MODE OPERATOIRE Réhydratation et démasquage coupes

Version : 2
Date d'application :
08/04/2011
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Référence du document : MO_IMAG_07
CNRS-UPR 9021
MODE OPERATOIRE
Réhydratation et démasquage coupes à paraffine
1.
OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
Ce mode opératoire décrit les différentes étapes de réhydratation et de démasquages
antigéniques des coupes incluent en paraffine pour immunomarquage en microscopie
optique.
2.
MATERIEL / EQUIPEMENT
Appareil
Etuve à 37°C
Marque
N° d’inventaire
MEMMERT
ICT-BIOXX006
FAR
ICT-BIOXX014
Micro-onde
3.
Pièce
Laboratoire
137
Laboratoire
137
REACTIFS ET CONSOMMABLES
3.1.
Liste des réactifs et consommables
Dénomination
Acide citrique
Citrate de sodium
(tri-sodium citrate)
Tris-Base
EDTA108
Glycine
HCl (1N)
Tween-20
Lieu de stockage
Laboratoire 138
(labo poudres
chimiques)
Laboratoire 138
(labo poudres
chimiques)
Laboratoire 138
(labo poudres
chimiques)
Laboratoire 137
armoire µscopie
Laboratoire 138
(labo poudres
chimiques)
Laboratoire 138
(labo poudres
chimiques)
Laboratoire 137
armoire µscopie
Fournisseur
Réf.
Fournisseur
Caractéristique
SIGMA
C2404
C6H8O7, H2O
SIGMA
C3434
C6H5O7Na3, 2H2O
SIGMA
T1503
PM = 121,1 g/mol
SIGMA
E5134
PM = 372.24 g/mol
SIGMA
G7403
PM = 75,07g/mol
Préparation interne
SIGMA
P1379
SIGNATAIRES
Rédacteur
Date et Signature
Vérificateur
Date et Signature
Approbateur
Date et Signature
Application par
Service Qualité
Support :
Date :
Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09
Version : 2
Date d'application :
XX/XX/XX
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Référence de la procédure : PT_
Référence du document : MO_IMAG_07
CNRS-UPR 9021
Laboratoire 137
Réfrigérateur
µscopie
NaOH (10N ou 4N)
Cuve avec couvercle
pour boite à coloration en
verre
Anse pour panier boite de
coloration
Laboratoire 137
Tiroirs µscopie
Laboratoire 137
Paillasse µscopie
Laboratoire 137
Panier boite de coloration Tiroirs µscopie
3.2.
Préparation interne
Dutscher
068506
Dutscher
068508
Dutscher
068507
Préparation des réactifs
 Tampon citrate 10 mM, pH 6.0
Solution A : acide citrique (C6H8O7, H2O) 0,1 M 2,1 g/100 ml H2O
Solution B : citrate de sodium (C6H5O7Na3, 2H2O) 0,1 M 2,94 g/100 ml H2O
Mélanger 9 ml de solution A et 41 ml de solution B
Compléter à 500 ml avec H2O milliQ
 Tampon Tris 100 mM, pH 10
Tris-Base 12 g
H2O milliQ ~ 800 ml
Ajuster le pH à 10 avec de l'HCl
H2O milliQ q.s.p. : 1 litre
 EDTA 10 mM, pH 8.0
EDTA108 3.72 g
H2O milliQ ~ 800 ml
pH ajusté à 8.0 avec de la soude
H2O milliQ q.s.p. 1 litre
Tampon glycine-HCl 0,05M, pH 3,6
Glycine 3,8 g
H2O milliQ ~ 800 ml
Ajuster le pH avec de l'HCl
H2O milliQ q.s.p. 1 litre
 Tampon citrate- tween20 (10mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)
Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g
H2O milliQ 1000 ml
Ajuster le pH à 6.0 avec 1N HCl
Ajouter 0.5 ml de Tween 20 et bien mélanger.
Stocker à température ambiante
4.
MODE OPERATOIRE
- Avant immunomarquage : placer les lames 2h à O/N à l’étuve 37°C pour une meilleure
adhésion des coupes sur les lames
- Déparaffinage (ou suppression de la résine) et hydratation des coupes
Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09
Référence de la procédure : PT_
CNRS-UPR 9021
Référence du document : MO_IMAG_07
Version : 2
Date d'application :
XX/XX/XX
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 10 min toluène.
 2 min éthanol absolu.
 1 min éthanol 95°.
 5 min H2O milliQ.
- Les coupes sont traitées au four à micro-ondes (mettre le panier dans un récipient résistant
au micro-onde, les cuves de coloration Hellendal ne résistent pas) :
 Placer les lames dans récipient thermorésistante(porcelaine, plastique, Pyrex) pour
four à micro-ondes, contenant du tampon souhaité (bien recouvrir les lames en cas
d’évaporation).
 Chauffer par les micro-ondes à 750 W pendant 5min, laisser 5min puis remettre en
marche 15min (attention à ce que les coupes ne sèchent pas).
 Laisser les lames refroidir dans la cuve hors du micro-ondes pendant 20 min à
température ambiante.
 Rincer ensuite les lames dans du TBS. Les coupes sont prêtes pour
l'immunoréaction.
Remarques :
 Le four à micro-ondes est le système de chauffage le plus couramment utilisé. Il peu être
remplacé par un bain-marie bouillant, ce qui évite d'avoir à contrôler l'ébullition, ou mieux
une cocotte-minute qui permet d'atteindre une température plus élevée (120°C) en principe
plus efficace.
5.
NETTOYAGE ET TRAITEMENT DES DECHETS
 Evacuer les solvants dans des containers en plastique qui sont évacués selon les
procédures de l’UdS.
6.
SECURITE
 Le toluène est à manipuler sous la hotte
Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09