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Étude des mécanismes de régulation à distance du gène
CFTR
Stephanie Moisan
To cite this version:
Stephanie Moisan. Étude des mécanismes de régulation à distance du gène CFTR. Médecine
humaine et pathologie. Université de Bretagne occidentale - Brest, 2014. Français. <NNT :
2014BRES0018>. <tel-01364781>
HAL Id: tel-01364781
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Submitted on 12 Sep 2016
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THÈSE / UNIVERSITÉ DE BRETAGNE OCCIDENTALE
sous le sceau de l’Université européenne de Bretagne
pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE BRETAGNE OCCIDENTALE
Mention : Biologie Santé
École Doctorale "Santé, Information, Communication,
Mathématiques, Matière" (ED SICMA 373)
Etude des mécanismes de
régulation à distance
du gène CFTR
présentée par
Stéphanie MOISAN
Préparée à l’Institut national de la santé et de
la recherche médicale, UMR 1078, Génétique,
Génomique Fonctionnelle et Biotechnologies
Thèse soutenue le 17 Novembre 2014
devant le jury composé de :
Mr Laurent CORCOS
Docteur, Université de Bretagne Occidentale / Président
(Inserm UMR 1078)
Mme Ann HARRIS
Professeur, Université de Northwestern (Chicago) / Rapporteur
(Human Molecular Genetics Program, Lurie Children's Research Center)
Mr Thierry FORNÉ
Docteur, Universités de Montpellier 1 et 2 / Rapporteur
(CNRS UMR 5535)
Mme Magali TAULAN-CADARS
Docteur, Université de Montpellier 1 / Examinateur
(Inserm UMR 827)
Mr Claude FÉREC
Professeur, Université de Bretagne Occidentale / Directeur de thèse
(Inserm UMR 1078)
Je tiens tout d’abord à exprimer toute ma gratitude à mon directeur de thèse, le
Professeur Claude Férec, pour m’avoir accompagné dans ce travail. Je vous remercie
très sincèrement pour l’opportunité que vous m’avez offerte de travailler sur ce sujet.
Merci pour votre disponibilité, votre écoute attentive et constructive, votre confiance et
surtout vos qualités humaines. J’ai eu beaucoup de plaisir à échanger avec vous, ce fut
toujours très enrichissant.
Je suis honorée et très reconnaissante de l’intérêt que le Professeur Ann Harris et
le Docteur Thierry Forné témoignent envers mon travail en ayant accepté d’être
rapporteurs de ce manuscrit.
Je souhaite également exprimer mes sincères remerciements au Docteur Magali
Taulan-Cadars qui a accepté d’examiner mon travail, ainsi qu’au Docteur Laurent Corcos
qui me fait l’honneur de présider le jury de ma thèse.
Je tiens aussi à remercier l’ensemble des membres de l’UMR 1078 pour leur
accueil chaleureux, leurs conseils et aides et les nombreuses discussions, scientifiques
ou non, que nous avons pu partager. Je remercie tout particulièrement :
Mes " copains " de bureau, pour tous les moments inoubliables que l’on a pu
partager. Il y a comme un " quick " dans le bureau depuis que vous êtes partis. Vous me
manquez.
Rozenn, ou RoRo pour les intimes (mais pourquoi en fait ?). Merci pour nos
innombrables et interminables discussions, pour ton soutien. Même à distance, tu arrivais
à me changer les idées quand j’en avais besoin dans ma rédaction avec tes petits mms.
J’aime la philosophie de vie que l’on partage " trouver du positif dans n’importe quelle
situation ". Je suis heureuse d’avoir rencontré une amie comme toi. Je vous souhaite, à
toi et Nono, beaucoup de bonheur avec ce joli double présent à venir.
Chandran, Mister Ka ou encore Clonus, merci pour tout. Tu es une personne avec le
cœur sur la main. Merci pour tes nombreux coups de main. J’ai beaucoup apprécié
d’échanger avec toi, que ce soit scientifiquement, cinématographiquement ou sur
beaucoup d’autres sujets. Tes petites reprises quand ma langue fourchait, si rares, me
manquent.
Estelle, même si ton passage dans notre bureau a été plus bref, ç’a été un réel bonheur
d’avoir eu l’opportunité de te rencontrer. Merci pour le partage de ton expérience, ta
bonne humeur et ton dynamisme. Je te souhaite le meilleur pour la suite et je compte bien
venir te faire un petit coucou vers Grenoble.
Nat, miss Benz, merci pour ta disponibilité et tous les conseils que tu as pu me
donner pour la réalisation de cette thèse. J’ai hâte d’avoir plus de temps pour reprendre
nos petites " sessions " sur l’aquariophilie et le jardinage. J’espère avoir encore d’autres
anecdotes à partager avec toi lors de nouvelles escapades. C’est promis, je ferai tout
pour ne pas te laisser bloquée à l’étranger…
Sophie P, merci pour ta gentillesse, ton efficacité et toute l’aide que tu as pu
m’apporter pour les diverses démarches administratives. J’ai pris bonne note de ta
proposition pour une petite sortie de footing. On s’organise ça bientôt.
Sans oublier non plus Sylvia, Caro, Sophie, Marie-Laure, Véronique, toutes les
personnes de la Pharmacie et celles qui sont parties pour de nouveaux horizons, MarieLise, Laura, Steph, Lucie, Caro D, Aurélie…
Merci à vous tous, votre partage, votre gentillesse et votre bonne humeur ont
rendu ces années de thèse des plus agréables.
Je remercie vivement Marie-Pierre, Paul et plus particulièrement Aurore pour le
temps et les nombreux échanges que nous avons pu avoir autour du NGS.
-1-
Je souhaiterai également remercier le Docteur Josée Dostie pour l’opportunité
qu’elle m’a offerte de séjourner dans son laboratoire pour apprendre la technique 5C. Je
remercie aussi toute son équipe qui m’a chaleureusement accueilli durant ces trois mois
passés à Montréal. Un merci plus particulier à Denis, pour son encadrement technique, sa
bonne humeur et tout ce qu’il a pu m’apprendre sur le Québec. Et bien entendu, un grand
merci à Soizic, pour toute l’aide que tu m’as apportée. Tu es quelqu’un de passionné, tous
nos échanges ont été très enrichissants pour moi. Merci pour ta disponibilité et tout ce
que tu as fait pour le projet 5C / CFTR.
J’adresse mes sincères remerciements à l’Association Vaincre la Mucoviscidose,
pour avoir soutenu ce projet. J’associe ces remerciements à l’Association Gaétan Saleün
qui a géré ses financements. Merci à Monsieur René Vigouroux, Président de cette
association, qui s’engage quotidiennement pour soutenir la recherche sur les maladies
génétiques. Merci pour votre gentillesse, votre dévouement et votre humanisme. Ces
actions ne seraient rien sans la présence de Marie-Aude, un grand merci pour ta
disponibilité et ta bonne humeur.
Plus personnellement, merci aux Goélopeurs, Sabine, Catherine, Véro, Anne, Seb,
Denis, Wil, Benj, pour n’en citer que quelques uns. Tous nos entraînements et sorties ont
été de véritables bouffées d’oxygène. Et puis, l’aventure que nous avons partagée, avec
d’une part la préparation du BIET (qui est très bien tombée pendant ma rédaction) puis le
grand week end, a été magnifique. Merci pour tous ces moments inoubliables. J’ai hâte
de partager les prochains…
Enfin, je tiens à remercier toute ma famille pour leur soutien inconditionnel. Merci
de vous êtes toujours intéressés à ce que je faisais même si cela restait parfois un peu
flou pour vous.
Un merci plus particulier, à toi papa, pour ta présence rassurante, la confiance que tu
m’as toujours donnée et la force de vie que tu m’as transmise.
A vous mes frères, Jo, Nico et Benji, merci d’avoir toujours été là, de m’avoir toujours
encouragé. Notre complicité m’apporte beaucoup, je ne serai pas celle que je suis sans
vous.
Et toi maman, je ne te remercierai jamais assez. Beaucoup de monde nous dit que je te
ressemble, autant sur le caractère que physiquement (étrangement sur ce point nous
sommes les seules à ne pas voir notre ressemblance). Et bien, sache qu’il n’y a pas de
plus beau compliment que l’on puisse me faire. Pour moi, tu es un exemple. Merci pour
tout ce que tu as toujours fait pour moi, merci d’avoir toujours cru en moi, merci d’être
toujours aussi présente pour moi. Et plus particulièrement, un grand merci pour les
nombreuses heures que tu as passées à relire ce manuscrit.
J’ai bien sûr une pensée spéciale pour deux personnes parties trop tôt qui ont tenu une
place importante dans ma vie. J’aurai aimé partager ce moment avec chacun de vous.
J’ose espérer que vous êtes fiers de moi.
Je terminerai en te remerciant toi, Pat. Merci pour tout ce que tu m’apportes.
Partager ta vie est un vrai bonheur au quotidien. Merci d’avoir supporté mes nombreuses
absences ces derniers temps. Merci de m’avoir encore plus cajolée en me préparant
comme toujours de bons petits plats et en t’occupant de tous les à côtés. Merci pour ta
tendresse et ton amour. J’ai conscience de la chance que j’ai d’être ton heureuse élue.
-2-
Résumé
Etude des mécanismes de régulation à distance du gène CFTR
Le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) a été
identifié en 1989. Vingt cinq ans après, les mécanismes contrôlant sa fine expression,
sont encore mal compris. Bien qu’environ 1980 mutations aient été découvertes, il reste
des patients pour qui le génotype n’a pas été établi. Les éléments de régulation, décrits
au sein du promoteur, ne peuvent à eux seuls expliquer cette complexe régulation tissu
spécifique. Des éléments de régulation à distance, en cis ou en trans, sont certainement
impliqués dans ce contrôle d’expression.
L’objectif de ce projet est de mieux décrypter les mécanismes de régulation à
distance du gène CFTR en identifiant des séquences régulatrices éloignées, mais
pouvant, par des mécanismes de repliement, interagir spécifiquement avec celui-ci.
Afin d’étudier ces contacts chromosomiques, nous avons, dans un premier temps,
mis au point la technique de Capture de Conformation Chromosomique (3C). Suite à cette
technique, nous sommes passés à une approche à plus grande échelle, la technique de
Copie Conforme de 3C (5C), qui permet de mesurer des milliers d’interactions
chromatiniennes en une analyse.
L’organisation spatiale d’une région d’environ 790 kb recouvrant le gène CFTR, a
été analysée dans des cultures primaires de cellules épithéliales nasales, exprimant le
gène CFTR et des fibroblastes de peau, ne l’exprimant pas ou très peu. Les interactions
entre les régions de ce locus et le promoteur CFTR ont été étudiées par séquençage
nouvelle génération sur Ion PGM™. Nous avons comparé ces conformations
chromatiniennes afin d’identifier des éléments de régulation spécifiques d’une expression
de CFTR.
Notre approche a été validée par l’identification de régions régulatrices
précédemment décrites. De plus, nous avons mis en évidence de nouveaux contacts
chromatiniens avec le promoteur CFTR. Ces régions semblent fortement impliquées dans
la régulation de l’expression du gène CFTR.
Grâce à la technique 3C et ses variantes, l’identification de nouvelles mutations à
distance du gène pourraient expliquer des dérégulations de son expression.
Mots clés : CFTR, régulation transcriptionnelle, chromatine, techniques 3C / 5C
-3-
Abstract
Analysis of long-range regulatory mechanisms of the CFTR gene
The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene was
identified in 1989. Twenty five years later, the regulatory mechanisms controlling its
complex expression are still not fully understood. Although, almost 1980 mutations have
been identified, many cases of cystic fibrosis or CFTR Related Disorders remain still of
unknown origin. The promoter which binds transcription factors and drives some aspects
of CFTR gene expression, cannot alone account for tissue specific control. This implicates
other distal cis- or trans-acting elements in cell-type-specific regulation of CFTR
expression.
The aim of our project is to study long-range regulatory elements of the CFTR
gene, which could interact specifically with the CFTR promoter by tri-dimensional folding
mechanism.
We first developed the Chromosome Conformation Captures (3C) approach to
map these chromosomal contacts.
Subsequently, we enhanced our analyses with a high-throughput adaptation of 3C: the
3C-Carbon Copy (5C) technology. This approach allows the analysis of millions chromatin
interactions.
Thus, we have analyzed the spatial organization of a 㹼790kb region, comprising
the CFTR gene, in primary nasal epithelial cells, which express the gene, and primary skin
fibroblasts, which do not express the gene. Interactions between this locus and the CFTR
promoter have been analysed by next generation sequencing with the Ion PGM™. We
have compared chromatin conformation in order to identify uncharacterized regulatory
elements that act especially in CFTR-expressing cells.
Our approach has been validated by the identification of previously characterized
regulatory elements. Moreover, we identify novel chromatin contacts of the CFTR
promoter with chromosomal regions, which could potentially be involved in CFTR gene
expression regulation.
Thanks to 3C and 3C-derivated analyses, we could identify new possible
mutations far from the gene, which may lead to its dysfunction by modifying the chromatin
conformation or regulatory elements.
Keywords : CFTR, transcriptional regulation, chromatin, 3C / 5C methods
-4-
Table des Matières
TABLEDESMATIERES
Index des Abréviations et Sigles ............................................................. 11
Liste des Figures ....................................................................................... 15
Liste des Tableaux..................................................................................... 18
Partie 1. INTRODUCTION…………………………………………………...19
A. Organisation spatiale du génome ....................................................... 20
1 Structure de la Chromatine.............................................................................................20
1.1
Nucléosome ........................................................................................................21
1.2
Repliement du nucléofilament en fibre de 30nm .................................................22
1.3
Condensation de la Chromatine..........................................................................22
2 Modification et remodelage de la Chromatine ................................................................23
2.1
Modifications de la chromatine............................................................................23
2.1.1
Méthylation de l’ADN....................................................................................23
2.1.2
Modifications post-traductionnelles des histones.........................................24
2.1.2.1 Acétylation ................................................................................................24
2.1.2.2 Méthylation ...............................................................................................25
2.1.2.3 Phosphorylation........................................................................................25
2.1.2.4 Mono-Ubiquitination..................................................................................26
2.1.2.5 Autres modifications .................................................................................26
2.1.2.6 Code des histones....................................................................................27
2.1.3
Les variants d’histones.................................................................................27
2.1.4
Les chaperons d’histones ............................................................................30
2.2
Remodelage ATP-dépendant de la chromatine ..................................................30
2.2.1
Grandes familles des complexes de remodelage ........................................31
2.2.1.1 Famille SWI/SNF ......................................................................................31
2.2.1.2 Famille ISWI .............................................................................................31
2.2.1.3 Famille CHD .............................................................................................32
2.2.1.4 Famille INO80...........................................................................................32
2.2.2
Mode d’action des complexes de remodelage.............................................33
3 Organisation de la chromatine........................................................................................33
3.1
Euchromatine ......................................................................................................34
3.2
Hétérochromatine................................................................................................34
3.3
Territoires chromosomiques................................................................................34
3.4
Relations entre Territoires Chromosomiques......................................................35
3.4.1
Modèle ICD ..................................................................................................35
3.4.2
Modèle ICN ..................................................................................................36
3.5
Domaines chromatiniens.....................................................................................36
3.5.1
Domaines fonctionnels.................................................................................36
3.5.2
Domaines structuraux ..................................................................................37
3.5.3
Interactions chromosomiques ......................................................................37
-5-
Table des Matières
4 Techniques d’étude de la conformation de la chromatine ..............................................38
4.1
La Technique 3C .................................................................................................38
4.2
La Technique 4C .................................................................................................39
4.3
La Technique 5C .................................................................................................40
4.4
Hi-C .....................................................................................................................41
B. Régulation transcriptionnelle des gènes............................................ 42
1 Les facteurs de transcription...........................................................................................42
2 Régulation proximale ......................................................................................................43
2.1
Mise en place de la machinerie transcriptionnelle...............................................43
2.2
Complexe Médiateur ...........................................................................................45
2.3
Eléments du promoteur minimal..........................................................................45
2.4
Types de promoteur ............................................................................................46
3 Régulation Distale...........................................................................................................47
3.1
Cis- et Trans-régulateurs.....................................................................................47
3.2
Régions insulatrices ............................................................................................49
4 Autres types de régulation ..............................................................................................51
4.1
Longs ARN non codants .....................................................................................51
4.2
ARN Pol II en pause (" paused Polymerase ") ....................................................52
4.3
Les " shadow " enhancers...................................................................................53
4.4
Les super-enhancers...........................................................................................54
4.5
Régulation chromatinienne..................................................................................54
5 Dérégulations et maladies génétiques humaines ...........................................................55
6 Projet ENCODE ..............................................................................................................56
C. La Mucoviscidose ................................................................................. 57
1 Généralités .....................................................................................................................57
1.1
Historique des premières dates clés ...................................................................57
1.2
Données épidémiologiques .................................................................................59
2 Du gène à la protéine CFTR...........................................................................................60
2.1
Le gène CFTR.....................................................................................................60
2.2
La protéine CFTR................................................................................................60
2.3
Les anomalies moléculaires du gène CFTR .......................................................62
2.3.1
Les types de mutations ................................................................................62
2.3.2
Les différentes classes de mutations ...........................................................63
2.3.3
La répartition des mutations.........................................................................65
3 Manifestations cliniques et prises en charge ..................................................................66
3.1
Les atteintes et traitements symptomatiques associés.......................................67
3.1.1
Atteintes des voies respiratoires ..................................................................67
3.1.2
Atteintes digestives ......................................................................................68
3.1.3
Atteintes génitales........................................................................................69
3.1.4
Atteintes associées ......................................................................................70
-6-
Table des Matières
3.2
La recherche thérapeutique ................................................................................ 71
3.2.1
La thérapie génique ..................................................................................... 71
3.2.2
Les traitements correcteurs.......................................................................... 72
3.2.2.1 Voies alternatives de transport ionique .................................................... 72
3.2.2.2 Thérapie protéique ................................................................................... 73
4 Dépistage et Diagnostic..................................................................................................75
4.1
Période prénatale ................................................................................................75
4.2
Période postnatale ..............................................................................................76
4.2.1
Dépistage néonatal ......................................................................................76
4.2.2
Outils diagnostiques de la mucoviscidose ...................................................77
4.2.2.1 Test de la sueur........................................................................................77
4.2.2.2 Analyse moléculaire du gène CFTR.........................................................78
4.2.2.3 Différence de potentiel trans-épithélial nasal............................................78
5 Les formes frontières ......................................................................................................79
5.1
Les cas d’infertilité masculine..............................................................................79
5.2
Les pancréatiques chroniques idiopathiques ......................................................80
5.3
Les bronchectasies .............................................................................................80
6 Relation génotype-phénotype.........................................................................................81
D. Régulation transcriptionnelle du gène CFTR..................................... 84
1 Expression du gène CFTR .............................................................................................84
1.1
Expression spatiale .............................................................................................84
1.2
Expression temporelle.........................................................................................85
2 Promoteur CFTR ............................................................................................................86
2.1
Structure du promoteur CFTR.............................................................................86
2.2
Sites d’initiation de la transcription ......................................................................86
2.3
Eléments de régulation de la région promotrice..................................................87
3 Organisation chromatinienne du locus CFTR.................................................................89
3.1
Accessibilité de la chromatine et régulations ......................................................89
3.1.1
En amont du gène, dans la région 5’ ...........................................................90
3.1.2
Au sein du gène, dans les régions introniques ............................................93
3.1.3
En aval du gène, dans la région 3’...............................................................95
3.2
Localisation nucléaire du locus CFTR.................................................................96
OBJECTIFS ET STRATEGIES DU PROJET DE THESE ................... 97
-7-
Table des Matières
Partie 2. MATERIELS ET METHODES ................................................. 99
A. Culture cellulaire ................................................................................. 100
1 Lignées cellulaires ........................................................................................................100
1.1
Caco-2...............................................................................................................100
1.2
Lignées lymphoblastoïdes.................................................................................100
2 Cellules primaires humaines.........................................................................................101
2.1
Fibroblastes de peau.........................................................................................101
2.2
Cellules épithéliales nasales .............................................................................101
B.Techniques d’étude de la conformation chromatinienne ................ 102
1 Analyses 3C..................................................................................................................102
1.1
Confection des librairies 3C ..............................................................................102
1.1.1
Librairies 3C ...............................................................................................102
1.1.2
Librairies contrôles .....................................................................................103
1.2
Contrôles qualité des librairies 3C.....................................................................104
1.2.1
Profils de migration des librairies et témoins de digestion .........................104
1.2.2
Test de l’efficacité de digestion ..................................................................104
1.2.3
Titration ......................................................................................................104
1.3
Quantification des librairies 3C..........................................................................106
1.3.1
PCR quantitative ........................................................................................106
1.3.2
Quantification sur gel .................................................................................107
1.4
Analyse des librairies 3C...................................................................................107
1.4.1
Analyses par QFM-PCR.............................................................................107
1.4.2
Analyses par PCR quantitative ..................................................................109
2 Analyses 5C..................................................................................................................110
2.1
Design d’amorces et régions d’étude ................................................................110
2.2
Conversion des librairies 3C en 5C...................................................................111
2.3
Séquençage des librairies 5C ...........................................................................113
2.4
Analyses des datas 5C......................................................................................115
C. Bases de données et outils bioinformatiques ................................. 116
-8-
Table des Matières
Partie 3. RESULTATS ET DISCUSSION ............................................ 117
A. Mises au point de la technique 3C .................................................... 119
1 Contexte de l’étude.......................................................................................................119
2 Résultats.......................................................................................................................119
2.1
Analyses par QFM-PCR....................................................................................119
2.2
Analyses par PCRq ...........................................................................................122
3 Discussion ....................................................................................................................124
B. Comparaison de profils d’interaction du locus CFTR entre des
patients CF et des témoins - Analyses 3C ............................................ 126
2 Résultats.......................................................................................................................126
2.1
Comparaison des profils avec des cellules Caco-2...........................................126
2.2
Comparaison des profils avec des cellules témoins..........................................128
3 Discussion ....................................................................................................................131
C. Recherche d’interactions entre des séquences non codantes
conservées (CNCs) et le promoteur CFTR Analyses 3C .................... 133
2 Résultats.......................................................................................................................134
2.1
Détection de CNCs à proximité du locus CFTR ................................................134
2.2
Analyses 3C entre les CNCs identifiées et le promoteur CFTR........................135
2.2.1
Résultats des CNCs situés sur le BAC 915H23.........................................135
2.2.2
Résultats des CNCs situés sur le BAC 1012L24 .......................................137
2.2.3
Résultats des CNCs situés sur le BAC 656G24 ........................................138
2.2.4
Résultats des CNCs situés sur le BAC 241B3...........................................139
2.2.5
Résultats des CNCs situés sur le BAC 145A22.........................................140
3 Discussion ....................................................................................................................142
-9-
Table des Matières
D. Détermination d’une conformation expression- dépendante du
locus CFTR - Analyses 5C ...................................................................... 144
2 Résultats.......................................................................................................................145
2.1
Etude d’un large locus CFTR avec la technique 5C..........................................145
2.2
Interactions longues distances et niveau d’expression CFTR...........................146
2.3
Interactions longues distances et promoteur CFTR de cellules HNEC.............149
2.4
Corrélations entre contacts physiques et éléments de régulation.....................150
3 Discussion ....................................................................................................................152
Partie 4. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .................... 156
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES..................................................... 161
ANNEXES ................................................................................................. 192
CV ET TRAVAUX...................................................................................... 207
- 10 -
Abréviations et Sigles
Index des Abréviations et Sigles
3C
Chromosome Conformation Capture
4C
Circular Chromosome Conformation Capture
5C
Chromosome Conformation Capture Carbon Copy
A
A
Adénine
A
Antisens
ABCD
Absence Bilatérale Congénitale des canaux Déférents
ACF
ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor
ADN
Acide DésoxyriboNucléique
AMPc
Adénosine MonoPhosphate cyclique
ARN
Acide Ribonucléique
ARNm
Acide Ribonucléique messager
ATB
Antibiotique
ATP
Adénosine TriPhosphate
B
BAC
Bacterial Artificial Chromosome
BRE
TFIIB Recognition Element
C
C
Cytosine
C/EBP
CCAAT/Enhancer Binding Protein
CBAVD
Congenital Bilateral Absence of Vas Deferens
CFTR
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
CFTR-RD
CFTR-Related Disorder
CHRAC
Chromatin accessibility complex
-
Cl
Ion chlorure
CNCs
Conserved Non Coding sequence
CTCF
CCCTC-binding Factor
CTD
Carboxy-Terminal Domain
- 11 -
D
D
Digéré
DBD
DNA Binding Domain
DHS
DNase Hypersensitive Site
dNTPs
deoxyNucleotide TriPhosphates
DPE
Downstream Promoter Element
E
ECR
Evolutionary Conserved Regions
EDTA
Ethylène Diamine Tétra Acétique
emPCR
PCR en émulsion
ENCODE
ENCycolpedia Of DNA Elements
ERCC3
Excision Repair Cross-Complementing 3
F
FISH
Fluorescence In Situ Hybridization
FOX
Forkhead box
FT
Facteur de Transcription
G
G
Guanine
GEO
Gene Expression Omnibus
GERP
Genomic Evolutionary Rate Profiling
HGVS
Human Genome Variation Society
H
HNEC
Human Nasal Epithelial Cells
I
Ion PGM™
Ion Torrent Personal Genome MachineTM
INO80
Inositol requiring
ISP
Ion Sphere Particles
ISWI
Imitation SWItch
K
K
Lysine
- 12 -
L
LB
Lysogeny Broth
lncRNA
long non-coding RNA
M
m
mètre
M
Molaire (mole par litre)
MDFIC
MyoD Family Inhibitor Domain Containing
N
Na
+
Ion sodium
NBD
Nucleotide Binding Domain
ND
Non digéré
nm
nanomètre
NEB
New England Biolabs
NP-40
Nonidet P-40
NTC
No Template Control
NURD
Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation
NURF
Nucleosome Remodeling factor
O
ORCC
Outwardly Rectifying Chloride Channel
P
pb
paire de bases
PBS
Phosphate-Buffered Saline
PC
Pancréatite Chronique
PCR
Polymerase Chain Reaction
PCRq
PCR quantitative
P/S
Pénicilline/Streptomycine
Q
QFM-PCR
Quantitative Fluorescent Multiplex-PCR
- 13 -
R
R
Arginine
RE
Réticulum endoplasmique
RFM
Registre Français de la Mucoviscidose
S
S
Sens
SAEC
Small Airway Epithelial Cells
SANT
SWI3, ADA2, N-CoR, TFIIIB
SDS
Sodium Dodécyl Sulfate
STD
Salmon Testis DNA
SVF
Sérum de veau fœtal
SSC
Saline-Sodium Citrate
SWI/SNF
SWItching/Sucrose Non Fermenting
T
T
Thymine
TAD
Topologicaly Associated Domains
TBP
TATA-box Binding Protein
TFEC
Transcription Factor EC
TMD
TransMembrane Domain
TSS
Transcription Start Site
U
UCSC
University of California Santa Cruz
UTR
UnTranslated Region
µm
micromètre
V
vol
volume
- 14 -
Liste des figures
Liste des figures
Figure 1 :
Représentation de la double hélice d’ADN (page 20)
Figure 2 :
Les différents niveaux de condensation de la chromatine (page 20)
Figure 3 :
Structure d’un nucléosome (page 21)
Figure 4 :
Constitution des histones cœur (page 21)
Figure 5 :
Assemblage de l’octamère d’histones (page 21)
Figure 6 :
Repliement du nucléofilament en fibre de 30nm (page 22)
Figure 7 :
Modèles d’enroulement des nucléosomes (page 22)
Figure 8 :
Méthylation de l’ADN (page 23)
Figure 9 :
Acétylation des queues des histones (page 24)
Figure 10 :
Les 4 grandes familles de complexes de remodelage de la chromatine (page 31)
Figure 11 :
Mécanismes d’action des complexes de remodelage de la chromatine (page 33)
Figure 12 :
Localisation nucléaire des formes de chromatine (page 34)
Figure 13 :
Organisation de la chromatine en territoires chromosomiques (page 35)
Figure 14 :
Modèles de disposition des territoires chromosomiques (page 35)
Figure 15 :
Segmentation de la chromatine en domaines topologiquement associés (page 37)
Figure 16 :
Interactions chromosomiques (page 37)
Figure 17 :
Techniques 3C, 4C et 5C (page 38)
Figure 18 :
Technique Hi-C (page 41)
Figure 19 :
Représentations schématiques des principaux motifs de liaison à l’ADN (page 43)
Figure 20 :
Structure de l’ARN Pol II (page 43)
Figure 21 :
Illustration de l’assemblage du complexe de pré-initiation de la transcription (PIC)
(page 44)
Figure 22 :
Schéma de la structure modulaire du complexe Médiateur humain (page 45)
Figure 23 :
Principaux éléments d’un promoteur eucaryote (page 45)
Figure 24 :
Types de promoteur (page 46)
Figure 25 :
Cis- et trans-régulations (page 47)
Figure 26 :
Modèles de mécanismes d’actions des régulateurs situés à distance d’un promoteur
(page 49)
Figure 27 :
Modes d’action des insulateurs (page 50)
Figure 28 :
Origine génomique des lncRNA (page 51)
Figure 29 :
Mode d’action des lncRNA (page 52)
Figure 30 :
Mécanisme de l’ARN Pol II en pause (page 53)
Figure 31 :
Modifications des histones et éléments fonctionnels (page 54)
Figure 32 :
Variations de séquences : Cis-Ruptions (page 55)
Figure 33 :
Carte de l’incidence de la mucoviscidose dans les différentes régions de France
(page 59)
- 15 -
Liste des figures
Figure 34 :
Evolution de la prise en charge des patients atteints de mucoviscidose (page 59)
Figure 35 :
Localisation du locus du gène CFTR (page 60)
Figure 36 :
Du gène CFTR à la protéine CFTR (page 60)
Figure 37 :
Structure de la protéine CFTR et schéma de sa biosynthèse et maturation (page 61)
Figure 38 :
Activation du canal CFTR (page 61)
Figure 39 :
Code Génétique (page 62)
Figure 40 :
Distribution des différents types de mutations CFTR (page 63)
Figure 41 :
Classes de mutations CFTR (page 64)
Figure 42 :
Prévalence de la mucoviscidose et mutations fréquentes dans le monde (page 65)
Figure 43 :
Des anomalies du gène CFTR aux différentes manifestations cliniques (page 66)
Figure 44 :
Troubles de la clairance mucociliaire au niveau de l’épithélium respiratoire
de patients atteints de mucoviscidose (page 67)
Figure 45 :
Evolution des infections bactériennes en fonction de l’âge des patients CF (page 67)
Figure 46 :
Organigramme du dépistage néonatal de la mucoviscidose (page 76)
Figure 47 :
Analyses moléculaires du gène CFTR (page 78)
Figure 48 :
Corrélation Génotype/Phénotype (page 81)
Figure 49 :
Contribution de différents facteurs sur la sévérité phénotypique (page 82)
Figure 50 :
Sites d’initiation de la transcription (page 86)
Figure 51 :
Eléments de régulation décrits au sein du promoteur CFTR (page 87)
Figure 52 :
Localisation de sites DHS dans la région 5’ du gène CFTR (page 91)
Figure 53 :
Localisation de sites DHS dans les régions introniques du gène CFTR (page 93)
Figure 54 :
Localisation de sites DHS dans la région 3’ du gène CFTR (page 95)
Figure 55 :
Profils du locus CFTR (page 95)
Figure 56 :
Prélèvement de cellules épithéliales nasales (page 101)
Figure 57 :
Profils de migration des librairies et témoins de digestion (page 104)
Figure 58 :
Courbe de titration d’une librairie 3C (page 105)
Figure 59 :
Localisation des amorces de QFM-PCR (page 107)
Figure 60 :
Principe de la QFM-PCR (page 108)
Figure 61 :
Amplification des librairies 5C (page 113)
Figure 62 :
Amplification clonale sur ISP des librairies 5C (page 113)
Figure 63 :
Enrichissement des ISP (page 114)
Figure 64 :
Principe du séquençage par le système Ion Torrent (page 114)
Figure 65 :
Obtention des données de séquençage (page 115)
Figure 66 :
Conversion du fichier FASTQ en un fichier lisible par l’outil " my5C-heatmap "
(page 115)
Figure 67 :
Représentation de l’amplicon de 106 pb " Promoteur CFTR " / " 3’INS " (page 120)
Figure 68 :
Gamme de température pour l’amplicon de 106 pb " Promoteur CFTR " / " 3’INS "
(page 120)
Figure 69 :
Gamme de cycles pour l’amplicon de 106 pb " Promoteur CFTR " / " 3’INS " (page
121)
- 16 -
Liste des figures
Figure 70 :
Analyses 3C de régions du locus CFTR par QFM-PCR (page 121)
Figure 71 :
Exemple d’un rapport d’amplification avec le logiciel LightCycler 480 II (page 123)
Figure 72 :
Analyses 3C de régions du locus CFTR par PCRq (page 124)
Figure 73 :
Comparaison de nos résultats par rapport à ceux publiés par [Ott et al., 2009a]
(page 125)
Figure 74 :
Analyses 3C du locus CFTR du patient P1 en comparaison à des Caco-2 (page
127)
Figure 75 :
Analyses 3C du locus CFTR du patient P2 en comparaison à des Caco-2 (page
128)
Figure 76 :
Analyses 3C du locus CFTR du patient P1 en comparaison d’un témoin (page 129)
Figure 77 :
Figure 78 :
Figure 79 :
Analyses 3C du locus CFTR du patient P4 en comparaison de témoins (page 131)
Figure 80 :
Analyse de CNCs sur une vaste région comprenant le gène CFTR (page 134)
Figure 81 :
CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-915H23 de la région TFEC / TES (page
136)
Figure 82 :
Exemple d’un rapport d’amplification montrant l’absence d’interaction entre la
région promotrice du gène CFTR et une CNCs (page 136)
Figure 83 :
CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-1012L24 de la région MDFIC / TFEC
(page 137)
Figure 84 :
Courbes d’analyse de la température de fusion de l’amplification avec la CNCs B
(page 138)
Figure 85 :
CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-656G24 de la région MDFIC / TFEC
(page 138)
Figure 86 :
Courbes d’analyse de la température de fusion de l’amplification avec la CNCs N
(page 139)
Figure 87 :
CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-241B3 de la région MDFIC / TFEC
(page 140)
Figure 88 :
CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-145A22 de la région MDFIC / TFEC
(page 140)
Figure 89 :
Courbes d’analyse de la température de fusion de l’amplification avec la CNCs V
(page 141)
Figure 90 :
Test d’efficacité de digestion de la librairie contrôle constituée d’un mélange
équimolaire du BAC 652K3 et du BAC 145A22 (page 142)
Figure 91 :
Représentation du locus CFTR d’étude recouvert par les amorces 5C (page 145)
Figure 92 :
Profils des fréquences d’interaction des cellules HNEC et des fibroblastes de peau
(page 147)
Figure 93 :
Répartition des reads d’analyses 5C des cellules HNEC et fibroblastes de peau
(page 148)
Figure 94 :
Analyses 5C des cellules HNEC et des fibroblastes de peau (page 149)
Figure 95 :
Localisation de potentiels éléments de régulation du gène CFTR des cellules HNEC
(page 151)
- 17 -
Liste des tableaux
Liste des tableaux
Tableau I :
Fréquence des différents types de mutations retrouvés sur le gène CFTR (page 63)
Tableau II :
Distribution des génotypes les plus fréquents en France (page 65)
Tableau III :
Composition de la réaction d’amplification de titration des librairies 3C (page 105)
Tableau IV :
Conditions d’amplification de la réaction de titration des librairies 3C (page 105)
Tableau V :
Composition de la réaction d’amplification de quantification des librairies 3C
(page 106)
Tableau VI :
Conditions d’amplification de la réaction de quantification des librairies 3C (page
107)
Tableau VII :
Liste des oligonucléotides utilisés pour les analyses 3C de QFM-PCR (page 108)
Tableau VIII :
Composition de la réaction d’amplification des librairies 3C en QFM-PCR (page 108)
Tableau IX :
Conditions d’amplification des librairies 3C par QFM-PCR (page 108)
Tableau X :
Composition de la réaction d’amplification des librairies 3C en PCRq (page 109)
Tableau XI :
Conditions d’amplification des librairies 3C par PCRq (page 110)
Tableau XII :
Composition de la réaction d’hybridation des amorces 5C à une librairie 3C
(page 111)
Tableau XIII :
Composition de la réaction de ligation des amorces 5C hybridées (page 112)
Tableau XIV :
Composition de la réaction d’amplification des produits 5C (page 112)
Tableau XV :
Conditions d’amplification des produits 5C (page 112)
Tableau XVI :
Composition de la réaction d’amplification clonale par emPCR des produits 5C
(page 114)
Tableau XVII :
Différences de positionnement des amorces 3C dans le locus CFTR (page 122)
Tableau XVIII :
Réactifs utilisés pour le marquage des sondes (page 195)
- 18 -
INTRODUCTION
- 19 -
Figure 1 : Représentation de la double hélice d’ADN
La molécule d’ADN est constituée de deux brins qui s’enroulent et sont formés d’un enchaînement de
nucléotides composés d’une base azotée, d’un sucre (le désoxyribose) et d’un groupement phosphate. Il
existe quatre bases azotées (Adénine=A, Thymine=T, Cytosine=C et Guanine=G), C s’appariant à G via 3
liaisons hydrogènes et T à A avec seulement deux liaisons.
D’après http://police-scientifique2012.webnode.fr/
Figure 2 : Les différents niveaux de condensation de la chromatine
Enroulement de la fibre de chromatine pour passer de son état le plus relâché : double hélice d’ADN de
2nm, à son état le plus condensé : chromosome métaphasique de 700nm.
Adaptée du manuscrit "Biologie moléculaire" de Joëlle Brodeur et Martin Toussaint, 2006
Introduction
A. Organisation spatiale du génome
Le génome, désignation dérivée des mots " gène " et " chromosome ", correspond à
l'ensemble de l'information génétique présente dans chacune des cellules de notre
organisme. Le génome humain est constitué d’environ 25 000 gènes. Le gène peut être
décrit comme une unité d’information génétique. En 1944, les scientifiques Avery,
MacLeod et McCarthy ont montré que l’information génétique est portée par l’ADN (Acide
DésoxyriboNucléique) [Avery et al., 1944]. Quelques années plus tard, en 1953, la
structure de cette molécule fut décrite par Watson et Crick [Watson and Crick, 1953]. Ils
ont démontré que cette molécule est constituée de deux brins qui s’enroulent pour former
une double hélice. Les brins correspondent à un enchaînement de nucléotides composés
d’une base azotée, d’un sucre (le désoxyribose) et d’un groupement phosphate. On
dénombre quatre bases azotées (Adénine=A, Thymine=T, cytosine=C et guanine=G), C
s’appariant à G, et T à A (Figure 1). Cette séquence d’ADN permet la fabrication d’un
produit fonctionnel : une protéine.
Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est organisé au sein d’un complexe nucléoprotéique : la chromatine. La chromatine, définie par Flemming dans les années 1880, a
un rôle de compaction de l’ADN. Ainsi, un noyau de cellule, d’environ 5 micromètres (µm)
de diamètre, peut contenir l’ensemble de l’information génétique, d’une longueur d’environ
2 mètres (m) chez l’homme, suite à un repliement très hiérarchisé et ordonné. Ces
différents niveaux de compaction vont impacter des processus nucléaires, telles que la
transcription, la réplication et la réparation de l’ADN [Santos-Rosa and Caldas, 2005].
1 Structure de la Chromatine
La chromatine est composée d’ADN, de protéines basiques : les histones, et de
protéines non histones. L’ensemble de ces protéines aide au support de l’ADN et au
changement de son état de compaction. Les différents niveaux de condensation vont
d’une chromatine accessible, c'est-à-dire complètement décondensée, au chromosome
mitotique représentant l’état le plus condensé (Figure 2).
- 20 -
Figure 3 : Structure d’un nucléosome
Les nucléosomes sont formés d’une particule cœur composée de protéines d’empaquetage, autour de
laquelle s’enroulent 146 paires de bases (pb) d’ADN en 1.65 tours.
Adaptée de http://www.frontiers-in-genetics.org
Figure 4 : Constitution des histones coeur
Les quatre histones cœur sont toutes formées d’un domaine central nommé histone-fold. Ce domaine
structuré est formé d’une grande hélice Į (Į2) entourée de deux petites (Į1 et Į3) et reliées entre elles par
deux petites boucles (L1 et L2). Ces quatre histones se distinguent par leurs extrémités N- et C-terminales
non structurées, qui sont de longueurs variables.
Adaptée de http://www.studyblue.com
Figure 5 : Assemblage de l’octamère d’histones
L’assemblage du cœur protéique des nucléosomes commence par l’hétérodimérisation de 2 complexes
H3-H4 via leurs hélices Į2 et boucles L1 et L2, suivie d’une dimérisation entre les hélices Į3 des deux H3
pour former un tétramère (H3-H4)2. Parallèlement, H2A et H2B forment un dimère via leurs domaines
histone-fold. Pour finir, les dimères H2A-H2B viennent encadrer le tétramère (H3-H4)2 grâce à des
interactions entre les hélices Į2 de H4 et Į3 de H2B.
Adaptée de http://en.wikipedia.org
Introduction
1.1 Nucléosome
Le premier niveau de compaction correspond à la formation de nucléosomes. Cette
unité structurale de la chromatine a été observée pour la première fois par Olins et Olins
en 1973. Elles furent d’abord nommées « v bodies » [Olins and Olins, 1974], puis le terme
nucléosome est apparu en 1975 [Oudet et al., 1975].
Les nucléosomes sont formés à partir d’ADN et de protéines histones (Figure 3). Ils
sont composés d’une particule cœur et d’une région internucléosomale. La particule cœur
est constituée d’un octamère d’histones autour duquel s’enroulent 146 paires de bases
(pb) d’ADN en 1.65 tours [Felsenfeld and Groudine, 2003]. Cet assemblage est possible
grâce à des interactions électrostatiques entre l’ADN chargé négativement et les
protéines basiques que sont les histones. Ces particules cœur sont séparées par de
l’ADN internucléosomique, dît ADN de liaison.
L’octamère est composé de deux exemplaires de chacune des 4 histones de cœur
H2A, H2B, H3 et H4. Ces protéines, très conservées au cours de l’évolution des
eucaryotes, ont été identifiées par Kossel en 1884 [Sullivan and Landsman, 2003]. Ce
sont des petites protéines d’environ 15kDa, riches en acides aminés basiques : tels que
les résidus arginines (R) et lysines (K). Ces histones cœur sont formées d’un domaine
central commun structuré, " histone-fold ", d’environ 70 résidus, composé d’une grande
hélice Į (Į2) entourée de deux petites (Į1 et Į3) et reliées entre elles par deux petites
boucles (L1 et L2) [Luger et al., 1997b; Wang et al., 1994]. Ce motif ultra conservé est
entouré par des extrémités N- et C-terminales non structurées de longueurs variables
(Figure 4). Ces queues peuvent être soumises à un grand nombre de modifications posttraductionnelles (voir § A.2.1.2), alors que la partie centrale hydrophobe va permettre la
dimérisation des histones. Celle-ci se fait selon une configuration dite " en poignée de
main ", nécessaire à l’assemblage des nucléosomes [Ramaswamy et al., 2005].
L’assemblage de ce cœur protéique commence par l’hétérodimérisation de deux
complexes H3-H4 via leurs hélices Į2 et boucles L1 et L2, suivie d’une dimérisation entre
les hélices Į3 des deux H3 pour former un tétramère (H3-H4)2 (Figure 5). Parallèlement,
H2A et H2B forment deux dimères via leurs domaines histone-fold. Pour finir, les dimères
H2A-H2B viennent encadrer le tétramère (H3-H4)2 grâce à des interactions entre les
hélices Į2 de H4 et Į3 de H2B [Ramakrishnan, 1997].
L’enchaînement régulier des nucléosomes va former le nucléofilament aussi nommé
fibre de chromatine de 11 nanomètres (nm) ou structure en "collier de perles" de par son
observation au microscope.
- 21 -
Figure 6 : Repliement du nucléofilament en fibre de 30nm
L’ajout de l’histone de liaison H1 stabilise les nucléosomes et permet leur surenroulement pour former une
fibre de chromatine de 30nm.
Adaptée de http://www-lemm.univ-lille1.fr
Figure 7 : Modèles d’enroulement des nucléosomes
Deux modèles d’enroulement des nucléosomes pour aboutir à la fibre de 30 nm ont été proposés. Dans le
modèle solénoïde 6 nucléosomes s’enroulent consécutivement en hélice autour d’un axe virtuel. Dans le
modèle zig-zag, les nucléosomes s’entrelacent en suivant une hélice à départ double. Les nucléosomes ne
sont donc pas en contact avec leur voisin proche mais le suivant.
Adaptée de http://www.proprofs.com
Introduction
Le groupe de Timothy Richmond a tout d’abord décrit cette structure à une
résolution de 7 Angström (Å) [Richmond et al., 1984] en 1984, puis à 2.8 Å en 1997
[Luger et al., 1997a] et pour finir en 2002, à 1.9 Å par cristallographie aux rayons X
[Davey et al., 2002].
1.2 Repliement du nucléofilament en fibre de 30nm
Le nucléofilament se replie en une fibre de 30nm avec l’ajout d’histones de liaison
H1 sur l’ADN de liaison au niveau de la particule de cœur (Figure 6). H1 stabilise les
nucléosomes et intervient dans leur espacement en modifiant ainsi la topologie et
compaction de l’ADN [Robinson and Rhodes, 2006; Thoma et al., 1979]. Le nucléosome
complexé avec l’histone de liaison H1 forme le chromatosome [Simpson, 1978]. A la
différence des histones canoniques, histones cœur, l’histone H1 est peu conservée, de
masse moléculaire plus grande, environ 21kDa, et plus positivement chargée.
Deux modèles d’enroulement des chromatosomes ont été proposés et restent
toujours discutés (Figure 7). En 1976, Finch et Klug ont proposé un modèle solénoïde
dans lequel les nucléosomes s’enroulent consécutivement en hélice à raison de six
nucléosomes par tour autour d’un axe virtuel [Finch and Klug, 1976]. Le deuxième modèle,
un peu plus controversé, hélice à départ double, propose un arrangement en zigzag où
les nucléosomes ne sont donc pas en contact avec leur voisin proche mais le suivant et
où l’ADN de liaison zigzague ainsi entre chaque nucléosome [Woodcock et al., 1984]. Le
choix du modèle de compaction pourrait dépendre de la longueur de l’ADN de liaison
[Routh et al., 2008]. Un autre groupe a lui montré que les deux arrangements pourraient
coexister [Grigoryev et al., 2009].
1.3 Condensation de la Chromatine
Le dernier niveau de compaction de la chromatine correspond à des repliements
successifs de la fibre de 30nm via la formation de boucles pour aboutir au niveau de
compaction maximal correspondant au chromosome métaphasique. Ce taux final de
condensation serait d’un rapport x10.000 en comparaison de la molécule d’ADN linéaire
[Belmont, 2002].
- 22 -
Figure 8 : Méthylation de l’ADN
La méthylation de l’ADN correspond a l’ajout d’un groupement méthyle (-CH3), issu de la molécule SAM
(S-Adenosyl-Methionine), sur un résidu cytosine qui est suivi d’une guanine (CpG). Elle est réalisée par
des DNMT (DNA MethylTransferase). Cette modification entraîne une condensation de la et donc une
répression transcriptionnelle
Adaptée de [Strietholt et al., 2008] et [Zakhari, 2013]
Introduction
2 Modification et remodelage de la Chromatine
Afin de répondre aux différentes fonctions nucléaires, dépendantes de l’organisation
de la chromatine et donc de l’arrangement des nucléosomes, les cellules ont développé
différents mécanismes permettant de moduler la dynamique structurelle de la chromatine.
Ces modifications peuvent agir soit en cis, en intervenant directement sur les liaisons
ADN-histone ou histone-histone, ou en trans avec le recrutement de complexes impliqués
dans le remodelage de la chromatine.
2.1 Modifications de la chromatine
L’organisation de la structure chromatinienne peut être altérée suite à des
changements au niveau de l’ADN (méthylations), ou au niveau des histones
(modifications post-traductionnelles, incorporation de variants).
2.1.1 Méthylation de l’ADN
Chez les mammifères, la méthylation de l’ADN repose sur l’ajout d’un groupement
méthyle (-CH3), issu de la molécule SAM (S-Adenosyl-Methionine), sur un résidu cytosine
suivi d’une guanine (Figure 8). On parle alors de dinucléotides CpG. Ces motifs CpG ne
sont pas répartis de manière aléatoire sur le génome, on les retrouve en particulier très
présents au niveau des régions 5’ des gènes. Ces régions correspondent à des
séquences d’ADN de plus de 500pb que l’on nomme " îlots CpG " [Antequera and Bird,
1993]. Cette modification covalente est réalisée par les protéines conservées DNMT
(DNA MethylTransferase). Chez les eucaryotes, il existe trois ADN méthyltransférases:
DNMT1, DNMT3a et DNMT3b [Bestor, 2000]. La première, DNMT1, intervient pour les
méthylations de maintenance. Elle recopie les motifs méthylés sur les brins d’ADN
néosynthétisés lors de la réplication. Les deux autres, DNMT3a et DNMT3b, sont liées au
méthylations de novo, ajout de nouveaux groupements méthyles, en dehors de la phase
de réplication, sur des séquences d’ADN jusque là non méthylées [Okano et al., 1999].
La présence d'un groupement méthyle en un site précis est associée à un état
fermé de la chromatine et donc une répression transcriptionnelle [Bird and Wolffe, 1999].
Cette inhibition des gènes s’explique d’une part par un encombrement stérique
empêchant l’accès de la machinerie transcriptionnelle à l’ADN [Watt and Molloy, 1988],
mais aussi par le recrutement de protéines inhibitrices au niveau de ces sites CpG
méthylés [Boyes and Bird, 1991].
- 23 -
Figure 9 : Acétylation des queues des histones
L’acétylation consiste en l’ajout d’un groupement acétyle : CH3-C=O, dérivé de l’acétyl-CoA, vers un
+
groupement amine (NH3 ) d’un résidu lysine. Cette modification post-traductionnelle est réalisée au niveau
des extrémités terminales des histones par des histones acétyltransferases (HAT). La désacétylation est
effectuée par des histones désacétylases (HDAC). L’acétylation permet un relâchement de la chromatine
qui favorise la transcription.
Adaptée de http://cellways.blogspot.fr
Introduction
2.1.2 Modifications post-traductionnelles des histones
Les modifications post-traductionnelles des histones sont covalentes et réversibles.
L’ajout ou la suppression d’un groupement chimique va dépendre d’un équilibre entre
deux enzymes antagonistes. Elles touchent principalement les extrémités aminoterminales sortant des nucléosomes, mais peuvent aussi être retrouvées au niveau des
domaines globulaires ou sur les queues carboxy-terminales. Ces changements vont
influencer les interactions ADN-histones jouant ainsi sur la compaction de l’ADN et donc
impacter les processus cellulaires. L’implication de ces modifications dans la régulation
transcriptionnelle a été décrite dès le début des années 70 [Allfrey et al., 1964]. Les
modifications les plus retrouvées et donc les mieux documentées sont l’acétylation, la
méthylation, la phosphorylation et l’ubiquitination [Berger, 2007; Kouzarides, 2007]. Les
histones modifiées pourront être reconnues par des effecteurs qui se fixent grâce à des
domaines spécifiques tels que les bromodomaines (reconnaissance de résidus acétylés)
ou chromodomaines (reconnaissance de résidus méthylés).
2.1.2.1 Acétylation
L'acétylation a été la première des marques d’histone étudiée. Elle consiste en
l'addition d'un groupement acétyle : CH3-C=O, dérivé de l’acétyl-CoA, vers un groupement
amine (NH3+) d’un résidu lysine (Figure 9) [Nohara et al., 1968]. Ces marques sont
principalement retrouvées sur l’histone H3 (acétylation des lysines (K) 9, 14, 18, et 23) et
sur l’histone H4 (acétylation des lysines 5, 8, 12, et 16). On en retrouve également un peu
au niveau des queues N-terminales des histones H2A et H2B. L’acétylation des histones
impacte différents processus nucléaires qui varieront en fonction de l’activité des histones
acétyltransferases (HAT) et des histones désacétylases (HDAC) [Carrozza et al., 2003;
Kuo and Allis, 1998].
L'acétylation des lysines par les enzymes HAT est associée à un relâchement de
la chromatine qui devient alors permissive à l’activation de la transcription [Hebbes et al.,
1988]. Cette décondensation est due à la neutralisation des charges positives portées par
les lysines, relaxant les interactions entre les histones et l’ADN. Les histones acétylées
peuvent être la cible de protéines non histone, contenant un bromodomaine, comme de
nombreux facteurs de transcription [Yang, 2004]. A l’inverse, la désacétylation, réalisée
par les enzymes HDAC réprime la transcription en favorisant une compaction de la
chromatine [Eberharter and Becker, 2002].
- 24 -
Introduction
2.1.2.2 Méthylation
Cette modification, reposant sur l’ajout d’un groupement méthyle par une histone
méthyltransférase (HMT) sur une lysine ou une arginine, n’est retrouvée que sur les
histones H3 et H4 [Bannister and Kouzarides, 2005]. Les lysines peuvent subir une mono,
bi ou tri-méthylation via l’action d’une lysine-méthyltransférase (HKMT), alors que les
arginines sont mono ou di-méthylées, suivant une disposition symétrique ou asymétrique,
par des arginine-méthyltransférases (PRMT) [Campos and Reinberg, 2009]. La
méthylation ne modifie pas la charge de l’histone ce qui la rend plus stable que d’autres
types de modification. Les marques de méthylation, en fonction du type de résidu ciblé et
de sa position, vont moduler la structure de la chromatine en la faisant passer d’un état
condensé à relaxé, ce qui va influencer différentes fonctions dont certaines antagonistes
[Stallcup, 2001]. Ainsi les marques H3K27me, H3K9me, H3K4me1/2/3, H3K36me3 et
H4K20me sont associées à un état transcriptionnel actif [Barski et al., 2007]. Alors qu’au
contraire, les marques H3K9me2/3, H4K20me3 ou H3K27me3 sont en lien avec une
chromatine silencieuse.
Les arginines méthylées sont majoritairement retrouvées au niveau de régions
actives et donc associées à une chromatine relâchée [Litt et al., 2009].
Des protéines régulatrices, via leur chromodomaine, vont préférentiellement venir se fixer
sur ces résidus méthylés et ainsi réguler différents processus cellulaires.
2.1.2.3 Phosphorylation
La phosphorylation, avec l’ajout d’un groupement phosphate, PO43í, sur des
résidus sérine (S) ou thréonine (T) des queues des histones, déstabilise leur structure en
en modifiant la charge globale.
L’histone le plus sujet à ces modifications est l’histone H3 avec en particulier de
nombreuses phosphorylations de S10, S28 et T4. On retrouve aussi quelques
phosphorylations des histones H2A (S1), H2B (S14) et H4 (S3).
Cette modification intervient dans différentes fonctions telles que la régulation de
la transcription, le déroulement de la mitose, la réparation de l’ADN, la progression du
cycle cellulaire et l’apoptose [Oki et al., 2007]. Par exemple, la phosphorylation de la
sérine 10 de l’histone H3 a un effet plutôt répressif lors de la condensation et ségrégation
des chromosomes durant la mitose. Mais elle peut aussi avoir un rôle positif sur la
transcription en activant des cascades MAP kinases et en favorisant acétylation de K14
[Nowak and Corces, 2004].
- 25 -
Introduction
Le rôle de la phosphorylation de la sérine 139 de l’histone H2AX a également été
bien étudié. Cette modification joue un rôle important lors des lésions double-brins de
l’ADN en permettant le recrutement de facteurs de réparation de l’ADN [Rogakou et al.,
1998].
2.1.2.4 MonoͲUbiquitination
L’ubiquitination et plus particulièrement la poly-ubiquitination est le plus souvent
associée à un processus de présentation des protéines au protéasome pour leur
dégradation. Mais ici, la mono-ubiquitination des résidus lysines des histones intervient en
particulier dans la régulation de l’expression génique et la réparation de l’ADN [Cao and
Yan, 2012]. La fixation covalente d’une ubiquitine repose sur l’intervention de trois
enzymes : E1 (enzyme activatrice), E2 (enzyme de conjugaison) et E3 (enzyme de
ligation). L’ubiquitination peut avoir deux rôles inverses sur la transcription : l’ubiquitination
de la lysine 119 de l’histone H2A est liée à une répression alors que l’ubiquitination de la
lysine 120 de l’histone H2B est associée à une transcription active.
2.1.2.5 Autresmodifications
Les histones peuvent également être soumises à d’autres types de modifications
un peu moins décrites, telles que :
- L’ADP-ribosylation qui serait plutôt associée à une transcription active et pourrait
intervenir dans la réplication et la réparation de l’ADN [Messner and Hottiger, 2011].
- La SUMOylation, touchant les lysines des histones de la partie cœur. L’ajout d’un
groupement SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) aurait tendance à réprimer la
transcription en empêchant l’acétylation ou l’ubiquitination de ce résidu [Gill, 2004; Shiio
and Eisenman, 2003].
- La biotinylation qui intervient également sur les lysines et de la même manière que la
SUMOylation aurait un rôle négatif sur la transcription en inhibant l’ajout de groupement
acétyle [Kothapalli et al., 2005].
- La citrullination, qui remplace les résidus arginines par des citrullines, aurait un effet
répressif sur la transcription en
bloquant l’accès des groupements méthyles sur ces
résidus [Thompson and Fast, 2006].
- 26 -
Introduction
2.1.2.6 Codedeshistones
Ainsi la dynamique chromatinienne et les fonctions nucléaires qui y sont liées
varient en fonction du type de modification post-traductionnelle, du type de résidu ciblé et
de la position de ce résidu. De ce fait, il a été suggéré un " code des histones " qui
propose que chaque combinaison de modifications correspondrait à une réponse
biologique [Jenuwein and Allis, 2001; Strahl and Allis, 2000]. Des protéines spécifiques
seraient capables de déchiffrer ce langage pour moduler l’état de la chromatine
[Margueron et al., 2005; Turner, 2002]. Il a également été décrit un dialogue entre les
modifications : certaines vont influencer la mise en place de d’autres ou à l’inverse inhiber
une modification [Latham and Dent, 2007]. On parle de communication cis lorsque que ce
sont deux modifications présentes sur le même histone, c’est le cas de la phosphorylation
de la sérine 10 de l’histone H3 qui inhibe la méthylation de la lysine 9 de ce même histone
[Jeong et al., 2010]. Et de communication trans, lorsqu’une modification va interférer avec
une modification d’une autre histone, c’est le cas de l’ubiquitination de la lysine 123 de
l’histone H2B qui favorise la méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 [Chandrasekharan
et al., 2011].
2.1.3 Les variants d’histones
L’état de la chromatine peut aussi être modulé par le remplacement des histones
conventionnelles par des variants [Biterge and Schneider, 2014]. En effet, les histones de
cœur (hormis l’histone H4) possèdent chacune une ou plusieurs isoformes non alléliques.
A la différence des histones canoniques, qui sont synthétisées en phase S et incorporées
dans la chromatine pendant la réplication, les variants peuvent être transcrits durant tout
le cycle cellulaire et introduits d’une manière indépendante de la réplication [Henikoff and
Ahmad, 2005]. Les variants ayant des propriétés propres, leur incorporation au sein des
nucléosomes forme de nouveaux complexes nucléoprotéiques, de structure et de stabilité
différentes, ce qui aboutit à un nouvel état de la chromatine et donc impacte la régulation
des processus nucléaires [Kamakaka and Biggins, 2005; Pusarla and Bhargava, 2005;
Sarma and Reinberg, 2005]. Les variants ne sont pas conservés au sein des espèces,
voici les variants retrouvés chez l’homme :
- Les variants de l’histone H2A :
Le variant H2A.Z, homologue à 63% de l’histone H2A, représente environ 5 à 10%
des variants. Ce variant, mieux conservé que le majoritaire, serait ainsi primordial pour
différentes fonctions cellulaires [Redon et al., 2002]. Son rôle est assez controversé.
- 27 -
Introduction
Certaines études ont suggéré qu’il permettait de stabiliser l’octamère d’histones [Park et
al., 2004] et serait associé à une transcription active, en favorisant la formation de
l’euchromatine et bloquant la propagation de l’hétérochromatine [Meneghini et al., 2003].
Alors que d’autres recherches ont proposé qu’il altérait la structure du nucléosome et
serait impliqué dans la répression génique en induisant une structure chromatinienne
condensée [Fan et al., 2004].
Le variant H2A.X est remarquable par son motif SQ(E/D)ĭ (ĭ = résidu
hydrophobe), très conservé sur son extrémité C-terminale. Sa forme phosphorylée sur la
sérine 139, ȖH2A.X, jouerait un rôle décisif dans le maintien de l’intégrité génomique en
participant à la réparation des cassures double-brins de l’ADN [Celeste et al., 2003b;
Rogakou et al., 1998]. Dans ce sens, ce variant serait impliqué dans le contrôle du
développement tumoral [Bassing et al., 2003; Celeste et al., 2003a].
Le variant macroH2A est caractérisé par sa grande taille. Il est composé de 372
acides aminés, ce qui équivaut à trois fois la taille de l’histone canonique H2A [Pehrson
and Fried, 1992]. MacroH2A est divisé en deux domaines distincts : une partie Nterminale homologue à 64% de l’histone H2A, nommée " H2A like " [Pehrson and Fuji,
1998] et le "macrodomaine" en C-terminale qui contient une région non-histone (NHR).
Ce variant, retrouvé sous plusieurs isoformes, est associé à une répression de la
transcription en intervenant dans la formation et le maintien de l’hétérochromatine, via son
domaine NHR [Perche et al., 2000] et avec son domaine "histone fold" qui inhibe l’action
du complexe de remodelage SWI/SNF [Angelov et al., 2003]. Du fait de son importante
présence au niveau du chromosome X inactif chez les mammifères [Chadwick et al.,
2001; Costanzi and Pehrson, 1998], ce variant serait impliqué dans l’extinction génique
[Ladurner, 2003].
Le variant H2A.Bbd, (H2A-Barr-Body-Deficient), a été le plus récemment
découvert et reste donc moins documenté. Cette isoforme, identique à 48% de l’histone
H2A, est très peu conservée [Eirin-Lopez et al., 2008]. Sa taille, plus courte que la forme
canonique, confère une structure plus ouverte et moins stable des nucléosomes le
comportant [Gautier et al., 2004]. A l’inverse du macroH2A, H2A.Bbd n’est pas retrouvé
au niveau des chromosomes X inactifs [Chadwick and Willard, 2001], mais serait plutôt
enrichi au niveau des sites de transcription [Sansoni et al., 2014]. Cette localisation lui
permet d’être en contact avec l’histone H4 acétylée sur la lysine 12 et ainsi de favoriser
une chromatine transcriptionnellement active [Doyen et al., 2006; Tolstorukov et al., 2012].
- 28 -
Introduction
- Les variants de l’histone H2B : Les différents variants de cette histone sont tous
uniquement retrouvés dans les tissus testiculaires et spermatozoïdes. Leurs fonctions
sont assez mal définies.
Le variant spH2B, (human Sperm specific H2B), possède une grande partie Nterminale riche en acides aminés basiques et jouerait un rôle dans l’organisation des
télomères durant la spermiogénèse [Gineitis et al., 2000].
Le
variant
hTSH2B,
(human
Testis/Sperm-specific
H2B),
partage
85%
d’homologie avec l’histone H2B. La substitution de H2B par ce variant déstabiliserait la
structure de l’octamère d’histones [Li et al., 2005].
Le variant H2BFWT (H2B Family member W Testis specific), est localisé sur le
bras long du chromosome X et exprimé exclusivement dans les testicules. Il serait
également impliqué dans les fonctions télomériques [Churikov et al., 2004]. Le
remplacement de l’histone H2B par ce variant ne change en rien la structure et la stabilité
du nucléosome, mais affecte l’assemblage du chromosome mitotique en inhibant le
recrutement de facteurs de condensation [Boulard et al., 2006].
- Les variants de l’histone H3 : Les isoformes de cette histone sont en particulier
impliquées dans la transcription et la ségrégation des chromosomes. Leurs impacts sur
les fonctions cellulaires vont dépendre des modifications post-traductionnelles auxquelles
elles seront soumises [Hake and Allis, 2006; Hake et al., 2006].
Le variant H3.1, lorsqu’il subit une acétylation de la lysine 14 est associé à une
transcription active alors qu’il est lié à une répression des gènes lorsqu’il est di-méthylé
sur la lysine 9.
Le variant H3.2 est lui uniquement impliqué dans le silencing transcriptionnel avec
des di ou tri-méthylations de la lysine 27.
Le variant H3.3 ne varie que de quatre acides aminés par rapport à l’histone
conventionnelle. Il est particulièrement retrouvé au niveau de région de chromatine active
et porte des marques transcriptionnellement favorables telles que la di ou tri-méthylations
de la lysine 4 ou encore les acétylations des lysines 9, 18 et 23.
Le variant H3.1t, (H3.1 Testis Specific), qui est exclusivement exprimé dans les
testicules [Witt et al., 1996].
- 29 -
Introduction
Le variant H3 CENP-A, (CENtromeric Protein A), qui possède une partie Cterminale assez proche de l’histone H3 (60% d’identité) mais une région N-terminale
extrêmement différente. Ce variant est uniquement retrouvé au niveau des centromères
[Palmer et al., 1987]. Il est impliqué dans la formation des kinétochores et impacte ainsi la
ségrégation des chromosomes pendant la mitose et la méiose [Van Hooser et al., 2001].
2.1.4 Les chaperons d’histones
Les protéines chaperonnes des histones influencent la dynamique de la
chromatine en prenant en charge l’acheminement des histones. Certaines vont assurer
leur déplacement du cytoplasme vers le noyau, d’autres leur assemblage ou
désassemblage dans les nucléosomes ou encore leur remplacement par l’incorporation
de variants [De Koning et al., 2007]. Ces chaperons interviennent ainsi dans différents
processus cellulaires comme la transcription, la réplication, la recombinaison et la
réparation de l’ADN. Ces protéines sont, pour la majorité,
composées de domaines
acides qui leur permettent de s’associer aux histones basiques ainsi qu’à des facteurs de
la chromatine.
Les
principales
protéines
intervenant
dans
l’assemblage
des
histones
conventionnelles, au cours de la phase S lors de la réplication de l’ADN, sont la protéine
CAF1 (Chromatin Assembly Factor 1) [Gaillard et al., 1996], la protéine NAP1
(Nucleosome Assembly Protein 1) [Ishimi et al., 1984] et RCAF (Replication-Coupling
Assembly Factor) [Tyler et al., 1999]. L’incorporation de variants d’histone, dont
l’assemblage est non couplé à la réplication, repose particulièrement sur la protéine HIRA
(Histone Regulation A) [Ray-Gallet et al., 2002]. La protéine Asf1 (Anti-Silencing function
1) est impliquée dans l’activation génique, elle permet l’accès aux séquences promotrices
par désassemblage de la chromatine [Adkins et al., 2004].
2.2 Remodelage ATP-dépendant de la chromatine
Les complexes de remodelage de la chromatine vont modifier la position et/ou la
conformation des nucléosomes en les déplaçant ou en les restructurant. Cette
réorganisation va permettre de rendre des séquences d’ADN accessibles aux facteurs de
régulation intervenant dans des processus cellulaires tels que la transcription, la
réparation de l’ADN et l’assemblage de la chromatine [Lusser and Kadonaga, 2003]. Les
facteurs de remodelage forment des machineries multiprotéiques qui vont altérer les
associations entre l’ADN et les histones à partir de l’énergie produite par une réaction
d’hydrolyse de l’ATP [Clapier and Cairns, 2009].
- 30 -
Figure 10 : Les 4 grandes familles de complexes de remodelage de la chromatine
Il existe 4 grandes familles de complexes multiprotéiques remodelant la chromatine. Elles ont toutes en
commun un domaine ATPase. Ce domaine est divisé en deux parties : le domaine ATPase DExx et le
domaine hélicase HELICc. Elles diffèrent par leurs sous-unités catalytiques : HSA : Helicase SANT ;
BROMO : bromodomaine ; SANT : SWI3, ADA2, N-CoR, TFIIIB ; SLIDE : SANT-like ISWI domain.
SWI/SNF : SWItching/Sucrose Non Fermenting
ISWI : Imitation SWItch
CHD : Chromodomain Helicase DNA-binding protein
INO80 : Inositol requiring.
Adaptée du manuscrit "Chromatin Remodelling", édité par Danuta Radzioch en 2013
Introduction
2.2.1 Grandes familles des complexes de remodelage
Ces complexes multiprotéiques remodelant la chromatine ont tous en commun un
domaine ATPase. Ce domaine est divisé en deux parties : le domaine ATPase DExx et le
domaine hélicase HELICc. Les complexes de remodelage diffèrent par leurs sous-unités
catalytiques et par les facteurs de transcription ou chromatiniens auxquels ils sont liés.
Selon ces propriétés et en fonction de leurs activités, on peut distinguer quatre classes de
facteurs de remodelage : SWI/SNF, ISWI, CHD et INO (Figure 10) [Hargreaves and
Crabtree, 2011].
2.2.1.1 FamilleSWI/SNF
La famille SWI/SNF (SWItching/Sucrose Non Fermenting) est constituée, en plus
de sa sous-unité catalytique ATPase, d’un bromodomaine en C-terminale qui va
reconnaître spécifiquement les lysines acétylées des histones H3 et H4 et d’un domaine
de liaison HSA (Helicase SANT) en N-terminale, qui permet le recrutement de protéine
d’actine.
Ce complexe a d’abord été décrit comme jouant un rôle majeur dans l’activation de
la transcription [Carlson and Laurent, 1994; Sudarsanam et al., 1999]. Il a ensuite été
montré qu’il pouvait aussi intervenir de manière répressive [Martens and Winston, 2002;
Sudarsanam and Winston, 2000]. Cette famille de facteur de remodelage agit par
glissement du nucléosome le long de l’ADN ou par éviction du nucléosome.
2.2.1.2 FamilleISWI
La classe ISWI (Imitation SWItch) est quant à elle constituée, en plus de sa partie
ATPase, de deux sous-unités catalytiques en C-terminales : un domaine SANT (SWI3,
ADA2, N-CoR, TFIIIB) qui s’associe aux queues des histones non modifiées et un
domaine SLIDE (SANT-like ISWI domain) qui se lie à l’ADN linker [Grune et al., 2003].
Les principaux complexes sont NURF (Nucleosome remodeling factor) [Tsukiyama
et al., 1995], ACF (ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor) [Ito et al.,
1997] et CHRAC (Chromatin accessibility complex) [Varga-Weisz et al., 1997].
Ces facteurs sont majoritairement retrouvés dans la répression des gènes mais
peuvent aussi être impliqués dans de nombreuses autres fonctions [Corona and Tamkun,
2004; Erdel and Rippe, 2011]. L’inhibition de la transcription repose sur une
réorganisation de l’espacement des nucléosomes qui va réassembler la chromatine dans
une configuration condensée. Les facteurs ACF et CHRAC sont en particulier impliqués
- 31 -
Introduction
dans cette re-structuration [Varga-Weisz and Becker, 1998].
A l’inverse, NURF déstabilise cette organisation nucléosomique et intervient donc
plutôt en tant qu’activateur de la transcription [Badenhorst et al., 2002]. Ainsi, cette famille
joue un rôle important dans la maintenance et l’expression génique [Deuring et al., 2000],
mais on la retrouve aussi en particulier impliquée dans les mécanismes de réparation de
l’ADN.
2.2.1.3 FamilleCHD
Le groupe de complexe de remodelage CHD (Chromodomain Helicase DNAbinding protein) comporte un duo de chromodomaines en N-terminale, reconnaissant
spécifiquement les lysines méthylées des histones, en plus de leur domaine ATPase.
Cette famille joue un rôle crucial dans la régulation de la transcription et dans les
processus de développement [Marfella and Imbalzano, 2007]. Neuf sous-unités
catalytiques ont été décrites chez l’homme : CHD1 à 9, avec CHD3 et CHD4 composant
le complexe NURD (Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation), qui est le
complexe majoritaire chez l’homme. En plus de ces deux ATPases CHD3 et CHD4,
NURD comporte deux histones déacétylases : HDAC1 et HDAC2 et est donc impliqué
dans la répression de la transcription [Xue et al., 1998]. NURD possédant également une
région pouvant liée les îlots CpG méthylés, la répression génique pourrait dépendre de la
méthylation de l’ADN [Zhang et al., 1999]. Au contraire, le complexe CHD1 est retrouvé
au niveau de gènes actifs. Il s’associe avec des histones acétyltransférases ou des
facteurs d’élongation pour favoriser la transcription [Simic et al., 2003].
2.2.1.4 FamilleINO80
La famille INO80 (Inositol requiring) est caractérisée par la présence d’une grande
région qui divise le domaine ATPase en deux et d’un domaine de liaison à l’ADN HSA
aussi nommé DBINO (DNA Binding INO) [Bakshi et al., 2006; Bao and Shen, 2007]. Le
complexe INO80 a été retrouvé impliqué dans différents processus cellulaires tels que
l’activation de la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN [Conaway and
Conaway, 2009]. Plus récemment, un second facteur de cette famille a été décrit. Il s’agit
du complexe SWR1 (SWI/SNF-Related 1) qui a la capacité de remplacer le dimère
H2A/H2B par H2A.Z/H2B [Mizuguchi et al., 2004]. Ces deux complexes intervenant dans
plusieurs fonctions nucléaires fondamentales participent au maintien de l’intégrité
génomique [Morrison and Shen, 2009].
- 32 -
Figure 11 : Mécanismes d’action des complexes de remodelage de la chromatine
Les complexes de remodelage de la chromatine (CRC) agissent de manière ATP-dépendante selon quatre
mécanismes. Ils modulent les nucléosomes en les relâchant, en les déplaçant, en les supprimant ou en
modifiant leurs compositions avec l’échange d’une histone par un de ses variants.
Adaptée du manuscrit "Chromatin Remodelling", édité par Danuta Radzioch en 2013
Introduction
2.2.2 Mode d’action des complexes de remodelage
Comme détaillé plus haut, les facteurs impliqués dans le remodelage de la
chromatine s’appuient sur différentes actions mécaniques. Les machineries de
remodelage se fixent, via leur domaine ATPase, sur l’ADN de liaison présent à l’entrée
des nucléosomes. Cette mise en place déstabilise les contacts entre l’ADN et les histones
et entraîne la formation d’une boucle d’ADN. Ce décollement d’ADN va se propager
autour du nucléosome et permettre différents remodelages en fonction de la classe des
facteurs [Cairns, 2007; Wang et al., 2007]. L’énergie de l’hydrolyse d’ATP peut être
utilisée pour : (Figure 11)
- Le relâchement de nucléosomes : l’altération des contacts entre l’ADN et les
nucléosomes va détendre l’organisation de ceux-ci, libérant des séquences d’ADN qui
étaient masquées au sein de l’octamère. Ces séquences seront de cette manière
accessibles à des facteurs de régulation chromatiniens ou transcriptionnels.
- Le déplacement de nucléosomes : on parlera de glissement ou de déplacement en cis
lorsque le nucléosome conserve sa place parmi les autres, et de transfert ou déplacement
en trans lorsqu’il permute avec un autre nucléosome.
- L’éviction de nucléosomes : afin de rendre des séquences d’ADN accessibles à
différents facteurs, des nucléosomes peuvent être supprimés. C’est en particulier le cas
au niveau de régions promotrices pour permettre l’accès à la machinerie transcriptionnelle
[Brown et al., 2011].
- La substitution d’histone: la formation de boucles d’ADN le long des nucléosomes peut
permettre un remplacement d’une histone par un de ses variants. C’est en particulier le
cas pour le dimère d’histones HA/H2B qui peut être échangé par le dimère H2A.Z/H2B
[Bruno et al., 2003].
3 Organisation de la chromatine
Ainsi, comme l’avait observé le botaniste allemand Emil Heitz en 1928, la chromatine
se présente sous deux formes en fonction de son niveau de condensation :
l’euchromatine et l’hétérochromatine [Passarge, 1979]. Ces deux états présentent des
caractéristiques et fonctions différentes [Fedorova and Zink, 2008].
- 33 -
Figure 12 : Localisation nucléaire des formes de chromatine
La chromatine peut être distinguée en deux formes selon son état de condensation. L’euchromatine
représente sa forme relâchée et est majoritairement située au centre du noyau. L’hétérochromatine
correspond à sa forme condensée. Elle est plus particulièrement localisée en périphérie.
Adaptée de http://www.facbio.com
Introduction
3.1 Euchromatine
L'euchromatine représente les régions d’ADN actives, riches en gènes, qui grâce à
son état décondensé permet une accessibilité de la machinerie transcriptionnelle. Les
gènes présents sont ainsi transcrits. Les histones de ces régions sont fortement acétylés,
mais leur niveau de méthylation est plutôt faible.
Ces régions de chromatine ouverte sont préférentiellement localisées au centre du
noyau (Figure 12).
3.2 Hétérochromatine
Les régions plus condensées correspondent à l’hétérochromatine, qui représente
une chromatine inactive, c'est-à-dire silencieuse transcriptionnellement. Ces régions,
pauvres en gènes, sont principalement retrouvées en périphérie du noyau et à proximité
du nucléole. En comparaison à l’euchromatine, elles sont soumises à de nombreuses
méthylations mais sont beaucoup moins acétylées [Grewal and Moazed, 2003].
L’hétérochromatine est retrouvée sous deux formes : l’hétérochromatine constitutive et
l’hétérochromatine facultative [Grewal and Jia, 2007].
L’hétérochromatine constitutive reste stable, réprimée, durant l’ensemble du cycle
cellulaire, à tous les stades du développement et dans tous les tissus. Elle est le plus
souvent constituée d’ADN répétitif et retrouvée au niveau des régions centromériques,
péricentromériques et télomériques [Grewal and Elgin, 2002; Hsu and Arrighi, 1971].
L’hétérochromatine facultative, est une région transcriptionnellement inactive
contenant des gènes en silence, mais dont la répression peut être levée à certains stades
du développement ou dans certains types cellulaires [Grigoryev et al., 2006]. Ce sont des
régions fermées mais de manière transitoire et réversible.
3.3 Territoires chromosomiques
Les premières observations des territoires chromosomiques ont été faites dans les
années 80 lors d’expériences de micro-irradiation au laser UV sur des cellules de hamster
chinois en interphase [Cremer et al., 1982]. Ces territoires ont ensuite été confirmés par
des analyses de chromosome painting en hybridation in-situ [Manuelidis, 1985; Schardin
et al., 1985]. L’agencement dans le noyau de ces territoires a été encore mieux
documentés grâce au développement de la technique de FISH (Fluorescence In Situ
Hybridization) [Cremer and Cremer, 2001]. Ces marquages individuels des chromosomes
ont mis en évidence que leur localisation au sein des noyaux n’est pas aléatoire.
- 34 -
Figure 13 : Organisation de la chromatine en territoires chromosomiques
Au sein du noyau, la chromatine n’est pas répartie de manière aléatoire. Elle s’organise en territoires
chromosomiques. a. Analyse de l’organisation chromatinienne par 3D-FISH (three-dimensional
fluorescence in situ hybridization). b. Représentation du positionnement des chromosomes. Les 24
chromosomes sont identifiés par une couleur différente.
D’après [Speicher and Carter, 2005]
Figure 14 : Modèles de disposition des territoires chromosomiques
Deux modèles de la disposition des territoires chromosomiques et de leurs relations spatiales ont été
proposés :
A. Le modèle ICD (Interchromatin Domain) présente l’existence d’un espace interchromatinien. Cette zone,
sans chromatine, sépare distinctement les territoires chromosomiques. Quelques boucles d’ADN
s’avancent au niveau de cette frontière pour former des contacts interchromatiniens.
B. Le modèle ICN (Interchromosomal Network), propose une zone de recouvrement entre les territoires
chromosomiques. Les contacts interchromatiniens sont alors plus nombreux.
Adaptée de [Branco and Pombo, 2006]
Introduction
Ils sont retrouvés dans des espaces bien délimités et organisés (Figure 13). Cette
organisation dépend à la fois de la taille des chromosomes et de leur richesse en gènes.
Les petits chromosomes sont préférentiellement retrouvés au centre du noyau, alors que
les grands sont plutôt localisés en périphérie [Francastel et al., 2000; Sun et al., 2000].
Dans le cas de chromosomes de taille identique, comme les chromosomes 18 et 19, le
chromosome possédant le plus de gènes sera majoritairement en position centrale et
donc celui pauvre en gène plus en périphérie [Croft et al., 1999; Kupper et al., 2007]. Le
timing de réplication peut également influencer ce positionnement. Les gènes mis sous
silence, donc transcriptionnellement inactifs, sont retrouvés en périphérie. Lors de leur
activation, ils seront relocalisés plus au centre du territoire [Chuang et al., 2006]. De
manière intéressante, il a été démontré que ces territoires chromosomiques ont été
conservés durant l’évolution [Tanabe et al., 2002].
3.4 Relations entre Territoires Chromosomiques
La
disposition
et
les
relations
spatiales
entre
les
différents
territoires
chromosomiques ne sont toujours pas bien définies. Deux modèles distincts ont été
proposés : l’un suggérant l’existence d’un espace interchromatinien et l’autre présentant
un recouvrement entre les territoires voisins (Figure 14).
3.4.1 Modèle ICD
Le modèle ICD (Interchromatin Domain) décrit qu’une zone, ne contenant pas de
chromatine, sépare les territoires chromosomiques. Ces espaces, dits interchromatiniens,
sont reliés les uns aux autres pour former un réseau qui, de par son contact avec les
pores nucléaires, permettrait une circulation des protéines et produits nucléaires au
travers de la membrane nucléaire. Les espaces interchromatiniens contiendraient le
matériel non chromatinien : les corps nucléaires et des protéines impliquées dans les
processus cellulaires tels que la transcription, la réplication, la réparation de l’ADN ou
encore l’épissage [Zirbel et al., 1993]. La fonction de ces espaces n’a toujours pas été
bien définie. Est-ce simplement un lieu de stockage des macromolécules ? Ou également
le lieu des réactions enzymatique ? Par ailleurs, il a clairement été montré que des
boucles d’ADN s’échappent des territoires chromosomiques pour se retrouver dans cet
espace qui deviendrait une zone de transcription active [Branco and Pombo, 2006;
Cremer and Cremer, 2001].
- 35 -
Introduction
3.4.2 Modèle ICN
Le modèle ICN (Interchromosomal Network), lui, propose que les territoires
chromosomiques se chevauchent. Les zones de recouvrement représenteraient environ
40% de chacune de leur étendue. Ce volume d’interpénétration dépendrait de la paire de
chromosome et de l’état de compaction des territoires [Branco and Pombo, 2006]. Dans
cette représentation, les protéines non chromatiniennes chemineraient entre les boucles
de chromatine de chaque territoire [Zhao et al., 2006].
3.5 Domaines chromatiniens
Avec le développement de nouvelles technologies comme les puces à ADN et plus
récemment le séquençage nouvelle génération (NGS : Next Generation Sequencing ),
différents domaines chromatiniens ont été observés.
3.5.1 Domaines fonctionnels
Les analyses transcriptomiques ont permis de définir des profils d’expression des
gènes qui ont mis en évidence des domaines fonctionnels. Les chromosomes riches en
gènes actifs tendent à se situer vers la partie extérieure de leur territoire chromosomique
et à s’étendre vers le centre du noyau dans des régions dites RIDGEs (Regions of
Increased Gene Expression) [Bannister and Kouzarides, 2011; Caron et al., 2001]. A la
différence, les régions peu exprimées, pauvres en gènes, sont plutôt présentes en
périphérie pour constituer des domaines Anti-RIDGEs.
L’analyse de données d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP « Chromatin
ImmunoPrecipitation), a quant à elle, décrit une segmentation de la chromatine en
domaines homogènes de marques épigénétiques. On retrouve des segments avec des
enchaînements de régions enrichies ou appauvries en marques de modification des
histones. On peut en particulier citer les domaines LOCKs (Large Organized Chromatin K
(lysine) modifications) avec les marques H3K9me2 [Wen et al., 2012] et BLOCs (Broad
LOCal enrichments) des marques H3K27me3 [Brinkman et al., 2012].
- 36 -
Figure 15 : Segmentation de la chromatine en domaines topologiquement associés
Grâce à l’étude de la conformation de la chromatine par la technique de Hi-C, qui permet de mesurer
l’ensemble des interactions chromatiniennes du génome, il a été montré que le génome est segmenté en
domaines topologiquement associés (TAD : Topologically Associated Domains). Ces TADs sont séparés
par des régions barrières, « boundary regions », où sont souvent retrouvés des sites de fixation aux
facteurs de transcription CTCF (CCCTC-binding Factor).
Adaptée de http://blmoore.bitbucket.org/edbio et [Ong and Corces, 2014]
Figure 16 : Interactions chromosomiques
Représentation des différents niveaux d’organisation de la chromatine au sein du noyau. Les
repliements finement structurés et hiérarchisés de la chromatine permettent à des régions de
chromatine distantes d’interagir entre elles via la formation de boucles. On parle de contacts
intrachromosomiques, ou cis-interactions, lorsque deux régions d’un même chromosome
s’associent, et de contacts interchromosomiques, ou trans-interactions, lorsqu’il s’agit
d’association entre des loci situés sur des chromosomes différents.
Adaptée de [Crutchley et al., 2010]
Introduction
3.5.2 Domaines structuraux
Plus récemment, le développement des techniques d’études de la conformation de
la chromatine et plus particulièrement celui de la technique de Hi-C, ont montré que le
génome est segmenté en domaines topologiquement associés (TAD : Topologically
Associated Domains) (Figure 15) [Dixon et al., 2012; Hou et al., 2012; Nora et al., 2012;
Sexton et al., 2012].
Ces domaines physiques, de l’ordre de 1 mégabase (Mb) chez les mammifères,
sont définis par une multitude d’interactions chromatiniennes en leur sein. Les domaines
avoisinants partagent ainsi très peu d’interaction et sont distincts par des zones frontières.
Ces délimitations représenteraient des régions barrières, « boundary regions »,
comportant des éléments insulateurs comme la protéine CTCF (CCCTC-binding Factor)
et jouant un rôle de barrière à la propagation de l’hétérochromatisation (voir § B.3.2).
Ces domaines topologiques sont retrouvés de manière assez conservée entre
différentes espèces.
3.5.3 Interactions chromosomiques
L’organisation tri-dimensionnelle finement structurée et hiérarchisée de la chromatine
permet à des régions de chromatine distantes d’interagir entre elles via la formation de
boucles.
On parle de contacts intrachromosomiques, ou cis-interactions, lorsque deux régions
d’un même chromosome s’associent, et de contacts interchromosomiques, ou transinteractions, lorsqu’il s’agit d’association entre des loci situés sur des chromosomes
différents (Figure 16).
Ces rapprochements sont souvent observés au niveau de régions sensibles à la
DNAse I (DeoxyriboNuclease 1), plus communément nommées DHSs (DNase
HyperSensitive sites). L’accessibilité de l’ADN à l’endonucléase traduit une conformation
ouverte de la chromatine, à laquelle peuvent également venir se fixer des facteurs de
transcription, reflétant ainsi une éventuelle région transcriptionnellement active.
- 37 -
Figure 17 : Techniques 3C, 4C et 5C
Adaptée de [Noonan and McCallion, 2010]
Introduction
4 Techniques d’étude de la conformation de la chromatine
Depuis le début des années 2000, l’étude de l’organisation spatiale de la chromatine
a inspiré de nombreux groupes de recherche qui ont développés de nouvelles techniques
pour cartographier l’ensemble des interactions de la chromatine.
Ces méthodes dérivent toutes de la technique de capture de conformation de la
chromatine (3C : Chromosome Conformation Capture) décrite par Job Dekker en 2002
[Dekker et al., 2002]. La technique 3C a ensuite été perfectionnée avec différentes
technologies comme les puces à ADN ou le séquençage nouvelle génération afin
d’obtenir un grand nombre de données. Ces diverses variantes reposent toutes sur une
fixation chimique de cellules vivantes permettant de quantifier les fréquences de contact
entre fragments du génome.
4.1 La Technique 3C
La 3C est une technique de biologie moléculaire de haute résolution permettant
d’analyser l’organisation chromosomique de cellules à l’état naturel. Une librairie 3C est
obtenue à la suite de différentes étapes: (Figure 17 )
La première étape consiste à fixer des cellules intactes par incubation avec du
formaldéhyde. La conformation originelle de la chromatine est ainsi figée avec la
formation de pontages entre les loci qui étaient retrouvés à proximité dans l’espace
nucléaire. Un nombre important de cellules est utilisé afin d’analyser l’ensemble des
interactions possibles (㹼10 millions).
La chromatine cross-linkée est ensuite digérée pour ne garder que les fragments
d’ADN ayant formé une interaction. Ce clivage va libérer des petits fragments associés,
aux extrémités compatibles. Le choix de l’enzyme de restriction dépend de la taille du
locus analysé. On utilise fréquemment des enzymes clivant des séquences de 4 paires de
bases (pb) pour étudier des petits loci (<10–20 kb). Pour des loci plus grands, les
enzymes coupant des séquences de 6pb seront préférentiellement utilisées.
Les fragments chromatiniens digérés ayant interagi vont pouvoir être accolés suite à
une ligation. Cette étape est réalisée avec de faibles concentrations d’ADN pour favoriser
les liaisons intramoléculaires : liaisons entre les fragments de restriction cross-linkés.
Un reverse cross-link est ensuite effectué pour séparer les ponts fixés lors de la mise
en contact avec le formaldéhyde. Cette étape est réalisée par thermosensibilité et
déprotéinisation.
- 38 -
Introduction
L’ensemble des fragments linéaires d’ADN ainsi obtenus vont former une librairie 3C
contenant des séquences hybrides de tous les produits de ligation du génome de deux
segments de chromatine qui étaient proches in-vivo.
Les librairies 3C peuvent être analysées par PCR (Polymerase Chain Reaction)
classique ou PCR quantitative (PCRq) [Hagege et al., 2007] en plaçant des amorces au
niveau des sites de restriction des deux fragments chromatiniens dont on veut quantifier
l’interaction. La quantité du produit PCR reflète l’abondance du produit de ligation et donc
l’intensité d’interaction entre les deux régions chromatiniennes étudiées. Dans le cas de la
3C on étudiera donc un contact à la fois. La méthode est dite " one versus one " : analyse
d’une interaction entre un fragment avec un autre fragment.
Pour passer à des quantifications à plus grande échelle, des approches dérivées de
cette technique ont été développées.
4.2 La Technique 4C
La technique de Capture Circulaire de Conformation Chromosomique, 4C pour
Circular Chromosome Conformation Capture, permet d’analyser les interactions de
séquences d’ADN de tout le génome avec une séquence de choix [Simonis et al., 2006;
Zhao et al., 2006]. Ce fragment d’intérêt est nommé “bait” pour “cible”. Il peut en
particulier s’agir d’une région promotrice d’un gène pour en étudier les régulations à
longues distances. Cette approche suit les premières étapes de la 3C pour en obtenir des
librairies qui vont être transformées en librairies 4C suite à deux étapes supplémentaires.
Les produits de ligation 3C subissent une deuxième digestion enzymatique. Cette
digestion est réalisée avec des enzymes coupant plus fréquemment (site de restriction de
4pb). Des petits fragments avec des extrémités de restriction différentes du site de
restriction du milieu vont ainsi être obtenus. Ces fragments nouvellement digérés vont
être circularisés par une seconde ligation. Le pool de ces séquences d’ADN chimériques
circulaires va former la " librairie 4C " (Figure 17).
L’ensemble des fragments d’ADN capturés avec la séquence cible est amplifié par
PCR inverse en utilisant deux amorces divergentes dans le fragment de restriction
d’intérêt.
Ces régions inconnues ayant interagi avec la région d’attention peuvent être
identifiées par séquençage à haut débit.
- 39 -
Introduction
Une analyse de 4C-seq utilise généralement les trois modules suivants:
- Demutliplexing: Ce premier module permet de séparer les lectures par groupe
d’amorces lorsque plusieurs points de vue ont été multiplexés lors du séquençage. Le
barcode est ainsi retiré.
- Mapping: Ce module sert à aligner les séquences lues sur le génome de référence. Il
utilise les fichiers d’alignements ainsi que des fichiers de densité de lecture par position le
long du génome.
- 4C-seq: A partir des alignements, ce dernier module génère une librairie de fragments si
celle-ci n’existe pas. Il calcule les scores au niveau des fragments (+ normalisation des
données) et retourne les clusters de fragments positifs (via une analyse de
domainograms) afin d’identifier et quantifier les régions ayant interagi avec le domaine
d’intérêt choisi.
Cette approche est dite " one versus all " : analyse des interactions d’un fragment
chromatinien avec l’ensemble du génome.
4.3 La Technique 5C
La technique de copie conforme de 3C, 5C pour Chromosome Conformation
Capture Carbon Copy, est une adaptation à haut débit de la 3C qui permet de mesurer en
parallèle des milliers d’interactions chromatiniennes [Dostie et al., 2006]. Les librairies 3C
sont converties en librairies 5C par trois étapes supplémentaires (Figure 17).
Dans un premier temps, les fragments de ligation de la librairie 3C sont hybridés à
un mélange d’oligonucléotides recouvrant l’ensemble des régions d’étude. Les amorces
5C sont composées de 30pb spécifiquement complémentaires d’une extrémité d’un site
de restriction d’un fragment, auxquelles est ajoutée une queue universelle de 23 à 30pb.
Une phosphorylation est également ajoutée à l’extrémité 3’ soit des amorces sens soit
des amorces anti-sens.
A la suite de cette hybridation, les amorces sens et anti-sens vont se retrouver en
tête à tête et ainsi pouvoir s’apparier lors d’une étape de ligation.
Pour finir, en réalisant une amplification avec deux amorces universelles
complémentaires des queues ajoutées aux amorces 5C, l’ensemble des produits de
ligation de la librairie 3C va pouvoir être amplifié. Les librairies 5C obtenues pourront,
entre autre, être analysée par séquençage nouvelle génération (next-generation
sequencing, NGS) [Fraser et al., 2012].
Cette variante permettant l’analyse de nombreux fragments chromatiniens les uns
avec les autres est dite " many versus many ".
- 40 -
Figure 18 : Technique Hi-C
Adaptée de [van Berkum et al., 2010]
Introduction
4.4 Hi-C
La technique de Hi-C, autre version haut débit dérivée de la 3C, permet de mesurer
l’ensemble des interactions chromatiniennes du génome entier [Lieberman-Aiden et al.,
2009]. Lors de cette méthode, la réalisation des librairies 3C varie légèrement après
l’étape de digestion : les extrémités cohésives sont comblées et un résidu biotinylé est
ajouté. Une librairie Hi-C est obtenue en fragmentant l’ADN afin d’en isoler les fragments
biotinylés avec des billes de streptavidine. Les librairies sont ensuite analysées par
séquençage haut débit après ajout d’adaptateurs " paired ends " (Figure 18).
Cette approche permet ainsi, en une expérience, d’identifier l’ensemble des
contacts chromatiniens d’un noyau. Elle est dite " all versus all " : "tout le génome avec
tout le génome". Les données Hi-C, de par leurs faibles résolutions (㹼20 à 100 kb),
permettent uniquement d’apporter une vue globale de l’ensemble des contacts
chromatiniens d’un génome.
De nouvelles adaptations, très récemment décrites, permettent d’analyser avec une
encore meilleure résolution l’ensemble des interactions de plusieurs centaines de loci en
une analyse. Parmi ces approches, dites " many versus all ", nous pouvons citer la
technique de Capture-C [Hughes et al., 2014] et la technique T2C (Targeted Chromatin
Capture) [Kolovos et al., 2014].
Nous pourrons également citer d’autres variantes de la 3C couplées aux technologies
ChIP qui ont été utilisées pour quelques études spécifiques : le ChIP-loop [Horike et al.,
2005; Cai et al., 2006; Kumar et al., 2007], et sa version haut débit : le ChIA-PET
(Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing), qui permet d’identifier
toutes les interactions chromatiniennes associées à une protéine donnée. Des études ont
en particulier été réalisées avec le récepteur des œstrogènes alpha (ER-Į) [Fullwood et
al., 2009] et la protéine CTCF [Handoko et al., 2011].
- 41 -
Introduction
B. Régulation transcriptionnelle des gènes
L’ensemble des cellules d’un organisme renferme le même patrimoine génétique. Il
existe une grande hétérogénéité dans la taille des gènes. Les plus petits couvrent à peine
quelques milliers de nucléotides, alors qu’à l'extrême, on trouve de très grands gènes qui
s'étendent sur plus de 2 millions de nucléotides.
Leur spécificité dépend de l’expression génique qui est soumise à une régulation spatiotemporelle très stricte. L’activation d’un gène va donc dépendre du type cellulaire, du
stade de développement et/ou de sollicitations physiologiques particulières. Ainsi, au sein
d’une cellule à un moment t, on peut retrouver des gènes réprimés, des gènes fortement
transcrits ou encore des gènes " en pause ", prêts à être exprimés. Ces différents niveaux
d’expression vont dépendre de l’état transcriptionnel du gène qui est soumis à différentes
régulations. L’étape cruciale dans le choix des gènes à transcrire a lieu lors du
recrutement de la machinerie transcriptionnelle de base qui permet l’initiation de cette
transcription. Lors de cette initiation de nouvelles régulations vont intervenir pour moduler
les conditions et niveaux de transcription. Ces variations reposent sur l’intervention de
différents facteurs et co-régulateurs transcriptionnels.
1 Les facteurs de transcription
Les facteurs de transcription (FTs) sont des protéines nucléaires capables de se lier
à des courtes séquences d’ADN, de 5 à 30 nucléotides, pour moduler l’activité d’un gène.
On parle de protéines trans-régulatrices se liant à des séquences cis-régulatrices. Cette
fixation est possible grâce à leur structure qui comprend un domaine de liaison à l’ADN,
aussi nommé DBD pour DNA Binding Domain. En plus de ce domaine, les FTs possèdent
un domaine effecteur, permettant de réguler l’expression des gènes, et souvent un
domaine d’interaction avec d’autres ligands.
On distingue deux types de FTs : les facteurs généraux de transcription, qui, en se
liant au niveau des séquences promotrices minimales d’un gène, vont permettre la mise
en place du complexe d’initiation de la transcription [Reese, 2003]; et les facteurs
spécifiques de la transcription qui se lient à des régions distales et interviennent le plus
souvent pour répondre à un besoin cellulaire. Ces facteurs peuvent être classés en
différentes familles selon la structure tridimensionnelle de leur motif de liaison à l’ADN
[Vaquerizas et al., 2009]. La majorité de ces motifs possède une hélice Į qui s’insère
dans le grand sillon de la double hélice d’ADN.
- 42 -
Figure 19 : Représentations schématiques des principaux motifs de liaison à l’ADN
Adaptée de Principles of Cell Biology (BIOL2060)
Figure 20 : Structure de l’ARN Pol II
A- Représentation schématique de la disposition des sous-unités Rbp1 à Rbp12 de l’ARN Pol II, chaque
sous-unité étant représentée par une couleur.
B- Modélisation tri-dimensionnelle de la structure de l’ARN Pol II suivant le même code couleur.
Adaptée de [Cramer et al., 2001].
Introduction
Les domaines de fixation à l’ADN les plus fréquemment retrouvés sont : (Figure 19)
- Le motif Hélice-Tour-Hélice : Ce motif, aussi appelé "homéodomaine" ou "Helix-TurnHelix" (HTH), reconnait plus particulièrement des séquences d’ADN riches en A et T
[Aravind et al., 2005]. Les FTs de la famille des gènes Hox contiennent un domaine de ce
type. Une variante de ce motif, dite “hélice ailée” ou “winged-helix” de part sa structure
composée de trois hélices et deux grandes boucles est retrouvée chez les protéines FOX
(Forkhead box).
- Le motif en doigts de zinc : Ce domaine, en forme de pince et chargé positivement par
les éléments zinc, est particulièrement retrouvé chez les facteurs généraux de
transcription et les récepteurs nucléaires [Klug and Schwabe, 1995].
- Le motif leucine zipper : Les "fermetures éclair à leucine" sont constituées par un
enroulement de deux hélices Į maintenues par des ponts entre leurs leucines. Les
protéines possédant ce motif, comme les FTs des familles Fos et Jun, se lient de manière
préférentielle à des séquences riches en G et C [Miller, 2009].
- Le motif Hélice-Boucle-Hélice : Le motif "Helix-Loop-Helix" (HLH), est formé par une
longue et une courte hélice reliées entre elles par une boucle. Ces domaines sont
principalement retrouvés sur des FTs impliqués dans les processus développementaux
[Massari and Murre, 2000].
2
Régulation proximale
2.1 Mise en place de la machinerie transcriptionnelle
La transcription d’un gène commence au niveau d’un site d’initiation qui, par
convention, est appelé +1 ou TSS (Transcription Start Site). Cette réaction débute par la
mise en place du complexe d’initiation de la transcription PIC (PreInitiation Complex), au
niveau du promoteur proximal [Sikorski and Buratowski, 2009; Thomas and Chiang, 2006].
Le PIC, composé de l’ARN polymérase II (ARN Pol II) et des facteurs généraux de
la transcription, forme un complexe multiprotéique de 44 protéines pour une masse
moléculaire (MM) d’environ 2,2 MDa [Martinez, 2002]. L’ARN Pol II est l’enzyme
permettant la synthèse de l’ARN à partir de l’ADN. Elle est formée de 12 sous-unités,
Rpb1 à Rpb12, avec une MM de 550kDa (Figure 20).
- 43 -
TAFs
TFIID
TBP
1
IB
+1
TFI
TFIIA
TAFs
TBP
2
+1
ARN Pol
II
TFIIF
TBP
TFIIA
TFI
3
IB
TAFs
+1
TFIIA
TFI
4
TBP
IB
TAFs
ARN Pol
II
TFIIF
+1
TF
IIE
5
TFIIA
TFI
TBP
IB
TAFs
TFIIH
ARN Pol
II
TFIIF
TF
IIE
+1
TFIIH
Figure 21 : Illustration de l’assemblage du complexe de pré-initiation de la transcription (PIC)
Les différentes étapes de la mise en place de la machinerie transcriptionnelle :
1- Le FT général TFIID débute la formation du PIC en se liant à l’ADN via sa sous unité TBP
reconnaissant spécifiquement la boîte TATA.
2- La fixation de TFIID permet le recrutement des FTs généraux TFIIA et TFIIB.
3- L’ARN Pol II est incorporée à ce pré-complexe en association avec TFIIF.
4- Les FTs généraux TFIIE et TFIIH sont enfin recrutés.
5- Le complexe PIC est mis en place et grâce aux activités hélicases et kinases des différents FTs
généraux, l’ARN Pol II va pouvoir débuter la transcription.
Introduction
Les sous-unités sont classées en fonction de cette masse moléculaire . La plus
grande sous-unité étant Rpb1 avec une MM de 220kDa et Rpb12 est la plus petite avec
une MM de 12kDa. Rpb1 est caractérisée par un domaine sur son extrémité C-terminale
(CTD : Carboxy-Terminal Domain) qui comporte une répétition (52 fois chez l’homme) de
l’heptapeptide : Tyrosine-Sérine-Proline-Thréonine-Sérine-Proline-Sérine [Corden et al.,
1985].
Les FTs généraux sont au nombre de six : TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH.
Ils permettent de distinguer le site d’initiation de la transcription en se positionnant au
niveau de séquences spécifiques du promoteur, à plus ou moins 50pb du TSS, et ainsi
recruter l’ARN Pol II pour qu’elle transcrive le gène d’intérêt.
Le recrutement du complexe PIC au niveau des séquences promotrices débute par
la fixation de TFIID sur une séquence spécifique nommée boîte TATA via sa sous-unité
TBP (TATA-box Binding Protein) (Figure 21). Cette fixation est renforcée par une dizaine
de sous-unités TAFs (TBP Associated Factors) [Green, 2000] qui sont associées à TBP et
se lient à d’autres séquences spécifiques du promoteur, comme les éléments Inr et DPE
[Kaufmann and Smale, 1994; Lee et al., 2005]. L’ancrage de la sous-unité TBP de TFIID
au niveau de la boîte TATA engendre une courbure de l’ADN qui va rendre le complexe
PIC plus compact et faciliter l’ouverture de l’ADN [Burley and Roeder, 1996].
L’ajout de TFIIA au côté de TFIID continue d’augmenter la stabilité et permet
d’empêcher l’accès d’inhibiteurs [Pugh, 2000].
TDIIB est ensuite recruté au niveau du site BRE (TFIIB Responsive Element)
[Buratowski and Zhou, 1993] et favorise l’incorporation de l’ARN Pol II au complexe.
Celle-ci est transportée et positionnée par TFIIF [Tan et al., 1995]. A ce stade, le
complexe reste toujours instable de par la conformation en double hélice de l’ADN.
Le recrutement de TFIIE puis TFIIH en aval de l’ARN Pol II va permettre l’ouverture
de l’ADN. Cette action est réalisée grâce aux activités hélicase ATP-dépendantes de
TFIIH et TFIIF [Kim et al., 2000]. TFIIE intervient en moulant les activités de TFIIH. De par
son activité kinase TFIIH va phosphoryler le domaine CTD de l’ARN Pol II qui va alors
être libérée du PIC et démarrer la transcription [Boeing et al., 2010; Hirose and Ohkuma,
2007].
L’assemblage du complexe PIC ainsi que l’initiation de la transcription nécessite
également la présence du complexe médiateur.
- 44 -
Figure 22 : Schéma de la structure modulaire du complexe Médiateur humain
La structure multiprotéique du complexe médiateur est divisée en quatre modules. Les modules tête,
milieu et queue composent la partie appelée "core". Le quatrième module est caractérisé par son activité
kinase, il est souvent également nommé "CDK8".
Adaptée de [Malik and Roeder, 2010]
Figure 23 : Principaux éléments d’un promoteur eucaryote
Représentation des positions et des motifs consensus des différents éléments de base pouvant constituer
un promoteur minimal eucaryote. Ces sites sont reconnus par les différentes composantes du complexe
de pré-initiation de la transcription. Le motif Inr n’a pas de séquence spécifique.
BRE : TFIIB Recognition Element, u: upstream, d: downstream ; DCE : Downstream Core Element ; DPE
: Downstream Promoter Element ; Inr : Initiator ; MTE : Motif Ten Element.
Adaptée de [Lenhard et al., 2012]
Introduction
2.2 Complexe Médiateur
Le complexe médiateur, identifié en 1990 [Kelleher et al., 1990], est une structure
multiprotéique ultra conservée chez les eucaryotes [Boube et al., 2002; Bourbon, 2008].
Il est constitué de nombreuses sous-unités et se présente sous la forme d’une
structure divisée en quatre modules (Figure 22): un module "tête", un module "milieu" et
un module "queue" composant tous les trois le complexe "core". A ce complexe s’ajoute le
module à activité kinase "CDK8". Le module tête est particulièrement impliqué dans les
interactions directes avec l’ARN Pol II. Le module queue intervient plutôt dans les
associations avec les FTs et le module milieu a, quant à lui, un rôle de transmission du
signal effecteur [Casamassimi and Napoli, 2007].
Le médiateur joue un rôle important dans l’assemblage du complexe PIC. Il
intervient dans la régulation de la transcription des gènes en tant que co-régulateur en
s’associant avec les FTs spécifiques ou des facteurs de remodelage de la chromatine
[Malik and Roeder, 2010; Ries and Meisterernst, 2011].
La forte implication de ce complexe dans l’initiation de la transcription n’est pour
autant pas son unique rôle. Le médiateur intervient également dans de nombreuses
autres fonctions, tels que les processus développementaux, la différentiation et la
prolifération cellulaires ou encore les mécanismes de réparation de l’ADN [Casamassimi
and Napoli, 2007; Eyboulet et al. 2013].
2.3 Eléments du promoteur minimal
La transcription dépend donc d’une bonne mise en place du complexe PIC en
amont du gène à transcrire. Ce recrutement est possible grâce à des séquences d’ADN
spécifiques présentes sur une région appelée "promoteur". Les principaux éléments de
base reconnus par les FTs généraux définissent un promoteur minimal.
La séquence promotrice correspond à une région non transcrite d’ADN qui s’étend
sur environ 100pb autour du TSS. Les principales "boîtes" régulatrices retrouvées chez
les promoteurs eucaryotes sont : (Figure 23)
- La boîte TATA (TATA box), ou encore boîte Goldberg-Hogness (du nom de ses
découvreurs en 1979), porte un motif conservé thymine-adénine-thymine-adénineadénine-adénine (TATAAA). Cette séquence se situe à une trentaine de paires de base
en amont du TSS et est reconnue par la protéine TBP de TFIID.
- L’élément Inr (Initiator) est localisé autour du TSS (des nucléotides -4 à +3). Il est
beaucoup moins conservé que la boîte TATA et suit une séquence de type YYANWYY,
où Y = C ou T et N = A, C, G, T.
- 45 -
Figure 24 : Types de promoteur
Illustrations des deux grands types de promoteurs eucaryotes :
A- Les promoteurs de type concentré possèdent une boîte TATA et/ou un élément Inr, et un TSS bien
déterminé et unique.
B- Les promoteurs de type dispersé ne contiennent ni boîte TATA ni séquence Inr. Ils possèdent de
nombreux ilôts CpG et plusieurs TSS générant des transcrits de différentes tailles.
Inr : Initiator ; TSS: Transcription Start Site ; UTR: UnTranslated Region
Adaptée de [Sandelin et al., 2007]
Introduction
Ce motif permet le recrutement de TFIID par la reconnaissance de deux de ces sousunités TAFs [Chalkley and Verrijzer, 1999; Kaufmann and Smale, 1994].
- La séquence DPE (Downstream Promoter Element) est localisée à une trentaine
de paires de bases en aval du TSS, elle est symétrique à la boîte TATA [Juven-Gershon
et al., 2008]. Son motif est faiblement conservé et lie également TFIID via des sous-unités
TAFs [Burke and Kadonaga, 1997]. Ce motif est souvent retrouvé en absence de boîte
TATA [Kadonaga, 2002].
- Les motifs BRE (TFIIB Recognition Element), riches en CG, sont spécifiquement
reconnus par TFIIB. Ils sont retrouvés en amont (BREu pour "upstream") et en aval
(BREd pour "downstream") de la boîte TATA avec laquelle ils agissent [Deng and Roberts,
2006; Lagrange et al., 1998].
- L’élément MTE (Motif Ten Element) décrit plus récemment, est situé à proximité
en amont du DPE [Lim et al., 2004a]. Il lie les sous-unités TAF6 et TAF9 de TFIID
[Theisen et al., 2010].
- Les séquences DCE (Downstream Core Element), au nombre de trois sont situées
en aval du TSS et reconnues par TFIID via la sous-unité TAF1 [Lee et al., 2005].
- Les îlots CpG sont retrouvés dans plus de 50% des promoteurs humains et sont
associés à la méthylation (voir § A.2.1.1).
2.4 Types de promoteur
L’expression génique va dépendre de la constitution en éléments régulateurs du
promoteur minimal portant un ou plusieurs motifs [Juven-Gershon and Kadonaga, 2010].
La boîte TATA et l’élément Inr peuvent agir indépendamment en tant que séquence
promotrice ou peuvent fonctionner de pair. De ce fait, les promoteurs peuvent posséder
une boîte TATA seule (㹼8% des promoteurs humains), un motif Inr seul (㹼 30%), les
deux éléments (㹼 15%) ou aucun des deux motifs (㹼 46%) [Yang et al., 2007]. Les
promoteurs ne comportant ni boîte TATA ni motif Inr ne démarrent pas la transcription en
un site unique mais possèdent de nombreux TSS.
On peut ainsi distinguer deux types de promoteurs : (Figure 24)
- Les promoteurs de type concentré (sharp type promoter) sont composés d’une boîte
TATA et/ou un élément Inr, et possèdent un TSS bien déterminé et unique. Ce type de
promoteur est majoritairement retrouvé pour des gènes ayant une expression tissuspécifique ou impliqués dans un contexte physiologique donné [Schug et al., 2005].
- Les promoteurs de type dispersé (broad type promoter) ne contiennent ni boîte TATA
ni séquence Inr. Ils sont riches en di-nucléotides CpG et possèdent de nombreux TSS
- 46 -
Figure 25 : Cis- et trans-régulations
La machinerie transcriptionnelle de base est représentée avec en vert les facteurs de transcription
généraux, en saumon l’ARN Pol II et le complexe co-activateur, médiateur, en jaune.
Les facteurs de transcription spécifiques se fixent à des séquences cis régulatrices (bleu foncé) et vont
pouvoir interagir avec la machinerie transcriptionnelle de base grâce à la formation d’une boucle d’ADN.
Les facteurs trans-régulateurs peuvent soit activer la transcription (rouge) ou l’inhiber (bleu clair).
Adaptée de Biology 1081 Exam 3 - StudyBlue
Introduction
répartis sur une centaine de paires de bases. Ils initient ainsi la génération de transcrits
de différentes tailles [Carninci et al., 2006]. Cette organisation est préférentiellement
retrouvée pour les gènes ayant une expression ubiquitaire comme les gènes de ménage,
housekeeping genes, ou encore pour des gènes ayant des profils d’expression complexes.
3 Régulation Distale
La mise en place de la machinerie transcriptionnelle est essentielle à l’initiation de la
transcription mais les FTs généraux seuls ne suffisent pas à moduler le niveau de
transcription.
Cette régulation peut dépendre de l’intervention de différents éléments régulateurs.
Des FTs spécifiques vont en particulier s’associer aux FTs généraux pour amplifier ou
réprimer la transcription d’un gène. Ces FTs n’agissent généralement pas seuls, ils se
retrouvent au sein de modules cis-régulateurs (CRMs) regroupant de nombreuses
séquences régulatrices liant ces facteurs. On trouve également des régions dites
"insulatrices" qui vont isoler des régions d’ADN à certaines régulations. De plus, ces FTs
opèrent régulièrement en association avec des co-facteurs.
La transcription peut également être modulée par d’autres éléments comme des ARN
non codants, des régulateurs leurres ou des mécanismes mettant en pause l’ARN Pol II.
L’ensemble de ces processus dépendra de la nécessité à activer ou non un gène en
fonction de différents stimuli répondants aux besoins de la cellule. Les facteurs
intervenant dans cette régulation sont eux-mêmes régulés par des voies de signalisations
complexes.
3.1 Cis- et Trans-régulateurs
Les FTs spécifiques se lient à des séquences cis-régulatrices, pouvant être proches
du promoteur, situées dans des introns, ou distantes de plusieurs milliers de paires de
bases du +1 de leur gène cible (Figure 25). Plus rarement, ils peuvent même se fixer sur
des régions présentes sur un chromosome différent de celui du gène à réguler. Dans ce
cas, on parle de séquences trans-régulatrices [Williams et al., 2010].
Lorsque la séquence régulatrice permet une activation de la transcription, elle est
définie comme une région "enhancer" (de l’anglais " amplificateur "). A l’inverse, quand
elle diminue l’expression d’un gène, c’est une région dite "silencer" (de l’anglais
"répresseur"). Du fait de l’identification de peu de silencers, le terme enhancer a été
généralisé pour décrire une séquence régulatrice.
- 47 -
Introduction
Ces séquences ne dépendent pas d’une orientation spécifique. On peut aussi bien
les trouver en amont ou en aval du gène quelles régulent.
En fonction de la séquence sur laquelle ils se fixent, les FTs peuvent avoir un rôle
d’activateur ou de répresseur.
Les activateurs jouent un rôle primordial dans l’expression des gènes, suivant des
signaux internes ou externes à la cellule, ils vont se lier sur des séquences spécifiques
pour moduler le taux de transcription et répondre à un besoin cellulaire.
Ils peuvent intervenir à différents niveaux : certains FTs sont directement impliqués
dans la mise en place de la machinerie transcriptionnelle de base. Ils interagissent, via
leurs domaines effecteurs TADs (Trans-Activation Domain), avec les FTs généraux ou
avec des co-régulateurs, comme le complexe médiateur, qui permettent la transduction
des signaux. D’autres FTs vont également intervenir au moment de l’initiation de la
transcription en favorisant l’ouverture de la chromatine pour faciliter l’accès des éléments
formant le PIC. Pour cela, ils vont recruter des molécules co-activatrices telles que les
enzymes de modification (ex :HAT) ou complexes de remodelage (ex : SWI/SNF) de la
chromatine (voir § A.2).
Les co-régulateurs recrutés par les FTs ont ainsi un rôle de médiateur de la
transcription. Ils font le lien entre les FTs et la machinerie transcriptionnelle. Ces cofacteurs sont le plus souvent agencés en complexes multi-protéiques et ne se lient pas
directement à l’ADN [Naar et al., 2001].
Les répresseurs peuvent quant à eux inhiber la transcription selon trois modes de
fonctionnement principaux.
Ils peuvent induire la modification de la structure de la chromatine pour rendre des
séquences d’ADN moins accessibles, ce mécanisme à en particulier été décrit avec la
protéine Mecp2 dans le syndrome de Rett [Horike et al., 2005]. Cette action nécessite
également le recrutement de co-régulateurs répressifs.
Les facteurs inhibiteurs peuvent interagir directement avec les FTs généraux ou
les co-activateurs pour réprimer leurs activités, le FT HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1)
agit de cette manière sur différents facteurs [van Rechem et al., 2010].
Pour finir, ils peuvent réprimer la transcription en se fixant sur des séquences
régulatrices communes ou chevauchantes celles d’activateurs, c’est par exemple le mode
de fonctionnement du répresseur ICER (Inducible cAMP early repressor) [Favre et al.,
2011].
- 48 -
Figure 26 : Modèles de mécanismes d’actions des régulateurs situés à distance d’un promoteur
Modes de communication employés par les éléments régulateurs à distance du promoteur qu’ils doivent
réguler.
A- Le "looping model " : les éléments régulateurs entrent directement en contact avec les régions
promotrices pour réguler un gène donné. Cette interaction est possible par la formation d’une boucle
d’ADN. C’est certainement le mode qui prédomine.
B- Le "tracking model ", aussi appelé "scanning model " : un transfert de l’information de régulation est
transmis le long de la chromatine jusqu’à atteindre le promoteur du gène à réguler.
C- Le "linking model " : un pont de protéines permet de transmettre le signal de régulation de l’élément
régulateur au promoteur ciblé.
Adaptée de [Bulger and Groudine, 2002]
Introduction
Voici quelques exemples de couples séquences régulatrices / FTs associés,
retrouvés assez fréquemment dans la régulation génique :
- La boîte CCAAT qui est reconnue par les activateurs transcriptionnels C/EBP
(CCAAT/Enhancer Binding Protein) et CTF (CCAAT binding Transcription Factor).
- Les boîtes GC qui lient les facteurs Sp1.
- Les séquences CRE (cAMP Response Elements) liant les facteurs CREB
(cAMP Response Elements Binding Protein) qui peuvent à leur tour recruter les protéines
co-activatrices CBP (CREB Binding Protein) et p300.
A noter, qu’un facteur de régulation, en fonction du complexe de régulation dans
lequel il est engagé, peut dans certains cas avoir un rôle d’activateur et dans d’autres cas
intervenir en tant que répresseur. Du reste, il est plutôt rare que les FTs interviennent seul.
On les retrouve majoritairement dans des modules cis-régulateurs (CRM). Les
CRM sont des régions d’ADN non codantes associées à la régulation d’un ou plusieurs
gènes. Ils sont constitués de nombreux sites de fixation pour différents FTs, aussi bien
activateurs qu’inhibiteurs [Nelson and Wardle, 2013].
Les longues distances pouvant séparer un élément régulateur de son promoteur
(des centaines de kb voire quelques Mb) ont depuis des années soulevé des
interrogations sur les mécanismes de communication employés. Plusieurs modèles ont
été proposés [Petrascheck et al., 2005]: (Figure 26)
- Le "tracking model ", aussi appelé "scanning model ", repose sur un transfert du signal
de régulation le long de la chromatine jusqu’au promoteur du gène à réguler.
- Le "linking model " dans lequel la communication entre l’élément régulateur et le
promoteur cible est réalisée par un pont de protéines véhiculant le signal de régulation
jusqu’au promoteur.
- Le "looping model " qui grâce à la formation d’une boucle d’ADN permet aux éléments
de régulation d’interagir directement au niveau des séquences promotrices. C’est ce
modèle qui est le plus décrit.
- 49 -
Figure 27 : Modes d’action des insulateurs
Les insulateurs, pour assurer une bonne régulation des gènes, peuvent agir selon deux modes.
A- Ils peuvent empêcher l’activité d’un enhancer uniquement s’ils sont positionnés entre l’enhancer et le
gène à réguler.
B- Et/ou ils peuvent avoir un rôle de protection pour l’activation d’un gène, en faisant barrière à la
propagation de l’hétérochromatine : marque répressive à la transcription.
Adaptée de http://www.ijm.fr/recherche/equipes/domaines-chromatiniens-replication
Introduction
3.2 Régions insulatrices
Les insulateurs sont des séquences d’ADN qui s’assurent que l’action d’un
enhancer sur son gène cible est bien restreinte à ce gène [Wallace and Felsenfeld, 2007].
Ces régions évitent les régulations inappropriées en compartimentant les gènes
dans des domaines transcriptionnellement indépendants.
Ils peuvent être distingués en deux types selon leur mode d’action : certains
insulateurs interfèrent les interactions entre un enhancer et sa cible alors que d’autres
agissent en bloquant la propagation de l’hétérochromatine [Burgess-Beusse et al., 2002].
Les enhancer-blocking insulators définissent les insulateurs ayant la capacité à
bloquer l’action d’enhancers (Figure 27). Ces éléments régulateurs, lorsqu’ils se trouvent
situés entre un enhancer et le promoteur qu’il régule, empêchent ces deux régions de
communiquer entre elles. Cette interférence peut s’expliquer soit par un effet physique de
barrière de l’insulateur ou par la formation de boucles de chromatine qui isolent l’enhancer
de sa cible.
Les insulateurs barrières vont permettre de délimiter des domaines de
chromatine active et inactive. Ils ont un rôle de protection contre la propagation de
marques répressives de l’hétérochromatine. Cette délimitation forme des frontières,
boundaries, et établie la mise en place de domaines chromatiniens aux activités
transcriptionnelles opposées (voir § A.3.5). En effet, ce type d’insulateur est
particulièrement retrouvé à la limite entre des domaines portant des marques d’activation
d’un côté et de répression de l’autre [Cuddapah et al., 2009].
Les insulateurs interviennent également dans la régulation de la transcription en
permettant le recrutement d’enhancer au niveau de leur promoteur cible. Il a aussi été
montré que les insulateurs contribuent à d’autres processus nucléaires. Ils jouent en
particulier un rôle dans la régulation de la recombinaison V (D) J [Yang and Corces,
2012].
Une même protéine insulatrice peut remplir toutes ces fonctions. Chez les vertébrés,
le facteur majoritairement rencontré dans ce type de régulation est la protéine CTCF [Bell
et al., 1999]. CTCF est un facteur de transcription ubiquitaire composé d’un grand
domaine de liaison à l’ADN formé par 11 doigts de zinc. De très nombreux sites de
fixation de cette protéine ont été trouvés proches de promoteurs, de clusters de gènes corégulés ou au niveau de domaines chromatiniens [Xie et al., 2007].
- 50 -
Figure 28 : Origine génomique des lncRNA
Les lncRNA peuvent être différenciés en fonction de leur localisation par rapport à une région codante
d’un gène. Ainsi on retrouve des lncRNA : A- Intergéniques : non situés près d’une région codante. BSens : chevauchant dans le même sens qu’une région codante. C- Antisens : chevauchant un gène mais
dans le sens opposé. D- Divergents : en antisens à moins de 1000pb du promoteur d’un gène. EIntroniques : situés dans un intron.
Adaptée de http://mcmanuslab.ucsf.edu
Introduction
Une organisation particulière est retrouvée autour de ces sites avec un
positionnement des nucléosomes très bien arrangé. Un site est entouré de part et d’autre
par 10 nucléosomes espacés exactement de la même manière et particulièrement
enrichis par le variant d’histone H2A.Z [Fu et al., 2008].
Le facteur CTCF semble
fonctionner en lien étroit avec un co-facteur : la cohésine [Wendt et al., 2008]. La
cohésine est un complexe multiprotéique, constituée des sous-unités SMC1 (Structural
Maintenance of Chromosomes), SMC3, Rad21 et STAG, qui forment un grand anneau
[Chien et al., 2011].
A noter, que les activités insulatrices ne sont pas les seules fonctions de la protéine
CTCF. Celle-ci peut par exemple, intervenir également en tant que protéine activatrice ou
inhibitrice [Phillips and Corces, 2009].
4 Autres types de régulation
Outre ces facteurs et processus de régulation déjà bien établis, des études plus
récentes ont décrit de nouveaux mécanismes de régulation de la transcription comme
l’intervention de longs ARN non codants, l’action de pause de l’ARN Pol II et le rôle de
shadow enhancers et de super-enhancers.
4.1 Longs ARN non codants
Malgré l’importance de la part des régions non codantes dans le génome (㹼98.5%
du génome humain), elles ont longtemps été délaissées, considérées comme de l’ADN
"poubelle" n’ayant aucune utilité. Il a maintenant été clairement établi qu’un bon nombre
de ces régions joue un rôle primordial dans divers processus cellulaires.
Les ARN non codants correspondent à des séquences d’ADN transcrites mais qui
ne sont pas traduites en protéines. Ces ARN sont divisés en deux classes selon leur
taille : les petits ARN de moins de 200 nucléotides qui sont en majorité impliqués dans les
mécanismes post-transcriptionnels. Et les ARN de plus de 200 nucléotides qui font partie
des longs ARN non codants (lncRNA : long non-coding RNA). Ils peuvent être séparés en
différentes classes selon leur origine génomique. Les lncRNA peuvent provenir de régions
intergéniques, de portions de gène ou de la région 3’ en sens ou anti-sens de ce gène, de
régions introniques ou de régions à moins de 1000pb d’un promoteur où ils seront
transcrits en sens inverse de ce gène ils sont dans ce cas nommés "divergents" [Rinn and
Chang, 2012] (Figure 28).
- 51 -
Figure 29 : Mode d’action des lncRNA
Les lncRNA peuvent agir de différentes manières. Ils peuvent servir de:
A- Leurre : en s’associant à des régulateurs transcriptionnels, ils les empêchent de se lier à l’ADN.
B- Echafaudage: en formant des complexes protéiques, ils permettent le recrutement de protéines
régulatrices n’ayant pas de domaine d’interaction, qui pourront alors interférer sur la transcription.
C- Guide: en recrutant des facteurs de régulation de la transcription pour les conduire et permettre leur
ancrage au niveau de régions promotrices.
D- Enhancer: en cis ou en trans, en interagissant directement avec des facteurs de transcription pour
moduler la transcription.
Adaptée de [Wang and Chang, 2011]
Introduction
Les lncRNA sont impliqués dans différentes fonctions. Leurs rôles ont été décrits au
niveau de régulations épigénétiques, transcriptionnelles et post-transcriptionnelles [Wilusz
et al., 2009]. Pour ce qui est de la régulation de l’expression génique, ils interviennent
majoritairement selon quatre modes : (Figure 29)
- Rôle de leurre (decoy) où ils s’associent avec des régulateurs transcriptionnels pour les
empêcher de se lier à l’ADN.
- Rôle d’échafaudage (scaffold) où ils forment des complexes protéiques afin de
rapprocher des protéines régulatrices n’ayant pas de domaine d’interaction mais qui
combinées pourront interférer sur la transcription [Spitale et al., 2011].
- Rôle de guide, où ils recrutent des facteurs de régulation de la transcription pour les
conduire et permettre leur ancrage au niveau de régions promotrices. Des complexes
modifiant la chromatine sont en particulier recrutés de cette manière [Costa, 2008].
- Rôle d’enhancer, en cis ou en trans, où ils interagissent directement avec des facteurs
de transcription pour moduler la transcription [Orom and Shiekhattar, 2011]. De la même
manière que pour les enhancer classiques, la formation de boucles de chromatine, pour
rapprocher les éléments régulateurs de leur promoteur cible, pourra être retrouvée.
4.2 ARN Pol II en pause (" paused Polymerase ")
La transcription peut ne pas être régulée au moment de l’initiation mais juste après
en début d’élongation. En effet, des études ont montré la présence de l’ARN Pol II au
niveau du promoteur de 10 à 30% de gènes inactifs [Core et al., 2008; Levine, 2011]. Ces
gènes inactifs ont bien recruté le complexe PIC, la transcription a démarré et l’ARN Pol II
s’est arrêtée après avoir transcrit une quarantaine de nucléotides. Elle est dite en "pause",
paused polymerase. La transcription va alors être régulée en fonction du redémarrage de
l’ARN Pol II. L’ARN Pol II s’arrête au niveau d’une séquence spécifique sur le motif PB
(paused button). Elle est maintenue en pause via l’intervention des protéines NELF
(Negative Elongation Factor) et DSIF (DRB sensitivity-inducing factor) [Yamaguchi et al.,
2013]. L’action serait levée suite à un signal permettant le recrutement de la protéine PTEFb (Positive Transcription Elongation Factor b) qui via son activité kinase va permettre
de redémarrer l’élongation de la transcription. P-TEFb agit en phosphorylant la sérine 2
du CTD de l’ARN Pol. Elle phosphoryle également l’extrémité C-terminale de DSIF qui va
alors activer l’élongation au lieu de la réprimer, et NELF qui va lui se dissocier du
complexe [Fujita and Schlegel, 2010] (Figure 30).
- 52 -
Figure 30 : Mécanisme de l’ARN Pol II en pause
Schéma illustrant le mécanisme de pause de l’ARN Pol II. A- Une fois que la machinerie transcriptionnelle
de base est mise en place, l’ARN Pol II commence la transcription. B- Au début de l’élongation, l’ARN Pol
II s’arrête sur le motif PB (paused button). C- L’ARN Pol II est maintenue en pause au niveau de la PB via
l’intervention des protéines NELF (Negative Elongation Factor) et DSIF (DRB sensitivity-inducing factor).
D- L’état de pause est levé suite à un signal permettant le recrutement de la protéine kinase P-TEFb
(Positive Transcription Elongation Factor b). E- Suite aux différentes phosphorylations effectuées par PTEFb : NELF est dissociée du complexe, DSIF devient un facteur d’élongation et ainsi l’ARN Pol II
reprend la transcription
Adaptée de [Adelman and Lis, 2012]
Introduction
Les gènes retrouvés avec une ARN Pol II en pause, ont la particularité de porter
deux marques opposées d’histones : la marque H3K4me3 associée à un état
transcriptionnellement actif et la marque H3K27me3 associée à une répression de la
transcription (voir § A.2.1.2.2). Ainsi ces gènes sont dans un état de répression prêt à être
levé. On parle de promoteurs préparés à la transcription "paused promoters", qui pourront
être rapidement induits.
Ce mécanisme est majoritairement retrouvé dans des gènes du développement ou
des gènes codant des protéines de choc thermique, HSP (Heat Shock Proteins). Il aurait
plusieurs fonctions, dont les principales seraient : [Adelman and Lis, 2012]
- Le maintien de la structure chromatinienne : cet arrêt permet de conserver, au niveau
des régions promotrices, une chromatine ouverte et donc accessible aux régulateurs
transcriptionnels. L’ARN Pol II a la capacité d’empêcher l’assemblage de nucléosomes au
niveau des promoteurs [Gilchrist et al., 2010].
- Une activation rapide et synchronisée : cette pause dans l’initiation de la transcription
donne la possibilité, lors d’un besoin soudain, d’activer un gène plus rapidement.
L’activation ne nécessite alors plus que le recrutement de P-TEFb, et non toutes les
étapes d’assemblage du complexe PIC. De plus, ce phénomène peut permettre d’induire
des cellules spécifiques de manière simultanée [Muse et al., 2007].
- L’intégration de signaux de régulation : cette étape laisserait le temps aux différents
éléments régulateurs de se mettre en place [Henriques et al., 2013].
- Un point de contrôle : l’interruption au démarrage de l’élongation donnerait l’occasion
de s’assurer de la pertinence de la transcription d’un gène. En effet, le recrutement de
l’ARN Pol II pouvant être stochastique, un mauvais gène pourrait être transcrit [Levine,
2011].
4.3 Les " shadow " enhancers
En 2008, un nouveau type d’enhancer a été décrit : les "enhancers ombres" ou
shadow enhancers [Hong et al., 2008]. Ces éléments régulateurs ont la caractéristique
d’avoir une activité redondante. Ils contrôlent le même gène, les FTs qui s’y fixent sont les
mêmes et les conditions d’activation sont identiques : même temps donné et lieu, qu’un
autre enhancer précédemment décrit. Ce premier enhancer se trouve généralement plus
à proximité du gène. Ces enhancers "secondaires", à distance du promoteur qu’ils
régulent, apporteraient une robustesse face à des perturbations environnementales et/ou
génétiques, et une précision d’expression [Hobert, 2010].
- 53 -
Figure 31 : Modifications des histones et éléments fonctionnels
Schéma récapitulant la répartition des modifications des histones au niveau des différents éléments
fonctionnels du génome.
Les promoteurs de gènes actifs sont majoritairement enrichis en histones acétylés, en marques
H3K4me2, H3K4me3 et en variants d’histones H2A.Z. Les régions transcrites sont, elles, enrichies en
marques H3K36me3 et H3K79me2. A l’inverse, on retrouve plus particulièrement les marques H3K9me2,
H3K9me3 et/ou H3K27me3 au niveau de gènes silencieux. Les régions activatrices quant à elles sont
caractérisées par des marques H3K4me1, H3K4me2, H3K27ac et la présence de l’histone
acétyltransférase p300.
Adaptée de [Zhou et al., 2011]
Introduction
Le nombre de shadow enhancers devenant de plus en plus important, avec une
répartition à des distances très variables, cette nuance a été remise en question et le
terme "enhancers distribués" a été proposé [Barolo, 2012].
4.4 Les super-enhancers
En 2013, un autre type d’enhancer a été décrit : les "super-enhancers". Les superenhancers se distinguent des enhancers classiques par leurs importantes tailles et la forte
présence de FTs qui s’y fixent. Ils forment des clusters d’enhancers de plusieurs dizaines
de kb. Ils joueraient un rôle important dans le contrôle de l’identité cellulaire [Whyte et al.,
2013]. De plus, ces super-enhancers étant associés à des gènes fortement exprimés ils
sont particulièrement retrouvés dans différents types de cancer comme les myélomes
multiples [Lovén et al., 2013]. Ces découvertes laissent entrevoir une nouvelle approche
thérapeutique des cancers en intervenant sur les FTs se liant aux super-enhancers.
4.5 Régulation chromatinienne
Comme détaillé précédemment, l’état de transcription d’un gène est dépendant de
l’organisation de la chromatine et des modifications auxquelles celle-ci peut être soumise
(Figure 31). La transcription d’un gène ou de plusieurs gènes simultanément peut
également dépendre de la conformation chromatinienne. En effet, l’action de nombreux
régulateurs transcriptionnels, tels que les enhancers, insulateurs ou lncRNA, nécessite la
formation de boucles d’ADN pour agir.
Ces boucles de chromatine, favorisant les interactions entre séquences régulatrices
et promotrices, peuvent être étudiées grâce aux techniques de capture de conformation
de la chromatine (voir § A.4).
Le rôle déterminant de ces contacts chromatiniens a largement été documenté et a
fait ressortir le lien entre une signature conformationnelle de la chromatine et la régulation
génique.
- 54 -
Figure 32 : Variations de séquences : Cis-Ruptions
Représentations des différentes variations de séquence pouvant altérer un mécanisme de régulation en
cis ou en trans. A- Délétion : perte de l’élément de régulation. B- Translocation : un échange entre des
séquences chromosomiques différentes fait perdre la régulation initiale. C- Mutation : modification de la
séquence qui perd son rôle de régulation. D- Duplication d’un élément de contrôle aboutissant à une surexpression d’un gène
Adaptée de [Crutchley et al., 2010]
Introduction
5 Dérégulations et maladies génétiques humaines
Les maladies génétiques sont souvent associées à des variations dans des
séquences codantes. Pourtant, de nombreuses pathologies peuvent être dues à une
expression anormale d’un gène, suite à l’altération d’un de ses éléments de régulation.
Ainsi, il a été mis en lumière l’implication d’anomalies de régions régulatrices à
distance d’un gène dans différentes maladies génétiques [Kleinjan and van Heyningen,
2005]. Il a été proposé le terme de ‘cis-ruption disorder ’ pour décrire les pathologies dont
l’origine provient d’un dysfonctionnement d’un élément cis-régulateur [Kleinjan and
Coutinho, 2009]. Ces dérégulations peuvent dépendre d’une anomalie de la structure
chromatinienne au niveau du locus d’un gène, c’est en particulier le cas dans un type de
myopathie : la dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD : facioscapulohumeral muscular
dystrophy) [Bodega et al., 2009].
Ce changement conformationnel peut aussi résulter d’un défaut au niveau du
complexe cohésine, on parle alors de "cohésinopathies". Les deux principaux exemples
sont le syndrome de Roberts (SR) et le syndrome de Cornelia de Lange [Bose and Gerton,
2010; Barbero, 2013].
Ces pathologies peuvent également résulter d’un défaut de l’action à distance d’un
facteur trans-régulateur avec une séquence cis-régulatrice.
Les principaux défauts peuvent être : (Figure 32)
- la perte d’une région régulatrice due à une délétion. La maladie de Van Buchem en est
un bon exemple [Loots et al., 2005].
- l’élimination d’un élément régulateur due à une translocation. Cette anomalie est
retrouvée dans des cas d’aniridie [Kleinjan et al., 2001].
- la présence de mutation dans un élément de régulation. Comme dans le syndrome de
Pierre Robin [Benko et al., 2009].
- une duplication d’un élément de contrôle aboutissant à une sur-expression d’un gène.
Cette modification a été décrite dans le syndrome triphalangeal de pouce-polysyndactyly
(TPTPS) [Sun et al., 2008].
- 55 -
Introduction
6 Projet ENCODE
Il serait incongru de finir ce chapitre sur la régulation transcriptionnelle des gènes
sans avoir dit au moins deux mots sur le projet ENCODE.
Le projet ENCODE pour ENCyclopedia Of DNA Elements a été lancé en septembre
2003 par le National Human Genome Research Institute. Ce consortium regroupait au
départ 442 scientifiques issus de 32 laboratoires différents situés aux Etats-Unis, en
Grande-Bretagne, en Suisse, en Espagne, au Japon et à Singapour.
Le projet, dans la continuité du Human Genome Project qui a présenté en avril 2003
le séquençage complet du génome humain, a pour objectif d’identifier et détailler
l’ensemble des éléments fonctionnels du génome [Consortium, 2004].
La démarche repose sur l’utilisation de nombreuses techniques de pointes. La plupart
sont liées à du séquençage nouvelle génération, et permettent de dresser une
cartographie de l’activité de notre génome : propriétés chromatiniennes, descriptions des
éléments de régulation, analyse des transcrits…
Les résultats de la phase pilote, portant sur l’analyse fonctionnelle de 1% du génome,
ont mis en évidence l’importance de nombreuses séquences non codantes [Birney et al.,
2007]. En effet, jusque là, seul 1,5% du génome, correspondant aux régions d’ADN
codantes, était décrit comme fonctionnel. Le reste était considéré comme de l’ADN
"poubelle", junk DNA. Les derniers gros résultats parus en 2012, décrivent le rôle
fonctionnel de 80% du génome [Bernstein et al., 2012]Ǥ Ces résultats décrivent
l’intervention de plus de 4 millions d‘ " interrupteurs " génétiques assurant une régulation
transcriptionnelle optimale.
Ce projet est loin d’être fini. Il reste encore 20% de séquences du génome dont
l’activité n’a pas été élucidée. Et grâce à ces nombreuses découvertes, de nouvelles
voies de recherche pour la biologie médicale ont été ouvertes : meilleure compréhension
de pathologies, outils thérapeutiques…
- 56 -
Introduction
C. La Mucoviscidose
La mucoviscidose, littéralement "maladie des mucus visqueux", également nommée
fibrose kystique du pancréas (ou en anglais cystic fibrosis, CF), est la maladie génétique
létale la plus fréquente dans les populations de type caucasienne. Elle est transmise
selon un mode autosomique récessif, c'est-à-dire qu’elle touche aussi bien les garçons
que les filles et que pour être atteint il faut hériter de deux mutations : une de chacun des
parents. Elle touche en moyenne un nouveau-né sur 3000. En France, le nombre de
patients atteints de mucoviscidose, dits "patients CF", est d’environ 6500. Et on estime
qu’une personne sur 25 serait porteuse de cette maladie, soit environ deux millions de
porteurs sains.
Cette pathologie est due à des anomalies moléculaires du gène codant la protéine
CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Un dysfonctionnement
de ce canal ionique, qui assure normalement des échanges d’eau et d’ions, en particulier
dans les cellules épithéliales, aboutit à une atteinte multifonctionnelle de différents tissus
épithéliaux tels que ceux du système respiratoire et digestif. La gravité dépend de la ou
des mutations du gène CFTR : allant de la forme classique, dont la principale cause de
morbidité
est
l’atteinte
pulmonaire ;
à
des
formes
moins
sévères,
souvent
monosymptomatique, nommées CFTR-RD (CFTR-Related Disorder).
A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement curatif de la mucoviscidose. La prise
en charge des patients, avec des soins et médications symptomatiques de plus en plus
adaptés, a tout de même permis une grande amélioration de la qualité de vie des patients
et une augmentation considérable de l’espérance de vie. De plus, les avancées des
recherches thérapeutiques laissent entrevoir de grands espoirs.
1 Généralités
1.1 Historique des premières dates clés
Les premiers rapprochements de cas de mucoviscidose remonteraient au Moyen
Age. En 1595, le professeur de botanique et d’anatomie néerlandais Pieter Pauw, réalisa
l’autopsie d’une fillette de 11 ans qui était supposée "ensorcelée". Il décrivit l’enfant
comme très mince et son examen révéla en particulier, la présence d’un liquide visqueux
blanchâtre, d’une cirrhose du foie et d’un pancréas anormalement gonflé.
- 57 -
Introduction
Au début du XVIIe siècle, en 1606, un médecin espagnol, Alonzo y de Los Ruyzes
Fonteca, relatait que les enfants au goût salé quand on les embrasse, étaient maudits et
destinés à mourir. Cette déclaration fut retranscrite dans l’ouvrage germanique de
Rochholz de 1857 “The child will soon die whose brow tastes salty when kissed”.
Il fallut attendre le XXe siècle pour que cette affection ne soit plus considérée
comme un ensorcellement mais bien reconnue comme une maladie à part entière. En
1936, le pédiatre suisse Guido Fanconi fait un lien entre maladie coeliaque, fibrose
kystique du pancréas et bronchectasie. C’est la pédiatre américaine Dorothy Andersen,
en 1938, qui conclura en une unique pathologie bien distincte.
Nous devons l’appellation "mucoviscidose", moins centrée sur une maladie unique
du pancréas, au docteur américain Sydney Farber qui désigna, en 1943, cette maladie :
"mucoviscidosis", composée des mots "mucus " et "viscous". La transmission héréditaire,
selon un mode autosomique récessif, a été caractérisée en 1946, par Dorothy Andersen
assistée de son collègue Richard Hodges.
Suite à la vague de chaleur durant l’été 1948 à New-York, le nouvel assistant du Dr
Andersen, Paul Di Sant’Agnese, va faire le lien avec les "baisers salés" décrits trois
siècles plus tôt. En 1953, il démontre un excès anormal de chlorure de sodium et de
potassium dans la sueur de patients CF. Ce constat va permettre la mise en place du
premier outil de diagnostic de la mucoviscidose : le test de la sueur. Ce sont les
chercheurs Lewis Gibson et Robert Cooke qui développèrent ce test qui fut utilisé pour la
première fois en 1959. Cet examen reste de nos jours, toujours incontournable dans
l’établissement d’un diagnostic de mucoviscidose.
En 1979, Jeannette Crossley démontra que le taux de trypsine immunoréactive
(TIR) dans le plasma de sujets CF était plus élevé. Cette découverte sera à l’origine du
développement du dépistage néonatal.
Un autre outil de diagnostic, la mesure de différence de potentiel trans-épithélial,
dérivera de la découverte de Mickael Knowles et al en 1981 [Knowles et al., 1981]. Ils ont
démontré qu’au niveau des muqueuses nasales, les patients CF avaient un potentiel
transépithélial plus électronégatif que celui de sujets sains.
L’explication de ces taux anormaux d’ions ne sera apportée qu’en 1983 par le Dr
Paul Quinton, lui-même atteint de la mucoviscidose. Il identifia un défaut de perméabilité
aux ions chlorure des cellules épithéliales des glandes sudoripares chez des patients CF
[Quinton, 1983]. De la même manière, Knowles et ses associés décrivirent, dans la même
année, cette anomalie électrolytique au niveau de l’épithélium respiratoire [Knowles et al.,
1983].
- 58 -
Figure 33 : Carte de l’incidence de la mucoviscidose dans les différentes régions de France
Sur le territoire français, l’incidence de la mucoviscidose varie énormément d’une région à l’autre. Entre le
er
1 Janvier 2002 et le 31 Décembre 2009, l’incidence la plus élevée a été retrouvée en Franche Comté
avec une naissance sur 3214. A l’inverse, c’est en Auvergne que l’on a enregistré le moins de nouveauxnés atteints de mucoviscidose, avec une incidence de 1/7632.
Adaptée de [Audrezet et al., 2014]
Figure 34 : Evolution de la prise en charge des patients atteints de mucoviscidose
Graphique représentant le nombre de patients reçus dans les Centres de Ressources et de Compétences
de la Mucoviscidose (CRCMs) par an, avec le pourcentage d’adultes, depuis 1992 à 2012. La prise en
charge a considérablement évoluée. Le nombre de patients suivis en 1992 était à un peu plus de 1500, il
s’élève à plus de 6150 en 2012. En 20 ans, le pourcentage d’adultes a plus que doublé.
D’après le Registre Français de la Mucoviscidose (RFM) - Bilan des données 2012
Introduction
La suite de l’histoire, avec l’année 1985 qui marqua les premières découvertes
associées au gène responsable de la mucoviscidose (voir § C.2.1), sera plus amplement
développée tout au long de ce manuscrit.
1.2 Données épidémiologiques
La mucoviscidose est retrouvée sur l’ensemble de la planète mais avec une
distribution très hétérogène en fonction des origines ethniques [O'Sullivan and Freedman,
2009]. Les incidences les plus fortes sont retrouvées dans les populations de type
europoïde : populations blanches d’Europe et d’Amérique du Nord. Les populations
africaines et asiatiques sont les moins touchées.
La France compterait environ 6500 patients avec une incidence moyenne d’un peu
plus de 1/4700 naissances [Audrezet et al., 2014]. Il existe d’importants contrastes en
fonction des régions et même entre départements d’une même région (Figure 33). La
Bretagne est une des régions les plus touchées avec une incidence de 1/3669.
L’incidence la plus faible est retrouvée en Auvergne avec un peu moins d’une naissance
sur 7600. La fréquence moyenne des hétérozygotes, c'est-à-dire porteurs sains, est de 1
personne sur 32, ce qui estimerait à plus de 2 millions de personnes portant une mutation.
L’association nationale " Vaincre la mucoviscidose " publie tous les ans un "Registre
Français
de
la
Mucoviscidose"
(RFM)
répertoriant
l’ensemble
des
données
épidémiologiques réunies par les 45 Centres de Ressources et de Compétences de la
Mucoviscidose (CRCM) répartis sur l’ensemble du territoire français. Le dernier bilan des
données de 2012 publié en mars 2014 fait état de résultats et chiffres plus
qu’encourageants. En effet, la prise en charge a considérablement évoluée : le nombre de
patients suivis en 1992 était à un peu plus de 1500 alors qu’il s’élève à plus de 6150 en
2012. Et s’il y a encore quelques années, on parlait d’une maladie de l’enfant, ce n’est
plus le cas aujourd’hui car sur les patients recensés en 2012, plus de la moitié sont des
adultes (Figure 34).
Grâce à un diagnostic établi de plus en plus tôt et des traitements symptomatiques
améliorés, l’espérance de vie des patients CF gagne pratiquement une année tous les
ans. L’espérance de vie d’un enfant né en 2012 est estimée à 50 ans, alors que dans les
années 1950, 45% des sujets décédaient avant l’âge de 1 an et qu’un enfant naissant en
1992 avait une espérance de vie de 29 ans.
- 59 -
Figure 35 : Localisation du locus du gène CFTR
La localisation génomique du gène CFTR a été identifiée en 1987. Ce gène se situe sur la sous-bande 2
de la bande 1 de la région 3 du bras long du chromosome 7, c'est-à-dire au niveau du locus 7q31.2.
Adaptée de l’U.S. National Library of Medicine
Figure 36 : Du gène CFTR à la protéine CFTR
A- Le gène CFTR, identifié en 1989, est un grand gène constitué de 27 exons qui s’étend sur une région
génomique d’environ 190 kb. Les exons sont numérotés de 1 à 27 selon la nomenclature officielle
internationale de la HGVS (Human Genome Variation Society). On peut aussi les trouver numérotés de 1
à 24, avec les exons 6, 14 et 17 divisés en deux, selon l’ancienne nomenclature. B- Le gène CFTR code
un ARN messager (ARNm) de 6,5 kb. C- 4,4kb seront traduites en une protéine membranaire de 1480
acides aminés (aa).
Introduction
2 Du gène à la protéine CFTR
2.1 Le gène CFTR
La première découverte concernant le gène responsable de la mucoviscidose fut
l’identification de son locus en 1985 [Tsui et al., 1985]. Ce locus est en 7q31.2, c'est-àdire sur la sous-bande 2 de la bande 1 de la région 3 du bras long du chromosome 7
(Figure 35). Les recherches s’étaient portées sur ce chromosome suite à la découverte
de dérégulations de l’enzyme paraoxonase chez des patients CF [Eiberg et al., 1985].
Cette enzyme est codée par le gène PON présent sur le chromosome 7. Il faudra attendre
quatre ans de plus pour que le gène soit précisément identifié. Ainsi en 1989, le gène a
été cloné par une des premières démarches de génétique inverse, par trois équipes qui
l’ont nommé CFTR [Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989].
C'est un grand gène constitué de 27 exons qui s’étend sur une région génomique
d’environ 190 kb. On peut retrouver deux nomenclatures sur la numérotation des exons :
l’ancienne nomenclature où les exons sont numérotés de 1 à 24 avec les exons 6, 14 et
17 divisés en deux. Et la nomenclature officielle internationale qui suit les règlementations
de la HGVS (Human Genome Variation Society) avec 27 exons.
Le gène CFTR est transcrit en un ARN messager (ARNm) de 6,5 kb dont 4,4kb
seront traduites en une protéine de 1480 acides aminés (Figure 36).
2.2 La protéine CFTR
La protéine CFTR est une glycoprotéine transmembranaire composée de 1480
acides aminés.Elle est synthétisée au niveau du réticulum endoplasmique (RE) et gagne
la membrane cellulaire en passant par l’appareil de Golgi, tout en subissant plusieurs
modifications post-traductionnelles. Elle est alors mature, entièrement glycosylée, et a
une masse moléculaire d’environ 170kDa (Figure 37).
Elle est principalement localisée au pôle apical des cellules épithéliales de l’arbre
trachéobronchique, des glandes sudoripares, du pancréas ou encore du tractus génital.
Son niveau d'expression est variable selon les tissus et le stade du développement. Le
plus fort taux est observé au niveau du pancréas et de l'intestin.
Les deux parties symétriques de la protéine CFTR sont chacune formées d’un
domaine hydrophobe transmembranaire TMD (TransMembrane Domain) constitué de six
hélices Į: TMD1 (exons 1–8), TMD2 (exons 14–18) et d’une importante région hydrophile
NBD (Nucleotide Binding Domain), contenant des séquences de fixation de l'Adénosine
TriPhosphate (ATP): NBD1 (exons 9–12), NBD2 (exons 19–21).
- 60 -
Figure 37 : Structure de la protéine CFTR et schéma de sa biosynthèse et maturation
La protéine CFTR est une glycoprotéine transmembranaire composée de 2 domaines hydrophobes
transmembranaires TMD (TransMembrane Domain). Chacun d’eux est constitué de six hélices Į, de 2
régions hydrophiles NBD (Nucleotide Binding Domain) et d’un domaine régulateur central R. La protéine
CFTR est synthétisée au niveau du réticulum endoplasmique où elle subit les premières modifications
post-traductionnelles. Seulement 30% de protéines sortent du RE, le reste est dégradé. Avant de gagner
la membrane cellulaire, la protéine CFTR subit de nouvelles glycosylations en passant par l’appareil de
Golgi. Elle atteint la membrane sous sa forme mature, entièrement glycosylée, avec une masse
moléculaire d’environ 170kDa.
D’après la thèse de J. Micoud, 2009 (tel-00363323)
Figure 38 : Activation du canal CFTR
La fixation d’un ATP au niveau des domaines NBD entraîne la phosphorylation du domaine R par les PKA
au niveau de résidus sérines. Cette phosphorylation produit un changement de conformation de la
protéine qui permet l'ouverture du canal et ainsi le passage d’ions Cl-.
Adaptée de http://www.biochemj.org/csb/frame.htm
Introduction
Ces deux régions sont reliées entre elles par un domaine central unique
intracellulaire, appelé R pour régulateur, codé par le seul exon 13 (Figure 37). Ce
domaine régulateur expose à sa surface plusieurs sérines phosphorylables par les
protéines kinases A et C (PKA et PKC).
De par sa structure, la protéine CFTR rejoint la famille des protéines ABC (ATPBinding Cassette) qui sont des transporteurs membranaires liant l'ATP au niveau de
domaines NBD très conservés entre eux et entre les espèces.
Cette protéine est multifonctionnelle.
Avant tout, il s'agit d'un canal chlorure AMPc dépendant (Adénosine
MonoPhosphate cyclique), de faible conductance.
Ce canal permet la sortie des ions chlore (Cl-) de la cellule épithéliale [Bear et al., 1992].
La fixation d’un ATP sur le premier domaine NBD entraîne la phosphorylation du domaine
R par les PKA et PKC au niveau de résidus sérines. Cette phosphorylation entraîne un
changement de conformation de la protéine et permet l'ouverture du canal (Figure 38).
La fixation d'une deuxième molécule d'ATP sur NBD2 prolonge le temps d'ouverture du
canal qui se ferme lorsque l'ATP est hydrolysé [Hwang et al., 1994].
De plus, il a été démontré que cette protéine régule l’activité d’autres transporteurs
et canaux ioniques. La protéine CFTR active en particulier l’ouverture du canal ORCC
(Outwardly Rectifying Chloride Channel) de part sa fonction de transporteur de l’ATP
[Schwiebert et al., 1995].
Le canal sodium sensible à l'amiloride, ENaC (Epithelial Na+ Channel), responsable d'une
absorption par la cellule épithéliale d'ions sodium (Na+), est lui contrôlé négativement par
la protéine CFTR [Kunzelmann et al., 2001].
Cette protéine participe également à la régulation des échanges des ions
potassium (K+) en inhibant le canal ROMK (Renal Outer Potassium Channel) par l’ATP
cytoplasmique mais aussi à travers une interaction directe [Lu et al., 2006]. Les ions
HCO3- sont également régulés par modulation soit de leur transporteur soit des
échangeurs Cl-/ HCO3- ou Na+/ HCO3- [Park et al., 2002]. Elle transporte également les
ions HCO3- et le glutathion [Gao et al., 2001].
La protéine CFTR intervient également dans le recyclage des membranes en
favorisant le phénomène d'exocytose et en inhibant celui d'endocytose [Bradbury et al.,
1992].
Pour finir, elle joue un rôle important dans la réponse immuno-inflammatoire locale,
via le facteur NF-ɤB [Vij et al., 2009] et dans la défense antimicrobienne [Pier et al., 1998].
- 61 -
Figure 39 : Code Génétique
Adaptée de http://raymond.rodriguez1.free.fr
Introduction
2.3 Les anomalies moléculaires du gène CFTR
Suite à la découverte du gène il y a maintenant 25 ans, de nombreux laboratoires
se sont lancés dans la recherche de mutations du gène CFTR conduisant à un effet
délétère. Dans ce sens, une collaboration internationale pour répertorier l’ensemble des
mutations découvertes a été créée sous la direction, entre autre, d’un des découvreurs du
gène, le Dr Lap Chee Tsui. Ce consortium: CFGAC (Cystic Fibrosis Genetic Analysis
Consortium) regroupe plus d’une centaine de laboratoires du monde entier .
À ce jour, 1 978 anomalies moléculaires du gène CFTR y sont recensées
(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/StatisticsPage.html). Ces mutations peuvent être
distinguées en plusieurs types, en fonction de l’anomalie moléculaire qu’elles engendrent.
Et elles sont divisées en classes selon les conséquences fonctionnelles qu'elles
occasionnent.
2.3.1 Les types de mutations
Il existe différents types de mutations. La majorité sont des mutations dites
ponctuelles. Les mutations ponctuelles engendrent une variation de séquence d’une ou
quelques bases. Ce changement peut dépendre d’une substitution d’une base par une
autre, d’une délétion ou encore d’une insertion. Plus rarement, on peut retrouver de
grands réarrangements, délétion ou insertion d’un nombre important de bases.
En fonction de leurs conséquences sur la séquence polypeptidique, les variations
peuvent être:
- Des mutations faux sens : c'est-à-dire que la variation entraîne un remplacement de
l’acide aminé codé. Par exemple, si la mutation change le premier nucléotide du codon
CUU en un G, une leucine est alors remplacée par une valine (Figure 39).
- Des mutations non-sens : la modification d’une base provoque le changement d’un
acide aminé en un codon stop et donc l’arrêt de la synthèse protéique précocement. C’est
le cas, si le dernier nucléotide d’une cystéine est changé en un A.
- Des mutations d’épissage : elles affectent l’épissage du transcrit primaire engendrant
généralement une protéine non fonctionnelle.
- Des mutations décalantes : c’est le cas des insertions ou délétions qui vont provoquer
un changement du cadre de lecture du code génétique. Ce décalage provoque
couramment l’apparition d’un codon STOP prématuré.
- 62 -
Type
Nombre de mutations
Fréquence (%)
Mutations faux-sens
789
39,89
Mutations décalentes
311
15,72
Polymorphismes
269
13,60
Mutations d'épissage
228
11,53
Mutations non-sens
163
8,24
Grands réarrangements
chromosomiques
51
2,58
Mutations non-décalentes
39
1,97
Mutations promotrices
15
0,76
Non identifiées
113
5,71
TOTAL
1978 mutations recensées
Tableau I : Fréquence des différents types de mutations retrouvés sur le gène CFTR
D’après la Cystic Fibrosis Mutation Database, http://www.genet.sickkids.on.ca, septembre 2014
Figure 40 : Distribution des différents types de mutations CFTR
Adaptée de http://www.genet.sickkids.on.ca, août 2014
Introduction
Les insertions ou délétions peuvent être non-décalantes lorsque l’ajout ou la suppression
de nucléotides est un multiple de 3.
- Des polymorphismes : ils correspondent à des variations de séquence n’ayant pas
d’impact phénotypique. Sont considérés comme polymorphismes, les variations ayant une
fréquence allélique au moins égale à 1%.
Les principales anomalies moléculaires retrouvées au sein du locus du gène
CFTR sont des mutations faux-sens (㹼40%). La répartition de l’ensemble des altérations
génétiques est détaillée dans le Tableau I et leur distribution le long du gène CFTR est
représentée sur la Figure 40.
2.3.2 Les différentes classes de mutations
Les différents types de mutations ne permettant pas forcément de présumer des
conséquences sur la protéine CFTR, les mutations du gène CFTR ont été distinguées en
classes fonctionnelles. Une première classification, en fonction des anomalies de
synthèse ou fonctionnelles de la protéine CFTR, a proposé une distinction en quatre
classes numérotées de I à IV [Welsh and Smith, 1993]. A cette répartition ont été ajoutées
deux nouvelles classes (V et VI), issues de la classe I, afin de bien distinguer les
altérations biochimiques [Haardt et al., 1999; Wilschanski et al., 1995], (Figure 41) :
x Les mutations de classe I : Défaut de synthèse de la protéine CFTR
Cette classe résulte en une absence totale ou partielle de la protéine. Il s’agit
majoritairement de mutations non-sens. L’apparition d’un codon STOP prématuré peut
être due à un décalage de lecture ou toucher un site
d’épissage. Ces mutations
engendrent un ARNm muté instable qui sera dégradé avant de produire une protéine. Ou
une protéine anormale (tronquée ou contenant des séquences aberrantes) qui sera elle
aussi instable et détruite.
x Les mutations de classe II : Défaut de maturation de la protéine CFTR
Les mutations de cette classe affectent le processus de maturation de la protéine et
donc son adressage à la membrane apicale. L’ARNm est bien transcrit mais les protéines
traduites subissent un repliement anormal. Ces protéines mutées resteront alors
séquestrées au niveau du RE et y seront dégradées. Les principales mutations à l’origine
de ce type d’anomalies sont des mutations faux-sens ou des micro-délétions non
décalantes.
- 63 -
Figure 41 : Classes de mutations CFTR
Les mutations du gène CFTR ont été distinguées en six classes en fonction des anomalies de synthèse
ou fonctionnelles de la protéine CFTR :
Les mutations de classe I résultent d’un défaut de synthèse de la protéine CFTR. Les mutations de
classe II regroupent les anomalies conduisant à un défaut de maturation de la protéine CFTR. Les
mutations de classe III correspondent à un défaut de régulation de la protéine CFTR. Les mutations de
classe IV représentent un défaut de conductance de la protéine CFTR.Les mutations de classe V
décrivent un défaut de stabilité de l’ARNm CFTR. Les mutations de classe VI rassemblent les
altérations donnant lieu à un défaut de stabilité de la protéine CFTR.
Adaptée de The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. ; 2001
Introduction
x Les mutations de classe III : Défaut de régulation de la protéine CFTR
Ces altérations n’inhibent ni la transcription de l’ARNm, ni sa traduction en une
protéine qui subira une maturation normale et sera bien adressée à la membrane apicale
des cellules. Les mutations de cette classe perturbent la régulation de l’activation de la
protéine : l’ouverture du canal. Ce sont principalement des mutations faux-sens situées au
niveau des domaines NBD de liaison à l’ATP. Elles altèrent l’hydrolyse de l’ATP et la
phosphorylation du domaine R, inhibant l’ouverture du canal.
x Les mutations de classe IV : Défaut de conductance de la protéine CFTR
De la même manière que les mutations de classe III, ces anomalies n’interviennent pas
sur la synthèse et le bon adressage de la protéine à la membrane. La protéine mutée
assure même une activité canal, mais de manière beaucoup moins importante que la
sauvage. Les mutations, majoritairement faux-sens et retrouvées au niveau des domaines
transmembranaires, altèrent la durée d’ouverture du canal et la sélectivité ionique. Une
diminution du flux d’ions chlorure est alors observée.
x Les mutations de classe V : Défaut de stabilité de l’ARNm CFTR
Ce type de mutation impacte le taux de transcrits et/ou la stabilité des ARNm. La
synthèse protéique est alors diminuée et donc, la quantité de protéines CFTR
fonctionnelles à la membrane, réduite. Cette classe comprend des mutations au sein du
promoteur, qui impactent directement la transcription. Des mutations faux-sens qui
altèrent le trafic intracellulaire. Et des mutations d’épissage qui conduisent à un épissage
aberrant ou alternatif.
x Les mutations de classe VI : Défaut de stabilité de la protéine CFTR mature
Cette dernière classe regroupe des mutations qui entraînent une diminution de la
stabilité de la protéine mature à la membrane. Cette instabilité aboutit aussi à une
altération de son rôle de régulation sur d’autres canaux comme ORCC ou ENaC. La
protéine est fonctionnelle mais instable, elle est rapidement dégradée. Ces variations
nucléotidiques sont principalement retrouvées sur l’extrémité C-terminale, les protéines
traduites sont tronquées au niveau de cette partie.
Selon leur impact, on parle de mutations sévères ou modérées. Les mutations de
classe I, II, III et VI sont considérées comme sévères. L’absence ou la présence très
minime de protéines fonctionnelles à la membrane engendre des conséquences
phénotypiques graves. Les mutations des classe IV et V permettant tout de même une
faible synthèse de protéines fonctionnelles et donc une activité résiduelle, les atteintes
sont plus modérées.
- 64 -
Figure 42 : Prévalence de la mucoviscidose et mutations fréquentes dans le monde
Cette carte représente les principaux pays touchés par la mucoviscidose avec des prévalences
approximatives à la naissance. Les mutations les plus fréquemment retrouvées dans chacun de ces pays
sont indiquées, dans certains cas avec l’origine ethnique. Ainsi, on peut observer que la distribution des
mutations varie en fonction du lieu géographique et de l’origine ethnique.
Adaptée de [O'Sullivan and Freedman, 2009]
Tableau II : Distribution des génotypes les plus fréquents en France
La mutation F508del est majoritairement retrouvée chez les patients CF en France. Elle est retrouvée à
l’état homozygote chez environ 40% des patients et au total chez plus de 80% des patients Ensuite
seulement 7 mutations ont une fréquence de plus de 1% et une trentaine une fréquence entre 0,1% et
1%. Toutes les autres mutations sont rares, voire privées.
Introduction
2.3.3 La répartition des mutations
Sur les presque 2000 mutations décrites, la majorité sont rares voire privées. Il
existe une mutation principale, communément appelée la mutation F508del et
c.1521_1523delCTT, p.Phe508del selon la nomenclature HGVS. Cette mutation décrite
en même temps que la découverte du gène en 1989, consiste en une délétion de trois
nucléotides au niveau du dixième exon du gène, aboutissant à l'élimination d'un acide
aminé, la phénylalanine, en position 508 [Kerem et al., 1989]. C’est une mutation de
classe II qui perturbe donc la maturation et le trafic intracellulaire de la protéine CFTR et
est plutôt associée à un phénotype sévère. La grande majorité des patients
mucoviscidose dans le monde est porteur d’une mutation F508del, pratiquement la moitié
en est porteuse homozygote [Boyle and De Boeck, 2013].
Hormis cette mutation, très peu ont une fréquence supérieure à 0,1%. Ces faibles
fréquences dépendent de la distribution très variable, en fonction du lieu géographique et
de l’origine ethnique, de chaque mutation. Ainsi certaines mutations sont particulièrement
retrouvées dans des
groupes ethniques distincts. Par exemple, la mutation G551D
(c.1652G>A, p.Gly551Asp) est principalement retrouvée dans les populations d’origine
Celte. La mutation 394delTT (c.262_263delTT, p.Leu88IlefsX22) est majoritairement
présente dans les pays nordiques. Les principales mutations, retrouvées dans les
différents pays du monde présentant des prévalences de mucoviscidose assez élevées,
sont exposées sur la Figure 42.
La France est un des pays possédant un large spectre mutationnel, avec plus de
200 mutations différentes identifiées. Cette diversité peut s’expliquer par son histoire
ayant connue de grands flux migratoires et certaines prévalences régionales assez
importantes peuvent s’expliquer par une endogamie géographique (cas de La Bretagne).
La mutation F508del est retrouvée chez 67,24% des patients et dont plus de 47,58%
en sont porteurs à l’état homozygote [Audrezet et al., 2014].
La deuxième mutation la plus retrouvée en France est la mutation G542X
(c.1624G>T, p.Gly542X) avec une fréquence de 3,19%.
Une trentaine de mutation seulement présente une fréquence supérieure à 0,1%
(Tableau II).
Toutes les autres mutations sont rares, voire individuelles, uniquement retrouvées au
sein d'une famille.
- 65 -
Figure 43 : Des anomalies du gène CFTR aux différentes manifestations cliniques
A la suite de mutations du gène CFTR, la protéine canal n’assure plus son rôle de transporteur ionique et
une déshydratation des muqueuses des tissus épithéliaux se produit. Un mucus visqueux et épais obstrue
alors certains canaux, ce qui perturbe différentes voies de circulation. Les principaux organes touchés
sont ceux du système respiratoire, du système digestif et de l’appareil reproducteur.
D’après http://www.chtimuco.fr/comprendre-la-mucoviscidose
Introduction
3 Manifestations cliniques et prises en charge
La protéine CFTR étant le principal canal de sécrétion des ions chlorure, son
absence ou une anomalie de son fonctionnement entraîne un défaut du transport
transépithélial. Lors d’anomalies du canal CFTR, le mouvement des ions Cl- des cellules
épithéliales vers l'intérieur des organes est diminué voire inexistant. Notre organisme
cherchant toujours un équilibre parfait, l'accumulation des ions Cl- va indirectement
entraîner une absorption en excès d’ions Na+. Ceci entraîne une formation de NaCl, c'està-dire de sel, ce qui explique la concentration élevée en sel de la sueur des malades. Afin
de maintenir une osmolarité, l’eau des différentes muqueuses de notre organisme va être
absorbée au sein des cellules.
Le mucus va alors se déshydrater et s'épaissir. Le
système ciliaire ne pouvant plus évacuer ce mucus, il va s'accumuler et stagner dans les
différents canaux et organes. Ainsi les tissus épithéliaux sécréteurs sont altérés avec des
atteintes touchant principalement l’appareil respiratoire, le système gastro-intestinal, les
glandes sudoripares et le système reproducteur (Figure 43). Les poumons et les voies
respiratoires sont les plus affectés et entraînent le plus de morbidité suite à des
inflammations et colonisations microbiennes.
A ce jour, la mucoviscidose reste toujours incurable. La prise en charge
thérapeutique des patients repose sur des traitements symptomatiques visant à traiter
séparément chaque conséquence délétère du dysfonctionnement de la protéine, et en
particulier à améliorer la fonction respiratoire.
Malgré tout, l’espérance de vie mais aussi la qualité de vie des patients se sont
grandement améliorées. D’une part, grâce à une prise en charge de plus en plus précoce
de la maladie, avec un suivi régulier dans des centres de soins spécialisés et une
éducation thérapeutique des patients et de leurs entourages. Et d’autre part, grâce à une
meilleure compréhension physiopathologique qui permet d’adapter et de développer des
soins plus appropriés et spécifiques à chaque patient.
Les avancées en recherche thérapeutique laissent entrevoir de grands espoirs
quant à la mise au point de futurs traitements curatifs. Ces traitements pourraient viser à
corriger directement le gène avec une approche de thérapie génique. Une autre
démarche, de thérapie protéique, vise à moduler l’expression de la protéine canal. Les
premiers résultats sont déjà très prometteurs.
- 66 -
Figure 44 : Troubles de la clairance mucociliaire au niveau de l’épithélium respiratoire de
patients atteints de mucoviscidose
En situation normale, un film protecteur recouvre l’épithélium bronchique, c’est le liquide de surface, ASL
pour Airway Surface Liquid. L’ASL est constitué de deux phases : une phase aqueuse, formée par le
liquide périciliaire (PCL) où baignent les cils, et une phase muqueuse. Lors d’anomalies CFTR le liquide
périciliaire se déshydrate. Les cils, évacuant normalement le mucus grâce à leurs battements, se
retrouvent englués et ne peuvent donc plus remplir leur fonction. La clairance mucociliaire est alors
diminuée et ce mucus anormalement visqueux devient un lieu d’implantation et de développement de
différents germes
Adaptée de la thèse de E.Saussereau, 2013 (tel-00836178)
Figure 45 : Evolution des infections bactériennes en fonction de l’âge des patients CF
Ces courbes représentent les fréquences d’infections bactériennes isolées dans les expectorations de
patients CF en fonction de leur âge.
Les bactéries les plus retrouvées dès le plus jeune âge sont des Staphylococcus aureus ou des
Haemophilus influenza. A partir de 10 ans ces infections commencent à décroître et être majoritairement
remplacées par l’installation de colonisations de Pseudomonas aeruginosa.
Introduction
3.1 Les atteintes et traitements symptomatiques associés
3.1.1 Atteintes des voies respiratoires
Les manifestations et complications les plus sévères de la mucoviscidose sont
liées à l’atteinte des voies respiratoires. Le déclin de la fonction pulmonaire est la cause
de morbidité et de mortalité la plus importante. Elle est à l’origine de plus de 90% des
décès [Regamey et al., 2011]. En effet, suite au dysfonctionnement du canal CFTR le
liquide de surface, ASL pour Airway Surface Liquid, recouvrant l’épithélium bronchique
est altéré. En situation normale, ce film de protection est constitué de deux phases : une
phase aqueuse, formée par le liquide périciliaire (PCL) où baignent les cils, et une phase
muqueuse. Lors d’une déshydratation du mucus, celui-ci se densifie, augmentant la
phase muqueuse. Les cils des cellules épithéliales se retrouvent alors englués, leurs
battements sont altérés ce qui diminue l’efficacité d’évacuation du mucus. Les patients CF
ont ainsi une clairance muco-ciliaire altérée, favorisant l’accumulation d’un mucus épais et
visqueux qui encombre les bronchioles. Les bronches finissent par être obstruées ce qui
cause une détresse respiratoire (Figure 44). Ceci entraîne généralement une
inflammation chronique et un environnement propice à l’implantation et au développement
de différents germes. Effectivement, les poumons sont des organes fréquemment en
contact avec les bactéries. Dans cette situation pathologique, celles-ci restent
emprisonnées dans le mucus anormalement dense, et causent de graves infections
pulmonaires. Les bactéries les plus rencontrées sont les Staphylococcus aureus,
l'Haemophilus influenzae et le Pseudomonas aeruginosa [Lane and Doe, 2014]. Ces
infections évoluent en fonction de l’âge des patients. Au cours des premières années de
vie, le mucus des patients CF est plutôt colonisé par des Staphylococcus aureus et
Haemophilus influenza, et vers 10 ans ces infections vont décroître et être
majoritairement remplacées par des colonisations de Pseudomonas aeruginosa (Figure
45). L’infection par ce dernier, bacille pyocyanique extrêmement résistant aux
antibiotiques, est plutôt d’assez mauvais pronostic. En plus des colonisations
bactériennes, des infections fongiques sont régulièrement retrouvées au niveau des voies
respiratoires. D’après le bilan des données 2012 du RFM,
une colonisation par le
champignon Aspergillus a été identifiée chez 23,8% des patients.
Les premières atteintes respiratoires surviennent relativement tôt. Une bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est identifiée chez plus de deux tiers des
enfants CF de moins d’un an. Cette manifestation se traduit majoritairement par un
essoufflement, des expectorations anormales et une toux chronique.
- 67 -
Introduction
En plus de cette détérioration de la fonction respiratoire, les patients CF sont
régulièrement sujets à des troubles ORL. Ils développent fréquemment des otites
séreuses et des polyposes naso-sinusiennes [Pettit and Fellner, 2014].
Au quotidien, les traitements de ces différentes manifestations sont lourds et
contraignants. Les patients CF enchaînent séances de kinésithérapie, prises de
traitements mucolytiques, broncho-dilatateurs, cures d’antibiotiques et / ou d’antiinflammatoires voire cures intraveineuses.
Des traitements par oxygénothérapie sont ajoutés quand l’insuffisance respiratoire devient
trop sévère. Et à terme, l’ultime recours reste la transplantation pulmonaire, quand elle est
réalisable.
3.1.2 Atteintes digestives
Le tractus digestif est composé de nombreux organes sécréteurs. Ainsi, lors
d’anomalies du CFTR qui entraînent une hyperabsorption de NaCl corroborée avec une
hyperabsorption d’eau dans les cellules, les diverses sécrétions vont être déshydratées.
De ce fait, la bile, le suc pancréatique et les sécrétions intestinales sont anormalement
visqueux. Suite à l’altération des transports ioniques et plus précisément de celui des ions
bicarbonate, ces sécrétions, en particulier le suc pancréatique, seront également plus
acides. Ces modifications des sécrétions digestives associées à la présence d’un mucus
obstruant certains petits canaux vont empêcher une digestion efficace et entrainer divers
symptômes gastro-intestinaux.
L’atteinte la plus précoce, parfois visible dès la vie fœtale lors de l’échographie
morphologique par une hyperéchogénicité intestinale, est l’iléus méconial. Cette
occlusion intestinale, se traduisant par une impossibilité à évacuer le méconium (les
premières selles), est retrouvée chez environ 15% des nouveaux nés CF [Scotet et al.,
2010].
Les manifestations les plus sévères sont dues à une insuffisance pancréatique
exocrine qui est détectée, dès la naissance ou au cours de la première année, chez
environ 85% des patients CF. Les modifications du suc pancréatique vont inhiber l’action
des enzymes pancréatiques en les empêchant de rejoindre le tube digestif. Ces enzymes
protéolytiques, glucolytiques et lipolytiques sont alors incapables de digérer les différents
nutriments ingérés lors de l’alimentation.
- 68 -
Introduction
Les lipides, substances énergétiques essentielles à notre organisme et à notre
croissance, ne sont ni digérés, ni absorbés par l'organisme mais directement restitués
sous forme de diarrhées graisseuses nommées stéatorrhées. Une malabsorption des
protéines, vitamines et minéraux contenus dans les aliments entraîne des carences. Ces
carences sont à l’origine d’une dénutrition provoquant un retard de croissance staturopondéral. De plus, les enzymes pancréatiques, ne pouvant rejoindre le tube digestif, vont
s’accumuler dans le pancréas et lui être nocives. Cette accumulation d’enzymes
digestives provoque une fibrose qui progressivement va conduire à la destruction du
pancréas.
Une atteinte hépatobiliaire est décrite chez un peu plus d’un quart des patients
CF. L’épaississement de la bile empêche son transport et provoque une obstruction des
canaux biliaires inhibant les fonctions digestives et métaboliques du foie. Cette mauvaise
circulation de la bile va provoquer une cirrhose biliaire focale chez plus de 20% des
patients qui dégénèrera en une cirrhose hépatique chez environ 10% d’entre eux et des
anomalies de la vésicule biliaire chez environ 30% des sujets CF [Rubenstein and Zeitlin,
1998; Wilschanski and Kerem, 2011].
De nombreux autres troubles digestifs peuvent être retrouvés. Par exemple, les
personnes CF ont 5 à 6 fois plus de risque de développer une maladie de Crohn. On
retrouve également une augmentation des cancers du tube digestif et dans plus de 25%
des cas un reflux gastro-œsophagien …
Afin de traiter ces différentes atteintes digestives, les patients CF doivent observer
un régime alimentaire hypercalorique en combinaison avec l’administration d’extraits
pancréatiques. En fonction de leurs carences, ils ajouteront des compléments
alimentaires, majoritairement des vitamines et oligo-éléments. La prise en charge de
l’atteinte hépatique repose principalement sur des traitements permettant de diminuer la
viscosité des sécrétions biliaires. En dernier recours, une transplantation du foie peut être
envisagée.
3.1.3 Atteintes génitales
L'appareil reproducteur peut lui aussi être perturbé, plus particulièrement chez les
hommes que chez les femmes.
- 69 -
Introduction
Les hommes CF sont, dans plus de 95% des cas, infertiles. Cette stérilité est
majoritairement due à une absence ou une atrophie des canaux déférents, ce qui résulte
en une azoospermie excrétoire. Ces canaux, assurant normalement le passage des
spermatozoïdes des testicules à la prostate, sont obstrués par l’accumulation de mucus
pathogène décrit précédemment.
On parle d’infertilité par absence bilatérale congénitale des canaux déférents (ABCD) ou
CABVD (Congenital bilateral absence of the vas deferens).
Chez les femmes une diminution de la fertilité est parfois observée. L’appareil
génital reste anatomiquement sans anomalie. Cette hypofertilité serait due à un
épaississement de la glaire cervicale qui obstruerait le passage des spermatozoïdes dans
le col de l’utérus.
Afin de palier à ces différents troubles de la fertilité une démarche de procréation
médicalement assistée peut être envisagée.
3.1.4 Atteintes associées
En plus de ces principales atteintes respiratoire, digestive et génitale, d’autres
affections associées, un peu moins caractéristiques et moins fréquentes, peuvent être
développées par les sujets CF [Wang et al., 2014].
On peut en particulier citer une complication endocrine qu’est le diabète. En effet,
suite à l’atteinte pancréatique exocrine aboutissant à une destruction du pancréas, la
fonction endocrine de celui-ci peut également être touchée. Ceci va engendrer une
destruction des îlots de Langerhans qui va aboutir à une insuffisance pancréatique
endocrine et un diabète [Moran et al., 2010]. Le diabète touche, selon le bilan 2012 de la
RFM, 15.8% des patients CF dont 12,4% sont insulino-dépendants.
De même, consécutivement aux atteintes respiratoires, des troubles musculosquelettiques apparaissent. 5,2% des patients CF suivis en France sont sujets à des
pathologies osseuses comme l’ostéopénie ou l’ostéoporose et 1,9% à de l’arthropathie et.
On dénombre également de nombreux cas d’hippocratisme digital.
Les personnes CF sont également plus sensibles à la déshydratation. En effet, au
niveau de l’épithélium des glandes sudoripares le sens des flux d’ions est inversé. En
situation normale, les ions chlorure entrent dans la cellule par le canal CFTR.
- 70 -
Introduction
Cette absorption permet de maintenir un équilibre en contrant la perte en chlorure
de sodium de la sueur, et ainsi éviter une déshydratation. Lors d’anomalies du canal
CFTR, les ions chlorure ne peuvent plus être absorbés. Ils sont alors évacués dans la
sueur provoquant de forts risques de déshydratation aigüe lors d’efforts physiques
soutenus ou de fortes chaleurs.
3.2 La recherche thérapeutique
Aucun traitement curatif n’a pu être envisagé devant le nombre important de
mutations associées aux anomalies de CFTR. Les multiples atteintes organiques diverses
et variées engendrées sont traitées séparément. La prise en charge de la maladie reste
alors très contraignante.
Les recherches thérapeutiques actuelles reposent sur l’espoir de traiter les défauts
de CFTR à leurs origines et non d’en traiter les conséquences. Ainsi, différentes
démarches sont envisagées. La thérapie génique pour faire exprimer, par les cellules
d’intérêt, le gène CFTR correct. Ou une approche protéique, avec le développement de
molécules pharmaceutiques venant corriger ou moduler les fonctions protéiques.
3.2.1 La thérapie génique
Depuis la découverte du gène CFTR, il y a maintenant 25 ans, de nombreuses
équipes de recherche ont envisagé la thérapie génique comme une possibilité
thérapeutique permettant de traiter la source de la maladie. Ainsi, pas moins de trente-six
essais
cliniques
ont
été
lancés
à
travers
le
monde
(source :
http://www.wiley.com/legacy/wileychi/genmed/clinical/).
Cette approche a pour but de remplacer le gène CFTR défectueux par un gène
sauvage et ainsi faire synthétiser la protéine CFTR normale par les cellules d’organes
touchés, en particulier les cellules épithéliales des voies aériennes, AEC (Airway
Epithelial Cells). Le gène CFTR doit donc être introduit dans les cellules cibles des
malades pour y être efficacement transcrit et traduit. L’axe principal des recherches
repose par conséquent sur le choix du vecteur à utiliser.
Les vecteurs qui ont été les plus étudiés sont les vecteurs viraux, tels que les AAV
(Adeno-Associated Virus) et les vecteurs synthétiques, utilisant en particulier des lipides
cationiques.
Malgré de grandes avancées, de nombreuses difficultés restent encore à résoudre
avant de pouvoir proposer ce type de traitement aux patients CF.
- 71 -
Introduction
En effet, bien que le transfert du gène dans des cellules épithéliales respiratoires
ait été réalisé avec succès, l’expression de CFTR reste transitoire et des effets
secondaires sont engendrés, comme par exemple des problèmes de toxicité et de
réactions immunitaires.
Ainsi, après toutes ces années de recherche, cette approche qui paraissait
prometteuse et avait laissé naître de nombreux espoirs, n’a pas encore répondu aux
attentes.
Actuellement l’espoir se tourne plutôt vers une nouvelle démarche thérapeutique
qui a déjà donné des résultats plus qu’encourageants : les traitements correcteurs.
3.2.2 Les traitements pharmacologiques
Les traitements correcteurs ont pour objectif de rétablir un transport ionique transépithélial correct. Pour cela, l’activité de nombreuses molécules pharmacologiques est
étudiée.
Deux démarches sont principalement envisagées. L’une repose sur une
modulation des transporteurs ioniques autres que CFTR. Et la deuxième, elle, intervient
directement sur les différentes altérations de la protéine CFTR pour lui rendre une activité
résiduelle suffisante.
3.2.2.1 Voiesalternativesdetransportionique
Cette
démarche
thérapeutique
envisage
l’utilisation
de
substances
pharmacologiques pour moduler les fonctions de transporteurs ioniques présents à la
membrane plasmique, autres que le canal CFTR.
Plusieurs recherches portent sur des molécules capables d’activer d’autres canaux
chlorures, comme les canaux chlorures calcium dépendants (CaCCs). Les molécules les
plus étudiées sont le peptide polycyclique Moli 1901, Duramycin® [Grasemann et al.,
2007; Oliynyk et al., 2010] et le Denufosol [Accurso et al., 2011; Kellerman et al., 2008;
Ratjen et al., 2012].
Le deuxième type d’agents ciblés est un composé bloquant l’absorption d’ions Na+
pour contrer leur passage excessif au niveau des épithéliums de sujets CF. Des
inhibiteurs des canaux ENaCs sont en particulier étudiés avec par exemple le dérivé
amiloride P680 (552-02) [Hirsh et al., 2008].
- 72 -
Introduction
3.2.2.2 Thérapieprotéique
La thérapie protéique cherche à intervenir directement sur les défauts de la
protéine CFTR engendrés par les différentes classes de mutation. Ainsi c’est une
correction spécifique s’adressant à un petit nombre de patients portant telle ou telle
mutation. Ces modulateurs de la protéine CFTR peuvent être distingués en deux groupes.
Les correcteurs qui agissent au niveau de l’adressage défectueux à la membrane
apicale des protéines : on parle d’une restauration des protéines CFTR.
Et les potentiateurs qui cherchent à activer et amplifier les fonctions de la
protéine : on parle d’une stimulation des protéines CFTR.
Cet axe de recherche soulève de grands espoirs. Plus d’une trentaine de
modulateurs de CFTR est actuellement en étude (http://www.exchemistry.com/chemcatalog/cftr-compounds/). Certains de ces composés ont déjà donné des résultats
notables et obtenu une autorisation de mise sur le marché.
Les recherches actuelles ont principalement porté sur l’identification de petites
molécules spécifiques aux mutations de classe I, II et III.
Les
différentes
approches
avec
quelques
exemples
de
molécules
pharmacologiques sont détaillées ci-dessous.
La correction de certaines mutations de classe I repose sur une stratégie de
translecture de codons stop prématurés. Certains composés sont capables de courtcircuiter la lecture de codons stop pour permettre une traduction complète de l’ARN
messager et donc la synthèse d’une protéine CFTR entière et fonctionnelle. Les
premières molécules testées, de la famille des aminosides : comme la Gentamycine, ont
permis de valider cette approche mais ne permettaient pas une administration à long
terme aux patients du fait de leur toxicité [Sermet-Gaudelus et al., 2007; Wilschanski et al.,
2003]. D’autre part, la molécule PTC124, Ataluren ®, a largement fait ses preuves et avec
une parfaite innocuité [Kerem et al., 2008; Sermet-Gaudelus et al., 2010a; Wilschanski et
al., 2011].
Les mutations de classe II peuvent être modulées d’une part par des correcteurs
et d’autre part par des potentiateurs.
- Les correcteurs vont chercher à rétablir les défauts de maturation de la protéine
CFTR pour lui permettre un adressage correct jusqu’à la membrane apicale des cellules.
- 73 -
Introduction
Ainsi certains composés, comme le 4-phénylbutyrate de sodium : 4PBA,
Buphenyl®, permettent de moduler l’expression et l’activité chaperonne de molécules
pour améliorer le transport intracellulaire du CFTR-508del [Lim et al., 2004b; Rubenstein
and Zeitlin, 1998; Zeitlin et al., 2002]. Le Miglustat, Zavesca®, agissant sur la protéine
chaperonne calnexine, a montré une bonne correction de la protéine CFTR en recherche
préclinique [Norez et al., 2009; Norez et al., 2006]. Mais, lors d’essais sur des patients CF,
ce traitement n’a montré qu’un très faible effet [Leonard et al., 2012].
D’autres correcteurs vont agir en favorisant l’adressage de la protéine CFTR
directement en interagissant avec elle. C’est en particulier le cas de la molécule VX-809,
aussi nommée Lumacaftor, qui a montré une restauration spécifique de la protéine CFTRF508del dans des essais in-vitro [Van Goor et al., 2011]. Des études du VX-809 sur des
patients CF porteurs homozygotes de la mutation F508del, ont démontré une amélioration
du transport d’ions chlores au niveau des glandes sudoripares mais pas au niveau
pulmonaire [Clancy et al., 2012]. Plus récemment, il a même été montré que ce type de
correcteur, en plus de permettre un bon adressage à la membrane, a une deuxième
fonction. Il intervient également dans la stabilité
de la protéine CFTR-F508del à la
membrane [Eckford et al., 2014].
Les potentiateurs vont intervenir pour améliorer la fonction des protéines CFTR
mutées, en particulier en agissant sur l’ouverture du canal. Ils s’adresseront donc aussi
bien aux mutations de classe II, que de classe III. Les premières molécules identifiées
comme pouvant favoriser l’ouverture du canal chlore furent entre autre le composé CPX
[McCarty et al., 2002] et la génistéine [Al-Nakkash et al., 2001]. Mais à l’heure actuelle,
s’il faut retenir un nom de potentiateur du CFTR, c’est le composé VX-770. Cette
molécule, aussi connue sous le nom d’Ivacaftor, a été au centre de nombreuses études
cliniques validant son extrême efficacité pour stimuler les fonctions de canaux CFTR
mutés. Le premier essai clinique comprenant des patients CF porteurs de la mutation
G551D a mis en avant des bénéfices thérapeutiques notables : amélioration de la fonction
pulmonaire, prise de poids, diminution des exacerbations pulmonaires et rétablissement
des sécrétions sudorales [Accurso et al., 2010; Davies et al., 2013; Ramsey et al., 2011].
Suite à ces résultats plus que probants, la molécule VX-770 (Kalydeco®) a obtenu
l’approbation de la FDA (Food and Drug Administration) pour être utilisée en tant que
traitement oral chez des patients CF (de 6 ans et plus) ayant une mutation G551D.
L’Ivacaftor est maintenant testé pour d’autres mutations que la G551D, en particulier pour
d’autres mutations de classe III, pour ainsi offrir un traitement à un grand nombre de
patients [Flume et al., 2012].
- 74 -
Introduction
Actuellement,
les
recherches
thérapeutiques
s’orientent
plus
vers
des
combinaisons de correcteurs et potentiateurs, pour permettre à la fois une restauration de
la protéine CFTR et en assurer une bonne fonctionnalité. Ainsi, des essais sont en cours
pour des traitements combinant l’Ivacaftor et le Lumacaftor [Boyle et al., 2014]. Les
résultats de la phase III de l’essai clinique ont montré une amélioration significative des
fonctions pulmonaires sur des patients homozygotes pour la mutation F508del
(http://www.cff.org/aboutCFFoundation/NewsEvents/6-24-Vertex-Phase-3-ResultsLumacaftor-Ivacaftor.cfm). Une demande de mise sur le marché de ce traitement
combinant le VX809 et le VX-770 devrait bientôt être faite.
Ainsi, les traitements correcteurs semblent prometteurs. Néanmoins, étant donné la
rareté de certaines mutations, il est très peu probable que cette forme de thérapie puisse
s’adresser à l’ensemble des patients atteints de mucoviscidose.
4 Dépistage et Diagnostic
Suivant les particularités génétiques et physiopathologiques de la mucoviscidose,
plusieurs outils de dépistage et/ou de diagnostic ont été développés. En France, la
stratégie de dépistage / diagnostic est bien établie.
Le dépistage et le diagnostic de la mucoviscidose peuvent être établis à différentes
périodes de la vie. En effet, ils peuvent avoir lieu durant la période prénatale s’il y a déjà
eu des antécédents familiaux ou en cas de signes d’appels échographiques. Au moment
de la naissance lors du test néonatal mis en place de manière systématique depuis 2002
en France. Ou plus tard au cours de la vie à la suite de symptômes cliniques.
4.1 Période prénatale
Le diagnostic prénatal de mucoviscidose durant une grossesse peut dépendre de
deux situations :
La première, lorsqu’un couple a déjà connaissance d’antécédents familiaux. En effet,
en France, un conseil génétique est proposé aux couples à risques identifiés lors d’études
familiales ou aux parents d’enfants atteints de mucoviscidose dépistés à la naissance.
Suite à ce conseil génétique, un dépistage prénatal peut être proposé aux couples à
risque et une interruption de grossesse médicale envisagée en cas de diagnostic positif
[Super et al., 1994].
- 75 -
Figure 46 : Organigramme du dépistage néonatal de la mucoviscidose
TIR : Trypsine immuno-réactive ; dpp : Différence de potentiel ; CRCM : Centres de Ressources et de
Compétences de la Mucoviscidose.
Introduction
La deuxième, lors d’anomalies fœtales découvertes lors d’une échographie. En
effet, lors du deuxième ou troisième trimestre d’une grossesse, une hyperéchogénicité
intestinale peut être visible. Ce signe a été corrélé à une forte suspicion de mucoviscidose
lors d’une étude réalisée en Bretagne qui a montré que 11% des fœtus atteints de
mucoviscidose présentaient cette particularité [Scotet et al., 2002]. D’autres signes
échographiques comme une dilatation des anses intestinales et une absence de
visualisation de la vésicule biliaire peuvent être des indicateurs de suspicion [Eggermont
and De Boeck, 1991].
Le diagnostic prénatal repose en premier lieu sur la recherche de mutations
parentales, qui si elles sont identifiées, seront recherchées sur l’ADN fœtal. Cette étude
est le plus souvent réalisée sur de l’ADN extrait de villosités choriales à partir de 12
semaines d’aménorrhée. Elle peut également être faite sur du liquide amniotique à partir
de 18 semaines d’aménorrhée.
4.2 Période postnatale
Depuis 2002, un dépistage systématique de la mucoviscidose a été mis en place à
la naissance. Lors de suspicion des tests diagnostiques vont être réalisés afin de
confirmer le statut de la maladie (Figure 46). Pour les personnes nées avant 2002, des
manifestations cliniques telles que des toux chroniques, des douleurs abdominales ou des
diarrhées graisseuses peuvent orienter une démarche diagnostique de la mucoviscidose.
Les principaux outils permettant de poser un diagnostic sont la réalisation d’un test
de la sueur couplé à une recherche de mutations CFTR.
4.2.1 Dépistage néonatal
Afin de permettre un diagnostic précoce avec une bonne prise en charge de la
maladie, le dépistage néonatal de la mucoviscidose de manière systématique a été mis
en place en 2002 en France [Farriaux, 2002]. Ce dépistage est réalisé au troisième jour
de vie par un dosage sanguin de trypsine immuno-réactive (TIR). La trypsine est une
enzyme pancréatique qui a été décrite comme augmentée dans la circulation sanguine
dans les premiers mois de vie des enfants CF. Ainsi si un taux supérieur à la normale est
retrouvé (>65ȝg/L), une recherche des mutations les plus fréquentes est effectuée,
avec un consentement écrit des parents.
L’identification d’une ou des deux mutations CFTR conduit à une prise en charge
de l’enfant dans un CRCM pour confirmer le diagnostic par un test de la sueur.
- 76 -
Introduction
Si aucune mutation n’a été identifiée ou que l’analyse moléculaire n’a pas été
effectuée (pas de consentement), un deuxième dosage contrôle de TIR est réalisé à 21
jours. Lorsque ce nouveau contrôle est positif, un test de la sueur est préconisé.
4.2.2 Outils diagnostiques de la mucoviscidose
Le diagnostic de la mucoviscidose est majoritairement établi suite à une recherche
des trente mutations les plus fréquemment retrouvées et à un test de la sueur positif.
Dans quelques cas, ces outils ne suffisent pas à confirmer un statut de
mucoviscidose.
Des tests complémentaires sont alors effectués : recherche approfondie
d’anomalies moléculaires et test fonctionnel de mesure de différence de potentiel transépithéliale.
4.2.2.1 Testdelasueur
Ce test diagnostique consiste en un dosage de la concentration sudorale en ions
chlorure. Il a été mis en place par les chercheurs Lewis Gibson et Robert Cooke en 1959,
suite à la découverte de Paul Di Sant’Agnese, qui avait montré quelques années plus tôt,
que les sécrétions sudorales de patients CF étaient anormalement riches en chlorure de
sodium et potassium. Cet examen se décompose en trois phases. La première étape
correspond à une stimulation de la sudation par iontophorèse à la pilocarpine. La
pilocarpine est une molécule alcaloïde d’origine végétale qui par ses propriétés
cholinergiques, stimule des récepteurs du système parasympathique. Les récepteurs M3,
responsables de l'exocytose des sécrétions, sont en particulier activés. Cette stimulation
entraîne ainsi une hyperproduction des glandes sécrétoires et donc, entre autre, une
hypersécrétion sudorale. La sueur est ensuite recueillie et les ions Cl- dosés. Ce test est
l’analyse de référence pour affirmer ou écarter un diagnostic de mucoviscidose. Sa
sensibilité est de 98% [Rota et al., 2008]. Ce test est dit positif s’il présente un taux de Clsupérieur à 60 mmol/L.
Si le test de la sueur se révèle négatif, concentration inférieure à 40 mmol/L
(30mmol/L chez les enfants), mais qu’une mutation avait été identifiée, les parents du
nouveau-né sont reçus en conseil génétique pour les informer des conséquences futures
possibles d’une hétérozygotie.
Si le test de la sueur présente un taux intermédiaire, entre 40 et 60 mmol/L (entre
30mmol/L et 60mmol/L chez les enfants), le diagnostic reste douteux et doit être renforcé
par d’autres examens. - 77 -
Figure 47 : Analyses moléculaires du gène CFTR
Stratégie d’analyse moléculaire du gène CFTR, à discuter selon les indications cliniques. Après les
différentes recherches de mutation, il reste entre 1 et 3% de patients atteints de mucoviscidose pour
lesquels une ou les deux mutations n’ont pas été identifiées. Il est possible que ce soit des mutations
introniques ou des mutations situées dans des régions régulatrices en 5’ ou 3’ du gène.
DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ; DHPLC : Denaturing High Performance Liquid
Chromatography ; HRM : High Resolution Melt ; QFM-PCR : Quantitative Fluorescent Multiplex
Polymerase Chain Reaction ; MLPA : Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification.
Adaptée de la thèse de A. de Becdelièvre, 2011 (tel-00733488)
Introduction
4.2.2.2 AnalysemoléculairedugèneCFTR
Aujourd’hui, en cas de suspicion de mucoviscidose, l’analyse moléculaire du gène
CFTR est bien établie (Figure 47). La première étape consiste à réaliser une recherche
des 30 mutations les plus fréquentes du gène. Cette étude est réalisée en quelques
heures grâce à plusieurs kits commerciaux (kits Cystic Fibrosis Genotyping Assay,
Abbott ; Elucigene TMCF30 ; Gene-Probe ; INNO-Lipa CFTR, Innogenetics). Ces
trousses commerciales ont une sensibilité de 80 à 85% sur l’analyse de population
caucasienne. Cette première recherche permet d’établir un génotype (détection des deux
mutations héritées) dans 60% des cas. Si les deux mutations sont identiques le patient
est dit homozygote. A l’inverse, si le patient a hérité de deux mutations différentes, il est
dit hétérozygote composite.
En cas de génotype non établi (une mutation voire les deux non caractérisées), on
poursuit alors l’étude par un balayage complet des séquences codantes du gène :
analyse de toutes les mutations décrites dans les 27 exons. Cette analyse est réalisée par
HRM (High-Resolution Melting Analysis) [Audrezet et al., 2008] et/ou séquençage avec
une sensibilité de détection des anomalies du gène CFTR supérieure à 95%.
Si le génotype reste toujours incomplet, une troisième étude sur les grands
réarrangements est réalisée. Ces grands remaniements (délétion / duplication), sont
retrouvés dans plus de 2% des anomalies du gène CFTR et révèlent plus de 20% des
allèles qui restaient non identifiés [Audrezet et al., 2004; Niel et al., 2004].
Au terme de toutes ces recherches il reste environ 1 à 3% de patients
mucoviscidose (selon l’origine géographique ou ethnique), pour lesquels au moins une
mutation n’a pas été caractérisée. Il est probable que ces patients soient porteurs de
mutations introniques ou de mutations situées dans des régions régulatrices en 5’ ou 3’
du gène.
4.2.2.3 DifférencedepotentieltransͲépithélialnasal
Dans le cas de diagnostic douteux, test de la sueur intermédiaire et/ou absence
d’identification de mutation CFTR, le diagnostic peut être complété par un test fonctionnel.
Ce test consiste à mesurer la différence de potentiel (ddp) trans-épithélial au niveau de la
muqueuse nasale et permet donc d’évaluer la fonction de la protéine CFTR au niveau de
l’épithélium nasal en analysant le transport ionique. Alors qu’en situation normale, la ddp
est de l’ordre de -20 millivolt (mV). Chez des patients CF, cette différence est d’environ 50 mV. Cette mesure permet en particulier d’identifier des formes atypiques de
mucoviscidose [Sermet-Gaudelus et al., 2010b; Wilschanski et al., 2001].
- 78 -
Introduction
Le diagnostic de la mucoviscidose est posé lors d’une association d’au moins une
des manifestations cliniques ou d’un antécédent familial dans la fratrie ou d’un test
néonatal positif avec un test de la sueur positif ou l’identification de deux mutations du
gène CFTR ou une ddp anormale.
Ainsi, le diagnostic de la mucoviscidose repose sur plusieurs paramètres :
symptomatiques, physiologiques et génétiques. Lors de ces démarches de dépistage et
diagnostic, des formes plus ou moins sévères de la maladie ont été mises en évidence.
On peut distinguer la forme classique de mucoviscidose : forme la plus sévère avec
une atteinte multisystémique, à des formes plus modérées ou atypiques souvent monosymptomatiques.
Pour des motifs médicaux, sociaux et psychologiques, il a été décidé de discerner la
mucoviscidose des pathologies liées à CFTR.
5 Les formes frontières
Le dépistage néonatal et les nouvelles stratégies de diagnostic, en particulier la
recherche d’anomalies moléculaires du gène CFTR, ont permis de mettre en évidence
des formes atténuées de mucoviscidose.
Ces manifestations, dites frontières, sont d'expression tardive, plus modérées et
souvent mono-symptomatiques [Ferrari and Cremonesi, 1996]. On parle de CF atypiques
ou CFTR-RD (CFTR-Related Disorders).
Ainsi, des altérations du gène CFTR peuvent aussi être responsables de pathologies
atypiques ou associées telles que des agénésies bilatérales des canaux déférents,
certaines formes de pancréatite chronique ou des bronchectasies [Bombieri et al., 2011;
Noone and Knowles, 2001].
5.1 Les cas d’infertilité masculine
L'absence bilatérale congénitale des canaux déférents (ABCD) ou congenital
bilateral absence of vas deferens (CBAVD), est rencontrée chez la grande majorité des
hommes atteints de mucoviscidose. Cette malformation peut également être observée
chez des hommes stériles indemnes de toute atteinte pulmonaire ou pancréatique. Elle
représente 2% des formes de stérilité masculine. Quatre-vingts pourcent des patients
porteurs d'une ABCD sont hétérozygotes composites, soit pour deux mutations du gène
CFTR à effet modéré, soit pour une mutation sévère (le plus souvent, ǻF508) et pour une
autre dont l'effet est plus modéré [Chillon et al., 1995].
- 79 -
Introduction
La présence d'un variant polypyrimidique (5T), dans le site accepteur d'épissage de
l'intron 8 du gène CFTR, est fortement associée à cette pathologie [Costes et al., 1995;
Cuppens and Cassiman, 2004].
Une fréquence anormalement élevée des mutations du gène CFTR a également été
retrouvée chez des patients ayant d'autres formes d'infertilité comme l'azoospermie
obstructive et les oligospermies [Jarvi et al., 1995].
5.2 Les pancréatiques chroniques idiopathiques
La pancréatite chronique (PC) se caractérise par une destruction progressive du
parenchyme pancréatique associée à une inflammation continue. Bien que la principale
cause des PC soit l’alcoolisme, il existe des formes de PC idiopathiques apparaissant dès
l’enfance.
En 1998, il a été suggéré l'existence d'un lien entre des mutations du gène CFTR et
les pancréatites idiopathiques [Sharer et al., 1998].
Il
est
actuellement
admis,
sur
des
arguments
épidémiologiques
et
physiopathologiques, que les mutations de CFTR sont des facteurs de prédisposition
génétique à la survenue de PC idiopathiques [Audrezet et al., 2002].
5.3 Les bronchectasies
Les bronchectasies ou dilatation des bronches se traduisent cliniquement par une
expectoration abondante et quotidienne due à une atteinte permanente, irréversible et
irrégulière du calibre bronchique. La muqueuse bronchique, inflammatoire, est le siège
d’une infection par P. aeruginosa ou S. aureus, qui peut aboutir à la destruction du
parenchyme pulmonaire.
Différentes études ont suggéré une corrélation entre des bronchectasies
idiopathiques et des mutations du gène CFTR [Girodon et al., 1997]. Ces observations ont
été confirmées par des travaux plus récents [Hubert et al., 2004].
D’autres phénotypes sont plus rarement associés au CFTR : aspergillose bronchopulmonaire d'origine allergique (ABPA) [Miller et al., 1996], polypose nasale, asthme
[Lazaro et al., 1999].
- 80 -
Figure 48 : Corrélation Génotype/Phénotype
Les mutations de classe I, II, III et VI sont plutôt corrélées à un phénotype sévère, qui correspond à une
forme classique de mucoviscidose. Alors que les mutations de classe IV et V (et quelques mutations de la
classe VI) sont corrélées à un phénotype modéré qui s’illustre par des formes atypiques ou des CFTRRD. Les principales mutations retrouvées dans ces différentes formes sont renseignées.
CF : Cystic Fibrosis ; CFTR-RD : CFTR-Related Disorders ; CBAVD : Congenital Bilateral Absence of
Vas Deferens ; ABPA : Aspergillose Broncho-Pulmonaire Allergique ; PS : Pancreatic Sufficiency ; PI :
Pancreatic Insufficiency.
Adaptée de [Sousa et al., 2012]
Introduction
6 Relation génotype-phénotype
Les corrélations entre les génotypes et les phénotypes, c’est-à-dire entre les
mutations et le tableau clinique, reposent avant tout sur la nature des mutations.
Globalement, les mutations de classe I, II, III ont un effet délétère "sévère". Au niveau
phénotypique, elles sont associées à une insuffisance pancréatique (PI pour Pancreatic
Insufficiency) et une atteinte pulmonaire qui débutent dans l’enfance (Figure 48). Les cas
de mucoviscidose classique de l’enfant et les patients homozygotes F508del en sont les
exemples les plus fréquents.
La combinaison d’une mutation "sévère" et d’une mutation "modérée" (classe IV et V),
ou de deux mutations "modérées", est plutôt associée à une forme atténuée de
mucoviscidose. Celle-ci se révèle plus tardivement, avec une conservation de la fonction
pancréatique (PS pour Pancreatic Sufficiency)
et une colonisation pulmonaire plus
tardive par le Pseudomonas aeruginosa [Zielenski, 2000].
Les mutations modérées, laissant persister une fonction CFTR résiduelle, ont un
effet dominant sur les mutations sévères.
Bien que ces classifications donnent des informations très précieuses sur les relations
entre le génotype mutationnel identifié et le phénotype observé, elles ne concernent qu’un
petit nombre de mutations.
La très grande majorité des anomalies moléculaires du gène CFTR étant des
événements rares, on peut observer une grande variabilité d’expression à l’échelle
individuelle. Ainsi, un patient porteur de deux mutations sévères, peut présenter un
phénotype classé relativement "peu sévère" pendant de nombreuses années. A l’inverse,
la présence d’une mutation qualifiée à priori de "peu sévère" peut parfois s’accompagner
d’une évolution rapide vers l’insuffisance respiratoire terminale.
De plus, des patients ayant des génotypes identiques peuvent présenter des
tableaux cliniques très différents.
- 81 -
Figure 49 : Contribution de différents facteurs sur la sévérité phénotypique
Influence des altérations du gène CFTR, des gènes modificateurs et de l’environnement sur les différents
organes atteints par la mucoviscidose.
Adaptée de http://www.cftr.info/
Introduction
Ce manque de corrélation suggère l’intervention de facteurs supplémentaires. Il a
ainsi été démontré que l’expression phénotypique de la mucoviscidose pouvait dépendre
de facteurs environnementaux, de la présence de mutations additionnelles sur un allèle
CFTR, et/ou de gènes modificateurs (Figure 49).
Des études sur des jumeaux ou sur des fratries laissent penser que les facteurs
environnementaux ne joueraient pas un rôle prépondérant sur les variations
phénotypiques [Picard et al., 2004]. Des recherches sur les atteintes pulmonaires
envisagent quand même un impact équivalent de l’environnement et de facteurs
génétiques [Collaco et al., 2010].
La présence d’une deuxième mutation ou d’une variation de séquence en cis sur
un allèle CFTR, nommée "allèle complexe" pourrait expliquer de nombreuses variations
phénotypiques.
Ces
altérations
supplémentaires
peuvent
intervenir
au
niveau
phénotypique en majorant ou atténuant l’effet délétère d’une mutation. Il a par exemple
été montré qu’un patient homozygote de la mutation F508del, portant une mutation
R553Q en plus sur un de ses allèles CFTR, présentait un phénotype moins sévère que la
majorité des homozygotes F508del [Dork et al., 1991]. A l’inverse, l’association de deux
mutations modérées sur un même allèle peut engendrer un phénotype sévère [Clain et al.,
2001].
Pour finir, la variabilité de l'expression phénotypique peut s’expliquer par
l’intervention de variants génétiques, en dehors du locus CFTR, dits gènes
modificateurs [Corvol et al., 2006; Vanscoy et al., 2007].
Les premiers gènes modificateurs impliqués dans la mucoviscidose ont été mis en
évidence par une approche de région chromosomique candidate. Plusieurs gènes,
comme le gène CLCA1 (chloride channel accessory 1), le gène ADIPOR2 (adiponectin
receptor 2), gène SLC4A4 ont ainsi été associés au développement d’iléus méconial
[Dorfman et al., 2009; van der Doef et al., 2010].
D’autres gènes modificateurs ont été identifiés, en testant divers polymorphismes
de "gènes candidats" sélectionnés en fonction de leur rôle potentiel dans la
physiopathologie. Parmi les gènes modificateurs interagissant dans la mucoviscidose, on
retrouve ceux impliqués dans la défense antimicrobienne et ceux intervenants dans les
réponses immuno-inflammatoires et anti-oxydantes [Acton and Wilmott, 2001].
- 82 -
Introduction
Au niveau de l'atteinte pulmonaire, ces études ont, en particulier, permis de
référencer les gènes MBL2 (Mannose-Binding Lectin 2) et NOS (Nitric Oxide Synthases)
comme étant associés à la défense antimicrobienne [Buranawuti et al., 2007]. Des gènes
participant à la réaction immuno-inflammatoire ont également été décrits, comme le TNFĮ (Tumor Necrosis Factor-Į), le TGF-ȕ1 (Transforming Growth Factor-ȕ 1), l’ACE
(Angiotensin Converting Enzyme), l’IL-8 (InterLeukine 8), l’IL-10 (InterLeukine 10) et les
antigènes HLA (Human Leucocyte Antigen) [Drumm et al., 2005; Hillian et al., 2008;
Weiler
and
Drumm,
2013].
Les
gènes
intervenants
dans
le
système
oxydants/antioxydants sont les GST (Glutathion-S-Transférases).
A l’heure actuelle, les méthodes d’identification de gènes modificateurs reposent
sur des analyses du génome entier (GWAS pour Genome-Wide Association Study). Ces
analyses permettent d’étudier plusieurs milliers de polymorphismes, dans de larges
cohortes de patients, pour les associer à des caractères phénotypiques.
Une étude nord-américaine a ainsi identifié six loci particuliers chez 320 patients
CF porteurs homozygotes de la mutation F508del et présentant une atteinte pulmonaire
sévère. Ces résultats ont permis de mettre en évidence le rôle du gène IFRD 1
(Interferon-Related Developmental Regulator 1) dans la modulation de l'atteinte
pulmonaire [Gu et al., 2009].
Une seconde étude, sur environ 3500 patients CF présentant une insuffisance
pancréatique, a décrit sept régions associées à la sévérité pulmonaire. Les loci 11p13 et
20q13.2 semblent particulièrement liés à cette atteinte [Wright et al., 2011].
Les consortiums nord-américain et français se sont ensuite regroupés pour créer
" The International CF modifier genes consortium ". De nouvelles études ont ainsi permis
d’identifier des loci impliqués dans l’iléus méconial [Sun et al., 2012], ou encore dans les
formes de diabète associées à la maladie [Blackman et al., 2013].
- 83 -
Introduction
D. Régulation transcriptionnelle du gène CFTR
L’expression du CFTR est régulée durant les différentes étapes allant du gène à la
protéine telles que la transcription, l’épissage, la traduction et les modifications posttraductionnelles.
Malgré des découvertes intéressantes associées à la protéine CFTR, il existe peu de
données sur les éléments clés intervenant dans la régulation de l’expression du gène
CFTR.
Cette partie sera uniquement consacrée à la description des régulations associées à
la transcription du gène CFTR. Ces régulations dépendent principalement de l’intervention
d’éléments régulateurs et de l’organisation chromatinienne du locus CFTR.
1 Expression du gène CFTR
Le gène CFTR a des profils d’expression spatio-temporels très variables. Son niveau
d’expression est finement régulé à la fois dans le temps, au cours du développement, et
dans l’espace, au niveau des différents organes [Koh et al., 1993; Tizzano et al., 1993].
1.1 Expression spatiale
La protéine CFTR est principalement retrouvée dans les organes et tissus
typiquement affectés par la mucoviscidose [Crawford et al., 1991; Gregory et al., 1990;
Trezise and Buchwald, 1991].
Ainsi, elle est spécifiquement exprimée au niveau du système respiratoire
[Trapnell et al., 1991], et plus particulièrement dans les poumons [Engelhardt et al., 1994].
On la retrouve aussi au niveau du système digestif, notamment dans le pancréas [Marino
et al., 1991] et l’intestin [Strong et al., 1994]. Et enfin, au niveau des glandes sudoripares
[Denning et al., 1992] et au niveau des organes reproducteurs [Tizzano et al., 1994].
A noter, que les taux de transcrits retrouvés dans les cellules épithéliales restent
relativement faibles [Yoshimura et al., 1991b]. Les plus importants sont retrouvés au
niveau des cellules épithéliales de l’intestin, du pancréas et des canaux déférents. Une
étude sur les lignées cellulaires HT-29 et T84, dérivées d’un adénocarcinome du côlon
humain, ont rapporté une faible efficacité du promoteur CFTR. En effet, en comparaison
avec une transcription induite par le promoteur de la ȕ-actine, la transcription avec le
promoteur CFTR ne représente que 5% [Yoshimura et al., 1991b].
- 84 -
Introduction
Entre 1 et 5 copies de transcrits CFTR seraient retrouvées par cellule HT-29
[Montrose-Rafizadeh et al., 1992]. Le niveau est encore plus faible au niveau pulmonaire,
avec seulement 1 à 2 copies de transcrits par cellule [Trapnell et al., 1991].
Par ailleurs, le gène CFTR est aussi exprimé dans d’autres tissus, ou cellules nonépithéliales [Yoshimura et al., 1991a]. Des expressions, dans des cellules sanguines
[Sterling et al., 2004], au niveau du cœur [Levesque et al., 1992], du cerveau
[Marcorelles et al., 2014; Mulberg et al., 1998], ou encore du rein [Morales et al., 2000],
ont par exemple été rapportées.
1.2 Expression temporelle
L’expression du gène CFTR varie considérablement au cours du développement.
Les premiers transcrits sont détectés dès le stade 8 cellules du développement
embryonnaire [Ben-Chetrit et al., 2002]. La protéine CFTR jouerait un rôle essentiel, en
tant que transporteurs des ions Na+ et Cl-, dans la formation de la cavité de la blastula, le
blastocoele.
Au cours du deuxième trimestre de grossesse, l’expression de CFTR peut être
identifiée dans différents organes et tissus [Harris et al., 1991; McCray et al., 1992;
Trezise et al., 1993]. Les taux de transcrits les plus élevés sont retrouvés au niveau du
pancréas. Des taux moyens sont détectés dans l’épithélium pulmonaire et au niveau de
l’intestin. Une présence plus faible de transcrits est trouvée au niveau de l’épithélium du
tractus génital masculin (épididyme).
Ce n’est que durant le troisième trimestre de grossesse, qu’une expression de
CFTR est identifiée dans le tractus génital féminin, au niveau des trompes de Fallope et
de l’utérus, et au niveau des glandes sudoripares et salivaires [Tizzano et al., 1994].
Pour la majorité de ces organes et tissus, leur profil d’expression est maintenu
jusqu’à la naissance. A noter, une exception au niveau pulmonaire. Le taux de transcrits
CFTR atteint son maximum vers la 24ème semaine de grossesse puis diminue fortement
jusqu’à pratiquement devenir nul dans le poumon adulte [Marcorelles et al., 2007; Trezise
et al., 1993].
- 85 -
Figure 50 : Sites d’initiation de la transcription
La transcription du gène CFTR peut démarrer au niveau de différents sites d’initiation. Plus d’une dizaine
de sites ont été répertoriés, dont certains sont tissus spécifiques. Le site décrit par Riordan et al. en 1989,
est classiquement le +1 de référence.
Adaptée de la thèse de A. de Becdelièvre, 2011 (tel-00733488)
Introduction
2 Promoteur CFTR
Bien que les quelques éléments de régulation présents dans le promoteur CFTR
soient nécessaires à son expression, ils ne peuvent expliquer la fine régulation spatiotemporelle du gène. Par l’absence d’une boîte TATA et la présence de nombreux sites
d’initiation de la transcription, le promoteur CFTR est régulièrement associé aux
promoteurs de gènes de ménage.
2.1 Structure du promoteur CFTR
Le promoteur CFTR est de type " dispersé ". Il ne contient pas les éléments de
régulation habituellement à l’origine de la transcription [Yoshimura et al., 1991b]. Il est
dépourvu d’une boîte TATA et présente de nombreuses régions riches en GC. La région
+1 à -592 contient 68% de GC [Chou et al., 1991]. Chou et al. ont également décrit un
promoteur minimal de -226 à +98.
La transcription du gène est initiée sur de nombreux sites d’initiation dont la plupart
sont tissu-spécifiques.
2.2 Sites d’initiation de la transcription
Différentes études ont montré que la transcription du gène CFTR peut être initiée
sur une dizaine de sites sur un peu plus de 150pb en amont du codon initiateur ATG de
l’exon 1 (Figure 50).
Le TSS +1 qui sert de référence est celui décrit par Riordan et al. en 1989. Il se
situe à -132pb de l’ATG.
Les sites d’initiation utilisés peuvent dépendre du niveau d’expression du gène
CFTR. Ainsi, il a été décrit que les lignées cellulaires HT-29, T84 et Caco-2, également
dérivées d’un adénocarcinome du côlon humain, qui expriment fortement le gène CFTR,
initient majoritairement la transcription au niveau d’un TSS +62 [Koh et al., 1993;
Yoshimura et al., 1991b]. Le TSS -21, est lui, spécifique aux cellules exprimant faiblement
le gène CFTR comme la lignée HeLa, dérivée d’un adénocarcinome utérin humain, et la
lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines B3.1.0 [Koh et al., 1993].
Une autre étude a démontré que certains sites d’initiation de la transcription sont
tissu-spécifiques et peuvent varier en fonction du stade de développement [White et al.,
1998]. Le TSS +65 est observé au niveau du pancréas. Deux TSS ont été identifiés au
niveau de l’intestin : TSS +19 et TSS +64.
- 86 -
Figure 51 : Eléments de régulation décrits au sein du promoteur CFTR
Représentations des différents éléments de cis- et trans-régulateurs identifiés au niveau du promoteur
CFTR. Les protéines écrites et entourées en bleu ont une action positive sur la transcription du gène
CFTR. Les éléments en rouge sont eux répressifs. Les étoiles rouges représentent des variations de la
séquence décrites comme modifiant la régulation du gène CFTR.
Introduction
Ce TSS +64 est également retrouvé dans les poumons adultes, alors que dans les
cellules pulmonaires fœtales, l’initiation de la transcription se fait au niveau du TSS +1.
2.3 Eléments de régulation de la région promotrice
Même si le promoteur CFTR ne peut expliquer à lui seul la fine régulation du gène
CFTR, de nombreux éléments cis- et trans-régulateurs ont tout de même été identifiés en
son sein (Figure 51). Toutes les positions décrites par la suite se réfèrent au TSS +1
décrit par Riordan.
Le promoteur CFTR comporte de nombreux sites potentiels de fixation de facteurs
de transcription tels que Sp1 (Specificity protein 1) et AP-1 (Activator Protein-1).
Les protéines Sp1 sont des facteurs de transcription à doigts de zinc. Elles sont
plus particulièrement impliquées dans la régulation de la transcription de gènes
dépourvus de boîte TATA. Ces FTs, qui se fixent sur des séquences riches en GC,
peuvent aussi bien agir en tant qu’activateur ou répresseur [Tan and Khachigian, 2009].
Le promoteur CFTR comporte trois sites riches en GC, 5’-GGGCGG-3’ susceptibles de
lier Sp1 (en position -194, -273 pb et -889 pb) [Chou et al., 1991; Yoshimura et al.,
1991b].
La variation moléculaire, avec la substitution d’un T par un G en position -94, a été
retrouvée chez une patiente CF. Il a été montré que cette altération modifie un site de
fixation pour le FT Sp1, mais également pour le FT USF2 (Upstream Stimulatory Factor 2).
Ces deux facteurs se lient normalement au promoteur CFTR pour activer sa transcription.
Une diminution transcriptionnelle est observée lors de l’altération des sites de fixation de
ces deux FTs [Taulan et al., 2007].
Les FT AP-1 se présentent sous la forme d’hétérodimères formés par l’association
de protéines Fos et Jun. Ces facteurs se fixent sur des régions TREs (TPA (12-Otetradecanoylphorbol)Response Elements) qui sont particulièrement présentes dans les
promoteurs de gènes domestiques. Six sites potentiels de liaison de AP-1, 5’TGAC/GTCA-3’, ont été décrits dans le promoteur CFTR en positions -222, -425, -612, 680, -914, et -996 pb) [Chou et al., 1991; Yoshimura et al., 1991b].
La substitution d’un T à la place d’un G (T>G) au niveau du site -680 permet,
uniquement dans cette configuration mutée, de fixer un FT l’AP-1. La liaison d’AP-1 sur ce
site régule négativement la transcription du gène CFTR [Bienvenu et al., 1995].
- 87 -
Introduction
D’autres sites potentiels pour lier des éléments régulateurs ont été identifiés dans
le promoteur CFTR. Dont quatre sites GRE (Glucocorticoid Receptor Element) en position
-878, -1079, -1165 et -1405, deux sites AP-2 (-1046 et -283) et un site de fixation pour la
protéine C/EBP (CCAAT Enhancer Binding Protein) à -125pb [Yoshimura et al., 1991b].
De plus, de nombreux éléments de régulation dans la région promotrice CFTR ont
clairement été identifiés comme intervenant sur la transcription du gène.
Le promoteur CFTR contient une séquence inversée CCAAT, aussi appelée
boîte Y, localisée de +1 à +13. Plusieurs protéines régulatrices sont en compétition pour
s’y fixer. Il a été montré que les fixations, du FT à fermeture éclair à leucine, C/EBP et de
du FT ATF/CREB (Activating Transcription Factor/cyclic-AMP Response Element Binding
Protein) sont nécessaires pour l’activation de la transcription du gène CFTR [Pittman et
al., 1995]. A l’inverse, la fixation de la protéine CDP/cut (CCAAT Displacement Protein
cut homolog inhibe la transcription de CFTR en empêchant la fixation de ATF-1 et de
l’histone acétyltransférase humaine hGCN5 (human General Control Non-depressible 5)
et en recrutant une histone désacétylase qui va modifier la structure de la chromatine [Li
et al., 1999].
Un variant du motif palindromique CRE (cAMP Response Element), 5’TGACaTCA-3’, a été identifié en position +14. Les FTs CREB et ATF, activés par la
protéine kinase PKA, s’y fixent pour moduler l’expression de manière AMPc dépendante
[Matthews and McKnight, 1996; McDonald et al., 1995].
Un polymorphisme au sein du promoteur minimal, en -102 T>A a été identifié et
décrit comme créant un motif CArG-like ((CC(A/T)richG)-like) [Romey et al., 1999]. Ce
site peut être reconnu par deux FTs, YY1 (Yin Yang 1) et SRF (Serum Response Factor)
[Rene et al., 2005; Romey et al., 2000]. L’antagonisme fonctionnel de ces deux FTs
résulte en une augmentation de l’expression du gène CFTR. La fonction répressive de
YY1 peut être augmentée par la protéine NRF2 (NF-E2 Related Factor) en situation de
stress oxydatif [Rene et al., 2010].
De plus, une étude plus récente, a montré que le FT se liait au promoteur CFTR
sur un site de -111 à -100 pour contribuer à son activation transcriptionnelle. Cette fixation
est dépendante de la phosphorylation de C/EBPȕ. Cette phosphorylation inhibe la fixation
répressive du facteur YY1 en favorisant sa liaison avec le facteur USF2 [Viart et al., 2013].
- 88 -
Introduction
Lors d’une inflammation, la protéine IL-1ȕ (Interleukine 1 beta) régule de manière
dose-dépendante l'expression du gène via l'activation du facteur de transcription NF-țB
(Nuclear Factor Kappa B) qui se fixe sur le motif ițB-like en position -1040 à -1030. Cette
fixation a un effet positif sur l’activation transcriptionnelle de CFTR [Brouillard et al., 2001].
En cas d’accumulation de protéines mal conformées dans le réticulum
endoplasmique, une réponse adaptative nommée UPR (Unfolded Protein Response) est
induite afin de protéger la cellule contre ce stress. Cette réponse réprime l'activité
promotrice du gène CFTR à travers la fixation du facteur de transcription ATF6
[Bartoszewski et al., 2008].
De la même manière, il a été montré qu’en condition d’hypoxie, la cellule répond
par la fixation du facteur HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1). HIF-1 se fixe sur le site HRE
(HIF Responsive Element) présent à -718pb et réprime la transcription du gène CFTR
[Zheng et al., 2009].
Pour finir, un variant à -33 (G>A) empêche la fixation de la protéine FOXI1, ce qui
entraîne une forte diminution de la transcription de CFTR [Lopez et al., 2011].
3 Organisation chromatinienne du locus CFTR
Comme décrit dans le paragraphe précédant, la régulation transcriptionnelle du gène
CFTR n’est pas exclusivement due aux éléments régulateurs présents au niveau de la
région promotrice.
Ainsi, cette régulation repose sur d’autres mécanismes. Elle peut en particulier
dépendre de la conformation chromatinienne du locus CFTR ou de sa localisation
nucléaire.
3.1 Accessibilité de la chromatine et régulations
En fonction de l’accessibilité de la chromatine, des séquences régulatrices
éloignées peuvent intervenir au niveau du promoteur CFTR pour en moduler son
expression. L’accessibilité de la chromatine peut être documentée par l’analyse de
marques épigénétiques, par la recherche de sites hypersensibles à la DNAse ou encore
par l’étude de l’arrangement des nucléosomes. Ce paragraphe décrira les différentes
études de l’état de la chromatine du locus CFTR qui ont permis de découvrir de nouveaux
éléments régulateurs.
- 89 -
Introduction
3.1.1 En amont du gène, dans la région 5’
Les premières études de l’organisation et de l’accessibilité de la chromatine du
locus CFTR remontent à plus de 20 ans.
En 1993, Koh et al. comparèrent les profils de méthylation de l’ADN au niveau
du promoteur CFTR dans différentes lignées cellulaires exprimant ou non CFTR [Koh et
al., 1993]. Ils décrivirent que le promoteur CFTR est hypométhylé dans les cellules
exprimant fortement le gène (T84) et hyperméthylé dans les cellules ayant une faible
expression (HeLa et B3.1.0).
Plus récemment, un autre groupe de recherches a mis en cause ces observations
en ne distinguant pas de profils majeurs de méthylation sur des lignées et cultures
primaires exprimant différemment le gène CFTR [Lewandowska et al., 2010]. Ils ont ainsi
conclu que la méthylation du promoteur CFTR n’est pas la principale cause d’inactivation
du gène.
Une autre étude a fait le même constat en montrant que la méthylation de l’ADN
du promoteur n’influençait pas la régulation tissu-spécifique de l’expression de CFTR et
n’intervenait pas non plus dans les différences de niveaux d’expression au cours du
développement [Bergougnoux et al., 2014].
Par ailleurs, la méthylation de l’ADN pourrait intervenir en réponse à des stimuli
environnementaux ou en contexte pathologique. En effet, il a été décrit qu’en condition de
stress, induit par le réticulum endoplasmique, le promoteur CFTR devenait hyperméthylé
et donc réprimé [Bartoszewski et al., 2008].
Une étude a également montré que le promoteur CFTR de cellules cancéreuses
de patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC : Non-Small
Cell Lung Cancer), était hyperméthylé par rapport à des cellules de poumon sain [Son et
al., 2011]. Le niveau de méthylation serait même corrélé à la survie des patients.
L’importance de la méthylation serait de mauvais pronostic pour les patients âgés de 62
ans ou moins.
De plus, il a été montré que les cellules exprimant CFTR possédaient un
promoteur riche en marques d’histones spécifiques d’une chromatine permissive,
comme H3K4me2 et des acétylations [Blackledge et al., 2007].
D’autres travaux, tout juste publiés, ont également décrit in-vivo une corrélation
entre le niveau d’expression de CFTR et la présence de modifications d’histones
retrouvée dans une chromatine active [Bergougnoux et al., 2014].
- 90 -
Figure 52 : Localisation de sites DHS dans la région 5’ du gène CFTR
De nombreux sites hypersensibles à la DNAse 1 (DHS) ont été identifiés au sein du promoteur CFTR et
dans la région en amont. Certains de ces sites sont tissus spécifiques. C’est par exemple le cas des DHS
-3,4 ; -35 et -44 kb qui sont majoritairement retrouvés dans des cellules épithéliales des voies aériennes.
Introduction
Ainsi, dans des tissus exprimant le gène CFTR (digestif et pulmonaire), le
promoteur est associé à une chromatine accessible mais est caractérisé par la présence
de marques de chromatine active (H3K4me3) et silencieuse (H3K27me3). Cette
configuration bivalente de la chromatine est typique des promoteurs riches en GC [Zhou
et al., 2011]. Alors que les tissus n’exprimant pas le gène ne présentent que des marques
de chromatine silencieuse (H3k27me3) et toutes les séquences régulatrices sont
associées à des histones hypoacétylés.
Outre les analyses de méthylation de l’ADN, en 1993 Koh et al. ont également
recherché des sites d’accessibilité de l’ADN en étudiant les sites hypersensibles à la
DNAse 1 (DHS). Ils ont ainsi identifié 5 sites au sein du promoteur de cellules de la lignée
T84, à environ -900, -800, -400, -200 et +200pb (Figure 52). En 1991, Yoshimura et al.
avaient déjà identifié des sites à environ -3000, -1600, -900 et -200pb dans des cellules
HT-29 [Yoshimura et al., 1991a]. Par la suite, le groupe de Ann Harris a identifié deux
nouveaux DHS à -79,5 et -20,9 kb de l’ATG [Smith et al., 1995]. Ces DHS ne sont pas
spécifiques à un tissu et sont même retrouvés dans des cellules n’exprimant pas le gène
CFTR. Des DHS plus spécifiques de cellules épithéliales des voies aériennes (AEC Airway Epithelial Cells) à -3,4 ; -35 et -44 kb ont ensuite été découverts [Zhang et al.,
2012]. Les DHS -35 et -44kb avaient également été identifiés dans des cultures primaires
d’épididyme [Ott et al., 2009a].
Des recherches supplémentaires ont ensuite permis d’identifier que le DHS 20,9kb permettait le recrutement de l’insulateur CTCF. Cet élément empêche les
interactions entre des FTs activateurs et le promoteur CFTR. Il a une activité de blocage
d’enhancers, enhancer-blocking activity [Blackledge et al., 2007].
Le groupe de Job Dekker a par ailleurs montré qu’une région à proximité de ce DHS, à
environ -20kb ; et une autre à -80kb interagissaient spécifiquement avec le promoteur
CFTR uniquement dans des cellules exprimant le gène [Gheldof et al., 2010]. Ces
résultats ont été confirmés en montrant des interactions de la région du DHS -79,5kb avec
le promoteur dans des cellules 16HBE14o- et Caco-2 [Zhang et al., 2012]. Cette même
étude a également montré une interaction d’une région à -163kb avec le promoteur.
Les DHS -3,4 et -35kb ont, eux, été décrits comme des enhancers spécifiques des
cellules AEC [Zhang et al., 2012]. Ils possèdent des marques H3K4me1 retrouvées dans
des régions de chromatine ouvertes.
- 91 -
Introduction
Il est ainsi intéressant de noter que des régions séparées du promoteur par
l’insulateur du DHS -20,9kb peuvent l’outrepasser pour réguler le gène. Ceci peut
s’expliquer par la formation de boucles de chromatine grâce aux interactions des régions
encore plus en aval citées précédemment.
Une étude approfondie du DHS -35kb a isolé une région de 350pb à laquelle
viendraient se fixer les éléments IRF1 (Interferon Regulatory Factor 1) et NF-Y (Nuclear
Factor Y) [Zhang et al., 2013]. Ces facteurs joueraient un rôle crucial dans l’expression
spécifique de CFTR dans les AEC en formant un réseau de régulation avec d’autres
protéines telles que l’histone-lysine N-méthyltransférase SETD7, sin3A ou encore p300.
Pour finir, l’accessibilité des éléments de régulation peut aussi dépendre de la
présence ou non de nucléosomes. Ainsi l’équipe de Ann Harris a réalisé des analyses
d’occupation des nucléosomes le long du locus CFTR.
Une première étude sur une région de 2,7kb recouvrant le promoteur, a permis
l’identification de quatre régions dépourvues de nucléosomes [Ott et al., 2012]. Ces
régions, nommées NFR (Nucleosome Free Region), ont été numérotées de 1 à 4 et
possèdent les coordonnées suivantes : NFR1= -138 à -88 ; NFR2= -268 à -218 ; NFR3= 459 à -378 et NFR4= -568 à -528pb. Les cellules présentant les plus importants niveaux
d’expression de CFTR sont les plus déplétées. Un recrutement, cellules spécifiques, de
complexes protéiques a été démontré au niveau de NFR1 et NFR4. Ces deux régions
contiennent des motifs de liaison à des FTs très conservés dans de nombreux promoteurs
de gènes humains. L’activité du promoteur CFTR est influencée par NFR1 et NFR4. En
effet, une modulation de l’expression est observée lors de mutations de ces régions.
Une deuxième étude, dont l’analyse s’est portée sur un locus de 250kb comportant
le gène CFTR, a montré que le DHS -35kb était déplété d’au moins trois nucléosomes
dans des cellules 16HBEo- [Yigit et al., 2013]. Cette région dépourvue de nucléosome
permet la fixation d’un composant du complexe de remodelage de la chromatine
SWI/SNF, l’élément BAF155 (BRG1-Associated Factor 155).
De plus, il a été observé une modification du positionnement de deux nucléosomes au
niveau du site CTCF du DHS -20,9kb. Les nucléosomes sont en général espacés
d’environ 150pb. Ici, ils sont espacés de 270pb. Cette augmentation d’espace libre
permettrait un meilleur accès au CTCF.
- 92 -
Figure 53 : Localisation de sites DHS dans les régions introniques du gène CFTR
De nombreux sites hypersensibles à la DNAse 1 (DHS) ont été identifiés dans les régions introniques du
gène CFTR. Par exemple dans l’intron 1 deux sites ont été décrits dont un en position 185 +10kb, c'est-àdire à 10kb du dernier nucléotide de l’exon 1 qui se situe à 185pb de l’ATG.
Introduction
3.1.2 Au sein du gène, dans les régions introniques
Le groupe de Ann Harris a également identifié de nombreux DHS au sein des
régions introniques du gène CFTR (Figure 53).
Le premier, localisé dans l’intron 1, a été identifié en 1996 en position 185 +10kb,
c'est-à-dire à 10kb du dernier nucléotide de l’exon 1 qui se situe à 185pb de l’ATG [Smith
et al., 1996].
Quelques années plus tard, dix nouveaux DHS ont été décrits dans les introns 2
(296+4,4kb), 3 (405+0,7kb), 10 (1716+ 13,2 ; + 13,7 et +23kb), 16 (3120+3kb), 17a (3271
+0,7kb), 18 (3600+6,8kb), 20 (4005+4kb) et 21 (4095+7,2kb) [Smith et al., 2000]. Les
coordonnées de ces sites sont données suivant l’ancienne nomenclature de numérotation
des exons de 1 à 24. Plusieurs de ces DHS sont associés à une expression tissuspécifique du gène CFTR. C’est en particulier le cas des DHS de l’intron 1, 2, 10
(1716+23kb) et 18.
Une autre étude a permis d’identifier un DHS dans l’intron 11 (1811+0,8kb), un
DHS dans l’intron 18 (3600+1,6kb) dans des cellules HT29, et trois DHS, dans l’intron 18
(3600+10kb), l’intron 19 (3849+12,5kb) et l’intron 23 (4374+1,3kb), dans des cultures
primaires HTE (Human Tracheal Epithelial cells) [Ott et al., 2009a].
Plus récemment, deux nouveaux DHS ont été détectés dans des cellules Calu-3,
un dans l’intron 1 (185+20 kb) et un autre dans l’intron 16 (3120+1 kb) [Zhang et al.,
2012].
Pour finir, lors d’une étude de l’accessibilité de la chromatine dans des cellules
épithéliales humaines de l’épididyme sur le génome entier, un dernier DHS a été décrit
dans l’intron 20 (4005+3kb) [Bischof et al., 2013].
Les premières études ont cherché à caractériser l’importance de ces DHS sur
l’expression du gène CFTR. Ainsi, il a d’abord été montré que le DHS de l’intron 1
possède une activité enhancer sur le promoteur CFTR [Mogayzel and Ashlock, 2000;
Moulin et al., 1999; Rowntree et al., 2001; Smith et al., 1996]. Les DHS des introns 20 et
21 ont également été reconnus comme des enhancer [Phylactides et al., 2002]. Une
autre étude, a quant à elle, affirmé que l’activité du promoteur CFTR pouvait être régulée
de manière tissu-spécifique. En effet, la fixation de la protéine HNF1Į (Hepatocyte
Nuclear Factor 1Į) au niveau des DHS des introns 10, 17a et 20 augmente la
transcription du gène CFTR dans des cellules intestinales [Mouchel et al., 2004]. Dans ce
sens, d’autres travaux ont mis en évidence la fixation du FT PBX1 (Pre-B-Cell Leukemia
Homeobox 1) au niveau du DHS de l’intron 16 [McCarthy et al., 2009].
- 93 -
Introduction
Le DHS de l’intron 23 a lui été caractérisé comme ayant une activité enhancer dans des
cellules intestinales et AEC [Zhang et al., 2012].
Les DHS les plus relevants ont été plus finement analysés afin de mieux
comprendre et documenter leur mode d’action.
Le DHS de l’intron 1 qui augmente l’expression de CFTR dans les cellules
intestinales a été étudié plus attentivement.
Des recherches dans des cellules Caco-2, ont révélé que la structure de la chromatine au
niveau de ce DHS portait des marques spécifiques d’un état actif. Les histones H3 et H4 y
sont fortement acétylés [Paul et al., 2007]. Cette configuration permet d’ailleurs aux FTs
HNF1Į, CDX2 (Caudal homeobox protein 2) et TCF4 (T Cell Factor 4) de s’y fixer pour
permettre l’activation de la transcription. Cette activation est possible par la formation
d’une boucle d’ADN qui permet à ces facteurs de rentrer en contact direct avec le
promoteur CFTR [Ott et al., 2009b]. Ce mécanisme est bien tissu-spécifique car les
interactions entre le promoteur CFTR et le DHS de l’intron 1, décrites grâce à la technique
3C, ont spécifiquement été retrouvées dans des cellules Caco-2. Une étude parallèle a
montré que ce DHS est aussi associé avec l’acétyltransférase p300 [Ott et al., 2009a].
De plus, une dernière étude a montré, dans ce même type cellulaire, que cette région
était dépourvue de nucléosome [Yigit et al., 2013].
Le DHS de l’intron 11 a également été étudié plus en détail. Il a été décrit comme
un enhancer fort dans des cellules intestinales [Ott et al., 2009a]. Il permet d’augmenter
d’un facteur 20 l’expression du gène CFTR. Cette action dépend également d’un
repliement chromatinien permettant une interaction directe avec le promoteur avec un
recrutement de HNF1 et p300. La formation d’une boucle d’ADN a aussi été décrite par
un autre groupe de recherches qui a décrit en plus une liaison entre cette région et une
région en 3’ [Gheldof et al., 2010]. La recherche de FTs pouvant intervenir dans cette
régulation a mis en évidence l’intervention d’un réseau protéique incluant en plus des
éléments précédemment identifiés, les FTs FOXA1, FOXA2 et CDX2 [Kerschner et al.,
2014].
Les études d’occupation de nucléosomes ont révélé la déplétion de deux nucléosomes au
niveau de ce site [Yigit et al., 2013]. Ces espaces libres plus importants permettraient
ainsi de favoriser tous ces facteurs de régulation.
- 94 -
Figure 54 : Localisation de sites DHS dans la région 3’ du gène CFTR
De nombreux sites hypersensibles à la DNAse 1 (DHS) ont également été identifiés en aval du gène
CFTR. Certains de ces sites sont tissus spécifiques. C’est par exemple le cas des DHS 4574 + 21,5 et
4574 + 36,6 kb qui sont majoritairement retrouvés dans des cellules épithéliales des voies aériennes. La
position 4574 correspond au dernier nucléotide du dernier exon du gène.
Figure 55 : Profils du locus CFTR
A. Profils des données d’éléments de régulation du locus CFTR sur le site UCSC. Visualisation de
marques d’histones, de sites d’accessibilité à la chromatine (DHS) ou encore de sites de liaison à des
facteurs de transcription.
B. Formation de boucles d’ADN au sein du locus CFTR. Le locus CFTR de cellules exprimant le gène
ne reste pas linéaire. Différents repliements chromatiniens permettent à des régions régulatrices
éloignées d’être rapprochées du promoteur CFTR. Ainsi, les facteurs de transcription recrutés au niveau
de ces régions peuvent entrer en contact avec la région promotrice. Adaptée de [Blackledge et al., 2009]
Introduction
3.1.3
En aval du gène, dans la région 3’
L’analyse de sites DHS s’est également portée sur la région suivant le gène CFTR
en aval (Figure 54).
Dans la région 3' non codante du gène CFTR, cinq autres DHS ont tout d’abord
été découverts en position 4574 +5,4; +6,8 ; +7 ; +7,4 et +15,6 kb (la position 4574
correspond au dernier nucléotide du dernier exon du gène) [Nuthall et al., 1999]. Deux
autres DHS ont ensuite été isolés spécifiquement de cultures de AEC en position 4574 +
21,5kb et 4574 + 36,6kb [Ott et al., 2009a]. Cette même étude a également décrit un DHS
en position 4574 + 48,9kb retrouvé de manière ubiquitaire et liant la protéine RAD21, une
sous-unité de la cohésine.
Le DHS 4574 + 6,8kb, uniquement retrouvé dans des cellules pulmonaires et de
l'épididyme, comporte une action insulatrice avec une activité de blocage des interactions
amplificateur-promoteur via la fixation du facteur CTCF [Blackledge et al., 2009]. Une
étude dans des cultures primaires de cellules de l’épididyme a montré que son action
passe également par la formation d’une structure chromatinienne particulière qui lui
permet d’être rapproché du promoteur CFTR. La région de ce DHS est également
dépourvue de nucléosome. Un nucléosome y serait au moins déplété [Yigit et al., 2013].
Le DHS 4574 + 15,6kb, seulement retrouvé dans les cellules exprimant le gène
CFTR, contient une région pouvant fixer les protéines CREB/ATF, AP-l et C/EBP, qui
régulent l'activité promotrice du gène CFTR et lient d'autres facteurs de transcription
comme ARP-l et HNF-4 [Rowntree and Harris, 2002]. Bien qu’il ne fixe pas l’insulateur
CTCF, cet élément portant des marques spécifiques de chromatine active possède une
activité de blocage d’enhancer [Blackledge et al., 2007]. Il fonctionne donc différemment
des autres insulateurs des DHS -20,9kb et 4574 +6,5kb. Son action passerait peut être
par le recrutement de l’hétérodimère RXRĮ-VDR (Retinoic X Receptor Į - Vitamin D
Receptor). La région de ce DHS entre également en contact direct avec le promoteur
CFTR et interagit avec la région du DHS de l’intron 11 [Ott et al., 2009a].
Ainsi, l’expression du gène CFTR est finement régulée par l’intervention de
nombreux facteurs cis- et trans-régulateurs. Ces éléments dépendent eux-mêmes de la
conformation chromatinienne du locus CFTR ou pour certains d’entre-eux régulent cette
organisation tri-dimensionnelle du locus CFTR (Figure 55).
- 95 -
Introduction
Une étude tout juste publiée a d’ailleurs mis en exergue l’importance des protéines
CTCF et RAD21 dans cette fine régulation [Gosalia et al., 2014]. Ces deux protéines sont
toutes les deux essentielles à l’organisation du locus CFTR mais de manière distincte.
CTCF intervient plutôt dans le maintien des interactions aux sites de liaison de ces
facteurs, en particulier au niveau des régions à activité de blocage d’enhancer en 5’ et 3’
du gène.
RAD21 intervient également dans ce mécanisme mais stabilise en plus les
interactions avec les enhancers des régions introniques.
Étonnamment, la déplétion de CTCF et RAD21 entraîne une augmentation de
l’expression du gène CFTR. Cette hausse d’expression peut s’expliquer par des
altérations des modifications des histones, des différences d’occupation de FTs et un
repositionnement nucléaire du locus CFTR en l’absence de CTCF et RAD21.
3.2 Localisation nucléaire du locus CFTR
L’état transcriptionnel du gène CFTR impacte sa localisation nucléaire. En effet, il a
été démontré que, lorsque le gène CFTR est actif, il est préférentiellement localisé au
centre de l’espace nucléaire. Par contre, quand le gène est dans un état silencieux, il se
retrouve au niveau de l’hétérochromatine périnucléaire [Zink et al., 2004]. A l’inverse, un
changement de localisation nucléaire du locus CFTR n’impacte pas son état
transcriptionnel. Cette localisation dépend uniquement du statut transcriptionnel, elle n’est
pas impactée par le niveau de transcription.
Le positionnement du gène CFTR inactif dans l’espace périnucléaire est dépendant
des protéines CTCF, des lamines de type A et d’histones désacétylases (HDAC) [Muck et
al., 2012]. Le rôle de CTCF a été confirmé par une autre étude qui a montré qu’en
absence de CTCF et de RAD21, le gène CFTR était internalisé dans l’espace nucléaire
[Gosalia et al., 2014].
- 96 -
Projet de Thèse
OBJECTIFSETSTRATEGIESDUPROJETDE
THESE
Bien que de nombreuses études aient permis une meilleure description et
compréhension physiopathologique de la mucoviscidose, elle reste néanmoins la maladie
génétique létale la plus fréquente dans les populations europoïdes. C’est une pathologie
complexe caractérisée par une importante variabilité phénotypique. De nombreuses
interrogations subsistent sur les mécanismes à l’origine de ces manifestations cliniques
très hétérogènes. Ces disparités sont également décrites pour des patients porteurs d’un
même génotype. De plus, chez un petit nombre de patients, le génotype n’a pas
entièrement été établi. Toutes ces constatations impliquent certainement des processus
de régulation non identifiés.
Début 2010, au moment du lancement de ce projet, de nombreux éléments de
régulation avaient été décrits au sein de la région promotrice du gène CFTR (voir § D.2.3).
Cependant, ces éléments ne pouvaient expliquer à eux seuls la fine régulation, en
particulier tissu-spécifique, du gène CFTR. Par ailleurs, plusieurs études avaient
démontré la présence, tissu-spécifique ou non, de nombreux sites DHS au sein du locus
CFTR et leur lien avec des facteurs trans-régulateurs (voir § D.3.1). Ainsi, certaines
régions de ces DHS, comme le DHS 185 +10kb présent dans l’intron 1 ou le DHS
1811+0,8kb de l’intron 11, ont été décrites comme ayant une activité enhancer sur
l’expression du gène CFTR.
Des premiers travaux, tout juste publiés par le groupe de recherche de Ann Harris,
permettaient d’expliquer le mécanisme d’action de ces régulations en mettant en évidence
la formation de boucles chromatiniennes. Ces repliements d’ADN permettent ainsi à ces
régions régulatrices distantes de se retrouver à proximité de la région promotrice du gène
et de réguler le gène grâce aux facteurs trans-régulateurs s’y liant. De la sorte, le groupe
de Ann Harris venait d’identifier par la technique 3C, des interactions entre le promoteur
CFTR et différents sites DHS dans des modèles cellulaires différents. Leur première
étude mettait particulièrement en évidence une forte interaction entre le promoteur CFTR
et une région en 3’ au niveau du site DHS 4574 + 6,8kb dans des cellules primaires de
l’épididyme [Blackledge et al., 2009]. Une seconde étude révélait que l’activité enhancer
du DHS 185 +10kb de l’intron 1 passait par la formation d’une boucle d’ADN.
- 97 -
Projet de Thèse
Ce mécanisme a été montré comme étant tissu-spécifique. Les interactions entre
cette région de l’intron 1 et le promoteur CFTR ont uniquement été décrites dans des
cellules Caco-2. Elles n’ont pas été retrouvées dans des cellules 16HBE14o- ni dans des
cultures primaires de fibroblastes de peau [Ott et al., 2009b]. Pour finir, d’autres travaux
venaient d’exposer une importante interaction entre le promoteur CFTR et la forte région
enhancer du DHS 1811+0,8kb de l’intron 11. Une deuxième interaction, avec une région
en 3’ au niveau du DHS 4574 + 15,6kb, était également montrée. Malgré des analyses
dans six types cellulaires différents, ces deux interactions ont principalement été
identifiées dans des cellules Caco-2 [Ott et al., 2009a].
L’ensemble de ces travaux confirmait que l’expression du gène CFTR est soumise à
des régulations à distance. Ces régions régulatrices peuvent aussi bien être situées dans
des régions introniques du gène CFTR ou des régions entourant le gène. De plus,
l’identification de ces éléments de régulation peut être réalisée par l’analyse
conformationnelle du locus.
C’est dans cette optique que ce projet a été initié.
Afin de mieux décrypter les mécanismes de régulation du gène CFTR, plusieurs
études ont été menées durant ce projet.
La technique 3C a, dans un premier temps, été développée au sein du laboratoire en
reproduisant des résultats déjà publiés.
Une fois cette technique bien maîtrisée, elle a été utilisée au travers de deux études
réalisées en parallèle.
Nous avons, d’une part, cherché à décrire si la conformation chromatinienne du locus
CFTR pouvait expliquer les cas de patients CF dont une mutation n’avait pas été
identifiée.
D’autre part, nous avons cherché à identifier de nouveaux éléments de régulation du
gène CFTR, au sein de régions non-codantes conservées.
Pour finir, nous sommes passés à une variante à plus haut débit avec la technique
5C. Cette méthode a été utilisée pour analyser la conformation chromatinienne d’un large
locus CFTR. Ces analyses ont été réalisées dans des cultures primaires de cellules,
exprimant ou non le gène CFTR, afin d’identifier de possibles dissemblances expressiondépendante de l’organisation du locus CFTR.
- 98 -
MATÉRIELS
&
MÉTHODES
- 99 -
Matériels et Méthodes
Partie2.MATERIELSETMETHODES
A. Culture cellulaire
Durant ce projet, des lignées cellulaires ont tout d’abord été utilisées pour les mises
au point techniques et quelques premières analyses. Nous avons ensuite préféré travailler
sur du matériel génétique " frais ", n’ayant pas subi de dégénération, en réalisant des
cultures primaires.
L’ensemble des cellules a été cultivé à 37°C en présence d’une atmosphère
contenant 5% de CO2. Les manipulations des cellules ont toutes été réalisées en
condition stérile sous une hotte à flux laminaire avec du matériel à usage unique stérile.
1 Lignées cellulaires
Deux types de lignées cellulaires ont été utilisés pour les mises au point et analyses
de la technique 3C.
1.1 Caco-2
Les cellules Caco-2 sont issues d'un carcinome humain du côlon. Cette lignée
cellulaire exprime fortement le gène CFTR sauvage.
Les cellules Caco-2 ont été cultivées dans du milieu nutritif de culture EMEM (Eagle's
Minimal Essential Medium) supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 1% de LGlutamine et 1% d’antibiotique pénicilline/streptomycine (P/S).
1.2 Lignées lymphoblastoïdes
Des lignées de cellules lymphoblastoïdes ont été établies à partir du sang
périphérique d’individus témoins, non porteurs de mutation CFTR, et de patients atteints
de mucoviscidose. Ces cellules ont été immortalisées par infection par le virus Herpes
d’Epstein-Barr (EBV). Elles sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Roswell Park
Memorial Institute medium) supplémenté par 10% de SVF, 1% de L-Glutamine, 1% de
pyruvate de sodium, 2% d’Hépès à 1M pH 7,25 et 1% de S/P.
- 100 -
Figure 56 : Prélèvement de cellules épithéliales nasales
2 Cellules primaires humaines
Les cultures primaires ont été préférées pour les analyses 5C pour être au plus
proche des conditions in-vivo.
2.1 Fibroblastes de peau
Une collaboration avec le Pr Laurent Misery, dermatologue du CHU de Brest, nous
a permis de réaliser des cultures de fibroblastes de peau. Ces fibroblastes ont été isolés à
partir de plasties abdominales chez des femmes adultes. Les prélèvements sont nettoyés
par de l’éthanol 70% et rincés dans du tampon phosphate salin (PBS, PhosphateBuffered Saline). Une fois ces lavages effectués, la peau est découpée en fines lanières
de quelques millimètres. Ces lanières sont incubées en présence de dispase (25U/mL)
pendant une nuit à interface air-liquide. Le derme est alors séparé de l’épiderme et traité
par une solution de trypsine/EDTA (Ethylène Diamine Tétra Acétique) pendant 30 minutes
(min). Les cellules dissociées sont finalement filtrées et mises en culture. Les cellules
fibroblastiques sont cultivées dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's
Medium) supplémenté de 10% de SVF et 1% de P/S.
2.2 Cellules épithéliales nasales
Les cellules épithéliales les plus faciles à prélever sont les cellules présentes au
niveau des cornets nasaux, en particulier au niveau du cornet moyen. Ainsi, afin de
récupérer des cellules épithéliales de choix pour l’analyse de l’expression du gène CFTR,
un protocole de prélèvement de cellules nasales a été mis en place (Figure 56). Les
cellules épithéliales nasales humaines (HNEC, Human Nasal Epithelial Cells) ont été
isolées à partir d’individus témoins ne portant pas de mutation CFTR. Les cellules HNEC
sont récoltées suite à un grattage, d’environ une minute, du cornet moyen avec une
brossette (Gyneas Ref 02.106). Une fois le prélèvement réalisé, la brossette est placée
dans du milieu de récupération composé du milieu de culture Ham’s F12 supplémenté par
1% Ultroser G et 1% d’une solution d’antibiotiques/antimycotiques (PAA Ref P11-002).
Les cellules sont détachées de la brossette par vortexage et par plusieurs lavages celle-ci
avec du milieu DMEM. Des bains décroissants d’antibiotiques sont réalisés pour éviter
toute contamination du prélèvement. Les cellules isolées sont ensuite cultivées dans du
milieu SAGM (Small Airway Epithelial Growth Media – Lonza).
- 101 -
B.Techniques d’étude de la conformation chromatinienne
1 Analyses 3C
Les premières analyses 3C réalisées avaient pour objectif de reproduire des résultats
déjà publiés pour valider notre prise en main de la technique. Les librairies 3C ont tout
d’abord été analysées par QFM-PCR (Quantitative Fluorescent Multiplex-PCR) puis dans
un deuxième temps par PCR en temps réel.
Une fois la technique assimilée, elle a été appliquée à la recherche d’interactions
entre le promoteur CFTR et des séquences non codantes conservées (CNCs -
Conserved Non Coding sequence). Des comparaisons de profils d’interaction entre
des patients CF, avec un génotype incomplet, et des témoins ont également été menées.
1.1 Confection des librairies 3C
1.1.1 Librairies 3C
Les librairies 3C sont réalisées à partir de 1.107 cellules. La première étape
consiste à fixer les interactions chromatiniennes en traitant les cellules intactes avec 2%
de formaldéhyde durant 10 minutes. Cette fixation est stoppée par l’ajout de glycine à
125mM. Après avoir laissé agir la glycine pendant 20 minutes, dont 15 minutes sur glace,
les cellules sont rincées plusieurs fois au PBS 1X. Elles sont ensuite décollées par
grattage au râteau, puis centrifugées 15 min à 2000 g à 4°C pour obtenir un culot
cellulaire de cellules fixées. A cette étape, les culots cellulaires peuvent être congelés à 80°C ou utilisés directement pour l’étape suivante de lyse cellulaire.
Le culot cellulaire est repris dans du tampon de lyse, constitué de 10 mM de Tris
pH8, 10 mM de NaCl, 0.2% de NP-40 (Nonidet P-40) et d’un cocktail inhibiteur de
protéase à 1X. Cette étape de lyse est réalisée durant 10 minutes sur glace et favorisée
par 2 x 20 mouvements avec un homogénéisateur de type Potter. Les culots de cellules
lysées sont lavés deux fois dans du tampon de restriction 1,2X. Les cellules sont alors
incubées, dans ce même tampon de restriction supplémenté de SDS, Sodium Dodécyl
Sulfate (concentration finale de 0,3%), dans un thermomixer durant 1 heure à 37°C sous
agitation à 900 rpm. Une deuxième incubation, suivant les mêmes conditions, est de
nouveau réalisée après ajout de Triton X-100 (concentration finale de 2%). A la suite de
cette seconde incubation, un échantillon contrôle, témoin non digéré (ND) est récupéré
avant la digestion.
- 102 -
La digestion est réalisée avec 400 unités (U) d’enzyme de restriction sur la nuit,
toujours à 37°C et sous agitation à 900 rpm. Un deuxième échantillon contrôle, témoin
digéré (D) est récupéré après la digestion. L’enzyme de restriction est inactivée par
l’addition de SDS, à une concentration finale de 1,6%, en incubant 30 minutes à 65°C
sous agitation à 900 rpm.
La solution digérée est ensuite fortement diluée dans un mix de ligation 1 et
incubée durant une heure à 37°C sous agitation à 600 rpm. La ligation est alors réalisée
avec 100 U de T4 DNA ligase pendant 5 heures à 16°C.
Les librairies ainsi que les témoins de digestion (ND et D) sont incubés durant une
nuit à 65°C en présence de protéinase K pour rompre les fixations engendrées par le
formaldéhyde. On parle d’étape de " de-crosslinking ".
Après un dernier traitement à la RNAse, entre 30 et 45 minutes à 37°C, les
différents échantillons d’ADN sont purifiés par une extraction au phénol-chloroforme avec
l’ajout d’un volume équivalent à la solution à purifier : 1 vol. Les solutions sont précipitées
par 0,1 vol de sodium d’acétate (NaOAc) à 3M et pH 5,2, 0,005 vol de glycogène et 2,5
vol d’éthanol 100%. Après un lavage à l’éthanol 70%, les échantillons d’ADN sont
resuspendus dans de l’eau distillée (H2O) : 150µL pour les librairies 3C et 15µL pour les
témoins de digestions, et incubés 30 minutes à 37°C.
1.1.2 Librairies contrôles
Chaque produit 3C étant quantifié par amplification PCR avec un couple
d’amorces spécifiques, il est nécessaire de réaliser une librairie contrôle permettant de
normaliser les différences d’efficacité d’amplification des couples. Cette librairie contrôle
est réalisée à partir d’un ou de plusieurs BACs, Bacterial Artificial Chromosome, (Annexe
I). Ces BACs doivent recouvrir l’ensemble des régions d’étude pour contenir tous les
produits de ligation attendus en quantité équimolaire. Les BACs sont mélangés de façon
équimolaire, puis digérés et ligués comme les échantillons 3C. Les librairies BACs
diffèrent des librairies 3C par l’absence de l’étape de fixation. Les BACs RP11-652K3 et
RP11-42H5 ont dans un premier temps été utilisés pour recouvrir l’intégralité du locus
CFTR. Le groupe grec de Georges Kotzamanis nous a ensuite aimablement envoyé un
BAC de 250,3kb qu’il a conçu pour recouvrir entièrement le gène CFTR, le BAC EL350.
1
Pour 7,62mL, un mix est composé de 750 Pl de Triton X-100 à 10%, 750 Pl de tampon de ligation
10X, 80 Pl d’albumine de sérum bovin (BSA) à 10 mg/ml et de 80 Pl d’ ATP à 100 mM.
- 103 -
Figure 57 : Profils de migration des librairies et témoins de digestion
Gel d’agarose de 1% permettant de contrôler la qualité d’une librairie 3C. Les témoins de digestion non
digéré (ND) et digéré (D) ainsi que différents volumes de la librairie finale (L1=0,1µL ; L2=0,2µL et
L4=0,4µL) ont été déposés et mis à migrer durant 45 minutes à 100 Volts. Le témoin ND, correspondant à
de l’ADN génomique complet, est bien retrouvé en une bande à plus de 10kb par rapport au marqueur de
taille (MT). Le témoin D est lui bien représenté par un smire constitué des fragments d’ADN digérés. Et la
librairie finale est de nouveau retrouvée avec une bande unique démontrant ainsi l’efficacité de l’étape de
ligation. De même, l’intensité de la bande augmente bien en fonction de l’importance du volume de
librairie.
Différents BACs ont également été utilisés pour recouvrir les régions non codantes
conservées étudiées : le BAC RP11-915H23 pour la région intergénique TFEC-TES et les
BACs RP11-1012L24, RP11-656G24, RP11-241B3 et RP11-145A22 pour la région
intergénique MDFIC-TFEC.
1.2 Contrôles qualité des librairies 3C
Plusieurs contrôles peuvent être réalisés pour s’assurer de la qualité des librairies.
Les librairies et les témoins de digestion ND et D sont contrôlés lors d’une migration sur
gel. Un test d’efficacité de digestion peut être ajouté pour connaître le pourcentage de
digestion des librairies. Et/ou les librairies peuvent être titrées.
1.2.1 Profils de migration des librairies et témoins de digestion
La qualité des librairies 3C peut dans un premier temps être appréciée en faisant
migrer sur un gel d’agarose de 1% , 5µL des échantillons témoins de digestion ND et D et
la librairie finale après ligation. La librairie 3C est déposée à plusieurs dilutions pour
s’assurer de sa pureté. L’ensemble est mis à migrer durant 45 minutes à 100 Volts avec
un marqueur de taille 1kb.
Les profils de migration attendus sont une bande unique à plus de 10kb pour le
témoin ND, un smear d’ADN pour le témoin D et une nouvelle bande unique reflétant
l’efficacité de la ligation (Figure 57). Les intensités des bandes des librairies finales
doivent bien corréler avec l’importance des dilutions.
1.2.2 Test de l’efficacité de digestion
Il est également possible de calculer l’efficacité de digestion des librairies en
comparant les profils d’amplification des témoins ND et D après avoir positionné des
amorces encadrant les sites de restriction.
1.2.3 Titration
Pour finir, une titration des librairies peut aussi permettre de s’assurer de leur
bonne qualité. Les librairies 3C sont amplifiées grâce à un couple d’amorces positionné
dans une région désertique en gène (la région ENr313). Cette région est connue pour
adapter la même conformation chromatinienne en toutes circonstances (type cellulaire,
stade de développement).
- 104 -
Figure 58 : Courbe de titration d’une librairie 3C
Afin de contrôler la qualité des librairies 3C, une amplification avec un couple d’amorces d’une région de
normalisation est effectuée avec des quantités décroissantes de librairie.
A. Profil de migration de la titration d’une librairie 3C sur un gel d’agarose de 1,5% après 45 minutes de
migration à 100 Volts. Cette titration révèle une librairie de bonne qualité avec une bande unique et une
corrélation entre l’intensité des bandes et la quantité de librairie. Un témoin eau en remplacement de la
librairie est réalisé afin de s’assurer qu’il n’y ait pas d’amplification sans ADN (NTC, No Template Control)
B. En analysant l’intensité des bandes de chaque quantité de librairie avec le logiciel Quantity One®, une
courbe de titration peut être réalisée. Cette courbe permet de vérifier que l’on obtient bien un plateau à
force d’augmenter la quantité de librairie. Cette courbe permet également d’estimer le volume à utiliser
pour réaliser une librairie 5C. Le volume adéquat, représenté en vert, se situe au niveau de la tangente de
la courbe
Les amorces utilisées pour titrer les librairies 3C digérées par EcoR1 (librairies utilisées
pour les analyses 5C) ont été :
- GD1-E (5’-GTGCATGTTAGAGCACGTAGATGCTG-3’)
- GD4-E (5’-GCTACAAGAATGAGGTTTAGGTAGCTGTG-3’).
Les librairies 3C sont diluées sept fois au demi puis amplifiées dans un volume
réactionnel de 25µL selon les conditions suivantes :
Réactifs
Volume par réaction (µL)
Tampon PCR 10X
50 mM MgSO4
25 mM dNTPs 1
100 ng/µL STD 2
Amorce GD1-E 5 µM
Amorce GD4-E 5 µM
Taq DNA Polymerase 5 U/µL
H2O
Librairie 3C diluée
2,5
2,0
0,2
1,5
2,0
2,0
0,2
10,6
4,0
Tableau III : Composition de la réaction d’amplification de titration des librairies 3C
Nombre de cycles
Dénaturation
Hybridation
Elongation
1
2-35
36
94°C - 5 min
94°C - 30 s
94°C - 1 min
65°C - 30 s
65°C - 45 s
72°C - 30 s
72°C - 8 min
Tableau IV : Conditions d’amplification de la réaction de titration des librairies 3C
Les produits d’amplification sont analysés grâce au logiciel Quantity One® de BioRad suite à une migration sur gel d’agarose à 1,5% de 45 minutes à 250 Volts.
Cette titration permet de s’assurer que la librairie est bien constituée de contacts uniques
et que leurs intensités corrèlent bien avec la quantité de librairies. Une librairie 3C de
qualité doit obtenir un produit d’amplification unique qui atteint un plateau avec de grand
volume de librairie et disparaît progressivement au fur et à mesure des dilutions (Figure
58) [Dostie and Dekker, 2007; Dostie et al., 2007; Fraser et al., 2010].
1
deoxyNucleotide TriPhosphates : solution contenant les quatre désoxyribonucléotides : dATP,
dCTP, dGTP et dTTP.
2
Salmon Testis DNA
- 105 -
1.3 Quantification des librairies 3C
Les échantillons 3C ayant une pureté limitée, il est impossible de les doser par leur
densité optique. En effet, les valeurs d’absorbance sont faussées, en particulier, par le
DTT présent dans le tampon de ligation qui n’est pas complètement éliminé lors de la
purification.
Ces librairies peuvent être quantifiées de différentes manières selon l’utilisation
envisagée. Pour les analyses 3C, les librairies sont quantifiées par PCR quantitative. La
quantité de librairie 3C nécessaire pour la confection d’une librairie 5C est, elle, estimée
sur gel suite à la titration.
1.3.1 PCR quantitative
Pour les analyses 3C, les librairies ont été quantifiées par PCRq en temps réel au
SYBR® Green (Annexe II).
Une série de dilutions d’un ADN de référence permet de réaliser une gamme étalon. Cette
gamme de référence permet ensuite de déterminer la concentration des librairies 3C.
Cette concentration est calculée à partir de deux dilutions différentes des librairies pour en
vérifier la qualité.
Les analyses ont été réalisées avec le kit "QuantiTect SYBR Green PCR" de Qiagen et
les amorces, internes à un fragment de restriction, suivantes :
- Sens (5’-TGCCTTTCAAATTCAGATTGAC-3’)
- Anti-sens (5’ACAGCAAATGCTTGCTAGACC-3’)
Les réactions d’amplifications ont été réalisées dans un volume réactionnel de 25µL selon
les conditions suivantes :
Réactifs
QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix
Amorce sens 10 pmol
Amorce anti-sens 10 pmol
H2O
Librairie 3C diluée
12,5
1,0
1,0
8,0
2,5
Tableau V : Composition de la réaction d’amplification de quantification des librairies 3C
- 106 -
Figure 59 : Localisation des amorces de QFM-PCR
Afin de confirmer les résultats du groupe de Ann Harris, des amorces pour réaliser des analyses 3C par
QFM-PCR ont été disposées dans les mêmes régions que celles publiées. Une amorce antisens (A) a été
dessinée dans un fragment de restriction du promoteur CFTR. Plusieurs amorces sens (S) ont été
choisies, une dans un fragment de restriction de l’intron 8, une dans l’intron 11 et deux dans la région 3’.
Nombre de cycles
Dénaturation
Hybridation
Elongation
1
2-45
95°C - 15 min
95°C - 30 s
55°C - 30 s
72°C - 30 s
Courbe de fusion
Passage de 50°C à 95°C par palier de 0.5°C
Tableau VI : Conditions d’amplification de la réaction de quantification des librairies 3C
1.3.2 Quantification sur gel
Pour les analyses 5C, la quantité de librairie 3C est estimée à partir de la migration
sur gel de l’amplification de la réaction de titration. Le volume idéal de librairie 3C à utiliser
pour réaliser une librairie 5C se situe au niveau de la tangente de la courbe de titration
(Figure 58) [Ferraiuolo et al., 2012].
1.4 Analyse des librairies 3C
Les premières librairies 3C ont été analysées par QFM-PCR. Puis afin de faciliter
les analyses et à la suite d’un séjour dans l’équipe du Pr Thierry Forné de l’UMR5535 de
l’Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier (IGMM), les analyses ont été effectuées
en PCRq.
1.4.1 Analyses par QFM-PCR
La QFM-PCR est une technique semi-quantitative basée sur une PCR multiplexe
de courts fragments. Ces analyses ont été réalisées à partir de librairies 3C de cellules
Caco-2 et de fibroblastes de peau, digérées par l’enzyme de restriction HindIII. Ces
études ont eu pour but de reproduire les résultats de travaux du groupe de A.Harris [Ott et
al., 2009a]. Une amorce antisens (A) a été dessinée pour un fragment de restriction de la
séquence d’intérêt, dans le promoteur CFTR. Plusieurs amorces sens (S) ont été choisies,
une dans un fragment de restriction de l’intron 8, une dans l’intron 11 et deux dans la
région 3’ (Figure 59). Un couple d’amorces de normalisation a également été utilisé au
sein du gène ERCC3 (Excision Repair Cross-Complementing 3). ERCC3 est un gène de
ménage qui a une expression ubiquitaire. Ainsi, il permet de normaliser les résultats entre
les différentes préparations cellulaires. Pour réaliser ce type de PCR, une séquence de
16b en 5’ des amorces sens et une séquence de 7b en 5’ de l’amorce antisens sont
ajoutées.
- 107 -
Figure 60 : Principe de la QFM-PCR
La QFM-PCR est une technique semi-quantitative basée sur une PCR multiplexe de courts fragments.
Lors du design des amorces, des petites queues sont ajoutées à la séquence spécifique. Au moment de
l’amplification, une troisième amorce marquée par le fluorochrome FAM et spécifique d’une de ces
queues est ajoutée. L’amplification est quantifiée grâce à l’émission de fluorescence.
Amorces
Séquences 5' - 3'
A - Promoteur CFTR
S - Intron 8
S - Intron 11
S - 3' INS
S - 3' +20
A - ERCC3
S - ERCC3
GTTTCTTGCAGTGTGGGTCTGATGCAT
TAGTCGACGACCGTTA GCTTCCTCCTGATCAATCTTTAGG
TAGTCGACGACCGTTATGACTCTGATGTCAAATGTTTCTCAA
TAGTCGACGACCGTTACTGTGGTTTGAATGTGTTCCCTAA
TAGTCGACGACCGTTACTGCTACAAGCCCACTATACAATATTG
GTTTCTTAGGATCTCTGTTTAATGGAAAAGCTT
TAGTCGACGACCGTTACCCTGAGGTGAGTTTGTGGAAT
Tableau VII : Liste des oligonucléotides utilisés pour les analyses 3C de QFM-PCR
Lors de la PCR, une troisième amorce identique à la séquence de 16b, marquée
par le fluorochrome FAM, est ajoutée (Figure 60). Ce modèle de PCR quantitative est
délicat à mettre en œuvre dans la mesure où il n’existe qu’une fenêtre étroite entre le
nombre minimum de cycles requis pour obtenir un signal suffisant et le nombre maximum
de cycles à ne pas dépasser.
Les analyses ont été réalisées avec le kit Multiplex PCR Master Mix 2X de Qiagen.
Les amorces sens sont diluées au 1/3. 3µl de cette dilution est ajoutée à 99µL de
l’amorce antisens. C’est ce mélange S+A qui est utilisé pour les amplifications réalisées
dans un volume réactionnel de 10µL selon les conditions suivantes :
Réactifs
Multiplex PCR Master Mix 2X
S + A 3µM
Amorce sens marquée FAM 10µM
H2O
Librairie 3C 50ng/µL
5,0
1,0
0,4
1,6
2,0
Tableau VIII : Composition de la réaction d’amplification des librairies 3C en QFM-PCR
Nombre de cycles
Dénaturation
Hybridation
Elongation
1
2-34
35
95°C - 15 min
95°C - 30 s
64°C - 30 s
72°C - 45 s
65°C - 10 min
Tableau IX : Conditions d’amplification des librairies 3C par QFM-PCR
- 108 -
Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse capillaire sur séquenceur
automatique ABI PRISM® 310 d’Applied Biosystems.
1µL de chaque échantillon est mis en présence de 19,8µL de Formamide et 0,2µL d’un
marqueur de taille interne GeneScan™ 500 ROX™ Size Standard.
Le support de migration est un polymère liquide (pop4). La détection de fluorescence se
fait au niveau d’une fenêtre du capillaire d’électrophorèse où un faisceau laser à argon
excite le fluorochrome FAM. La fluorescence émise est récupérée au niveau d’une cellule
de détection et transmise vers une caméra CCD (Charge Couple Device) pour être
analysée. L’identification de la fluorescence émise par la caméra CCD permet d’extraire
des données brutes qui sont analysées par le logiciel GeneMapper.
1.4.2 Analyses par PCR quantitative
Ces analyses ont, dans un premier temps, également été effectuées pour
confirmer les résultats du groupe de Ann Harris. Dans un second temps, elles ont permis
d’étudier si des régions non codantes conservées entraient en contact avec le promoteur
CFTR. Enfin pour finir, une étude a été menée pour comparer la conformation
chromatinienne du locus CFTR entre des librairies de cellules lymphoblastoïdes issues de
témoins et de patients CF.
L’ensemble de ces analyses a été effectué avec des librairies digérées par
l’enzyme de restriction HindIII. La liste d’amorces utilisées est répertoriée en Annexe III.
A la suite d’un échange avec l’équipe du Pr Thierry Forné, le mix de PCRq " fait maison "
qu’ils utilisent a été employé pour les analyses [Court et al., 2011; Lutfalla and Uze, 2006].
Ces études sont réalisées dans un volume réactionnel de 10µL selon les conditions
suivantes :
Réactifs
Mix PCRq " fait maison "
Amorce sens 10µM
Amorce anti-sens 10µM
H2O
Librairie 3C 25ng/µL
1,0
0,5
0,5
7,0
1,0
Tableau X : Composition de la réaction d’amplification des librairies 3C en PCRq
- 109 -
Nombre de cycles
1
2-45
Courbe de fusion
Dénaturation
Hybridation
95°C - 10 min
95°C - 10 s
69°C - 8 s
Passage de 50°C à 95°C par palier de 0.5°C
Elongation
72°C - 14 s
Tableau XI : Conditions d’amplification des librairies 3C par PCRq
Ces conditions d’amplifications sont spécifiques à une analyse sur LightCycler 480
II de la compagnie “Roche”. Les analyses ont été effectuées sur des microplaques PCR
de 384 puits.
Une gamme étalon de référence, constituée de quatre dilutions, est réalisée avec la
librairie BAC recouvrant les régions d’études. Chaque échantillon de la librairie contrôle
BAC et des librairies d’études, est réalisé en triplicat. Un couple d’amorces interne à un
fragment de restriction permet de normaliser les librairies les unes par rapport aux autres.
Les efficacités de PCR des différents couples d’amorces sont normalisées par la librairie
BAC.
Les données 3C sont analysées et présentées sous forme graphique grâce à un
algorithme d’analyse des fréquences d’interaction, sous forme excel, développé par le
groupe de Thierry Forné. Les datas sont normalisés par rapport à un niveau d’interaction
de base (BIL Basal Interaction Level) qui est calculé pour chaque échantillon [Braem et al.,
2008].
2 Analyses 5C
Les analyses 5C ont été réalisées sur des cultures primaires de cellules HNEC et de
fibroblastes de peau de témoins non porteurs de mutation CFTR. Ces librairies ont été
digérées par l’enzyme de restriction EcoR1.
2.1 Design d’amorces et régions d’étude
Des amorces 5C couvrant le locus CFTR (hg19, chr7:116,608,455-117,391,622), la
région du gène ERCC3 (hg19, chr2:128,014,866-128,051,752) et la région ENr313 (hg19,
chr16:62,276,449-62,776,448) ont été dessinées grâce à l’outil " my5C.primer ". Les
amorces ont été formées suivant différents paramètres: taille optimale de 30 nucléotides,
température de fusion (Tm) optimale de 60°C et fragments de restriction ne dépassant
pas 20kb. La spécificité de chaque amorce a également été vérifiée. Les queues
universelles A et P1 ont respectivement été ajoutées aux amorces sens et anti-sens :
- 110 -
- A (CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-(Amorce 5C spécifique))
- P1 ((Amorce 5C spécifique)-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG).
Les amorces anti-sens sont en plus phosphorylées à leurs extrémités 5’.
La région CFTR a été recouverte par 3 amorces antisens au niveau de la région
promotrice et 140 amorces sens le long du reste du locus, on parle d’un " anchored 5C
design ". Les deux régions de normalisation ont, elles, été recouvertes par un " alternating
5C design " avec 2 amorces sens et 3 amorces antisens au sein du gène à expression
ubiquitaire ERCC3 et 13 amorces sens et 13 amorces antisens dans la région dépourvue
de gène ENr313. Les séquences oligonucléotidiques sont listées en Annexe IV.
2.2 Conversion des librairies 3C en 5C
Les librairies 3C sont converties en librairies 5C à la suite de trois étapes. La
première consiste à hybrider l’ensemble des amorces 5C sur la librairie 3C. Une ligation
permet par la suite d’obtenir des fragments hybrides entre les amorces sens et antisens.
Finalement, la librairie 5C est obtenue en amplifiant l’ensemble de ces fragments de
restriction grâce à des amorces spécifiques des queues universelles A et P1.
Les librairies 5C ont été préparées et amplifiées selon la procédure précédemment décrite
et détaillée par le groupe de Josée Dostie [Fraser et al., 2012].
Pour commencer, les amorces 5C sont diluées séparément et mélangées pour
chacune être à une concentration finale de 0,002µM. L’hybridation de ce mélange
d’amorces à la librairie 3C est réalisée dans un volume réactionnel de 10µL selon les
conditions suivantes :
Réactifs
Amorces 5C 0,002µM
Tampon d'hybridation 1
STD 1µg/µL
Librairie 3C diluée 2
1,7
1,0
1,44
5,86
Tableau XII : Composition de la réaction d’hybridation des amorces 5C à une librairie 3C
1
2
10X NEBuffer 4, New England Biolabs (NEB)
Dilution en fonction du volume estimé lors de la titration de la librairie 3C (voir § B.1.2.3)
- 111 -
Les échantillons sont dénaturés à 95°C durant 5 minutes puis l’hybridation se
déroule à 50°C pendant 16 heures. A la fin de l’hybridation, la réaction de ligation est
réalisée dans un volume réactionnel de 30µL selon les conditions suivantes :
Réactifs
Réaction d'hybridation
Tampon de ligation 10X
Taq DNA Ligase 40U/µL
H2O
10,0
2,5
0,25
17,25
Tableau XIII : Composition de la réaction de ligation des amorces 5C hybridées
La ligation s’effectue durant 1 heure à 50°C suivie de 10 minutes à 65°C. Lors de
ces deux étapes, il est nécessaire de réaliser un contrôle sans ADN et un contrôle sans
ligase pour chaque échantillon. Ces contrôles permettent de s’assurer que les produits 5C
ont bien été formés à la suite de la ligation au niveau des extrémités de restriction des
produits 3C.
Pour finir, les produits 5C sont amplifiés dans un volume réactionnel de 25µL selon
les conditions suivantes :
Réactifs
Tampon PCR 10X
25 mM dNTPs
Amorce A 20µM
Amorce P1 20µM
50 mM MgSO4
Taq DNA Polymerase 5U/µL
H2O
Réaction de ligation 5C
2,5
0,2
0,5
0,5
2,0
0,2
16,1
3,0
Tableau XIV : Composition de la réaction d’amplification des produits 5C
Nombre de cycles
Dénaturation
Hybridation
Elongation
1
2-35
36
95°C - 5 min
95°C - 30 s
95°C - 30 s
60°C - 30 s
60°C - 30 s
72°C - 30 s
72°C - 8 min
Tableau XV : Conditions d’amplification des produits 5C
- 112 -
Figure 61 : Amplification des librairies 5C
L’amplification des librairies 5C (L) est contrôlée sur gel d’agarose de 2,5% à la suite d’une migration de
45 minutes à 100 Volts. Une bande unique correspondant aux deux amorces liées des fragments de
restriction des deux régions ayant interagit est attendue à 120 pb. Deux contrôles sont nécessaires : un
contrôle sans ligase (NL) qui permet de vérifier que l’amplification est uniquement spécifique aux amorces
s’étant associées lors de l’étape de ligation, et un contrôle NTC spécifique de l’amplification.
Figure 62 : Amplification clonale sur ISP des librairies 5C
Les librairies 5C sont amplifiées lors d’une PCR en émulsion. Cette amplification est réalisée au sein de
microréacteur (microgouttelette d’huile) avec des sphères ISP (Ion Sphere Particles), des amorces,
spécifiques des queues universelles A et P1 et d’un fragment des sphères, et d’une quantité de librairie
favorisant la configuration : une sphère pour un fragment de librairie. Ainsi, à la fin cette étape réalisée sur
l’appareil Ion OneTouch™, les différents fragments de la librairie ont été chargés et amplifiés sur une
sphère.
D’après http://www.biorigami.com/?s=pgm
L’amplification des librairies 5C est vérifiée en faisant migrer les produits sur un gel
d’agarose de 2,5% avec le marqueur de taille " Quick-Load® Low Molecular Weight DNA
Ladder " (NEB) à 100 Volts durant 45 minutes. Une bande unique est attendue à 120 pb
(Figure 61).
Une fois les amplicons 5C validés, ces échantillons subissent une dernière
purification, avec le kit " MinElute QIAquick Gel Extraction " (Qiagen), avant d’être
quantifiés pour l’étape suivante de séquençage.
Cette quantification est réalisée sur gel en comparant les intensités des bandes des
librairies à 4 bandes différentes du marqueur de taille " Quick-Load® Low Molecular
Weight DNA Ladder " . Les librairies sont diluées à 0,0018ng/µL.
2.3 Séquençage des librairies 5C
Les librairies 5C ont été analysées par séquençage nouvelle génération sur le
séquenceur Ion Torrent Personal Genome MachineTM (Ion PGM™) de Life Technologies.
Plusieurs étapes précèdent le séquençage des librairies.
Pour être séquencées, les librairies nécessitent tout d’abord d’être chargées sur
des sphères ISP (Ion Sphere Particles) (Figure 62).
Pour réaliser cette étape, il est important de charger une quantité adéquate de
librairie. Si la quantité est trop faible, des ISP resteront vides ou plusieurs ISP pour un
même fragment seront retrouvées. A l’inverse, si la librairie est trop concentrée, plusieurs
fragments de la librairie seront chargés sur une même ISP. Le but est qu’un seul fragment
de librairie soit chargé par sphère. En effet, seule cette configuration de monoclonalité est
source de données de séquençage.
Les différents fragments de la librairie subissent une amplification clonale au cours
d’une PCR en émulsion (emPCR) avec les amorces ePCR-A et ePCR-B-trP1,
respectivement spécifiques des queues universelles A et P1. ePCR-B-trP1 est également
complémentaire des extrémités des ISP.
Cette étape automatisée a été réalisée sur l’appareil Ion OneTouch™ avec le kit
"Ion OneTouch™ 200 Template Kit v2 DL " selon les conditions décrites par le fabricant
dans le volume réactionnel de 900µL suivant:
- 113 -
Figure 63 : Enrichissement des ISP
Une étape d’enrichissement des ISP, permettant d’isoler les ISP chargées est ensuite réalisée sur
l’appareil Ion OneTouch™ ES. Cette sélection dépend d’une capture par un système d’aimant grâce aux
biotines ajoutées sur les fragments de librairie lors de l’amplification clonale et à l’ajout de billes de
streptavidines magnétiques. D’après http://www.biorigami.com/?s=pgm
Figure 64 : Principe du séquençage par le système Ion Torrent
Les ISP chargées avec les fragments de librairie 5C sont déposées sur une puce Ion 314™, constituée de
TM
1,3 millions de puits. Elles sont ensuite séquencées sur Ion Torrent Personal Genome Machine (Ion
PGM™). Ce séquenceur repose sur le système Ion Torrent avec une mesure en temps réel de l’émission
de protons produite lors de l’incorporation de chaque base pendant l’élongation. Les capteurs présents au
fond des différents puits vont transformer cette variation de pH en un signal électrique qui sera traduit en
un ionogramme. Adaptée de http://www.biorigami.com/?s=pgm
Réactifs
Ion OneTouch™ 2X Reagent Mix
Ion OneTouch™ 2X Enzyme Mix
Librairie 5C diluée à 0,0018ng/µL
H2O
500
100
20
280
Tableau XVI : Composition de la réaction d’amplification clonale par emPCR des produits 5C
Cette amplification clonale est suivie d’un enrichissement des ISP chargées (Figure
63). Les ISP chargées sont isolées par un système d’aimant qui capture des billes
magnétiques liées à la streptavidine. Cette isolation est possible grâce aux fragments de
librairie qui lors de l’amplification clonale, ont été marqués à la biotine par l’amorce ePCRA.
Cette étape est également automatisée. La sélection des ISP est réalisée grâce à
l’appareil Ion OneTouch™ ES (Enrichment System). Lors de l’enrichissement, les ISP
chargées polyclonalement sont également isolées. A la fin de ces deux étapes
d’amplification clonale et d’enrichissement, la matrice de séquençage, correspondant aux
ISP chargées par les fragments de la librairie 5C et purifiées, est prête à être séquencée.
La matrice de séquençage est mise en présence des différents réactifs du kit de
séquençage " Ion PGM™ 200 Sequencing Kit " selon les instructions du fabricant. Ainsi,
une solution composée de la matrice de séquençage, de billes " tests de fragments ", des
amorces de séquençage et de la polymérase est chargée sur la puce de séquençage Ion
Torrent.
Les librairies de ce projet ont été séquencées sur des puces Ion 314™ ou Ion 314™
Chips v2 constituées de 1,3 millions de puits.
Les différents fragments de la librairie 5C sont alors séquencés simultanément
dans chaque puit. Le système Ion Torrent repose sur l’analyse de variation de pH (Figure
64). L’incorporation d’un nucléotide au cours de l’élongation entraîne la libération d’ions
hydrogène H+. Ce relargage de proton est détecté par les capteurs présents au fond de
l’ensemble des puits de la puce et va être transformé en un signal électrique. Ainsi en
injectant tour à tour les différents nucléotides, il est possible de détecter leur ordre
d’intégration durant l’élongation des brins complémentaires des fragments 5C.
- 114 -
Figure 65 : Obtention des données de séquençage
A la fin du séquençage, les données brutes, présentées sous forme de ionogrammes, sont regroupées
dans un fichier .DAT qui est transféré au Torrent Server. Les ionogrammes sont convertis en séquences
grâce à l’algorithme " base calling " du programme Torrent Suite. Une étape de filtrage permet d’éliminer
les séquences universelles A et P1 et/ou des séquences de mauvaise qualité ou ayant été amplifiées
polyclonalement. Les séquences restantes, en format fasta, sont associées à un score de qualité (Phred
Score codé en ASCII) et retrouvées dans un fichier .FASTQ.
Adaptée de http://www.biorigami.com/?s=pgm
Figure 66 : Conversion du fichier FASTQ en un fichier lisible par l’outil " my5C-heatmap "
Cette conversion est réalisée grâce à un algorithme accessible en ligne sur le serveur privé de la
plateforme web Galaxy du groupe montréalais de Josee Dostie.
Adaptée de [Fraser et al., 2012]
Les données brutes, présentées sous forme de ionogrammes, sont regroupées
dans un fichier .DAT qui est transféré du séquenceur à son serveur, le Torrent Server
(Figure 65). Les ionogrammes sont convertis en séquences grâce à l’algorithme " base
calling " du programme Torrent Suite du serveur.
Un premier traitement des séquences est réalisé pour éliminer les séquences
universelles A et P1 et/ou des portions de séquences de mauvaise qualité, c’est le "
trimming ". Les séquences sont également filtrées pour supprimer les séquences trop
courtes, de mauvaise qualité ou ayant été amplifiées polyclonalement.
Les séquences restantes, en format fasta, sont associées à un score de qualité
(Phred Score codé en ASCII) et retrouvées dans un fichier .FASTQ.
2.4 Analyses des datas 5C
L’analyse des séquences 5C a été réalisée comme décrit précédemment par le
groupe de Josée Dostie [Berlivet et al., 2013; Fraser et al., 2012].
Le fichier .FASTQ est converti en une liste de fréquences d’interaction, IFL
(Interaction Frequency Lists), en un fichier texte. Cette conversion est réalisée grâce à un
algorithme accessible en ligne sur le serveur privé de la plateforme web Galaxy du groupe
de Josée Dostie (Figure 66).
Le fichier .FASTQ est tout d’abord croisé avec un fichier référence, contenant la
liste des amorces 5C utilisées lors des analyses, grâce au programme d’alignement
TMAP (Torrent Mapping Alignment Program).
Les séquences alignées sont de nouveau filtrées puis répertoriées dans un
fichier .SAM. La filtration permet de supprimer les séquences de mauvaise qualité, les
séquences s’alignant avec une différence de plus de deux nucléotides sur la référence, ou
ne contentant pas le site de restriction ayant servit à former les fragments hybrides.
Les séquences du fichier .SAM sont analysées en comptant le nombre de chaque
contact possiblement attendu pour former le fichier IFL.txt.
Pour finir, ce fichier est transformé en un fichier, my5C.txt, lisible par l’outil du site
de bioinformatique de Job Dekker " my5C-heatmap ".
Les différentes librairies analysées ont été comparées après avoir normalisé les
données grâce aux régions adoptant les mêmes profils de compaction. Les données des
interactions des régions ERCC3 et ENr313 ont été divisées par celles d’une librairie de
référence (librairie HNEC 5). Le ratio obtenu a été appliqué aux données des interactions
de la région d’étude du locus CFTR.
- 115 -
C. Bases de données et outils bioinformatiques
Les régions non codantes conservées étudiées lors des analyses 3C, ont été
sélectionnées grâce au site ECR Browser, http://ecrbrowser.dcode.org/.
Les données d’alignement réalisées avec les analyses 5C ont été obtenues à partir
de différentes bases de données.
Les sites DHS et CTCF décrits dans les cellules SAEC (Small Airway Epithelial Cells) ont
été téléchargés sur la base de données GEO (Gene Expression Omnibus) sur le site
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc (Acc. No GSE26328 et GSE30263).
Les profils de conservation GERP (Genomic Evolutionary Rate Profiling) sont issus du
site web UCSC (University of California Santa Cruz), http://genome.ucsc.edu/.
Les outils " my5C.primer " et " my5C-heatmap " sont en libre accès sur le site de
bioinformatique du groupe de Job Dekker, http://my5c.umassmed.edu/.
- 116 -
RÉSULTATS
&
DISCUSSION
- 117 -
Résultats et Discussion
Partie3.RESULTATSETDISCUSSION
Les résultats sont présentés sous la forme de quatre parties et seront directement
discutés à la fin de chacune de ces présentations.
La première partie décrit les résultats du développement de la technique 3C au
sein de notre laboratoire par la reproduction de travaux précédemment publiés.
La deuxième et troisième partie traitent des applications réalisées avec la
technique 3C. Ces travaux ont, dans un premier temps, consisté à comparer la
conformation du locus CFTR de patients CF portant un génotype incomplet, à celle de
sujets témoins. Dans un second temps, une recherche d’interactions entre des séquences
non codantes conservées et le promoteur du gène CFTR a été réalisée.
Pour finir, la dernière partie expose des analyses à plus haut débit avec l’utilisation
de la technique 5C pour étudier dans des cultures primaires les différentes conformations
du locus CFTR en fonction de son expression.
- 118 -
A. Mises au point de la technique 3C
1 Contexte de l’étude
Ce projet était tout à fait novateur au sein de notre laboratoire. Aucune étude
apparentée n’avait précédemment été réalisée. Il a donc fallut développer l’ensemble de
cet axe de recherche.
Afin de s’assurer d’une bonne prise en main de la technique, nous avons décidé de
commencer par reproduire des résultats déjà publiés. En fonction des types cellulaires
déjà disponibles au laboratoire, nous avons cherché à répéter les travaux qui avaient
décrit de fortes interactions entre le promoteur CFTR et un site DHS de l’intron 11 [Ott et
al., 2009a]. Nous avons utilisé deux types cellulaires de ces travaux, les cellules Caco-2
qui expriment fortement le gène CFTR en comparaison à des fibroblastes de peau qui
n’expriment pas ou très peu le gène.
A la suite d’une bonne étude bibliographique sur cette nouvelle technologie
d’analyses 3C, et après quelques adaptations techniques en fonction de l’équipement
disponible au laboratoire, des premières librairies 3C, digérées par l’enzyme HindIII, ont
été réalisées. Nous avons, dans un premier temps, jugé intéressant d’analyser ces
librairies par la technique de QFM-PCR. Cette technique était déjà utilisée pour plusieurs
autres projets au laboratoire et avait l’avantage de pouvoir quantifier plusieurs
amplifications en une analyse. Par la suite, il a finalement été plus intéressant de réaliser
ces analyses grâce aux outils de quantification développés par le groupe montpelliérain
de Thierry Forné.
2 Résultats
2.1 Analyses par QFM-PCR
Les amorces utilisées pour ces analyses ont été les mêmes que celles utilisées par
le groupe de Ann Harris. Les queues nécessaires à l’analyse par QFM-PCR y ont juste
été ajoutées. Nous avons seulement utilisé l’amorce antisens du promoteur, les amorces
sens de l’intron 8 et 3’ +20, en tant que contrôles négatifs, et les amorces de l’intron 11 et
de la région 3’INS entrant normalement en contact avec le promoteur. Les deux amorces
de la région ERCC3 ont également été utilisées pour normaliser les analyses entre les
différents types cellulaires.
- 119 -
L’idée de départ était donc d’analyser les fréquences d’interaction entre ces
différentes régions en une fois en poolant toutes les amorces. Cette amplification n’ayant
donné aucun résultat, nous avons commencé par analyser chaque couple d’amorces
séparément en réalisant des gammes de températures et de cycles pour identifier des
paramètres d’amplification appropriés pour l’ensemble des couples. C’est à la
température d’hybridation de 64°C et avec 34 cycles que les amplifications étaient les
plus spécifiques.
Un exemple de mise au point pour le couple d’amorces " Promoteur CFTR " /
" 3’INS " est détaillé ci-dessous.
Comme le montre la Figure 67, l’amplicon de ce produit de ligation est attendu à
106 pb. Ces 106 pb correspondent au 58 pb du fragment de restriction du " Promoteur
CFTR " (surligné en bleu), au 25 pb du fragment de restriction de la région " 3’INS "
(surligné en jaune) et au 23 pb des queues spécifiques ajoutées aux amorces (bases
grisées). Le site de restriction HindIII est représenté par les bases en gras et surlignées.
Figure 67 : Représentation de l’amplicon de 106 pb " Promoteur CFTR " / " 3’INS "
Une première expérience a été réalisée avec 40 cycles et 4 températures
d’hybridation différentes : 61,8°C - 63°C - 64,1°C - 65°C.
Figure 68 : Gamme de température pour l’amplicon de 106 pb " Promoteur CFTR " / " 3’INS "
Comme on peut le voir sur la Figure 68, c’est en réalisant l’hybridation aux
alentours de 64°C que l’on obtient le moins de pics non spécifiques. Il reste juste un pic à
moins de 100 pb qui devrait disparaître en diminuant le nombre de cycles. Ce nombre de
cycles est d’ailleurs également trop élevé pour l’amplicon attendu (surligné en vert) qui
sort beaucoup trop fort.
- 120 -
Une deuxième expérience a donc été réalisée avec une température d’hybridation à
64°C et en testant 6 nombres de cycles différents : 30 - 32 - 34 - 36 - 38 et 40.
Figure 69 : Gamme de cycles pour l’amplicon de 106 pb " Promoteur CFTR " / " 3’INS "
Les résultats d’amplification représentés sur la Figure 69, démontrent que les
conditions idéales sont retrouvées avec une hybridation à 64°C et 34 cycles. En utilisant
ces paramètres, l’amplification est bien spécifique. On retrouve bien d’un pic unique qui
ne sature pas.
Suivant ces conditions, de nouveaux essais d’analyse en poolant l’ensemble des
amorces ont été réalisés. Les résultats n’étant pas assez spécifiques, des analyses
individuelles ont été préférées.
De cette manière, plusieurs analyses ont été réalisées sur des librairies de cellules
Caco-2 et de fibroblastes de peau. Les résultats, regroupant trois analyses différentes en
duplicat, sont résumés sur la Figure 70.
Figure 70 : Analyses 3C de régions du locus CFTR par QFM-PCR
- 121 -
Les données entre les cellules Caco-2 et les fibroblastes de peau ont été
normalisées avec un couple d’amorces spécifiques de la région du gène ubiquitaire
ERCC3. Les différences d’efficacité d’amplification des différents couples d’amorces ont,
elles, été normalisées grâce à un témoin BAC constitué d’un mélange équimolaire des
BACs RP11-652K3 et RP11-42H5.
Cette représentation graphique ne montre pas d’interaction spécifique entre les
quatre régions du locus CFTR testées et le promoteur CFTR dans les fibroblastes de
peau (diagramme bleu). Au contraire, dans les cellules Caco-2, on retrouve deux fortes
interactions (diagramme rose). Le promoteur CFTR est soumis à un contact important
avec la région de l’intron 11, à un peu moins de 110 kb du site d’initiation de la traduction.
Et bien que plus faiblement, la région 3’INS, située à plus de 200 kb du site d’initiation de
la traduction, interagit également avec la région promotrice CFTR.
2.2 Analyses par PCRq
Pour des questions d’optimisation d’expériences, les amorces utilisées pour ces
analyses n’ont pas été les mêmes que celles utilisées par le groupe de Ann Harris. Alors
que certaines ont été dessinées au sein des mêmes fragments de restriction, d’autres ont
été positionnées dans des régions différentes. Les différences sont récapitulées au sein
du Tableau XVII :
Amorces CFTR
A - Promoteur CFTR
S - CFTR 1
S - CFTR 2
S - CFTR 3
S - CFTR 4
S - CFTR 5
S - CFTR 6
S - CFTR 7
S - CFTR 8
S - CFTR 9
S - CFTR 10
S - CFTR 11
Localisation
Amorces [Ott et al., 2009a]
Intron 1
Intron 1
Intron 3
Intron 8
Intron 10
Intron 11
Intron 15
Intron 18
Intron 19
Intron 21
3' + 19 kb
Promoter R
S2
S6
Int3
Int8
Int10(2)
Int11
Int19
3'INS
Tableau XVII : Différences de positionnement des amorces 3C dans le locus CFTR
Lorsque les amorces ont pu être positionnées au sein du même fragment de
restriction HindIII que celui utilisé par le groupe de Ann Harris, la référence de l’amorce
qu’il avait utilisée est notée. Si l’amorce dépend d’un fragment de restriction non utilisé
précédemment, un " - " le spécifie.
- 122 -
La quantité des différents produits de ligation 3C amplifiés, pour les diverses librairies,
a été rapportée et normalisée en fonction de la courbe étalon de la librairie contrôle
constituée du BAC EL350.
La Figure 71 montre un exemple de rapport présenté par le logiciel LightCycler 480 II,
pour une amplification avec l’amorce positionnée dans l’intron 11.
Figure 71 : Exemple d’un rapport d’amplification avec le logiciel LightCycler 480 II
Le plan de plaque est présenté en haut à gauche avec les échantillons de la librairie
BAC en rouge foncé. Les échantillons des librairies sont en rouge (ceux en gris ont eu un
problème d’amplification) et les contrôles NTC en vert. Le graphique à droite représente
les courbes d’amplification en temps réel. Une ligne seuil (threshold) est positionnée dans
la phase exponentielle au dessus du bruit de fond. Un threshold de 0,5 a été utilisé pour
toutes les analyses. Le Ct des différents échantillons est établi au niveau de l’intersection
du threshold avec la courbe d’amplification. Les valeurs de Ct permettent de réaliser la
gamme étalon de la librairie BAC (en bas à droite) pour ensuite analyser les librairies.
Les résultats d’analyses de 4 librairies de cellules Caco-2 comparées à 3 librairies de
cellules fibroblastiques sont présentés sur la Figure 72.
- 123 -
Figure 72 : Analyses 3C de régions du locus CFTR par PCRq
Ce graphique montre un profil typique de données 3C, avec une relation inverse
entre l’importance de la fréquence d’interaction et l’éloignement de la région cible.
Les régions les plus proches de l’amorce positionnée dans la région promotrice de
CFTR, présentent des fréquences d’interaction importantes mais qui décroient au fur et à
mesure qu’on s’en s’éloigne.
Par ailleurs, trois régions présentent d’importantes interactions avec le promoteur
CFTR dans les lignées Caco-2. Les régions introniques 10 et 11, avec respectivement les
amorces CFTR 5 et 6, sont retrouvées très fortement liées avec la région promotrice. Une
région en 3’ entre également en contact direct avec la région promotrice avec l’amorce
CFTR 11 située à un peu plus de 19 kb de la fin du gène CFTR.
3 Discussion
Ces deux études confirment les résultats des travaux publiés par le groupe de Ann
Harris [Ott et al., 2009a]. En effet, les mêmes variations de fréquence d’interaction ont été
retrouvées en fonction du type cellulaire exprimant ou non CFTR et en fonction des
différents loci étudiés (Figure 73).
- 124 -
Figure 73 : Comparaison de nos résultats par rapport à ceux publiés par [Ott et al., 2009a]
Aucune interaction significative n’a été mise en évidence dans le type cellulaire
témoin, les fibroblastes de peau qui n’expriment pas le gène CFTR. Alors que dans le
modèle cellulaire exprimant fortement le gène CFTR, les cellules Caco-2, deux régions
ont été décrites comme intimement liées à la région promotrice du gène. L’ensemble de
ces résultats a permis de valider la mise en place et l’utilisation de la technique 3C au
sein du laboratoire.
Les analyses en pool par QFM-PCR n’ayant pas été concluantes et suite à l’utilisation
des outils d’analyses développés par le groupe de Thierry Forné, l’intérêt de la technique
de QFM-PCR pour l’analyse des librairies 3C n’a plus lieu d’être. Cette technique est
expérimentalement beaucoup plus longue et compliquée à réaliser (amplification +
séquençage) et l’analyse moins relevante.
Les analyses par QFM-PCR ont ainsi été écartées pour la suite du projet.
- 125 -
B. Comparaison de profils d’interaction du locus
CFTR entre des patients CF et des témoins
Analyses 3C
Suite à la mise en place et à la validation de la maîtrise de la technique 3C, nous
avons souhaité étudier de possibles modifications des phénomènes de régulation à
distance déjà décrits sur le gène CFTR. Cette étude a été réalisée chez des patients CF
dont le génotype n’était pas entièrement élucidé. En effet, le génotype d’une dizaine de
patients CF, dont le diagnostic moléculaire a été réalisé à Brest, n’a pu être totalement
posé.
Plusieurs lignées de cellules lymphoblastoïdes issues de ces patients avaient déjà
été établies au laboratoire. Nous avons alors pensé qu’il pourrait être intéressant d’étudier
le profil d’interaction de leur locus CFTR. L’identification d’une modification d’interaction
pourrait expliquer une dérégulation de l’expression du gène.
Les profils d’interaction des patients ont, dans un premier temps, été comparés à
ceux de cellules Caco-2.
Par soucis de niveaux d’expression du gène CFTR, il nous a ensuite paru plus
logique de comparer ces profils avec le même type de cellules issues de témoins non CF.
2 Résultats
2.1 Comparaison des profils avec des cellules Caco-2
Des librairies 3C, digérées par HindIII, ont été réalisées à partir de cellules
lymphoblastoïdes de deux patients CF. Ces patients sont tous les deux porteurs d’une
mutation F508del. Leur deuxième mutation n’a pas été identifiée. Les résultats de trois
analyses distinctes, où chaque échantillon a été réalisé en triplicat, sont comparés à ceux
obtenus avec des librairies de cellules Caco-2.
- 126 -
La comparaison des profils d’interaction du locus CFTR entre des librairies de
cellules Caco-2 et de cellules lymphoblastoïdes issues du patient CF, nommé P1, montre
plusieurs disparités (Figure 74).
Figure 74 : Analyses 3C du locus CFTR du patient P1 en comparaison à des Caco-2
D’une part, on peut constater que le patient P1 ne présente pas d’interaction entre
les régions précédemment décrites avec les cellules Caco-2. Les amorces CFTR 6 et 11,
respectivement situées dans l’intron 11 et en 3’ du gène, n’entrent significativement pas
en contact avec l’amorce du promoteur CFTR.
Par ailleurs, les cellules issues de ce patient présentent une forte interaction entre
une région de l’intron 8, avec l’amorce CFTR 4, et le promoteur CFTR. Cette interaction
n’est pas retrouvée dans les librairies de cellules Caco-2.
Les résultats obtenus avec le deuxième patient CF, identifié P2 et également porteur
de la mutation F508del et d’une deuxième mutation non identifiée, sont assez semblables
(Figure 75).
- 127 -
Figure 75 : Analyses 3C du locus CFTR du patient P2 en comparaison à des Caco-2
Le patient P2 affiche aussi un fort rapprochement du fragment de restriction de
l’amorce CFTR 4, dans l’intron 8, au fragment de la région promotrice du gène CFTR.
Pour le reste, la région intronique 11 et la région identifiée " 3’INS ", n’interagissent pas
non plus avec le promoteur CFTR.
Ces résultats soulèvent une question : l’interaction entre la région de l’intron 8 et le
promoteur CFTR est-elle spécifique de ces patients ou dépend-elle du type cellulaire, à
savoir les cellules lymphoblastoïdes ?
2.2 Comparaison des profils avec des cellules témoins
De nouvelles librairies 3C, toujours digérées par HindIII, ont été réalisées à partir de
cellules lymphoblastoïdes de deux nouveaux patients CF, et également à partir de
cellules lymphoblastoïdes de témoins, non porteurs de mutation CFTR (-/-).
De manière intéressante, les profils d’interaction du locus CFTR présentent des
différences entre les patients CF porteurs d’une mutation F508del et les témoins. De
même, les profils issus des cellules lymphoblastoïdes de témoin diffèrent des profils
obtenus avec des cellules Caco-2.
- 128 -
Les résultats de comparaison avec un témoin, des deux patients porteurs d’une
mutation F508del, précédemment analysés avec les cellules Caco-2 (P1 et P2), sont
respectivement présentés sur les Figures 76 et 77.
Figure 76 : Analyses 3C du locus CFTR du patient P1 en comparaison d’un témoin
Figure 77 : Analyses 3C du locus CFTR du patient P2 en comparaison d’un témoin
- 129 -
Ces analyses montrent tout d’abord que les cellules lymphoblastoïdes ne
présentent pas d’interaction particulière entre les différentes régions du locus CFTR
testées et le promoteur du gène. On retrouve chez les cellules témoins, un profil
d’interaction assez semblable aux fibroblastes de peau. Cette observation est assez
concordante avec le faible niveau d’expression du gène CFTR de ces deux types
cellulaires.
Par ailleurs, l’interaction entre l’intron 8 et le promoteur CFTR est, de la même
manière que dans les premières expériences, retrouvée avec les librairies des patients P1
et P2. Cette interaction semble spécifique à ces deux patients car elle n’est pas retrouvée
avec les cellules témoins.
Afin d’approfondir cette étude, deux autres patients CF porteurs d’une mutation
F508del ont été analysés avec différents témoins (Figures 78 et 79).
Le patient P3 a été comparé au même témoin que celui des patients P1 et P2 :
Figure
78 : Analyses 3C du locus CFTR du patient P3 en comparaison d’un témoin
Le profil d’interaction du patient P3, représenté sur la Figures 78, montre toujours
un rapprochement entre l’intron 8 et la région promotrice CFTR.
- 130 -
Le patient P4 a été comparé aux librairies de trois témoins différents :
Figure 79 : Analyses 3C du locus CFTR du patient P4 en comparaison de témoins
De la même façon que pour les trois premiers patients porteurs d’une mutation
F508del, on retrouve une différence d’interaction plus marquée entre ce patient et les
témoins, au niveau de l’amorce CFTR 4 présente dans l’intron 8 (Figures 79).
3 Discussion
La comparaison des fréquences d’interaction du locus CFTR de deux patients CF,
dont seule une mutation F508del a été identifiée, avec celles de cellules Caco-2, a permis
de mettre en évidence plusieurs dissemblances.
Premièrement, les deux régions, dans l’intron 11 et en 3’ du gène CFTR, qui avaient
été décrites comme interagissant spécifiquement avec le promoteur CFTR dans des
cellules Caco-2, ne sont pas retrouvées physiquement proches de la région promotrice
avec les cellules lymphoblastoïdes de ces patients.
Deuxièmement, une région de l’intron 8, entre en contact avec le promoteur CFTR
uniquement dans ces cellules de patients.
- 131 -
Afin d’identifier si ces absences ou nouvelle interaction étaient spécifiques aux
cellules lymphoblastoïdes ou étaient dues aux génotypes des patients, nous avons réalisé
des analyses supplémentaires en comparant les profils de ces deux patients avec des
cellules lymphoblastoïdes de sujets " sains ", non porteurs de mutations CFTR.
Nous avons ainsi pu montrer que les cellules lymphoblastoïdes, exprimant
faiblement CFTR, ne présentaient pas d’interaction particulière avec le promoteur du gène.
Ces résultats sont en accord avec ceux présentés par [Ott et al., 2009a] qui ne décrivaient
pas d’interaction spécifique au sein du locus CFTR dans les cellules n’exprimant pas ou
très peu le gène.
Ainsi, l’interaction entre la région de l’intron 8 et le promoteur CFTR n’a pas été
retrouvée avec les cellules de ces témoins. Cette interaction est donc dépendante des
deux patients étudiés.
De manière à mieux documenter la présence de cette interaction nous avons
reproduit ces analyses sur deux autres patients et deux nouveaux témoins. Les deux
patients supplémentaires sont porteurs d’un génotype semblable à celui des premiers :
présence d’une mutation F508del et d’une mutation non identifiée.
Ces deux nouveaux patients ont présenté, de la même manière que les deux
premiers, une interaction entre une région de l’intron 8 et le promoteur CFTR.
Ces résultats laissent à penser que cette interaction serait spécifique de la
mutation F508del.
Il aurait été intéressant d’analyser des patients CF non porteurs de la mutation
F508del. N’ayant pas de cellules issues de ce type de patients, nous n’avons pu confirmer
ou réfuter cette hypothèse.
De plus, du fait de leur faible niveau d’expression du gène CFTR, les cellules
lymphoblastoïdes ne sont pas forcément un type cellulaire de choix pour ce genre
d’analyse.
Afin d’être dans des conditions les plus proches de l’in vivo et avec un type
cellulaire plus relevant, nous avons souhaité nous orienter vers des études utilisant des
cultures primaires de cellules épithéliales.
- 132 -
C. Recherche d’interactions entre des séquences non
codantes conservées (CNCs) et le promoteur CFTR
Analyses 3C
Parallèlement à l’étude des profils d’interaction du locus CFTR de patients CF, nous
avons cherché à identifier de nouveaux éléments régulateurs du gène CFTR.
Les mécanismes de régulation spatio-temporels intervenant dans l’expression du
gène CFTR n’étant toujours pas entièrement décrits, nous nous sommes demandés si
des séquences non codantes conservées (CNCs), encadrant le locus CFTR,
n’intervenaient pas au niveau de ce fin contrôle. En effet, plusieurs études ont démontré
que des CNCs étaient impliquées dans des mécanismes cis-régulateurs. Une étude a par
exemple mis en avant l’importance d’une CNCs sur la régulation du gène RET [Emison et
al., 2005]. Une altération moléculaire dans cette CNCs a été décrite comme impliquée
dans la maladie de Hirschsprung. D’autres travaux ont également montré l’action cisrégulatrice de CNCs sur le promoteur du gène FOXL2 (Forkhead Box L2) [D'Haene et al.,
2009]. Des analyses 3C ont identifié le mécanisme d’action de ces régulations-cis en
décrivant des interactions avec le promoteur. Une délétion dans ces CNCs a été associée
au syndrome BPES (Blepharophimosis-Ptosis-Epicanthus inversus Syndrome).
Ainsi, il a clairement été établi que des CNCs pouvaient jouer un rôle important dans
la régulation génique. De plus, des modifications moléculaires au niveau de ces CNCs
peuvent avoir un effet délétère sur l’expression d’un gène et engendrer des
conséquences pathologiques.
Nous avons donc testé si des CNCs entourant le gène CFTR interagissaient avec la
région promotrice. L’identification de possibles interactions entre CNCs et le promoteur
CFTR pourrait laisser entrevoir une potentielle régulation à distance du gène. Une telle
description pourrait également tendre à rechercher des mutations au niveau de ces
régions pour expliquer des cas de mucoviscidose non élucidés.
- 133 -
2 Résultats
2.1 Détection de CNCs à proximité du locus CFTR
Les
CNCs
ont
été
répertoriées
grâce
au
site
ECR
Browser
(http://ecrbrowser.dcode.org/). Ce navigateur est une interface graphique dynamique qui
permet aux utilisateurs de visualiser et d’analyser des régions conservées au cours de
l’évolution (ECRs : Evolutionary Conserved Regions) en alignant des génomes
séquencés d'espèces. Les ECRs sont représentés par des pics colorés sur un graphique
dont l'axe des abscisses représente les positions du génome et l'axe des ordonnées le
pourcentage d'identité entre le génome de base et les génomes alignés à cette position.
Pour cette étude, le génome humain a été comparé à celui d’espèces assez
éloignées, comme celui de poissons, d’amphibiens ou de rongeurs. L’analyse était
paramétrée pour étudier des ECRs avec une homologie de 90% sur 100 pb minimum.
Afin d’étudier uniquement des séquences non codantes conservées, nous avons
uniquement
sélectionné
les
pics
rouges, jaunes
et
saumon
qui
représentent
respectivement des zones de région intergénique, des UTRs (UnTranslated Region) ou
des zones introniques.
Une première analyse englobant une région de plus de 4 Mb a été réalisée pour
avoir une large vision de l’importance de la présence de CNCs autour du gène CFTR.
Figure 80 : Analyse de CNCs sur une vaste région comprenant le gène CFTR
- 134 -
Comme on peut le voir sur la Figure 80, peu de CNCs sont retrouvés en aval ou
dans les régions proches en amont du gène CFTR (rectangle rouge).
Par ailleurs, lorsque l’on remonte un peu plus en amont du gène CFTR, on peut se
rendre compte que de nombreuses régions sont extrêmement conservées (rectangle vert).
La majorité de ces CNCs est localisée dans la région intergénique comprise entre les
gènes MDFIC (MyoD Family Inhibitor Domain Containing) et TFEC (Transcription Factor
EC). Quelques pics supplémentaires sont retrouvés dans la région intergénique
TFEC / TES.
A partir de ces données, ces deux régions intergéniques ont été étudiées plus
précisément. Les pics de conservation les plus importants ont été sélectionnés pour être
analysés avec la technique 3C.
Au total, vingt-quatre CNCs de la région intergénique MDFIC / TFEC, indiqués de
A à W, et cinq CNCs présents au sein de la région séparant les gènes TFEC et TES,
numérotés de 1 à 5, ont été sélectionnés. Ces CNCs sont représentées sur différentes
figures du paragraphe suivant.
2.2 Analyses 3C entre les CNCs identifiées et le promoteur CFTR
Afin de préparer des librairies contrôles, quatre BACs recouvrant la région
intergénique MDFIC / TFEC (RP11-1012L24, RP11-656G24, RP11-241B3 et RP11145A22), et un BAC de la région TFEC / TES (RP11-915H23) ont été commandés et
préparés.
Les séquences des CNCs sélectionnées ont été isolées pour dessiner une amorce
sens au niveau d’un site de restriction HindIII de chacune de ces régions. L’amorce antisens du promoteur CFTR, est la même que celle précédemment utilisée. Les possibles
interactions entre ces séquences et le promoteur CFTR ont ensuite été étudiées avec la
technique 3C en PCRq.
Ces analyses ont été effectuées avec des librairies de la lignée cellulaire Caco-2 en
triplicat. Toutes les librairies contrôles ont été réalisées avec un mélange équimolaire du
BAC de la région CNCs et du BAC 652K23 recouvrant la région promotrice du gène
CFTR.
2.2.1 Résultats des CNCs situés sur le BAC 915H23
Comme indiqué précédemment, cinq CNCs ont été sélectionnés au sein du BAC
915H23 qui recouvre la région intergénique TFEC et TES (Figure 81).
- 135 -
Figure 81 : CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-915H23 de la région TFEC / TES
Les analyses 3C réalisées avec ces CNCs, pour montrer une possible interaction
avec le promoteur du gène CFTR, ont réfuté cette hypothèse. En effet, quelque soit
l’amorce utilisée pour chacune de ces régions, aucune amplification n’a été obtenue avec
les librairies de cellules Caco-2. Les différents rapports qui ressortent du logiciel
LightCycler 480 II montrent des profils identiques. Des courbes d’amplification sont
uniquement retrouvées pour les échantillons de la librairie contrôle, qui forment la gamme
étalon (échantillons représentés en bordeaux sur la Figure 82).
Figure 82 : Exemple d’un rapport d’amplification montrant l’absence d’interaction entre la
région promotrice du gène CFTR et une CNCs
- 136 -
Ces résultats permettent de ne pas remettre en cause l’efficacité d’amplification
des différents couples d’amorces. Si l’amplification n’a pas lieu dans les échantillons de
librairie Caco-2 (échantillons représentés en vert), c’est qu’il n’y a pas eu d’interaction
entre les deux régions étudiées et qu’ainsi le fragment de ligation que l’on cherche à
amplifier n’a pas été formé.
2.2.2 Résultats des CNCs situés sur le BAC 1012L24
Cinq CNCs étudiés, se situent dans une partie de la région intergénique TFEC /
TES, recouverte par le BAC RP11-1012L24 : (Figure 83 )
Figure 83 : CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-1012L24 de la région MDFIC / TFEC
Le même type de profil que ceux obtenus pour les CNCs de la région intergénique
TFEC / TES a été retrouvé pour les CNCs A, C, D et E. Ces quatre régions ne semblent
donc pas non plus entrer en contact avec la région promotrice du gène CFTR.
En revanche, nous ne pouvons rien conclure en ce qui concerne la CNCs B. En
effet, les amplifications obtenues avec l’amorce sens de cette région ne sont pas
spécifiques. Le rapport d’analyse de la courbe de fusion ne montre pas un pic de
température unique (Figure 84).
- 137 -
Figure 84 : Courbes d’analyse de la température de fusion de l’amplification avec la CNCs B
La présence de tous ces pics révèlent une amplification non spécifique qui donne
lieu à plusieurs amplicons.
2.2.3 Résultats des CNCs situés sur le BAC 656G24
Neuf CNCs ont été sélectionnés au sein du BAC 656G24 qui recouvre une partie
de la région séparant les gènes MDFIC et TFEC : (Figure 85)
Figure 85 : CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-656G24 de la région MDFIC / TFEC
- 138 -
Les amplifications avec les amorces sens des CNCs F, G, H, I, J, K et M, n’ont
donné aucun résultat avec les librairies Caco-2.
Les gammes avec la librairie contrôle étant bien amplifiées, nous en déduisons
une nouvelle fois que ces différentes régions ne sont pas impliquées dans une
quelconque interaction avec le promoteur CFTR.
L’amplification avec la CNCs L, est de la même manière que décrit précédemment
pour la CNCs B, non spécifique.
La CNCs N, elle, ne montre aucune amplification, que ce soit avec les librairies
contrôles ou Caco-2 : (Figure 86)
Figure 86 : Courbes d’analyse de la température de fusion de l’amplification avec la CNCs N
L’absence d’amplification avec les échantillons de la librairie BACs laisse à penser
à un problème relatif à l’amorce sens MT-N.
2.2.4 Résultats des CNCs situés sur le BAC 241B3
Au niveau d’une partie de la région intergénique MDFIC / TFEC recouverte par le
BAC RP11-241B3, sept CNCs ont été étudiés : (Figure 87 )
- 139 -
Figure 87 : CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-241B3 de la région MDFIC / TFEC
Les CNCs O, P, Q, R, S et U ne présentent pas de profil d’amplification dans les
cellules Caco-2. Ces amplifications étant retrouvées pour les librairies contrôles, on peut
également conclure en une absence de contact entre ces CNCs et la région promotrice
de CFTR.
Une amplification non spécifique avec le CNCs T, ne permet pas d’apporter
d’information pour cette région.
2.2.5 Résultats des CNCs situés sur le BAC 145A22
Pour finir, quatre CNCs se situant dans la région recouverte par le BAC RP11145A22 de la région MDFIC / TES ont été analysés : (Figure 88 )
Figure 88 : CNCs sélectionnés au sein du BAC RP11-145A22 de la région MDFIC / TFEC
- 140 -
Aucune amplification de cette région n’a marché pour les échantillons de la librairie
contrôle. Ces résultats mettent en exergue une librairie BACs défectueuse. Sans ce
contrôle, il est impossible de savoir si les amorces fonctionnent correctement et de
manière spécifique.
Par ailleurs, un pic unique a été trouvé lors de deux analyses différentes pour un
échantillon de la librairie Caco-2 au niveau de la CNCs V (Figure 89).
Figure 89 : Courbes d’analyse de la température de fusion de l’amplification avec la CNCs V
Sans contrôle supplémentaire, il est impossible de conclure sur une spécificité de
ce pic. Il est intéressant d’avoir noté cet amplicon avec deux analyses distinctes, mais en
contre partie, il n’a été retrouvé que pour un échantillon sur six testés et n’apparaît pas du
tout dans la troisième analyse.
- 141 -
3 Discussion
Le bilan de ces travaux n’a pas été celui espéré.
Sur les vingt-neuf CNCs testées, aucune information n’a pu être apportée pour sept
d’entre-elles.
Il aurait fallu tester de nouvelles amorces pour les CNCs B, L, T et N qui étaient
respectivement non spécifiques et inefficaces.
Concernant les CNCs V, W et X, l’absence de résultat est due à un souci relatif à la
librairie contrôle utilisée. Cette librairie a été constituée avec un mélange équimolaire du
BAC RP11-652K3, qui recouvre la région promotrice du gène CFTR, et du BAC RP11145A22, qui est spécifique d’une partie de la région intergénique située entre les gènes
MDFIC et TFEC. La pureté et l’efficacité de digestion de cette librairie contrôle avaient
pourtant été vérifiées. Les résultats de la quantification avec deux quantités différentes de
librairie ont révélé des données en accord avec le facteur de dilution, reflétant une pureté
satisfaisante. De même, les amplifications réalisées sur les témoins ND et D, avec 8
couples d’amorces encadrant différents sites de restriction, ont donné des résultats tout à
fait corrects avec une efficacité de digestion d’environ 80% (Figure 90).
Figure 90 : Test d’efficacité de digestion de la librairie contrôle constituée d’un mélange
équimolaire du BAC 652K3 et du BAC 145A22
- 142 -
Le problème de ces résultats est que les tests réalisés n’utilisent que des amorces
situées au niveau du locus CFTR. Ainsi la qualité de la librairie parait bonne, mais en
réalité, il n’y a que le BAC 652K3 qui est contrôlé. Les analyses défectueuses sont donc
certainement dues à une mauvaise qualité du BAC 145A22. Il serait nécessaire de
dessiner des amorces contrôles également dans cette région.
Pour le reste, les vingt-deux CNCs pour lesquelles les amplifications étaient bien
retrouvées avec les librairies contrôles ont donné des résultats négatifs. L’absence
d’amplification avec les différentes librairies Caco-2 laisse penser qu’aucune interaction
n’a lieu entre ces régions et le promoteur CFTR. Si les interactions ne sont pas présentes,
le fragment de ligation ne se forme pas et donc les amorces positionnées pour amplifier
ce fragment hybride, n’amplifient forcément rien.
Cette démarche reposait sur trop d’hypothèses. Nous espérions en identifiant des
régions ultra-conservées, au plus proche du gène CFTR, pouvoir peut être décrire une
fonction dans sa régulation. Il aurait aussi été intéressant de pouvoir identifier le rôle de
ces séquences. En effet, si elles sont restées aussi conservées au cours de l’évolution,
elles ont certainement une fonction importante à jouer.
Afin de ne pas être si aléatoire et d’avoir plus de chance d’identifier des éléments
de régulation, nous aurions du recroiser les profils de conservation avec des données
décrivant des sites DHS ou des sites de fixation à des facteurs de transcription. Une
étude a, en particulier, montré que les CNCs étaient plus fortement impliquées dans des
mécanismes de régulation quand elles étaient associées à ces éléments [Attanasio et al.,
2008].
De plus, la technique 3C n’est peut-être pas l’approche la plus adaptée pour ce
genre de recherche. Le seuil de détection de la technique est-il suffisant pour détecter des
contacts entre des régions éloignées de plusieurs Mb ? Et le fait de ne pouvoir étudier
qu’un contact à la fois n’est pas des plus approprié lorsque l’on souhaite étudier un grand
nombre de régions.
Suite à ces constats, nous n’avons pas cherché à poursuivre en faisant plus de
mises au point pour les régions n’ayant pas fonctionnées. Nous nous sommes plutôt
tournés vers la recherche d’une méthode à plus haut débit.
- 143 -
D. Détermination d’une conformation expressiondépendante du locus CFTR - Analyses 5C
Suite aux premières analyses réalisées avec la technique 3C nous nous sommes
aperçus de différents facteurs limitant les études.
Nous avons dans un premier temps été limité par le choix du modèle cellulaire. En
effet, si l’on souhaite étudier des dysrégulations du gène CFTR chez des patients CF, il
est préférable de pouvoir travailler sur un type cellulaire exprimant ce gène. De plus, pour
être dans des conditions au plus proche de l’in vivo, nous avons souhaité privilégier les
études sur culture primaire. Ainsi, nous avons développé un protocole de prélèvement et
remise en culture de cellules nasales.
Dans un deuxième temps, nous avons été limités par le pouvoir d’analyse de la
technique 3C. Afin d’étudier de plus nombreuses régions à la fois et avec un meilleur
taux de détection nous avons souhaité passer à une approche à plus haut débit. A la suite
d’un échange avec le Dr Josée Dostie, responsable du groupe de recherche ayant
développé la technique de 5C, et grâce à l’obtention d’une bourse de mobilité, j’ai eu la
chance de pouvoir me rendre au sein de leur laboratoire pour être directement initiée à
cette nouvelle technologie.
Dans ce sens, nous avons décidé de réaliser un projet sur l’étude du gène CFTR par
la technique 5C.
Au moment de l’initiation de ce projet, début 2012, quelques études portant sur la
conformation chromatinienne du locus CFTR avaient déjà été réalisées.
Le groupe de Job Dekker avait effectué des analyses 3C sur un locus englobant le gène
CFTR, un peu plus de 100 kb en 5’ et 70 kb en 3’, dans six lignées cellulaires différentes
[Gheldof et al., 2010].
Et puis, trois différents travaux d’analyses 3C des membres du groupe de Ann Harris,
avaient été publiés. Une étude concernait l’analyse d’interactions de la région de l’intron 1
dans les lignées Caco-2 et 16HBE14o- [Ott et al., 2009b]. D’autres travaux portaient sur
un locus comprenant le gène CFTR, un peu plus d’une vingtaine de kb en amont et un
peu plus de 15 kb en aval sur des cultures primaires de fibroblastes de peau et de cellules
de l’épididyme [Blackledge et al., 2009].
- 144 -
Et les dernières analyses avaient été réalisées sur à peu près le même locus que l’étude
précédente mais dans les lignées Caco-2 et HT29, et sur des cultures primaires de
cellules d’épididyme, de fibroblastes de peau et de cellules épithéliales de la trachée et
des bronches [Ott et al., 2009a].
Ainsi, afin de mieux documenter les possibles mécanismes de régulation à distance
auxquels le gène CFTR peut être soumis, nous avons décidé d’utiliser la technique 5C
pour étudier les interactions chromatiniennes d’un plus large locus CFTR. Ces analyses
ont été réalisées sur des cultures primaires de cellules épithéliales nasales en
comparaison à des fibroblastes de peau.
2 Résultats
2.1 Etude d’un large locus CFTR avec la technique 5C
Les précédentes études d’analyses 3C se portaient principalement sur la région du
gène CFTR et sur quelques kb en amont et en aval. Nous avons souhaité étendre ce
locus d’étude, en particulier la région en amont du gène qui avait été moins étudiée, afin
d'identifier de possibles nouvelles régions régulatrices.
La technique 5C, combinée au séquençage haut débit, permet d’analyser les
interactions de nombreuses régions en une analyse. Nous avons ainsi délimité une région
d’environ 783 kb (hg19, chr7:116,608,455-117,391,622). Ce locus comprend une large
région d’un peu plus de 500 kb en amont du gène CFTR englobant les gènes voisins ST7,
WNT2 et ASZ1, le gène CFTR, et une région d’un peu moins de 85 kb en aval du gène
contenant le gène CTTNBP2.
Afin d’analyser les interactions chromatiniennes du promoteur CFTR avec l’ensemble
de cette région, nous avons dessiné trois amorces 5C antisens dans la région promotrice
et 140 amorces 5C sens sur le reste du locus (les séquences sont détaillées en Annexe
IV).
Le locus d’étude est représenté sur la Figure 91 :
Figure 91 : Représentation du locus CFTR d’étude recouvert par les amorces 5C
- 145 -
Les différents triangles symbolisent les fragments de restriction EcoR1. Les trois
amorces antisens, positionnées au plus proche du promoteur CFTR, sont représentées
par les triangles rouges. Les triangles bleus correspondent aux fragments de restriction
des amorces sens. Les amorces des fragments de restriction illustrés par les triangles
verts n’ont pas été sélectionnées pour des raisons de qualité.
L’expression du gène CFTR est beaucoup plus faible dans les tissus que dans les
lignées cellulaires. Dans ce sens, nous avons favorisé l’utilisation de cellules humaines
primaires, issues d’individus témoins, pour travailler au plus proche des niveaux
d’expressions physiologiques de CFTR. Les différents volontaires témoins ont été
génotypés pour s’assurer qu’ils ne portaient pas de mutation CFTR.
Afin d’identifier des changements conformationnels du locus CFTR en fonction de
son niveau d’expression, nous avons comparé des cultures de cellules exprimant
fortement ou faiblement le gène.
La protéine CFTR étant fortement exprimée au niveau des épithéliums, les cellules
épithéliales sont un type cellulaire de choix. Les cellules épithéliales les plus faciles à
prélever sont les cellules présentes au niveau des cornets nasaux, en particulier au
niveau du cornet moyen. Un protocole de prélèvements de ces cellules via un grattage du
nez a ainsi été développé.
De la sorte, des analyses 5C ont été réalisées sur dix librairies de cellules épithéliales
nasales (HNEC) en comparaison à six librairies de cellules de fibroblastes de peau,
cellules exprimant très faiblement le gène CFTR.
2.2 Interactions longues distances et niveau d’expression CFTR
Les interactions du promoteur CFTR avec la région d’étude, d’un peu plus de 783 kb,
ont été mesurées en séquençant, sur Ion PGM™, les librairies 5C des cellules HNEC et
des fibroblastes de peau, issues des différents individus témoins.
Les profils d’interaction montrent tout d’abord des variations entre les différents
individus témoins (Figure 92).
- 146 -
Figure 92 : Profils des fréquences d’interaction des cellules HNEC et des fibroblastes de peau
Les profils d’interaction des dix librairies HNEC et six librairies de fibroblastes de
peau, ont été tirés de l’outil " my5C-heatmap " après avoir normalisé l’ensemble des
librairies par rapport à la librairie HNEC 5.
Les contacts de chacune des amorces antisens avec l’ensemble de la région
d’étude sont respectivement représentés sur les trois lignes horizontales. Chaque carré
illustre l’interaction d’une amorce antisens avec une amorce sens. Le locus d’étude est
détaillé au-dessus des profils des deux types cellulaires pour situer le positionnement de
l’amorce sens. La fréquence de l’interaction est corrélée à l’intensité de la couleur : plus la
fréquence est importante, plus la couleur est intense.
Ainsi, comme on peut le voir, les fréquences d’interaction entre le promoteur et
l’ensemble du locus de librairies, réalisées avec le même type cellulaire, diffèrent
légèrement d’un individu à un autre. On peut par exemple noter des contacts plus
importants entre le promoteur et des séquences en 3’ du gène, dans l’échantillon de
cellules de peau de l’individu 14 par rapport à celui de l’individu 15.
Néanmoins,
malgré
quelques
variabilités
caractéristiques aux deux types cellulaires se détachent.
- 147 -
inter-individuelles,
des
profils
Les fibroblastes de peau, qui n’expriment pas le gène CFTR, montrent
majoritairement des interactions à faible distance. Ces interactions sont particulièrement
retrouvées entre le promoteur et les régions toutes proches en 5’, les régions de la
première partie du gène CFTR, et quelques régions en 3’.
Ces observations se confirment lorsque l’on étudie la répartition des reads de
séquençage en divisant le locus d’étude en quatre régions : la région 5’, la région
promotrice du gène CFTR, le gène CFTR et la région 3’ (Figure 93).
Figure 93 : Répartition des reads d’analyses 5C des cellules HNEC et fibroblastes de peau
Le nombre de reads correspond au nombre de fois où la séquence, formée par un
fragment hybride à la suite d’une interaction, a été lue.
Ces données de répartition montrent clairement les différences de profils
d’interaction entre les cellules HNEC et les fibroblastes de peau.
La majorité des interactions des cellules fibroblastiques (80,4%) intervient au sein
même de la région promotrice CFTR. Alors que les cellules HNEC présentent également
de nombreuses interactions au niveau du promoteur (62,2%), elles affichent plus de deux
fois plus de contacts entre la région 5’ et le promoteur CFTR que les fibroblastes de peau
(7,1% contre 3%).
De même, des rapprochements entre la région 3’ et la région promotrice du gène
CFTR sont présents dans pratiquement deux fois plus de cas dans les cellules HNEC,
15,3% contre 7,5% pour les fibroblastes de peau.
Pour finir, les cellules n’exprimant pas le gène présentent aussi moins d’interaction
entre le promoteur et les différentes régions du gène CFTR, 9,1% contre 15,5% pour les
cellules HNEC.
- 148 -
2.3 Interactions longues distances et promoteur CFTR de cellules HNEC
La plus grande présence d’interactions longues distances sur le promoteur CFTR
des cellules HNEC suggère de possibles localisations d’éléments de régulation de ce type
cellulaire dans les régions 5’ et 3’ du gène.
Afin de mieux définir le positionnement de ces éléments, nous avons identifié des
régions interagissant préférentiellement avec le promoteur CFTR dans les cellules
nasales.
Les résultats des fréquences d’interaction des trois amorces antisens, R1, R2 et R3,
positionnées au niveau du promoteur CFTR sont présentés sur la Figure 94 :
Figure 94 : Analyses 5C des cellules HNEC et des fibroblastes de peau
- 149 -
On peut constater que c’est l’amorce R3, située la plus proche du point d’initiation
de la traduction du gène CFTR (à environ 500 pb), qui est la plus impliquée dans des
interactions. Les amorces R1 est R2 qui sont respectivement localisées à environ 5 et 4
kb sont beaucoup moins soumises à des contacts. Ces observations suggèrent que les
interactions détectées sont bien spécifiques à la région promotrice CFTR.
Les profils d’interaction des fibroblastes de peau présentent une configuration
chromatinienne de base. On observe une relation inverse entre les fréquences
d’interaction et la distance génomique à partir de l’amorce cible. Cette configuration est
plus particulièrement constatée au niveau de la région 5’. Mais bien que des interactions
plus fortes soient retrouvées en 3’, elles restent toujours plus faibles que celles des
cellules HNEC.
A partir de ces données, nous avons défini onze régions préférentiellement
enrichies en interactions dans les cellules HNEC (régions A à H et 1 à 3). Ces régions se
situent d’environ -460 kb (région A) à +241 kb (région H) du site d’initiation de la
traduction du gène CFTR. Sept de ces régions se situent dans la région 5’, deux dans le
gène CFTR et deux dans la région 3’ (les positions de ces régions sont détaillées dans
l’Annexe V).
Les trois régions numérotées de 1 à 3 ont précédemment été décrites comme
impliquées dans une interaction avec le promoteur CFTR. La région 1 correspond à la
région DHS -79,5 kb dont une interaction avec le promoteur CFTR a particulièrement été
décrite dans des cellules Caco-2 et 16HBE14o- [Gheldof et al., 2010; Zhang et al., 2012].
Les régions 2 et 3 comprennent respectivement, les sites DHS de l’intron 10 et 11, et le
DHS de la région nommée " 3’INS ", qui ont été montrés comme entrant fortement en
contact avec la région promotrice du gène CFTR dans plusieurs types cellulaires [Ott et
al., 2009a].
2.4 Corrélations entre contacts physiques et éléments de régulation
L’identification d’interactions à distance, préférentiellement enrichies dans les
cellules exprimant le gène CFTR, laisse à penser que ces régions éloignées, entrant en
contact avec le promoteur CFTR, peuvent intervenir dans sa régulation.
Afin de déterminer un potentiel rôle régulateur de ces régions, nous avons regardé
si elles présentaient des caractéristiques d’éléments de régulation. Pour cela, nous avons
analysé les données de différents marqueurs de régulation disponibles pour les cellules
SAEC sur la base de données GEO.
- 150 -
Les cellules SAEC sont des petites cellules épithéliales issues des poumons. Ce
modèle cellulaire étant celui se rapprochant le plus des cellules HNEC, nous supposons
que les éléments de régulation contrôlant l’expression du gène CFTR dans ces cellules
sont, au moins en partie, les mêmes que ceux des cellules HNEC.
Dans un premier temps, nous avons étudié la présence de sites DHS.
De manière intéressante, mise à part la région E, toutes les régions que nous avions
définies comme interagissant spécifiquement avec le promoteur CFTR dans les cellules
HNEC, corrèlent avec des sites DHS (Figure 95).
Figure 95 : Localisation de potentiels éléments de régulation du gène CFTR des cellules HNEC
On peut en particulier noter la forte interaction de la région F avec le promoteur
CFTR qui correspond exactement à un pic DHS. Cette région est située à -44 kb du site
d’initiation de la traduction du gène CFTR.
- 151 -
La région G, localisée au niveau de l’intron 19 du gène CFTR, pour laquelle nous
avons également montré un contact avec le promoteur CFTR, présente aussi plusieurs
sites DHS. Une interaction au niveau d’un site DHS de l’intron 19 avait d’ailleurs été
précédemment décrit dans des cellules d’épididyme [Blackledge et al., 2009].
Par ailleurs, nous avons examiné la présence de sites de fixation au facteur CTCF.
Les régions C et H, entrant fortement en contact avec le promoteur CFTR et qui
présentaient déjà un site DHS, contiennent également chacune un important site de
liaison au CTCF. Elles se situent à respectivement -267 kb du site d’initiation de la
traduction et +48,9kb de la fin du gène CFTR (Figure 95). Un site plus faible de
reconnaissance du facteur CTCF est aussi retrouvé au niveau de la région A, située à
environ -465 kb du site d’initiation de la traduction du gène CFTR, qui possède également
un site DHS.
Pour finir, la conservation de séquences génomiques pouvant être un indicateur
d’éléments fonctionnels, nous avons observé si les régions que nous avions
sélectionnées étaient conservées. Nous avons ainsi comparé nos régions d’intérêt aux
profils de conservation GERP, accessibles sur le site UCSC [Cooper et al., 2005]. Nous
pouvons constater, qu’hormis la région A qui présente un fort degré de conservation dans
différentes espèces, les autres régions ne sont pas particulièrement très conservées
(Figure 95).
3 Discussion
L’analyse 5C de la conformation chromatinienne d’une région de 783 kb, a permis
d’apporter de nouvelles informations quant à une organisation expression-dépendante du
locus CFTR.
En effet, la comparaison d’interactions avec le promoteur CFTR dans différentes
librairies de cellules, exprimant ou non le gène CFTR, a montré d’importantes disparités.
Bien que quelques différences aient été observées entre les librairies des mêmes types
cellulaires, certainement dues à des variations génétiques inter-individuelles, les résultats
montrent clairement deux profils distincts d’organisation de la chromatine en fonction du
niveau d’expression du gène CFTR.
- 152 -
Les fibroblastes de peau, qui n’expriment pas ou très peu le gène CFTR, présentent
un locus CFTR plutôt linéaire. La majorité des interactions est retrouvée au sein même de
la région promotrice. A noter que ces interactions sont beaucoup plus importantes que
celles présentes dans le promoteur de cellules exprimant le gène. Cela pourrait laisser
penser que la région promotrice des cellules présentant une faible expression de CFTR
serait soumise à une conformation de la chromatine assez fermée. La présence de ces
nombreux repliements pourrait empêcher l’accès de la machinerie transcriptionnelle au
promoteur CFTR.
Les cellules épithéliales nasales, dont l’expression du gène CFTR est plus importante,
présentent une région promotrice moins compacte que celles des fibroblastes de peau.
Ces résultats sont concordants avec une étude qui a décrit, que suite à une
décondensation de la chromatine, les fréquences d’interaction autour de promoteurs actifs
étaient plus faibles [Gheldof et al., 2006].
D’autre part, le locus de cellules HNEC est engagé dans de nombreux repliements
chromatiniens. Ces boucles de chromatine permettent le rapprochement de régions
distantes au promoteur CFTR. Les régions entrant spécifiquement en contact avec le
promoteur CFTR, sont aussi bien situées en 5‘ ou en 3’ du gène, que dans des régions
introniques.
Fait intéressant : ces analyses 5C ont mis en évidence des interactions entre le
promoteur CFTR et des régions distantes précédemment décrites par des analyses 3C.
Ces résultats permettent de valider notre approche qui repose sur l’utilisation de la
technique 5C pour identifier de nouveaux éléments de régulation.
Par ailleurs, il est important de préciser que nous n’avons pas retrouvé l’ensemble
des interactions déjà documenté. Ceci peut être expliqué par plusieurs raisons.
Premièrement, nos études ont été réalisées avec des cellules HNEC qui n’avaient
auparavant jamais été utilisées pour ce type d’analyse. Et comme l’a montré une étude,
les fréquences d’interactions ne sont pas toujours proportionnelles au niveau d’expression
du gène CFTR et peuvent varier d’un type cellulaire à un autre [Gheldof et al., 2010]. Ces
différences peuvent en partie être expliquées par la spécificité tissulaire ou cellulaire des
sites DHS.
- 153 -
Deuxièmement, nos analyses ont été réalisées en fonction de sites de restriction
EcoR1 alors que la plupart des études précédentes utilisaient l’enzyme HindIII.
De ce fait, les fragments de restriction ne recouvrent pas exactement les mêmes régions.
On peut alors perdre de l’information ou montrer l’importance de nouvelles régions. Selon
le design de nos amorces nous n’avons, par exemple, pas pu positionner d’amorce dans
la région contentant le site DHS 4574 + 6,8kb qui avait auparavant été décrit comme
entrant spécifiquement en contact avec le promoteur CFTR dans des cellules de
l’épididyme [Blackledge et al., 2009].
Ainsi, nous avons également décrit de nombreuses nouvelles régions spécifiquement
impliquées dans des interactions avec le promoteur CFTR dans les cellules HNEC. Les
données marquantes de ces régions sont leurs liens avec des marques de régulation. En
effet, la majorité de ces régions comportent des sites DHS. Ceci révèle une accessibilité
de la chromatine de ces régions à des facteurs régulateurs. Dans ce sens, nous
retrouvons en particulier des sites de liaison au facteur CTCF dans deux de ces régions.
Le facteur CTCF est la protéine majoritairement impliquée dans la formation de boucle de
chromatine. Il est plus qu’envisageable que les repliements chromatiniens permettant
l’interaction de ces deux régions, situées pour l’une à -267 kb du site d’initiation de la
traduction et pour l’autre à +48,9 kb en aval du gène CFTR, soient initiés par la fixation de
ce facteur.
Quelques mois après le lancement de cette étude, le groupe de Ann Harris a publié
les résultats de nouveaux travaux. Cette étude, dans le même sens que la nôtre, portait
sur l’identification de mécanismes moléculaires contrôlant l’expression du gène CFTR
dans des cellules AEC [Zhang et al., 2012]. Après avoir identifié plusieurs nouveaux sites
DHS spécifiques de cellules AEC, ils ont étudié ces sites en réalisant des analyses 3C sur
plusieurs types cellulaires. Leurs analyses ont porté sur un locus de 800 kb s’étendant
plus en 3’ que notre région d’étude, et moins loin en 5’ que nous. Elles se sont
uniquement focalisées sur quinze sites DHS.
Ainsi, ils ont également étudié la région à +48,9 kb comportant un site CTCF
ubiquitairement présent dans tous les types cellulaires. Leurs études n’ont pas montré de
contact entre cette région et le promoteur CFTR ni dans des cellules 16HBE14o-, ni dans
un mélange de cellules primaires de bronches et de trachées (NHBE, Normal Human
Bronchial /Tracheal Epithelial Cells). Par ailleurs, ils ont décrit des interactions dans des
cellules Caco-2. Nos résultats diffèrent également au niveau d’une région à -44 kb.
- 154 -
Nous la retrouvons physiquement proche de la région promotrice CFTR dans les cellules
HNEC, alors qu’elle ne parait pas spécifiquement en contact dans les cellules AEC qu’ils
ont testées.
Pour conclure, ces analyses ont permis d’identifier de nouvelles régions qui
interagissent spécifiquement avec la région promotrice CFTR dans des cellules HNEC.
Alors que certaines de ces interactions ont auparavant été décrites dans d’autres types
cellulaires, de nouvelles semblent spécifiques des cellules HNEC.
Ce projet n’est bien entendu pas achevé. Nous testons actuellement l’impact de ces
différentes régions sur l’expression du gène CFTR. Ces régions sont clonées avec le
promoteur CFTR dans des systèmes de gènes rapporteurs. Les constructions sont
ensuite transfectées dans des lignées 16HBE14o- et des cellules SAEC pour en tester
l’activité.
Le manuscrit présentant ces résultats est en cours de rédaction. Nous sommes en
attente de résultats complémentaires des tests de gène rapporteurs.
" Analysis of long-range interactions in primary human
cells reveals CFTR new regulatory elements "
S. Moisan1,2,3*, S. Berlivet4,5, C. Ka2,3, J. Dostie5, C. Férec1,2,3*
1) INSERM U1078 Laboratoire de Génétique, Génomique Fonctionnelle et
Biotechnologies, Brest, France ;
2) Université de Bretagne Occidentale, Faculté de Médecine et
des Sciences de la Santé, Brest, France ;
3) CHU Brest, Hôpital Morvan, Laboratoire de Génétique Moléculaire, Brest, France;
4) Unité de Génétique et Développement, Institut de Recherches Cliniques de Montréal,
Québec, Canada;
5) Departement of Biochemistry and Goodman Cancer Research Center, McGill
University, Montréal, Québec, Canada
*Corresponding authors:
Stéphanie Moisan ([email protected])
Claude Férec ([email protected])
INSERM-UMR 1078
46, rue Félix le Dantec, CS 51819
29218 Brest Cedex 2
Tel: 33.(0)2.98.22.36.79
Fax: 33.(0)2.98.01.83.42
- 155 -
CONCLUSION
&
PERSPECTIVES
- 156 -
Conclusion et Perspectives
Partie4.CONCLUSIONGENERALEET
PERSPECTIVES
L’organisation chromatinienne a clairement été démontrée comme jouant un rôle clé
dans l’expression génique. L’intervention de régions régulatrices par la formation de
boucles chromatiniennes a été décrite dans de nombreux modèles géniques. Ces
mécanismes de régulation à distance ont été particulièrement exposés dans des
processus développementaux. De plus, des dysfonctionnements de ces mécanismes ont
été impliqués dans de nombreuses pathologies.
Les mécanismes moléculaires contrôlant l’expression du gène CFTR, responsable de
la mucoviscidose, n’ont clairement pas été entièrement identifiés. Ainsi, l’étude de
l’organisation de la chromatine et des régulations à distance pouvant en découler, est
devenue une voie de recherche incontournable.
Dans ce sens, cette thèse a été consacrée à l’ " Etude des mécanismes de régulation
à distance du gène CFTR ".
Cette étude s’est décomposée en plusieurs axes.
Afin d’analyser les contacts chromatiniens impliqués dans la régulation du gène
CFTR, la technique 3C a tout d’abord été développée avec succès au sein du laboratoire
d’étude.
Cette technique a, dans un premier temps, été utilisée sur des cellules de patients CF
dont une mutation n’avait pas été identifiée. Nous avons ainsi cherché à identifier des
changements conformationnels du locus CFTR, qui pourraient expliquer une dérégulation
du gène. Nous avons, de cette manière, identifié une interaction entre le promoteur CFTR
et une région de l’intron 8, uniquement dans des cellules de patients portant une mutation
F508del et une deuxième mutation inconnue. Ces analyses ayant été réalisées sur un
type cellulaire n’exprimant pas fortement le gène CFTR, nous avons préféré rester
prudents quant à une quelconque conclusion. Ces résultats ne demandent qu’à être redémontrés dans un modèle cellulaire plus relevant.
- 157 -
Dans un second temps, des analyses 3C ont été menées pour chercher à identifier
de nouveaux éléments de régulation intervenant sur l’expression du gène CFTR. Des
régions non-codantes conservées ont été sélectionnées autour du gène CFTR. Des
contacts entre ces régions et le promoteur CFTR ont ensuite été recherchés. Ces
différentes analyses n’ont pas été concluantes. Aucune interaction n’a pu être décrite de
cette manière. Suite à ces résultats négatifs, nous avons pris du recul et nous nous
sommes rendu compte de la mauvaise démarche de notre approche. Nous sommes trop
partis trop au hasard. Nous aurions du recroiser les données des profils de conservation
avec d’autres éléments spécifiquement retrouvés dans des mécanismes de régulation. De
plus, la technique 3C a des limites. Il n’était pas des plus judicieux de l’utiliser pour ce
type de recherche.
Dans ce sens, nous avons orienté nos recherches vers une variante à plus haut débit
de la technique 3C.
Suite à la mise en place d’une collaboration avec le laboratoire pionnier de la
technique 5C, nous avons initié un projet pour étudier les contacts chromatiniens d’un
locus CFTR de pratiquement 800 kb. Afin d’être dans un type cellulaire de choix de la
mucoviscidose et pour être au plus proche des conditions physiologiques, nous avons
développé un protocole de prélèvement et de remise en culture de cellules épithéliales
nasales. Les profils d’interaction de ces cellules ont été comparés à ceux de cellules
exprimant faiblement le gène CFTR. Cette comparaison a permis de mettre en évidence
des interactions spécifiquement retrouvées dans les cellules exprimant le gène. De
manière intéressante, la plupart de ces régions qui entrent en contact avec le promoteur
CFTR, présentent des éléments caractéristiques de régions régulatrices.
Ces résultats semblent très prometteurs dans l’identification de nouveaux éléments
régulateurs du gène CFTR. Le rôle enhancer de ces régions est actuellement en cours
d’étude.
Par ailleurs, le choix d’avoir utilisé des cellules épithéliales nasales qui, comparées à
des cellules intestinales ou du tractus uro-génital expriment beaucoup moins le gène
CFTR, était de pouvoir facilement adapter ces études sur des cellules de patients CF.
Suivant cette idée, nous avons souhaité mettre en place un protocole d’autoprélèvement. Ainsi, nous pouvons simplement envoyer un kit de prélèvement
accompagné d’un petit livret photo expliquant la démarche à suivre (Annexe VI).
- 158 -
Une fois ce prélèvement réalisé, les patients n’ont plus qu’à nous le poster grâce à une
boîte cartonnée prépayée fournie dans le kit. Le but est que ce prélèvement soit le moins
contraignant possible pour le patient : rapidité (réalisation du prélèvement en moins d’un
quart d’heure), facilité (le patient n’a pas besoin d’être convoqué et donc de se déplacer
dans un centre médical). Une fois le grattage réalisé, le patient n’a plus qu’à signer un
consentement joint au kit (répondant au CPP Ouest VI du 10/12/2010) et le déposer dans
une boîte aux lettres classique.
Cette notion de transport engendre bien entendu des difficultés supplémentaires. Il a
alors fallu tester la conservation du prélèvement pour être sûr qu’assez de cellules soient
préservées pour une bonne remise en culture.
Nous avons dans un premier temps réalisé des grattages sur des volontaires au
laboratoire et laisser les brosses dans un milieu de récupération (HamF12, Ultroser G +
antibiotiques) à température ambiante pendant 72 heures avant de les remettre en culture.
L’ensemble des prélèvements a été bien conservé, les cellules ont bien reprises. Suite à
ces premiers résultats, nous avons testé le transport. En effet, même si les cellules sont
bien conservées pendant 72 heures, des changements de température dus aux transports
(avion, train…) pourraient être néfastes à leur bonne survie.
Nous avons ainsi fait plusieurs essais avec des volontaires habitants à Montpellier,
Cholet et Evreux. Certains prélèvements ont mis deux jours à arriver à Brest. D’autres ont
mis jusqu’à quatre jours. Au final même les prélèvements ayant mis le plus de temps à
arriver ont bien repris et nous ont permis d’avoir suffisamment de cellules pour la
réalisation de librairies nécessaires à nos analyses.
De cette manière, nous envisageons d’étudier le profil conformationnel du locus
CFTR de différents patients. Nous pourrions nous attendre à identifier des dérégulations à
distance chez des patients dont le génotype n’a pas été établi et pourquoi pas également
chez des patients présentant des phénotypes extrêmes. Des modifications de régulation
pourraient aussi être explorées chez des patients atteints de formes frontières.
En plus de ces travaux, il serait intéressant de continuer à rechercher des éléments
régulateurs pouvant être situés encore plus à distance du promoteur CFTR. Ces travaux
pourraient être menés avec l’utilisation de la technique 5C sur d’autres régions, en
approfondissant l’étude de régions non codantes conservées.
- 159 -
De même, il pourrait être encore plus intéressant d’étudier l’ensemble des
interactions auquel est soumis le promoteur CFTR avec le génome entier, grâce à la
technique 4C.
La caractérisation fine de l’expression du gène doit nous permettre de mieux
comprendre la variabilité phénotypique observée dans la maladie, voire à terme, d’agir
positivement sur l’expression du gène. On sait qu’une augmentation, même modeste, du
transcrit et donc de la protéine, a un effet majeur sur la fonction du canal CFTR.
Ces régions, régulant à distance le gène CFTR, pourraient être demain la cible de
petites molécules thérapeutiques permettant de stimuler l’expression de CFTR voire de
restaurer une expression stable chez certains patients.
Par
ailleurs,
l’identification
de
régions
génomiques,
situées
sur
d’autres
chromosomes, interagissant avec CFTR pourrait donner des indications sur la localisation
possible de gènes modificateurs. On sait, aujourd’hui, que ce champ de recherche reste
très ouvert et que beaucoup de facteurs génétiques modifiant l’expression phénotypique
de la maladie sont encore inconnus
Pour finir, la découverte de nouvelles mutations, hors du locus CFTR, impliquées
dans la régulation du gène pourrait permettre un meilleur diagnostic de la mucoviscidose
et des formes frontières et ainsi, peut être, une meilleure prise en charge.
En conclusion, mon travail de thèse s’est inscrit dans le développement de nouvelles
technologies d’analyse de la conformation chromatinienne permettant d’identifier des
mécanismes de régulation plus atypiques. Tout au long de ce projet, de nombreuses
remises en question se sont posées. Afin d’être le plus en adéquation avec le sujet
d’étude de perpétuelles adaptations ont été mises en œuvre.
Cette étude est loin d’être finie. Et malgré les premiers résultats très encourageants, il
reste encore beaucoup de points à étudier.
De plus, l’apport de ces nouvelles technologies au sein du laboratoire ouvrent
d’éventuelles perspectives d’études pour d’autres axes de recherche de notre unité.
- 160 -
RÉFÉRENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
- 161 -
Références Bibliographiques
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Zink, D., Amaral, M.D., Englmann, A., Lang, S., Clarke, L.A., Rudolph, C., Alt, F., Luther, K.,
Braz, C., Sadoni, N., et al. (2004). Transcription-dependent spatial arrangements of CFTR
and adjacent genes in human cell nuclei. The Journal of cell biology 166, 815-825.
Zirbel, R.M., Mathieu, U.R., Kurz, A., Cremer, T., and Lichter, P. (1993). Evidence for a nuclear
compartment of transcription and splicing located at chromosome domain boundaries.
Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and
evolutionary aspects of chromosome biology 1, 93-106.
- 191 -
ANNEXES
- 192 -
Annexes
ANNEXE I : Obtention de BACs
I.1 Préparation des BACs
Les BACs sont des fragments d’ADN spécifiques clonés dans un vecteur
plasmidique. Les BACs, recouvrant les différentes régions d’intérêt, ont été sélectionnés
grâce au site UCSC Genome Browser, puis commandés à la société CHORI (Children's
Hospital Oakland Research Institute).
Une fois réceptionné sous forme de gélose, un petit prélèvement de chaque BAC
est mis en pré-culture dans 2mL de milieu LB (Lysogeny Broth) complémenté avec de
l’antibiotique chloramphénicol (ATB) pendant 5h à 37°C.
30µL de la pré-culture diluée au 1/100e sont ensemencés sur milieu LB/Agar 1%. Les
boîtes de culture sont recouvertes d’aluminium et déposées à l’envers dans l’étuve à 37°C
pendant une nuit.
Le lendemain, une colonie est récoltée par boîte et mise en présence de 5mL de
milieu LB/ATB pendant 6h à l’étuve. 2mL de cette culture sont ensuite ajoutés à 50mL de
LB/ATB et mis en agitation à 150rpm durant une nuit à 37°C.
Le milieu de culture est éliminé par une centrifugation de 25 min à 4000rpm à 4°C.
Le culot bactérien va ensuite subir une lyse alcaline. Pour cela, il est resuspendu dans
une solution de GTE (Glucose-Tris-EDTA) 1X / Lysosyme. Cette première étape va
permettre de déstabiliser la membrane bactérienne et d’inactiver les DNases grâce à
l’EDTA qui chélate les cations métalliques divalents et le lysosyme qui hydrolyse les
polysaccharides de la paroi bactérienne.
Les bactéries sont lysées dans de la soude (NaOH 0.2M) et du SDS. Cette étape
rend le pH basique. A un tel pH, l’ADN se dénature, le chromosome bactérien se linéarise
alors en grands fragments. L’ADN plasmidique, beaucoup plus petit, lui, reste circulaire et
conserve ses deux brins associés.
L’ajout d’acétate de potassium 3M à pH 5.5 permet aux brins d’ADN de se ré-apparier.
L’ADN plasmidique se renature très vite du fait de la non-séparation de ses brins. L’ ADN
génomique, lui, va précipiter sous l’effet de la forte concentration en sels. Pour finir, l’ADN
plasmidique va être précipité par addition d’alcool mobilisant l’eau du milieu (isopropanol,
éthanol).
Une dernière purification au phénol/chloroforme est réalisée après traitement à la RNase
A et à la protéinase K avant une nouvelle précipitation à l’alcool.
- 193 -
Annexes
I.2 Vérification des BACs
Afin de s’assurer que les BACs recouvrent bien la région d’intérêt, il est nécessaire de
vérifier leur spécificité par FISH. Les techniques d'hybridation in situ sont fondées sur la
propriété de réassociation spécifique des acides nucléiques. Une sonde dénaturée (ici le
BAC marqué) va s'hybrider spécifiquement avec sa séquence cible (préparation
chromosomique dénaturée). Les hybrides infidèles et les molécules de sonde non
hybridées sont éliminés par lavage, puis les hybrides spécifiques sont révélés au
microscope à fluorescence. Pour valider l’emplacement des BACs, une sonde de
localisation connue sera hybridée en même temps.
- Prétraitement :
Dans cette étude, les préparations chromosomiques utilisées sont des lames
témoins, préparées à partir de prélèvements sanguins de sujets sains. La goutte déposée
sur la lame est délimitée à l’aide d’un graveur, afin d’y déposer ensuite la sonde, de
manière précise.
Les lames sont plongées dans une solution de perméabilisation : SSC 2X/0,4%
NP 40 pendant 30 min à 37°C. Le SSC (Saline-Sodium Citrate) contient des ions Na+ qui
vont favoriser l’hybridation des sondes. Le NP-40 est un détergent non ionique qui va
limiter les hybridations non spécifiques.
A température ambiante, les lames sont ensuite plongées dans des bains successifs de
3min d’alcool de concentration croissante (70°/90°/100°). Ces bains permettent de
déshydrater la préparation chromosomique pour éviter une dilution de la sonde et donc
une diminution du signal fluorescent.
Les lames sont ensuite mises à sécher à l’air libre.
- Marquage des sondes :
Les sondes (BAC et sonde référence) sont marquées par "Nick Translation". Ce
marquage repose sur la création aléatoire de cassures (nicks) par la DNAse I de E.Coli.
Ces cassures sont ensuite réparées à l’aide de l’ADN polymérase I de E.coli en présence
de nucléotides marqués. Cette dernière a deux activités : une activité 5’->3’ exonucléase
qui va lui permettre d’éliminer les nucléotides en 5’ des trous créés par la DNAse I et une
activité 5’->3’ polymérase, grâce à laquelle, les nucléotides en 3’ sont remplacés par des
nucléotides marqués. Ceci conduit à un déplacement de la cassure le long de l’ADN d’où
le terme de Nick-Translation. Un mix de marquage est réalisé pour chaque sonde pour
huit lames.
- 194 -
Annexes
Réactifs
Sonde 1,25µg
dUTP 0,2mM
dTTP 0,1mM
dATP/dGTP/dCTP 0,1mM
Tampon 10X
ADN Polymerase 5 U/µL
H2O
2,5
2,5
5,0
10,0
5,0
5,0
10,6
Tableau XVIII : Réactifs utilisés pour le marquage des sondes
Les BACs sont marqués par du SpectrumGreen™- dUTP et la sonde référence
par du SpectrumOrange™-dUTP. La réaction se déroule sur une nuit à 15°C, puis est
stoppée par 10 min à 70°C. Une fois marquées, les sondes sont mélangées et mises en
présence d'ADN enrichi en séquences répétitives (ADN Cot-1), pour éviter les
hybridations non spécifiques. Pour finir, elles sont précipitées par de l’acétate de
potassium et de l’éthanol absolu. Le culot est repris dans du tampon d’hybridation.
- Dénaturation et hybridation :
Cette étape se fait sur un Hybrite® qui est une plaque chauffante programmable
qui permet la dénaturation et l’hybridation de plusieurs lames en même temps. Le dépôt
de la sonde se fait à 45°C à cause de la viscosité du tampon de la sonde. La lame est
recouverte d’une lamelle qui est scellée par du Rubber Cement® (mélange de colle et de
silicone). L’Hybrite® est programmé 1 minute à 75°C puis diminution de la température à
37°C. La minute à 72°C permet de dénaturer simultanément les sondes et l’ADN des
préparations. Une fois l’Hybrite® à 37°C, les lames sont placées en chambre humide
(boîte en plastique contenant des éponges et du papier absorbant mouillés) à 37°C
pendant une nuit.
- Lavages et lecture :
Après avoir éliminé le Rubber Cement® et retiré la lamelle, la lame est plongée
dans un bain de 0,4 SSC/ 0,3% NP 40 à 72°C pendant 45 secondes puis dans un bain de
2 SSC/ 0,1% NP 40 pendant 20 secondes.
Afin de colorer les chromosomes et les noyaux en bleu fluorescent, 14 µL de DAPI (4, 6diamidino-2-phénylindole dihydrochloride) sont déposés sur la lame. Le DAPI est un
agent intercalant de l’ADN. Il permet aussi de ralentir la décroissance de la fluorescence.
Les lames sont lues au microscope à fluorescence et analysées par le logiciel ISIS® de
Metasystem.
- 195 -
Annexes
ANNEXE II : PCR quantitative au SYBR® Green
La PCR quantitative permet, à partir d’une gamme étalon d’ADN amplifié avec nos
échantillons, de déterminer, en temps réel, la concentration en ADN de chaque
échantillon. La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR classique
(amplification cyclique d’un fragment d’ADN, basée sur une réaction enzymologique) avec
une mesure de fluorescence en continu. A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN
est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement
proportionnelle à la quantité d’amplicons produits. La fluorescence est émise par un agent
intercalant, le SYBR® Green, qui est une molécule capable de s’insérer entre les bases
appariées d’un acide nucléique. Cet agent est peu fluorescent à l’état libre, il augmente en
fluorescence lorsqu’il est lié à l’ADN double brin. L’augmentation de la fluorescence
mesurée pendant l’étape de polymérisation, est proportionnelle au nombre de produits
amplifiés formés (amplicons). Dans ce système, la spécificité de la réaction ne repose que
sur la spécificité des amorces, sans contrôle de la taille des amplicons. Pour vérifier qu’un
seul produit PCR ait été amplifié, on réalise une courbe de fusion en fin de réaction.
A chacune des réactions de PCR en temps réel est ajoutée une référence passive
ROX, c’est un fluorophore qui a une émission constante et donc est utilisé pour
normaliser les fluctuations de fluorescence, compenser la variation entre tous les puits de
réaction et réguler les différences minimes de volume de réaction entre les puits.
Pour quantifier un échantillon par PCR en temps réel, on détermine le nombre de cycles à
partir duquel le produit PCR est détectable. Le moment d’apparition de ce signal seuil
dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle threshold) est dépendant de la quantité d’ADN
initialement présente dans l’échantillon amplifié. Il apparaît toujours au cours de la phase
exponentielle de la PCR.
La valeur du Ct peut être traduite en un résultat quantitatif par comparaison avec
les valeurs de Ct générées par des échantillons de concentrations connues sur une
courbe d’étalonnage exprimant le log de la quantité d’ADN en fonction du Ct observé.
La courbe de fusion permet de vérifier qu'il n'y a qu'un seul produit de PCR
amplifié. Elle est réalisée en soumettant les amplicons à une température progressant de
50°C à 95°C par palier de 0,5°C et en mesurant l'intensité de fluorescence en continu.
Elle correspond à la variation de la fluorescence en fonction de la température. La
température de fusion des amplicons appelée Tm est représentée par un pic unique sur la
dérivée primaire de cette courbe.
- 196 -
Annexes
ANNEXE III : Séquences nucléotidiques des amorces 3C en PCRq
Amorces CFTR
Séquences 5' - 3'
A - Promoteur CFTR
S - CFTR 1
S - CFTR 2
S - CFTR 3
S - CFTR 4
S - CFTR 5
S - CFTR 6
S - CFTR 7
S - CFTR 8
S - CFTR 9
S - CFTR 10
S - CFTR 11
A - CTRL
S - CTRL
CTTAGCGCTTCCTTTGCGTGTC
GCATTACAGAGTGGCTTTACGGC
GTGTAGGCTTTGGTGTCACAATCC
CCCTAGCCTGTCAATTGCCTTG
GGACTCATGAGAGGGAAGTAGG
GGCATTGGGACACACAACACTAC
GAGGAGGTCCCTTAGTAGAAACAC
GGAACCGCATGTGGAAAGCAGG
CCTGCATTCTACTCTGGCCTTG
GATCCAACATTCTCAGGGAGGAG
CACCCACATTCTAGGAGCTCAG
CTCTGACAAACCATCAGGCCAG
GAATGTAGGACATGTGGGAGGTG
CGTGAGAGCATACTTCCTGGTTC
Amorces CNCs
Séquences 5' - 3'
A - Promoteur CFTR
S - TT1
S - TT2
S - TT3
S - TT4
S - TT5
S - MT-A
S - MT-B
S - MT-C
S - MT-D
S - MT-E
S - MT-F
S - MT-G
S - MT-H
S - MT-I
S - MT-J
S - MT-K
S - MT-L
S - MT-M
S - MT-N
S - MT-O
S - MT-P
S - MT-Q
S - MT-R
S - MT-S
S - MT-T
S - MT-U
S - MT-V
S - MT-W
S - MT-X
CTTAGCGCTTCCTTTGCGTGTC
GATCCCCATCTCCTTGCTGATG
GCCAGACAGGTGCCATGATCC
CCCTGATCTCACTGAACCTGGG
CCTACTCTGACACTTTCCCCAAC
GGAGCTGGCAATACTTGTAGGC
GCCTTCTTGTCTATGCTAACCAACC
GTGAATGGAATGGCTGAAGGTGAG
CCCTTGTTGTGTACCTGCTAGTG
GGTTGGCTCTGGATACATCTGG
GGTGTCGTCTTACATCAGAGGC
GGATGATGCATAGACGGGGAAC
GACTGTTAGGAAGGCCATTTAGTGC
CACAGAATACTCAGTTTGACAGGGAG
CTGTGTTTCTGCCCCCTCGTAC
GTGGCCAATGACAATGACAGTTCC
GTCTCCTCATGCTGGAAAGCATG
CCACTTCCTCCCAGTGACAGC
CCACACCACTCTCAGACTATGTTG
GGACTGGGATACACAAACTTGGAG
CAACCTGGCACATTTGAATCGGTG
GAGAGGATGAAACTAGAGCCGAC
GGACAGCAGGAGGAAGATAGGC
CCTGTGGAAGCAAATGAATCAAACTGG
CAGCCCATTGTAGCTTCTCTCTAG
CCTCTTTGCCTTAACCCTTTCTCTTC
GTCACTTCCCACTGCCTTAATTAGC
CCAAGCCTGTAATATTGGTCTGTGC
CCAACACAGGTGGAAAGTAGACC
GCTGCATTCCCTCTCTACCTCC
- 197 -
Annexes
ANNEXE IV : Séquences nucléotidiques des amorces 5C
Amorces 5C Locus CFTR
Séquences 5' - 3'
S-1
S-2
S-3
S-4
S-5
S-6
S-7
S-8
S-9
S - 10
S - 11
S - 12
S - 13
S - 14
S - 15
S - 16
S - 17
S - 18
S - 19
S - 20
S - 21
S - 22
S - 23
S - 24
S - 25
S - 26
S - 27
S - 28
S - 29
S - 30
S - 31
S - 32
S - 33
S - 34
S - 35
S - 36
S - 37
S - 38
S - 39
S - 40
S - 41
S - 42
S - 43
S - 44
S - 45
S - 46
S - 47
S - 48
S - 49
S - 50
TTGACCGTGCTGGACTCGAA
AAGGTAGTGTTCTATATCAATTATTTTGAA
AAAGTTATCTGGCAATGATGTGGATTAGAA
GCCTCAATGGTTCCTCATGATTGAA
CTGCTGGGCCTTTAAGTGAGAA
ATTTTTCTACTCAAGACTATTAAAAATGAA
GCTTGGAAAAGAATTGTGTCCGGAA
TAAGTACTTTCTGTTACTGACACTGAAGAA
AAAATGTCCTGGGAAAAAATCTAAATTGAA
GATTGTAGTCTGTTTCTTGTTTCTCAAGAA
GGTCATGATATTGAGTTGAGTAGCTGAA
GTCTTGTGCATTTTGTGACAAAGGAA
TGATAATATGAACGACCAGATGATTGGGAA
GCCTAAAGGCCGCTTACAGAA
GTGTATTTGCAGACATCTCCCGAA
AGGACACCATGAACACAGAATATAAGTGAA
TCAGGTTATCTATCTAAATAAGATAGGGAA
GCTGCATATATAGAGCAGAATAGGAAGGAA
ACAGTCTATTTAATATACTCAAATGATGAA
CTCCTGTCCCCATCATCAGGAA
TGTTCATGTACTATCTTTCTAAAACTAGAA
CTTCAGCACCAGTTGTACCTGAA
CTGAGTAAGCCTTCTGGTGTGAA
TGTAGGTATGCACCAGGGAAAAGAA
AGGTTCTGCAATTATCATGGAAGAAATGAA
ATGTGGAGGTGGTTTTAGTCATTTTATGAA
AATGCACGCTTGAAGAATGTGGAA
TTTTTAAAGCAACACGTTAATTATTTTGAA
AGCAGTTATTATCTTGATATTATTATAGAA
TCTAATGCTCATATTGTCATTATCCATGAA
TGAGAACAACTTCATTAAATATGATGTGAA
CACTTTGTCACCTAGGTTGTTTCTTGAA
CTTGCTTCAGGCAATTTGTAGAACAGAA
AGGCCATTCATAGAGCTGTGGAA
CTCTCATGCCCTCAGAAGAGGAA
GAAATCAACTGCTCTATTTTCAATACTGAA
GATTTTCCATCAGATGACCTGGATTAGAA
GGAAAAAGTTCAAGGGAGTCTTTGTGAA
CTTTGGTGGTGTTTTCGTGATAGTGAA
GGCAGGAAAGAAGGGACGAA
AATCCCCCGTTCCTTGGGAA
TGTTTATTTGTATCTGAATGGACTAATGAA
ACACAGAAATGTTGGCGGTTGAA
CTCAAGGTCCCCTAAGGGGAA
CCACTGAGAGTATTGTGAAACTGAAGAA
CCTTCGCACTCTCATGAAGGAA
GGAATGAGGGAAAGGGGATGAA
TATTCTTGGGGACGCACTCAGAA
TAGGGGTCAGCTTAGAGAAAAGATAATGAA
ATGGGAATACCGTACCATGCATTAGAA
- 198 -
Annexes
S - 51
S - 52
S - 53
S - 54
S - 55
S - 56
S - 57
S - 58
S - 59
S - 60
S - 61
S - 62
S - 64
S - 65
S - 66
S - 67
S - 68
S - 69
S - 70
S - 71
S - 72
S - 73
S - 74
S - 75
S - 76
S - 77
S - 78
S - 79
S - 80
S - 81
S - 82
S - 83
S - 84
S - 85
S - 86
S - 87
S - 88
S - 89
S - 94
S - 95
S - 96
S - 97
S - 98
S - 99
S - 100
S - 101
S - 102
S - 103
S - 104
S - 105
S - 106
S - 107
S - 108
S - 109
S - 110
GTCCCTGATACAGTAGTCTGGAGAA
GACTTGCCCAAGCTCAGTAATAAGAA
CCTTTAACGTGGACGCATTTTCTGAA
ATATAAGGTGTGGAATTTACATTTGTGGAA
GTAAACATGAAAGAAAGAAATCATTATGAA
CCCGTTATGAATGGCAGTGATGAA
TCTAGGGACTAAGGTGGGAAGAGAA
ACAAGAGAAATAAATTGTCTAGGTGCAGAA
AAGGAGTTCAAAGCACTTTTCAAATATGAA
TCTGCAAAATTTGTACTTTCTGAAATGGAA
TGGAGAAGGATACTGTCAACTTGGAA
TTTCTTAAAAATTAATTGATCAAAACAGAA
GAAGGCTGAGAATACTAAGACCCTGAA
AAGAAATCATAAAAAAAACCCAAAAGGGAA
TAGTCATAAAATTAGATTCTTCCAAAAGAA
GAAAAGTTGGTCAAGGCTATTAACAGAGAA
CAAAATTGCTAAAGATGTTTTCTTGATGAA
ACAACAAATTATTTGAATTAACCATTCGAA
TCCATCCAATCTGTGATCACGGAA
GAATGCCGTAAATATACTTAAACCATTGAA
ATGAAATACATCAAACAACAGATTTAAGAA
GCCACATCTGTCTCTGGGAA
TATATCACTACTTAGGTGTCAACTGCAGAA
GTACCAAAAGAAAGTAATGCTAACCTAGAA
TATAGAATATGTTCCTTCACCATAGTGGAA
CATGATATTGCATCTGACTGTCACAAGAA
ACAAGTTAAAAAATTTAAACTATTACAGAA
TTTTGACTAAGATACAAAGTTTGAAAAGAA
CAGGAGAAAATACTGCCCCAAAGAA
AATTTGGTTTTGTCTGAAGAGATTTGGGAA
TTTGAAAAAGTTCTGTTGGGATCCTGAA
TCTCAACCTTGTCTGCTGCTTAGAA
TGATTAAGGTATTCAAAAAAGTCCAAGGAA
CCTAATCCTTCTCCCCCAGTAAAAGAA
ACTAGCCTACAGGTGGAAAATGAAGAA
TGTTATTGGATAAGTAATTAACAAAAAGAA
AGAAAGGAGTCCCTAAACCTGTGAA
GAAAAAAGATCACTACTTTTCTTTTTAGAA
TACACATACCTTTTCTTTAATGAAAAAGAA
TTGACCCCAATACTGCGATTTTAAATTGAA
GCTTGAGGTAGGCATGGAGAA
CACAGTGATATATGGCAGAGCATTGAA
GCAAATCTTCTAAATGTCTGCCATGTAGAA
TTTACATTTAAATATCTACTCTATTTAGAA
GGCTAGGACAATTACCCAAGGAA
GTAGGTAATGTGCTGGATAAGAATTTGGAA
TTCTATTATTGAAGTGAGCCATTAAGTGAA
GCCGAGGCATCATTTAGGTGAA
GATGGTGTCAATATGGGTTATGAGGAA
GTGCTACCAGTGTGATGGAGTAGAA
ACATATTTAAACTTTGTTTTTCAACTCGAA
CCATGGCTGACAGGAGGAGAA
TAGGATGTAATGGGAAGTTGAGCGAA
GATCTAGCTATGCTGCTGGTATGTAGAA
TATTGTTCTACCTCTAGTTCTAATTTGGAA
- 199 -
Annexes
S - 111
S - 112
S - 113
S - 114
S - 115
S - 116
S - 117
S - 118
S - 119
S - 120
S - 121
S - 122
S - 123
S - 124
S - 125
S - 126
S - 127
S - 128
S - 129
S - 130
S - 131
S - 132
S - 133
S - 134
S - 135
S - 136
S - 137
S - 138
S - 139
S - 140
S - 141
S - 142
S - 143
S - 144
S - 145
A-1
A-2
A-3
ATAAATCTTTGGAAAGTGGGGCAAATGAA
AGACTGCAAATAAATGTGAGCAAGTGAA
TGTGAGCCAAAGTAAGACTTATTCTAAGAA
TATTTGAGGAGAGTCAAATTAATTATCGAA
AATATAGCATGTTATTTCATGCTATCAGAA
CAGAGTTCGGCAACATGCTTGAA
ACTCAAAGCAAATCTGTACTAAATTTTGAA
GGCAGAGAATTTACTTCAGTGAAATTTGAA
CTGATGGAATATTTAAATCCATGCGTTGAA
ATATATATCCCCATCAAGAGAGTACAAGAA
TGCTTTCTGCATAGGAGGTAGAATAATGAA
TAAGAGATATCCAGGTAAATGCTATGGGAA
TTGGGTAAGCCAGGTGCTAAGAA
TGCATAACACAATAACTTGCTTGATAAGAA
GAATGAAATACCTAATTGTATGAAATTGAA
GTTTAGAGACAAACACTCCTGTGTTTGAA
TCATTTACATCCAAAAGATCCGTAGGAGAA
GGAGAATGATTTAAAAAGTAGTTGGAAGAA
TACCTATTTGTTACAGTTAGTTTTTATGAA
CTGTCTTTTAGATATAGCCTCTTTTGAGAA
GAGGGGACATCAAGCGAGAA
TTCTACAACTGCACATACAAACTTCAAGAA
TGTATAATGAAGAATCCTACTCGCTTTGAA
CAGTCGAAGGGAGGTATTATTCATATGGAA
GTGCCTGATGAATTACAGAAGCAAAGAA
AATAGATCATTATCCCTGTGCCTCTTGAA
AATGCATTAAAACAGTTGCTTTTGAGTGAA
CCATTAACAAGTTAAAGATTAATTTTGGAA
CACCAACTTTACTTGGAGGTCTAGAA
GAGAAAGCTGGATCAATTTTTAAACATGAA
ACTCTTGAAAATGTGTCAAAAGGTATAGAA
ATCCTTATATTAAAAGTCCCAGAGAGTGAA
TTTTCTTAGCTCTCTAAGCTTAGAGCAGAA
GAAAAAAGTGGTACACAGGTGTGGAA
ATCCAGCATTTGGAATATAAAAAACTGGAA
TTCTCAGGAACATTGGAATTTCTCATTCC
TTCACCCCTTATTTTGTAATACAGTATATA
TTCAGTCAAGAAATGTTTTCTGAGCACTTA
- 200 -
Annexes
Amorces 5C ERCC3
Séquences 5' - 3'
S-1
S-2
A-1
A-2
A-3
ATGAATATGCCGCACAAAGCAAGAA
ACAGCAAACGGGGCTGAGAA
TTCCATATGGGGCAGTTGTTCC
TTCATGTCTGCTGAAGGAACTTCTC
TTCAGTATGGTACTGCAGCCAGT
Amorces 5C ENr313
Séquences 5' - 3'
S-1
S-2
S-3
S-4
S-5
S-6
S-7
S-8
S-9
S - 10
S - 11
S - 12
S - 13
A - 14
A - 15
A - 16
A - 17
A - 18
A - 19
A - 20
A - 21
A - 22
A - 23
A - 24
A - 25
A - 26
AATATTTATGGGCAATTCCCATAAAGGGAA
ACCACCACAACCTTAATAAAGTGAATAGAA
CAAAGAGCTGAAACAATTGTCTTCCAGAA
GACAGAGTTTGCCTTTTCTGTAGAAGAA
CTTTAGGCTTGTACTAGCAAAATGTAAGAA
GCAGGCCCTGGTGGGGTGAA
ACTCTTCAATGATAAGAATTGATGCCTGAA
ACATACTTCAAATTATACCGACTCTTGGAA
GAGATGTTGATGGCCATATGCTGAA
TCTCAAGTCCTGATTTTGTCATCCTGAA
GAATGTTTAAAGTTTGATGCATTCATAGAA
TTATAAATGACTTCACAAATGACTTTAGAA
GATGTCACTCAGTAAGCTTGAGTTTGAA
TTCTAAATAGCTGAGGTTATAGTGACCATA
TTCCTACTATTTGTCAGATTGCTAGGTAAT
TTCTAGTTCAGGAGAATAAAAGTTATATCA
TTCACATCCATTCACATGATGTTTCTAAAT
TTCAGGTAATCAAAAACATCAGTAATGTTT
TTCTGTACCATATTCAGCTAGAAATTTTCT
TTCTGAGGAATAGAGAGCTAAGAAACTCAC
TTCTCAAAGTGGTTTTCTATTGGATTATAT
TTCTATCTTCCTTAAGAAAAAATTCTGTCT
TTCCCTTCATTCAATGGAATAATTGCAGAG
TTCAGTATAAATCCCTCAGTGCATTTATCA
TTCTATGCTATTAACTAAATTATTGAGTTT
TTCTAGTGATAGATTACAGCTGAGACAAGA
- 201 -
Annexes
ANNEXE V : Coordonnées génomiques des régions d’interaction
Région
Coordonnées fragments de restriction (hg19)
A
B
C
D
D
1
F
2
G
3
H
chr7:116656508-116660156
chr7:116724586-116735369
chr7:116849790-116853040
chr7:116911841-116937700
chr7:116986510-116989774
chr7:117042360-117044649
chr7:117068088-117075709
chr7:117210917-117231814
chr7:117275043-117280987
chr7:117318337-117324400
chr7:117358546-117361237
- 202 -
Annexes
ANNEXE VI : Livret joint au kit de prélèvement de cellules HNEC
- 203 -
Annexes
- 204 -
Annexes
- 205 -
Annexes
- 206 -
CURRICULUM VITAE
&
TRAVAUX
- 207 -
CV et Travaux
Stéphanie MOISAN
Née le 24 avril 1987 à Saint-Nazaire (44)
Adresse professionnelle :
Inserm UMR 1078
46 Rue Félix Le Dantec
29 218 Brest Cedex 2
Tél : 02.29.02.00.80
Adresse personnelle :
6 Rue Capitaine Ferdinand Ferber
29200 Brest
Tél : 06.65.10.73.81
Courriel : [email protected]
FORMATION
2010-2014
Doctorat en Biologie Santé (Bourse INSERM/Région) - ED SICMA
Université Bretagne Occidentale - Faculté de Médecine de Brest
2009-2010
Master 2 Recherche en Biologie Santé
Parcours Génétique, Génomique & Biotechnologies
Université Bretagne Occidentale - Faculté de Médecine de Brest
2008-2009
Master 1 en Biologie Santé parcours Sciences Biologiques
Université des Sciences et Techniques de Nantes
2005-2008
Licence de Biochimie / Biologie Moléculaire
Université des Sciences et Techniques de Nantes
2004-2005
Baccalauréat Scientifique option SVT
Lycée Notre Dame d’Espérance à Saint-Nazaire
ACTIVITÉ DE RECHERCHE
Depuis Oct. 2010
Doctorante - Inserm U1078 Génétique, Génomique Fonctionnelle
et Biotechnologies de Brest - Directeur de thèse: Pr. Claude Férec
- Etude des mécanismes de régulation à distance du gène CFTR
Août à Oct. 2010
Ingénieur Hospitalier - Inserm U613 de Génétique Moléculaire de
Brest
Janv. à Juin 2010
Stage de M2 - Inserm U613 de Génétique Moléculaire de Brest
- Régulation du gène CFTR et Technique 3C
Avril à Juin 2009
Stage de M1 - Laboratoire Génétique Nantes Atlantique (LGNA)
- Production de variant pour des études de Pharmacogénétique
Juin 2008
Stage volontaire - Inserm U649 de Thérapie Génique du CHU de
Nantes
- Production de vecteurs viraux à usage clinique
- 208 -
CV et Travaux
OUTILS ET COMPÉTENCES
Biologie cellulaire : Culture cellulaire, culture primaire
Biologie moléculaire : Extraction, purification et dosage d’ADN et d’ARN, PCR, PCR en
temps réel (PCRq), QFM-PCR, mutagénèse dirigée, discrimination allélique, séquençage,
séquençage nouvelle génération
Biochimie : Extraction et dosage protéique, Western blot, dot blot
Bactériologie : Amplification et extraction de vecteurs plasmidiques
Immunofluorescence : Immunocytochimie
Langues : Anglais (lu, parlé et écrit), Espagnol (notions), Allemand (notions)
Informatique : Maîtrise des logiciels courants de bureautique (word, excel, powerpoint),
Utilisation de logiciels de bioinformatique (Galaxy, UCSC, my5C)
ENCADREMENT ET ENSEIGNEMENT
Novembre 2013 : 2 heures de cours magistraux de Génétique - Niveau Master 2
Janvier à Septembre 2014 : Encadrement d’un étudiant en stage obligatoire de Master 2
sur l’étude de la régulation à distance des gènes PKD1 et PKD2 impliqués dans la
polykystose autosomique dominante.
COMMUNICATIONS ORALES
- Au ”11th ECFS Basic Science Conference ”
St Julians (Malte) du 26 au 30 Mars 2014
- Au ”8th European CF Young Investigator Meeting ”
Paris du 19 au 21 Février 2014
- À la journée des doctorants de l'ED SICMA
Télécom Bretagne - Plouzané - 26 Septembre 2013
- À la journée des doctorants et post-doctorants du secteur Biologie-Santé de
Bretagne - Faculté de Médecine - Brest - 21 Juin 2013
- À la journée scientifique de l’UMR1078 - EFS - Brest - 18 Février 2013
Bretagne - Campus de Beaulieu - Rennes - 27 Juin 2012
- 209 -
CV et Travaux
PRÉSENTATIONS AFFICHÉES
- Au ”64th American Society of Human Genetics Annual Meeting ”
San Diego (Californie - USA) du 18 au 22 Octobre 2014
- Au ”11th ECFS Basic Science Conference ”
St Julians (Malte) du 26 au 30 Mars 2014
- Au ”8th European CF Young Investigator Meeting ”
Paris du 19 au 21 Février 2014
- Aux 7èmes Assises de Génétique Humaine et Médicale
Bordeaux du 29 au 31 Janvier 2014
- À la 16ème Journée Jeunes Chercheurs de la Faculté de Médecine et du CHRU de
Brest - Faculté de Médecine – Brest - 29 Novembre 2013
- Au ”European Society of Human Genetics”
Paris du 8 au 11 Juin 2013
- Au 13ème Colloque des Jeunes Chercheurs en mucoviscidose
Paris - 24 Avril 2012
- Au ”10th ECFS Basic Science Conference”
Malaga (Espagne) du 20 au 24 Mars 2013
- Au ”9th ECFS Basic Science Conference”
Sainte-Maxime du 28 Mars au 1er Avril 2012
Bretagne - Faculté de Médecine - Brest - 20 Juin 2011
MOBILITÉS INTERNATIONALES
- Séjour de 1 mois à Chicago (USA) dans le laboratoire du Pr Ann Harris au Lurie
Children's Hospital of Chicago Research Center - Northwestern University Feinberg
School of Medicine - Bourse de mobilité UBO
- Séjour de 3 mois à Montréal (Canada) dans le laboratoire du Dr Josée Dostie à
l’université McGill - Bourse de mobilité ED SICMA
- 210 -
Etude des mécanismes de régulation à distance du gène CFTR
Le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) a été identifié
en 1989. Vingt cinq ans après, les mécanismes contrôlant sa fine expression, sont encore mal
compris. Bien qu’environ 1980 mutations aient été découvertes, il reste des patients pour qui le
génotype n’a pas été établi. Les éléments de régulation, décrits au sein du promoteur, ne
peuvent à eux seuls expliquer cette complexe régulation tissu spécifique. Des éléments de
régulation à distance, en cis ou en trans, sont certainement impliqués dans ce contrôle
d’expression. L’objectif de ce projet est de mieux décrypter les mécanismes de régulation à
distance du gène CFTR en identifiant des séquences régulatrices éloignées, mais pouvant, par
des mécanismes de repliement, interagir spécifiquement avec celui-ci. Afin d’étudier ces
contacts chromosomiques, nous avons, dans un premier temps, mis au point la technique de
Capture de Conformation Chromosomique (3C). Suite à cette technique, nous sommes passés
à une approche à plus grande échelle, la technique de Copie Conforme de 3C (5C), qui permet
de mesurer des milliers d’interactions chromatiniennes en une analyse. L’organisation spatiale
d’une région d’environ 790 kb, recouvrant le gène CFTR, a été analysée dans des cultures
primaires de cellules épithéliales nasales, exprimant le gène CFTR et des fibroblastes de peau,
ne l’exprimant pas ou très peu. Les interactions entre les régions de ce locus et le promoteur
CFTR ont été étudiées par séquençage nouvelle génération sur Ion PGM™. Nous avons
comparé ces conformations chromatiniennes afin d’identifier des éléments de régulation
spécifiques d’une expression de CFTR. Notre approche a été validée par l’identification de
régions régulatrices précédemment décrites. De plus, nous avons mis en évidence de
nouveaux contacts chromatiniens avec le promoteur CFTR. Ces régions semblent fortement
impliquées dans la régulation de l’expression du gène CFTR. Grâce à la technique 3C et ses
variantes, l’identification de nouvelles mutations à distance du gène pourraient expliquer des
dérégulations de son expression.
Mots clés : CFTR, régulation transcriptionnelle, chromatine, techniques 3C / 5C
Analysis of long-range regulatory mechanisms of the CFTR gene
The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene was identified in
1989. Twenty five years later, the regulatory mechanisms controlling its complex expression are
still not fully understood. Although, almost 1980 mutations have been identified, many cases of
cystic fibrosis or CFTR Related Disorders remain still of unknown origin. The promoter which
binds transcription factors and drives some aspects of CFTR gene expression, cannot alone
account for tissue specific control. This implicates other distal cis- or trans-acting elements in
cell-type-specific regulation of CFTR expression. The aim of our project is to study long-range
regulatory elements of the CFTR gene, which could interact specifically with the CFTR promoter
by tri-dimensional folding mechanism. We first developed the Chromosome Conformation
Captures (3C) approach to map these chromosomal contacts. Subsequently, we enhanced our
analyses with a high-throughput adaptation of 3C: the 3C-Carbon Copy (5C) technology. This
approach allows the analysis of millions chromatin interactions. Thus, we have analyzed the
spatial organization of a 㹼790kb region, comprising the CFTR gene, in primary nasal epithelial
cells, which express the gene, and primary skin fibroblasts, which do not express the gene.
Interactions between this locus and the CFTR promoter have been analysed by next generation
sequencing with the Ion PGM™. We have compared chromatin conformation in order to identify
uncharacterized regulatory elements that act especially in CFTR-expressing cells. Our
approach has been validated by the identification of previously characterized regulatory
elements. Moreover, we identify novel chromatin contacts of the CFTR promoter with
chromosomal regions, which could potentially be involved in CFTR gene expression regulation.
Thanks to 3C and 3C-derivated analyses, we could identify new possible mutations far from the
gene, which may lead to its dysfunction by modifying the chromatin conformation or regulatory
elements.
Keywords : CFTR, transcriptional regulation, chromatin, 3C / 5C methods

These-2014-SICMA-Biologie_sant... - HAL

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