Multiplication massive in vitro de Mentha pulegium (PDF

Multiplication massive in vitro
de Mentha pulegium
K. AID1, I. ALAMI2, D. BENALI1, M. ZEMZAMI2, A. MOKHTARI1 , A. SOULAYMANI1
1- Laboratoire Pharmacologie et Toxicologie. Faculté des Sciences - Kénitra.
2- Unité de Contrôle de plants - Domaine Agricole Maâmora, Salé.
Résumé :
Actuellement, les plantes médicinales et aromatiques (PMA) représentent une source
considérable et permanente pour l’extraction de principes actifs. Plus de 200 spécialités
pharmaceutiques à base de plantes existent. Au niveau national, plus de 71 % de personnes
interrogées utilisent des PMA pour se faire soigner.
Parmi les PMA industrialisées et commercialisées par le Maroc, on trouve Mentha
pulegium (Menthe pouliot) utilisée dans les traitements d’asthme, de la toux, d’enrouement
et d’affections gastriques. Cependant, la production et les exportations des PMA de façon
générale restent à un niveau très modeste par rapport à d’autres pays. Ceci s’explique par
la production irrégulière des PMA due à la cueillette spontanée des plantes sauvages.
Parmi les mesures qui pourraient contribuer au redressement de ce secteur, nous citons
l’instauration des surfaces cultivées des PMA. Ainsi, la culture in vitro pourrait être un
moyen de production et d’approvisionnement en PMA par le biais de la micropropagation.
La présente étude vise à la mise au point des conditions de multiplication végétative in vitro
de la Menthe pouliot.
Les essais réalisés dans ce sens ont permis de définir les différents paramètres de
multiplication in vitro de cette plante, à savoir le taux de débourrement des bourgeons, celui
de la multiplication, de l’enracinement et d’acclimatation. Ceux-ci représentent une étape
fondamentale pour l’établissement d’un éventuel programme de multiplication massive de
la Menthe Pouliot à l’échelle industrielle et commerciale.
Mots-clés : Mentha pulegium, micropropagation, plantes médicinales et aromatiques.
Le recours aux plantes pour se guérir a pris
naissance depuis bien longtemps en médecine
traditionnelle grecque, romaine, indienne,
chinoise et arabo-musulmane. Au niveau
national et d’après une enquête réalisée dans le
cadre d’une étude sur l’utilisation des plantes
en médecine traditionnelle, 71% des personnes
interrogées utilisent les plantes médicinales et
aromatiques (PMA) pour se faire soigner [1].
Le nombre de produits naturels, de médicaments à base de plantes ou de substances
Article reçu le 17 Juin 2002, accepté le 23 sept. après modification.
Adresse de correspondance et de tirés à part : Dr. K. AID
Laboratoire Pharmacologie et Toxicologie.
Faculté des Sciences - Kénitra.
Biologie & Santé vol. 3, n° 2, 2003
végétales ne cesse de croître à l’échelle
mondiale. De même, la recherche scientifique
ne cesse de nous fournir de nombreux
principes actifs à partir de plantes.
En plus de l’enjeu thérapeutique, l’enjeu socioéconomique des PMA est également très important aux niveaux national et international.
En terme d’exportation, le marché marocain
reste à un niveau très modeste par rapport aux
marchés internationaux. Les exportations de la
France en huiles essentielles sont estimées à
803 millions Euros avec 60 245 tonnes, alors
que pour le Maroc, les chiffres sont estimés à
60.3 millions DH avec 291 tonnes [1].
244
K. Aid et al.
Plusieurs facteurs peuvent expliquer le retard
du Maroc dans ce domaine, notamment le
manque de surfaces cultivées.
Dans notre pays, Mentha pulegium - connue
sous le nom vernaculaire français ‘Menthe
pouliot’ et arabe ‘Fliyou’- est l’une des
principales PMA utilisées et commercialisées
par le Maroc [2].
Appartenant à la famille des Labiées, elle est
utilisée fréquemment en médecine traditionnelle contre l’asthme, la toux, l’enrouement, le
hoquet et les affections gastriques. Elle est
reconnue comme stimulante et excitante du
système nerveux. La Menthe pouliot est
également utilisée en pharmacologie, en
parfumerie, en confiserie, en alimentation et
dans l’industrie des liqueurs.
La commercialisation de la Menthe Pouliot se
fait sous forme d’huile essentielle dont la
production connaît des fluctuations très
significatives d’une année à l’autre [2].
Cette irrégularité de production est due en
grande partie à la cueillette spontanée des
plantes sauvages à cause de l’insuffisance des
surfaces cultivées des PMA de façon générale.
Parmi les moyens qui pourraient contribuer au
redressement de ce secteur, la culture in vitro
par la multiplication massive des PMA.
Ainsi, l’objectif de notre étude consiste à la
mise au point des conditions de multiplication
végétative in vitro de la Menthe Pouliot.
Matériel et méthodes
Matériel végétal
Les rameaux de Mentha pulegium, utilisés
dans le présent travail, sont âgés d’un mois et
demi (2 à 4 mm de diamètre) et sont tous issus
d’un même pied-mère maintenu en culture en
serre à 25°C ± 2.
Désinfection et préparation des explants
Les rameaux sont effeuillés, désinfectés dans
un bain d’alcool (70 %, 2 min), suivi d’un
traitement par une solution d’hypochlorite de
sodium à 10 %, pendant 10 min. Ils sont
ensuite rincés par passages successifs dans
245
trois bains d’eau distillée stérile.
Initiation
Les rameaux sont fragmentés en boutures de 3
à 4 cm portant un seul nœud chacune. Les
boutures sont ensuite placées sur un milieu à
base de macro-éléments et micro-éléments AP
[3]. Ce milieu contient également 2 mg/l de
pyridoxine-HCl, 25 mg/l de myoinositol,
1mg/l du 6-benzylaminopurine (BAP), 0,01
mg/l d’acide indolylbutyrique (AIB), 30 g/l de
saccharose, 3,5 g/l d’agar-agar et 1 g/l de
gelrite. Le pH est ajusté à 5,7 ± 0,1 avant
stérilisation par autoclavage à 110°C pendant
20 min.
Les cultures sont placées ensuite à l’obscurité
à 25 ± 2°C pendant une semaine, puis
transférées à la lumière sous une photopériode
de 16 h (tubes fluorescents lumière du jour, 40
W, 3000 LUX). Cette phase d’initiation dure
trois semaines.
Multiplication
Les pousses obtenues après le débourrement
des bourgeons sont séparées de l’explant, puis
transférées sur un milieu de multiplication.
Dans ce sens, nous avons testé deux milieux de
culture pour la multiplication des pousses de la
Menthe Pouliot. Il s’agit du milieu AP, le
même utilisé en phase d’initiation, et d’un
milieu à base de macro-éléments et microéléments MS [4], contenant 100 mg/l de
myoinositol, 0,5 mg/l d’acide nicotinique, 0,5
mg/l de pyridoxine-HCl, 0,4 mg/l de thiamineHCl, 2 mg/l de BAP, 30 mg/l de saccharose,
3,5 g/l d’agar-agar et 1 g/l de gelrite. Le pH est
ajusté à 5,7 ± 0,1 avant stérilisation par
autoclavage à 110°C pendant 20min. Ces
cultures sont placées à 25 ± 2°C, sous une
photopériode de 16 h (3000 LUX) ; le cycle de
croissance est de 21 jours.
Elongation
Après l’étape de multiplication, les touffes sont
éclatées et les pousses sont placées
individuellement sur milieu d’élongation. La
composition de celui-ci est la même que celle
du milieu utilisé en phase d’initiation (AP) à la
seule différence des régulateurs de croissance
Biologie & Santé vol. 3, n° 2, 2003
Multiplication massive in vitro de Mentha pulegium
avec 0.1 mg/l de BAP, 0.2 mg/l d’AIB et 0.2
mg/l d’acide gibbérellique (GA3).
Les conditions de culture et la durée du cycle
de croissance sont les mêmes que celles
décrites au paragraphe précédent.
Enracinement
Cette phase se déroule généralement en deux
étapes :
a- L’induction racinaire : Au cours de laquelle,
nous avons utilisé le milieu de culture MS,
additionné d’hormones de croissance 0.1 mg/l
d’acide naphtalène acétique (ANA). Ce milieu
est désigné par MS (Er) dans ce qui suit.
b- L’élongation racinaire: Le milieu
d’induction racinaire utilisé au cours de cette
étape est le milieu MS, dépourvu d’hormones.
Il est noté par MS (SH).
En ce qui concerne les conditions physiques de
l’enracinement, les cultures sont placées à
25±2°C à l’obscurité et/ou à la lumière sous
une photopériode de 16 h (3000 Lux). Sept
conditions ont été testées lors de notre
expérimentation (Tableau II).
Remarque
Aussi bien en phases d’initiation, de
multiplication, d'élongation et d'enracinement,
les cultures sont réalisées dans des tubes à essai
en verre (150mm x 22 mm) contenant 15 ml du
milieu de culture.
Acclimatation
Les racines des vitroplants sont lavées à l’eau
pour éliminer les restes de la gélose. Les
vitroplants sont transplantés ensuite dans des
pots de 150 ml contenant un substrat stérile
composé de tourbe et de sable alluvial (V/V :
1/1) préfertilisé par :
- 50 g de sulfate de magnésium
- 150 g de 2Ca(H2PO4)2,CaSO4
- 5 g de sulfate de fer.
- 80 ml d’une solution mère de sulfate de
cuivre 50 g/ 2 l.
- 400 ml d’une solution mère de sulfate de
manganèse (200 g) et de sulfate de zinc (100 g)
dans 10 l.
Ces quantités s’entendent pour 100 litres .
La stérilisation du substrat se fait à la vapeur
(90°C, 10 min).
Les pots sont placés dans des conditions
saturantes d’humidité (système mini-serre) à
25°C sous ombrage. Après une semaine, les
pots sont enlevés de l’ambiance confinée et
remis en conditions normales de la serre à
25±2°C. La fertilisation est apportée, tous les 3
jours, à raison de 100 ml/pot d’une solution de
nitrate d’ammonium à 375 mg/l et de nitrate de
potassium à 125 mg/l.
Résultats et discussions
I- Etablissement in vitro du matériel végétal
Les caractéristiques statistiques, l’analyse de
variance et la comparaison multiple des
Tableau I : Différentes conditions d’enracinement testées.
(*Température = 25 °C ± 2, Luminosité = 16 heures de photopériode : 3000 Lux).
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246
K. Aid et al.
moyennes par le test Duncan [5] sont
consignées sur la figure 1.
Ces résultats montrent un avantage de
débourrement pour les deux premiers essais
avec un degré de signification de 2.5%
correspondant à un rapport F significatif (F =
3.16). La comparaison multiple des moyennes
confirme cet avantage en dissociant les
différents essais en 3 groupes (figure 1) : deux
groupes distincts A (essais 1 et 2) et B (essai 4)
et un groupe intermédiaire AB (essai 3). La
moyenne générale des 4 groupes est de 71.85 ±
45.06%.Au cours de la phase d’établissement,
les boutures sur milieu d’initiation sont placées
à l’obscurité pendant une semaine et ceci afin
d’éviter le problème d’oxydation des explants
observé durant les essais préliminaires. Au
cours de cette période, les bourgeons
commencent à débourrer et donnent des
pousses de 0.5 à 1 cm de longueur.
La réussite de l’établissement in vitro de la
Menthe pouliot est évaluée en pour-cent des
bourgeons débourrés par rapport à la totalité
des bourgeons mis en culture. Ainsi, 71.85 %
des bourgeons ont répondu positivement à nos
conditions de culture en donnant, au bout de
trois semaines, des pousses vigoureuses qui
atteignent jusqu’à 4 cm de longueur.
Ces résultats montrent un débourrement
important durant les deux premiers essais, qui
sont dûs probablement à l’épuisement des
meilleures boutures d’un essai au suivant (effet
d’épuisement du pied-mère), en plus de
l’accumulation du stress mécanique au niveau
de ce pied. Il est à signaler que des
contaminations des explants, généralement de
nature fongique, sont observées au cours de
cette étape. Leurs pourcentages fluctuent
autour d’une moyenne théorique de 10.74 %.
L’analyse de variance ne montre pas de
différences significatives entre les différents
essais; d’où on peut conclure que le taux de
contamination au cours de l’initiation est le
même quelque soit l’essai (figure 2).
Ce niveau de contamination n’est pas alarmant
si on le compare avec d’autres matériels
végétaux, surtout les ligneux comme le cas
d’un porte-greffe de pommier [6] où 30%
d’explants sont contaminés au cours de l’étape
d’initiation.
Pourcentage de débourrement en fonction des essais
180
-Caractéristiques statistiques:
* X1 = 80 %
* X2 = 82 %
* X3 = 72 %
* X4 = 62 %
Contamination
140
100
A
A
AB
B
60
-Conclusion: les différences
entre les essais sont
significatives.
-Comparaison des moyennes: (
Test Duncan): La comparaison
des moyennes donne trois
groupes ( A,AB & B ).
20
- la moyenne générale des 4
groupe est de 71.85 ± 45.06 %.
-20
-60
-Analyse de variance:
* F = 3.16
* p = 0.025
1
2
Essais
3
4
±1,96*Ec.-Type
±1,00*Ec.-Type
Moyenne
Figure 1 : Caractéristiques statistiques, analyse de variance et comparaison
multiple des moyennes du pourcentage de débourrement au cours de l’initiation.
247
Biologie & Santé vol. 3, n° 2, 2003
Multiplication massive in vitro de Mentha pulegium
Pourcentage de contamination
100
Pourcentage de contamination en fonction des divers essais
-Caractéristiques statistiques:
* X1 = 12 %
* X2 = 05 %
* X3 = 15 %
* X4 = 11 %
80
60
-Analyse de variance:
* F = 1.09
* p = 0.35
40
20
-Conclusion: les différences
entre les essais ne sont pas
significatives; d’où on peut
conclure que le taux de
contamination au cours de
l’initiation est le même quelque
soit l’essai. Ce taux fluctue
autour d’une moyenne
théorique de µ = 10.74%.
0
-20
-40
-60
-80
1
2
Essais
3
4
±1,96*Ec.-Type
±1,00*Ec.-Type
Moyenne
Figure 2: Caractéristiques statistiques et analyse de variance du pourcentage
de contamination des différents essais au cours de l’initiation.
Nos résultats montrent bien qu’avec le
protocole de désinfection appliqué, nous
avions réussi à satisfaire deux conditions
importantes, à savoir la désinfection des
explants et le débourrement des bourgeons.
Par ailleurs, 31 ± 8% des boutures ont émis des
racines au cours de cette étape. Ce phénomène
serait conditionné par l’effet des hormones
endogènes des boutures.
II- Multiplication
Pour la multiplication de la Menthe Pouliot,
deux milieux de cultures ont été testés. Ils
diffèrent par la composition minérale et hormonale.
Il s’agit du milieu AP avec 1 mg/l de BAP et
0.01 mg/l d’AIB et le milieu MS avec 2 mg/l
de BAP. Les résultats obtenus représentent la
moyenne de trois répétitions indépendantes.
Bien qu’il n’y ait pas eu une grande différence
entre la réponse des pousses aux deux milieux
de culture, le milieu MS a donné le meilleur
résultat avec un taux de multiplication de 4.3 ±
0.8. Pour le milieu AP, ce taux est de 3.2 ± 0.3.
Dans les deux cas, les pousses obtenues sont
vigoureuses et présentent une bonne croissance.
Biologie & Santé vol. 3, n° 2, 2003
Pendant les deux premières subcultures, les
pousses montrent un niveau de multiplication
hétérogène. Néanmoins, au fur et à mesure des
subcultures, une plus grande régularité apparaît,
conséquences probables des sélections
conscientes ou non, réalisées à chaque
repiquage. Ces observations sont proches à
celles de [7] faites sur des pousses de certains
porte-greffes de pommier et de poirier.
Au cours de cette phase et dans les deux
milieux de culture, 10% des cultures sont
vitrifiées. Elles correspondent toutes à des
cultures présentant une forte densité du
matériel végétal. Ce phénomène s’accompagne
par une accumulation importante d’eau dans
les tubes à essai. Plusieurs hypothèses ont tenté
d’expliquer les causes de la vitrification. Ainsi,
l’implication de plusieurs facteurs a été
reconnu dans l’induction de ce phénomène, à
savoir des concentrations élevées de BAP [8],
de NH4+ [9], utilisation du milieu liquide [10]
et les faibles concentrations en Ca++ [11].
Ainsi, certains auteurs ont essayé de résoudre
ce problème par une augmentation de la
248
K. Aid et al.
concentration de l’agar dans le milieu de
culture comme chez l’artichaut [12], une
réduction du niveau de NH4+ [13] ou des
cytokinines [14].
Pour remédier à ce problème et sans toucher à
la composition du milieu de culture, nous
avons essayé de réduire l’accumulation d’eau
dans les cultures, par une amélioration
d’échange d’air dans les tubes. Pour cela, les
tubes ont été fermés par du coton au lieu des
bouchons en polypropylène. Avec cette
pratique, le nombre des cultures vitrifiées a
significativement baissé à 3%.
Par ailleurs, en ce qui concerne les pratiques
culturales au cours de la multiplication, un
éclatement des souches est réalisé à chaque
repiquage.
III- Elongation
Dans le cas de la Menthe pouliot, les pousses
obtenues en phase de multiplication sont
vigoureuses ayant en moyenne 3 cm de
longueur.
L’utilisation
d’un
milieu
d’élongation n’a pas apporté une amélioration
significative. Cette étape s’est avérée donc non
nécessaire. Les pousses passent directement de
la multiplication à l’enracinement.
IV- Enracinement
Plusieurs schémas pour l’enracinement des
vitropousses sont décrits dans la littérature.
Pour certains auteurs, cette étape passe par
deux phases.
Une phase d’induction racinaire avec une
auxine dans le milieu de culture. Elle se
déroule à l’obscurité [15] ou à la lumière [16].
Une phase de développement et d’élongation
racinaire qui se déroule souvent à la lumière
dans un milieu dépourvu d’hormones [17, 18,
19]. Le passage dans un milieu sans hormones
permettrait d’éliminer toute rétroinhibition possible
du développement racinaire par les auxines.
Cependant, dans d’autres cas, l’enracinement se
déroule en une seule phase et sur un seul milieu
de culture contenant une auxine [20, 21, 22].
L’optimisation des conditions d’enracinement
est fondamentale pour la suite du travail, car
l’obtention d’un système racinaire développé
pourrait lever toute ambiguïté quant à la
249
reprise des plants en serre.
Ainsi et afin d’optimiser les conditions
d’enracinement des vitropousses de la Menthe
Pouliot, sept conditions ont été testées. Cellesci différent par rapport au milieu de culture
(MS (Er) et/ou MS (SH)) et/ ou aux conditions
de cultures (lumière et/ou obscurité).
Les résultats obtenus représentent la moyenne
de trois répétitions indépendantes (figure 3).
Le meilleur taux d’enracinement 82% est
obtenu avec la condition II où les vitropousses
passent une semaine sur milieu MS (Er) avant
d’être transférées sur milieu MS (SH). Durant
toute cette étape, les vitropousses sont placées
à la lumière (sous une photopériode de 16h,
3000 Lux).
Dans ces conditions, les vitroplants émettent
des racines longues et épaisses avec en
moyenne 4 à 5 par plant. De plus, pas de
formation de cals à la base des pousses. Toutes
ces caractéristiques sont en faveur d’une
reprise facile et réussie de ces vitroplants en
serre.
Par ailleurs, bien que le taux d’enracinement
des vitropousses
dans les différentes
conditions ne présente pas de différences
significatives, nous avons opté pour la
deuxième condition pour laquelle la qualité de
la racine est meilleure (racines épaisses,
longues en général, au nombre de 4).
V- Acclimatation
L’acclimatation des vitroplants représente
l’étape la plus délicate dans le programme de
la multiplication in vitro des espèces végétales.
Les meilleures souches sorties du laboratoire
peuvent subir d’énormes dégâts au cours de
cette étape.
En ce qui concerne les vitroplants de la Menthe
Pouliot, après leur transfert sur un substrat
horticole et un séjour d’une semaine dans des
conditions d’humidité saturante, la reprise des
plants est de 100%.
Ce taux de réussite est maintenu même après
quatre semaines dans les conditions de la serre.
Les plants présentent une croissance et un
développement très satisfaisant; les rameaux
atteignent jusqu’à 20 cm de longueur.
Biologie & Santé vol. 3, n° 2, 2003
Multiplication massive in vitro de Mentha pulegium
Pourcentage d'enracinement en fonction des différentes conditions
Pourcentage d'enracinement
180
-Caractéristiques statistiques:
* C1 = 77 %
* C2 = 82 %
* C3 = 68 %
* C4 = 62 %
* C5 = 54 %
* C6 = 62 %
* C7 = 71 %
140
100
-Analyse de variance:
* F = 1.51
* p = 0.17
60
-Conclusion: les différences
entre les diverses conditions ne
sont pas significatives; d’où on
peut conclure que le taux
d’enracinement est le même
quelque soit la condition. Ce
taux fluctue autour d’une
moyenne théorique de µ =
68.5%.
20
-20
±1,96*Ec.-Type
±1,00*Ec.-Type
Moyenne
-60
1
2
3
4
5
6
7
Conditions
Figure 3 : Caractéristiques statistiques et analyse de variance dans
différentes conditions utilisées au cours de l’étape d’enracinement.
Conclusion
Les résultats obtenus dans ce travail
représentent une étape fondamentale pour
l’établissement d’un éventuel programme de
multiplication massive de la Menthe Pouliot à
l’échelle industrielle et commerciale.
Ainsi, l’optimisation et la maîtrise des
conditions de multiplication au niveau du
laboratoire, à savoir les conditions de cultures
(physiques et chimiques), les paramètres de
multiplication (taux de débourrement, de
multiplication, d’enracinement et d’acclimatation) constituent, sans aucun doute, les repères
clés pour planifier un calendrier de production
massive de cette plante.
more than 71 % of surveyed people use MAP
for treatment of various illnesses. However,
production and export of MAP are in general
such fact less important in Morroco than in
other countries. This is explained by irregularity in production and use of traditional
harvesting techniques of wild species. One of
the actions that may contribute to improvement
of this industry, is to extend production using
modern techniques.
In this present study, we report an impravemet
of a protocol for mass-propagation of wild
peppermint "Mentha pelegium". Optimization of
technical parameters concerning shoot
multiplication, elongation rooting and
acclimation of plant letts, have been achieved.
Massive multiplication of these species has
now been made possible.
Summary
Medicinal and aromatic plant (MAP) species
constitute a constant source of active reagents.
More than, 200 pharmaceutical formulations
of plant origin are presenty in use. In Morroco,
Biologie & Santé vol. 3, n° 2, 2003
Keywords: Mentha pulegium, micropropagation,
medicinal and aromatic plants.
250
K. Aid et al.
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