Utilisation des bactériophages pour le contrôle de

Lynn El Haddad et Nour Ben Abdallah
o Staphylococcus aureus et ses phages dans le lait
o
Hypothèses de travail
o Objectif 1: Souches de S. aureus
o Objectif 2: Phages de S. aureus
o Objectif 3: Résistance des phages
o Objectif 4: Test du cocktail de phages
o Conclusions
2
Staphylococcus aureus
o Gram-positif
o Mésophile
o Anaérobie facultative
o Tolère 20% de NaCl
Source: Wikipedia
o Bactérie commensale
o Bactérie pathogène
o Dotée de pouvoirs invasifs et toxiques
3
o Intoxications alimentaires
o Transmission par mauvaise
manipulation
o Ingestion d’un aliment contenant
> 100 ng d’entérotoxines
staphylococciques
o Symptômes bénins jusqu’à
dangereux
o Lots de lait cru rejetés
4
o Solution envisagée pour contrôler la présence et
la concentration de S. aureus dans l’aliment
o Utilisation de phages comme additifs
alimentaires
Phages de ferments lactiques
Phages de S. aureus
Spécifiques aux souches de
ferments
Spécifiques aux
staphylocoques
Petit spectre lytique
Polyvalent
Responsable de rejets de lots
de lait et de fromage
Peuvent réduire le nombre de
rejets (?)
5
o Utilisation de phages comme additifs
alimentaires:
o Ne changent pas les propriétés
organoleptiques des produits
o Reconnus comme sécuritaires
pour le contrôle de Listeria
monocytogenes (FDA, 2007)
http://www.listex-p100.com/
o AgriPhage-CMM anti-Clavibacter
michiganensis (Santé Canada, 2012)
6
o Conditions d’utilisation des phages comme
additifs alimentaires:
o Phage lytique
o Absence de facteurs de virulence
o Spectre lytique large
o Efficacité dans la matrice
alimentaire
o Cocktail de phages
7
Trois familles de Caudovirales, ADN db
Myoviridae
Pyophage, Team1,
Team2, phi812, K
Siphoviridae
3 morphotypes
3A, MSA, LH1, LH1MUT
Podoviridae
2 morphotypes
P68, 44AHJD
8
Les phages présents dans les laits du Québec sont
plus adaptés à la réduction de S. aureus dans les
fromages d’ici
L’activité des phages staphylocoques a lieu durant
la fabrication et la maturation fromagère
9
1. Sélection et identification de souches de S.
aureus isolées du milieu laitier
2. Collection, isolement et caractérisation des
phages de S. aureus
3. Test de la résistance des phages à deux
étapes de la fabrication de fromage Cheddar
4. Test de l’efficacité de cocktail contre
S. aureus durant une fabrication de fromage
Cheddar
10
11
o Quarante souches de S. aureus isolées de la
mammite envoyées par le RCRMB
o Toutes les provinces canadiennes
o Différents types d’échantillons
o Score de mammite entre 0 et 3
o Une souche de S. aureus isolée de fromage au
lait cru québécois.
12
13
14
Trois familles de Caudovirales, ADN db
Myoviridae
Pyophage, Team1,
Team2, phi812, K
Siphoviridae
3 morphotypes
3A, MSA, LH1, LH1MUT
Podoviridae
2 morphotypes
P68, 44AHJD
15
Échantillons de lait cru:
o Centrifugation
5 ml d’échantillon de lait
5 ml de TSB 2X contenant
une culture bactérienne de
S. aureus
37 ºC
16
Phage LH1
o Siphoviridae de groupe B2
o Phage infectieux
o Souche hôte: S. aureus 01
o Solution turbide après amplification
17
Mutant naturel de LH1, LH1-MUT
Lysat clair
El Haddad, L., and S. Moineau. 2013. Appl. Environ. Microbiol. 79(8):2828-2832
18
19
20
Traitement
thermique
73 ºC pour 20 sec
Affinage
1 mois à 4 ºC
21
o Température/durée du traitement thermique:
o 73 ºC pendant 20 secondes
o Milieu:
o Lait pasteurisé ultrafiltré à 2% de M.G.
o Phages:
Myoviridae
Podoviridae
Siphoviridae
Cocktails
Team1
P68
LH1-MUT
phi812/K/LH1-MUT
phi812
44AHJD
phi2
phi812/P68/LH1-MUT
K
3A
MSA
22
Réduction de la concentration phagique (unités de log)
après 73ºC pour 20 secondes
Siphoviridae
Myoviridae
Podoviridae
Cocktails
LH1-MUT
phi2
MSA
3A
1,4 ±0,5
0,6 ±0,1
2,9 ±0,4
4,2 ±0,2
Team1
phi812
K
4,0 ±1,0
2,6 ±0,5
3,5 ±0,2
P68
44AHJD
2,7 ±0,1
3,6 ±0,7
phi812/K/LH1-MUT phi812/P68/LH1-MUT
2,2 ±0,7
2,8 ±0,3
23
Réduction de la concentration phagique (unités de log)
après 73ºC pour 20 secondes
Siphoviridae
Myoviridae
Podoviridae
Cocktails
LH1-MUT
phi2
MSA
3A
1,4 ±0,5
0,6 ±0,1
2,9 ±0,4
4,2 ±0,2
Team1
phi812
K
4,0 ±1,0
2,6 ±0,5
3,5 ±0,2
P68
44AHJD
2,7 ±0,1
3,6 ±0,7
phi812/K/LH1-MUT phi812/P68/LH1-MUT
2,2 ±0,7
2,8 ±0,3
24
Traitement
thermique
73 ºC pour 20 sec
o Résistance des phages
LH1-MUT et phi2, isolés
du lait cru
Affinage
1 mois à 4 ºC
25
o Conditions du caillé modèle :
o 1,77% de sel
o 39% d’humidité
o Cheddar lyophilisé
o Réduction du pH à 5,5 avec de l’eau acidifiée
(Adapté de Lessard et al. 2012. Appl. Environ. Microbiol.)
o Phage à une concentration de 107 ufp/ml
Myoviridae
Podoviridae
Siphoviridae
Cocktails de phages
Team1
K
P68
44AHJD
LH1-MUT
3A
phi2
T1/P68/LH1-MUT
K/44AHJD/phi2
o Temps d’échantillonnage: 0, 4, 7, 14 et 28 jours
26
10 grammes

+
Caillé modèle

Eau
peptonée
Eau
acidifiée

95% de vide

90 ml de
citrate de
sodium à
45ºC
4ºC



TSA
27
Résistance des phages dans du caillé modèle, pH 5,5 à 4ºC
9
Log10 concentration phagique (ufp/ml)
8
7
6
0 JOUR
5
4 JOURS
7 JOURS
4
14 JOURS
28 JOURS
3
2
1
0
LH1-MUT
3A
P68
44AHJD
K
TEAM1
PHI2
COCKT1
(T1-P68-MUT)
COCKT2
(K-44AHJD-2)
28
Traitement
thermique
73 ºC pour 20 sec
Affinage
1 mois à 4 ºC
o Résistance des phages
LH1-MUT et phi2, isolés
du lait cru
o Résistance de tous les
phages
29
o En présence de S. aureus :
o Production d’entérotoxines staphylococciques
en présence/absence de phages
o Efficacité de cocktails de phages
staphylococciques durant la fabrication et la
maturation de fromage Cheddar
30
Phages de ferments lactiques
Phages de S. aureus
Spécifiques aux souches de
ferments
Spécifiques aux
staphylocoques
Petit spectre lytique
Polyvalents
Responsable de rejets de lots
de lait et de fromage
Peuvent réduire le nombre de
rejets (?)
o Phages polyvalents
o Au-delà de l’espèce
o Ferment alimentaire GRAS, S. xylosus
o Reproduction du phage sur une souche non
pathogène
31
o Phage Team1 amplifié avec S. aureus/ S. xylosus:
o Pas de différences sur 140Kb séquencés et
analysés
32
o Isolement d’agents de biocontrôle plus stables et
résistants à l’étape de chauffage
o Utilisation de souches isolées du milieu laitier
o Stratégie de sélection de phages polyvalents
o Les phages amplifiés sur S. aureus et S. xylosus sont
génétiquement identiques
33
o Hypothèse
o Objectifs
o Sélection
o Paramètres
o Types de lait
o Inoculation initiale
o Agitation
o Moment d’ajout du phage
o Fromage Cheddar
o Conclusion
o Perspectives
L’activité des phages anti-staphylocoques
dépend de différents paramètres liés au type
de lait et au processus de la fabrication
fromagère
1. Sélection d’un phage stable dans le lait
cru à partir d’une collection de phages
2. Détermination des paramètres favorisant
l’action lytique du phage dans le lait
3. Suivie de l’action phagique durant une
mini-fabrication fromagère de type
Cheddar
Lait moyennement
contaminé
Staphylocoques totaux
= 102 UFC/mL
350
300
%
250
K
200
Team 2
150
Φ812
100
Pyophage
Lait plus contaminé
Staphylocoques totaux =
104 UFC/mL
Team 1
50
0
0
5
10
15
20
25
temps (h)
Suivi des titres phagiques dans un lait cru
%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
Team 2
Φ812
Pyophage
Team 1
0
1
2
3
4
5
temps (h)
Suivi des titres phagiques dans le temps
Étapes du test de Pearce
(Pearce L.E., 1969. J. Dairy Technol.)
o Staphylocoque à coagulase négative (SCN)
o Ferment pour la fabrication des saucissons
o Microflore de surface pour les viandes séchées et
les fromages (Munster)
Suivi du titre phagique du Phage K dans différents
types de lait
Croissance de S. xylosus dans du TSB avec des contaminations
initiales différentes en présence du phage K
•
•
•
•
CI3 = 103 UFC/mL
CI5 = 105 UFC/mL
CI6 = 106 UFC/mL
Phage K à une MOI = 100
Croissance de S. xylosus dans du TSB en présence du
phage K
• Contamination initiale = 105 UFC/mL
• Phage K à une MOI = 100
Croissance de S. xylosus dans du TSB en présence du
phage K
• Contamination initiale =106 UFC/mL
• Phage K à une MOI = 10
o Lait pasteurisé
o Contamination initiale = 105, 106 UFC/mL
o L’ajout du phage : au début de la fabrication
o Garder une légère agitation en continue
S. xylosus
Phage K
Lait
Caillé
Lactosérum
Bilan de S. xylosus et du phage K en % durant la fabrication
de Cheddar
o L’activité lytique des phages anti-staphylocoques est
optimale dans le lait pasteurisé
o L’activité dépend de la contamination initiale en
staphylocoques (contamination minimale de
105 UFC/mL)
o Une faible agitation en continue est nécessaire pour
favoriser le contact entre le phage et sa cellule hôte
o Durant la fabrication, les phages semblent être retenus
dans le caillé
o Dans une matrice solide leur action semble être inhibé
o Utilisation d’un cocktail de phages
o Production de fromages Cheddar à partir de lait
contaminé avec une souche de S. aureus en présence
d’un cocktail de phages
o Efficacité des phages dans d’autres types de
production fromagère
o Diminution des risques de contamination
alimentaires par S. aureus
o Amélioration de l’innocuité des aliments
50
Laboratoire du Prof. Sylvain Moineau
Laboratoire du Dr Daniel St-Gelais
o Prof. Steve Labrie
o Dr Claude Champagne
o Organismes subventionnaires:
AAC, MAPAQ, Novalait et
FRQNT