(Microsoft PowerPoint - pr\351sentation LabCLuster CC initiation)

Culture cellulaire - session initiation
Solutions aux problèmes les plus fréquents
Bénédicte Gagny, SIGMA- ALDRICH
Sylvie Bailly, CORNING AXYGEN
Le Groupe Sigma-Aldrich
• Fournisseur majeur dans le domaine de la recherche
en sciences de la vie
• 1 000 000 de clients à travers le monde
• 7 900 employés
• Un réseau de 10 000
fournisseurs
Sigma-Aldrich France
• Plus de 200 collaborateurs
• Près de 100 M€ de chiffre d’affaires (15% du chiffre
européen du groupe)
• 2 plates-formes logistiques , dont une classée
Seveso2, sécurisée et certifiée ISO 9001
• 140 000 références en stock
• 3000 commandes par semaine
• 490 000 expéditions par an
Les marques Sigma-Aldrich
• Sigma – Génomique fonctionnelle, Protéomique, Biologie
moléculaire, culture cellulaire
• Aldrich – Synthèse chimique, Sciences des matériaux, Drug
Discovery, Isotopes Stables
• Fluka – Réactifs d’analyse & Standards
• Supelco – Chromatographie & Produits de séparation
• SAFC – Matières premières, phases de Développement ,
solutions d’approvisionnement et produits à façon
La culture cellulaire chez Sigma: un
partenariat pour l’excellence
Comment savoir si vos cellules ont un
problème?
Mort cellulaire
Changements imprévus dans la
culture
– Taux de croissance
– Comportement
– Morphologie/apparence
Des résultats expérimentaux
inexpliqués
Détecter ces
changements dès
qu’ils se produisent :
étape critique pour
identifier l’origine du
problème
Déroulement de la présentation
3 parties:
1) Répertorier les problèmes courants (et les moins
courants) rencontrés, ainsi que leurs causes
2) Comment éviter/limiter ces problèmes?
3) Quelques conseils pour aider vos cellules à se
“sentir bien”!
Quelles sont les origines des problèmes
rencontrés en culture cellulaire?
Les contaminations
biologiques
Le contenant
le milieu et le
sérum
L’ incubateur
Bien souvent, ces problèmes sont liés à la manipulation
Les contaminations biologiques
• Bactéries, champignons, levures, mais surtout…
Les mycoplasmes !
Les problèmes liés aux contenants
(flasques, boites de Petri, plaques…)
Problèmes liés à l’entretien :
• restes de produits chimiques (détergents, décontaminants,
aluminium ou papier…)
•Résidus provenant du précédent contenu
Problèmes liés aux cellules:
• Cellules qui adhèrent mal (HEK-293)
• Cellules « difficiles » à cultiver
Problèmes liées à la technique du manipulateur
ou à son manque d’expérience
A quoi sont dues ces taches claires circulaires?
Des bulles d’air dans le milieu!
Pendant l’inoculation les bulles prennent la place du milieu et
empêchent les cellules de se fixer au fond de la flasque
Voici ce qu’on observe après fixation et coloration des cellules:
Les problèmes liés au milieu et au sérum
Influence du milieu ou du sérum sur la cellule
– Sous-produits toxiques générés par l’exposition à la
lumière ou à la chaleur
(bain-marie à 37 degrés )
– Variabilité nutritionnelle du sérum en fonction
des lots
Les problèmes liés au milieu et au sérum
(suite)
• Erreurs lors du choix ou de la fabrication du milieu
– Mauvaise formulation (DMEM ou EMEM?)
– Ingrédients oubliés (Glutamine)
– Choix du mauvais système tampon
Trypsination, congélation: 2 étapes critiques
Le mélange trypsine-EDTA :
Trypsine : enzyme protéolytique
Coupe les liaisons entre les cellules mais ne les détache
pas du support : rôle de l’EDTA
Problèmes rencontrés:
• Destruction des cellules : exposition trop longue à la
trypsine
• Mauvais détachement des cellules : trypsine dégradée
(mise au bain-marie à 37 degrés : auto protéolyse)
Trypsination, congélation: 2 étapes critiques
(suite)
Congélation/décongélation avec le DMSO :
• Agent de congélation le plus utilisé (référence SIGMA
D0619)
• Toxique pour les cellules à une température
supérieure à 4 degrés : réaction exothermique en
contact avec le milieu
Problème rencontré:
Viabilité des cellules à la décongélation : procédure de
congélation non respectée
Les problèmes liés aux incubateurs
Origine des problèmes rencontrés:
1. Contamination des incubateurs
2. Ouverture et fermeture des portes: variation du taux
de CO2 , de la température, du taux d’humidité
Les problèmes liés aux incubateurs
(suite)
• Deshydratation des cellules
en l’absence d’eau dans le
bac de l’incubateur
• Vibrations
certains problèmes sont liés à des accidents
ou des catastrophes indépendants de la
culture ….et de votre volonté!
Problèmes « classiques »
• Panne de congélateur, en particulier du congélateur
de cellules à azote …
• surchauffe ou panne de l’incubateur
Problèmes moins classique…
• Inondation, feu
• Panne générale d’électricité
comment éviter/limiter ces problèmes?
Rappel:
Les contaminations
Biologiques
Le contenant
le milieu et le
sérum
L’ incubateur
Comment éviter /limiter les
contaminations biologiques?
• Principales sources de contaminations biologiques:
l’expérimentation et les cellules
Utiliser de bonnes pratiques d’asepsie:
•
•
•
Lavage des mains
Port d’une blouse, de gants (voire
charlotte/masque)
Travailler sous hotte à flux laminaire
(PSM)
Comment éviter /limiter les
contaminations biologiques? (suite)
• Décontaminer à l’alcool la paillasse et tout le matériel
qui entre dans le PSM
• Travailler séquentiellement
• Décontaminer à nouveau la paillasse après utilisation
• Utilisation possible des UV
Concernant les cellules:
• Mettre les nouvelles cellules en observation/quarantaine
(quand c’est possible)
• Acheter régulièrement de nouvelles lignées certifiées
(ECACC)
Comment éviter /limiter les
problèmes liés aux contenants?
Problèmes liés aux contaminations des contenants:
limités car utilisation de contenants jetables
Problèmes liés aux cellules:
• Adhésion: surface Corning CellBind/ULA
• Cellules souches, ostéoblastes: surfaces dédiées Corning
• Difficulté de croissance: penser à tester différentes
surfaces
Comment éviter /limiter les problèmes
liés au milieu et sérum?
• Favoriser les milieux sous forme liquide, prêts à l’emploi
• Ne pas les mettre à 37 degrés avant utilisation
(laisser à température ambiante)
• Ne pas laisser les milieux à la lumière
• Sérum: tester des lots différents et choisir celui qui
convient le mieux à vos cellules (test gratuits chez SIGMA,
réservation et conservation dans nos entrepôts)
Choisir le bon système tampon
Propriétés d’un système tampon:
1. Maintenir invariablement un pH donné dans le milieu
2. Pas d’interférences avec des activités chimiques ou
biochimiques se produisant dans le milieu
3. Pas de modifications des mesures ou des observations
faites dans le système
Choisir le bon système tampon (suite)
Le système Bicarbonate de Sodium/ Dioxyde de Carbone:
NaHCO3 + H20
Na+ + HCO3- + H2O
Na+ + H2CO3 + OHNa+ + OH- + H2O + CO2 : alcalinité augmentée
Avantages:
• Maintien du pH
• Maintien de la pression osmotique
• Apport d’énergie
Inconvénients:
• pKa de 6,3 à 37 degrés : effet tampon non optimal dans
les gammes de pH de 7 à 7,5
• Nécessité d’un mélange de 5 à 10% de CO2 dans 90 à
95% d’air
Choisir le bon système tampon (suite)
• Le tampon HEPES:
• Avantages :
• pKa de 7.31 à 37 degrés: optimal pour la culture
cellulaire
• s’équilibre à l’air
• Inconvénient :
• Plus onéreux
Liste des milieux Sigma-Aldrich et leur composition:
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learningcenter/media-formulations.html
Trypsination et congélation
•
Surveillez les cellules pendant la trypsination,
surtout si c’est une nouvelle lignée
• Autres agents de dissociation:
*Cell Lysis Reagent: Ref: C2978
*CelLytic MT Cell Lysis Reagent, C3228 testé avec
succès sur la croissance 3D de cellules de peau
*TrypsZean Solution: Recombinant, animal-Free bovine
Trypsin – T3449
*Non-enzymatic Cell Dissociation Solutions: C1419 –
C1544 – C5789 – C5914 (études immunochimiques:
reconnaissance des protéines de surface )
Trypsination et congélation(suite)
Congélation avec DMSO:
• Procéder rapidement pour l’aliquotage des cellules
dans le milieu avec DMSO
• Ne pas faire plus de 10 ampoules à la suite
• Mettre les tubes dans la boite de congélation
préalablement refroidie
• Une fois la boite pleine, la mettre à – 80 degrés;
transférer les ampoules dans le contenant à – 196
degrés pour la congélation longue durée
Autres produits de congélation que le DMSO
(glycérol…)
comment éviter /limiter les problèmes
liés à l’incubateur?
• Bien choisir son incubateur:
Gaine à eau:
Bonne inertie
Lourd
Gaine à air:
Auto-stérilisation possible
Perte rapide de chaleur
• Bien installer son incubateur pour éviter les vibrations
• Bien l’entretenir, régulièrement
Suggestions pour résoudre vos
éventuels problèmes de culture cellulaire
Jouez les détectives!
• Rassembler toutes les personnes impliquées
• Identifier et décrire clairement le problème
• Identifier et évaluer toutes les causes possibles
pour trouver la cause la plus probable
(changements effectués récement?)
• Faire des tests de confirmation
• Donner des consignes écrites pour le moyen et le
long terme
Conseils pour que vos cellules se sentent
bien dans leur environnement artificiel
Qu’est ce qu’une cellule en culture?
Une survivante à un évènement catastrophique
dans un environnement complètement étranger !!
• Sa priorité: survivre!
• Différenciation et perte des fonctions tissus-spécifiques
sont courants
• Transformation et polyploïdie sont également fréquents
• Les cellules génétiquement modifiées ou transfectées
sont particulièrement stressées
Les cellules en culture sont elles de
bons modèles?
In vivo
• Croissance en 3-D sur
substrat naturel
In vitro
• Croissance en 2-D sur du
plastique
• Environnement très stable • Environnement instable et
non naturel
• Déchets et disponibilité des
nutriments extrêmement • Présence des déchets
contrôlés
dans la culture
• Maintien des fonctions
cellulaires: le plus
important
• Croissance cellulaire :
souvent le plus important
• Etudes in vitro : outil incontournable MAIS nécessité de
validation in vivo (fonction de l’application/de l’étude en
cours)
• Grâce à la recherche menée par les fournisseurs:
création de surfaces et matrices qui permettent
d’approcher les conditions du vivant
Shéma de la surface
Synthemax Corning
Les matrices 3D Sigma
HydroMatrix
MaxGel
HyStem
Composition
Peptide Hydrogel (Synthetic)
Extracellular Matrix, Biological Extract
Hyaluronic Acid Hydrogel
(Synthetic)
Similar to
BD PuraMatrix
BD Matrigel
Unique
Customizable?
Yes, limited
No
Yes, many parameters can be
customized
Consistency
Very consistent
Very Inconsistent
Very consistent
Why do
customers like it?
They have complete control over
the 3D environment; they can
control the flexibility of the
hydrogel themselves
Cells grow very well in it. It is a rich,
complex biological matrix filled with
everything cells need to grow. Unlike
Matrigel, Maxgel comes from human
fibroblasts (not mouse tumors) so the
level of growth factors is more natural.
It is also more consistent than Matrigel
Combines the advantages of a
synthetic matrix with the rich,
complex 3D environment of a
biological extract. Mostly,
customers like that they can
control and customize it.
Because it is Hyaluron-based,
many Haaluron-loving cells
proliferate well in it.
Why do
customers dislike
it?
Because it is only a peptide
scaffold, if requires significant
optimization and addition of
growth factors. It is rather
artificial and may not lead to cell
growth as found in life.
Because it is a biological extract, it is
difficult to identify and control all of
the components in each lot of
material. Lots are inconsistent, and
researchers do not know what they
have exposed cells to.
Takes ~1 hour to create the gel
and seed the cells. Customers
wish the time was shorter.
Comment rendre les cellules
heureuses en culture cellulaire ?
“Optimiser” les
techniques de
culture
travailler avec de
“bonnes “cellules
“Optimiser” leur
environnement
Qu’est-ce que de « bonnes » cellules?
• Sans mycoplasmes ni autres contaminants
• Maintien de leurs caractéristiques et de leurs
fonctions
• Origine des cellules réputée et reconnue
• Arrivent avec un historique et des instructions de
cultures claires et précises
Comment optimiser l’environnement de
vos cellules?
Optimisez les basiques:
• Milieu
• Sérum
• Gaz
• pH
• Température
• Surface
Optimisation du milieu
• Regarder dans la littérature le milieu préconisé pour vos cellules
General
Human &
monkey
Rat & rabbit
Mouse
Chicken
Fish
F12K, M199, MEM, DMEM
M199, CMRL 1969, MCB 104 & 105,
RPMI 1640 (lymphoblast), BME, 5a
F12K, MCDB 104, MEM, 5a
MCDB 202 & 401, DMEM
F12K, M199, MCDB 202, DMEM
CO2 independent medium
« Optimisation » du sérum
• Problèmes liés au sérum:
Pas physiologique
Toxicité, agents pathogènes éventuels
•
Pensez aux alternatives
– Milieux sans sérum ou fonctionnant avec moins de
sérum (MegaCell)
– Sérum de cheval; sérum de veau
• Testez votre sérum avant de l’acheter
Optimisation du sérum grâce aux tests
Clone 9 (rat liver) serum test
% CE
50
45
Lot A
40
35
30
25
Lot B
20
15
10
Lot C
5
0
0
5
10
15
20
25
% FBS
30
35
40
45
50
« Optimisation » du gaz
• Le CO2 peut être un nutriment à basse concentration
• Il aide au contrôle du pH à plus haute concentration
• Cependant: trop de CO2 peut être inhibiteur
• L’O2 peut être soit essentiel à la respiration, soit
toxique en fonction de sa concentration
Optimisation du pH
• Pensez à la question du pH, surtout quand vous
démarrez des nouvelles cultures
• pH entre 6.8 et 7.8 : gamme pour à la majorité des
cellules
• Contrôlez en utilisant les tampons et la quantité
de CO2 appropriés
• Faire correspondre le niveau de bicarbonate avec le
niveau de CO2:
- Haut niveau de bicarbonate (1.5g/L) : utiliser entre 5 et 10% de CO2
- Bas niveau de bicarbonate (0.35g/L) : utiliser des unités scellées
sans ajout de CO2
• Utiliser le tampon HEPES (5 à 10 mM) pour
supplémenter le bicarbonate
Optimisation de la température
• De petites différences qui ont
parfois de gros effets
• Trop bas est mieux que trop
élevé
• Température du tissu d’ou
vient la cellule?
• Attention à la position dans
l’incubateur et à l’empilement
des flasques
Optimisation de la surface
Plusieurs choix:
1. Surfaces en plastique –
Polystyrene (nonbiologique)
2. “Coatings” biologiques et
“Feeder layers”
3. “Coatings” non-biologiques
(poly-lysine)
4. Transwell® Corning
Comment optimiser mes techniques ?
Optimiser la récolte des cellules:
• Prendre des cellules en pleine croissance, à 80 –
90% confluentes
• Récolte : douce mais la plus rapide possible
• Compter les cellules (quantité et viabilité)
• Inoculer à haute densité pour commencer
Comment optimiser mes techniques ?
(suite)
Optimiser l’inoculation:
• Augmente le rendement, diminue le
stress
• Permet de savoir quand il faudra
passer les cellules
• Dépend des lignées, de la densité, du
milieu et du volume
• Utilisation de milieux conditionnés
Conclusion: comment savoir si votre
lignée cellulaire est heureuse?
• Morphologie
• Taux de croissance
• Efficacité de clonage
• Expression de fonctions spécifiques
• Production de produits cellulaires
Toujours se poser la question: est ce que mes
cellules se comportent de la façon attendue?
Pour en savoir plus…
Le nouveau manuel de Culture cellulaire SIGMA
• Formulation des milieux classiques
• Nos différents séra
• La gamme la plus complète en matière d’additifs
pour la culture cellulaire
• Les cellules de la banque ECACC
• Les produits Corning
Le site internet de Sigma-Aldrich
• Le « Handbook » édités en collaboration entre
l’ECACC et SIGMA:
• Les « technical bulletin » de Corning
Corning Guide for Identifying and
Correcting Common Cell Growth
Problems
Questions?