T95-3-Env18

Immunodosage rapide des toxines individuelles du
venin d’Androctonus australis.
N. Aubrey (1, 2), C. Devaux (2) & P. Billiald (1)
1.Laboratoire d’études et de recherches sur les arthropodes irradiés(LERAI),Muséum national d’histoire naturelle, 57 rue Cuvier, 75231 Paris cedex 05, France, ([email protected])
2. Biochimie-ingénierie des protéines, UMR 6560, CNRS-Université de la Méditerranée, IFR Jean Roche, Faculté de médecine Nord, Bd Pierre-Dramard, 13916 Marseille Cedex 20, France.
([email protected])
Summary: Fast immunotitration of individual toxins from the venom of Androctonus australis.
Passive immunotherapy against scorpion envenomations is facilitated by the preliminary titration of
circulating toxins in envenomed patients. Currently, routinely used ELISA tests allow only the titra tion of the whole venom, without reference to the toxins which compose the venom and spread
variably within the tissue. Taking as a model one of the three toxins responsible for the lethal effects
of Androctonus australis hector (AahI) venom, we developed an ELISA sandwich test based on a
fragment of recombining antibody (scFv) consisting of the variable chains of the monoclonal IgG
9C2 coupled to a decapeptide showing high affinity for streptavidine. Conjugate scFv/Strep-tag was
prepared by genetic engineering. It was produced in the periplasm of recombining bacteria, in a
reproducible way, in a soluble form, at low cost and with an output, after purification, of 0.8 mg/L
of bacterial culture. The recombinant protein, of small size (28 kDa), is bifunctional. It preserves a
very high affinity for the toxin Aah I (Kd of 2.3 10 -10 M, very close to that of IgG 9C2), yet recognises
streptavidine and its conjugate (streptavidine-peroxidase). The titration of the AahI toxin used an
ELISA sandwich test in which the toxin was captured in a specific way by a monoclonal antibody;
the immuncomplexes were then detected by recombinant immunoconjugate, thus conferring a high
specificity on titration. The test is quick (90 mn), reproducible and sensitive, with a limit of detec tion of 0.6 toxin (ng·ml -1). This method could be extended to two other lethal toxins of the venom
of the scorpion Androctonus australis hector and to those of other species. New perspectives are
thus possible for the diagnosis of the envenomations.
venom
toxin
scorpion
analysis
titration
Résumé :
La mise en place d’une immunothérapie passive efficace des envenimations scorpioniques est faci litée par le dosage préalable des toxines circulantes chez les patients envenimés. Actuellement, les
tests ELISA utilisés en routine ne permettent que le dosage du venin total, sans distinction des
toxines qui le composent et dont la diffusion tissulaire est variable. En prenant comme modèle l’une
des trois toxines responsables des effets létaux du venin du scorpion Androctonus australis hector
(AahI), nous avons développé un test ELISA sandwich basé sur l’utilisation d’un fragment d’anticorps
recombinant (scFv) constitué des domaines variables de l’IgG monoclonale 9C2 couplé à un déca peptide affin pour la streptavidine. L’immunoconjugué scFv/Strep-tag a été préparé par génie géné tique. Il est produit dans le périplasme de bactéries recombinantes, de façon reproductible, sous une
forme soluble, à faible coût avec un rendement, après purification, de 0,8 mg/L de culture bacté rienne. La protéine recombinante, de petite taille (28 kDa), est bifonctionnelle. D’une part, elle
conserve une affinité très élevée pour la toxine Aah I (Kd de 2,3 10 -10 M, sensiblement équivalent à
celui de l’IgG 9C2). D’autre part, elle reconnaît la streptavidine et ses conjugués (streptavidine-per oxydase). Le dosage de la toxine AahI développé est un ELISA sandwich dans lequel la toxine est
capturée de façon spécifique par un anticorps monoclonal et les immuncomplexes sont ensuite
détectés par l’immunoconjugué recombinant, conférant ainsi une haute spécificité au dosage. Le
test est rapide (90 mn), reproductible et sensible, avec une limite de détection de 0,6 ng/ml de
toxine. Cette méthodologie pourrait être étendue aux deux autres toxines létales du venin du scor pion Androctonus australis hector et à celles d’autres espèces. De nouvelles perspectives sont ainsi
envisageables pour le diagnostic des envenimations.
D
ans les pays tropicaux et sub-tropicaux, l’envenimation
scorpionique est un sérieux problème de santé publique.
Le seul traitement spécifique est une immunothérapie passive, mais celle-ci doit être adaptée à la gravité de l’envenimation pour être aussi efficace que possible en limitant au
maximum les effets secondaires. Ainsi, immunothérapie et
immunodosage sont étroitement liés.
Les sérums antiscorpioniques sont constitués généralement
de fragments d’anticorps de type F(ab’)2 et Fab (obtenus par
protéolyse ménagée d’immunoglobulines) dirigés contre l’ensemble des constituants du venin. Seules quelques protéines du
Envenimations
venin
toxine
scorpion
analyse
dosage
venin, des neurotoxines actives sur les canaux sodium représentant environ 5 % du poids sec, sont responsables des signes
cliniques et des effets létaux de l’envenimation chez les mammifères. Dans le venin du scorpion sud-tunisien Androctonus
australis hector (famille des Buthidae), ces neurotoxines sont
au nombre de trois (AahI, AahII et AahIII).
Les tests ELISA, parce qu’ils sont sensibles, fiables, souples
d’utilisation et rapides, sont bien appropriés pour doser le
venin, mais ils ne permettent pas, dans leur forme actuelle, le
dosage de toxines individuelles. Ceci est un inconvénient
majeur car la composition d’un venin est variable et la fixation
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Immunodosage des toxines du venin d’Androctonus australis.
tissulaire de ses constituants n’est pas uniforme: elle dépend
de la nature des organes et des tissus, mais également du type
de toxine (3). Le dosage individuel des neurotoxines permettrait, d’une part, de rendre l’utilisation de l’immunothérapie
beaucoup moins empirique, avec une posologie adaptée et,
d’autre part, de mieux comprendre le comportement pharmacocinétique des toxines dans l’organisme.
Pour développer simultanément un antivenin ciblé sur les
trois toxines hautement diffusibles du venin d’Androctonus
australis (4) et des immunotraceurs permettant le dosage spécifique des toxines, des fragments variables simples chaînes
(scFv) ont été construits. Ces molécules chimériques, produites par voie génétique, sont constituées des domaines
variables VH et VL de l’anticorps associés par un court lien
peptidique flexible. Un scFv préserve vis-à-vis de l’antigène
les caractéristiques fonctionnelles de l’immunoglobuline dont
il dérive et répond mieux de par sa faible taille (environ 30 kDa)
aux critères de pénétration et de diffusion au niveau des tissus (meilleure protection), de tolérance clinique (absence de
fragment constant) et de persistance dans l’organisme (élimination par voie rénale). De plus, l’ingénierie moléculaire permet d’améliorer ultérieurement les propriétés intrinsèques
des scFv mais également de les fusionner, pour l’acquisition
d’une nouvelle fonction, à un peptide ou une protéine traceur comme la phosphatase alcaline, la luciférase, la protéine
à fluorescence verte (GFP).
Nous décrivons ici le clonage de l’immunoconjugué
scFv9C2/Strep-tag (1), et son utilisation pour le dosage spécifique de la toxine AahI. Ce traceur recombinant est constitué du scFv9C2 (2) et d’un décapeptide affin pour la
streptavidine (Strep-tag) (5). Le peptide Strep-tag a préalablement été identifié par criblage d’une banque de peptide
aléatoire. Ce décapeptide, dont le motif central est le tripeptide HPQ, est reconnu par la streptavidine et ses conjugués.
L’un de ses intérêts majeurs est une activité de liaison réversible sous certaines conditions, de sorte qu’il peut être utilisé
pour la purification rapide de la protéine à laquelle il est
fusionné, mais aussi pour la détection et le dosage d’antigènes
grâce à l’existence de nombreux systèmes de révélation développés pour le système biotine-streptavidine.
L’insertion de la séquence du Strep-tag à l’extrémité du gène du
scFv9C2, présent dans le vecteur d’expression pSW1, a été réalisée par une réaction PCR modificatrice à l’aide d’amorces
appropriées (figure 1). La séquence signal pelB permet l’exportation de l’immunotraceur dans le périplasme de bactéries
recombinantes, facilitant ainsi la formation des ponts disulfure
et un repliement correct de la protéine. Cette localisation simplifie considérablement la purification puisqu’il n’est pas nécessaire d’avoir recours à des méthodes de solubilisation des corps
d’inclusion cytoplasmiques et de renaturation.
Figure 1.
Vecteur pSW1 9C2/Strep-tag.
pSW1 9C2/Strep-tag vector.
A) Schéma du vecteur. / Vector model.
B) Séquence nucléotidique de l’extrémité 3’ du gène de la protéine scFv9C2/Strep-tag.
Les 10 résidus correspondant au domaine Ck sont indiqués en italique. Le décapeptide
Strep-tag est en caractères gras. / Nucleotid sequence of the 3’ extremity for the
scFv9C2/Strep-tag protein gene.The 10 residues corresponding to the Ck domain are
shown in italics.The strep-tag decapeptide is in bold print..
Bull Soc Pathol Exot, 2002, 95, 3, 194-196
L’immunotraceur, après extraction périplasmique, est purifié
rapidement en une seule étape par chromatographie d’affinité
sur gel de protéine L-agarose ou de streptavidine-agarose. La
protéine L ne reconnaît que des motifs structuraux propres
aux chaînes légères de type kappa. Cette propriété a permis de
purifier l’immunotraceur scFv9C2/Strep-tag avec un rendement
de 1 mg·L-1 de culture, comparable à celui observé au cours de
la purification du scFv libre. Cependant la préparation est
hétérogène comme l’indique son analyse par spectrométrie de
masse et contient des produits de dégradation monofonctionnels ayant perdu la capacité à lier la streptavidine (figure
2C). L’immunotraceur, possédant le peptide Strep-tag, peut
également être purifié par chromatographie sur gel de streptavidine-agarose avec un rendement légèrement inférieur
(0,8 mg·L-1 de culture). L’avantage ici, est une homogénéité
parfaite de la préparation (figure 2A-B).
Figure 2.
Analyse structurale des préparations de scFv9C2/Strep-tag
par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (A)
ou par spectrométrie de masse (B,C).
Structural analysis of scFv9C2/Strep-tag preparations by electrophoresis
on polyacrylamide gel with SDS (A) or by mass spectrometry (B, C).
A. & B. Préparation purifiée par chromatographie sur gel de streptavidine-agarose. /
Purified preparation by chromatography on Streptavidine-agarose gel.
C.Préparation purifiée par chromatographie sur gel de protéine L-agarose. /
Purified preparation by chromatography on Protein L-agarose gel (C).
La bifonctionnalité de l’immunotraceur a été montrée par un
test ELISA direct. La toxine AahI est immobilisée sur une
plaque, puis incubée avec le scFv9C2/Strep-tag. Les immuncomplexes sont ensuite révélés avec le conjugué streptavidine-peroxydase et un substrat chromogénique de l’enzyme.
Ce test très rapide permet d’établir la bifonctionnalité de l’immunotraceur, qu’il soit sous forme pure ou dans l’extrait périplasmique, facilitant ainsi l’optimisation des conditions de sa
production par les bactéries recombinantes.
La constante de dissociation (KD) des immuncomplexes AahIscFv9C2/Strep-tag, déterminée par radioimmunodosage compétitif, est de 2,3·10 -10 M, valeur proche de celle obtenue pour les
immuncomplexes AahI-scFv9C2 (KD = 1,7·10 -10 M) (figure 3A).
Ces mesures ont été réalisées en utilisant les formes monomériques
des fragments d’anticorps recombinants, isolées par FPLC, pour
éviter toutes interférences avec les formes dimériques et oligomériques qui peuvent se former spontanément. L’immunotraceur
conserve, ainsi, une très haute affinité pour la toxine AahI, avec
un KD similaire à celui du scFv9C2 libre. Le peptide Strep-tag ne
crée pas de nouvelles contraintes conformationnelles susceptibles de perturber la cohésion des domaines VH et VL et d’altérer la fonctionnalité du scFv.
Un ELISA sandwich a été développé pour permettre la détection et le dosage spécifique de la toxine AahI. Ce test est semblable à l’ELISA direct, mais comprend une étape préalable
de capture de la toxine AahI par une immunoglobuline (IgG
2G3), augmentant ainsi la spécificité du test (figure 3B). La sensibilité de l’ELISA est bonne avec une réponse parfaitement
linéaire pour une concentration de toxine supérieure à
0,6 ng·mL-1 ou 2,5 ng·mL-1, selon que celle-ci est diluée dans
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N. Aubrey, C. Devaux & P. Billiald
Figure 3.
Immunoréactivité du scFv9C2/Strep-tag et dosage de toxine AahI.
Immunoreactivity of ScFv9C2 Strp-tag and dosage of AahI toxin.
A) Fixation de la toxine [ 125 I] AahI sur les monomères du scFv9C2 (∆) ou du scFv9C2/Strep-tag
(▲) en compétition avec la toxine AahI non radiomarquée. Les résultats sont exprimés par le
rapport B/Bo, où B et Bo représentent la radioactivité liée au scFv en présence (B) ou en
absence (Bo) de la toxine non radiomarquée . / Fixation of [ 125 I] AahI toxin on scFv9C2 mono meres (∆) or scFv9C2/Strep-tag (▲) in competition with non radiomarked AahI toxin. Results
are expressed by the B/Bo relation, where B and Bo represent radioactivity linked to scFv in
the presence (B) or absence (Bo) of non radiomarked toxin.
B) ELISA sandwich utilisant l’immunotraceur scFv9C2/Strep-tag pour la quantification de la
toxine AahI.La toxine AahI est diluée dans du tampon (—) ou dans du sérum (--). /
ELISA sandwich using scFv9C2/Strep-tag immunotraceur for quantification of AahI toxin. AahI
toxin is diluted in tampon (-) or serum(--).
Cette méthodologie de dosage doit maintenant être appliquée
à une sérothèque afin de confronter les résultats obtenus
aux données cliniques et d’élaborer une corrélation entre la
quantité de toxine sérique circulante et la gravité de l’envenimation telle qu’elle est actuellement évaluée à partir d’examens cliniques. Elle pourrait également être appliquée aux
autres toxines létales du venin (AahII et AahIII), ainsi qu’à
celles d’autres espèces de scorpion. L’utilisation de fragment
d’anticorps de type scFv, dans la production d’antivenins
ou dans l’élaboration d’immunodosages, ouvre ainsi de nouvelles perspectives pour le traitement des envenimations
scorpioniques.
Références bibliographiques
1.
2.
du tampon ou dans du sérum. Le test, reproductible, est rapide
et peut être réalisé en 1h 30 lorsque la toxine est incubée simultanément avec les immunoconjugués.
Les premiers essais de dosage de la toxine AahI montrent l’intérêt d’un immunotraceur recombinant, même si des améliorations sont souhaitables en terme de sensibilité. La
construction et la production d’un tel immunotraceur à partir d’un scFv neutralisant sont bon marché. Sa purification
sous une forme soluble et homogène est rapide, en une seule
étape, avec un rendement de l’ordre de 1 mg·L-1 de culture. Les
propriétés intrinsèques du scFv, dont une haute affinité pour
la toxine AahI, sont conservées. Enfin, l’immunotraceur, préparé par voie génétique, peut être produit rapidement, en
grande quantité et de façon parfaitement reproductible au
cours des années.
Envenimations
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