Cy3, Cy5

Pioneering off-gel methodology for protein
quantification using a dual channel (Cy3, Cy5)
Laser Induced Fluorescence detector
and nanoESI-Qq-FT-ICR ECD-MS/MS
Caroline Tokarski,1 Claude Netter,2 Jocelyne Tahar,3 Christian Rolando1
1
Chimie Organique et Macromoléculaire, UMR CNRS 8009, Protéomique,
Modifications Post-traductionnelles et Glycobiologie, IFR 147, USTL, 59655
Villeneuve d'Ascq Cedex, France
2
Dionex, Voisins-le-Bretonneux, France
3
Picometrics, Toulouse, France
Détection LIF double canal
2 détecteurs à fluorescence laser induite en
série, équipés de filtres
(Zetalif Evolution, Picometrics, Toulouse)
Décalage constant de l’échelle de
temps entre les deux canaux, dû au
capillaire de connexion entre les deux
détecteurs (10 cm)
Développement d’un nouveau type de
détecteur LIF, permettant une détection
synchrone des deux colorants
(Zetalif Discovery, Picometrics, Toulouse)
Séparation des protéines sur colonne Monolith PS-DVB d.i. 200 µm (Dionex)
Séparation des peptides sur colonne PepMap C18 d.i. 75 µm (Dionex)
Zetalif Discovery
Photodiode proche du
collimateur pour la mesure
effective de la puissance
du rayonnement laser
Montage
colinéaire
Sortie nano-colonne
Détection
dans le
capillaire
Lentille
sphérique
saphir
laser diode 532 nm optimisé pour la détection du Cy3
laser Helium-Neon 633 nm optimisé pour la détection du Cy5
sensibilité et linéarité du détecteur LIF
1 attomole injectée détectée avec un bon
rapport signal/bruit (estimation S/N= 13)
l’intensité de la fluorescence est
lineaire sur 4 ordres de magnitude
Cy3 dye from GE Healthcare
=> Les 2 canaux ont un
comportement similaire
=> la sensibilité du LIF est
très supérieure à celle de la
spectrométrie de masse
(# deux ordres de grandeur)
Evaluation des colorants maleimide
Fluoprobes
GE HealthCare
Colorants Fluoprobes vs colorants GE Healthcare : un groupe CH2 en moins
détection nanoESI-Qq-FT-ICR MS
en mode positif pour les deux
colorants en dépit de la présence
des groupes sulfonate
(détection peu sensible en mode négatif)
Cy3 vs Cy5 : liaison ethylénique
supplémentaire dans le colorant Cy5
Détection LIF des colorants maleimide
Injections d’un mix Cy3 / Cy5
Décalage en rétention dû à la
séparation des colorants sur la
colonne chromatographique
Emission du Cy3
sur le canal Cy5
100 fmol injected
Cross-labeling des tests et des contrôles par
Cy3/Cy5 pour la validation et la quantification
Colorants et conditions de marquage
Evaluation: réduction des protéines / paramètres du marquage (quantité, durée …)
+ pour peptides: étape de marquage avant ou après digestion
Paramètres usuels pour le marquage
« à saturation » :
Paramètres optimisés pour le marquage
à saturation :
- Réduction des protéines: 0.4 nmol Tris(2-carboxyethyl) phosphine chlorhydrate
(TCEP) par µg de protéine
Tampon Tris-HCl pH= 7.5, 1 h, 37°C
- Marquage des protéines: 0.8 nmol de
fluorophore par µg de protéine fraîchement
dissout dans le DMF anhydre, 30 min,
37°C
- Réduction des protéines: 0.8 nmol Tris(2-carboxyethyl) phosphine chlorhydrate
(TCEP) par µg de protéine
Tampon Tris-HCl pH= 7.5, 4 h, 37°C
- Marquage des protéines: 1.4 nmol de
fluorophore par µg de protéine fraîchement
dissout dans le DMF anhydre, 12 h, 37°C
Dessalage sur colonne de gel filtration (élimination du fluorophore en excès):
Evaluation des conditions d’élution (eau, ammonium bicarbonate 50 mM pH=7.0,
ammonium phosphate 50 mM pH=7.0, …)
Conditions d’élution optimisées: dessalage sur HiTrap (Sephadex G-25 Superfine,
limite d’exclusion 5000), eau désionisée, 10 min
Evaluation du marquage: analyse MALDI-TOF
α-lactalbumine marquée par Cy3 / Cy5
α-lactalbumine
(100 fmol)
M+2H+
M+H+
m/z # 14 kDa
2M+H+
# 8 Cy3
α-lactalbumine
marquée Cy3
Evaluation du marquage pour 4 protéines:
- Cytochrome C (# 12 kDa, 2 cystéines)
- α-Lactalbumine (# 14 kDa, 8 cystéines)
- Lysozyme (# 16 kDa, 9 cystéines)
- Ovalbumine (# 42 kDa, 6 cystéines)
La protéine native n’est plus détectée
Seules les protéines marquées sont détectées
# 8 Cy5
α-lactalbumine
marquée Cy5
Détection en mode positif, en dépit des groupes
sulfonate présents dans les molécules de colorant
(importance de la matrice acide)
Evaluation du marquage: analyse MALDI-TOF
digests α-lactalbumine marquée Cy3 / Cy5
Les 8 cystéines sont détectées avec l’incrément en masse
correspondant aux tags Cy3 et Cy5
Aucune cystéine libre détectée, tous les peptides sont marqués Cy
(MASCOT avec database SwissProt)
Quantification des peptides marqués en détection LIF
Digest α-lactalbumine marquée Cy3 et Cy5
100 fmol injected
100 fmol injected
Quantification des peptides avec le logiciel Chromeleon
Pourquoi les surfaces/hauteurs des pics de peptides issus d’une
protéine unique sont-elles différentes?
Identification des peptides marqués détectés en LIF
ALCSEKLDQWLCEK (128 - 141) + 2 Cy5
GRAVY: -0.379
GYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNN
DSTEYGLFQINNK (36–77)
+ 1 Cy5, GRAVY: -0.495
(100 fmol injectées)
paramètre d’hydrophobicité GRAVY
indiqué pour le peptide non marqué
Digest α-lactalbumin marquée Cy5
Identification des peptides marqués détectés en LIF
ALCSEKLDQWLCEK (128 - 141) + 2 Cy5
GRAVY: -0.379
GYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNN
DSTEYGLFQINNK (36–77)
+ 1 Cy5, GRAVY: -0.495
LDQWLCEK (134–141) + 1 Cy5
GRAVY: -0.650
DLKGYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIV
QNNDSTEYGLFQINNK (33–77) + 1 Cy5
GRAVY: -0.542
DDQNPHSSNICNISCDK (82-98)
+ 2 Cy5, GRAVY: -1.271
CEVFRELKDLK (25-35)
+ 1 Cy5, GRAVY: -0.518
IWCKDDQNPHSSNICNISCDK + 3 Cy5
ou
DDQNPHSSNICNISCDKFLDDDLTDDIMCVK
+ 3 Cy5 (1clivage manqué)
(candidats potentiels)
FLDDDLTDDIMCVK (99-112 ) + 1 Cy5
GRAVY: 0.100
CEVFR (25–29) + 1 Cy5
GRAVY: 0.300
IWCK (78-81) + 1 Cy5
GRAVY: 0.550
(100 fmol injectées)
paramètre d’hydrophobicité GRAVY
indiqué pour le peptide non marqué
Digest α-lactalbumine marquée Cy5
L’aire du pic dépend du nombre de cystéines marquées dans la séquence
Analyse On-line des peptides marqués: spectre MS/MS
identification d’un peptide marqué avec 2 fluorophores
*
y3 + Cy3 2+ +Cy3
2 +
y3
y4
3
3
3
3
3
3
y 2+ +Cy 2+ +Cy 2+ +Cy 2+ +Cy 2+ +Cy 2+ +Cy3
2+ + C
y7
y8
y5
y4
y3
y6
y9
2+ + C
y5
y3
2+ + C
y 11
A L Ccy3 S E K L D Q W L Ccy3 E K
y3 2+ +Cy3 2+ +Cy3 2+ +Cy3
b9
b 10
b 11
3
Cy
2+ + C
b8
b82++Cy3
y3
2+ + C
b3
y72++Cy3
y62++Cy3
y52++Cy3
y42++Cy3
y32++Cy3
b92++Cy3
y32+ +Cy3 + Cy3 2+ +
2 +
b8
b6
b7
2+ + C
b5
spectre MS/MS
montrant les ions b et y
avec tag Cy3
b3++Cy3
y82++Cy3
b102++Cy3
y112++Cy3
y92+
+Cy3
b112+
+Cy3
y3++Cy3
les cystéines marquées
sont stables dans les
conditions CID MS/MS
y4++Cy3
y5++Cy3
+
b5 +Cy3
b6++Cy3 b7++Cy3 b8++Cy3
* fluorophore avec un résidu sulfure provenant de la cystéine
Analyse On-line des peptides marqués
*
2+ +C
y5
y3
3
3
3
y3
3
y3
y3
y32+ +Cy3
y4
3
3
y
y
y
y
2+ +C 2+ +C 2+ +C 2+ +C y 2+ +C 2+ +C y 2+ +C 2+ +C2+ +C 2+ +C
y9
y6 y5 y4
y7
y8
y 12 y 11 y 10
y 13
F L D D D L T D D I M Ccy3 V K K
y52++Cy3
y92++Cy3
2+
y4
+Cy3
y6
2++Cy3
y7
y13
2++Cy3
2++Cy3
y82+
+Cy3
2++Cy3
y102++Cy3 y11
y122++Cy3
y4++Cy3
y5
+ +C
y4
y5 Cy5 y5 y5
y5 y5 y5 Cy5 Cy5 y5
2+ +C 2+ +C 2+ +C 2+ + 2+ + 2+ +C 2+ +C 2+ + 2+ +C 2+ +C
y6 y5 y4
y7
y 13 y 12 y 11 y 10 y 9 y 8
y52+
+Cy5
F L D D D L T D D I M Ccy5 V K K
y62++Cy5
*
2+
y7
+Cy5
y82++Cy5
y92++Cy5
Détection spécifique
des peptides marqués:
Extraction des chromatogrammes
correspondant aux signaux contenant
l’ion spécifique *
m/z 773.2343 / 799.2516
pour les peptides marqués
respectivement avec
Fluoprobes Cy3 / Cy5
y122++Cy5
y102++Cy5
y42++Cy5
y5++Cy3
le process d’élimination à partir du
peptide marqué conduit à un ion
monochargé * spécifique (observé
sur spectres resultant des ions
M+2H+, M+3H+…)
y132++Cy5
y112++Cy5
y4++Cy5
m/z 787.2499 */ 813.2672 *
pour les peptides marqués
respectivement avec
GE Healthcare Cy3 */ Cy5 *
Analyse On-line des peptides marqués
*
Proportions injectées:
Digest α-lactalbumine
marquée avec Cy3/Cy5 : 1/2
*
Identification des peptides marqués du mélange d’ α-lactalbumine
marquée Cy3- and Cy5- (logiciel MASCOT, database SwissProt)
les peptides marqués avec 1 ou 2 Cy sont identifiés
Quantification des protéines marquées en détection LIF
α-Lactalbumine marquée Cy3 et Cy5
5 fmol injected
la quantification est facilitée du fait qu’un pic représente une protéine
Possibilité d’analyse de mélanges biologiques complexes
Quantification des protéines marquées en détection LIF
Intens.
x10 6
TIC of α-lactalbumin
Saturation labeling with Cy3
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Time [min]
EIC 1161.9±0.25 +All MS
Intens.
x10 5
+MS, 10.1-10.3min #(165-169)
MS spectrum
1161.8829
6
1032.8932
4
1076.2994
956.5961
929.7042
2
997.1275
1229.7753
884.6575
1130.0473
1327.7272
1196.3568
1283.7066
0
800
900
1000
1100
1200
Intens.
x10 5
1300
m/z
+MS, 10.1-10.3min #(165-169), Deconvoluted (maximum entropy)
Deconvoluted spectrum
All the cysteins are labeled
13000
16000
6
4
2
0
14000
15000
17000
18000
19000 m/z
Analyse On-line des protéines marquées Cy3 et Cy5
Intens.
x10 4
5
4
Intens.
x10 4
α-Lactalbumine
marquée Cy3
3
1436.31013
+MS, 5.5-14.0min #(20-48)
1483.44338
1483.64330
1483.53228
+MS, 5.5-14.0min #(20-48)
10+ ion
1.0
0.8
0.6
1596.01462
0.4
1483.4
1483.5
1483.6
1483.7
1483.8
1483.9
m/z
Pic detecté :
14824.4338
1476.74164
1306.00754
1640.59600
2
1386.51936
1
v
1195.91999
1795.13851
1685.07308
1847.18575
1890.19451
0
1200
Intens.
x10 5
1300
1400
Intens.
x10 4
α-Lactalbumine
marquée Cy5
1486.45107
10+
ion
2.0
1431.61123
1.5
1500
1600
Intens.
x10 4
3.0
1590.35317
2.5
1700
Intens.
x10 4
1651.17141
9+
ion
Déconvolution
protéine:
14850.4106
2.0
1.5
1800
1.5
1900
Mr (h)
14850.41061
m/z
+MS, 0.9-4.6min #(5-17)
5
4
3
1.0
2
1.0
1.0
1301.28044
0.5
1
1471.64005
1634.82367
0.5
1789.01884
0.5
1486
0
1652
14860
1338.12848
1839.42062
1884.22112
2044.46471
0.0
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
Détermination de la masse moléculaire précise de la protéine avec 1 Cy-
m/z
On-line Electron Capture Dissociation
Optimisation des paramètres du mode ECD : diminution du courant cathodique de
façon à éviter l’échauffement de la cellule ICR, et augmentation de l’electron
emission gate
Diminution courant cathode => 1.5 A
Augmentation electron emission time => pulse: 0.01 s
Selection Ion => ici par exemple m/z = 941.7263
x10 4
+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)
1020.28715
5
13+
4
12+
11+
spectre ECD
1112.94849
941.72632
10+
3
1224.04117
9+
2
Cytochrome C
1412.52450
10 pmol injectées
1376.68904
1157.58799
1
0
900
1000
1100
1200
Zoom 1
1300
Zoom 2
1400
m/z
On-line Electron Capture Dissociation
x10 4
1.2
+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)
Zoom 1
1.0
0.8
z69
7+.
z91
0.6
z39
9+.
z76
10+
10+
c101
4+.
1142.03849
10+
c103
1128.88976
0.4
z82
c104
1157.58799
6+.
z61
9+
c93
z83
8+.
z94
10+.
z104
c84
9+.
z84
8+.
8+
9+
c96
1186.58400
c55
9+.
9+ z
95
c
8+. 95 1179.59257
z85
5+
z74
6+
7+. 1219.63994
c67
7+
1210.73670
c76
7+.
z98
9+.
8+.
0.2
0.0
1120
x10 4
1130
1140
1150
1160
1170
1180
1190
1200
5+.
z59
1360.34900
1.0
z78
0.6
0.4
c89
m/z
+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)
Zoom 2
0.8
1210
6+
7+.
1246.82620
9+.
z100
8+
1308.82207
9+
c102
1261.48426
c101
9+
c59
5+
4+
8+.
c48 1295.65537
z93
5+.
1284.67508
z56
7+.
6+.
z81 z69
c72
1323.81302
c83
7+
z97
8+
7+c
96
1336.00506
c84
c97
8+.
c87
8+
z98
7+
8+.
0.2
0.0
1240
1260
1280
1300
1320
1340
1360
m/z
Conclusion
Résumé :
Nouvelle méthode off-gel très sensible, combinant quantification
et identification des protéines
Conditions de marquage optimisées
Détection spécifique des peptides / protéines marquées
Linéaire sur 4 ordres de grandeur
Optimisation top down on line en mode ECD
Compatible avec les logiciels MS (Mascot etc)
Perspectives :
Poursuite de l’évaluation du protocole
Tests sur échantillon réels (protéines extraites de plasma humain,
par ex. analyse différentielle de l’Apolipoprotéine A)