dans l'ensemble ;
1,7% (589/35.401) des donneurs de sang avaient des infections multiples. Dans
une population à forte prévalence au VIH et à l’infection chronique de l’hépatite
B, le VIH-AgHBs représentait prés de 15,9% des co-infections enregistrées. Les
prévalences des co-infections VHC-AgHBs et VHC-VIH sont similaires et
concordantes avec les prévalences globales respectives 0,1 et 0,9%. Dans le
centre de transfusion de Fada N’gourma, la co-infection la plus fréquente
rencontrée a été l’AgHBs-VHC.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 115
Tableau VI : Répartition des donneurs de sang par centre de transfusion sanguine
Caractéristiques
Ouagadougou
Bobo-Dioulasso
Fada N’gourma
Total (%)
(%)
(%)
(%)
19.582
9.434
6.385
35.401
17.294
8.231
5.880
31.405
Donneurs réguliersa
2.288 (11,7)
1.203 (12,8)
505 (7,9)
3.996 (11,3)
2 donsb
1.642 (71,8)
782 (65,0)
388 (76,8)
2.812 (70,4)
3 dons
501 (21,9)
290 (24,2)
105 (20,8)
896 (22,4)
4 dons
145 (6,3)
131 (10,8)
12 (2,4)
288 (7,2)
Homme
1.815 (79,3)
1.024 (85,1)
391 (77,4)
3.230 (80,8)
Femme
473 (20,7)
179 (14,9)
Nombre total des
donneurs
Donneurs de premier
don
a.
114 (22,6)
766 (9,2)
Pourcentage est obtenu à partir du nombre total des donneurs des centres de
transfusion
b.
Pourcentage obtenu à partir du nombre total des donneurs réguliers
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 116
Tableau VII : Prévalence des marqueurs infectieux confirmés et des co-infections chez les
donneurs volontaires de premier don
Co-Infections
Anti-VIH
AgHBs
Anti-VHC
Antisyphilis
Multiples
infections2
Total (%)
Anti-VIH
AgHBs
4331
77
3.706
35
298
11
101
IBCS 1,
IBC 6, IBS 2,
ICS 2, BCS 12
1.566
44
491
567 (1,8)
4203
(13,4)
1964 (6,3)
664 (2,1)
28
158
10
75
IBCS 1,
IBC 5,IBS 2,
ICS 2, BCS 9
886
27
371
< 0,0001
5,0 (3,7-6,9)
425 (2,5)
2334
(13,5)
1.116 (6,5)
497 (2,9)
Anti-VHC
Anti-Syphilis
Ouagadougou
Anti-VIH
AgHBs
Anti-VHC
Anti-Syphilis
Valeur-P3 O vs B
OR (IC,95%
321
< 0,0001
2,5 (2,0-3,2)
56
2.028
< 0,0001
1,3(1,2-1,4)
< 0,0001
1,5 (1,4-1,7)
Bobo-Dioulasso
Anti-VIH
AgHBs
Anti-VHC
Anti-Syphilis
Valeur-P B vs F
OR4 ( IC,95%)
70
8
839
3
43
300
0,75
1,1 (0,8-1,5)
< 0,0001
1,6(1,4-1,8)
< 0,0001
1,9 (1,6-2,2)
42
13
839
4
97
380
< 0,0001
2,4 (1,8-3,2)
< 0,0001
1,3(1,2-1,4)
0,0003
1,2 (1,1-1,4)
0
9
5
32
< 0,0001
3,5 (2,5-5,0)
BCS 2
81 (1,0)
901 (11,0)
353 (4,3)
48 (0,6)
1
17
12
88
0,0004
1,4 (1,2-1,8)
IBC 1, BCS 1
61 (1,1)
968 (18,0)
495 (9,2)
119 (2,2)
Fada N’gourma
Anti-VIH
AgHBs
Anti-VHC
Anti-Syphilis
Valeur-P O vs F
OR, (IC,95% )
1. Les chiffres en gras indiquent le nombre de cas d’infections . Les autres chiffres indiquent le nombre de cas de plus de
deux infections
2. Les échantillons ayant plusieurs marqueurs (plus de 2 marqueurs) sont indiqués dans la sixième colonne du tableau (I =
anti-HIV, B =AgHBs, C= anti-VHC, S = anti-treponema)
3. O = Ouagadougou; B = Bobo-Dioulasso; F = Fada N’gourma
4. OR = Odds ratio, IC = Intervalle de confiance
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 117
VI.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang de
premier don et les donneurs réguliers de
Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et de
Fada N’gourma
Trois mille neuf cent quatre-vingt-seize (3.996) donneurs de sang ont faits entre 2 et 4
dons de sang en 2009. Les intervalles de temps entre ces dons (8.384) ont permis de
calculer les infections incidentes pour les anti-VIH, anti-VHC et l’AgHBs dues à des dons
effectués au cours de la période de fenêtre immunologique silencieuse du donneur
(tableau VIII).
Comme constaté chez les donneurs de sang de premier don, les
prévalences des différents marqueurs viraux dépistés en transfusion sanguine variaient
considérablement entre les centres. Le centre de transfusion de Bobo-Dioulasso a
montré une baisse significative du taux d'incidence pour chaque marqueur par rapport
aux deux autres centres. Cependant, des taux d'incidences relativement élevés ont été
observés. Des différences significatives entre les prévalences des marqueurs viraux ont
été également observées chez les donneurs de sang de premier don. Le taux d’incidence
était environ trois fois plus élevé pour le VIH, 10 fois pour l’infection par le VHB et cinq
fois pour le VHC (tableau VIII). Les infections incidentes ont été trouvés essentiellement
chez les hommes (88,5%), quel que soit le marqueur. Les donneurs réguliers étaient
recrutés pour la plus part dans les centres de transfusions (66,8%), les écoles (21,3%) et
les provinces (5,8%) lors des collectes mobiles. Les séroprévalences des hépatites B
(22,2%) et C (19,1%) étaient reparties de façon disproportionnée chez les donneurs
recrutés en collecte mobile (provinces) ainsi que chez les donneurs du secondaire
(respectivement 37,4 et 26,4%, pour les mêmes marqueurs). Dans l'ensemble ; 5,6% des
donneurs de sang réguliers qui fréquentaient les centres de transfusions présentaient
une séroconversion pour au moins un marqueur viral.
Les donneurs de sang volontaires recrutés dans les écoles et au cours des collectes
mobiles en provinces présentaient un taux de séroconversion élevé (respectivement
9,5 et 22,8%, p <0,0001 entre les centres de transfusion et les écoles ou les collectes en
provinces et P = 0,0032 entre les écoles et les provinces).
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 118
Tableau VIII : Incidence du VIH, du VHB et du VHC chez les donneurs réguliers et les donneurs de premier don dans les trois
centres régionaux de transfusion sanguine au Burkina Faso
VIH
VHB
VHC
VIH
VHB
VHC
Ouagadou
gou
BoboDioulasso
Fada2
Ouagadou
gou
BoboDioulasso
Fada2
Ouagadou
gou
BoboDioulasso
Fada2
total
total
total
22.214
11.180
6.512
22.214
11.180
6.512
22.214
11.180
6.512
39.906
39.906
39.906
4.446
2.859
1.046
4.446
2.859
1.046
4.446
2.859
1.046
8.351
8.351
8.351
36
9
8
75
9
12
73
19
22
53
96
114
3679,1
1336,5
3340,1
7567,9
1336,4
4986,0
7380,7
2812,4
9080,3
2802,2
5038,9
5978,2
Total des dons
17.292
8.246
5.379
17.292
8.246
5.379
17.292
8.246
5.379
30.917
30.917
30.917
Dons infectés
425
81
61
2.334
901
968
1.116
353
495
567
4.203
1.964
Facteur de
conversion
3,04
3,12
1,48
8,00
34,71
15,69
3,93
6,44
4,38
2,89
11,83
4,65
IR/100.000 dons
11167,5
4170,6
4952,6
60553,3
46385,7
78213,0
29010,9
18116,2
39729,6
8097,4
59589,3
27819,3
Total des dons
Dons réguliers
Dons non infectés
Dons infectés
IR1/100.000 dons
Dons faits par des
donneurs de
premier don
1. IR = Taux d’incidence
2. Fada N’gourma
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 119
VI.3. Contribution de la PCR à l’amélioration du diagnostic des agents infectieux
au Burkina Faso : RT-PCR du VIH-1 au centre de transfusion de Ouagadougou
Justification et contexte de l’étude
La modestie des moyens alloués aux centres de transfusion sanguine du Burkina ne
permet pas l’utilisation en routine des tests moléculaires bien que leur utilité ait été
démontrée dans la réduction de la période fenêtre. Au CRTS de Ouagadougou, chaque
année plus de 2000 donneurs de sang sont accrochés pour le dépistage des anticorps
anti-VIH. Certes les donneurs accrochés sont éliminés du circuit de distribution des PSL.
Cependant, le processus de confirmation du statut sérologique du donneur accroché
(douteux) peut prendre plusieurs semaines voir des mois, pour cela le donneur de sang
douteux doit revenir au CRTS-O pour un second prélèvement.
Peu de donneurs
accrochés reviennent pour le prélèvement de confirmation (perte d’un donneur
éventuel). Ceci a un impact sur la disponibilité du sang et la fidélisation des donneurs car
1/3 des donneurs accrochés pour le VIH
s’avèrent être de faux positifs pour ce
marqueur et le risque qu’ils ne reviennent plus au CRTS-O est aussi à considérer.
Le but de cette étude était d’évaluer la RT-PCR sur les pools de plasmas de donneurs
sang. L’objectif étant de permettre une notification plus rapide du statut sérologique VIH
lorsqu’il était douteux par ELISA afin de réduire la perte de vue des donneurs
« accrochés » pour le VIH-1.
Les pools étaient constitués d’échantillons sélectionnés dont la sérologie était connue. La
stratégie du poolage est décrite plus en détail dans la section matériel et méthode. Pour
valider la méthode, 20 pools de 5 échantillons chacun ont été testés en RT-PCR. 8 pools
d’échantillons positifs au VIH, 10 pools de négatifs et 2 pools de douteux (tableau IX). Un
fragment de 233 paires de base correspondant au VIH-1 a été amplifié par RT-PCR avec
les pools de plasmas ou les échantillons individuels positifs (figure 25). Tous les
échantillons des 8 pools de plasmas positifs ont tous été confirmés positifs à la RT-PCR.
De même, les pools constitués d’échantillons négatifs (10 pools) au VIH-1 ont été
confirmés négatifs par RT-PCR. En ce qui concerne les deux pools constitués
d’échantillons dont le statut était douteux au VIH-1, un pool de ces plasmas a été
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 120
confirmé négatif au VIH-1 par RT-PCR. L’analyse de chaque échantillon de ce pool a
confirmé son statut négatif au VIH-1. En déroulant le pool de douteux (5 plasmas) positif
par RT-PCR, les 5 plasmas ont tous été confirmés positifs au VIH-1.
Tableau IX : RT-PCR sur les pools de plasmas au cours de l’enquête prospective d’août à
décembre 2009 au CRTS-O
Pool de plasmas
ELISA
VIH-1
N (%)
Positif
Négatif
Positif
8 (40)
8 (100)
0 (0)
Négatif
10 (50)
0 (0)
10 (100)
Douteux
2 (10)
1 (50)
1 (50)
BOLNI MARIUS NAGALO
RT-PCR
Page 121
Figure 25 : Gel d’agarose à 2% des pools de plasmas et de quelques échantillons
individuels
Le fragment d’ADN attendu est de 233 paires de base (pb) et est situé sur la photographie
entre 300 et 200 pb.
M : Marqueur de masse moléculaire Hyper Ladder II (Bioline®)
1-6 : pools de plasmas positifs en ELISA, positifs en RT-PCR
7 : pool de plasmas douteux en ELISA, positif en RT-PCR
8 : pool de plasmas douteux en ELISA, négatif en RT-PCR
9 : pool de plasmas positifs en ELISA, positif en RT-PCR
N : pool de plasmas négatifs en ELISA, négatif
10-12 : échantillons individuels positifs en RT-PCR
13 : Contrôle positif VIrH-1.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 122
VI. 4. Discussion
VI.4.1. Prévalences des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang au Burkina
Faso
Pour les pays d’Afrique subsaharienne à majorité pauvres où les ressources sont
limitées, la disponibilité et la sécurité du sang et des produits sanguins dérivés pour les
transfusions continuent d’être préoccupantes, surtout avec l’existence des prévalences
élevées dans ces populations des marqueurs infectieux tels que le VIH/SIDA et d’autres
infections comme l’hépatite B, l’hépatite C et la syphilis.
Au Burkina, comme généralement en Afrique subsaharienne, il existe trois catégories de
donneurs de sang : Les donneurs volontaires non rémunérés, les donneurs familiaux
/remplacements, les donneurs rémunérés professionnels, moins nombreux et souvent
des donneurs aux profils recherchés (facteurs rhésus négatifs) également rémunérés
dont les dons sont coordonnés par des associations de dons de sang.
Le centre national de transfusion sanguine (CNTS) coordonne les activités des centres
régionaux (CRTS) de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso, Fada N’gourma et de Koudougou.
La politique nationale en matière de transfusion suit les recommandations de l’OMS et
se base sur le recrutement de donneurs de sang volontaires non rémunérés,
principalement des jeunes, de sexe masculin (80,8%) qui représentent souvent la
majorité des donneurs réguliers. Cette politique de recrutement de donneurs de sang
préconisée par l’OMS pose problème au Burkina Faso parce qu’à l’évidence, elle ne
permet pas encore de satisfaire la forte demande en poches de sang. Il est nécessaire
d’évaluer d’autres stratégies de dons de sang comme par exemple la prise en compte
dans les collectes des donneurs familiaux/remplacements. En effet, au Burkina Faso
comme dans d'autres pays ouest africains, le pourcentage de donneurs réguliers est
faible (11,4%) et la plupart d'entre eux ne font pas plus de deux dons de sang par an
(Owusu-Ofori et al, 2010; Diarra et al, 2009).
D’une manière générale, les collectes de sang ont concerné les donneurs bénévoles
volontaires non rémunérés. Dans tout les centres de transfusion du pays, le recrutement
de donneurs s’est effectué principalement au cours des cérémonies culturelles,
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 123
religieuses, de distractions organisées par les scolaires (élèves, étudiants), les
coopératives, les associations et dans quelques cas les services et les entreprises privées
ou publiques.
Les prévalences des marqueurs infectieux chez les donneurs bénévoles volontaires non
rémunérés et de premier don dans tout le pays sont élevées et similaires à celles
décrites dans la population par Collenberg et al. (Collenberg et al, 2006). Seul le centre
de Bobo-Dioulasso a montré des prévalences plus faibles que celles des autres centres.
Cependant les prévalences des marqueurs infectieux (VIH, VHB, VHC et syphilis) étaient
plus élevées que les données fournies par d’autres auteurs (Dahourou et al, 2010;
Lefrère et al, 2011).
Les variations épidémiologiques entre les centres de transfusions sont considérables et
significatives (tableaux V et VII). Les prévalences des anticorps anti-VIH et anti-VHB
sont assez similaires à celles décrites dans les pays voisins comme le Mali, la Guinée et
le Ghana chez les donneurs familiaux/remplacements (Loua et al, 2010; Diarra et al,
2009; Allain et al, 2008). La séropositivité au VIH était similaire chez les donneurs de
sang de premier don (à majorité jeunes) par rapport aux donneurs réguliers. Ce constat
est discordant avec les rapports publiés par d’autres études (UNIAIDS, 2010; Buseri et
al ,2009; Petersen et al, 1993; Ampofo et al, 2002). Les pourcentages des donneurs
réguliers et des donneurs de premier don sont similaires dans tous les centres. Ce sont
majoritairement des jeunes (20-29 ans) sexuellement plus actifs et potentiellement plus
exposés aux infections. Malgré les campagnes de sensibilisation sur les infections
sexuellement transmissibles auprès des jeunes, il n’en demeure pas moins que beaucoup
d’entre eux
par leur vulnérabilité socio-économique continuent à adopter des
comportements à risque. Une autre explication réside dans le fait que la majorité des
donneurs réguliers ne font que 2 dons de sang par an et le temps séparant les deux dons
est très variable (Jusqu'à 10 mois entre les deux dons). Pendant le temps qui sépare les
dons, cette catégorie de donneurs réguliers peut s’exposer au risque de nouvelles
infections.
Cependant pour les pays d’Afrique subsaharienne comme le Burkina où le paludisme est
endémique les causes des anémies sont nombreuses
surtout chez les femmes
(malnutrition, drépanocytose, menstrues, saignements divers etc.). L’effet d’un don de
sang est donc plus long à réparer que dans d’autres populations. Pour éviter de rendre
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 124
les donneurs anémiques et d’éviter une éventuelle carence en fer (ferritine) deux dons
de sang par an sont préconisés, trois dons ou plus serait pour la majorité des donneurs
courir le risque d’être anémiés. Ceci limite la disponibilité en PSL puisque la grande
partie de ces donneurs de sang volontaires sont des élèves et des étudiants difficiles à
fidéliser et souvent en déplacement (vacances, congés scolaires).
En revanche, les séroprévalences des anticorps anti-VHC comprises entre 4,3 et 9,2%
selon les centres de transfusions sanguines au Burkina Faso étaient plus élevées que
celles décrites dans d'autres pays ouest-africains (Candotti et al, 2003; Jeannel et al,
1998; Ruggieri et al, 1996). Dans les 3 centres de transfusion sanguine (Ouagadougou,
Bobo-Dioulasso et Fada N’gourma), les anticorps anti-VHC ont été retrouvés
majoritairement chez les donneurs jeunes (80,3% en dessous de 30 ans contre 75,4% <
30 chez les donneurs non infectés par le VHC). La séroconversion à l’anti-VHC a
également été retrouvée à des fréquences élevées chez les donneurs réguliers (2,8% par
an).
Les prévalences du VHC observées chez les donneurs de sang du Burkina sont
supérieures aux valeurs situées entre 0,07 % et 0,6% retrouvées aux Etats-Unis et en
Europe (Murphy et al, 2010 ; Durro et al, 2010) et inférieures à la prévalence de 12,3%
rapportée chez les donneurs de sang du Nigeria (Halim et al, 2000). Globalement les
prévalences du VHC étaient pratiquement similaires chez les donneurs de sang de
premier don des 4 centres de transfusion sanguine. Ceci est en discordance avec les
résultats de Buseri et al. (2009). Ces variations drastiques des prévalences décrites dans
la sous région par d’autres études, suggèrent que d’autres voies d'infections restent à
élucider. En effet au Burkina, l’usage des drogues par voie intraveineuse n’est pas très
répandu, l’explication la plus plausible résiderait dans l’utilisation en zone rurale
d’objets tranchants qui peuvent être potentiellement infectieux dans les circoncisions,
les tatouages ethniques, les scarifications et récemment le piercing chez les jeunes des
grandes villes comme Ouagadougou et Bobo Dioulasso. Aussi,
des études plus
approfondies sont nécessaires pour mieux comprendre les modes de transmission
actuelle du VHC au Burkina.
Et comme rapporté au Ghana, l'efficacité de la reprise des analyses sur des échantillons
initialement réactifs aux anti-VHC est insuffisante et des réactions de fausses positivités
ne sont pas toutes éliminées (Allain, 2011). Des études ont rapporté une baisse
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 125
significative de la prévalence de l’anti-VHC (jusqu'à 5 fois) lorsque que les échantillons
initialement réactifs étaient confirmés par des méthodes plus précises (Candotti et al,
2003; Vardas et al, 1999; Ampofo et al, 2002). Par conséquent la prévalence réelle de
l’anti-VHC se situe en Afrique subsaharienne en moyenne autour de 1% sauf au Nigeria
(Allain, 2011). Compte tenu des fréquences élevées de tous les marqueurs, les coinfections avec un ou plusieurs maladies infectieuses présentaient des prévalences
également élevées (tableau V et VIII).
La séroprévalence de la syphilis dans cette étude est inférieure à celle trouvée chez les
donneurs de sang en Tanzanie (Matee et al, 1999). Cependant elle est plus élevée que
celle observée au Nigéria (Ejele et al, 2005). Des prévalences plus élevées de 12,8% et
12,7% ont été rapportées respectivement en Ethiopie et en Tanzanie (Matee et al, 2006).
La différence entre ces prévalences très élevées et les nôtres n’a pu être élucidée ; mais
pourraient être attribuée à des variations géographiques qui probablement influent sur
la prévalence de la syphilis (Tessema et al, 2010). Cette persistance des marqueurs
infectieux dans la population de donneurs de sang au Burkina pourrait justifier une
incidence également élevée de ces agents infectieux. Nous avons mené une étude
d’estimation de l’incidence des marqueurs viraux chez les donneurs de sang réguliers
des centres de transfusion du pays. Pour mieux apprécier les éventuels risques pour la
sécurité transfusionnelle de ces fortes prévalences et trouver des alternatives pour un
meilleur recrutement et une fidélisation de donneurs réguliers.
VI.4.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang
volontaires, réguliers de trois
centres régionaux de transfusion sanguine du
Burkina
En 2009, les centres de transfusion de Ouagadougou, de Bobo-Dioulasso et de Fada
N’gourma comptaient 11,3% (3.981/35.401) de donneurs de sang réguliers. Les
prévalences élevées des marqueurs viraux dépistés dans la population de donneurs de
sang volontaires ont engendrés des taux d’incidences de 3270,2 ; 5874,1 et 6784,6
respectivement pour l’anti-VIH-1, l’AgHBs et
l’anti-VHC pour
100.000 dons. Ces
incidences également élevées n’étaient pas similaires dans tous les centres que nous
avons étudiés. Comme les prévalences des agents infectieux observées à Bobo© Thèse de Doctorat Unique
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 126
Dioulasso, l’incidence des marqueurs viraux chez les donneurs de sang réguliers de cette
Ville était plus faible que celles des autres centres. Cependant les taux d’infections
incidentes étaient élevés chez les donneurs de sang des 3 centres de transfusion réunis.
La majorité des infections incidentes ont été retrouvées chez les hommes (88,5%), qui
constitue l’essentiel de la population de donneurs en Afrique subsaharienne (Sarkodie et
al, 2001 ; Matee et al, 2006 ; Cunha et al, 2007 ; Allain et al, 2009 ; Tounkara et al,
2009a ; Tessema et al, 2010 ; Nagalo et al, 2011b). La majorité des donneurs réguliers
ont été recrutés directement dans les centres de transfusion (66,8%), dans les écoles
(21,3%) et au cours des collectes mobiles en provinces (5,8%). Ces lieux de
recrutements des donneurs de sang ont une influence sur l’épidémiologie de ces
derniers. En effet, des prévalences élevées des marqueurs de l’hépatite B et C ont été
trouvées respectivement chez les donneurs de sang de premier don en zone rurale
(22,2 et 19,1%) et en zone urbaine (37,4 et 26,4%). Pour les donneurs de sang des
provinces, les explications proviendraient du mode de vie de ces populations rurales
(tatouages ethniques, mode de vie communautaire etc.) (Nagalo et al, 2011b). Les
donneurs issus des écoles sont à majorité jeunes (adolescents) et l’infection au VHB se
contracte en bas âge dans nos régions d’où une prévalence élevée de ce marqueur
(Allain, 2011). Toutefois, la fréquence élevée de séroconversion au VHB chez les
donneurs réguliers (2,5%/an) implique que la transmission sexuelle a lieu chez les
adultes.
En Afrique subsaharienne les prévalences de l’AgHBs sont généralement élevées. Deux
études précédentes ont mis en évidence un faible portage de l’AgHBe (marqueur de la
multiplication du virus) chez les donneurs de sang AgHBs positifs (Tsega et al, 1987 ;
Ryder et al, 1984); ainsi que la forte présence de sérologies HBV positives chez les
receveurs, pourrait avoir pour conséquence la réduction significative de la survenue
des cas d’hépatites post-transfusionnelles dues au VHB. En effet, l’AgHBs est le principal
marqueur recherché pour le diagnostic de VHB chez les donneurs de sang. Il est urgent
d’associer d’autres marqueurs de l’infection à adjoindre au dépistage de l’AgHBs.
Contrairement aux études de Tsega et al. (1987) et de Ryder et al. (1984) qui posaient la
question de la nécessité du dépistage de l’AgHBs chez les donneurs de sang en Afrique
subsaharienne ; ce dépistage est plus que nécessaire malgré les fortes prévalences
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 127
rencontrées dans cette zone. En effet, nous suggérons plutôt une plus grande couverture
vaccinale des enfants et des femmes enceintes et une extension de la vaccination contre
le VHB chez les donneurs réguliers de sang comme alternative à l’abandon du dépistage
de VHB chez les donneurs de sang préconisé par Ryder et al.
Les prévalences du VIH trouvées chez les donneurs volontaires de premier don et
réguliers étaient presque similaires (respectivement 1,8 et 1,3%). Ces données
confirment les résultats des comparaisons des prévalences de l’AgHBs et les anticorps
VIH
entre
les
donneurs
volontaires
de
premier
don
et
les
donneurs
familiaux/remplacements au Ghana (Allain et al, 2010), en Guinée (Loua et Nze Nkoure,
2010) et au Cameroun (Mbanya et al, 2010).
Cependant, la prévalence des co-infections entre le VIH, le VHB et le VHC a été similaire
aux prévalences des marqueurs pris séparément ce qui explique que les voies
d’infections sont probablement les mêmes. En Afrique subsaharienne, l’hépatite B est
contracté essentiellement en bas âge (transmission horizontale jusqu’à 5 ans) tandis que
le VIH est contracté par voie sexuelle avec un pic entre 15 et 20 ans. Ceci pourrait
expliquer les similitudes dans les prévalences des co-infections VIH-AgHBs positifs et
l’AgHBs pris séparément chez les donneurs de sang de premier don comme dans la
population en générale.
La transmission du VHC étant liée au contact direct avec du sang aucune association
entre l'infection au VIH et au VHB n’a été constatée. Il n’y avait pas de différence
significative entre les prévalences du VIH et du VHC trouvées dans les deux catégories
de donneurs de sang des différents centres de transfusion. Les prévalences des
marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de premier don semblent assez
représentatives du profil épidémiologique de la population en générale. Cependant, ils
représentent la principale source de dons de sang et assurent
l'approvisionnement en sang du pays.
fidélisation
Ce qui implique que
des donneurs réguliers serait
l'essentiel de
seule une meilleure
en mesure d'améliorer la sécurité
transfusionnelle dans les centres de transfusion du Burkina Faso. En outre, compte tenu
de la pénurie
chronique de sang
dans le pays et le coût élevé qu’engendre le
recrutement des donneurs bénévoles non rémunérés, l’orientation de la collecte de sang
vers les donneurs familiaux /remplacements devrait être sérieusement envisagée. Dans
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 128
un contexte où les ressources du pays sont modestes cette nouvelle stratégie pourrait
permettre de recruter plus de donneurs tout en les fidélisant pour un meilleur
approvisionnement en sang et en composants sanguins pour une majorité de patients
dont la survie dépend de la disponibilité en produits sanguins labiles.
VI.4.3. Approvisionnement en sang sûr : Quel type de donneur recruter ?
Les résultats précédents montrent que les donneurs de sang de premier don censés être
une population susceptible d’héberger plus de donneurs en séroconversion que les
réguliers ont les mêmes profils épidémiologiques que ces derniers. Finalement le choix
de donneurs volontaires non rémunérés et leur fidélisation comme population cible
pour les dons de sang ne garantie pas un apport suffisant en poches de sang ou une
meilleure
sécurité
transfusionnelle.
Puisque
l’objectif
est
d’approvisionner
régulièrement en quantité suffisante et en qualité les systèmes sanitaires du pays en
sang, il faudrait donc se tourner vers d’autres types de donneurs potentiels puisque
jusqu'à nos jours aucun produit de synthèse n’a pu remplacer convenablement les
produits sanguins labiles.
A l’exclusion des donneurs rémunérés les donneurs familiaux sont les plus présents
dans les dons de sang. Les structures spécialisées dans le traitement du sang ne sont pas
toujours présentes dans les régions reculées et le besoin immédiat de sang pour un
patient hospitalisé se faisant pressant, on a recours le plus souvent aux donneurs
familiaux/remplacements qui sont pour la plupart de la famille du malade ou de
l’entourage de ce dernier (Bates et al, 2007 ; Tapko et al, 2007). Ce type de don
généralement se fait par pure humanisme et le donneur ne s’attend pas dans la plupart
des situations à une compensation. Cela revient beaucoup moins cher que si on
mobilisait des équipes et du matériel pour des collectes mobiles (Allain, 2011).
Une grande partie des dons bénévoles non rémunérés sont faits par des élèves de sexe
masculins issus du secondaire âgés de 17-20 ans, or le constat dans nos résultats c’est
que des marqueurs comme l’AgHBs sont assez élevés chez ces jeunes puisque cette
pathologie est contractée en bas âge en Afrique subsaharienne. Contrairement à ce
groupe majoritaire les donneurs familiaux /remplacement sont plus âgés avec un âge
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 129
médian de 30 ans contre 18 ans pour les donneurs volontaires non rémunérés (Allain,
2011). A cet âge en plus du fait que la prévalence de l’hépatite B diminue, les donneurs
sont plus conscients de l’enjeu du don de sang et répondront aisément aux questions de
sélection et le plus souvent la plupart ont a leur actif un don ou un statut sérologique à
au moins un des marqueurs recherchés en transfusion.
La persistance, dans notre
région, des maladies transmissibles par le sang pose un réel problème vu les taux
considérables de nouvelles contaminations. En plus de la volonté de garantir une
meilleure disponibilité des produits sanguins, le Burkina devrait se tourner vers des
techniques de dépistage plus adaptées (PCR) à nos réalités. Le dépistage génomique
viral est déjà utilisé et maitrisé dans quelques centres de transfusion sanguine de la
sous-région au Ghana (Allain JP, communication personnelle) et en Côte d’Ivoire. Nous
avons tenté une étude pilote dans le but d’apprécier la faisabilité de la méthode et
d’apporter des réponses au problème de diagnostic des agents infectieux transmissibles
par le sang rencontré dans les centres de transfusion.
VI.4.4. Quel type de donneur pour quel coût ?
D’une manière générale, la sécurité transfusionnelle en Afrique subsaharienne est
marquée par des prévalences élevées des marqueurs infectieux, une forte demande en
poches de sang et la modestie des ressources allouées au secteur de la santé. Dans ce
contexte, pour des pays à revenus limités comme le Burkina Faso, le meilleur donneur
de sang est celui qui
assure un approvisionnement
continu en PSL à un coût
raisonnable (Allain, 2011). Au Burkina, la disponibilité des poches de sang ne suffit pas
à couvrir les besoins du pays. Et certains centres de santé en zones rurales dépendent le
plus souvent des donneurs familiaux/remplacements pour les dons, lorsque ceux-ci
accompagnent un membre de leur famille ou un proche malade. Ce type de don est
presqu’une aubaine et constitue du sang immédiatement disponible pour l’hospitalisé
et/ou un don complémentaire qui pourrait être mis en réserve pour d’autres malades.
Cette stratégie est moins coûteuse, car elle ne nécessite pas un recrutement coûteux et
un processus de collecte éprouvant (Allain, 2010). Comme le montre plusieurs auteurs
le prix de revient d’une poche de sang est 2 à 3 fois moins élevé
en Afrique
subsaharienne pour les donneurs de sang familiaux/remplacements (6.000–9.000
FCFA) que pour les donneurs de sang volontaires non rémunérés (13.000-30.000 FCA)
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 130
(Allain et al, 2004, 2010; Bates et al, 2007; Bates et Hassall, 2010). La politique actuelle
du recrutement des donneurs de sang devrait prendre en compte les donneurs
familiaux/remplacements parce que différentes études montrent qu’ils ne constituent
pas une population plus à risque pour le receveur que les donneurs volontaires non
rémunérés de premier don dont le recrutement nécessite des moyens financiers et
matériels 2 à 5 fois plus élevés (Allain, 2011). C’est la répétition du don qui améliore la
sécurité transfusionnelle, encore qu’au Burkina, comme nous l’avons montré ici,
l’incidence des infections chez les donneurs réguliers est remarquablement élevée, ce
qui limite cet avantage escompté. Comme l’ont montré les études Sud Africaines
(Vermeulen et al, 2009), les infections récentes se trouvent plus fréquemment chez les
donneurs réguliers et, en conséquence, le nombre des périodes fenêtre pour le VIH. Au
Burkina, ces périodes fenêtre semblent s’étendre non seulement au VIH mais aussi au
VHC, augmentant d’autant le risque transfusionnel et le besoin urgent d’un dépistage
génomique dont nous avons montré la faisabilité.
VI.4.5. Introduction du dépistage génomique viral en transfusion sanguine au CRTS
de Ouagadougou : diagnostic moléculaire du VIH-1 sur les pools de plasmas de
donneurs de sang
Longtemps réservée
au domaine de la recherche en Afrique subsaharienne les
techniques de biologie moléculaire contribuent qualitativement à l’amélioration du
dépistage en transfusion sanguine. Nombreuses sont les variantes de la PCR qui ont
prouvées leur efficacité partout dans le monde, du DGV (dépistage génomique viral) en
passant par les méthodes multiplex pour un diagnostic en une seule étape du VIH, du
VHB et du VHC.
En transfusion sanguine, le risque de qualifier une poche infectée au VIH provient
exclusivement des dons d’individus en période fenêtre où la présence des anticorps
dirigés contre le virus est indétectable chez l’individu primo-infecté (Coste J, 2000). Au
CRTS-O, la marge de sécurité est revue à la hausse pour le diagnostic sérologique des
marqueurs viraux tel que le VIH. Ainsi la valeur seuil de chaque plaque analysée à
l’ELISA de 4e génération est réduite de 20 %. Et tous les dons situés dans cette marge
réduite sont considérés comme douteux (zone grise) et éliminés du circuit
transfusionnel.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 131
Le donneur douteux est invité à revenir quelques semaines plus tard pour un second
prélèvement de confirmation ; le premier don «accroché» pour un marqueur infectieux
n’étant pas introduit dans le circuit de distribution des produits sanguins labiles (PSL).
Pendant le processus de confirmation le donneur est dans une attente éprouvante et le
risque qu’il ne revient pas au CRTSO pour le second prélèvement est aussi à considérer.
Cela pourrait poser un problème de fidélisation des donneurs. Surtout si le don
considéré douteux s’avère être non réactif pour le VIH au test de reprise ou si le statut
du donneur est confirmé négatif dans une autre structure sanitaire. L’étude avait pour
objectif d’améliorer la qualité du diagnostic du VIH-1 par l’introduction de la RT-PCR sur
les dons de sang au CRTS-O.
Pour minimiser le coût de la RT-PCR, et les effets dus à la dilution des plasmas (Le Corfec
et al, 1999) nous avons choisi de travailler sur des pools de 5 plasmas. En effet,
différentes tailles de pools (15 à 96), ont déjà été développés et testés (McMahon et al,
1995 ; Candotti et al, 2003). Ces pools d’effectifs restreints ont l’avantage de réduire le
nombre de tests à effectuer tout en affectant que très peu la sensibilité de la méthode.
Les échantillons ont été repartis en pools en fonction de leur réactivité préalable à
l’ELISA de 4 ème génération. Sur les 20 pools de plasmas testés (10 pools de négatifs, 8
pools de positifs et 2 pools de douteux au VIH-1), le statut sérologique des 10 pools de
négatifs et des 8 pools de positifs a été confirmé par RT-PCR.
La totalité des pools de positifs et de négatifs ont été analysés individuellement et tous
se sont révélées être soit des dons infectés pour les pools positifs ou des dons noninfectés pour les pools négatifs. Des 2 pools de plasmas de donneurs de sang douteux à
l’ELISA, un pool a été confirmé positif et l’autre négatif à la RT-PCR du VIH-1. Nous avons
ensuite recherché l’ARN du VIH-1 individuellement dans les dix dons des 2 pools
douteux. Les résultats des tests individuels ont montré que les cinq dons du pool positif
étaient tous des dons infectés au VIH-1, tandis que les cinq autres dons du pool testé
négatif étaient non infectés.
Les sérologies VIH effectuées quelques semaines plus tard, sur un second prélèvement
issu des 5 dons douteux confirmés négatifs par RT-PCR, étaient négatives. Ce qui
constitue un gain net de 5 poches de sang. Comparativement à l’ELISA de 4éme
génération, la RT-PCR permet d’éviter le désagrément de l’attente des résultats en
favorisant une notification rapide aux donneurs. Elle permet également dans notre cas
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 132
l’identification avec une plus grande sensibilité et spécificité des dons contaminés suivis
de leur élimination. Nous avons mené une étude pilote sur les avantages de l’utilisation
de la RT-PCR du VIH-1 en transfusion sanguine. La technique s’est avérée être très
avantageuse pour le centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou.
Cependant l’inconvénient est le coût élevé de sa réalisation et son usage nécessite aussi
un personnel qualifié. Nous préconisons la réalisation de la RT-PCR du VIH-1 associée à
l’ELISA de 4éme génération au CRTS-O. En testant uniquement les échantillons dont le
statut est douteux au VIH par ELISA, un effectif réduit sera obtenu, et les dons
pourraient être testés individuellement par RT-PCR.
Cependant la modestie des moyens des banques de sang d’Afrique subsaharienne et le
manque d’infrastructures sanitaires adéquates constituent une entrave à l’extension de
la PCR et de la PCR en temps réel qui actuellement sont uniquement réservées au
domaine de la recherche au niveau du dépistage.
Au Burkina Faso comme dans d’autres pays ouest africains, le pourcentage de donneurs
réguliers est faible (9 à 11 %) et la plupart d’entre eux ne font pas plus de deux dons de
sang par an (Owusu-Ofori et al, 2010 ; Diarra et al, 2009). A cela s’ajoute la faiblesse des
effectifs de donneurs (24.261 dons pour presque 1,5 millions d’habitants en 2009 au
CRTS-O), le don du sang est souvent fait dans le cadre d’activités socioculturelles. Ce
recrutement assez aléatoire de donneurs augmente le risque d’enrôler des donneurs en
séroconversions ou en primo infection. D’où l’intérêt de l’introduction d’une technique
aussi spécifique et sensible que la RT-PCR en transfusion sanguine.
La RT-PCR présente aussi un avantage économique non négligeable. En effet, le coût
engendré par la qualification biologique d’une poche de sang au CRTS-O est d’environ 25
000 F.CFA (38,11 €) et ce coût est revu à la hausse si le don provient d’une collecte
mobile (30 000 F.CFA soit 45,73 €). En utilisant la technique RT-PCR de notre étude, le
diagnostic reviendrait à 8 000 F.CFA (12,20 €) par poche pour le VIH-1. Une PCR
multiplex détectant à la fois le VIH, VHB et VHC a été mise au point et elle ne coûterait
que 10 € pour valider une poche de sang (JP Allain, Communication personnelle). En
associant dans un premier temps au CRTS-O, la RT-PCR à l’ELISA de 4ème génération on
obtient un algorithme qui pourrait réduire le coût de la technique dans un souci
d’économie de la santé, tout en renforçant la sécurité transfusionnelle.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 133
VI.4.6. Coordination des activités transfusionnelles : Quelle approche ?
La transfusion sanguine est une composante capitale des soins de santé modernes.
Garantir une sécurité transfusionnelle convenable s’avère être d’une nécessité
indéniable pour la santé du receveur notamment dans les circonstances où les
prévalences des agents infectieux transmissibles par le sang sont élevées. Cela sous
entend une bonne connaissance de l’épidémiologie de ces différents marqueurs suivi de
leur dépistage systématique sur toutes les unités de sang collectées. En effet, les
produits sanguins labiles doivent tous être sans danger, efficaces sur le plan clinique, et
conformes à la qualité désirée. Pour cela une bonne politique
transfusionnelle
s’appuyant sur des stratégies rigoureuses doit être mise en place.
Cette politique implique non seulement la création d’une structure nationale de
transfusion sanguine bien organisée qui coordonne au plan national les collectes chez
des donneurs de sang sûr issus de populations à faible risque ; mais aussi le dépistage
systématique sur tous les dons de sang (incluant : recherche des agents infectieux
transmissibles par transfusion, groupage sanguin, tests de compatibilités et une
utilisation clinique appropriée du sang).
Enfin une bonne politique de transfusion sanguine nécessite l’élaboration d’un système
d’assurance qualité efficace qui est en mesure de garantir la traçabilité, depuis le
recrutement et la sélection des donneurs jusqu’à la distribution des produits sanguins
labiles. Cette traçabilité prend en compte non seulement les activités transfusionnelles
mais aussi le contrôle et la bonne utilisation des réactifs et consommables utilisés en
routine. La politique qualité doit également être adaptée à la structure, aux besoins et
aux possibilités des centres de transfusion sanguine ainsi qu’aux besoins des hôpitaux et
des patients desservis.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 134
Conclusion et perspectives
Les précédentes études menées dans les centres de transfusion sanguine du Burkina ont
montrées des prévalences élevées des principaux marqueurs infectieux dépistés dans
les banques de sang du pays. Du fait de ces prévalences élevées dans les centres de
transfusion sanguine la fréquence d’accidents transfusionnels représentée par le risque
de transmission d’un virus au cours d’une transfusion sanguine pourrait être également
élevée. En plus des prévalences, les incidences également élevées des marqueurs viraux
qu’on retrouve dans la population de donneurs représente un véritable problème de
santé publique pour les autorités sanitaires du pays.
La problématique de l’approvisionnement en sang repose sur la disponibilité des
donneurs notamment les réguliers qui sont en mesure de garantir une assez bonne
sécurité des produits sanguins labiles. Le constat suivant est qu’une grande majorité des
donneurs n’a effectué qu’un seul don au cours de l’année 2009. Cela traduit le faible
taux de fidélisation des donneurs de sang qui ont le même profil épidémiologique dans
les anciens centres de transfusions (Ouagadougou et Fada N’gourma) comme dans les
plus récents (Koudougou). Les besoins en poches de sang augmentent chaque année et il
s’avère être nécessaire de se tourner vers de nouvelles sources d’approvisionnement en
PSL.
Comme
le
montre
plusieurs
auteurs
le
recrutement
des
donneurs
familiaux/remplacements longtemps exclus du processus transfusionnel en Afrique
subsaharienne serait une solution palliative aux besoins en sang. Les prévalences des
marqueurs infectieux dans cette catégorie de donneurs sont similaires à celles présentes
chez les donneurs de sang de premier don. Il serait donc judicieux de mettre en place
des stratégies pour enrôler les donneurs familiaux/remplacements et ensuite les
fidéliser enfin de satisfaire la demande en sang et améliorer la sécurité transfusionnelle
en Afrique subsaharienne.
Au regard des résultats que nous avons obtenu ; les perspectives d’utilisation de la PCR
en transfusion sanguine au Burkina sont remarquables et méritent
d’être plus
approfondies par des études de faisabilité à grande échelle. La recherche d’une sécurité
maximale en transfusion sanguine passe d’une part par une meilleure sélection des
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 135
donneurs de sang par la mise en place d’une politique de fidélisation robuste. D’autre
part par le diagnostic précoce des principales maladies transmissibles par le sang et
susceptibles d’infecter le receveur. En utilisant des techniques comme le DGV qui ont la
particularité d’allier une haute sensibilité à une grande spécificité
on pourrait
augmenter davantage les capacités de diagnostic des agents infectieux transmissibles
par transfusion sanguine partant de là l’amélioration même de la sécurité des produits
sanguins labiles au Burkina Faso.
En perspectives nous souhaitons toujours dans l’optique d’améliorer les services offerts
par le centre national de transfusion sanguine du Burkina Faso œuvrer à travers
d’autres études afin de permettre :
Le développement de nouvelles stratégies pour garantir aux patients un
approvisionnement en sang tant dans la quantité que dans la qualité ;
La vulgarisation et l’utilisation de la PCR comme outil de diagnostic précoce des
infections transmissibles par le sang en transfusion sanguine dans les banques de
sang du pays ;
Et étendre nos investigations à d’autres types de virus potentiellement infectieux et
présents chez les donneurs de sang comme le virus de l’hépatite G (VHG), les
Herpesviridae.
Une enquête sur l’impact sur la santé du receveur en l’occurrence les enfants et les
femmes enceintes de la transmission du paludisme par la transfusion sanguine.
Une étude approfondie sur les prévalences élevées du VHC observées chez les
donneurs de sang au Burkina Faso.
BOLNI MARIUS NAGALO
Page 136
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Med Rev. 2011 Aug 24.
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Liste des articles de la présente thèse
Article I.
Nagalo MB, Sanou M, Bisseye C, Kaboré MI, Nebie YK, Kienou K, Kiba A, Dahourou H,
Ouattara S, Zongo JD, Simporé J. Seroprevalence of human immunodeficiency virus
(HIV), hepatitis B and C and syphilis among blood donors at Koudougou (Burkina Faso)
in 2009. Blood Transfusion. 2011 Oct ; 9 (4) : 419-24.
Article II.
Nagalo MB, Sanou M, Bisseye C, Kaboré MI, Nebie YK, Kienou K, Kiba A, Dahourou H,
Oua ttara S, Jean Baptiste Nikiema, Rémy Moret, Jean Didier Zongo and Jacques Simpore.
Seroprevalence and incidence of transfusion-transmitted infectious diseases among
blood donors from regional blood transfusion centers in Burkina Faso, West Africa.
Tropical Medicine and International Health 2012 Feb; 17 (2):247-53.
Article III.
Nagalo, B. M., C. Bisseye, M. Sanou, Y. K. Nebie, A. Kiba, K. Kienou, J. D. Zongo, and J.
Simpore (2011a). [Molecular diagnosis of acquired human immunodeficiency virus (HIV) in
pooled plasma from blood donors at the Regional Blood Transfusion Center in Ouagadougou,
Burkina Faso]. Med Trop 2011 (Mars) 71: 137-41.
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Autres articles non inclus dans la présente thèse
1-Linguissi LS, Nagalo BM, Bisseye C, Kagoné TS, Sanou M, Tao I, Benao V, Simporé J,
Koné B. Seroprevalence of toxoplasmosis and rubella in pregnant women attending
antenatal private clinic at Ouagadougou, Burkina Faso. Asian Pac J Trop Med. 2012
Oct;5(10):810-3. doi: 10.1016/S1995-7645(12)60148-5.
2-Laure Stella Ghoma Linguissi, Cyrille Bisseye, Tani Sagna, Bolni Marius Nagalo,
Djeneba Ouermi, Florencia W. Djigma, Salvatore Pignatelli, Joseph D. Sia, Virginio Pietra,
Remy Moret, Jean Baptiste Nikiema, Jacques Simpore. Efficiency of HAART in the
prevention of mother to children HIV-1 transmission at Saint Camille medical centre in
Burkina Faso, West Africa. Asian Pac J Trop Med. 2012 Dec;5(12):991-4. doi:
10.1016/S1995-7645(12)60188-6.
3 -Moctar Tokèda Abdoul Zeba, Mahamoudou Sanou, Cyrille Bisseye, Alice Kiba, Bolni
Marius Nagalo, Florencia Wendkuuni Djigma, Tegwindé Rebecca Compaoré, Yacouba
Koumpingnin Nebié, Kisito Kienou, Tani Sagna, Virginio Pietra, Rémy Moret, Jacques
Simporé. Characterisation of hepatitis C virus genotype among blood donors at the
regional blood transfusion centre of Ouagadougou, Burkina Faso. Blood Transfus. 2012
Sep 12:1-5. doi: 10.2450/2012.0089-12.
4-Mahamoudou Sanou, Marius Bolni Nagalo, Cyrille Bisseye, Dapla Palenfo, Jacques
Simporé, Rasmata Traoré, Lassana Sangaré. Efficacité du diagnostic moléculaire par PCR
en temps réel d’agents bactériens responsables des méningites purulentes au Burkina
Faso. Médecine et Santé Tropicales ; Sous presse.
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