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Amélioration des qualités nutritionnelles du milieu de culture utilisé pour produire Trichoderma, afin d’en maximiser le potentiel antagoniste (Projet # 202-T) Rapport final de recherche Présenté au CRAAQ (Centre de référence en agriculture et agroalimentaire du Québec) Présenté par Mmes Johanne Caron et Lucie Laverdière Horti-Protection inc. février 2003 Table des matières 1. AVANT-PROPOS__________________________________________________________7 2. INTRODUCTION _________________________________________________________8 3. MATÉRIEL ET MÉTHODES________________________________________________9 3.1 Production de la biomasse de Trichoderma___________________________________9 3.2 Tests de confrontation en Pétri ____________________________________________9 3.3 Tests en serre expérimentale _____________________________________________10 4. RÉSULTATS ET DISCUSSION _____________________________________________12 4.1 Production de la biomasse de Trichoderma__________________________________12 4.1.1 Expérience #1 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 conventionnel ____________________________________________________________12 4.1.2 Expérience #2 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu conventionnel mais solide ___________________________________________________12 4.1.3 Expérience #3 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu à base de pomme de terre (PDA) _____________________________________________________13 4.1.4 Expérience #4 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 solide - sans carbonate de calcium ____________________________________________14 4.1.5 Expérience #5 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu eau et agar __________________________________________________________________15 4.1.6 Expérience #6 – Effets d’une plus grande concentration de cellulose au milieu V-8 solide - sans carbonate de calcium ____________________________________________16 4.1.7 Expérience #7 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus V-8 __________________________________________________________________16 4.1.8 Expérience #8 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 semi-solide – sans CaCO3 ___________________________________________________18 4.1.9 Expérience #9 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu ½ PDA + jus V-8 ________________________________________________________________18 4.1.10 Expérience #10 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 semi-solide et au milieu ½ PDA + jus V-8 ____________________________________________________20 4.1.11 Expérience #11 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 solide_________21 4.1.12 Expérience #12 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté d’une source de cellulose ___________________________________________________21 4.1.13 Expérience #13 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté d’une source de cellulose ___________________________________________________23 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 2 sur 44 Horti-Protection inc. 4.1.14 Expérience #14 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté de la cellulose raffinée (#2) ou à fibres moyennes (#3) ____________________________24 4.2 Test de confrontation en Pétri ____________________________________________25 4.2.1 Expérience #1 - Tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathogènes sur deux milieux de culture __________________________________________________25 4.3 Tests en serre expérimentale _____________________________________________27 5. 4.3.1 Concombre ________________________________________________________27 4.3.2 Tomate____________________________________________________________32 4.3.3 Muflier____________________________________________________________35 CONCLUSIONS__________________________________________________________40 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 3 sur 44 Horti-Protection inc. Liste des figures Figure 1. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide. ________________________________________12 Figure 2. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 solide._____________________________________________13 Figure 3. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu PDA. _________________________________________________14 Figure 4. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. __________________________________15 Figure 5. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu eau et agar. ____________________________________________16 Figure 6. Effet d’une plus grande concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. __________________________________17 Figure 7. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu PDA + jus V-8. _________________________________________17 Figure 8. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide sans CaCO3. _____________________________18 Figure 9. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu ½ PDA + jus V-8. _______________________________________19 Figure 10. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source d’hydrate de carbone sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8. _________22 Figure 11. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source d’hydrate de carbone sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8. _________24 Figure 12. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en absence d’agents pathogènes_______________________________________________________________28 Figure 13. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en présence de Rhizoctonia solani _________________________________________________________29 Figure 14. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en présence de Verticillium dahliae________________________________________________________30 Figure 15. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en présence de Pythium aphanidermatum ___________________________________________________30 Figure 16. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en absence d’agents pathogènes_______________________________________________________________33 Figure 17. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de Rhizoctonia solani _________________________________________________________34 Figure 18. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de Verticillium dahliae________________________________________________________34 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 4 sur 44 Horti-Protection inc. Figure 19. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de Pythium ultimum _________________________________________________________________35 Figure 20. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en absence d’agents pathogènes_______________________________________________________________36 Figure 21. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de Rhizoctonia solani _________________________________________________________36 Figure 22. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de Verticillium dahliae________________________________________________________37 Figure 23. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de Pythium ultimum _________________________________________________________________38 Liste des tableaux Tableau 1. Synthèse des observations effectuées lors des différentes expérimentations réalisées afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma. .20 Tableau 2. Comparaison des pH obtenus après ajustement ou non et l’ajout d’une source de glucose ou de sucrose - milieux de culture V-8 semi-solide et ½ PDA + jus V-8..............21 Tableau 3. Effet d’une source d’hydrate de carbone sur la croissance de Trichoderma – milieu V-8 solide...............................................................................................................................21 Tableau 4. Synthèse des observations effectuées lors des différentes expérimentations réalisées afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma. .23 Tableau 5. Effet d’une source d’hydrate de carbone et de cellulose sur la croissance de Trichoderma – milieu PDA + jus V-8. .................................................................................25 Tableau 6. Taux de croissance moyen journalier (mm) des champignons pathogènes et de l’agent de lutte biologique Trichoderma ................................................................................25 Tableau 7. Identification et pondération des critères de décision sélectionnés pour évaluer la performance de Trichoderma à la confrontation en Pétri contre différents agents pathogènes ................................................................................................................................................26 Tableau 8. Évaluation, in vitro, de l’activité antagoniste de Trichoderma vis-à-vis les agents pathogènes ..............................................................................................................................27 Tableau 9. Isolement des agents pathogènes et de Trichoderma à partir des systèmes racinaires présentant ou non des symptômes visuels de la maladie .......................................................31 Tableau 10. Isolement de Trichoderma et des agents pathogènes à partir d’échantillons de sol. .32 Tableau 11. Synthèse des résultats obtenus en serre expérimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au témoin négatif. 38 Tableau 12. Synthèse des résultats obtenus en serre expérimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au «témoin plante» ................................................................................................................................................39 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 5 sur 44 Horti-Protection inc. Liste des annexes Annexe 1. Barème de pondération employé lors de l'évaluation de Trichoderma suite au test de confrontation en Pétri ______________________________________________________41 Annexe 2. Dispositif expérimental utilisé dans la serre expérimentale ____________________43 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 6 sur 44 Horti-Protection inc. 1. AVANT-PROPOS Le projet comportait trois volets soit 1) amélioration de la qualité nutritionnelle du milieu de culture employé pour produire Trichoderma, 2) tests de confrontation en Pétri pour comparer l’agressivité de Trichoderma envers des agents pathogènes lorsque cultivé sur l’ancienne et nouvelle formulation et 3) visualiser, en serre expérimentale, le comportement de Trichoderma produit à partir du nouveau milieu de culture, lorsque comparé à l’ancienne formulation et en présence d’agents pathogènes seuls ou en combinaison. Ce projet a été réalisé dans le cadre du Programme pour le Fonds végétal géré par le Centre de Référence en Agriculture et Agroalimentaire du Québec (CRAAQ) et ses partenaires (HortiProtection inc. et l’IRDA). Le personnel impliqué Horti-Protection inc. Johanne Caron, M.Sc. Lucie Laverdière, tech. 11, rue des Peupliers Sainte-Hélène de Breakeyville (Québec) G0S 1E1 Tél. : (418) 832-0546 Fax : (418) 832-0546 [email protected] M. Pierre O. Thibodeau, agr., M.Sc. Institut de recherche et de développement en agroenvironnement (IRDA) 2700, rue Einstein Sainte-Foy (Québec) G1P 3W8 Tél. : (418) 644-7226 Fax : (418) 644-6855 [email protected] ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 7 sur 44 Horti-Protection inc. 2. INTRODUCTION Le genre Trichoderma regroupe un ensemble de champignons imparfaits saprophytes qui se retrouvent couramment dans le sol, sur le bois mort et les débris végétaux. Trichoderma est un champignon qui décompose naturellement la cellulose et à un degré moindre, la lignine. C’est également un des agents de lutte biologique le plus connu dans le monde et de nombreux travaux de recherche sont en cours afin de fournir aux producteurs l’accès à son potentiel antagoniste. Trichoderma trouverait des applications dans différents secteurs d’activités comme le domaine des petits fruits et dans le secteur serricole (productions horticoles, plantes ornementales et pépinières forestières). La cellulose est le composé organique le plus synthétisé sur la terre. On évalue à plus de 60 à 90 milliards de tonnes par an la quantité produite par les végétaux. C’est également le polymère le plus utilisé (bois de construction, pâte à papier, fibres textiles, etc….). Au niveau de la biosphère, les milliards de tonnes de cellulose synthétisée chaque année sont, malgré sa très grande résistance aux enzymes, dégradés, sinon la biomasse s’accumulerait dangereusement. Dans les forêts, les champignons, souvent associés à des bactéries, assurent une cellulolyse considérable et efficace. La cellulose est composée de monomères de glucose, qui, lorsqu’elle est dégradée, fournit une source de nourriture facilement assimilable par les agents dégradeurs. De plus, c’est une ressource naturelle importante au Québec à cause de notre économie forestière. Cette ressource est à la portée de la main, disponible et à bon marché. Des travaux de recherches portant sur Trichoderma ont été entamés depuis quelques temps et ils ont permis de démontrer que des souches indigènes de Trichoderma avaient un potentiel de lutte intéressant contre les agents pathogènes (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, etc…) dans les cultures serricoles (productions légumières et plantes ornementales) et dans les petits fruits. Afin d’évaluer les aptitudes antagonistes de Trichoderma, il a fallu mettre au point un mode de production de spores de Trichoderma puisqu’il est impossible de le multiplier à l’aide d’un fermenteur. Notre façon de produire la biomasse de Trichoderma est efficace, simple et facilement réalisable. Par contre, dans le but d’améliorer et de stimuler davantage l’activité antagoniste de Trichoderma et lui permettre d’occuper prioritairement les niches écologiques avant l’arrivée des agents pathogènes, qui se doit d’être le créneau de tout agent de lutte biologique, nous désirons raffiner la qualité nutritionnelle de ce milieu de culture en y amendant une source de cellulose. L’objectif général du projet était d’améliorer les qualités nutritionnelles du milieu de culture utilisé pour multiplier Trichoderma, agent de lutte biologique potentiel dans les productions serricoles et dans les petits fruits, afin de maximiser son potentiel antagoniste. Les objectifs spécifiques étaient : 1) Déterminer si l’ajout d’une source de cellulose améliore les qualités nutritionnelles du milieu de culture actuellement utilisé. 2) Déterminer l’effet de la source de cellulose sur le comportement de Trichoderma lorsqu’il est introduit seul dans un substrat en présence uniquement de plantes. 3) Déterminer l’effet du nouveau milieu de culture sur le comportement de Trichoderma lorsqu’il est introduit dans un substrat, en présence d’un agent pathogène et de plantes sensibles. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 8 sur 44 Horti-Protection inc. 3. 3.1 MATÉRIEL ET MÉTHODES Production de la biomasse de Trichoderma En laboratoire, différentes formes de cellulose (grossières, moyennes et raffinées) ont été amendées au milieu de culture actuellement utilisé pour multiplier Trichoderma et comparé à celui-ci. Le champignon a été produit en Pétri. La technique est simple : il suffit de préparer son milieu de culture et de le stériliser. Par la suite, le milieu est versé dans les Pétri et refroidi. Une rondelle de spores de Trichoderma est ensuite déposée au centre de la gélose. Avec ce milieu, la confluence du Pétri est atteinte après six jours. Le milieu conventionnel était composé des ingrédients suivants (/litre) : 200 ml de V-8 nonmodifié, 3 g de carbonate de calcium (CaCO3), 8 g d’agar et 800 ml d’eau, autoclavé pendant 20 min à 121°C, 15 PSI. Ce milieu est semi-solide et doit être manipulé avec soin. À partir de ce milieu, différents tests ont été réalisés en laboratoire afin d’améliorer la rapidité de croissance de Trichoderma soit en ajoutant un ou des ingrédients et/ou en enlevant des ingrédients au milieu conventionnel. Les différentes celluloses testées étaient : 1) cellulose avec des fibres longues et grossières (Sigma), 2) cellulose raffinée (microcristalline de 20 mm, Lab Mat) et 3) cellulose avec des fibres moyennes (Sigma). Pour tous les tests réalisés, 3 répétitions par type de cellulose et pour chaque concentration ont été faites. Les Pétri ont été incubés à la noirceur, à la température de la pièce (22 ± 2°C) et deux mesures de la croissance radiale ont été faites à chaque jour à partir de la deuxième journée d’ensemencement. La confluence du Pétri est atteinte lorsque la croissance radiale mesurée est de 85 mm. 3.2 Tests de confrontation en Pétri Des tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathogènes suivants : Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, P. aphanidermatum et Verticillium dahliae ont été faits in vitro sur deux milieux de culture : 1) PDA + jus V-8 alimenté de 1.5 % de cellulose raffinée, de 0.1% de sucrose et d’eau et 2) PDA + jus V-8 alimenté de 1% de cellulose raffinée, de 0.1% de glucose et d’eau. Le champignon Pyrenochaeta lycopersicis, responsable de la racine liégeuse chez la tomate, n’a pas fait l’objet de cette étude puisqu’il a été impossible d’obtenir une souche du champignon. Le test de confrontation consistait à placer de façon diamétralement opposée sur les milieux retenus, une souche de Trichoderma et une souche de l’agent pathogène à tester. La présence d'une zone d'inhibition au point de contact entre les deux champignons a été notée. L'action de compétition et en particulier l'effet "prédateur" de Trichoderma sur l'agent pathogène, en présence ou en l'absence d'une zone d'inhibition, a également été considéré lors de ce test. L’annexe 1 présente les critères de décision utilisés lors de l’étude. Les tests ont été réalisés à la température de la pièce (22 ±2°C, à la noirceur) et les Pétri ont été répartis aléatoirement. Cinq répétitions par souche ont été faites. Le résultat espéré était que le nouveau milieu de culture favorisait la croissance de Trichoderma au détriment des agents pathogènes. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 9 sur 44 Horti-Protection inc. 3.3 Tests en serre expérimentale En serre expérimentale, la nouvelle formulation pour produire Trichoderma a été comparée à l’ancienne méthode. Les aptitudes antagonistes de Trichoderma ont également été vérifiées lorsque confronté à différents agents pathogènes, toujours en comparant la nouvelle et l’ancienne méthode de production de Trichoderma. Nous avions déterminé, lors d’expériences précédentes, que Trichoderma devait être introduit au substrat avant l’arrivée des agents pathogènes. Dans cette expérience, Trichoderma a mélangé au substrat PRO-MIX BX deux semaines avant l’inoculation des agents pathogènes. Ce délai permet à Trichoderma de se multiplier et de coloniser les niches écologiques avant les agents pathogènes. Seul un arrosage adéquat a été maintenu et une fertilisation (20-20-20) aux deux semaines a été faite. Pour ces expériences, un terreau de culture PRO-MIX BX a été employé et le muflier (Antirrhinum majus), la tomate (Lycopersicon esculentum) et le concombre (Cucumis sativus), ont servi de plantes sensibles, cultivées dans des caissettes de fibres biodégradables. Une caissette de fibres (17 cm x 13 cm) contient environ 1 litre de terreau. Six graines ont été semées par caissette, pour chaque plante. Trois répétitions ont été réalisées. L'expérience s’est déroulée en serre (22 ± 2°C (jour) et 18 ± 2°C (nuit); 16:8 L:N). Les plantes ont observées après 60 jours de croissance. Le dispositif expérimental était un split-plot. Les différents paramètres étudiés pour chaque système étaient : 1) l’apparence des plantules saines ou malades (jaunissement, flétrissement, etc...), 2) la croissance de la partie aérienne (hauteur et poids frais), 3) le pourcentage de germination, 4) le développement du système racinaire, 5) l’observation des symptômes à la surface du système racinaire (nécrose, déformation, etc....), 6) le ré-isolement de Trichoderma du substrat et 7) le ré-isolement de Trichoderma et des agents pathogènes des racines. Les résultats espérés étaient : 1) une efficacité optimale de Trichoderma à la plus faible concentration et 2) toutes les plantes sensibles réagissent de la même façon. Pour réaliser cette expérience, les traitements étaient : J J J J Nouvelle formulation de Trichoderma à une concentration de 106 spores/ml Ancienne formulation de Trichoderma à une concentration de 106 spores/ml Nouvelle formulation de Trichoderma à une concentration de 107 spores/ml Ancienne formulation de Trichoderma à une concentration de 107 spores/ml Pour les confrontations entre Trichoderma et les agents pathogènes, les agents pathogènes suivants ont été retenus selon la culture visée : Tomate : Pythium ultimum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae Concombre : Pythium aphanidermatum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 10 sur 44 Horti-Protection inc. Muflier : Pythium ultimum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae Les racines présentant ou non des symptômes ont été conservées et déposées sur un milieu de culture SNA++ (Solution Nutrient Agar avec antibiotiques) ou PYT (P5ARP) pour les Pythium pour détecter si les agents pathogènes avaient effectivement infecté les plantes. Les Pétri ont été incubés pendant 5 j à 24 ± 2°C, à la noirceur. Les échantillons de sol ont été préparés pour obtenir une dilution 1:10 (10 g de terreau dans 100 ml d’eau) et 100 ml ont été étalés sur un milieu de culture SNA++. Les Pétri ont été incubées 3 à 5 j à 24 ± 2°C, à la noirceur. La présence de Trichoderma sur le milieu de culture a alors été évaluée. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 11 sur 44 Horti-Protection inc. 4. RÉSULTATS ET DISCUSSION 4.1 4.1.1 Production de la biomasse de Trichoderma Expérience #1 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 conventionnel Dans la littérature, il est mentionné que l’ajout d’une source de cellulose au milieu devrait se situer entre 1.5 et 2%. Dans un premier temps, des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.35 et 1.5% ont été amendées au milieu V-8 conventionnel (milieu semi-solide). La figure 1 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. La croissance maximale a été obtenue après 5 jours. Sur Pétri, la croissance de Trichoderma a semblé être affectée par la présence de cellulose puisqu’une alternance de zones concentriques claires et de zones mycéliennes était visible sur la gélose. #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.35 #1 - 1.5 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1 #2 - 1.35 #2 - 1.5 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.35 #3 - 1.5 Taux de croissance journalière (mm) 100 80 60 40 20 0 2 3 4 5 Temps (jour) Figure 1. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide. 4.1.2 Expérience #2 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu conventionnel mais solide Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu V-8 conventionnel mais solide (15 g d’agar ont été ajoutés au lieu de 8). Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 7.05 et variait entre 7.01 et 7.17 pour les différentes formes de cellulose et concentrations. La figure 2 indique les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. Par contre, après 4 jours, la croissance ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 12 sur 44 Horti-Protection inc. radiale maximale était atteinte dans les Pétri alimentés de 0.5% de cellulose à fibres moyennes (#3) et presque atteinte avec 0.5% de la cellulose grossière (#1 - 81 mm). La quantité d’agar supplémentaire n’a pas permis une meilleure croissance de Trichoderma sauf qu’il est plus facile de faire les lectures de la croissance radiale. #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.5 #1 - 2 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1.5 #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.5 #3 - 2 #2 - 1 Taux de croissance journalière (mm) 100 80 60 40 20 0 2 3 Temps (jour) 4 5 Figure 2. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 solide. 4.1.3 Expérience #3 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu à base de pomme de terre (PDA) Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu PDA (milieu solide avec 15 g d’agar / litre). Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 5.70 et variait entre 5.69 et 5.76 pour les différentes formes de cellulose et concentrations. Ce milieu est largement utilisé en laboratoire pour la croissance de divers champignons. La figure 3 indique les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. Par contre, Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après seulement 4 jours. Est-ce que le pH du milieu influencerait le développement du champignon? ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 13 sur 44 Horti-Protection inc. #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.5 #1 - 2 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1.5 #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.5 #3 - 2 #2 - 1 Taux de croissance journalière (mm) 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 Temps (jour) Figure 3. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu PDA. 4.1.4 Expérience #4 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 solide sans carbonate de calcium Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu V-8 solide et en absence de carbonate de calcium. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 4.50 comparativement à 4.44 à 4.65 pour les différentes formes de cellulose et concentrations. La figure 4 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. Par contre, Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après seulement 3 jours. Un milieu acide favorise donc le développement de Trichoderma. Suite à ces deux tests, le carbonate de calcium (CaCO3), qui avait comme fonction de rendre le milieu plus basique, a été banni de la recette de base. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 14 sur 44 Horti-Protection inc. #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.5 #1 - 2 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1.5 #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.5 #3 - 2 #2 - 1 Taux de croissance journalière (mm) 100 80 60 40 20 0 2 Temps (jour) 3 Figure 4. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. 4.1.5 Expérience #5 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu eau et agar Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu eau et agar. Il est connu que les milieux pauvres en éléments nutritifs favorisent la reproduction des spores des champignons afin d’assurer leur survie. C’est ce que nous voulions vérifier avec cette expérience. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 6.05 comparativement à 6.04 à 6.11 pour les différentes formes de cellulose et concentrations. La figure 5 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. De plus, Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après 5 jours et aucune sporulation n’était encore visible sur le milieu. Dans ce cas, la faible valeur nutritive du milieu de culture n’a pas favorisé la croissance et la reproduction de Trichoderma. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 15 sur 44 Horti-Protection inc. #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.5 #1 - 2 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1.5 #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.5 #3 - 2 #2 - 1 Taux de croissance journalière (mm) 100 80 60 40 20 0 2 3 4 5 Temps (jour) Figure 5. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu eau et agar. 4.1.6 Expérience #6 – Effets d’une plus grande concentration de cellulose au milieu V-8 solide - sans carbonate de calcium Différentes concentrations de cellulose (0 – 2.0 – 2.5 – 4.0 et 5.0%) ont été amendées au milieu V-8 solide - sans CaCO3. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 4.44. La figure 6 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après seulement 3 jours. Une plus forte concentration de cellulose n’accélère donc pas la production de spores de Trichoderma puisque le même résultat avait été obtenu avec des quantités plus faibles de cellulose (réf. point 4.1.4). Par contre, avec les celluloses grossière (#1) et fine (#2), la sporulation a été plus intense. 4.1.7 Expérience #7 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus V-8 Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu PDA fait en remplaçant 200 des 1 000 ml d’eau requis par du jus V-8. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 4.76. La figure 7 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après seulement 3 jours. L’apport de fibres par l’ajout de jus V-8 n’influencerait pas le développement de Trichoderma. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 16 sur 44 Horti-Protection inc. #1 - 0 #1 - 2,0 #1 - 2,5 #1 - 4,0 #1 - 5,0 #2 - 0 #2 - 2,0 #2 - 4,0 #2 - 5,0 #3 - 0 #3 - 2,0 #3 - 2,5 #3 - 4,0 #3 - 5,0 #2 - 2,5 Taux de croissance journalière (mm) 100 90 80 70 60 50 40 2 3 Temps (jour) Figure 6. Effet d’une plus grande concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. Concentration #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.5 #1 - 2 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1 #2 - 1.5 #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.5 Taux de croissance journalière (mm) 100 90 80 70 60 50 2 Temps (jour) 3 Figure 7. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu PDA + jus V-8. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 17 sur 44 Horti-Protection inc. 4.1.8 Expérience #8 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 semisolide – sans CaCO3 Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu V-8 conventionnel semi-solide mais en absence de CaCO3. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 4.38. La figure 8 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.5 #1 - 2 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1.5 #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.5 #3 - 2 #2 - 1 Taux de croissance journalière (mm) 100 90 80 70 60 50 2 Temps (jour) 3 Figure 8. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu V-8 semi-solide sans CaCO3. 4.1.9 Expérience #9 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu ½ PDA + jus V-8 Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu ½ PDA fabriqué avec 200 ml de jus V-8. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 4.63. La figure 9 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 18 sur 44 Horti-Protection inc. #1 - 0 #1 - .5 #1 - 1 #1 - 1.5 #1 - 2 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1.5 #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - 1.5 #3 - 2 #2 - 1 Taux de croissance journalière (mm) 100 90 80 70 60 50 2 Temps (jour) 3 Figure 9. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de Trichoderma - milieu ½ PDA + jus V-8. Suite à ces différents tests, il est clairement apparu que le carbonate de calcium devait être éliminé du milieu, que des concentrations plus élevées de cellulose n’étaient pas plus avantageuses et qu’un milieu solide permettait une meilleure croissance que le milieu semiliquide. De tous ces tests, le temps de croissance a pu être raccourci de 2 jours, ce qui est nonnégligeable. Par contre, les essais réalisés ne permettaient pas encore de déterminer quel type de cellulose était la plus efficace, ni à quelle concentration. Le tableau 1 schématise les résultats obtenus lors des différentes expériences. Dans la littérature, il est également recommandé d’ajouter des substances telles du glucose, sucrose, glycérol, des peptones, etc… afin de stimuler le développement de Trichoderma. Par contre, ces substances ne doivent pas dépasser 10% de la concentration de cellulose présente et idéalement, le pH doit être maintenu entre 3 et 3.5. Les tests qui ont le mieux réussi (en gras dans le tableau 1) ont été repris en ajoutant une dose de sucrose ou de glucose puisque ce sont deux ingrédients peu coûteux. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 19 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 1. Synthèse des observations effectuées lors des différentes expérimentations réalisées afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma. Milieu de culture avec présence de cellulose Nombre de jours pour atteindre la croissance radiale maximale en Pétri V-8 semi-solide avec CaCO3 5 V-8 solide avec CaCO3 5 Eau + agar 5 PDA 4 V-8 solide sans CaCO3 et concentration +++ de cellulose V-8 semi-solide sans CaCO3 3 V-8 solide sans CaCO3 3 PDA + jus V-8 sans CaCO3 3 ½ PDA + jus V-8 sans CaCO3 3 3 croissance radiale moyenne après 2 jours (mm) rep 1 rep 2 rep 3 --------50 52 51 54 54 55 54 54 54 58 59 58 50 47 48 Légende : --- : n / a car vérifié seulement avec ceux qui ont atteint la croissance radiale maximale après 3 jours 4.1.10 Expérience #10 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 semi-solide et au milieu ½ PDA + jus V-8 Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) a été amendé seul au milieu V-8 semi-solide et au milieu ½ PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vérifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Après la stérilisation, le pH a été ajusté entre 3 et 3.5 pour la moitié des Pétri de chaque système. Le tableau 2 résume les résultats obtenus pour les pH et indique la croissance radiale obtenue après 2 j; le champignon ayant atteint la confluence du Pétri au troisième jour. Trichoderma a eu une meilleure croissance sur le milieu où le pH n’était pas ajusté et la croissance a été légèrement supérieure avec la source de sucrose. Sur milieu V-8 semi-solide, la croissance était plus diffuse que sur le milieu ½ PDA + jus V-8. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 20 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 2. Comparaison des pH obtenus après ajustement ou non et l’ajout d’une source de glucose ou de sucrose - milieux de culture V-8 semi-solide et ½ PDA + jus V-8. Milieu de culture SANS cellulose V-8 semi-solide + glucose V-8 semi-solide + sucrose ½ PDA + jus V-8 + glucose ½ PDA + jus V-8 + sucrose pH normal / croissance radiale moyenne après 2 j pH ajusté / croissance radiale moyenne après 2 j écart de pH 4.45 47 3.29 41 1.16 4.44 47 3.41 40 1.03 4.68 48 3.48 40 1.20 4.66 52 3.41 40 1.25 4.1.11 Expérience #11 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 solide Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) a été amendé seul au milieu V-8 solide afin de vérifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Le pH n’a pas été ajusté. Même s’il n’y a pas de différence significative entre les deux sources de sucres, les résultats obtenus avec le sucrose sont encore légèrement supérieurs à ceux obtenus avec le glucose (tab. 3). La vitesse de croissance est un paramètre important dans le choix d’un agent de lutte biologique afin de favoriser son installation et en ce sens, le sucrose permettrait une installation plus rapide de Trichoderma que le glucose. Tableau 3. Effet d’une source d’hydrate de carbone sur la croissance de Trichoderma – milieu V-8 solide. Milieu de culture SANS cellulose V-8 solide + glucose V-8 solide + sucrose croissance radiale après 1 j croissance radiale après 2 j croissance radiale après 3 j 20 49 85 23 52 85 4.1.12 Expérience #12 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté d’une source de cellulose Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) et différentes sources et concentrations de cellulose ont été amendés au milieu PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vérifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Le pH n’a pas été ajusté. La figure 10 montre les résultats obtenus. Même s’il n’y a pas de différence significative entre les deux sources de sucres, les résultats obtenus avec le ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 21 sur 44 Horti-Protection inc. sucrose sont encore légèrement supérieur à ceux obtenus avec le glucose (fig. 10). La cellulose grossière (#1) a toujours donné des résultats inférieurs à ceux obtenus avec les celluloses raffinées (#2) et de fibres moyennes (#3). Pour les tests subséquents, elle a été abandonnée. Le tableau 4 résume le comportement de Trichoderma, sur différents milieux, lorsqu’il croît en présence d’une source de glucose ou de sucrose. Suite à ces tests, le milieu PDA + Jus V-8 offre les meilleures conditions de croissance pour Trichoderma. C’est ce milieu qui a été retenu et il a, par la suite, été testé à avec différentes concentrations des celluloses #2 (raffinée) et #3 (moyennes). Taux de croissance journalière (mm) 2 j-g 3 j-g 2 j-s 3 j-s 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 #1 - #1 - #1 - #1 - #1 - #2 - #2 - #2 - #2 - #2 - #3 - #3 - #3 - #3 - #3 0 .5 1 1.5 2 0 .5 1 1.5 2 0 .5 1 1.5 2 Concentration (%) et type de cellulose Figure 10. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source d’hydrate de carbone sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 22 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 4. Synthèse des observations effectuées lors des différentes expérimentations réalisées afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma. Milieu de culture SANS cellulose V-8 semi-solide + glucose Nombre de jours pour atteindre la croissance radiale maximale en Pétri 3 V-8 semi-solide + sucrose 3 ½ PDA + Jus V-8 + glucose 3 ½ PDA + Jus V-8 + sucrose 3 PDA + Jus V-8 + glucose 3 PDA + Jus V-8 + sucrose 3 V-8 solide + glucose 3 V-8 solide + sucrose 3 croissance radiale moyenne après 2 jours (mm) 48 45 48 46 46 48 47 50 46 53 51 52 56 57 57 61 60 63 50 48 48 52 51 53 4.1.13 Expérience #13 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté d’une source de cellulose Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) et deux sources et différentes concentrations de cellulose ont été amendées au milieu PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vérifier leur action sur la croissance de Trichoderma. Six répétitions par traitement ont été faites. Le pH n’a pas été ajusté. La figure 11 montre les résultats obtenus. Même s’il n’y a pas de différence significative entre les deux sources de sucres, les résultats obtenus avec le glucose sont encore légèrement supérieur à ceux obtenus avec le sucrose (fig. 11). L’ajout d’une source de sucre au milieu ne stimule pas toujours Trichoderma comme en fait foi la figure 11. Lorsque du glucose ou du sucrose est ajouté en absence de cellulose, la croissance de Trichoderma est moindre dans certains cas. Avec la cellulose #2, le sucrose donne de meilleurs résultats que le glucose sauf avec 1 et 2% tandis qu’avec la cellulose #3, c’est le glucose qui donne de meilleurs résultats sauf à 1.5%. Visuellement sur les Pétri, le témoin sucrose (#3-0) avait une sporulation dense tout comme les traitements #2g - 1% et #2s – 1.5%. Suite à ce test, les trois traitements suivants ont été retenus : cellulose #2 à 1% + 0.1% glucose; cellulose #2 à 1.5% + 0.1% sucrose et cellulose #3 à 1.5% + 0.1% sucrose. Ils ont fait l’objet d’un autre test. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 23 sur 44 Horti-Protection inc. Taux de croissance journalière (mm) 2 j-g 3 j-g 2 j-s 3 j-s 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 #2 - 0 #2 - .5 #2 - 1 #2 - #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - #3 - 2 Tem 1.5 1.5 PDAV8 Concentration (%) et type de cellulose Figure 11. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source d’hydrate de carbone sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8. 4.1.14 Expérience #14 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté de la cellulose raffinée (#2) ou à fibres moyennes (#3) Les traitements 1) cellulose #2 à 1% + 0.1% glucose, 2) cellulose #2 à 1.5% + 0.1% sucrose et 3) cellulose #3 à 1.5% + 0.1% sucrose ont été étudiés plus attentivement sur un milieu PDA + 200 ml de jus V-8. Six répétitions par traitement ont été faites. Le pH n’a pas été ajusté. Le tableau 5 montre les résultats obtenus. Visuellement sur les Pétri, la sporulation était moindre dans le traitement #3 (1.5%) – sucrose que dans le témoin sucrose et le traitement #2 (1.5%) + sucrose. Pour les tests de confrontation en Pétri, les traitements cellulose raffinée (#2 - 1.5%) + sucrose et cellulose raffinée (#2 - 1%) + glucose ont été conservés. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 24 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 5. Effet d’une source d’hydrate de carbone et de cellulose sur la croissance de Trichoderma – milieu PDA + jus V-8. Milieu de culture et type de cellulose croissance radiale croissance radiale croissance radiale croissance radiale après 2 j après 3 j après 2 j après 3 j glucose glucose sucrose sucrose Témoin PDA + jus V8 47 85 47 85 46 85 47 85 47 85 --- --- cellulose #2 – 1.5% - s --- --- 50 85 cellulose #3 – 1.5% - s --- --- 44 85 Tem cellulose #2 – 1% - g 4.2 4.2.1 Test de confrontation en Pétri Expérience #1 - Tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathogènes sur deux milieux de culture Dans un premier temps, la vitesse de croissance des agents pathogènes et de Trichoderma a été déterminée et elle est présentée au tableau 6. Trichoderma atteint la confluence du Pétri 3 jours après son ensemencement et son taux de croissance moyen journalier est de 14,2 mm. Pythium croit au même rythme que Trichoderma. Rhizoctonia solani doit être déposé sur le milieu de culture 1 journée avant Trichoderma tandis que Verticillium dahliae le sera 18 jours avant Trichoderma. Cet agent pathogène pousse très lentement in vitro ce qui pourrait favoriser l’agent de lutte biologique Trichoderma dans le contrôle de ces maladies. Par contre, dans le cas de Pythium et R. solani, la lutte devrait être plus intense puisqu’ils ont un taux de croissance similaire. Dans ces cas, la colonisation rapide des niches écologiques sera déterminante. Tableau 6. Taux de croissance moyen journalier (mm) des champignons pathogènes et de l’agent de lutte biologique Trichoderma. Champignon Trichoderma Pythium ultimum Pythium aphanidermatum Rhizoctonia solani Verticillium dahliae Croissance radiale moyenne journalière (mm) 14.2 14.2 14.2 10.7 2.0 Dépôt de l’agent pathogène (# jour) sur le milieu de culture AVANT Trichoderma 0 0 0 1 18 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 25 sur 44 Horti-Protection inc. Suite aux confrontations, Trichoderma a fait l'objet d'une "analyse multicritère simple". Au total, sept critères de décision qualitatifs et quantitatifs ont été déterminés et ces critères ont permis d'évaluer la performance de Trichoderma à la confrontation. Le tableau 7 présente les critères de décision retenus pour l'analyse. Tableau 7. Identification et pondération des critères de décision sélectionnés pour évaluer la performance de Trichoderma à la confrontation en Pétri contre différents agents pathogènes. Intervalle des poids 0 à 20 0à9 0à5 0à2 0à1 0à4 0à3 Critères de décision* Temps (jour) requis pour obtenir la zone de contact entre les deux champignons La croissance radiale mesurée (mm) à partir du centre de la pastille de gélose de Trichoderma jusqu'à la zone de contact Zone d'inhibition entre les deux champignons (intensité de la coloration) Sporulation différente et/ou dense au contact entre les deux champignons Zone claire au contact entre les deux champignons Envahissement de Trichoderma sur l'agent phytopathogène ou vice et versa Intensité de la sporulation de Trichoderma sur l'agent phytopathogène ou vice et versa Remarques : * Consulter l'annexe 1 pour connaître le barème de pondération employé lors de l'évaluation. Cette pondération a été faite de façon à favoriser l’action de Trichoderma sur les agents pathogènes. Le poids le plus grand étant celui du meilleur lors de la confrontation. La confrontation a eu lieu en tenant compte de la vitesse de croissance des champignons, vitesse déterminée lors du test précédent. Lors de ces tests in vitro, il apparaît que Trichoderma a une bonne activité antagoniste contre les champignons étudiés (tab. 8). Le milieu cellulose #2 – 1.5% + sucrose favorise le plus Trichoderma. C’est le milieu qui a été retenu pour les tests en serre expérimentale. La source de sucre seule n’influence pas réellement le comportement et la croissance des champignons étudiés. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 26 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 8. Évaluation, in vitro, de l’activité antagoniste de Trichoderma vis-à-vis les agents pathogènes. Confrontation PDA(V-8) T20 vs P. ultimum T20 vs P. aphanidermatum T20 vs R. solani T20 vs V. dahliae 4.3 +22 +22 +23 +20 Milieu de culture PDA(V-8) PDA(V-8) cellulose #2 cellulose #2 +g +s – 1% + g – 1.5% + s +22 +22 +21 +23 +22 +22 +19 +22 +23 +20 +24 +20 +22 +25 +25 +25 Tests en serre expérimentale Trichoderma titrait soit pour 106 ou 107 spores/ml tandis que pour les agents pathogènes, les concentrations étaient de 3 x 104 (R. solani), 1,6 x 105 (V. dahliae), 2 x 105 (P. aphanidermatum) et 5 x 105 spores/ml (P. ultimum). Le dispositif expérimental est présenté à l’annexe 2. Les remarques suivantes doivent être considérées : 1) La hauteur minimale et maximale ont été déterminées lors de l’évaluation des plants mais afin de mieux visualiser l’influence des traitements sur ce paramètre de croissance, une hauteur moyenne est considérée. 2) Le poids sec de la masse aérienne des plants n’a pas été évaluée, tel que prévu au projet, considérant que dans la grande majorité des cas, le poids sec représente 10% de la masse foliaire humide et ne permet pas de déterminer de différence significative par rapport à cette dernière. De plus, au moment de la récolte, le séchoir était hors d’usages. Le tableau 9 présente les agents pathogènes et Trichoderma isolés à partir des racines échantillonnées tandis que le tableau 10 indique si Trichoderma a été isolé à partir du sol ramassé lors de l’évaluation des plantes. Des racines ont été échantillonnées même si aucun symptôme n’était visible sur le système racinaire. En général, hormis les symptômes attribués à la fonte des semis, peu de symptômes ont été observés sur les racines des plantes, la plupart de ces cas, un jaunissement des racines était noté (qui peut également être attribué à l’asphyxie racinaire). Trichoderma a été observé dans tous les échantillons de sol mis sur milieu de culture (tab. 10). 4.3.1 Concombre Concombre vs Trichoderma Lorsque Trichoderma est amendé au substrat en l’absence d’agents pathogènes, il permet une meilleure croissance que le témoin dans tous les traitements et pour tous les paramètres de croissance. Ce fait est particulièrement important dans les traitements où Trichoderma a été cultivé sur le nouveau milieu de culture à base de cellulose (sur la figure = N) et à une dose de 106 ou 107 cfu/ml (fig. 12). De ce fait, nous pouvons supposer que des résultats intéressants ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 27 sur 44 Horti-Protection inc. puissent être obtenus à une concentration de Trichoderma de 106 cfu/ml, ce qui confirme des résultats obtenus antérieurement dans un autre projet. Hauteur moy (mm) 200 % germination 162 155 143 Poids frais (g) 169 149 150 100 94 100 43 39 50 100 100 46 100 43 48 0 Concombre T20-106-A T20-106-N T20-107-A T20-107-N Traitements Figure 12. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en absence d’agents pathogènes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Concombre vs R. solani Le témoin négatif R. solani a donné des résultats légèrement inférieurs au «témoin plante». Pourtant à l’isolement des racines, R. solani a été détecté en grande quantité sur les milieux de culture, tout comme Trichoderma (tab. 9). La souche de R. solani n’a peut-être pas eu le temps de démontrer pleinement son agressivité sur les racines des plants de concombre. De ce fait, tous les traitements ont donné des résultats supérieurs lorsque comparé au témoin R. solani. Si R. solani a été actif dans le substrat, nous pouvons supposer que Trichoderma a permis d’avoir une croissance normale des plants puisque des résultats égaux ou légèrement supérieurs à ceux obtenus avec la plante seule ont été enregistrés. Lorsque Trichoderma est amendé au substrat contaminé par R. solani à une concentration de 107 cfu/ml, les résultats sont légèrement supérieurs à tous les traitements. Le traitement «Rs-107-N» ayant un faible avantage sur l’ancienne formulation du milieu de culture «Rs-107-A» (fig. 13). ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 28 sur 44 Horti-Protection inc. Hauteur moy (mm) 175 143 147 150 125 100 75 50 % germination 39 100 100 94 150 143 129 94 Poids frais (g) 100 100 41 42 42 37 153 44 25 0 Concombre Rs Rs-106-A Rs-106-N Rs-107-A Rs-107-N Traitements Figure 13. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en présence de Rhizoctonia solani. Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Concombre vs V. dahliae Le témoin négatif V. dahliae a donné des résultats inférieurs au «témoin plante» malgré le fait qu’à l’isolement des racines, V. dahliae avait été détecté dans seulement 3 des 5 traitements (tab. 9). Tous les traitements ont donné des résultats supérieurs lorsque comparé au témoin V. dahliae et au «témoin plante» sauf dans le cas des traitements impliquant la concentration 107 cfu/ml. Les résultats sont alors égaux au «témoin plante» (fig. 14). La présence de Trichoderma a été notée dans tous les traitements lors de l’isolement (sauf dans le traitement témoin). Le traitement «Vd-106-N» semble assuré un bon contrôle de V. dahliae sur les racines des plants de concombre. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 29 sur 44 Horti-Protection inc. Hauteur moy (mm) % germination 250 209 200 143 152 150 141 119 94 94 100 94 39 50 0 Poids frais (g) Concombre Vd Vd-106-A 100 100 83 47 43 37 142 Vd-106-N 44 Vd-107-A 39 Vd-107-N Traitements Figure 14. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en présence de Verticillium dahliae. Vd = Verticillium dahliae; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Concombre vs P. aphanidermatum Le témoin négatif P. aphanidermatum a donné des résultats légèrement inférieurs au «témoin plante», ce qui peut s’expliquer par l’absence ou la faible agressivité de P. aphanidermatum dans le sol puisque lors de l’isolement des racines, Pythium a été détecté dans seulement 1 des 5 traitements (tab. 9). De ce fait, tous les traitements ont donné des résultats supérieurs aux témoins V. dahliae et au «témoin plante» (fig. 15). La concentration «Pa-106-N» semble assurer un meilleur contrôle du champignon que les trois autres traitements. Hauteur moy (mm) % germination 200 143 100 50 94 168 153 139 150 100 78 39 Poids frais (g) 94 47 34 154 151 94 45 83 47 35 0 Concombre Pa Pa-106-A Pa-106-N Pa-107-A Pa-107-N Traitements Figure 15. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en présence de Pythium aphanidermatum. P.a. = Pythium aphanidermatum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 30 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 9. Isolement des agents pathogènes et de Trichoderma à partir des systèmes racinaires présentant ou non des symptômes visuels de la maladie. Traitements Témoin Trichoderma Trichoderma -106-A Trichoderma -106-N Trichoderma -107-A Trichoderma -107-N R. solani R. solani -106-A R. solani -106-N R. solani -107-A R. solani 107-N V. dahliae V. dahliae -106-A V. dahliae -106-N V. dahliae -107-A V. dahliae -107-N P. ultimum P. ultimum -106-A P. ultimum -106-N P. ultimum 107-A P. ultimum -107-N P. aphanidermatum P. aphanidermatum -106-A P. aphanidermatum -106-N P. aphanidermatum 107-A P. aphanidermatum -107-N Concombre --T20 T20 T20 T20 T20 R.s. + F T20 + R.s. + F T20 + R.s. + F T20 + R.s. + F T20 + R.s. + F V.d. T20 + V.d. T20 + V.d. T20 + F T20 n/a n/a n/a n/a n/a F --F P.a. + F F Plantes Tomate --T20 T20 T20 T20 T20 R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. V.d. ------T20 P.u. --P.u. --P.u. n/a n/a n/a n/a n/a Muflier --T20 T20 T20 T20 T20 R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. T20 + R.s. V.d. --------P.u. --P.u. --P.u. n/a n/a n/a n/a n/a Légende n / a = ne s’applique pas --- = aucune détection du champignon recherché R.s. = Rhizoctonia solani V.d. = Verticillium dahliae P.u. = Pythium ultimum P.a. = Pythium aphanidermatum F = Fusarium spp. T20 = Trichoderma MAUL-20 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 31 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 10. Isolement de Trichoderma et des agents pathogènes à partir d’échantillons de sol. Traitements Témoin Trichoderma Trichoderma -106-A Trichoderma -106-N Trichoderma -107-A Trichoderma -107-N R. solani R. solani -106-A R. solani -106-N R. solani -107-A R. solani 107-N V. dahliae V. dahliae -106-A V. dahliae -106-N V. dahliae -107-A V. dahliae -107-N P. ultimum P. ultimum -106-A P. ultimum -106-N P. ultimum 107-A P. ultimum -107-N P. aphanidermatum P. aphanidermatum -106-A P. aphanidermatum -106-N P. aphanidermatum 107-A P. aphanidermatum -107-N Concombre --T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 n/a n/a n/a n/a n/a T20 T20 T20 T20 T20 Plantes Tomate --T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 n/a n/a n/a n/a n/a Muflier --T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 T20 n/a n/a n/a n/a n/a Légende n / a = ne s’applique pas --- = aucune détection du champignon recherché P. aphanidermatum = Pythium aphanidermatum T20 = Trichoderma MAUL-20 4.3.2 P. ultimum = Pythium ultimum R. solani = Rhizoctonia solani V. dahliae = Verticillium dahliae Tomate Tomate vs Trichoderma Lorsque Trichoderma est amendé au substrat en l’absence d’agents pathogènes, il permet une bien meilleure croissance des plants que la plante seule et particulièrement dans le traitement où ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 32 sur 44 Horti-Protection inc. Trichoderma a été cultivé sur le nouveau milieu de culture à base de cellulose (sur la figure = N) et appliqué à une concentration de 106 cfu/ml (fig. 16). Par contre, le pourcentage de germination des plantes est inférieur au «témoin plante» dans tous les traitements et particulièrement dans le traitement «T20-107-A». Hauteur moy (mm) 200 150 100 160 % germination 161 50 89 78 19 19 151 146 132 94 Poids frais (g) 83 72 25 25 22 0 Tomate T20-106-A T20-106-N T20-107-A T20-107-N Traitements Figure 16. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en absence d’agents pathogènes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Tomate vs R. solani Dans le témoin négatif R. solani, le champignon a été très actif, affectant grandement le développement des plants lorsque comparé au «témoin plante». Tous les traitements ont donné des résultats supérieurs au témoin R. solani mais inférieurs au «témoin plante». La souche de R. solani a été particulièrement active sur les plants de tomate causant 11 cas de fontes de semis, particulièrement dans l’ancienne formulation du milieu de culture (sur la figure = A) et dans le témoin. Trichoderma a eu à combattre activement cet agent pathogène mais aucune perte de plants attribuables à Rhizoctonia n’a été enregistrée dans le traitement «Nouvelle formulation du milieu de culture (cellulose)», ce qui est de bon augure (fig. 17). Par contre, le pourcentage de germination a été assez faible dans tous les traitements lorsque comparé au «témoin plante». Lors de l’isolement des racines, Trichoderma et R. solani ont été observés abondamment sauf que Trichoderma semble avoir de la difficulté à lutter efficacement contre cet agent pathogène. Cas de fontes de semis observés sur les plants de tomate Tomate de serre : L 3 cas dans le traitement R. solani - ancienne formulation @ 106 spores/ml L 4 cas dans le traitement R. solani - ancienne formulation @ 107 spores/ml L 4 cas dans le traitement témoin R. solani ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 33 sur 44 Horti-Protection inc. Hauteur moy (mm) 150 % germination 132 120 Poids frais (g) 125 94 96 93 90 73 54 60 0 22 19 30 44 1 Tomate RS 39 28 22 9 1 Rs-106-A Rs-106-N 5 2 Rs-107-A Rs-107-N Traitements Figure 17. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de Rhizoctonia solani. Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Tomate vs V. dahliae Tous les résultats sont similaires au témoin V. dahliae et légèrement supérieurs au «témoin plante», la souche de V. dahliae n’ayant sûrement pas été très active dans le sol puisque aucune différence n’a été enregistrée entre les traitements. Selon le tableau 9, Verticillium a été observé uniquement dans le témoin V. dahliae et même Trichoderma n’a pas ou peu été observé. Hauteur moy (mm) 160 120 144 132 94 % germination 149 141 89 Poids frais (g) 89 146 94 83 80 56 40 0 150 19 Tomate Vd 27 21 19 Vd-106-A Vd-106-N 16 Vd-107-A 21 Vd-107-N Traitements Figure 18. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de Verticillium dahliae. Vd = Verticillium dahliae; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 34 sur 44 Horti-Protection inc. Tomate vs P. ultimum Pythium ultimum a été isolé des racines du témoin P. ultimum et des traitements «Pu-106-N» et «Pu-107-N». Hors, lorsqu’on consulte la figure 19, ce sont les 3 traitements qui ont le mieux fonctionné. Pythium aurait-il eu un effet de stimulateur de croissance dans ces cas? Est-ce l’effet de la nouvelle formulation du milieu de culture? Ou un effet de Trichoderma sur la plante puisque ces valeurs se rapprochent de celles observées lorsque seul Trichoderma est ajouté au substrat (fig. 16). Par contre, tous les traitements ont été supérieurs au «témoin plante». Hauteur moy (mm) 200 150 % germination 170 94 100 162 149 132 50 154 147 94 78 72 20 19 Poids frais (g) 89 61 17 18 24 28 0 Tomate Pu Pu-106-A Pu-106-N Pu-107-A Pu-107-N Traitements Figure 19. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de Pythium ultimum. Pu = Pythium ultimum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. 4.3.3 Muflier Muflier vs Trichoderma Trichoderma ne semble pas autant stimuler la croissance du muflier lorsque comparé au concombre (fig. 12) et à la tomate (fig. 16), et même à la concentration de 106 cfu/ml, les résultats sont inférieurs ou égaux au témoin plante. Pourtant, lorsqu’on consulte le tableau 9, Trichoderma était présent au niveau racinaire. Le traitement «T20-107-A» semble le plus efficace. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 35 sur 44 Horti-Protection inc. Hauteur moy (mm) % germination Poids frais (g) 120 99 84 89 100 74 80 85 83 72 97 89 78 60 40 5 20 0 Muflier 9 5 T20-106-A T20-106-N 9 8 T20-107-A T20-107-N Traitements Figure 20. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en absence d’agents pathogènes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Muflier vs R. solani Sur le muflier, R. solani semble actif tandis que le pouvoir de compétition de Trichoderma envers Rhizoctonia semble amenuisé car dans tous les traitements, les résultats sont inférieurs au témoin R. solani et au «témoin plante», laissant présager une forte agressivité de R. solani sur les racines des plants. Pourtant, le tableau 9 spécifie une présence importante de R. solani et de Trichoderma lors de l’isolement racinaire. Peut-être que Trichoderma a lutté activement contre Rhizoctonia, au détriment de protéger les racines? Hauteur moy (mm) 100 84 89 76 80 % germination Poids frais (g) 83 70 67 63 61 61 72 72 62 60 40 20 5 2 4 5 3 4 0 Muflier RS Rs-106-A Rs-106-N Rs-107-A Rs-107-N Traitements Figure 21. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de Rhizoctonia solani. Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 36 sur 44 Horti-Protection inc. Muflier vs V. dahliae Verticillium a semblé agir seulement dans le témoin V. dahliae car dans les autres traitements, les résultats sont supérieurs au témoin V. dahliae et égaux ou supérieurs au «témoin plante». De plus, la présence de V. dahliae a été observée uniquement dans le témoin lors des isolements racinaires (tab. 9). Dans ces cas, on peut supposer une action de Trichoderma au niveau des racines pour combattre l’agent pathogène. Par contre, peu de différences ont été obtenues entre les traitements mais le traitement «Vd-106-N» semble un peu plus efficace que les autres. Hauteur moy (mm) 120 94 84 89 90 81 73 % germination 96 94 Poids frais (g) 100 89 86 82 89 60 30 0 6 5 Muflier Vd 10 6 Vd-106-A Vd-106-N 8 Vd-107-A 5 Vd-107-N Traitements Figure 22. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de Verticillium dahliae. Vd = Verticillium dahliae; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose.Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Muflier vs P. ultimum Tous les traitements ont démontré des rendements supérieurs au témoin Pythium. Par contre, lorsque comparé au «témoin plante», les résultats sont soit inférieurs. Il y a sûrement une lutte entre les deux antagonistes car les résultats sont quand même supérieurs à ceux obtenus avec le témoin Pythium sauf que le développement du muflier semble affecté. Des cas de fontes de semis ont d’ailleurs été notés dans le témoin Pythium et dans la formulation «Pu-106-A». Cas de fontes de semis observés sur les plants de muflier Muflier : L 2 cas dans le traitement témoin Pythium ultimum L 1 cas dans le traitement P. ultimum - ancienne formulation @ 106 spores/ml ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 37 sur 44 Horti-Protection inc. Hauteur moy (mm) % germination Poids frais (g) 120 84 89 83 90 83 77 78 67 81 78 72 72 83 60 30 0 5 Muflier Pu Pu-106-A Pu-106-N 5 6 6 5 4 Pu-107-A Pu-107-N Traitements Figure 23. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de Pythium ultimum. Pu = Pythium ultimum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose.Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose. Les tableaux 11 et 12 résument les résultats obtenus lorsqu’on compare les traitements effectués au témoin négatif ou au «témoin plante». Trichoderma devrait être produit sur un milieu de culture contenant de la cellulose (milieu de culture sous la Nouvelle formulation) et la concentration 106 cfu/ml devrait être privilégiée. Dans le cas des tandems «Tomate – R. solani» et «Muflier – Pythium», les résultats négatifs obtenus lorsque comparé au témoin plante suggère que Trichoderma a de la difficulté à lutter contre l’agent pathogène et que la lutte s’effectue au détriment de la plante puisque que son développement est ralenti. Tableau 11. Synthèse des résultats obtenus en serre expérimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au témoin négatif. Agent biologique ou pathogène Trichoderma R. solani V. dahliae P. ultimum ou aphanidermatum Légende Concombre Tomate Muflier +++ 106 N +++ 107 N +++ 106 N +++ 106 N +++ 106 N +++ 106 N ----- +++ 107 A --+++ 106 N +++ 106 N +++ = Les traitements ont donné des résultats supérieurs au témoin négatif --- = Les traitements ont donné des résultats inférieurs au témoin négatif 106 = centration de Trichoderma N = Nouveau milieu de culture à base de cellulose A = Ancienne formulation du milieu de culture ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 38 sur 44 Horti-Protection inc. Tableau 12. Synthèse des résultats obtenus en serre expérimentale selon la plante, la formulation du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au «témoin plante». Agent biologique ou pathogène Trichoderma Concombre Tomate Muflier +++ +++ +++ R. solani +++ --- --- V. dahliae +++ --- +++ P. ultimum ou aphanidermatum +++ +++ --- Légende +++ = Les traitements ont donné des résultats supérieurs au «témoin plante» --- = Les traitements ont donné des résultats inférieurs au «témoin plante» ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 39 sur 44 Horti-Protection inc. 5. CONCLUSIONS La composition d’un milieu de culture pour cultiver les champignons est un facteur important puisqu’elle influence et la quantité et la qualité des spores. Pour Trichoderma, il était donc primordial d’améliorer la qualité nutritionnelle du milieu de base employé pour sa multiplication. Suite à ce projet, il apparaît que Trichoderma peut être cultivé en ajoutant au milieu de culture une source de cellulose. En se dégradant, celle-ci libère du glucose qui est facilement assimilable pour l’agent dégradeur, dans ce cas-ci, Trichoderma. La cellulose raffinée (microcristalline; 22 microns) a fourni de meilleures conditions de croissance que les celluloses de type grossière ou moyenne. En incorporant également une source de sucre au milieu de base, Trichoderma semble bénéficier d’une source nutritive supplémentaire, le rendant encore plus performant. La modification du milieu de culture de base a également permis de supprimer la source de carbonate de calcium qui se trouvait à élever le pH et à ralentir le développement de Trichoderma. Ainsi, le nouveau milieu nutritif pour cultiver Trichoderma se compose de : PDA (15 g / l), 200 ml de jus V8 non-modifié, 1,5% de cellulose de type raffinée, 0,1% de sucrose et de 800 ml d’eau distillée par litre de milieu. Selon la plante, Trichoderma est efficace contre la majorité des agents pathogènes testés in vitro et en serre expérimentale. Trichoderma croît également très rapidement sur un milieu de culture, ce qui devrait l’avantager lors des confrontations in situ et pour la colonisation rapide des niches écologiques. Trichoderma devra être ajouté au substrat à une concentration de 106 cfu/g de sol. Trichoderma, lorsqu’il est ajouté au substrat, n’est pas pathogène pour les plante; il peut même stimuler le développement de celles-ci lorsqu’il est appliqué à une concentration supérieure à 106 cfu/g de sol. Pour le producteur, il est plus avantageux de permettre à l’agent de lutte biologique de s’établir à priori dans les substrats avant l’arrivée des agents pathogènes. En permettant à Trichoderma de coloniser la rhizosphère en premier lieu, celui-ci pourra créer plus facilement son manchon protecteur autour du système racinaire empêchant ainsi, aux différents agents pathogènes potentiels, l’accès aux sites recherchés. Par le fait même, la répression de l’ennemi à combattre est facilitée. Par contre, dans le cas de Pythium chez le muflier et de Rhizoctonia chez la tomate, la lutte avec Trichoderma semble plus ardue puisque les traitements ont donné des résultats inférieurs au «témoin plante» même s’ils avaient été supérieurs lorsque comparé au témoin négatif. Chez la tomate, la lutte semble également inefficace lorsque Verticillium est présent tandis que chez le muflier, la même situation est observée avec Rhizoctonia. Dans ces deux cas, la croissance des plantes est ralentie. La présence d’un agent de lutte biologique dans un terreau : § § § § § Favorise le développement de la plante; Assure une protection accrue du système racinaire; Prévient des pertes de rendement pour le producteur; Diminue l’utilisation de pesticides chimiques de synthèse utilisés pour combattre les agents pathogènes; Réduit la pollution de l’environnement. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 40 sur 44 Horti-Protection inc. Annexe 1. Barème de pondération employé lors de l'évaluation de Trichoderma suite au test de confrontation en Pétri. Critères de décision 1. Temps requis pour obtenir la zone de contact Temps (jours) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Poids associé 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 2. Mesure (mm) de la zone de contact * Mesure (mm) 0-10 Poids associé 9 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 8 7 6 5 4 3 2 1 * La croissance radiale mesurée (mm) à partir du centre de la pastille de gélose du Trichoderma jusqu’à la zone de contact entre les deux champignons (Trichoderma et l'agent pathogène). Le diamètre d'une boîte de Pétri étant de 85 mm. 3. Zone d’inhibition (intensité de la coloration)** Coloration Poids aucune 0 jaune très pâle - pâle 1 + 2 ++ 3 +++ 4 ++++ 5 ** La présence de la zone d’inhibition entre les deux champignons (Trichoderma et l'agent pathogène) à l’étude est notée par l’intensité de la coloration à la zone de contact (aucune coloration à orange en passant par différentes intensités de jaune) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 41 sur 44 Horti-Protection inc. 4. Sporulation dense et/ou 5. Présence ou absence de différente au contact *** zone claire au contact Sporulation Poids Zone claire Poids aucune 0 aucune 0 sporulation dense ou différente 1 présence 1 sporulation dense et différente 2 *** La sporulation différente au contact se manifeste par un aspect floconneux des hyphes de Trichoderma. 6. Envahissement du Trichoderma 7. Intensité de sporulation sur l'agent pathogène ou vice et versa Envahissement Poids du Trichoderma sur l'agent pathogène **** Intensité Poids aucun 0 aucune 0 par les côtés 1 faible 1 direct mais limité 2 moyen 2 direct mais intense 3 fort 3 direct mais total 4 **** Le poids associé est négatif quand c’est l'agent pathogène qui envahit Trichoderma. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 42 sur 44 Horti-Protection inc. Annexe 2. Dispositif expérimental utilisé dans la serre expérimentale Table 1 Tomate : (1-107 A) (3-106 A) (2-107 N) (T20-106 A) (T20-106 N) (3-106 N) (3-107 A) (1-106 A) (VD) (PU) (2-107 A) (T20-107 A) (T20-107 N) (1-107 N) (2-106 A) (1-106 N) (3-107 N) (1106 N) (RS) (TO) Muflier : (1-107 A) (3-107 A) (2-107 N) (T20-106 A) (PU) (1-107 N) (3-106 A) (T20-106 N) (3-107 N) (T20-107 A) (2-107 A) (RS) (3-106 N) (1-106 A) (VD) (MU) (2-106 A) (1-106 N) (T20-107 N) (1-106 N) Concombre : (PA) (3-106 N) (CO) (T20-106 N) (T20-107 A) (T20-107 N) (3-106 A) (1-106 A) (1-107 A) (1-106 N) (3-107 N) (T20-106 A) (2-107 A) (1-106 N) (VD) (2-106 A) (3-107 A) (2107 N) (1-107 N) (RS) Table 2 Concombre : (2-107 A) (3-106 A) (1-107 N) (2-107 N) (1-106 N) (T20-107 A) (T20-107 N) (3107 A) (T20-106 N) (CO) (T20-106 A) (3-107 N) (2-106 A) (3-106 N) (1-106 A) (RS) (1-106 N) (1-107 A) (PA) (VD) Tomate : (T20-107 A) (TO) (1-106 N) (1-107 N) (3-106 N) (PU) (T20-106 A) (T20-107 N) (1107 A) (RS) (2-106 A) (2-107 N) (3-107 N) (1-106 N) (1-106 A) (3-106 A) (VD) (2-107 A) (3107 A) (T20-106 N) Muflier : (PU) (2-106 A) (1-106 A) (2-107 A) (2-107 N) (1-107 N) (3-107 N) (3-106 N) (RS) (T20-106 A) (3-107 A) (T20-107 A) (1-106 N) (1-107 N) (T20-107 N) (T20-106 N) (VD) (1-107 A) (MU) (3-106 A) Table 3 Muflier : (PU) (RS) (1-106 N) (T20-107 A) (3-106 N) (2-106 A) (3-107 N) (T20-106 N) (1-106 A) (T20-106 A) (1-107 N) (3-106 A) (1-107 A) (VD) (1-107 A) (MU) (2-107 N) (T20-107 N) (2107 A) (3-107 A) Concombre : (2-107 N) (3-107 N) (RS) (T20-106 N) (PA) (1-107 N) (1-106 A) (VD) (2-106 A) (1-106 N) (2-107 A) (3-106 N) (CO) (3-106 A) (T20-106 A) (T20-107 N) (1-106 N) (1-107 A) (3-107 A) (T20-107 A) Tomate : (2-106 A) (RS) (2-107 N) (PU) (1-107 N) (3-106 A) (T20-107 N) (T20-106 N) (1-106 N) (2-107 A) (T20-106 A) (1-106 N) (VD) (1-106 A) (3-107 N) (3-106 N) (T20-107 A) (TO) (1107 A) (3-107 A) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 43 sur 44 Horti-Protection inc. Légende : Plantes Co = concombre Mu = muflier To = Tomate Agents pathogènes R. s. = Rhizoctonia solani V. d. = Verticillium dahliae P. u. = Pythium ultimum P. a. – Pythium aphanidermatum système à l’étude 1 = Trichoderma + R. solani 2 = Trichoderma + V. dahliae 3 = Trichoderma + P. ultimum ou P. aphanidermatum Concentration 106 = 106 spores / ml 107 = 107 spores / ml A = ancienne formulation N = nouvelle formulation ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ Page 44 sur 44 Horti-Protection inc.