SURVIE D`ESCHERICHIA COLI DANS DES CONDITIONS ACIDES

41
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2006, 145, 41-52
SURVIE D’ESCHERICHIA COLI DANS DES
CONDITIONS ACIDES (*)
Saï d OULKHEIR ( 1 ) , Khadija OUNINE ( 1 ) ,
Nou r Eddine ELH ALOUI ( 1 ) , Ben aïssa ATTARASSI
(1)
L’effet du stress acide sur la survie de deux souches
d’Escherichia coli (EC1 et EC2) en Bouillon Trypcase Soja acidifié
à pH 2,5, 4,5 ou 6 a été étudié.
Aux pH 4,5 et 6, la densité bactérienne subit une réduction
décimale de 2 à 3 unités pendant dix jours de survie. À pH 2,5, le
taux de survie diminue de façon plus sensible pour la souche EC2
(5 unités log10) que pour la souche EC1 (4 unités log10). Les cellules
prélevées en phase stationnaire possèdent un pouvoir adaptatif
plus élevé à pH 2,5 que celles récoltées en phase exponentielle.
Les cellules précultivées en milieu neutre présentent une
forte létalité après transfert dans un milieu à pH 2,5. En revanche,
les cellules préalablement incubées à pH 4,8 en absence de
chloramphénicol deviennent dix fois plus tolérantes au choc acide.
INTRODUCTION
Les infections bactériennes d’origine alimentaire constituent un
problème majeur pour la santé publique et représentent un coût social et
(*)
(1)
Manuscrit reçu le 27 février 2006.
Laboratoire de Biologie et Santé, Équipe de Microbiologie appliquée,
Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université Ibn Tofaïl, BP 133,
14000 Kénitra, Maroc.
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économique élevé [24]. Celles dues à Escherichia coli peuvent se manifester
sous forme d’une diarrhée banale non sanglante, mais peuvent évoluer vers
un syndrome hémolytique et urémique lorsqu’il s’agit de la souche
O157:H7. De nombreuses épidémies consécutives à la consommation
d’aliments contaminés par des EHEC (E s c h e r i c h i a c o l i
entérohémorragiques O157:H7) ont été rapportées à travers le monde
[14,17,20].
La capacité de survie des souches d’E. coli dans les denrées
alimentaires constitue une circonstance favorable à l’explosion des cas
d’infections humaines liées aux EHEC. Plusieurs études ont rapporté qu’E.
coli peut survivre dans les produits carnés fermentés [1,12,26], les produits
laitiers fermentés [11,23 ], le jus de pomme [34 ], la mayonnaise [35 ], les
sauces pour salades [27] et le vinaigre [30].
Plusieurs travaux reportent que la survie d’E. coli dans les aliments
conservés à pH acide est améliorée après adaptation aux conditions acides :
Leyer et al. [21] ont montré que les souches d'E. coli adaptées à l’acidité
survivent mieux pendant la fermentation des saucisses ; Tsai et Ingham [29]
ont signalé que l’adaptation à l’acidité améliore la survie d’E. coli dans le
‘ketchup’.
La présente étude a pour objectif d’examiner l’effet de l’âge de
l’inoculum et de l’adaptation acide sur la survie de deux souches d’E. coli.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Souches
Deux souches d’Escherichia coli EC1 et EC2 ont été isolées
respectivement des rejets d’abattoirs et des eaux usées domestiques de la
ville de Kénitra (Maroc). Elles ont été identifiées et caractérisées selon le
Bergy’s Manuel of Systematic Bacteriology [5]. Les souches ont été
conservées dans le bouillon glycérol à 50 % à -20°C à l’obscurité. Deux
précultures de 18 h à 37°C à l’obscurité sur Bouillon Trypcase Soja (BTS)
ont été réalisées avant chaque expérience.
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Tolérance au stress acide
Des Erlenmeyers de 250 ml contenant 100 ml de BTS acidifié à pH
2,5, 4,5 ou 6 avec HCl 1N sont inoculés avec 1 ml d’une suspension
bactérienne de telle manière que la concentration du milieu soit ajustée à
2.106 UFC/ml puis incubés à 20°C à l’obscurité. Après 2, 4, 6, 8 et 10 jours
d’incubation, une aliquote de 0,1 ml de dilutions décimales successives de
suspensions bactériennes de chaque échantillon est ensemencée sur
Trypcase Soja Agar (TSA). Après incubation 24 h à 37°C, les unités
formant des colonies sont dénombrées.
Effet de l’âge de l’inoculum
Afin de tester l’âge de l’inoculum sur la tolérance d’E. coli au stress
acide, des Erlenmeyers contenant le milieu BTS acidifié à pH 2,5 sont
inoculés avec les souches bactériennes en phase exponentielle ou
stationnaire de manière à avoir une densité de départ de 2.106 UFC/ml. Les
cinétiques de mortalité induite par le pH acide sont déterminées après 2, 4,
6, 8 et 10 jours d’incubation à 20°C à l’obscurité.
Adaptation au stress acide
L’adaptation des cellules au stress acide est réalisée selon le
protocole défini par Buchanan et Edelsson [7]. Les souches sont cultivées
sur BTS supplémenté avec 1 % de glucose 18 h à 37°C pour obtenir des
cellules en phase stationnaire. Le pH final de la préculture est de 4,8.
L’inoculum ainsi adapté est utilisé pour inoculer des Erlenmeyers contenant
100 ml de milieu BTS acidifié à pH 2,5 avec HCl 1 N et des
dénombrements sur TSA sont réalisés après dix jours d’incubation.
Parallèlement, nous avons examiné si l’adaptation au stress acide
dépend d’une synthèse protéique. Pour ce faire, des Erlenmeyers contenant
le milieu BTS acidifié à un pH 2,5 sont ensemencés avec des souches
préalablement cultivées sur BTS supplémenté avec 1 % de glucose en
présence ou non de chloramphénicol, antibiotique phénicolé inhibant la
synthèse des protéines, et des souches préalablement cultivées sur BTS sans
glucose ajusté à un pH 7 en présence ou non de chloramphénicol. L’addition
de glucose a pour but de s’assurer que l’inoculum est préadapté pour résister
à l'acidité.
Le taux de survie est le nombre d’unité formant colonie (UFC) à T10
rapporté au nombre d’UFC à T0.
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RÉSULTATS
Tolérance au stress acide
Après deux jours de survie à 20°C, la population bactérienne est
réduite quel que soit le pH étudié (Figure 1). À pH 6, le nombre de cellules
viables décroît de 1 unité log10 pour les deux souches EC1 et EC2 après deux
jours puis augmente et atteint 2,9.106 UFC/ml pour les deux souches à
quatre jours, le nombre de cellules survivantes au bout de dix jours étant de
1,52.103 et 1,35.103 UFC/ml pour les souches EC1 et EC2.
Lorsque les bactéries sont incubées à pH 4,5, la même cinétique est
observée avec un nombre de cellules viables en fin d’expérimentation de
l’ordre de 103 UFC/ml.
En revanche, à pH 2,5, les cellules perdent leur cultivabilité selon
une cinétique biphasique. On a d’abord une mortalité rapide à deux jours
avec une réduction décimale de 2 et 3 unités log10 respectivement pour les
souches EC1 et EC2 , suivie d’une phase durant laquelle le nombre de
cellules viables tend à se stabiliser et à ne plus dépendre du temps
d’incubation.
Effet de l’âge de l’inoculum
L’âge de l’inoculum affecte la viabilité bactérienne (Figure 2).
Lorsque les cellules sont prélevées en phase stationnaire, l’abondance des
souches EC1 et EC2 subit respectivement une réduction de 1,5 et 2 unités
log10 dès les deux premiers jours. Au contraire, si les bactéries sont
prélevées en phase exponentielle, la densité bactérienne chute de 2,4 et 3
unités log10 pour les souches EC1 et EC2. Au-delà de quatre jours, la densité
bactérienne devient relativement stable quel que soit le prélèvement.
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Log10 UFC/ml
pH 6
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
Log10 UFC/ml
Temps (jours)
pH 4,5
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
Log10 UFC/ml
Temps (jours)
pH 2,5
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
Temps (jours)
Fig. 1 : Survie des souches d’Escherichia coli EC1 ( ) et EC2 ( ) sur milieu
TSB à trois pH avec 2.106 UFC/ml, une incubation à 20°C.
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Log10 UFC/ml
Souche EC1
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
Log10 UFC/ml
8
10
Temps (jours)
Souche EC2
10
8
6
4
2
Temps (jours)
0
0
2
4
6
8
10
Fig. 2 : Effet de l’âge de l’inoculum (phase stationnaire et exponentielle )
sur la survie des souches d’Escherichia coli EC1, et EC2 sur milieu BTS
acidifié à pH 2,5, inoculé avec 2.106 UFC/ml et incubé à 20°C.
Adaptation au stress acide
Les deux souches survivent mieux à pH 2,5 lorsqu’elles ont subi une
adaptation à un pH non létal (pH 4,8). Les cellules adaptées sont dix fois
plus tolérantes au stress acide que les cellules non adaptées (Tableau I).
47
Tableau I :
Taux de survie des souches d’Escherichia coli après dix jours de culture
sur milieu BTS à pH 2,5, à partir d’inoculums obtenus en phase de
croissance stationnaire sur milieu BTS additionné ou non du glucose et
en présence ou non de chloramphénicol 18 h à 37°C.
taux de survie = (UFC à T10) / (UFC à T0)
Traitements
Taux de survie x 10-4
Souche EC1
Souche EC2
Cellules précultivées à pH 4,8 (avec glucose)
0,7
0,6
Cellules précultivées à pH 7 (sans glucose)
0,07
0,06
Cellules précultivées à pH 4,8
en présence de chloramphénicol (avec glucose)
0,08
0,05
Cellules précultivées à pH 7
en présence de chloramphénicol (sans glucose)
0,06
0,04
L’addition de chloramphénicol pendant l’adaptation réduit le taux de
survie des deux souches, alors que l’ajout de chloramphénicol n’a pas
d’incidence sur le taux de survie des cellules non adaptées (Tableau I).
DISCUSSION ET CONCLUSION
La tolérance des souches EC1 et EC2 d’Escherichia coli à pH acide
pendant dix jours à 20°C est similaire aux pH 4,5 et 6 avec un taux de
mortalité cellulaire faible. Ceci est en accord avec les résultats de Wu et al.
[33 ], qui ont montré que dans des salades de choux à pH 4,3 ou 4,5 une
population d’E. coli présentait une faible réduction au cours de stockage à 4,
11 et 21°C. D’autres travaux s’accordent sur le fait que la survie d’E. coli
dans les aliments à pH acide, comme des jus de fruits, des produits carnés
fermentés ou des salades, est favorisée lorsque ceux-ci sont conservés à des
températures de réfrigération [9,10,31-32].
Marques et al. [22] ont montré qu’E. coli peut survivre à pH compris
entre 2,5 et 3,3 dans les pulpes de fruits conservées trente jours à 4°C. À pH
48
2,5 et 20°C, la souche EC1 provenant des abattoirs apparaît légèrement plus
résistante que celle d’origine domestique. La survie des bactéries entériques
dans des conditions acides est très dépendante de leur état physiologique.
Benjamin et Datta [4] envisagent des souches fortement, moyennement et
faiblement acido-tolérantes d’après leur survie observée in vitro à pH 2,5.
Buchanan et Edelson [8] ont également mis en évidence une variabilité de
sensibilité à l’exposition aux pH acides pour un ensemble de souches d’E.
coli entérohémorragiques et une non entérohémorragique.
Les souches prélevées en phase stationnaire possèdent un pouvoir
adaptatif important par leur capacité à prolonger leur survie par rapport aux
souches récoltées en phase exponentielle. Ceci suggère que des processus
métaboliques responsables de l’acido-tolérance sont induits lors de la phase
stationnaire, ce qui permet aux bactéries entériques de réarranger leurs
constituants cellulaires de manière à favoriser leur survie. Hurst et al. [16] et
Jenkins et al. [18 ] ont observé que pendant la phase stationnaire de
croissance, les microorganismes détiennent des propriétés physiologiques
spécifiques. Ainsi, une population bactérienne en phase stationnaire de
croissance est plus résistante aux variations du pH [2,25] qu'en phase
exponentielle de croissance [28 ]. Ce phénomène explique en partie la
difficulté que rencontre l'industrie agroalimentaire dans la destruction des
microorganismes adaptés à leur environnement.
La résistance des souches EC1 et EC2 d’E. coli à pH 2,5 est plus
importante lorsque les bactéries sont adaptées à pH 4,8. En outre, la
présence du chloramphénicol lors de la préadaptation diminue la viabilité
des deux souches, en accord avec les travaux de Jordan et al. [19]. Ces
auteurs ont rapporté que l’addition de chloramphénicol au cours de la
préadaptation réduit significativement la survie bactérienne. Ces résultats
soulignent que les populations résistantes à l’acidité ont la capacité de
synthétiser des protéines restaurant les fonctions cellulaires après exposition
au stress acide. L'adaptation d’Escherichia coli au stress acide, peut contrer
l'efficacité de certains moyens de conservation et compromettre la salubrité
alimentaire.
Selon Brudzinski et Harrison [6], la survie d’E. coli dans un
environnement acide est liée à une résistance à l’acidité inductible,
dépendante du pH du milieu. Ces auteurs soulignent que la préadaptation
des cellules d’E. coli à des conditions acides (pH 5) favorise leur survie
dans une solution d’acide lactique à pH 3,85 ainsi que dans le jus de pomme
à pH 3,4. Cette résistance à l’acidité implique non seulement la survie
prolongée du microorganisme dans les aliments acides, mais favorise
également le transit de la bactérie dans l’estomac.
49
Ces résultats suggèrent fortement que lors de l’adaptation à pH
intermédiaire 4,8 des synthèses protéiques sont induites et sont responsables
de l’amélioration de la tolérance au stress acide [13,15]. D’autres auteurs [3]
ont évoqué des protéines liées à la membrane d’E. coli et notamment la
nécessité d’une expression complète du lipopolysaccharide O et de l’ECA
(Enterobacterial Common Antigen) pour résister à l’acide acétique et
d’autres acides gras à courte chaîne. Ces protéines élaborées lors de
l’adaptation permettent aux bactéries de restaurer des fonctions cellulaires
après une exposition à des stress environnementaux rencontrés au cours de
la transformation des aliments ou de leur conservation.
RÉFÉRENCES
1-
2-
3-
45-
6-
7-
Abdul-Raouf (U.M.), Beuchat (L.R.), Ammar (M.S.) - Survival and
growth of Escherichia coli O157:H7 on salad vegetables. - Appl.
Environ. Microbiol., 1993, 59(7), 1999-2006.
Arnold (K.W.), Kaspar (C.W.) - Starvation- and stationary-phaseinduced acid tolerance in Escherichia coli O157:H7. - Appl. Environ.
Microbiol., 1995, 61(5), 2037-2039.
Barua (S.), Yamashino (T.), Hasegawa (T.), Yokoyama (K.), Torii
(K.), Ohta (M.) - Involvement of surface polysaccharides in the
organic acid resistance of Shiga Toxin-producing Escherichia coli
O157:H7. - Mol. Microbiol., 2002, 43(3), 629-640.
Benjamin (M.M.), Datta (A.R.) - Acid tolerance of enterohemorrhagic
Escherichia coli. - Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61(4), 1669-1672.
Bergey (D.H.), Holt (J.G.), Krieg (N.R.) - Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology, Vol. 1: The Archaea and the Deeply
Branching and Phototrophic Bacteria. 1984. - Baltimore : The
Williams & Wilkins Co., XXVII, 964 p.
Brudzinski (L.), Harrison (M.A.) - Influence of incubation conditions
on survival and acid tolerance response of Escherichia coli O157:H7
and non-O157:H7 isolates exposed to acetic acid. - J. Food Prot.,
1998, 61(5), 542-546.
Buchanan (R.L.), Edelson (S.G.) - Culturing enterohemorrhagic
Escherichia coli in the presence and absence of glucose as a simple
means of evaluating the acid tolerance of stationary-phase cells. Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62(11), 4009-4013.
50
8-
9-
10 -
11 -
12 -
13 -
14 -
15 16 -
17 -
18 -
19 -
Buchanan (R.L.), Edelson (S.G.) - pH-dependent stationary-phase acid
resistance response of enterohemorrhagic Escherichia coli in the
presence of various acidulants. - J. Food Prot., 1999, 62(3), 211-218.
Clavero (M.R.), Beuchat (L.R.) - Survival of Escherichia coli
O157:H7 in broth and processed salami as influenced by pH, water
activity, and temperature and suitability of media for its recovery. Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62(8), 2735-2740.
Conner (D.E.), Kotrola (J.S.) - Growth and survival of Escherichia
coli O157:H7 under acidic conditions. - Appl. Environ. Microbiol.,
1995, 61(1), 382-385.
Dineen (S.S.), Takeuchi (K.), Soudah (J.E.), Boor (K.J.) - Persistence
of Escherichia coli O157:H7 in dairy fermentation systems. - J. Food
Prot., 1998, 61(12), 1602-1608.
Glass (K.A.), Loeffelholz (J.M.), Ford (J.P.), Doyle (M.P.) - Fate of
Escherichia coli O157:H7 as affected by pH or sodium chloride and in
fermented, dry sausage.- Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58(8),
2513-2516.
Guillouard (I.), Lim (E.M.), Van de Guchte (M.), Grimaldi (C.),
Penaud (S.), Maguin (E.) - Tolérance et réponse adaptative au stress
acide chez Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. - Lait, 2004, 84,
1- 6.
Haeghebaert (S.), Le Querrec (F.), Gallay (A.), Bouvet (P.), Gomez
(M.), Vaillant (V.) - Les toxi-infections alimentaires collectives en
France, en 1999 et 2000. - Bull. Épidémiol. Hebd., 2002, (23),
105-109.
Heyde (M.), Portalier (R.) - Acid shock proteins of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett., 1990, 69(1-2), 19-26.
Hurst (A.), Hugues (A.), Collins-Thompson (D.L.) - The effect of
sublethal heating on Staphylococcus aureus at different physiological
ages. - Can. J. Microbiol., 1974, 20(5), 765-768.
Infectious Agents Surveillance Center - Outbreaks of
enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection, 1996, Japan. Infect. Agents Surveill. Rep., 1996, 17, 180-181.
Jenkins (D.E.), Chaisson (S.A.), Matin (A.) - Starvation-induced cross
protection against osmotic challenge in Escherichia coli. - J.
Bacteriol., 1990, 172(5), 2779-2781.
Jordan (K.N.), Oxford (L.), O’Byrne (C.P.) - Survival of low-pH
stress by Escherichia coli O157:H7: Correlation between alterations in
the cell envelope and increased acid tolerance. - Appl. Environ.
Microbiol., 1999, 65(7), 3048-3055.
51
20 - Karmali (M.A.), Steele (B.T.), Petric (M.), Lim (C.) - Sporadic cases
of haemolytic-uraemic syndrome associated with faecal cytotoxin and
cytotoxin-producing Escherichia coli in stools. - Lancet, 1983,
1(8325), 619-620.
21 - Leyer (G.J.), Wang (L.L.), Johnson (E.A.) - Acid adaptation of
Escherichia coli O157:H7 increases survival in acidic foods. - Appl.
Environ. Microbiol., 1995, 61(10), 3752-3755.
22 - Marques (P.A.H.F.), Worcman-Barninka (D.), Lannes (S.C.S.),
Landgraf (M.) - Acid tolerance and survival of Escherichia coli
O157:H7 inoculated in fruit pulps stored under refrigeration. - J. Food
Prot., 2001, 64(11), 1674-1678.
23 - Massa (S.), Altieri (C.), Quaranta (V.), De Pace (R.) - Survival of
Escherichia coli O157:H7 in yoghurt during preparation and storage
at 4 degrees C. - Lett. Appl. Microbiol., 1997, 24(5), 347-350.
24 - Molins (R.A.), Motarjemi (Y.), Käferstein (F.K.) - Irradiation: a
critical control point in ensuring the microbiological safety of raw
foods. - Food Control, 2001, 12, 347-356.
25 - O'Driscoll (B.), Gahan (C.G.M.), Hill (C.) - Adaptative acid tolerance
response in Listeria monocytogenes: isolation of an acid-tolerant
mutant which demonstrates increased virulence. - Appl. Environ.
Microbiol., 1996, 62(5), 1693-1698.
26 - Riordan (D.C.), Duffy (G.), Sheridan (J.), Eblen (B.S.), Whiting
(R.C.), Blair (I.S.), McDowell (D.A.) - Survival of Escherichia coli
O157:H7 during the manufacture of pepperoni. - J. Food Prot., 1998,
61(2), 146-151.
27 - Skandamis (P.N.), Nychas (G.J.E.) - Development and evaluation of a
model predicting the survival of Escherichia coli O157:H7 NCTC
12900 in homemade eggplant salad at various temperatures, pHs, and
oregano essential oil concentrations. - Appl. Environ. Microbiol.,
2000, 66(4), 1646-1653.
28 - Smith (A.W.) - Stationary phase induction in Escherichia coli — new
targets for antimicrobial therapy? - J. Antimicrob. Chemother., 1995,
35, 359-361.
29 - Tsai (Y.W.), Ingham (S.C.) - Survival of Escherichia coli O157:H7
and Salmonella spp. in acidic condiments. - J. Food Prot., 1997,
60(77), 751-755.
30 - Tsujihata (S.), Entani (E.), Asai (M.), Tsukamoto (Y.), Ohta (M.) Mathematical modeling to predict the bactericidal effect of processed
vinegar on Escherichia coli O157:H7. - Int. J. Food Microbiol., 1998,
43(1-2), 135-138.
52
31 - Uljas (H.E.), Ingham (S.C.) - Survival of Escherichia coli O157:H7 in
synthetic gastric fluid after cold and acid habituation in apple juice or
trypticase soy broth acidified with hydrochloric acid or organic acids.
- J. Food Prot., 1998, 61(8), 939-947.
32 - Uyttendaele (M.), Taverniers (I.), Debevere (J.) - Effect of stress
induced by suboptimal growth factors on survival of Escherichia coli
O157:H7. - Int. J. Food Microbiol., 2001, 66(1-2), 31-37.
33 - Wu (F.M.), Beuchat (L.R.), Doyle (M.P.), Garrett (V.), Wells (J.G.),
Swaminathan (B.) - Fate of Escherichia coli O157:H7 in coleslaw
during storage. - J. Food Prot., 2002, 65(5), 845-847.
34 - Zhao (T.), Doyle (M.P.), Besser (R.E.) - Fate of enterohemorrhagic
Escherichia coli O157:H7 in apple cider with and without
preservatives. - Appl. Environ. Microbiol., 1993, 59(8), 2526-2530.
35 - Zhao (T.), Doyle (M.P.) - Fate of enterohemorrhagic Escherichia coli
O157:H7 in commercial mayonnaise. - J. Food Prot., 1994, 57(9),
780-783.
ABSTRACT
Survival of Escherichia coli under acidic conditions
The effect of acid stress on the survival of two strains of Escherichia
coli (EC1 and EC2) in tryptic soy broth acidified at pH 2.5, 4.5 and 6 was
studied.
At pH 4.5 and 6, the bacterial density was reduced 2 to 3 ULog10
during 10-day growth. At pH 2.5, the survival rate was more reduced for
EC2 strain (5 log10) than EC1 strain (4 log10). Cells sampled in stationary
phase had a higher adaptive ability at pH 2.5 than in the exponential phase.
Cells precultivated in neutral medium presented high lethality after
transfer to a pH 2.5 medium. On the contrary, cells previously incubated in
a pH 4.8 medium devoid of chloramphenicol became 10-fold more tolerant
to acid stress.
Key-words: acid stress, Escherichia coli, cell adaptation.
__________