Cytométrie en flux

 Guide du
débutant:
Cytométrie en flux
Introduction La cytométrie en flux est une méthode largement utilisée pour l’étude des cellules qui, pour le novice, peut paraître intimidante de par la complexité de son approche expérimentale et son analyse de données. Ce guide d’introduction simplifié a été écrit avec ces personnes novices à l’esprit. Il a pour mission de fournir un aperçu des thèmes suivant: 
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La cytométrie en flux et les applications qui lui sont associées Les composants de base du cytomètre en flux Les complexités principales de la cytométrie en flux Les avantages de Lightning‐Link® ‐ une technique simple qui permet de marquer anticorps et protéines en juste 30 secondes Qu’est‐ce que la cytométrie de flux et à quoi sert‐elle? En ce qui concerne l’analyse cellulaire, le principe fondamental de la cytométrie en flux est le suivant: une suspension cellulaire est concentrée en un flux à cellule unique qui passe à travers une source lumineuse (généralement un rayon laser). La lumière diffusée et émise (qui peut être fluorescente si les cellules sont marquées avec un marqueur fluorescent) est ensuite mesurée grâce à un éventail de détecteurs; et les mesures obtenues sont utilisées pour générer des ensembles de données à paramètres multiples. Ces paramètres représentent les caractéristiques physiques des cellules et leurs propriétés fluorescentes. La dimension et la granularité des cellules peuvent être déterminées en fonction des caractéristiques de leur dispersion lumineuse frontale et latérale (respectivement DLF et DLL). La caractérisation des cellules et/ou individualisation des diverses protéines peut être rendue encore plus précise par la coloration des cellules avec des anticorps, protéines, ou molécules à marquage fluorescent qui identifient les composants cellulaires et/ou leur intégration. Les marqueurs fluorescents acceptent l’énergie lumineuse à une longueur d’onde donnée (excitation) et émettent à une longueur d’onde plus élevée (émission). La lumière fluorescente, qui est émise par ces marqueurs lorsqu’ils sont excités par une source lumineuse adéquate, est canalisée par des filtres adaptés et les signaux sont récoltés par un assortiment de détecteurs. Relier de tels fluorochromes à un anticorps, ou utiliser des molécules à marquage fluorescent qui se lient à des composants cellulaires, permet d’identifier et de caractériser les profils des protéines qui sont présentes dans ces cellules grâce à la cytométrie en flux. Avec des instruments adéquats, il est possible d’identifier des sous‐populations de cellules spécifiques grâce à leurs propriétés physiques et/ou leurs caractéristiques fluorescentes, puis de les isoler et les trier. La cytométrie en flux et ses applications 
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Analyse ADN/Cycle Cellulaire Prolifération cellulaire Phénotypage multicolore (surface cellulaire) Oxidation de monocytes Oxidation de neutrophiles Analyse Microbiologique Cytotoxicité cellulaire et des anticorps ou à médiation complémentaire 
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Viabilité cellulaire Flux intracellulaire ionique (ex. Ca2+) Phénotypage multicolore (intracellulaire) Phagocytose de monocytes Phagocytose de neutrophiles Traffic cellulaire Triage par morphologie (DLF et DLL) et/ou caractéristiques fluorescents. Grace au cytomètre en flux, il est possible d’analyser des solutions cellulaires à un rythme extrêmement soutenu (jusqu’à des dizaines de milliers de cellules par seconde) tout en permettant jusqu’à 500 molécules par cellule d’être enregistrées. La rapidité et sensibilité de la cytométrie en flux en fait donc une méthode d’analyse de choix pour des populations cellulaires secondaires. Lightning‐Link® is a registered trademark of Innova Biosciences DyLight ® is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries 2 | P a g e Le cytomètre en flux – Composants de base La Chambre de flux (en anglais: flow chamber; voir diagramme à droite) est au cœur du système instrumental et a pour objectif de délivrer un flux à cellule unique à l’endroit de mesure. Pour rendre ceci réalisable, il est nécessaire de concentrer les cellules analysées au centre d’un flux étroit, appelé fluide vecteur, de telle sorte qu’une seule cellule soit autorisée à passer au travers du rayon lumineux dans la chambre de flux. Cette technique, qui permet d’obtenir un flux à cellule unique grâce à un rétrécissement du courant, est utilisée dans la plupart des cytomètres en flux; cependant une nouvelle technique utilisant la focalisation acoustique est en cours de développement. Le débit du fluide vecteur détermine la vitesse à laquelle le courant de matière traverse la chambre de flux, et donc atteint le laser du cytomètre. Dans l’idéal, les cellules passent au travers du rayon une par une, ce qui permet de collecter des données pour chaque cellule (ou ‘évènement’). Ceci permet l’obtention de résultats aussi précis que possible, c’est pourquoi il est primordial de connaître les limites du cytomètre que vous utilisez. Certains cytomètres sont limités à un maximum de 900 évènements par seconde. Dans l’éventualité ou le débit du fluide délivre les cellules à un taux plus élevé que celui recommandé pour l’instrument en question, cela peut amener 2 cellules (ou plus) a passer au travers du rayon laser simultanément (‘évènements coïncidents’). Dans ce cas, une seule des cellules sera analysée, ce qui conduira à une perte de données. Bien que la plupart des cytomètres affichent un message tel que “Alerte: débit binaire”, les utilisateurs doivent garder à l’esprit les conséquences qu’un débit de fluide vecteur trop élevé peut entrainer. La source lumineuse peut être un laser, une lampe à arc ou une diode électroluminescente (LED). Les lampes à arc (ex: mercure, xénon‐mercure) sont des sources lumineuses brillantes et puissantes qui émettent à des longueurs d’ondes multiples. Elles sont typiquement utilisées dans les microscopes optiques. Malgré les avantages qu’un large spectre d’excitation peut parfois apporter ; dans certains cas, cela peut être un vrai désavantage. Pour cette raison, la plupart des cytomètres en flux ont un laser pour source lumineuse. Un laser permet une source brillante et cohérente, avec une longueur d’onde étroite, bien définie et spécifique. De nombreux lasers de différents types sont actuellement disponibles, et ce nombre ne cesse d’augmenter. Certains lasers couramment utilisés comprennent les lasers à argon (351, 454, 488, 514 nm), au krypton (488, 532, 630 nm), hélium‐néon (632 nm), hélium cadmium (325, 441 nm) et les lasers Yag (532 nm). Le système optique La lumière émise par les cellules après qu’elles aient été irradiées dans la chambre de flux est dirigée vers un ensemble de détecteurs par un système complexe de miroirs et filtres qui constituent le système optique. Une configuration typique pour un instrument à laser simple est illustrée ci‐contre. Dans cet exemple, la source lumineuse est un laser de couleur bleue qui est concentré grâce à une lentille de focalisation avant de pénétrer dans la chambre de flux. Comme précédemment expliqué, les caractéristiques physiques et fluorescentes des cellules peuvent être directement déterminées à partir des caractéristiques des signaux lumineux Lightning‐Link® is a registered trademark of Innova Biosciences DyLight ® is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries 3 | P a g e émis par ces cellules. Une barre située à l’extrémité opposée de la chambre de flux permet de bloquer le rayon laser. Un détecteur de dispersion lumineuse frontale (DLF) se trouve derrière cette barre de blocage et détecte toute dispersion lumineuse qui est dirigée vers l’avant. Cette dispersion lumineuse frontale est une indication de la taille des cellules. Une seconde lentille de focalisation permet de diriger les rayons lumineux vers un ensemble de filtres qui permettent de séparer les différentes longueurs d’onde présentes. Les filtres passe‐haut ne laissent passer que la lumière au‐dessus d’une certaine fréquence d’onde et les filtres passe‐bas ne laissent passer que la lumière en‐dessous d’une certaine fréquence. Ensembles, ces deux filtres forment un filtre passe‐bande. Dans le diagramme ci‐dessus, le filtre 1 sélectionne la lumière à une longueur d’onde inferieure à 500nm (bleue) qui nous permet d’obtenir des données sur la dispersion latérale (granularité cellulaire) tandis que le filtre 2 filtre la lumière à une longueur d’onde supérieure à 540nm (vert). La lumière (photons) qui traverse un système optique doit être convertie en un signal électronique afin de permettre l’acquisition et l’analyse de données. Ceci est réalisé grâce à des photodiodes (dispersion frontale) et des tubes photomultiplicateurs (TPM) pour les rayons fluorescents et les signaux associés à la lumière à dispersion latérale; ces composants sont souvent décrits en tant que détecteurs lumineux. Certains cytomètres en flux modernes peuvent avoir jusqu’à 12 TPM, un nombre que ne fait qu’augmenter avec le développement de nouvelles technologies. Analyse des données Les signaux électroniques générés par les photodiodes et les TPM sont collectés et traités par des logiciels informatiques. Certains de ces logiciels peuvent être dédiés à l’acquisition et l’analyse de données venant d’un type spécifique d’instrument, tandis que d’autres, plus autonomes, peuvent être adaptes à n’importe quel instrument à condition que les données aient été collectées dans le format .fcs (flow cytometry standard). Les caractéristiques de la dispersion lumineuse frontale et latérale peuvent être utilisées pour identifier des cellules de type diffèrent grâce à leur taille et granularité. Dans l’exemple ci‐contre, neutrophiles, monocytes et populations lymphocytes sont différenciées sur base des caractéristiques de leur dispersion lumineuse. (Données fournies par Dr Jason Boland, University of Sheffield) La viabilité cellulaire et la présence de composants cellulaires et de certaines protéines sont quelques‐uns des paramètres qui peuvent être déterminés grâce au marquage des cellules avec des molécules ou anticorps fluorescents adaptés. Il est aussi possible de déterminer l’interaction de ces cellules avec différentes molécules en les incubant avec des protéines et molécules fluorescentes. La lumière fluorescente émise par ces colorants quand ils traversent le laser d’excitation est dirigée au travers du système optique puis analysée. Les signaux sont collectés par l’ensemble des détecteurs et étudiés pour fournir des informations sur les caractéristiques fluorescentes de la population cellulaire en cours d’analyse. En plus de permettre de déterminer si une certaine population cellulaire réagit avec une probe fluorescente, la cytométrie en flux peut fournir de précieuses données sur l’intensité du signal, et donc une indication de la quantité de probes conjuguées à vos cellules. Il est donc important de considérer le pourcentage de cellules qui expriment l’émission fluorescente en question et l’intensité de cette fluorescence. Lightning‐Link® is a registered trademark of Innova Biosciences DyLight ® is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries 4 | P a g e Difficultés liées à la cytométrie en flux. La gamme disponible de cytomètres en flux ne cesse d’augmenter, rendant ces instruments de plus en plus adaptables aux besoins spécifiques de l’utilisateur. Les configurations des lasers et des filtres peuvent être customisées soit par le fabricant, soit par un fournisseur spécialisé. Les tous premiers cytomètres en flux ne comportaient habituellement qu’un seul laser et ne pouvaient détecter que 5 paramètres (dispersion lumineuse avant et latérale et 3 longueurs d’onde fluorescentes différentes). Cependant, ces appareils ont depuis lors considérablement augmenté en complexité et les modèles les plus récents peuvent avoir jusqu’à 5 lasers et sont capables de mesurer 20 paramètres différents (18 longueurs d’onde au lieu de 3). Ces avancées ont rendu l’élaboration d’expérimentations et d’approches analytiques beaucoup plus complexe, étant donné qu’un certain nombre de considérations doivent être prisent en compte, comme expliqué ci‐dessous. Bien que l’apparition de cytomètres “sur table” permette une simplification de l’utilisation de ces appareils, l’obtention de résultats significatifs continue à être un challenge. Ceci explique pourquoi il est essentiel pour l’utilisateur de comprendre les forces et faiblesses de cette méthode, ainsi que les limitations des données obtenues. Cela est particulièrement important en ce qui concerne l’intégration de contrôles appropriés. La combinaison des marqueurs fluorescents est décisive, étant donné qu’ils doivent être sélectionnés individuellement sur la base de leurs caractéristiques propres, mais aussi de leur compatibilité avec les autres marqueurs et avec l’instrument qui sera utilisé pour l’analyse. D’autres paramètres qui doivent être pris en considération : 1.
Indice de coloration: l’indice de coloration est un paramètre qui permet de récupérer un signal positif faible à partir de l’arrière‐plan. Dès lors, pendant l’élaboration d’expérimentations à paramètres multiples, il est préférable d’utiliser un fluorochrome avec un indice de coloration faible pour mesurer des paramètres à concentration élevée et un fluorochrome avec un indice de coloration élevé pour mesurer des paramètres à concentration faible. 2. Chevauchement Spectral: Un chevauchement spectral se produit lorsque le signal lumineux émit part un fluorochrome déborde dans le canal de détection qui est sensé enregistrer le signal émis par un autre fluorochrome. Ceci produit parfois une fausse réponse positive. Bien qu’il soit possible d’éliminer de tel résultats en supprimant le signal électroniquement (selon un procédé appelé compensation), il est recommandé de l’éviter et/ou le minimiser. La compensation continue à être l’un des principes de la cytométrie en flux les plus déconcertants pour les nouveaux utilisateurs. Bien que la plupart des instruments et logiciels soient capables d’effectuer la compensation pour l’utilisateur (supposant que l’analyse ait été effectuée avec les échantillons corrects), il est tout de même essentiel de comprendre les principes de base. Pour une expérimentation bicolore, la meilleure façon d’aborder la compensation est de marquer un échantillon avec un fluorochrome pour lequel le canal d’émission est connu et de consigner la présence de signaux fluorescents dans les autres canaux que l’utilisateur souhaite utiliser. S’il n’y a aucune trace de signal, cela signifie qu’il n’y a pas de chevauchement spectral et donc pas besoin de compenser. Si un signal fluorescent est détecté dans un canal inhabituel, cela signifie qu’il existe un chevauchement spectral qui devra être éliminé en soustrayant le signal superflu des valeurs mesurées pour ce canal par le cytomètre en flux. Bien que cette technique soit efficace quand un nombre réduit de fluorochromes est utilisé, on peut imaginer qu’éliminer la possibilité de chevauchement spectral peut devenir un vrai challenge lorsque le nombre de fluorochromes augmente. 3. Contrôles appropriés: Pour assurer le bon déroulement d’une analyse par cytométrie en flux, il est essentiel d’inclure des contrôles appropriés qui permettent d’évaluer et de contrôler le chevauchement spectral et la liaison non spécifique des réactifs. Incuber les échantillons avec des immunoglobulines qui ont été marquées avec le même fluorochrome que celui des anticorps utilisés, mais qui sont connues pour ne par réagir avec les cellules en cours d’analyse, permet d’évaluer les problèmes potentiels de liaison non spécifique. Bien que ce contrôle ne soit pas définitif, il est très largement utilisé. Il est primordial de comprendre quels éléments peuvent être potentiellement Lightning‐Link® is a registered trademark of Innova Biosciences DyLight ® is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries 5 | P a g e 4.
présents dans un échantillon donné et d’inclure les contrôles nécessaires. Provenance et disponibilité des réactifs: le nombre de produits et fournisseurs pour la cytométrie en flux ne cesse d’augmenter et il devient de plus en plus complexe de déterminer quelle combinaison de réactifs utiliser pour une expérimentation spécifique et quel fournisseur choisir pour obtenir des produits de première qualité. De plus, certains anticorps ne sont pas toujours disponibles avec le marqueur désiré et dans ce cas, il est nécessaire de trouver une méthode pour les générer en interne. Dans la plupart des cas, il n’est pas financièrement avantageux de générer un anticorps monoclonal pour une application spécifique s’il est déjà disponible. Il est donc primordial d’être capable de marquer des anticorps de provenance commerciale de manière rentable, tout en surmontant les difficultés et pertes qui sont souvent associées avec les techniques de marquage traditionnelles. Lightning‐Link® ‐ Kits de marquage d’anticorps simples d’utilisation La simplification du procédé de marquage d’anticorps (plus particulièrement l’élimination des étapes de séparation) supprime de nombreux problèmes souvent associés aux procédures traditionnelles; par exemple la perte de matériel, la dilution des échantillons lors de la chromatographie sur colonne, les variations entre lots et les difficultés liées à l’augmentation de l’échelle. Le procédé Lightning‐Link® est illustré dans la figure ci‐contre. Les anticorps purifiés sont transférés dans un tube contenant une mixture lyophisée qui comprend le fluorochrome d’intérêt. La dissolution de cette mixture rend actives les substances qui catalysent la réaction du marquage des anticorps. Etant donné qu’il n’y a pas d’étape de purification ou de séparation (les produits dérivés de la réaction sont entièrement bénins), le recouvrement des anticorps approche les 100%. La simplicité de la démarche signifie que la procédure peut être accomplie en moins de trente secondes. Une démonstration chronométrée est accessible via le lien suivant: (Lightning‐Link® video). Le procédé chimique derrière le marquage utilise les groupes amines libres qui se trouvent sur les acides aminés « lysines » ; dès lors, n’importe quel anticorps ou protéine peut être marqué, indépendamment de son isotope ou espèce. En outre, Lightning‐Link® est désormais disponible sur le format « Rapid » qui comprend tous les avantages de Lightning‐Link®, mais ayant en plus le bénéfice de produire des anticorps marqués prêts à l’emploi en un temps record de 20 minutes. Vous trouverez une liste complète des fluorochromes disponibles en page suivante. Ces kits de marquage d’anticorps simples d’utilisation sont particulièrement intéressants pour les utilisateurs de cytomètres en flux, étant donné que plus de 50 différents marqueurs sont disponibles, y compris des protéines fluorescentes, des fluorochromes et des tandems, qui, ensembles, couvrent la totalité du spectre lumineux, de l’UV à l’infrarouge. Par conséquent, il est maintenant possible pour l’utilisateur du cytomètre en flux de concevoir et élaborer un ensemble unique d’anticorps marqués prêts à l’emploi à partir d’anticorps de provenance commerciale. Par ailleurs, il existe de nombreux avantages liés au marquage direct des anticorps primaires : 
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Supprime la nécessité d’utiliser des anticorps secondaires, réduisant ainsi le nombre d’incubations et d’étapes de lavage ‐ soit un gain de temps et d’argent. Pour les expérimentations qui utilisent plusieurs anticorps simultanément, la réactivité inter‐espèces ne pose pas de problème puisque les anticorps primaires peuvent être marqués avec des fluorochromes différents. En effet, pour la détection indirecte, la réactivité inter‐espèces des anticorps secondaires est souvent un problème. 
Les fournisseurs d’anticorps commerciaux ne procurent pas toujours les anticorps combinés au marqueur désiré. En marquant vos anticorps vous‐même, cet obstacle est facilement surmontable. Lightning‐Link® is a registered trademark of Innova Biosciences DyLight ® is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries 6 | P a g e DyLight® 350 AMCA Atto 390 DyLight® 405 PerCP PerCP/Cy5.5 PE/Cy5 DyLight® 488 Fluorescein Atto 488 R‐Phycoerythrin (R‐PE) PE/Texas Red PE/Atto 594 PE/Cy5.5 PE/Cy7 Rhodamine B‐Phycoerythrin (B‐PE) Cy3 DyLight® 550 Atto 565 FluoProbes®594 320‐0010 712‐0010 349‐0010 321‐0010 718‐0010 763‐0010 760‐0010 322‐0010 310‐0010 350‐0010 703‐0010 767‐0010 768‐0010 761‐0010 762‐0010 311‐0010 716‐0010 340‐0010 323‐0010 351‐0010 790‐0010 353 353 390 400 482 482 488 493 494 501 535 535 535 535 535 544 546 550 562 563 591 432 442 479 420 677 700 670 518 520 523 575 615 627 694 776 576 575 570 576 592 616 Extinction Coefficient ‐1 ‐1
(cm M ) 15,000 19,000 24,000 30,000 380,000 N/A N/A 70,000 73,000 90,000 2,000,000 N/A N/A N/A N/A 94,500 2,410,000 150,000 150,000 120,000 92,000 DyLight® 594 Texas Red Atto 633 APC/Cy5.5 APC/Cy7 DyLight® 633 Cy5 Allophycocyanin (APC) DyLight® 650 FluoProbes®647H Cy5.5 DyLight® 680 Atto 700 DyLight® 755 DyLight® 800 324‐0010 714‐0010 353‐0010 764‐0010 765‐0010 325‐0010 342‐0010 705‐0010 326‐0010 362‐0010 782‐0010 327‐0010 751‐0010 328‐0010 329‐0010 593 595 629 633 633 638 643 650 652 653 675 682 690 754 770 618 615 657 694 776 658 667 670 672 674 694 715 725 776 794 80,000 80,000 130,000 N/A N/A 170,000 250,000 700,000 250,000 250,000 250,000 140,000 120,000 220,000 270,000 Lightning‐
Absorbance
Link Product Max (nm) Label Emission Max (nm) Emission Colour Stokes Shift Blue Blue Blue Blue Red Red Red Green Green Green Orange Red Red Red Far Red Orange Orange Orange Orange Orange‐Red Red 79 89 89 20 195 218 182 25 26 22 40 80 92 159 241 32 29 20 14 29 25 Red Red Red Red Far Red Red Red Red Red Red Red Red Red Far Red Near Infrared 25 20 28 61 143 20 24 20 20 21 19 33 35 22 24 Résumé La cytométrie en flux est une technique d’analyse cellulaire efficace qui peut rapidement générer des ensembles de données complexes. Ceux‐ci peuvent fournir un aperçut de l’état, des procédés et des événements cellulaires qui seraient autrement difficiles, sinon impossibles, à obtenir. Si la lecture de ce guide du débutant vous a inspiré, nous vous encourageons à approfondir vos connaissances en consultant les ressources citées ci‐dessous. Lightning‐Link® is a registered trademark of Innova Biosciences DyLight ® is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries 7 | P a g e Bibliographies et ressources 
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Dean PN, Bagwell CB, Lindmo T, Murphy RF and Salzman GC. Data File Standard for Flow Cytometry. Cytometry 1990, 11:323‐332. Murphy RF, Chused TM:A proposal for a flow cytometric data file standard. Cytometry 1984 5:553‐
555. Robinson PJ. Mack Fulwyler in his own words. Cytometry Part A 2005, 67A:61–67 Flow Cytometry ‐ A Basic Introduction – Wicki Version (Michael G. Ormerod) http://flowbook‐
wiki.denovosoftware.com/ Consolidated Resource for Flow Cytometry Antibodies, Instrumentation, Software & Suppliers: http://www.chromocyte.com Lightning‐Link® is a registered trademark of Innova Biosciences DyLight ® is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries 8 | P a g e