Suivi comparatif de la qualité des ovules de truite

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AGROCAMPUS OUEST
65 rue de Saint Brieuc
CS 84215
35042 Rennes Cedex
Tél : 02 23 48 55 00
INRA - SCRIBE
SYSAAF
Campus de Beaulieu
Bâtiment 16A
35042 Rennes Cedex
SRA/INRA
37800 Nouzilly
Mémoire de Fin d'Etudes
DIPLOME D’INGENIEUR AGRONOME
Spécialisation ou spécialité : Halieutique
Option : AQUA
Suivi comparatif de la qualité des ovules de truite arc-en-ciel
(Oncorhynchus mykiss) conservés ex vivo à basse
température dans du liquide cœlomique ou du milieu minéral
Par : M. ANDRE Guirec
Soutenu le : Vendredi 16 Septembre 2011
Devant le jury :
Sous la présidence de : Pr. Hervé Le Bris
Maître de stage : Pierrick Haffray
Enseignant responsable : Pr. Hervé Le Bris
Bon pour dépôt 
Autorisation de diffusion externe du mémoire : Oui  Non
"Les analyses et les conclusions de ce travail d'étudiant n'engagent
que la responsabilité de son auteur et non celle d’AGROCAMPUS OUEST".
Remerciements :
Je souhaite tout d’abord remercier mon maître de stage M. Pierrick Haffray pour m’avoir
accueilli et permis d’effectuer ce stage au sein de la section aquaculture du SYSAAF, pour sa
sympathie, ses conseils et son encadrement.
Je voudrais aussi exprimer ma gratitude à M. Daniel Guéméné, directeur du SYSAAF, pour
m’avoir offert la possibilité de réaliser mon stage dans cet organisme ainsi qu’à M. Patrick Prunet,
directeur d’unité de l’INRA-SCRIBE, pour m’avoir accueilli dans l’enceinte du laboratoire.
Je remercie tout particulièrement Julien Bobe pour m’avoir encadré tout au long de mon
stage, pour sa disponibilité et ses conseils avisés.
Un grand merci à Benjamin Quittet pour sa disponibilité sa grande efficacité ainsi qu’à Cédric
Pincent pour ses informations et ses explications sur la sélection génétique.
Merci également à tous ceux qui m’ont aidé durant mon stage, notamment Cécile Melin pour
la préparation de l’Actifish™ et la mise à disposition de bassins d’incubation ainsi que Thao-Vi Nguyen
pour m’avoir présenté les locaux et formé aux techniques nécessaires à la préparation du milieu
minéral.
Je remercie chaleureusement toutes les personnes qui ont contribués à faire de cette période
de stage un agréable moment. En particulier Morgane, Johanna, Karina, Anne, Elodie, Yohann,
Laurent, Vincent, Arya, Axel et Clarisse.
Je remercie également Agrocampus-Ouest pour m’avoir offert l’opportunité de réaliser ce
stage qui aura été une expérience très enrichissante.
Liste des annexes :
Annexe I : Préparation du milieu minéral Cortland modifié…………………………………………….. p.32
Annexe II : Taux de survie des pontes de bonne qualité initiale à différents stades du
développement……………………………………………………………………………………….……… p.33
Annexe III : Taux de survie des pontes de mauvaise qualité initiale à différents stades du
développement………………………………………………………………………….…………………… p.34
Liste des illustrations :
Figure 1 : évolution de la production mondiale de Truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) de 1950 à
2009 (données FAO²)………………………………………………………………………………………… p.1
Figure 2 : effet du milieu sur l’évolution du taux moyen de survie lors de la conservation de ponte de
bonne qualité initiale………………………………………..……………………………………………..…. p.9
mauvaise qualité initiale…………………………………………………………………………..………... p.10
Figure 4 : effet de la qualité initiale de la ponte sur le taux moyen de survie après conservation dans le
liquide cœlomique filtré et le milieu minéral Cortland modifié……………………………………….…. p.11
Figure 5 : détail de la baisse de qualité des ovules en fonction de la durée de conservation selon le
milieu de conservation chez les pontes de bonne qualité initiale ……………………….…...……….. p.12
Figure 6 : détail de la baisse de qualité des ovules en fonction de la durée de conservation selon le
milieu de conservation chez les pontes de mauvaise qualité initiale………………………………….. p.13
Figure 7 : effets du milieu et de la duré de conservation sur les taux moyens d’apparition de
malformations types pour des pontes de bonne qualité initiale…………………………...…………… p.15
malformations types pour des pontes de mauvaise qualité initiale……………………………………. p.16
Figure 9 : effet de la durée de conservation et de la qualité initiale des pontes sur le taux de survie
sans malformations à la résorption………………………………………………………………………... p.17
Figure 10 : détail de la baisse qualité des ovules en fonction de la durée de conservation et de la
qualité initiale des pontes……………………………………………………………………………...…… p.18
Figure 11 : effets de la durée de conservation et de la qualité initiale de la ponte sur les taux moyens
d’apparition de malformations types………………………………………………………………………. p.20
Tableau 1 : effet de la durée de conservation, de la qualité initiale de la ponte et du milieu de
conservation sur la qualité des ovules……………………………………………………………………. p.13
Tableau 2 : effet de la qualité initiale de la ponte et de la durée de conservation sur la qualité des
ovules……………………………………………………………………………………………………….... p.19
Glossaire :
°Cj : Degré Celcius-jour
Hepes : ou acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique, est un composé servant de
tampon pour les pH compris entre 6 et 8,5 (pKa 7,55)
Lot : ensemble d’ovules, d’œufs ou d’alevins ayant subit le même traitement et qui sont élevés dans le
même incubateur
PEIMA : Pisciculture Expérimentale Inra des Monts d’Arrée
Rpm : rotation par minute
SCRIBE : Station Commune de Recherche en Ichtyophysiologie Biodiversité et Environnement
SYSAAF : SYndicat des Sélectionneurs Avicoles et Aquacoles Français
Table des matières :
Introduction........................................................................................................................................ 1
Matériel et méthode ........................................................................................................................ 4
A. Animaux : ..................................................................................................................................... 4
B. Détection des ovulations et recueil des pontes :...................................................................... 4
C. Traitement des produits de la ponte et conditionnement des ovules : .................................. 5
1. Obtention du liquide cœlomique filtré (LCf) : ............................................................................... 5
2. Préparation de la solution de milieu minéral Cortland modifiée (MM) : ...................................... 5
3. Manipulation « Store-Ovule » : .................................................................................................... 6
4. Conservation sur glace : .............................................................................................................. 6
D. Fécondation et incubation :......................................................................................................... 6
1. Vérification de la qualité du sperme ............................................................................................ 6
2. Fécondation ................................................................................................................................. 7
3. Mise en incubation et suivi du développement ........................................................................... 7
E. Critères de contrôle de la qualité des ovules après conservation : ........................................ 7
F. Traitement statistique : ................................................................................................................ 8
Résultats ............................................................................................................................................. 9
A. Expérience Store-Ovule : ............................................................................................................. 9
1. Effet du milieu de conservation sur l’évolution de la qualité des ovules ..................................... 9
2. Détail de la baisse qualité des pontes après conservation en fonction du milieu, de la
durée de conservation et de leur qualité initiale ....................................................................... 12
3. Suivi des malformations observées chez les alevins au stade de la résorption du sac vitellin 15
B. Expérience de conservation sur glace :................................................................................... 17
1. Effet de la qualité initiale de la ponte sur l’évolution de la qualité des ovules lors de leur
conservation ............................................................................................................................. 17
2. Détail de la baisse qualité des ovules en fonction de la durée de conservation et de la
qualité initiale des pontes ......................................................................................................... 18
3. Suivi des malformations observées chez les alevins au stade de la résorption du sac
vitellin ........................................................................................................................................ 20
Discussion ........................................................................................................................................ 21
A. Le liquide cœlomique filtré reste le meilleur milieu de conservation des ovules mais son
efficacité varie en fonction de la qualité initiale de la ponte : ................................................. 21
1. Effet de l’allongement de la durée de conservation des ovules sur leur qualité ....................... 21
2. Effet du milieu de conservation sur le maintien de la qualité des ovules .................................. 22
B. Les plus fortes mortalités surviennent avant l’éclosion et sont plus importantes après
conservation dans le milieu minéral tandis que le liquide cœlomique induit plus
d’alevins malformés :................................................................................................................... 23
C. La conservation ex vivo des ovules jusqu’à 12 jours à 4 °C n’est pas suffisante pour
observer une évolution claire de la fréquence d’apparition de malformations types : ... 24
D. Passage en conditions d’élevage et applications à la sélection génétique :....................... 25
Conclusion ....................................................................................................................................... 27
Bibliographie ................................................................................................................................... 27
Annexes ............................................................................................................................................. 31
Introduction
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce d’intérêt aquacole dont la production
mondiale est en croissance quasi-continue depuis les années 1950 (Fig.1). Cet essor est principalement du à sa
robustesse ainsi qu’à sa plasticité qui ont permis son adaptation à des conditions d’élevage au niveau des traits
de comportements sociaux, alimentaires et reproducteurs (Jalabert et Fostier, 2010). C’est l’espèce qui occupe
Quantités produites en milliers de
tonnes
la première place dans la salmoniculture française où elle représentait près de 95 % de la production
1
en tonnage en 2003 (FAO ).
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Année
Figure 1 : évolution de la production mondiale de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) de 1950 à
2
2009 (données FAO ).
Des études sur la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) ont montré qu’il existe une base
génétique des caractères de ponte comme le volume de ponte, le nombre et la taille des ovules ou
encore la fécondité relative. Les héritabilités de ces caractères sont de l’ordre de 0,2-0,3 (Gall, 1975 ;
Gall and Gross, 1978). De plus, le poids des femelles à la ponte présente une corrélation génétique
positive avec le volume de la ponte (0,5-0,8) et le nombre d’ovules (0,4-0,8) et négative avec la taille
des ovules (0,3-0,5). On note également que la fécondité, définie comme le nombre d’ovules par unité
de masse de la génitrice, présente une corrélation génétique positive avec le nombre (0,41 ± 0,14) et
la taille (0,47 ± 0,13) des ovules et négative avec le poids de la femelle à la ponte (-0,61 ± 0,10) (Gall,
1975 ; Huang and Gall, 1989 ; Gall and Gross, 1978). Or la croissance est un facteur primordial en
grossissement de même que la fertilité est importante en écloserie. On cherche donc à améliorer ces
caractères, notamment par la voie de la sélection génétique. Au vu des forts taux de corrélations
mentionnés ci-dessus, il serait intéressant prendre en compte les caractères de pontes pour effectuer
la sélection. Pour cela, il faudrait pouvoir attendre qu’un maximum de femelles ovule afin d’effectuer
des mesures sur leurs caractères de ponte et les intégrer ainsi dans les paramètres de choix des
génitrices. Cependant, s’il n’y a pas d’induction, les dates d’ovulations des femelles peuvent s’étaler
sur plusieurs jours. Il serait donc primordial de pouvoir conserver les ovules pondus les premiers, le
temps que toutes les femelles ovulent et que les croisements soient effectués.
De manière générale, quel que soit le caractère que l’on cherche à améliorer, le sélectionneur
a besoin de temps pour estimer les paramètres génétiques et optimiser ses plans de croisements. La
durée de conservation des ovules sans baisse notable de la qualité doit donc être la plus longue
possible afin de pouvoir effectuer toutes ces opérations sur un maximum de femelles et ainsi avoir le
choix parmi un panel de génitrices suffisamment grand.
D’autre part, la conservation des ovules permet de féconder le même jour les ovules de
femelles ayant pondu à des dates différentes. Cela limite la variabilité induite par les facteurs jour de
ponte et conditions de fécondation.
1
La bonne conservation des ovules présente également d’autres intérêts en pisciculture. Par
exemple si les femelles sont matures avant les mâles, les ovules doivent rester fécondables jusqu’à
ce que les mâles deviennent spermiants. Lorsque les génitrices se trouvent sur un site éloigné des
installations d’incubations, les gamètes doivent conserver leur fécondabilité durant le transport entre
les sites. Dans ce dernier cas, la fécondation pourrait être effectuée avant le transport afin d’éviter le
problème de conservation de la fertilité. Toutefois, les œufs sont sensibles aux chocs mécaniques
durant les deux premières semaines de développement, avec une période critique entre 4 et 9 jours
post-fécondation (Milla et al., 2010). Le transport des gamètes est donc à privilégier.
Lors de l’ovulation chez la truite arc-en-ciel (Oncorhychus mykiss), les ovocytes sont expulsés
des ovaires dans la cavité abdominale où ils s’accumulent. L’ovulation ne dure, en général, pas plus
de quelques heures. Lorsqu’elle est terminée, les gamètes peuvent demeurer plus d’une semaine
dans la cavité abdominale de la femelle sans diminution de leur qualité. La qualité des ovules est
définie comme leur capacité à être fécondés et à se développer en un individu normal. Elle peut
même être améliorée après une période de maturation in vivo variant de 4 à 6 jours post-ovulation à
10±1 °C (Springate et al., 1984). Cependant, une augmentation du nombre d’alevins présentant des
malformations externes a été observée dès 7 jours de vieillissement in vivo à 12 °C (Aegerter and
Jalabert, 2004). De plus la durée de conservation in vivo est variable selon les femelles et dépend
notamment du nombre de cycles de reproduction déjà effectués ainsi que de leur état physiologique
(Escaffre et Billard, 1979). La température est également un facteur qui influence fortement la
conservation in vivo des ovules (Aegerter and Jalabert, 2004).
Les recherches se sont orientées vers la conservation ex vivo des gamètes. A la différence du
sperme, les ovules ne peuvent pas subir de cryoconservation du fait de la présence de grandes
quantités de réserves lipidiques et de la difficulté d’éliminer l’eau intercellulaire (Azuma et al., 2003).
La conservation est donc effectuée à basse température mais en évitant la congélation de l’ovule. Le
premier milieu de conservation ex vivo testé a été le liquide cœlomique car c’est dans ce milieu que
baignent les ovules lorsqu’ils se trouvent dans la cavité abdominale de la femelle (Billard and
Legendre, 1982 ; Carpentier and Billard, 1978 ; Marcel et al., 1982). Cependant, la qualité du liquide
cœlomique est variable selon les femelles. Il peut être contaminé par du sang ou des fèces lors de sa
récolte, ce qui va favoriser le développement bactérien pendant le stockage. Pour palier le problème
bactérien, le liquide cœlomique peut être filtré à 0,22 micromètres ou additionné d’antibiotiques
(Bonnet, 2002 ; Holcomb et al., 2005). Cependant lors d’une contamination par des ovules brisés qui
abaissent le pH du liquide cœlomique (Dietrich et al., 2007) ou de l’urine qui en modifie la teneur en
minéraux, ces traitements ne sont d’aucune efficacité.
De plus, le liquide cœlomique peut être le vecteur de pathogènes et permettre ainsi la
transmission verticale de certaines maladies (Madsen, 2005 ; Kumagai and Nawata, 2010).
Afin de s’affranchir de ces problèmes de qualité du liquide cœlomique, les recherches se sont
portées sur la création de milieux de conservation artificiels (Goetz and Coffman, 2000 ; Bonnet et al.,
2003 ; Azuma et al., 2003). En outre, la production d’un milieu artificiel permet d’éviter le travail de
recueil et préparation du liquide cœlomique durant la période de récolte des pontes qui est déjà très
prenante pour le pisciculteur.
Les nombreuses études déjà menées sur le stockage ex vivo d’ovules de truite arc-en-ciel
(Oncorhynchus mykiss) dans du liquide cœlomique ou des milieux minéraux ont pu mettre en
évidence des facteurs qui ont une influence sur la durée de conservation.
Tout d’abord le vieillissement post-ovulatoire in vivo, qui peut précéder la conservation ex
vivo, est à prendre en compte. En effet, la rétention des ovules dans la cavité cœlomique est
assimilable à un début de conservation durant lequel les ovules commencent à vieillir.
Ensuite, le milieu de conservation a une importance primordiale dans le maintien de la fertilité
des ovules. Le liquide cœlomique ressort comme étant le milieu qui autorise les plus longues durées
de conservation des ovules (Bonnet et al., 2003 ; Niksirat et al., 2007). Toutefois, pour des durées
allant jusqu’à 48 heures, certains milieux minéraux permettent une conservation équivalente à celle
obtenue dans du liquide cœlomique à 12-13 °C (Goetz and Coffman, 2000) et à 2-3 °C (Niksirat et al.,
2007).
La température a également une influence notable sur la durée de conservation des ovules.
L’abaissement de la température d’incubation, proche de 0 °C mais toujours supérieure pour éviter la
2
congélation, permet d’allonger la durée de conservation des ovules de salmonidés (Jensen and
Alderdice, 1984).
Le stockage des gamètes doit être effectué à l’obscurité car la lumière a un effet négatif sur la
conservation des ovules de salmonidés (Takano et al., 1973).
L’atmosphère a aussi un effet sur la durée de conservation, via les teneurs en dioxygène et
dioxyde de carbone ainsi que l’humidité. Préférentiellement, le taux d’humidité de l’air est maintenu
élevé pour limiter l’évaporation du milieu de conservation. D’autre part, l’importance de la composition
de l’atmosphère est étroitement liée à la quantité d’ovules à conserver et à leur disposition. Si la
concentration en ovules dans le milieu n’est pas trop importante, la conservation peut se faire sous air,
voire même sous atmosphère de diazote pure, le dioxygène dissout dans le milieu de conservation
étant suffisant. Si les ovules sont plus nombreux ou s’ils sont disposés en plus de deux couches
superposées, la conservation sous atmosphère enrichie en dioxygène devient nécessaire (Komrakova
and Holtz, 2009 ; Komrakova and Holtz, 2011). Il est également primordial de permettre l’évacuation
du dioxyde de carbone tout au long de la période de conservation car sa teneur est un facteur
extrêmement limitant quant à la bonne conservation des ovules (Komrakova and Holtz, 2008).
L’état physiologique de la femelle peut avoir un effet sur la qualité des ovules (Campbell et al.,
1992). Par contre, la survie de la descendance n’est pas affectée par un stress dû au bruit (5 min/j), à
l’augmentation de la densité (15 min/j), à la poursuite avec un filet (5min/j) ou à l’émersion de la région
dorsale (5min/j) pendant les trois mois qui précèdent la ponte (Contreras-Sanchez et al., 1998). Il est
donc raisonnable de considérer que les manipulations des femelles pour détecter l’ovulation
n’influencent pas la qualité des ovules.
Devant l’intérêt que la conservation ex vivo des ovules de truite arc-en-ciel (Oncorhychus
mykiss) représente en sélection génétique, une expérience de conservation des ovules, baptisée
« Store-Ovule », a été élaborée. Elle avait pour objectif de caractériser la baisse de qualité des ovules
en fonction du milieu et de la durée de conservation. Les résultats de cette expérience devaient
également servir à étudier la faisabilité de la mise en place d’un protocole de conservation ex vivo en
condition de terrain.
Pour ce faire, plusieurs pontes ont été placées en conservation dans les conditions les plus
favorables connues à ce jour. Deux milieux de conservation ont été testés : le liquide cœlomique filtré
et le milieu minéral Cortland modifié tamponné à l’Hepes. Parmi les milieux artificiels, le milieu minéral
Cortland modifié a été choisi car c’est celui qui donne les meilleurs résultats d’après la littérature. Les
ovules ont été disposés en monocouche et conservés dans un incubateur maintenu à 4 °C.
La possibilité de conserver des ovules pendant une semaine à une température proche de
0 °C nous a incités à tester la conservation de pontes sur glace fondante à 0-1 °C, dans du milieu
minéral. L’expérimentation sur glace fondante a été menée sous air non modifié, le principal objectif
de cette expérience étant de tester des conditions de conservation se rapprochant des conditions de
terrain.
Ce rapport débute par une présentation du matériel utilisé et des méthodes mises en œuvre
dans cette expérimentation. Les résultats obtenus sont exposés dans la partie suivante. Ils sont
ensuite discutés en s’appuyant sur les résultats d’études antérieures, puis critiqués afin de déterminer
les possibilités d’applications sur le terrain, notamment lors de processus de sélection. Pour finir, une
conclusion résume les principaux enseignements tirés de cette expérimentation.
3
Matériel et méthode
A. Animaux :
Les animaux utilisés au cours de cette expérience sont des truites arc-en-ciel (Oncorhynchus
mykiss) de souche printanière appartenant à la cohorte 2009 et âgées de deux ans au printemps
2011. Un lot de 26 femelles et 7 mâles a été importé le 2 mars 2011 de la Pisciculture Expérimentale
INRA des Monts d’Arrée (PEIMA) située au Drennec (Sizun, Finistère). Arrivées au laboratoire (INRA
SCRIBE, Rennes), les animaux ont été stabulés dans un bassin de 4 m² rempli d’une eau à 12 °C où
elles sont maintenues à jeun. Au cours de l’expérimentation, trois mâles sont morts de maladie et un
n’a jamais produit de semence. C’est pourquoi 5 nouveaux mâles ont été réimportés de la PEIMA le
13 avril afin de s’assurer d’en avoir toujours en bassin et de pouvoir recueillir suffisamment de
spermes différents jusqu’à la fin de l’expérimentation. Profitant de ce transport, 5 femelles
supplémentaires ont également été commandées.
Les œufs, issus d’une fécondation artificielle, sont mis en incubation dans un circuit fermé
contenant une eau à 10 °C jusqu’au stade de résorption du sac vitellin auquel les alevins sont
sacrifiés. Le circuit fermé de l’écloserie comprenait une étape de stérilisation aux ultraviolets suivie
d’une filtration biologique. Il n’y avait pas d’étape de filtration mécanique de l’eau des incubateurs.
B. Détection des ovulations et recueil des pontes :
Les truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) élevées en pisciculture ont besoin d’une
assistance extérieure pour expulser les gamètes de leur cavité abdominale. Sans cette aide à la
ponte, les ovules demeurent dans la cavité abdominale où leur qualité va décroître s’ils ne sont pas
recueillis. En élevage, les ovules doivent donc être collectés par le pisciculteur.
Chez cette espèce, il n’existe pas de critère fiable permettant de détecter l’ovulation par une
simple observation externe. Pour prendre connaissance de l’état de maturité des femelles, trois jours
par semaine (lundi, mardi et vendredi) elles subissent un léger massage abdominal de l’avant vers
l’arrière, appelé aussi stripping, visant à expulser quelques ovules s’ils sont présents dans la cavité
abdominale. Afin de limiter le stress des poissons, d’en faciliter la manipulation et d’éviter de les
blesser, ils sont anesthésiés au 2-phénoxyéthanol à 3% avant chaque stripping.
Lorsque l’ovulation est détectée chez une femelle, celle-ci est mise à l’écart (seule ou avec 3
ou 4 autres femelles pour éviter la dominance) et sa ponte est récoltée le lendemain ou 3 jours plus
tard si la détection a eu lieu un vendredi. La période d’attente qui suit la détection de l’ovulation
permet de s’assurer que les ovules ont maturé un minimum de 24 h dans la cavité abdominale de la
femelle. Deux étapes importantes doivent précéder la collecte des ovules. D’abord, la femelle est
essuyée à l’aide d’une serviette. Une fois séchée, un léger massage d’arrière en avant est effectué au
niveau de la vessie de l’animal afin d’en expulser l’urine. Ces deux interventions ont pour but d’éviter
la contamination des ovules avec de l’eau ou de l’urine, ce qui provoquerait leur activation entraînant
alors une perte totale de fécondabilité.
La quasi-totalité de la ponte est recueillie après un stripping suffisamment intense pour
récupérer un maximum d’ovules et de liquide cœlomique mais pas trop pour éviter la contamination
avec du sang ou des fèces. Le poisson est ensuite sacrifié et placé au congélateur dans l’attente de
l’équarrissage.
Pour certaines femelles, celles dont l’ovulation a été détectée un vendredi ou un jour où
beaucoup de femelles sont ovulées, seul le liquide cœlomique est conservé pour être utilisé comme
complément de milieu de conservation.
Les jours où des fécondations doivent être effectuées, les spermes de plusieurs mâles sont
collectés. Les mâles étant spermiants tout au long de la période de reproduction, il est possible de
récupérer de la semence quotidiennement si besoin. De même que pour la collecte des ovules, le
sperme est recueilli par stripping. Il faut commencer par éliminer l’urine car elle risque de diluer le
liquide séminal, ce qui provoquerait l’activation suivie de la mort des spermatozoïdes. Le sperme
4
contenu dans le canal déférent doit également être éliminé car sa qualité est souvent moindre. Ainsi,
en début de collecte, le premier millilitre de sperme n’est pas conservé. Cette précaution peut être
prise car la quantité de sperme recueillie est largement supérieure à celle requise pour effectuer les
fécondations ; de l’ordre de quelques millilitres de sperme récoltés par mâle pour une centaine de
microlitres nécessaires aux fécondations. Une autre précaution doit être prise vis-à-vis de l’eau, qui a
pour effet de provoquer l’activation des spermatozoïdes, elle ne doit donc en aucun cas contaminer le
sperme lors de sa récolte. Cependant, comme le mâle n’est pas sacrifié lors de la récolte de ses
gamètes, il ne peut pas être entièrement séché comme cela est pratiqué pour les femelles. En effet,
l’essuyage entraîne la perte du mucus recouvrant les écailles du poisson, ce qui le rend alors
extrêmement vulnérable aux pathogènes. Pour éviter le contact entre l’eau et le sperme sans
condamner le poisson, seule la papille génitale est essuyée au moyen d’un papier absorbant.
Finalement pour chaque mâle, 2 à 3 ml de sperme sont récupérés dans un tube en verre
immédiatement placé à 0 °C dans un bac de glace dans l’attente de son utilisation.
C. Traitement des produits de la ponte et conditionnement des ovules :
Les opérations qui suivent sont réalisées en environnement stérile, sous hotte, avec de la
verrerie autoclavée et des ustensiles stériles à usage unique ou lavés puis rincés à l’éthanol à 70%.
La température de la salle de travail est maintenue à 12 °C, ce qui correspond à la température de
l’animal dont proviennent les ovules.
1. Obtention du liquide cœlomique filtré (LCf) :
Les œufs sont séparés du liquide cœlomique par tamisage. Le liquide cœlomique ainsi obtenu
est d’abord centrifugé (10 min, 4000 g, 4°C) pour éliminer les cellules sanguines et autres
contaminants. Le surnageant est ensuite filtrée à l’aide d’une cellule de filtration d’une porosité de
0,22 µm (Corning® 1000 ml Vacuum Filter System, CORNING). Cette opération de filtration à 0,22 µm
a été effectuée pour les quatre premières femelles. Le filtre ayant tendance à se colmater trop
rapidement, les liquides cœlomiques des femelles suivantes ont été filtrés avec une seringue
surmontée d’un filtre d’une porosité de 0,45 µm (Minisart®, sartorius). Même augmentée, la porosité
du filtre permet toujours d’éliminer une grande partie des bactéries présentes dans le liquide
cœlomique, ce qui est suffisant car la filtration a pour objectif de diminuer la charge bactérienne et non
de stériliser parfaitement le liquide cœlomique.
Le filtrat obtenu, appelé « liquide cœlomique filtré » ou « LCf », est utilisé comme milieu de
conservation des ovules.
2. Préparation de la solution de milieu minéral Cortland modifiée (MM) :
Le milieu minéral Cortland modifié se rapproche du liquide cœlomique de la truite de par la
nature des minéraux présents, leur concentration, la pression osmotique ainsi que le pH (Lahnsteiner
et al., 1995). La solution est préparée suivant les indications fournies par Goetz et Coffman (2000) (cf.
annexe 1). Une fois les minéraux en solution puis le tampon (Hepes) et les antibiotiques ajoutés, le pH
est ajusté par ajout de soude de manière à approcher 8,5 mais sans dépasser cette valeur. Comme le
pH diminue lors de la conservation, il est préférable de l’ajuster à la valeur maximale tolérée par les
ovules, ainsi les effets négatifs dus à l’acidification du milieu sont retardés au maximum. Lorsque le
pH est stabilisé, il faut ensuite mesurer la pression osmotique et éventuellement ajuster sa valeur. La
pression osmotique doit être comprise entre 290 et 300 mosmol, de manière à se rapprocher de la
valeur moyenne de la pression osmotique du liquide cœlomique qui se situe aux alentours de 291
mosmol (Lahnsteiner et al., 1995). La solution ainsi obtenue est filtré à l’aide d’une cellule de filtration
d’une porosité de 0.22 µm (Corning® 1000 ml Vacuum Filter System, CORNING) puis stockée à 4 °C
dans l’attente de son utilisation. Lors des jours de prélèvement de pontes, le milieu minéral Cortland
modifié est retiré de la chambre froide avant le stripping et est mis à réchauffer dans la salle de culture
à 12°C. Cette remontée en température permet d’éviter d’exposer les ovules à un choc thermique qui
pourrait avoir un impact négatif leur survie.
5
3. Manipulation « Store-Ovule » :
Pour chaque femelle dont les ovules sont mis en conservation, un duplicat de deux lots de
100 ovules est fécondé le jour même, au maximum 4 heures après le stripping. Il servira de témoin
afin de déterminer la qualité initiale de la ponte.
Pour chaque ponte, des lots d’ovules sont placés en conservation parallèlement dans le
liquide cœlomique filtré et le milieu minéral pendant 4, 8 et 12 jours pour suivre l’évolution de leur
qualité au cours du temps. Pour ce faire, les ovules sont déposés dans des plaques de culture à six
puits dotées d’un couvercle (Costar®, CORNING). Chacun des puits reçoit 3 ml de milieu de
conservation dans lesquels sont ensuite immergés 30 ovules. L’objectif est de remplir une plaque par
durée de conservation et ceci pour les deux milieux. Ainsi chaque couple (durée*milieu de
conservation) se voit allouer six puits soit 180 ovules. Cela est parfaitement réalisable lorsque l’on
utilise le milieu minéral qui est disponible quelle que soit la quantité souhaitée, ce qui n’est pas le cas
du liquide cœlomique. En effet, la production de liquide cœlomique par une femelle est très variable et
dépend notamment de sa taille et de son état de maturité. Pour les 22 femelles dont le liquide
cœlomique a été prélevé au cours de l’expérience Store-Ovule, la quantité moyenne de liquide
cœlomique filtré obtenu était de 24 ± 12 ml par femelle avec des valeurs comprises entre 9 et 47 ml.
Sa qualité peut également s’avérer très différente selon les femelles, bien souvent elle diminue à
cause de contamination par du sang ou des produits issus d’œufs brisés lors de la récolte. La
centrifugation et la filtration appliquées au liquide cœlomique ne permettent en général de le purifier
que lorsqu’il a été contaminé par du sang. Si une contamination par des débris d’œufs ou de l’urine a
eu lieu, le liquide cœlomique n’est pas conservé. En cas de manque de liquide cœlomique et lorsque
cela est possible, celui d’une autre femelle est utilisé en complément, sinon il y a tout simplement
moins de puits de réalisés.
Une fois les plaques à six puits complétées, elles sont refermées puis placées dans un
incubateur (Friocell 222, MMM-group) à 4 ± 0,5 °C. Elles y sont maintenues en agitation constante à
50 rpm (agitateur KS 260 control, IKA®) tout au long de leur conservation. Ceci permet de favoriser
les échanges gazeux entre l’air et le milieu de conservation et donc de se prémunir contre l’asphyxie
des ovules.
4. Conservation sur glace :
Cette expérimentation avait pour objectif d’étudier la conservation d’ovules en plus grande
quantité et à plus basse température que dans l’expérience Store-Ovule.
Pour chacune des femelles, deux piluliers reçoivent chacun 30 ml d’ovules (soit environ 600
ovules) et 30 ml de milieu minéral Cortland modifié. Ils sont ensuite fermés et placés sur une couche
de glace fondante à 0-1 °C dans une caisse en polystyrène. La glace est renouvelée avant qu’elle ne
soit entièrement fondue, environ tous les 4 jours. Un premier pilulier est conservé ainsi pendant 8
jours et le second pendant 15 jours.
D. Fécondation et incubation :
1. Vérification de la qualité du sperme
Le degré de motilité du sperme de chaque mâle a été déterminé afin de s’assurer de leur bon
pouvoir fécondant. Cette technique s’appuie sur l’observation au microscope optique de la motilité des
spermatozoïdes après activation. Tout d’abord 2 µl de sperme sont dilués dans 100 µl de milieu
StorFish™ (IMV Technologies, L’Aigle, Orne) afin d’induire la maturation des spermatozoïdes. La
solution de obtenue est laissée à reposer 3 heures à 4 °C. Ensuite, 2 µl de cette solution sont
mélangés à 20 µl d’eau préalablement déposés sur une lame montée sur le microscope. Le dépôt est
immédiatement recouvert d’une lamelle et observé. Les spermatozoïdes plongés dans l’eau n’étant
actifs que durant 20 à 30 secondes (Christen et al., 1987), la dernière opération doit être effectuée
rapidement si l’on veut pouvoir apprécier la motilité du sperme. Cette opération a été effectuée pour
chaque mâle quelques jours après leur entrée dans les bassins du laboratoire (INRA SCRIBE,
Rennes).
6
2. Fécondation
Lorsque les ovules ont atteint la durée de conservation souhaitée, ils sont recueillis et
mélangés de manière à former un duplicat de deux lots de 90 ovules par condition (durée*milieu de
conservation) pour l’expérience Store-Ovule. Cependant, il arrive que les duplicats comportent moins
d’ovules lorsque la quantité de liquide cœlomique n’était pas suffisante pour compléter entièrement la
plaque à six puits. En ce qui concerne l’expérience de conservation sur glace, un duplicat de deux fois
15 ml d’ovules est formé à partir de chaque pilulier.
Le sperme utilisé lors des fécondations est en réalité un mélange de spermes issus au
minimum de trois mâles strippés quelques heures auparavant. Le mélange est obtenu à partir de
100 µl de chacune des semences.
Les fécondations s’effectuant avec des quantités d’ovules différentes, le protocole est
présenté pour un lot en comptant une centaine. Tout d’abord, les ovules sont rincés avec 5 ml de
milieu minéral Cortland modifié pour éliminer tous les déchets ou contaminants qui ont pu s’accumuler
dans le liquide cœlomique lors de la conservation et replacer les ovules dans un environnement
semblable au liquide cœlomique frais. Dans ce cas également, le milieu minéral a préalablement été
retiré de la chambre froide et placé dans la salle à 12 °C afin d’éviter le choc thermique avec les
ovules. Ensuite 5 µl de sperme et 5 ml d’Actifish™ (IMV Technologies, L’Aigle, Orne) stocké à 10°C,
sont ajoutés conjointement. L’Actifish™ est une solution saline qui, comme l’eau, active les
spermatozoïdes, cependant il augmente leur temps de mobilité améliorant ainsi le taux de
fécondation. La solution obtenue est mélangée délicatement et laissée à reposer 10 minutes.
L’Actifish™ est ensuite éliminé par égouttage.
Ce protocole est adapté en fonction de la quantité d’ovules à féconder, tout en sachant
qu’avec les volumes utilisés les spermatozoïdes se retrouvent en large excès pour la fécondation.
3. Mise en incubation et suivi du développement
Les lots d’œufs fécondés sont transférés dans des incubateurs puis immergés dans une eau à
10 °C dans un système en recirculation. Un suivi quotidien des œufs puis des alevins est effectué. Les
œufs morts, qui prennent un aspect blanc opaque, sont ôtés des incubateurs. Le blanchiment des
œufs est du à une entrée d’eau qui se produit après leur mort et qui provoque la polymérisation des
protéines du vitellus. Le retrait des œufs mort permet d’éviter leur contamination par des champignons
qui peuvent s’y développer avant d’aller contaminer les œufs sains voisins. Cette opération doit être
effectuée délicatement pour ne pas endommager les autres œufs, qui sont particulièrement sensibles
aux chocs mécaniques durant les deux premières semaines de développement.
Les alevins morts sont eux aussi retirés des incubateurs dès leur détection. Un alevin est
considéré comme mort s’il commence à se désagréger, s’il ne bouge plus lorsqu’on le sollicite avec
une baguette ou encore quand aucun battement cardiaque n’est observé. Ce dernier critère est
utilisable uniquement lorsque le cœur est bien visible, ce qui est assez rare. Le retrait des alevins
morts est autant motivé par le risque de développement de pathogène sur le cadavre que par le fait
qu’ils se désagrègent rapidement après leur mort, ce qui complique le suivi des mortalités.
E. Critères de contrôle de la qualité des ovules après conservation :
La qualité des ovules après conservation est déterminée par des taux moyens de survie à des
stades particuliers du développement des embryons puis des alevins ainsi que par un relevé des
malformations qui les affectent.
Un premier comptage des embryons est effectué au stade œillé, après 190-200 °Cj postfécondation. Le stade œillé est atteint à 160 °Cj post-fécondation mais les yeux des embryons sont
plus facilement repérables après un développement de 190 °Cj. La température de l’eau des bassins
d’incubation étant de 10 °C, la mesure est donc effectuée 19 jours après la fécondation. Lors de ce
comptage, les ovules non fécondées ainsi que les œufs présentant des embryons qui ne sont pas
œillés sont retirés des incubateurs. Un ovule non fécondé est aisément reconnaissable de par sa
transparence et la couronne de gouttelettes lipidiques jaune-orangée qui se forme à sa périphérie. Ce
relevé étant le premier effectué, il prend en compte les mortalités des ovules survenues lors de la
conservation.
7
Un deuxième comptage est effectué lorsque le tous les œufs de l’incubateur sont éclos,
environ 350 °Cj après la fécondation. Un alevin est considéré comme éclos seulement à partir du
moment où il s’est entièrement extrait de l’œuf. Ceux qui périssent sans s’être totalement débarrassés
de leur coquille sont comptabilisés comme morts avant l’éclosion.
Un dernier comptage des survivants est effectué lorsque tous les alevins ont atteint le stade
de la résorption du sac vitellin, environ 550 °Cj post-fécondation. Ce comptage est couplé à un relevé
des malformations qui les affectent. Pour ce faire, les poissons sont sacrifiés en les plongeant
quelques minutes dans un bain de 2-phénoxyéthanol à 1‰. Ils sont ensuite étalés sur une feuille de
papier blanc puis l’ensemble est photographié afin de conserver une image des malformations pour le
traitement final.
Les taux de survie, de mortalités, d’alevins malformés et de fréquence d’apparition des
malformations présentés dans ce rapport sont exprimés en pourcentage sur la base du nombre initial
d’ovules mis en incubation.
F. Traitement statistique :
Les variables traitées sont des taux de survie des embryons et alevins aux différents stades
de développement selon le milieu et la durée de conservation. Les 17 pontes mises en conservation
constituent les individus statistiques.
La qualité des pontes varie en fonction les femelles, certaines montrent des taux de survie
pour le lot témoin très en deçà de ceux de la majorité des autres individus. Cette observation a motivé
le classement des pontes en deux catégories selon leur qualité initiale. Or il a été observé que la
qualité des ovules peut-être améliorée lorsqu’ils ont bénéficié d’un temps de maturation de quelques
jours dans la cavité abdominale de la femelle. Le taux de survie après 4 jours de conservation dans le
liquide cœlomique filtré a donc été pris en considération, en plus du taux de survie du témoin, afin de
déterminer la qualité initiale de chacune des pontes. De plus, l’obtention d’alevins normaux (sans
malformations apparentes) étant ce qui est recherché en écloserie, une ponte de bonne qualité initiale
a été définit comme une ponte présentant un taux d’alevins résorbés bien formés supérieur à 75 %
pour le lot témoin ou le lot d’ovules conservé 4 jours dans le LCf. Les pontes qui ne satisfont pas ce
critère sont qualifiées comme présentant une mauvaise qualité initiale. Finalement, cela conduit à la
formation de deux groupes, le premier compte 12 pontes de bonne qualité initiale et le second se
compose de 5 pontes de mauvaise qualité initiale.
Un test de comparaison des moyennes est effectué au sein de chacun des groupes pour
tester l’évolution des taux moyens de survie, de mortalité ou encore de malformations. Le nombre de
répétition trop faible dans chacun des deux groupes ne permet pas de déterminer si les différences
entre deux moyennes suivent une loi normale, le test effectué doit donc être non paramétrique. De
plus, les données sont appariées. Le test statistique adapté à ces conditions est un test de Wilcoxon
pour données appariées. Les comparaisons entre les pontes de différentes qualités initiales ont été
effectuées à l’aide d’un test de Wilcoxon Mann-Whitney, qui est un test de comparaison de moyennes
non paramétrique pour données indépendantes.
Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel R (CRAN).
8
Résultats
A. Expérience Store-Ovule :
L’expérimentation « Store-Ovule » avait pour objectif de comparer l’efficacité du liquide
cœlomique filtré et du milieu minéral Cortland modifié utilisés comme milieux de conservation pour
des ovules de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Des ovules de chacune des pontes prélevées
ont été fécondés le jour même du stripping (témoin) puis après 4, 8 et 12 jours de conservation.
1. Effet du milieu de conservation sur l’évolution de la qualité des ovules
La qualité des ovules est déterminée en calculant le taux moyen de survie sans malformation
au stade de la résorption du sac vitellin, appelé « taux moyen de survie» dans la suite du rapport. Il
correspond au nombre d’alevins qui atteignent le stade de la résorption du sac vitellin sans présenter
de malformation divisé par le nombre initial d’ovules mis en conservation. C’est le taux le plus
représentatif de la qualité globale de la ponte car c’est celui qui est calculé au stade de
développement le plus tardif atteint par les alevins dans cette étude. De plus, à ce stade, il est
possible de repérer et donc d’écarter les alevins malformés qui ne sont pas désirés. En effet, comme
ils ne peuvent pas être valorisés en production, ils sont éliminés le plus tôt possible du circuit
d’élevage pour ne pas avoir à les alimenter inutilement et ainsi améliorer l’efficacité de la pisciculture.
Taux de survie sans malformation à
la résorption
Evolution du taux de survie moyen des pontes de bonne qualité initiale selon le milieu de
conservation :
100
90
a,b
a*
b*
80
c*
70
60
50
LCf
40
c
30
MM
d
20
e
10
0
T0
4j
8j
12j
Durée de conservation
bonne qualité initiale. La courbe rouge représente les ovules conservés dans le liquide coelomique filtré (LCf) et
la courbe bleue, ceux conservés dans le milieu minéral Corland modifié (MM). Les mesures ont été effectuées sur
des pontes fécondées le jour de la collecte (T0) et après 4, 8 et 12 jours de conservation (respectivement 4j, 8j et
12j). Chaque point formant les courbes est la moyenne (N=12) des taux de survie sans malformation à la
résorption représentée avec son erreur type. Deux lettres différentes illustrent une différence significative
(p < 0,05) entre les points d’une même courbe tandis qu’un astérisque correspond à une différence significative
entre les deux milieux de stockage à une durée de conservation donnée (p < 0.001).
Les ovules peuvent être conservés jusqu’à 8 jours dans le liquide cœlomique sans baisse
significative (p < 0,05) du taux moyen de survie par rapport au témoin (Fig.2). Le taux moyen de
survie reste supérieur à 70 %. Néanmoins, pour une durée de conservation de 4 à 12 jours dans le
liquide cœlomique, le taux moyen de survie diminue linéairement (R² = 0,9996) en enregistrant des
baisses significatives (p < 0,05) lorsque la durée de conservation augmente par pas de 4 jours. Cela
indique que malgré le fait que la qualité des ovules conservés 8 jours dans le liquide coelomique soit
équivalente à celle d’ovules fraîchement collectés, elle est inférieure à celle d’ovules conservés 4 jours
dans les même conditions.
9
Après 12 jours passés dans le liquide cœlomique filtré, une baisse significative (p < 0,05) de
la qualité des ovules est observée par rapport au témoin et à des durées de conservation de 4 et 8
jours dans ce même milieu, avec un taux moyen de survie inférieur à 60 %.
Dans le milieu minéral, la qualité des ovules diminue significativement (p < 0,05) lorsque leur
durée de conservation augmente par pas de 4 jours. Une première baisse importante est relevée
entre le témoin et les lots conservés 4 jours où le taux moyen de survie passe de 78 à 47 %. Ensuite,
lorsque la durée de conservation augmente, il diminue quasi-linéairement (R² = 0,9911) pour atteindre
22 % après 12 jours passés ces conditions, ce qui correspond donc à une perte moyenne d’environ
3 % du nombre d’ovule initialement mis en incubation lorsque la durée de conservation est allongée
d’une journée.
Le taux moyen de survie des pontes présentant une bonne qualité initiale est supérieur
(p < 0.001) pour les ovules qui ont été conservés dans le liquide cœlomique plutôt que dans le milieu
minéral et ce quelle que soit la durée de conservation. L’écart entre les taux moyens de survie selon le
milieu de stockage reste quasi-inchangée de 4 à 12 jours de conservation, variant entre 35 et 38 %.
En effet, les pentes des deux droites de tendances calculées pour les points représentant les ovules
qui ont subit une conservation de 4 à 12 jours sont toutes les deux comprises entre -12 et -13 %. Cela
correspond à une baisse de qualité quotidienne de 3 à 3,25 % en moyenne à partir de 4 jours de
conservation.
En revanche, la qualité des ovules entre la collecte et 4 jours de conservation évolue de façon
opposée en fonction du milieu dans lequel ils sont stockés. En effet, lors d’une conservation dans le
liquide cœlomique, le taux moyen de survie augmente significativement au seuil de 20 % par rapport à
celui du témoin tandis qu’il diminue significativement (p < 0,05) si la conservation a eu lieu dans le
milieu minéral Cortland modifié.
C’est la baisse importante de qualité que subissent les ovules lors des premiers jours de
conservation dans le milieu minéral Cortland modifié qui en fait un milieu moins efficace que du liquide
coelomique filtré. Car sur la période de 4 à 12 jours de conservation, l’évolution de la qualité est
semblable dans les deux milieux.
Evolution du taux moyen de survie des pontes de mauvaise qualité initiale selon le milieu de
conservation :
Taux de survie sans malformation à
la résorption
80
70
60
a
a
a
a
50
40
LCf
30
MM
20
a
10
a, b
b
0
T0
4j
8j
12j
mauvaise qualité initiale. La courbe rouge représente les ovules conservés dans le liquide coelomique filtré
(LCf) et la courbe bleue, ceux conservés dans le milieu minéral Corland modifié (MM). Les mesures ont été
effectuées sur des pontes fécondées le jour du stripping (T0) et après 4, 8 et 12 jours de conservation
(respectivement 4j, 8j et 12j). Chaque point formant les courbes est la moyenne (N=5) des taux d’individus sans
malformation observés à la résorption représentée avec son erreur type. Deux lettres différentes illustrent une
différence significative (p < 0,05) entre les points d’une même courbe.
10
La conservation des pontes de mauvaise qualité initiale jusqu’à 12 jours dans le liquide
cœlomique ne provoque pas de diminution significative (p > 0,05) du taux moyen de survie qui passe
de 47% pour le témoin à 38 % à 12 jours (Fig.3).
Lors d’une conservation dans le milieu minéral, la baisse de qualité est linéaire (R² = 0,9997)
et aucune diminution significative (p > 0,05) du taux de survie n’est observée lors de l’allongement de
la durée de conservation des ovules jusqu’à 8 jours. Par contre le taux de survie relevé après 12 jours
de conservation est significativement inférieur (p < 0,05) à celui du témoin et celui relevé après 4 jours
de stockage.
Le milieu de conservation n’a pas d’effet notable sur le taux moyen de survie jusqu’à 8 jours
de conservation. Après douze jours, le taux moyen de survie après conservation dans le liquide
cœlomique est significativement supérieur au seuil de 7 % à celui relevé après conservation dans le
milieu minéral.
Un écart de 16 % entre les taux moyens de survie des deux milieux est visible dès 4 jours de
conservation, il reste stable à 8 jours (17 %) avant d’augmenter fortement à 12 jours atteignant 28 %.
Cette augmentation relevée à 12 jours est due à une baisse plus lente de la qualité des ovules dans le
liquide cœlomique filtré. En effet, les chutes des taux moyens de survie entre 4 et 8 jours après
conservation dans du liquide cœlomique ou du milieu minéral sont équivalentes : respectivement 11,2
et 12,2 %. Entre 8 et 12 jours de conservation, la chute du taux moyen de survie reste constante dans
le milieu minéral, soit 12,2 %, alors qu’elle est inférieure à 2 % dans le liquide cœlomique.
Evolution du taux moyen de survie selon la qualité initiale de la ponte dans chacun des milieux
de conservation :
B
100
Taux de survie sans malformation à la
résorption
Taux de survie sans malformation à la
résorption
A
**
80
*
*
60
40
20
0
T0
4j
8j
80
*
60
40
20
0
T0
12j
4j
8j
12j
Bonne qualité initiale
100
Mauvaise qualité initiale
Figure 4 : effet de la qualité initiale de la ponte sur le taux moyen de survie après conservation dans le
liquide cœlomique filtré ou le milieu minéral Cortland modifié. Les courbes en orange et bleu clair
représentent les pontes de bonne qualité initiale (N=12) tandis que celles en rouge et bleu foncé représentent les
pontes de mauvaise qualité initiale (N=5). Les mesures ont été effectuées sur des pontes fécondées le jour du
stripping (T0) et après 4, 8 et 12 jours de conservation (respectivement 4j, 8j et 12j) dans du liquide coelomique
filtré (A) et du mileu minéral Cortland modifié (B) . Chaque point sur les graphiques correspond la moyenne du
taux de survie sans malformation à la résorption pour un milieu et une durée de conservation donnés. Les points
sont accompagnés leur erreur type. Sur chacun des graphiques, une différence significative entre deux points de
même ordonnée est représentée par un astérisque (p < 0,05) ou deux astérisques (p < 0,01).
11
La qualité des ovules après conservation dans du liquide cœlomique est bien influencée par la
qualité initiale de la ponte (Fig.4). En effet, jusqu’à 8 jours de conservation dans du liquide cœlomique,
les pontes de bonne qualité initiale présentent un taux moyen de survie qui est significativement
supérieur (p < 0,05) à celui des pontes de mauvaise qualité initiale. Cependant, la forte diminution du
taux moyen de survie des pontes de bonne qualité initiale dès 4 jours de conservation dans le milieu
minéral atténue l’influence de la qualité initiale de la ponte sur le taux moyen de survie. De fait,
aucune différence significative (p > 0,05) n’a été relevée entre les taux moyens de survie des pontes
des qualités initiales différentes après conservation dans du milieu minéral.
On observe également que la baisse de qualité des ovules provoquée par la conservation est
moins importante pour les pontes dont la qualité initiale était déjà mauvaise et ceci quelle que soit le
milieu de conservation. En effet, lors d’une conservation de 12 jours dans du liquide cœlomique filtré,
le taux moyen de survie des pontes de mauvaise qualité initiale subit une baisse de 9 % du nombre
initial d’ovules vis-à-vis du témoin, tandis que dans les même conditions de conservation, celui des
pontes de bonne qualité initiale enregistre une diminution de 19 % vis-à-vis du témoin. Dans le milieu
minéral Cortland modifié, la baisse du taux moyen de survie entre le témoin et des ovules conservés
12 jours s’élève à 37 % pour les pontes de mauvaise qualité initiale, alors qu’elle est de 56 % pour
des pontes dont la qualité initiale était bonne.
2. Détail de la baisse qualité des pontes après conservation en fonction du milieu, de
la durée de conservation et de leur qualité initiale
Des différences entre les taux moyens de survie en fonction du milieu ou de la durée de
conservation des ovules ont été mises en évidence dans la partie précédente. Ce résultat nous a
amené à nous intéresser au détail des pertes subies dans les différentes conditions de conservation.
La perte globale relevée pour chacune des durées de conservation est divisée en quatre parties : trois
taux moyens de mortalités et un taux moyen d’alevins malformés mais toujours vivants au stade de la
résorption du sac vitellin, noté « taux moyen de malformés ». Le premier taux moyen de mortalité est
mesuré au stade œillé, le second entre le stade œillé et l’éclosion et enfin le dernier entre l’éclosion et
la résorption, aussi appelé « taux moyen de mortalité après l’éclosion ». Dans la suite, le terme « taux
moyens de pertes » regroupe les taux moyens de mortalités aux différentes périodes de
développement ainsi que le taux moyen de malformés.
Pontes de bonne qualité
A
B
100
80
Taux de pertes
Taux de pertes
100
60
40
20
80
60
40
20
0
0
T0
4j
8j
12j
T0
Durée de conservation dans le LCf
4j
8j
12j
Durée de conservation dans le MM
Légende :
Mortalité avant le stade oeillé
Mortalité après l'éclosion
Mortalité entre le stade oeillé-éclosion
Alevins malformés
Figure 5 : détail de la baisse de qualité des ovules en fonction de la durée de conservation selon le milieu
de conservation chez les pontes de bonne qualité initiale. Ces diagrammes présentent les taux moyens de
mortalité entre différents stades de développement (dégradés de bleu) et les taux moyens d’alevins malformés
(orange) relevées chez le témoin (T0) ou après 4, 8 et 12 jours (4j, 8j, 12j) de conservation des ovules. Les
pontes (N=12) ont été conservées soit dans le liquide cœlomique filtré (LCf) (A) soit dans le milieu minéral
Cortland modifié (MM) (B). A chaque point est associée son erreur type.
12
Pontes de mauvaise qualité
A
B
100
80
taux de pertes
Taux de pertes
100
60
40
80
60
40
20
20
0
0
T0
4j
8j
T0
12j
4j
8j
12j
Durée de conservation dans le MM
Durée de conservation dans le LCf
Légende :
Alevins malformés
Figure 6 : détail de la baisse de qualité des ovules en fonction de la durée de conservation selon le milieu
de conservation chez les pontes de mauvaise qualité initiale. Ces diagrammes présentent les taux moyens
de mortalité entre différents stades de développement (dégradés de bleu) et les taux moyens d’alevins malformés
(orange) relevées chez le témoin (T0) ou après 4, 8 et 12 jours (4j, 8j, 12j) de conservation des ovules. Les
pontes ont été conservés soit dans le liquide cœlomique filtré (LCf) (A) soit dans le milieu minéral Cortland
modifié (MM) (B). A chaque point est associée son erreur type.
Tableau 1 : effets de la durée de conservation, de la qualité initiale de la ponte et du milieu de
conservation sur la qualité des ovules
Qualité
initiale
Bonne
Durée de
conservation
X
0
8 ± 12
4 jours
5±9
8 jours
11 ± 12
12 jours
Liquide
cœlomique
filtré
Cortland
modifié
X
Mauvaise
Taux de mortalités
Milieu de
conservation
Liquide
cœlomique
filtré
Cortland
modifié
Incubé-œillé
a,b 1,2
Œillé-éclos
Eclos-résorbé
Taux
d’alevins
malformés
5±4
a 1,2,3
2±2
b
7±2
a1
3±3
b1*
1±1
c
6±1
a1*
a1*
7±7
a,b 2 *
3±3
b
8±3
a1*
24 ± 23
a2*
10 ± 9
b3*
2±2
c
6±2
b1*
4 jours
34 ± 33
a3
14 ± 12
a4
2±2
b
3±2
b2
8 jours
36 ± 29
a3
19 ± 10
a 4,5
4±5
b
5±5
b1
12 jours
51 ± 24
a4
20 ± 11
b5
3±3
c
4±3
c 1,2
0
43 ± 32
1,2
6 ± 11
4 jours
29 ± 23
a,b 3
8 jours
37 ± 24
1
12 jours
a,b 1 *
1
1±2
3±4
17 ± 21
a1
1±2
18 ± 18
2
1±1
5±5
35 ± 31
1
19 ± 17
1
2±2
6±5
4 jours
45 ± 22
a1
16 ± 15
a,c 2
1±2
b
3±3
c
8 jours
50 ± 31
a,b 1,2
21 ±17
a2
2±2
b
5±6
b
12 jours
72 ± 11
a2
15 ± 7
2±1
c
b1
b
0 ± 0,3
4±4
c
a,b
Ce tableau présente les taux moyens de mortalités à différentes périodes de développement ainsi que les taux
moyens de malformés relevés à la résorption présentés avec leurs écarts-types. Deux lettres différentes illustrent
une différence significative (p < 0,05) (p < 0,07) entre les taux moyens de perte pour une même durée de
conservation (i.e. sur une même ligne). Des numéros différents indiquent une différence significative (p < 0,05)
entre deux taux moyens relevés au même stade (i.e. d’une même colonne) selon la durée de conservation dans
un milieu donné et pour la même qualité initiale. Un astérisque illustre une différence significative (p < 0,05) entre
deux taux moyens relevés au même stade selon le milieu pour une durée de conservation et une qualité initiale
données. Un taux souligné dans les pontes de bonne qualité initiale indique qu’il est significativement différent
(p < 0,05) de son homologue relevé chez les pontes de mauvaise qualité initiale.
13
Détail des pertes pour les pontes de bonne qualité initiale (Tab.1) :
Lors de la conservation de pontes de bonne qualité dans le liquide cœlomique (Fig.5A), quelle
que soit la durée de conservation considérée, le taux moyen de mortalité avant stade œillé et le taux
moyen de malformés sont significativement supérieurs (p < 0,05) au taux moyen de mortalité après
l’éclosion. De plus, après 4 jours de conservation le taux moyen de malformés est significativement
supérieur au taux moyen de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion qui est lui-même supérieur au
taux moyen de mortalité après l’éclosion. Après 12 jours de conservation, le taux moyen de mortalité
avant le stade œillé est significativement supérieur au taux moyen de mortalité entre le stade œillé et
l’éclosion ainsi qu’au taux moyen de malformés qui sont eux-mêmes significativement supérieurs au
taux moyen de mortalité après l’éclosion.
Le taux moyen de mortalité avant le stade œillé relevé après 12 jours de conservation des
ovules dans le liquide cœlomique est significativement supérieur (p < 0,05) à ceux relevés à 4 et 8
jours. Le taux moyen de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion augmente significativement
(p < 0,05) entre 4, 8 et 12 jours de conservation.
Si les pontes présentant une bonne qualité initiale sont conservées dans le milieu minéral
(Fig.5B), on observe dès 4 jours que les taux moyens de mortalité avant le stade œillé et entre le
stade œillé et l’éclosion sont significativement supérieurs (p < 0,05) aux taux moyens de malformés
vivants et de mortalité après l’éclosion. Cette différence est toujours présente après 8 jours de
conservation. Après 12 jours, le taux moyen de mortalité au stade œillé est significativement supérieur
au taux moyen de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion qui est lui-même significativement
supérieur aux taux moyens de malformés vivants et de mortalité après l’éclosion. Ainsi, les pertes qui
résultent d’une conservation dans le milieu minéral sont principalement dues à des mortalités
intervenant avant l’éclosion.
Comme lors d’une conservation dans le liquide cœlomique, le taux moyen de mortalité avant
le stade œillé relevé après 12 jours de conservation des ovules dans le milieu minéral est
significativement supérieur (Pc < 0,05) à ceux relevés à 4 et 8 jours. Le taux de mortalité entre le
stade œillé et l’éclosion ne montre quant à lui qu’une différence significative (Pc < 0,05) entre 4 et 12
jours de conservation dans le milieu minéral.
Détail des pertes pour les pontes de mauvaise qualité initiale (Tab.1):
A durées de conservation égales dans le liquide cœlomique (Fig.6A), seule une différence
significative (p < 0,05) a été observée entre les différents taux moyens de pertes. Elle indique
qu’après 4 jours de conservation, le taux moyen de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion est
supérieur au taux de mortalité après l’éclosion. Cependant, Il est intéressant de noter que le taux
moyen de mortalité avant le stade œillé est toujours significativement supérieur au seuil de 7 % au
taux moyen de mortalité après l’éclosion.
Le taux moyen de mortalité avant le stade œillé diminue significativement (p < 0,05) après 4
jours de conservation dans du liquide cœlomique filtré. Il retrouve ensuite le niveau du témoin pour 8
et 12 jours de conservation. Le taux moyen de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion, quant à lui,
augmente significativement (p < 0,05) après 8 jours de conservation.
Les pontes conservées dans du milieu minéral (Fig.6B) ne présentent aucune différence
significative (p > 0,05) entre les taux moyens de pertes à une durée de conservation donnée.
Cependant, si le seuil de significativité est remonté à 7 %, on observe alors que le taux moyen de
mortalité avant le stade œillé est toujours supérieur aux trois autres taux moyens de pertes.
Le taux de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion augmente significativement (p < 0,05)
entre 4 et 12 jours de conservation dans le milieu minéral. Les taux de mortalités entre le stade œillé
et l’éclosion après 4 et 8 jours de conservation sont significativement supérieurs (p < 0,05) à celui du
témoin.
14
Effet du milieu de conservation sur les taux moyens de mortalités et de malformés au sein de
pontes de même qualité initiale (Tab.1) :
Seuls les taux moyens de mortalités et de malformés obtenus à partir de pontes de bonne
qualité initiale montrent des différences significatives selon le milieu de conservation utilisé. A durées
de conservation égales, les taux moyens de mortalités avant le stade œillé et entre le stade œillé et
l’éclosion sont significativement plus importants après une conservation des ovules dans le milieu
minéral. L’inverse est observé pour le taux d’alevins malformés.
Cela signifie que la différence de qualité observée entre les deux milieux est principalement
due à des mortalités survenant avant l’éclosion qui sont plus importantes dans le milieu minéral que
dans le liquide cœlomique.
3. Suivi des malformations observées chez les alevins au stade de la résorption du
sac vitellin
L’apparition de types de malformations récurrentes affectant les alevins de la quasi-totalité
des lots en incubation mais à des fréquences différentes nous a incité à tester les effets du milieu et
de la durée de conservation sur l’occurrence de ces malformations. De plus, suite à l’observation de
différences significatives entre les taux moyens de malformations pour une durée de conservation
donnée entre les deux milieux testés chez les pontes de bonne qualité initiale, nous voulions vérifier si
nous retrouvions ces différences pour un ou plusieurs types de malformations et ainsi déterminer si un
des deux milieux induit un type de malformation particulier. Pour ce faire, un relevé des malformations
de chaque lot a été effectué en dénombrant toutes celles observées sur chacun des individus encore
vivants à la résorption. Dix types de malformations ont pu être déterminés pour l’expérience StoreOvule : non résorbé, tordu, tire-bouchon (corps spiralé), siamois, sans caudale, cyclope, borgne,
télescope (exophtalmie), aveugle et prognathe (Fig.6-7).
Taux de malformations à la résorption
Taux moyens de malformations types relevées chez les pontes de bonne qualité initiale :
9%
*
T0
8%
4j
8j
12j
7%
6%
5%
4%
*
3%
2%
1%
0%
LCf
MM
Non résorbé
LCf
MM
Tordu
LCf
MM
Tirebouchon
LCf
MM
Siamois
LCf
MM
Cyclope
LCf
MM
Borgne
LCf
MM
Télescope
LCf
MM
Aveugle
LCf
MM
Prognathe
malformations types pour des pontes de bonne qualité initiale. Les barres représentent les taux moyens de
malformations (N=12) observés sur des individus encore vivants à la résorption du sac vitellin pour (du orange
plus foncé au plus clair) le témoin et après 4, 8 et 12 jours de conservation des ovules (codées respectivement
T0, 4j, 8j et 12j). Pour une même durée de conservation, les ovules ont été stockés dans du liquide coelomique
filtré (LCf) ou du mileu minéral Cortland modifié (MM). Chaque barre est accompagnée de son erreur type. Une
différence significative (Pc < 0,05) entre deux taux moyens de malformation due à la durée de conservation dans
un même milieu est indiquée par une ligne en pointillés reliant les sommets des deux barres concernées. Une
différence significatice (Pc < 0,05) entre deux taux moyens de malformation due au milieu de conservation pour
une même durée de stockage est représentée par un astérique au dessus de la plus haute barre.
15
Les pontes de bonne qualité initiale présentent préférentiellement quatre types de
malformations : la non-résorption du sac vitellin, la torsion, l’exophtalmie (télescope) et le
prognathisme.
Des différences significatives de taux moyens de non résorbés sont observées en fonction du
milieu de conservation des ovules après 8 (p < 0,05) et 12 jours (p < 0,01) de stockage. Une
conservation des ovules de 8 jours ou plus dans le liquide cœlomique induit donc un taux d’alevins
non résorbés plus important qu’une conservation dans du milieu minéral Cortland modifié.
Seule la conservation des ovules dans le milieu minéral Cortland modifié fait ressortir des
différences significatives (Pc < 0,05) en fonction de la durée de conservation. En effet 4 jours passés
dans le milieu minéral diminuent significativement le taux moyen de non résorption et de prognathisme
tandis que 8 jours dans ce milieu augmentent significativement le taux moyen d’alevins « tirebouchons ». D’autre part, une conservation de 12 jours diminue significativement le taux de non
résorption et d’exophtalmie.
Certains types de malformations, comme par exemple l’exophtalmie, présentent une tendance
à la diminution lorsque la durée de conservation des ovules augmente. D’autres au contraire ont
tendance à augmenter voire à apparaître si la durée de conservation est rallongée, c’est le cas des
tordus, tire-bouchons, siamois, cyclopes ou encore aveugles. Il faut néanmoins noter que l’évolution
au cours du temps du taux d’alevins cyclopes pour des ovules conservés dans du liquide cœlomique
filtré est le fait d’une seule femelle dont la ponte présente un nombre de cyclopes inhabituellement
élevé après 8 et 12 jours de conservation.
Taux de malformations types relevées chez les pontes de mauvaise qualité initiale :
6%
T0
4j
8j
12j
5%
4%
3%
2%
1%
0%
LCf
MM
Non résorbé
LCf
MM
Tordu
LCf
MM
Tirebouchon
LCf
MM
Siamois
LCf
MM
Sans
caudale
LCf
MM
Borgne
LCf
MM
Télescope
LCf
MM
Aveugle
LCf
MM
Prognathe
malformations types pour des pontes de mauvaise qualité initiale. Les barres représentent les taux moyens
de malformations (N=5) observés sur des individus encore vivants à la résorption du sac vitellin pour (du orange
plus foncé au plus clair) le témoin et après 4, 8 et 12 jours de conservation des ovules (codées respectivement
T0, 4j, 8j et 12j). Pour une même durée de conservation, les ovules ont été stockés dans du liquide coelomique
filtré (LCf) ou du mileu minéral Cortland modifié (MM). Chaque barre est accompagnée de son erreur type.
Les pontes de mauvaise qualité initiale sont elles aussi plus particulièrement sujettes à
certains types de malformations comme la non-résorption du sac vitellin, la torsion et le prognathisme.
Les alevins « tire-bouchons » et aveugles ne sont observés que lorsque les ovules ont été
conservés dans le milieu minéral. Cependant elles apparaissent uniquement chez la ponte d’une
seule femelle chacune.
Aucune différence significative (p > 0,05) n’est observée entre les taux de malformations en
fonction du milieu ou de la durée de conservation appliqués aux pontes de mauvaise qualité initiale.
Seuls les « tire-bouchons », les siamois et les aveugles présentent une tendance à l’augmentation
lorsque la durée de conservation des ovules est rallongée. Il faut cependant noter que la forte
16
augmentation du taux moyen de siamois qui apparaît après 12 jours de conservation dans du liquide
cœlomique filtré est principalement due à une femelle présentant un taux inhabituellement élevé
d’alevins siamois à la résorption. Les autres types de malformations ne présentent pas de tendance
d’évolution continue lorsque la durée de conservation augmente.
Comparaison des taux moyens d’apparition de malformations types entre les pontes de
qualités initiales différentes :
Les pontes de bonne qualité initiale présentent des alevins cyclopes mais aucun alevin sans
nageoire caudale tandis que c’est l’inverse pour les pontes de mauvaise qualité initiale.
Les taux moyens d’alevins non résorbés et télescopes des pontes de bonne qualité initiale,
qui varient respectivement entre 1,5 et 8,7 % et entre 0,4 et 2,6 %, sont supérieurs à ceux des pontes
de mauvaise qualité initiale qui sont compris respectivement entre 0,9 et 2 % et entre 0 et 0,8 %. On
note également que si la fécondation est effectuée le jour même de la collecte des ovules ou après
une conservation dans du liquide cœlomique filtré, on ne dénombre des alevins « tire-bouchons » que
chez les pontes de bonne qualité initiale. En ce qui concerne le taux moyen de prognathisme, il a
tendance à être plus important après une conservation de 8 jours ou plus dans le liquide cœlomique
chez les pontes de mauvaise qualité initiale que chez celles de bonne qualité initiale.
Les autres types de malformations présentent une fréquence d’apparition similaire dans les
deux classes de pontes.
B. Expérience de conservation sur glace :
Cette expérience avait pour objectif d’étudier la conservation d’une plus grande quantité
d’ovules dans du milieu minéral Cortland modifié pendant 8 et 15 jours à une température stabilisée
entre 0 et 1 °C grâce à un environnement de glace fondante. Le principal intérêt de cette expérience
était d’utiliser une technique de conservation qui soit plus aisément transposable à une entreprise
piscicole.
Taux de survie sans malformation
à la résorption
1. Effet de la qualité initiale de la ponte sur l’évolution de la qualité des ovules lors de
leur conservation
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a*
T0
b
c
8j
15j
Figure 9 : effet de la durée de conservation et de la qualité initiale des pontes sur le taux de survie sans
malformations à la résorption. La courbe verte représente les pontes de bonne qualité initiale (N=5) et la
courbe rouge celles de mauvaise qualité initiale (N=4). Chacun des points correspond à la moyenne des taux de
survie sans malformation à la résorption à une durée de conservation et une qualité de ponte initiale données. Ils
sont accompagnés de leurs erreurs types. Les mesures ont été effectuées sur des pontes fécondées le jour du
stripping (T0) et après 4, 8 et 12 jours de conservation (respectivement 4j, 8j et 12j). Deux lettres différentes
indiquent une différence significative (p < 0,05) entre deux points de la courbe représentant les pontes de bonne
qualité initiale. Un astérisque indique une différence significative (p < 0.05) entre les deux milieux de stockage
pour une durée de conservation donnée.
17
La conservation sur glace dans du milieu minéral Cortland modifié induit une importante
baisse significative (p < 0,05) de la qualité des ovules dès 8 jours de conservation (Fig.8). De plus
l’augmentation de la durée de conservation de 8 à 12 jours provoque également une diminution
significative (p < 0,05) de la qualité des ovules.
D’autre part, le témoin issu de pontes de bonne qualité initiale présente un taux moyen de
survie qui est significativement supérieur (p < 0,05) à celui issu de pontes de mauvaise qualité initiale.
Dès 8 jours de conservation, la différence entre les taux moyens de survie au regard de la qualité
initiale de la ponte s’estompe. Ceci s’explique par une chute importante du taux moyen de survie des
individus issus de pontes de bonne qualité initiale qui passe de 74 % pour le témoin à 13 % après 8
jours de conservation. Pour cette même durée de conservation, le taux moyen de survie des individus
issus de pontes de mauvaise qualité initiale subit une perte deux fois moindre passant de 44 à 18 %.
2. Détail de la baisse qualité des ovules en fonction de la durée de
conservation et de la qualité initiale des pontes
B
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Taux de pertes
Taux de pertes
A
T0
8j
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
T0
15j
8j
15j
Légende :
Alevins malformés
Figure 10 : détail de la baisse qualité des ovules en fonction de la durée de conservation et de la qualité
initiale des pontes. Ces diagrammes présentent les taux moyens de mortalité entre différents stades de
développement (en dégradé de bleu) et les taux moyens d’individus malformés à la résorption (en orange)
relevés chez le témoin (T0) ou après 4, 8 et 12 jours (4j, 8j, 12j) de conservation des ovules. La figure A présente
les résultats obtenus à partir de pontes de bonne qualité initiale (N=5) et la figure B ceux obtenus avec des
pontes de mauvaise qualité initiale (N=4). Chaque point est accompagné de son erreur type.
18
Tableau 2 : effet de la qualité initiale de la ponte et de la durée de conservation sur la qualité
des ovules
Qualité
initiale
Bonne
Mauvaise
Durée de
conservation
Taux de mortalités
Incubé-œillé
a,c 1 *
Œillé-éclos
a,b,c 1
Taux d’alevins
malformés
1±1
b
4±3
c
X
16 ± 15
8 jours
69 ± 9
15 jours
80 ± 13
X
53 ± 26
1±1
0±1
4±3
8 jours
66 ± 18
10 ± 6
2±1
5±2
15 jours
78 ± 11
9±2
1±1
3±3
a2
a3
5±4
Eclos-résorbé
13 ± 3
b2
1±1
c
4±3
c
11 ± 7
b2
1±1
c
3±3
d
Ce tableau présente les taux moyens de mortalité entre différents stades de développement ainsi que les taux
moyens de malformation relevés à la résorption accompagnés de leurs écarts-types. Deux lettres différentes
illustrent une différence significative (Pc < 0,05) entre les taux moyens de perte pour une même durée de
conservation (i.e. sur une même ligne). Des numéros différents indiquent une différence significative (Pc < 0,05)
entre deux taux moyens relevés au même stade (i.e. d’une même colonne) selon la durée de conservation pour
une qualité initiale donnée. Un astérisque auprès d’un taux moyen de perte dans les pontes de bonne qualité
initiale indique qu’il est significativement différent (Pc < 0,05) de son homologue relevé chez les pontes de
mauvaise qualité initiale.
Détail des pertes pour les pontes de bonne qualité initiale (Fig.A ; Tab.2) :
Lors de la conservation sur glace dans le milieu minéral, après 8 ou 15 jours de conservation,
le taux moyen de mortalité avant l’éclosion est significativement supérieur (p < 0,05) au taux moyen
de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion qui est lui-même supérieur aux taux moyens de
mortalités après l’éclosion et d’alevins malformés. Après 15 jours de conservation, le taux moyen
d’alevins vivants malformés est même significativement supérieur (p < 0,05) au taux moyen de
mortalités après l’éclosion.
L’augmentation de la durée de conservation de 8 à 15 jours provoque une hausse significative
(p < 0,05) du taux moyen de mortalité avant le stade œillé. La conservation sur glace pendant 8 ou 15
jours entraîne une hausse significative (p < 0,05) du taux moyen de mortalité entre le stade œillé et
l’éclosion par rapport au témoin. Cependant le prolongement de la durée de conservation de 8 à 15
jours n’induit pas de différence significative (p > 0,05) du taux moyen de mortalité entre le stade œillé
et l’éclosion.
Détail des pertes pour les pontes de mauvaise qualité initiale (Fig.B ; Tab.2) :
Seules des différences significatives au seuil de 7 % ont pu être observées chez les pontes de
mauvaise qualité initiales conservées sur glace. On observe alors que le taux moyen de mortalité
avant le stade œillé est significativement supérieur (Pc < 0,07) à tous les autres, chez le témoin et lors
d’une conservation de 8 ou 15 jours. De plus lors d’une conservation sur glace, le taux moyen de
mortalité entre le stade œillé et l’éclosion est supérieur au taux moyen de mortalité entre l’éclosion et
la résorption.
Conserver les ovules pendant 8 ou 15 jours provoque une hausse significative, toujours au
seuil de 7 %, du taux moyen de mortalité entre le stade œillé et l’éclosion.
Finalement, quelle que soit la qualité initiale de la ponte, la baisse de qualité qui affecte les
ovules lors du stockage sur glace est principalement due à des mortalités se produisant avant le stade
œillé.
19
3. Suivi des malformations observées chez les alevins au stade de la résorption du
sac vitellin
Un relevé de la fréquence d’apparition de différents types de malformations a été effectué
pour déterminer si la durée de conservation des ovules ou la qualité initiale des pontes induisent des
malformations particulières. Onze types de malformations ont pu être déterminés lors de la
conservation sur glace: non résorbé, tordu, tire-bouchon (corps spiralé), siamois, sans caudale,
cyclope, borgne, télescope (exophtalmie), aveugle, prognathe et sans bouche (Fig.10).
8%
T0
7%
8j
15j
6%
5%
4%
3%
2%
1%
0%
BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ BQ MQ
Non
résorbé
Tordu
TireSiamois
bouchon
Sans
caudale
Cyclope
Borgne Télescope Aveugle Prognathe
Sans
bouche
Figure 11 : effets de la durée de conservation et de la qualité initiale de la ponte sur les taux moyens
d’apparition de malformations types. Les barres représentent les taux de malformations observés sur des
individus encore vivants à la résorption du sac vitellin pour (du orange plus foncé au plus clair) le témoin et après
8 et 15 jours de conservation des ovules (codées respectivement T0, 8j et 15j) chez des pontes de bonne qualité
initiale (N=5) (BQ) et de mauvaise qualité initiale (N=4) (MQ). Chaque barre est représentée avec son erreur type.
Aucune différence significative (Pc > 0,05) n’a pu être observée entre les différents taux
moyens de malformations à la résorption. Cependant, en relevant le seuil de significativité à 7 %, on
observe, au sein des pontes de mauvaise qualité initiale, une augmentation significative du taux
moyen d’alevins « tire-bouchons » après 8 jours de conservation suivie d’une diminution significative
lorsque la durée de conservation est rallongée jusqu’à 15 jours.
Si le seuil de significativité est de nouveau relevé pour atteindre 8 %, alors 15 jours de
conservation sur glace induisent une diminution significative du taux moyen de non-résorption pour les
pontes de bonne qualité initiale.
D’autre part, quelle que soit leur qualité initiale, les pontes ayant subi une conservation
semblent être principalement sujettes à deux types de malformations : la non résorption du sac vitellin
et la torsion. A l’inverse, on dénombre très peu d’alevins sans nageoire caudale (3 répartis entre 2
pontes) ainsi que d’alevins sans bouche (2 au sein d’une seule ponte). De plus, ces deux types de
malformation n’apparaissent que lorsque les ovules ont été conservés pendant 15 jours sur glace. Il
faut également noter que le taux moyen de cyclopes élevé qui est observé après 15 jours de
conservation chez les pontes de bonne qualité initiale n’est le reflet que d’une seule ponte présentant
un taux anormalement élevé d’alevins cyclopes. Il en est de même pour le taux moyen de borgnes
relevé chez les pontes de bonne qualité initiale après 8 jours de conservation.
Finalement, une durée de conservation des ovules inférieure à 15 jours et la qualité initiale de
la ponte ne semblent pas induire un type de malformation particulier.
20
Discussion
L’objectif de ce stage était d’effectuer un test comparatif de l’efficacité du liquide cœlomique
filtré et du milieu minéral Cortland modifié utilisés comme milieux de conservation à basse
température pour des ovules de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Pour ce faire, des ovules
issus de mêmes pontes ont été conservés à 4 °C en parallèle dans ces deux milieux pendant 4, 8 et
12 jours. Une expérimentation de conservation sur glace fondante pendant 8 et 15 jours a également
été menée.
La qualité des ovules après conservation a été évaluée à partir de comptages des survivants
à différents stades du développement et d’un relevé des malformations.
A. Le liquide cœlomique filtré reste le meilleur milieu de conservation des
ovules mais son efficacité varie en fonction de la qualité initiale de la
ponte :
Lors de cette étude, certaines pontes présentaient une qualité initiale, c’est-à-dire la qualité
des ovules du lot témoin ou de ceux qui ont été conservés 4 jours dans du liquide cœlomique filtré,
anormalement basse avec certaines femelles dont le taux d’alevins résorbés sans malformation ne
dépassait pas 50 %. Cette différence de qualité des pontes déjà observée lors d’expériences
antérieures (Bonnet, 2002) est principalement attribuée à la variabilité individuelle entre femelles.
Cette variabilité individuelle se retrouve dans certaines caractéristiques des ovules comme leur poids
ou les teneurs en fer, calcium, protéines et lipides (Craik and Harvey, 1984).
Une fois le problème de variabilité individuelle résolu par la formation de deux groupes en
fonction de la qualité initiale de la ponte, les résultats ont pu être traités au regard cette qualité initiale.
1. Effet de l’allongement de la durée de conservation des ovules sur leur qualité
Lors d’une conservation de 4 jours à 4 °C dans du liquide cœlomique filtré, il a été observé
que le taux moyen de survie sans malformation à la résorption pouvait augmenter. Cette observation
est en accord avec la littérature où il est mentionné un phénomène de maturation post-ovulatoire
entraînant une amélioration de la qualité des ovules après leur conservation in vivo jusqu’à 6 jours à
10 ± 1 °C (Springate et al., 1984) ) et 5 jours à 12 °C (Aegerter, 2005).
La conservation des ovules à 4 °C dans du liquide cœlomique filtré est efficace jusqu’à 8
jours. Une diminution significative du taux de survie sans malformation à la résorption est ensuite
observée si la durée de conservation est prolongée jusqu’à 12 jours. Ceci est vrai si l’on compare la
qualité après conservation par rapport à la qualité des ovules fraîchement ovulés. Si la comparaison
se fait par rapport à des ovules qui ont maturé 4 jours dans le liquide cœlomique, alors une
conservation de 8 jours a un effet négatif sur leur qualité. Les pontes ayant une mauvaise qualité
initiale ne présentent quant à elles aucune diminution significative de leur qualité lors d’une durée de
conservation allant jusqu’à 12 jours dans le liquide cœlomique filtré. Ces résultats sont en accord avec
ceux observés dans la littérature où il est mentionné qu’après 9 jours de conservation à 2-3 °C dans le
liquide cœlomique aucune différence significative (p > 0,05) du taux de survie à l’éclosion n’est
observée par rapport au témoin (Niksirat et al., 2007).
Une baisse de qualité des ovules a pu être mise en évidence chez les pontes de bonne
qualité initiale dès 4 jours passés à 4 °C (i.e. 16 °Cj de développement) dans le milieu minéral. Pour
les pontes de mauvaise qualité initiale, aucune baisse de la qualité des ovules n’est relevée avant 8
jours de conservation dans les mêmes conditions, soit après 32 °Cj de vieillissement. Un
vieillissement de 25 °Cj dans le milieu minéral Cortland modifié tamponné à l’Hepes sans diminution
de la qualité avait déjà été observé chez des pontes de mauvaise qualité initiale lors d’une
conservation à 12-13 °C (Goetz and Coffman, 2000). Cela correspondrait à une durée de
conservation d’environ 6 jours à 4 °C dans ce milieu minéral sans baisse de qualité.
21
D’autre part, le taux de survie à l’éclosion d’ovules de bonne qualité initiale, après une
conservation dans le milieu minéral ne présente pas de différence significative vis-à-vis du témoin lors
d’une conservation de 2 jours à 2-3 °C, soit environ 5 °Cj de développement (Niksirat et al., 2007).
Ainsi, la baisse de qualité qui affecte les pontes de bonne qualité initiale lors de leur conservation
dans le milieu minéral Cortland modifié tamponné à l’Hepes devient significative entre 5 et 16 °Cj de
vieillissement des ovules. Il pourrait donc être intéressant de mener une expérience semblable à
« Store-Ovule », mais uniquement jusqu’à 4 ou 5 jours et en effectuant des relevés de qualité des
ovules quotidiens. Cela permettrait de caractériser avec plus de précision la baisse précoce de la
qualité des ovules qui a été observée lors leur conservation dans le milieu minéral.
La qualité des ovules diminue fortement lorsqu’ils sont stockés sur glace fondante dans le
milieu minéral. Le taux moyen de survie des pontes de bonne qualité initiale passe de 74 % pour le
témoin à moins de 13 % après 8 jours de conservation, soit une perte de plus de 60 %. Cela
représente le double de la baisse observée dans l’expérience Store-Ovule pour les mêmes durée et
milieu de conservation. Cette forte baisse de qualité lors de la conservation sur glace peut tout d’abord
s’expliquer par le fait que les ovules étaient conservés à des concentrations deux fois plus élevées
que dans l’expérience Store-ovule, respectivement 10 et 20 ovules par millilitre de milieu minéral.
D’autre part, les ovules sont stockés en plus grande quantité dans un pilulier fermé, il ne peut donc y
avoir aucun échange gazeux avec l’extérieur et les ovules étant disposés en couches superposées, le
renouvellement en gaz au niveau des couches inférieures est très faible. Tout ceci augmente le risque
de mortalité des ovules par asphyxie (Komrakova and Holtz, 2009). De plus, les piluliers étant
déposés à même la glace, les ovules situés sur le fond, au contact de la paroi, sont susceptibles
d’avoir subi des gelures létales. La mort des ovules, ou au minimum leur perte de fécondabilité, durant
la conservation expliqueraient l’augmentation de mortalité relevée dès le stade œillé après stockage
sur glace fondante.
La conservation en pilulier au contact de la glace fondante est donc à éviter. Il pourrait
néanmoins être intéressant de refaire cette expérimentation, mais en laissant une couche d’air entre
les ovules et la glace. Cela devrait permettre de limiter les gelures causées aux ovules. Le pas de
temps entre les relevés pourrait également être diminué afin de mieux caractériser la baisse de qualité
observée dès 8 jours de conservation.
2. Effet du milieu de conservation sur le maintien de la qualité des ovules
L’expérience Store-Ovule a également permis de mettre en évidence que le taux moyen de
survie après conservation des pontes de bonne qualité initiale dans le liquide cœlomique demeure
supérieur à celui obtenu après un stockage dans du milieu minéral, quelle que soit la durée de
conservation considérée. Cela démontre la supériorité du liquide cœlomique filtré par rapport au milieu
minéral Cortland modifié en tant que milieu de conservation des ovules à 4 °C sur une période allant
de 4 à 12 jours, soit une durée de développement de 16 à 48 °Cj.
Des pontes de mauvaise qualité initiale conservées 24 heures à 12-13 °C, équivalant à un
vieillissement de 12-13 °Cj, dans le milieu minéral Cortland modifié tamponné à l’Hepes présentent un
taux de survie à l’éclosion supérieur à celui d’ovules conservés dans du liquide cœlomique dans les
même conditions. De plus, si la durée de conservation est rallongée jusqu’à deux jours, soit environ
25 °Cj de développement, le taux de survie à l’éclosion est similaire pour les deux milieux de
conservation (Goetz and Coffman, 2000). Cependant, ces résultats ont été obtenus à partir des
pontes de 3 femelles. Il faut donc les considérer avec précaution étant donné la variabilité individuelle
qui existe entre les femelles.
Le ou les composés du liquide cœlomique responsables de sa meilleure efficacité globale en
tant que milieu de conservation vis-à-vis des milieux artificiels sont pour le moment inconnus. Le
milieu Cortland modifié tamponné à l’Hepes, qui donne les meilleurs résultats parmi les milieux de
conservation artificiels testés à ce jour, possède une composition en minéraux proche de celle du
liquide cœlomique de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) (Lahnsteiner et al., 1995), ce qui
laisse à penser que le ou les facteurs responsables de cette différence de conservation seraient
d’origine organique. Les dernières études se sont orientées vers la recherche de composés
protéiques suite à l’observation d’une corrélation positive entre la diminution de la qualité des ovules
in vivo et l’augmentation de la quantité de protéines présentes dans le liquide cœlomique (Rime et al.,
2004). Une étude récente a découvert qu’un traitement du liquide cœlomique au charbon actif, qui
22
élimine préférentiellement les composés hydrocarbonés non polaires, diminue son efficacité de
conservation. Malheureusement les connaissances actuelles ne nous permettent pas de définir quel
composant parmi ceux éliminés par le traitement au charbon actif serait impliqué dans le maintien de
la qualité des ovules (Bahabadi et al., 2011).
En attendant de découvrir quels sont les composés qui confèrent une meilleure efficacité au
liquide cœlomique, une expérimentation possible pour améliorer l’efficacité du milieu minéral serait de
le complémenter avec des extraits de liquide cœlomique. Il est possible que la simple présence,
même à une faible concentration, de certains composés du liquide cœlomique augmente
significativement l’efficacité du milieu minéral. Cependant, un des intérêts du milieu minéral est qu’il
est totalement stérile, ce qui n’est pas le cas du liquide cœlomique, même filtré. En effet, la filtration à
0,22 µm n’élimine pas les virus potentiellement présents dans le liquide cœlomique et une stérilisation
par la chaleur ou les ultraviolets risquerait de détruire les composés que l’on cherche à incorporer au
milieu minéral.
B. Les plus fortes mortalités surviennent avant l’éclosion et sont plus
importantes après conservation dans le milieu minéral tandis que le
liquide cœlomique induit plus d’alevins malformés :
Les relevés effectués à différents stades du développement de l’embryon ont permis
d’identifier les périodes de développement durant lesquelles les mortalités étaient les plus
importantes.
Lors de la conservation de pontes de bonne qualité initiale à 4 °C dans le liquide cœlomique,
les mortalités apparaissant avant le stade œillé et les pertes due à des malformations sont parmi les
plus importantes quelles que soient les durées de conservation considérées. Les mortalités avant le
stade œillé deviennent même la première composante de baisse de la qualité observée après douze
jours de conservation. Comparées aux mortalités qui précèdent l’éclosion, les mortalités touchant les
alevins après l’éclosion apparaissent comme étant une cause mineure dans la baisse de qualité des
ovules.
Aucune ponte conservée dans le liquide cœlomique filtré ne présente de différence avec le
témoin au niveau des taux moyens de pertes. Cependant, l’allongement de la durée de conservation
entraîne une augmentation des mortalités survenant avant l’éclosion. A ce jour, aucune étude ne
mentionne d’augmentation significative du taux de malformations lors de l’augmentation de la durée
de conservation ex vivo des ovules. La plus courte durée de vieillissement post-ovulatoire in vivo
induisant une augmentation significative du taux d’alevins malformés vivants à la résorption chez la
truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) mentionnée dans la littérature est de 7 jours à 12 °C, ce qui
correspond à une durée de développement de 84 °Cj (Aegerter and Jalabert, 2004).
Les pertes relevées chez les pontes de bonne qualité initiale conservées dans le milieu
minéral Cortland modifié sont principalement dues à des mortalités apparues avant l’éclosion. En
effet, elles présentent des taux de mortalité avant le stade œillé et entre le stade œillé et l’éclosion qui
sont supérieurs à celui après l’éclosion et au taux de malformés vivants. On note également que les
taux de mortalité avant le stade œillé et entre le stade œillé et l’éclosion sont équivalent jusqu’à 8
jours de conservation. Après 12 jours de stockage, les mortalités apparaissant avant le stade œillé
deviennent les plus importantes.
La conservation de pontes de bonne qualité initiale dans le milieu minéral Cortland modifié
induit une augmentation des mortalités survenant avant l’éclosion dès quatre jours de conservation à
4 °Cj. Le taux de mortalité avant le stade œillé s’accroît avec l’allongement de la durée de
conservation.
La comparaison du détail des pertes observées chez les pontes de bonne qualité initiale
stockées dans chacun des deux milieux permet de s’apercevoir qu’à durée de conservation égale, le
milieu minéral induit des mortalités avant le stade œillé et entre le stade œillé et l’éclosion qui sont
supérieures à celles observées lors d’une conservation dans le liquide cœlomique. A l’inverse, le taux
23
de malformés est plus important dans le cas d’une conservation dans le liquide cœlomique.
Cependant, le relevé des alevins malformés ne tient compte que des individus toujours vivant au
stade de la résorption du sac vitellin et laisse donc de côté tous ceux qui sont morts plus tôt. Ainsi la
baisse du taux de malformés observée suite à un stockage dans le milieu minéral par rapport au
liquide cœlomique est à considérer avec prudence sachant que les deux taux de mortalités calculés
avant la fécondation sont plus élevés dans le milieu minéral. Des travaux antérieurs ont montré que
dans des conditions entrainant des baisses drastiques de qualité (par exemple un vieillissement postovulatoire à haute température), le taux de malformation pouvait être très bas ou nul (Aegerter and
Jalabert 2004). Ce phénomène peut expliquer la relative faiblesse des taux de malformation observée
dans ce rapport après conservation dans du milieu minéral pendant 8 et 12 jours.
Les pertes enregistrées lors de la conservation de pontes de bonne qualité initiale sur glace
fondante dans du milieu minéral sont principalement dues aux mortalités touchant les œufs avant
l’éclosion. Au sein des mortalités affectant les ovules avant l’éclosion, celles se produisant avant le
stade œillé sont les plus importantes.
Un allongement de la durée de conservation de 8 à 15 jours entraîne une augmentation des
mortalités relevées avant le stade œillé.
C. La conservation ex vivo des ovules jusqu’à 12 jours à 4 °C n’est pas
suffisante pour observer une évolution claire de la fréquence
d’apparition de malformations types :
Selon les résultats présentés dans ce rapport, des ovules de bonne qualité initiale conservés
8 jours et plus dans le liquide cœlomique engendrent plus d’alevins non résorbés vivants qu’une
conservation de même durée dans le milieu minéral Cortland modifié. D’autre part, un effet de la
conservation sur le taux d’apparition de malformations types n’a pu être observé que sur des pontes
conservées dans du milieu minéral Cortland modifié.
De manière générale, les alevins sont principalement sujets à trois types de malformations qui
sont la non-résorption du sac vitellin, la torsion et le prognathisme. Pour les pontes de bonne qualité
initiale, l’exophtalmie peut être ajoutée à cette liste, sachant que les alevins atteints d’exophtalmie
sont bien souvent non résorbés. On note d’ailleurs une diminution des taux moyens de ces deux types
de malformation lors d’une conservation de douze jours dans le milieu minéral.
La littérature mentionne une augmentation de certains types de malformations (cyclope, tordu,
non résorbé) après un vieillissement post-ovulatoire in vivo de 16 jours à 12 °C, donc de 192 °Cj
(Bonnet et al., 2007). Dans notre expérience, les ovules ayant été conservés au maximum pendant
48 °Cj, le fait de ne pas observer d’évolution significative des taux de malformation types après
conservation dans le liquide cœlomique filtré reste en accord avec ces résultats.
La variabilité individuelle entre les femelles est importante en ce qui concerne l’apparition de
certaines malformations types. En effet, certaines femelles produisent des pontes présentant des taux
de fréquences inhabituellement élevés pour un type de malformation particulier, comme c’est observé
ici pour les alevins cyclopes. D’autre part, certaines malformations, comme l’absence de nageoire
caudale ou la non-ouverture de la bouche, ne sont exprimées que par quelques individus chez les
pontes d’une ou deux femelles sur les 17 que compte l’expérience.
24
D. Passage en
génétique :
conditions
d’élevage et
applications
à
la
sélection
D’après les résultats présentés dans ce rapport, la conservation ex vivo à 4 °C dans le liquide
cœlomique filtré permet de maintenir la qualité des ovules jusqu’à 8 jours si le stripping a été effectué
entre un et trois jours post-ovulation. Cependant, lors d’une conservation sous air, la plus probable en
condition de terrain, la quantité d’ovules doit être ajustée de manière à ne pas former plus d’une
double couche d’ovules afin d’éviter l’asphyxie des ovules se trouvant dans les couches inférieures
(Komrakova and Holtz, 2009).
Un simple réfrigérateur peut être utilisé pour maintenir la température de conservation (Babiak
and Dabrowski, 2003). Il est cependant nécessaire vérifier préalablement les fluctuations de la
température à l’intérieur du réfrigérateur afin de vérifier qu’elle reste dans la gamme des 0,5-4 °C.
La vitesse de filtration diminue plus ou moins rapidement avec le colmatage du filtre selon les
liquides cœlomiques. En moyenne, un filtre d’une surface de 7 cm² et d’une porosité de 0,45 µm se
colmate et devient inutilisable après avoir traité 15 à 20 ml de liquide cœlomique. Filtrer 15-20 ml de
liquide cœlomique dans ces conditions demande environ une minute. Du fait du colmatage, il n’est
donc possible de filtrer qu’entre 2 et 3 ml de liquide cœlomique par cm² de filtre et cela prend environ
une minute. Pour la préparation de grandes quantités de liquide cœlomique filtré, il semble nécessaire
d’augmenter la porosité du filtre, à 0,8 µm par exemple. Sans cela, son colmatage rapide rendra la
filtration laborieuse. La filtration à 0,8 µm devrait permettre de diminuer suffisamment la charge
bactérienne. Cependant, si des développements bactériens trop importants sont observés, il sera
possible d’effectuer une seconde filtration à 0,45 voire 0,22 µm après celle à 0,8 µm.
En sélection génétique, le nombre d’alevins qu’il est demandé à une femelle de produire est
moins important qu’en production. En général, les femelles utilisées pour donner les futurs géniteurs
pèsent entre 2 et 4 kg. Pour effectuer un programme de sélection, ces femelles doivent au minimum
produire 400 individus qui atteignent le stade d’alevins de 10 g (communication SYSAAF). Ainsi, pour
les femelles de 2 kg qui produisent environ 4000 ovules, le taux de survie de la ponte au stade
d’alevins de 10 g doit être au minimum de 10 %. Dans l’expérience « Store-Ovule », la survie a été
relevée au stade de la résorption du sac vitellin. Cependant, les mortalités qui touchent les alevins
après ce stade sont très faibles excepté en cas de développement de pathogènes (flavobactérium par
exemple). D’après les résultats de l’expérience « Store-Ovule », une conservation de 12 jours à 4 °C
dans le liquide cœlomique filtré permet de conserver un taux moyen de survie à la résorption
supérieur à 35 % quelle que soit la qualité initiale de la ponte. En ce qui concerne la conservation
dans le milieu minéral, les pontes de bonne qualité initiale présentent un taux moyen de survie de
22 % après 12 jours de conservation à 4 °C, ce qui reste acceptable. Par contre les pontes de
mauvaise qualité initiale conservées dans le milieu minéral ont un taux moyen de survie à la
résorption de 10 % après 12 jours de conservation. Cela ne laisse pas une marge suffisante compte
tenu des mortalités pouvant encore survenir avant le stade d’alevins de 10 g. Par contre, si la durée
de conservation est raccourcie à 8 jours, le taux moyen de survie est de 22 %. La conservation
d’ovules dans le milieu minéral est donc possible jusqu’à 8 jours dans le cadre de la sélection. (cf.
annexes II et III pour la correspondance entre les taux de survie à la résorption et au stade œillé)
Les durées de conservation des ovules mentionnées précédemment sont obtenues après
manipulation dans des conditions de laboratoire (environnement stérile) et avec un suivi quotidien
durant l’incubation pour retirer les œufs morts. Or le passage en conditions de terrain ainsi que le
grand nombre d’ovules à traiter risque de faire baisser le taux de survie des ovules.
En ce qui concerne la transmission verticale des maladies, l’agent pathogène est
généralement présent à l’intérieur des gamètes (Dorson, 1996 ; Kumagai and Nawata, 2010). De ce
fait, même si le milieu de conservation est stérile, les pathologies peuvent toujours se transmettre si
l’ovule n’est pas désinfecté. Il n’y a pas eu d’études de menées sur la transmission horizontale de
pathologies entre les gamètes lors de leur conservation. Cependant, il a par exemple été démontré
que si la bactérie Flavobacterium psychrophilum est inoculée en grande quantité dans le liquide
cœlomique sain in vivo, on la retrouve dans les ovules fraîchement pondus (Kumagai and Nawata,
2010). Il faudrait maintenant tester si l’on observe le même résultat lors d’une conservation ex vivo
dans le liquide cœlomique ou le milieu minéral.
25
Le maintien de la qualité des ovules lors de la conservation ex vivo est dépendant de la
qualité génétique et donc de la souche des génitrices (Babiak and Dabrowski, 2003). La durée de
conservation des ovules diffère également entre les femelles au sein d’une même souche. Il pourrait
être intéressant de mesurer l’héritabilité du caractère « maintien de la qualité des ovules lors du
stockage » afin de déterminer s’il ne serait pas possible de l’améliorer par la sélection génétique.
Cependant, la sélection est plutôt orientée vers l’amélioration de caractères comme les rendements
de découpe ou la résistance vis-à-vis de pathogènes, qui sont de première importance pour les
pisciculteurs.
.
26
Conclusion
Cette étude a permis de mettre en évidence la supériorité du liquide cœlomique filtré sur le
milieu minéral Cortland modifié tamponné à l’Hepes pour une utilisation en tant que milieu de
conservation des ovules. Nous avons également mis en évidence que les pontes peuvent être
conservées dans le liquide cœlomique filtré à 4 °C pendant 8 jours sans observer de baisse de la
qualité des ovules. Par contre elle diminue significativement dès 4 jours de stockage à 4 °C dans le
milieu minéral. Il a également été observé qu’après conservation, les mortalités affectant les ovules se
produisent principalement avant l’éclosion et qu’elles sont plus importantes lors d’un stockage dans le
milieu minéral. De plus, les mortalités apparaissant avant le stade œillé augmentent avec la durée de
conservation.
Pour le passage en conditions de terrain, la conservation des ovules en bicouche peut être
effectuée sans modifier l’atmosphère. Un réfrigérateur dont la température reste comprise entre 0,5 et
4 °C apparaît suffisant comme enceinte de refroidissement. Dans ces conditions, les pontes stockées
pendant 12 jours dans le liquide cœlomique filtré et 8 jours dans le milieu minéral Cortland tamponné
à l’Hepes conservent une qualité suffisante pour être utilisées dans le cadre de programmes de
sélection génétique.
Cependant, des expériences complémentaires restent encore à mener notamment pour
améliorer la qualité du milieu minéral et caractériser la transmission horizontale des maladies lors de
la conservation.
27
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30
Annexes :
31
Annexe I : Préparation du milieu minéral Cortland modifié
Selon la formule du milieu minéral Cortland présentée par Wolf et Quimby (1969), mais sans
bicarbonate de sodium ni phosphate de sodium car ils forment un précipité quand le pH dépasse 8
(Goetz and Coffman, 2000).
1
Composé
Molarité (mM)
Concentration (g/l)
124,1
7,252
KCl
5,1
0,380
MgSO4.7H2O
1,0
0,246
CaCl2.2H2O
1,6
0,235
Glucose
5,6
1,009
Hepes (tampon)
26,5
4,77
NaCl
Pour 1 litre :
Verser les composés du tableau ci-dessus à la concentration donnée dans un bécher d’un litre.
Ajouter 800 ml d’eau distillée et mélanger.
Ajuster le pH entre 8,4 et 8,5 par ajout de soude ou d’acide chlorhydrique.
Ajouter 10 ml d’une solution d’antibiotiques (pénicilline + streptomycine) à 100 x.
Compléter jusqu’à 1 litre avec de l’eau distillée.
Effectuer une mesure de la pression osmotique (elle doit être comprise entre 290 et 300 mosmol)
Filtrer à 0,22 µm, sous hotte
Obtention d’un litre de milieu minéral Cortland modifié tamponné à l’Hepes, stérile à conserver à 4 °C.
Wolf K., Quimby M.C. (1969). Fish cell and tissue culture. In : Fish Physiology, Vol. III. Hoar W.S., Randall D.J.
eds. Ed. Academic Press, New York, pp. 253Ŕ305
Goetz F.W., Coffman M.A. (2000). Storage of unfertilized eggs of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in artificial
media. Aquaculture, vol. 184, n° 3-4, pp. 267-276.
32
Annexe II : Taux de survie des pontes de bonne qualité initiale à
différents stades du développement
33
Annexe III : Taux de survie des pontes de mauvaise qualité initiale à
différents stades du développement
34
Département : Pôle Halieutique
Spécialisation : Halieutique
option : AQUA
Enseignant responsable : Pr. Hervé Le Bris
Auteur(s) : Guirec ANDRE
Organisme d'accueil : SYSAAF
Date de naissance : 12/08/1987
Adresse : SRA/INRA
37800 Nouzilly
Nb pages : 30
Annexe(s) : 3
Maître de stage : M. Pierrick Haffray
Année de soutenance : 2011
Titre français : Suivi comparatif de la qualité des ovules de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) conservés ex vivo à
basse température dans du liquide cœlomique ou du milieu minéral
Titre anglais : Comparative follow-up of the quality of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) unfertilized eggs stored ex
vivo at low temperature in cœlomic fluid or artificial medium
Résumé :
Afin de donner du temps au sélectionneur pour estimer les paramètres génétiques et optimiser ses plans de
croisements, la conservation des gamètes s’avère être un outil de première importance. Nous avons donc testé
l’évolution de la qualité des ovules de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) suite à leur conservation à 4 °C dans du
liquide cœlomique filtré ou du milieu minéral Cortland modifié tamponné à l’Hepes. Les résultats obtenus indiquent une
baisse de la qualité des ovules après 8 jours de conservation dans le liquide cœlomique. La qualité des ovules diminue
dès 4 jours de conservation dans le milieu minéral. Dans le cadre de la sélection génétique, la baisse de qualité relevée
après 12 jours de conservation dans le liquide cœlomique est acceptable. Par contre dans le milieu minéral, la durée de
conservation ne doit pas excéder 8 jours. Une seconde expérimentation de conservation dans le milieu minéral a été
effectuée, mais cette fois sur glace fondante (0-1 °C). Dans ces conditions, une forte baisse de qualité est observée dès
8 jours de conservation. L’observation détaillée des mortalités lors des stades du développement précoce nous a permis
de constater qu’elles survenaient principalement avant l’éclosion et même avant le stade œillé lors d’une conservation
de 12 jours à 4 °C. De plus, la conservation dans le milieu minéral induit des mortalités avant l’éclosion plus fortes que la
conservation dans le liquide cœlomique. Les conditions de conservation expérimentées dans ce rapport ne permettent
pas d’observer d’évolution claire de la fréquence d’apparition des malformations en fonction de la durée ou du milieu de
conservation.
Abstract :
In order to give time to the selector to estimate genetics parameters and optimize its crossing plans, the preservation of
gametes turns out to be a tool of first importance. Thus we tested the evolution of the quality of rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss) unfertilised eggs further to their storage at 4 °C in filtered cœlomic fluid or in the Cortland
modified mineral medium buffered with Hepes. The obtained results indicate a decline of the eggs quality after 8 days of
preservation in filtered cœlomic fluid. The eggs quality decreases from 4 days of preservation in the mineral medium.
Within the framework of the genetic selection, the decline of the quality raised after 12 days of preservation in filtered
cœlomic fluid is acceptable. On the other hand in the mineral medium, the storage duration does not have to exceed 8
days. A second experiment of preservation in the mineral medium was made, but this time on melting ice (0-1 °C). In
these conditions, a strong quality decline is observed from 8 days of storage. The detailed observation of the mortalities
during the early development stages allowed us to notice that they occurred mainly before the hatching and even before
the eyed stage during 12 days of storage at 4°C. Furthermore, the preservation in the mineral medium leads to stronger
mortalities before hatching than the preservation in filtered cœlomic fluid. The preservation conditions experimented in
this report do not allow to observe a clear evolution of the frequency of appearance of malformations according to
storage duration or medium.
Mots-clés : truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss, conservation d’ovules, conservation ex vivo, liquide cœlomique,
milieu minéral

Suivi comparatif de la qualité des ovules de truite

Transcription

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