THESE Docteur de l`Université Paris XII Discipline: Sciences de la

Université Paris XII Val-de-Marne
U.F.R Sciences
THESE
Pour obtenir le grade de
Docteur de l'Université Paris XII
Discipline: Sciences de la vie et de la santé
Présentée et soutenue publiquement par
Isabelle BARBOSA
Le 21 Novembre 2003
Etude in vivo et in vitro de la myogenèse et des GAG naturels associés :
effets des RGTA, mimétiques fonctionnels des héparanes sulfates.
Directeurs de thèse: Mme Isabelle MARTELLY/ Mr Jean FOUCRIER
JURY
M. Y. Laperche, Président
Mme G. Butler-Browne, Rapporteur
M. H. Hondermarck, Rapporteur
Mme I. Martelly, Examinateur
Mme D. Papy-Garcia, Examinateur
M. J. Foucrier, Examinateur
A mes parents, Justino et Odette
A ma petite famille Maria, José, Audrey, Guillaume et Bruno
A Didier
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En sciences comme ailleurs, l’inertie intellectuelle, la mode,
le poids des institutions et l’autoritarisme sont toujours à craindre
Hubert Reeves
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REMERCIEMENTS
Je remercie Monsieur le Professeur Denis Barritault et Monsieur le Professeur Jean-Pierre
Caruelle, directeurs du Laboratoire de Recherche sur la croissance cellulaire, la Réparation et
la régénération tissulaire pour m’avoir accueillie dans leur laboratoire.
Je tiens à remercier Madame Isabelle Martelly, d’avoir accepter d’être co-directrice de ma
thèse en cours de route, suite au changement de thématique, de m’avoir initiée et fait
découvrir le vaste « monde » des pathologies musculaires, de son appui dans l’obtention de la
bourse de l’AFM. Son aide et ses conseils dans la réalisation de ce mémoire ont été
particulièrement appréciés. Qu’elle soit assurée de ma reconnaissance et de mon respect.
Je remercie Monsieur Jean Foucrier, professeur de l’université Paris XII, pour m’avoir
accueillie en thèse dans son équipe, de m’avoir enseigné l’art de perfuser le foie et la
technique d’isolement des cellules de Ito. Je lui suis reconnaissante d’avoir poursuivi son
« mandat » de directeur de thèse malgré l’abandon de notre sujet concernant l’effet des RGTA
sur les fibroses hépatiques.
Je remercie, Monsieur Yannick Laperche, directeur de recherche de l’unitée Inserm 581, pour
avoir accepté de présider le jury de cette soutenance. J’ai grandement apprécié notre trop
courte collaboration sur les cellules de Ito.
Je remercie Madame Gillian Butler-Browne, directrice de recherche de l’unitée CNRS UMR
7000 et Monsieur Hubert Hondermarck, professeur à l’université de Lille, de toute l’attention
qu’ils ont apporté à ce travail et d’avoir accepté de le juger en qualité de rapporteurs.
Je tiens à remercier, Madame Papy-Garcia, maître de conférence à l’université Paris XII, de
m’avoir suivi et encadré dans l’univers des GAG. Après des « tonnes » de publications et
quelques réunions bibliographiques, nous avons ensemble appris et déterminé les méthodes
permettant l’étude des GAG, domaine encore très inexploré. Qu’elle trouve là toute ma
reconnaissance et mon admiration pour ses compétences.
Je suis très reconnaissante à Monsieur José Cebrian, chargé de recherche au CNRS, « mon
mentor », d’avoir été à mes côtés et soutenue durant toutes ces années. Je le remercie
profondément de tous les conseils qu’il m’a donnés et de son amitié.
Je remercie Madame Arlette Duchesnay, technicienne, pour m’avoir initié à la culture de
cellules satellites et transmis son savoir sur le modèle de régénération musculaire après
écrasement.
Tous mes remerciements et mon amitié s’adressent aussi à Mademoiselle Catherine Alexakis,
docteur ès-Sciences, pour sa présence à mes côtés durant ces années de thèse, et dont la
complicitée me manquent depuis son départ en post-doct de l’autre côté de la Manche.
Mes remerciements s’adressent aussi à Mademoiselle Stéphanie Garcia, doctorante, pour sa
gentillesse et sa bonne humeur, notamment dans les situations les plus critiques, à Monsieur
Gilles Carpentier, Assistant Ingénieur, pour sa gentillesse et son aide en analyse d’image, à
Madame Brigitte Blondet, Monsieur Yann Bassaglia, Madame Véronique Barbier-
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Chassefière, Monsieur Emmanuel Petit et Madame Cécile Riffet pour leur disponibilité et leur
gentillesse.
Je remercie tous les membres du personnel, Bertille, Gilberte, Djelloul, Luc pour leurs
disponibilités, leur sympathie et leur bonne humeur.
Je tiens tout particulièrement à remercier Madame Raymonde Marotte et Madame Elisabeth
Millet, directrice du Laboratoire d’analyse Médicale, pour m’avoir embauché en tant que
technicienne de Laboratoire depuis l’obtention de mon BTS analyses Biologiques et jusqu’au
début de la rédaction de ce mémoire, de leur compréhension, de leur soutien et de leur
gentillesse. Ces années passées dans leur laboratoire m’ont permis d’acquérir une expérience
du monde professionnelle mais m’ont surtout permis d’apprendre à écouter et à respecter les
malades rencontrer au cours de mes gardes de nuits en chirurgie clinique. Je remercie aussi
toutes mes collègues du laboratoire, Valérie, Pierrette, Martine, Joséphine, Dominique, Lydia,
Carine, Stéphane, etc......pour leur amitié et leur soutien.
Que toutes mes amies de BTS, de FAC et de « Boulot » trouvent dans ce mémoire
l’expression de la reconnaissance.
Enfin, je tiens à remercier du plus profond de mon cœur mes parents, qui m’ont permis de
réaliser mon rêve de petite-fille, « un jour je ferais de la recherche », merci pour leur soutien
financier, mais surtout pour leur confiance, leur patience et leur tendresse. Merci à ma nièce
Audrey pour avoir corrigé un partie de mes fautes d’orthographe durant ces vacances d’été.
Merci à mon ami, Didier, de m’avoir supportée dans les moments difficiles, de m’avoir
écouté et soutenu.
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Liste des figures
Figure n°1 : Constitution du muscle squelettique
Figure n°2 : Anatomie macroscopique et microscopique du muscle squelettique
Figure n°3 : Représentation schématique d’un somite
Figure n°4 : Schéma récapitulatif de l’action des différents facteurs myogéniques au cours de
myogenèse embryonnaire et la régénération musculaire chez l’adulte
Figure n°5 : Mécanismes potentiels pour l’activation de la transcription des gènes du muscle
squelettique par MEF2 et les facteurs myogéniques bHLH
Figure n°6 : Facteurs impliqués dans les étapes de prolifération, différenciation et de
dédifférenciation
Figure n°7 : Action de p21 sur les facteurs myogéniques au cours de la prolifération et de la
différenciation myogénique
Figure n°8 : L’évolution des MRF au cours du développement d’embryon de poulet.
L’expression des différentes protéines bHLH myogéniques suivent des profils différents
Figure n°9 A et B : Localisation des cellules satellittes
Figure n°10 : Représentation schématique du processus de la régénération musculaire après
une lésion
Figure n°11 A et B : Régénération après écrassement total. Immuocytochimie de la laminine
et de la desmine
Figure n°12 : Représentation du petit (TGFβ1-LAP) et grand (TGFβ1-LAP-LTBP) complexes
latents du TGFβ 1
Figure n°13 : Principales voies de signalisation mobilisées par le TGF β
Figure n°14 : Structure en triple hélice du procollagène I
Figure n°15 : Structure de la laminineFigure n°16 : Structures des ténascines
Figure n°17 : Structure de la fibronectine
Figure n°18 : Structure des différentes chaînes de glycosaminoglycannes
Figure n°19 : Modèle courant représentant la structure moléculaire d’une lame basale
Figure n°20 : Structure des différentes chaînes de glycosaminoglycannes (GAG)
Figure n°21 : Composition chimique et structure de l’acide hyaluronique
Figure n°22 : Les différents types de chondroïtine sulfates déterminés en fonction de la
position des groupements sulfates sur le disaccharide
Figure n°23 : Unités disaccharidiques répétées de l’héparine
Figure n°24 : Illustration du développement d’analogues de l’héparine
Figure n°25 : Effets anti-inflammatoires de l’héparine
Figure n°26 : Unités dissacharidiques N acétylé et N-sulfatédes héparanes sulfates
Figure n°27 : Les héparanes sulfates : régulateurs multifonctionnels des activités protéiques
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Figure n°28 : Evolution et relations structurales entre les gènes des différents composant de
la famille de SRLP
Figure n°29 : Représentation schématique des HSPG présents dans le muscle
Figure n°30 : Représentation schématique des protéoglycans de la famille des syndecans et
des glypicans
Figure n°31 : Structure des syndécans
Figure n°32 : Représentation schématique de la dimérisation des syndécans
Figure n°33 : Représentation schématique du glypican et de son ancrage à la membrane
Figure n°34 : Représentation schématique des structures des 6 membres de la famille des
glypicans
Figure n°35 : Interactions entre les protéoglycannes avec les facteurs de croissance en
fonction du type de GAG qui les constitues
Figure n°36 : Biosynthèse des heparosan et modification des HS
Figure n°37 : Organisation de l’appareil de Golgi (Cis, médian et trans)
Figure n°38 : Représentation schématique de la phosphorylation en C2 du Xylose et des
sulfatations
en
C4
et
C6
des
deux
galactose
du
tétrasaccharide
GlcA(β1,3)Gal(β1,3)Gal(1,4)Xyl(β1 coeur protéique)
Figure n°39 : Homologie entre les 5 gènes de la faille des EXT
Figure n°40 : Séquence d’intervention des différentes enzymes de la famille des EXT au cours
la biosynthèse des HS
Figure n°41 : Dégradation intracellulaire des HSPG
Figure n°42 : Type d’interaction possible entre les HSPG et les FGF
Figure n°43 : Représentation simplifiée des analogies de séquences entre les HS naturels et les
HS mimétique de synthèse
Figure n°44 : Structure des RGTA
Figure n°45 : Représentation schématique du complexe protéique associé à la dystrophine
dans le muscle strié squelettique
Figure n°46 : Protocole de purification des syndécans par immunoprécipitation
Figure n°47 : Injection de la solution à tester au centre du muscle EDL
Figure n°48 : Interactions possibles entre un facteur de croissance le FGF, l’héparine, les
HSPG ou les RGTA
Figure n°49 : Effets possibles du RGTA sur le catabolisme
protéoglycannes et des glycosaminoglycannes.
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et/ou l’anabolisme des
Listes des abréviations........................................................................................................13
INTRODUCTION ..............................................................................................................18
I. Le muscle squelettique ...................................................................................19
I.1.
Constitution générale du muscle ............................................................................19
I.2.
Diversité des fibres musculaires .............................................................................19
I.2.1.
Généralités ...................................................................................................20
I.2.2.
Propriétés contractiles et métaboliques ......................................................21
I.3.
Origine des cellules musculaires.............................................................................22
I.4.
La myogenèse..........................................................................................................23
I.4.1.
Diversité des myoblastes..............................................................................24
I.4.2.
Mécanismes moléculaires de l’engagement myogénique et de la
différenciation .............................................................................................................26
I.4.3.
La différenciation myoblastique est-elle irréversible? ...............................28
I.4.4.
Prolifération et différenciation, événements mutuellement exclusifs ? .....30
II. La régénération musculaire ........................................................................32
II.1. Les cellules myogéniques : les cellules satellites.....................................................32
II.1.1. Structure......................................................................................................32
II.1.2. Origine des cellules de la régénération .......................................................33
II.1.2.1.
Origine embryonnaire .........................................................................33
II.1.2.2.
Distribution des cellules satellites en fonction du type de muscle et de
l’âge
..............................................................................................................33
II.1.2.3.
Hétérogénéité des cellules satellites.....................................................34
II.1.3. Le déroulement de la régénération .............................................................36
II.1.3.1.
Dégénérescence et élimination des fibres lésées..................................37
II.1.3.2.
Régénération de fibres ou de parties de fibres lésées .........................38
II.1.3.3.
Régénération après écrasement total ..................................................39
II.2. Les facteurs de croissance dans la régénération musculaire et la myogenèse ......40
II.2.1. Les « Fibroblast Growth Factors” (FGF)...................................................40
II.2.1.1.
Les FGF dans la myogenèse et la régénération musculaire ...............41
II.2.1.2.
Les récepteurs aux FGF (FGFR) ........................................................42
II.2.1.2.1. Les récepteurs de haute affinité ..........................................................42
II.2.1.2.2. Les récepteurs de basse affinité ..........................................................44
II.2.2. Le Transforming Growth Factor β (TGFβ
β) ...............................................45
II.2.2.1.
Le TGFβ
β dans la myogenèse et la réparation tissulaire .....................46
II.2.2.2.
Caractéristiques des TGFβ
β et de leurs récepteurs .............................47
II.2.2.2.1. Récepteur de type I et II à haute affinité .............................................47
II.2.2.2.2. Récepteur de type III à basse affinité..................................................48
II.2.2.2.3. Polymérisation des récepteurs I et II et transduction de signal ...........48
II.2.3. Les « Insulin-like Growth Factors » (IGF).................................................49
II.2.3.1.
Les IGF et la myogénése......................................................................50
II.2.3.2.
Les récepteurs aux IGF .......................................................................51
III. La matrice extra-cellulaire ..........................................................................52
III.1.
Principaux composants de la matrice extra-cellulaire.......................................52
III.1.1. Les collagènes ..............................................................................................52
III.1.1.1. Structure et organisation générale......................................................52
III.1.1.2. Types et distribution des collagènes dans le tissu musculaire ............54
III.1.2. Les glycoprotéines .......................................................................................55
III.1.2.1. La laminine ..........................................................................................55
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III.1.2.2.
III.1.2.3.
III.1.2.4.
La Ténascine ........................................................................................56
La fibronectine.....................................................................................57
Les protéoglycannes.............................................................................57
III.2. La lame basale.................................................................................................58
IV. Les glycosaminoglycannes ............................................................................60
IV.1.
Structure des glycosaminoglycannes..................................................................60
IV.1.1. L’acide hyaluronique ou hyaluronan (HA) ................................................61
IV.1.2. Les galactosaminoglycannes .......................................................................62
IV.1.2.1. La chondroïtine et les chondroïtines sulfates (CS) .............................62
IV.1.2.2. Le dermatane sulfate (DS)...................................................................63
IV.1.3. Les glucosaminoglycannes ..........................................................................64
IV.1.3.1. Le kératane sulfate (KS)......................................................................64
IV.1.3.2. Les héparanes sulfates et l’héparine ...................................................64
IV.1.3.2.1. L’héparine ........................................................................................65
IV.1.3.2.2. Les héparanes sulfates ......................................................................67
IV.2.
Les protéoglycannes............................................................................................68
IV.2.1. Les « Small Leucine-Rich Proteoglycans » ou (SLRP) ..............................71
IV.2.2. Les protéoglycannes héparanes sulfates .....................................................72
IV.2.2.1. Agrine...................................................................................................72
IV.2.2.2. Les syndécans.......................................................................................73
IV.2.2.3. Les Glypicans.......................................................................................75
IV.2.2.4. Le perlécan...........................................................................................77
IV.3.
Dynamique d’expression des PG durant le développement du muscle
squelettique.........................................................................................................................77
V. Glycosaminoglycannes : synthèse et fonctions...........................................................78
V.1. Biosynthèse des héparanes sulfates ........................................................................78
V.1.1.
Synthèse du tétrasaccharide de liaison Protéine-GAG ..............................79
V.1.2.
Elongation de la chaîne de GAG.................................................................80
V.1.3.
Les « Exostose tumor suppressors » ou EXT .............................................80
V.1.4.
Synthèse de la chaîne finale des héparanes sulfates ou de l’héparine .......82
V.1.4.1.
Les N-deacétyl/N-sulfotransferases (NDST). ......................................83
V.1.4.2.
Les épimérases .....................................................................................83
V.1.4.3.
Les O-sulfotransférases .......................................................................84
V.1.5.
Dégradation des héparanes sulfates............................................................86
V.1.6.
Sulfatases et héparanases ............................................................................87
V.1.6.1.
Les sulfatases .......................................................................................87
V.1.6.2.
les héparanases ....................................................................................87
V.1.7.
Rôles physiologiques des héparanes sulfates ..............................................88
V.1.8.
Les HS dans la myogenèse...........................................................................89
V.1.9.
Interaction entre HS et facteurs de croissance...........................................90
V.1.9.1.
Interaction HS-FGF2...........................................................................90
V.1.9.2.
Interaction entre HS et TGFβ
β1 ............................................................91
V.2. Héparanes sulfates protéoglycannes (HSPG) et HS dans les pathologies
musculaires .........................................................................................................................92
V.3. Analogues de synthèse : mimétiques d’héparanes sulfates ou RGTA ..................93
VI. Les RGTA. Analogues de synthèse des héparanes sulfates .......................................94
VI.1.
Structure des RGTA et analogie avec les HS.....................................................94
VI.2.
Fonctions des RGTA...........................................................................................95
VII. Dystrophie musculaire et thérapie existante..............................................................96
VII.1. Cas particulier des dystrophies musculaires......................................................97
Page -9-
VII.2. Thérapie myoblastique : la transplantation myoblastique................................97
MATERIELS ET METHODES ......................................................................................100
I. Culture de cellulaire ......................................................................................101
I.1.
Culture primaire de cellules satellites ..................................................................101
I.1.1.
Prélèvements des muscles..........................................................................101
I.1.2.
Dissociation mécanique .............................................................................101
I.1.3.
Dissociation enzymatique ..........................................................................102
I.1.4.
Récupération des cellules et mise en culture ............................................102
I.2.
Culture de la lignée établie C2.7...........................................................................102
I.3.
Mesures de croissance cellulaire ..........................................................................103
I.3.1.
Détermination des conditions optimales de mise en culture des C2.7 .....103
I.3.2.
Comptage cellulaire par « Coulter-counter »..........................................103
I.3.3.
Evaluation de la prolifération par incorporation de thymidine ..............104
I.3.4.
Dosage de l’ADN par la méthode du DAPI ..............................................104
I.3.5.
Viabilité des cellules ..................................................................................105
I.4.
Traitement par les RGTA ....................................................................................105
I.4.1.
Effet sur la prolifération cellulaire ...........................................................105
I.4.2.
Conditions de traitement au RGTA durant la prolifération et la
différenciation ...........................................................................................................105
I.5.
Evaluation de la différenciation par le dosage des créatinine kinases ................106
I.5.1.
Devenir des RGTA après administration aux cellules en culture............107
II. Etude des glycosaminoglycannes au cours de la myogenèse in
vitro et in vivo ............................................................................................................107
II.1.
Méthode d’extraction............................................................................................107
II.1.1. Extraction des PG......................................................................................107
II.1.2. Extraction des glycosaminoglycannes.......................................................108
II.2. Méthodes de dosage des glycosaminoglycannes...................................................108
II.2.1. Dosage des glycosaminoglycannes par complexation au Bleu de1,9diméthylméthyléne....................................................................................................108
II.2.2. Détermination des rapports héparanes sulfates/chondroïtine sulfates....109
II.2.3. Dosage des glycosaminoglycannes totaux par HPLC...............................109
II.2.3.1.
Conditions de marquage à l’acide anthranilique .............................109
II.2.3.2.
Conditions de détection .....................................................................110
II.3. Etude des enzymes du métabolisme des héparanes sulfates................................110
II.3.1. Extraction des ARNm totaux des cellules myogéniques ..........................110
II.3.2. Electrophorèse des ARNm totaux.............................................................110
II.3.3. Protocole de RT-PCR................................................................................110
II.4. Dosage de l’activité aryl sulfatase A et B .............................................................111
II.5. Immunolocalisation des héparanes sulfates.........................................................112
II.6. Dosage des différents epitopes de HS par une technique dérivée d’ELISA .......113
II.7. Etude de l’expression des PG par Western Blot..................................................114
II.7.1. Dosage des protéines totales ......................................................................114
II.7.2. Immunoprécipitation des protéoglycannes ..............................................114
II.7.3. Western Blot ..............................................................................................115
II.7.3.1.
Electrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (SDS-PAGE)....115
II.7.3.2.
Transfert sur membrane en nylon ....................................................115
II.7.3.3.
Immunobloting ..................................................................................116
II.7.3.4.
Deshybridation du Western-Blot ......................................................116
III. La régénération musculaire ......................................................................116
Page -10-
III.1.
Modèle de l’écrasement total ............................................................................117
III.1.1. L’écrasement du muscle............................................................................117
III.1.2. Méthode d’injection ..................................................................................117
III.1.3. Le prélèvement ..........................................................................................118
III.1.4. Histologie par coloration au trichrome de Gomori..................................118
RESULTATS ....................................................................................................................119
CHAPITRE I :..................................................................................................................120
Article 1 : Stimulation de la prolifération in vitro des cellules satellites par des
mimétiques des glycosaminoglycannes. ...........................................................................120
CHAPITRE II...................................................................................................................133
Article 2 : Mise au point d’une méthode quantitative de détermination des
glycosaminoglycannes au niveau d’extraits cellulaires et des tissus biologiques. ..........133
CHAPITRE III .................................................................................................................144
Article 3: Les RGTA mimétiques synthétiques de GAG modulent le métabolisme des
GAG naturels au cours de la myogenèse (soumis J Cell. Biol.). .....................................144
CHAPITRE IV .................................................................................................................178
Résultats in vivo: Teneur en héparane sulfate au cours de la régénération d’un muscle
écrasé : effet de mimétiques de GAG (RGTA) ................................................................178
DISCUSSION ET CONCLUSION ..................................................................................183
BIBLIOGRAPHIE ...........................................................................................................196
ANNEXES ........................................................................................................................217
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LISTE DES ARTICLES CORRESPONDANT AUX TRAVAUX
PRESENTES DANS CE MEMOIRE DE THESE
1- Papy-Garcia, D., Barbosa, I., Duchesnay, A., Saadi, S., Caruelle, J. P., Barritault, D. et
Martelly, I. Glycosaminoglycan mimetics (RGTA) modulate adult skeletal muscle satellite
cell proliferation in vitro . J Biomed Mater Res, 62, 46-55, 2001
2- Barbosa, I., Garcia, S., Barbier-Chassefiere, V., Caruelle, J. P., Martelly, I. et PapyGarcia, D. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification
in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies ». Glycobiology 13
(9) :647-653, 2003
3- Isabelle Barbosa, Mustapha Oudghir*, Arlette Duchesnay, Guido Jenniskens**, Gilles
Carpentier, Jose Cebrian, Jean-Pierre Caruelle, Toin van Kuppevelt***, Isabelle Martelly and
Dulce Papy-Garcia. Synthetic glycosaminoglycan mimetic (RGTA) modulates natural
glycosaminoglycan metabolism during myogenesis (soumis pour publication dans J Cell Biol)
ARTICLE EN COURS DE PREPARATION
4- Isabelle Barbosa et Mustapha Oudghir, Dulce Papy-Garcia, Guido Jenniskens, Ahmed
Aamiri, Denis Barritault, Toin van Kuppevelt et Isabelle Martelly
The fate of Heparan Sulfate in crush-induced regeneration of the Soleus and EDL muscle:
effect of glycosaminoglycan mimetics (RGTA) (article en préparation)
ARTICLE NE FAISANT PAS L’OBJET DE CE MEMOIRE
5-P.Li, J.Cebrian, G. Carpentier, I. Barbosa et D.Barritault ; Effect of RG1192, a substituted
dextran on inflammatory response. Cellular and Molecular Biology. 49: 409-413
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Listes des abréviations
AchE : Acétyl choline estérase
ADN : Acide désoxyribo nucléique
ALK : Activin receptor like kinase
ARNm : Acide ribonucléique messager
ATIII : Anti trombine III
ATP: Adénosine triphosphate
BHLH: basique-hélice-boucle –hélice
BMP : Bone morphologic protein
Cdk : cyclin dependent kinase
CFR : récepteur riche en cysteine
CPK : Créatinine phosphokinase
CS : Chondroïtine sulfate
CSA : Chondroïtine sulfate A
CSB : Chondroïtine sulfate B
CSC : Chondroïtine sulfate C
CSPG : Chondroïtine sulfate protéoglycanne
DMD : Dystrophie musculaire de Duchenne
DS : Dermatane sulfate
DSPG : Dermatane sulfate protéoglycanne
EDL : Extensor Digitorum Longus
EXT : Exostose tumor suppressors
EXTL : Exostose tumor suppressor Like
FACIT : Fibril associated collagen with interrupted triple helice
FGF: Fibroblast growth factors
GAG: Glycosaminoglycanne
GalNac: N-acétyl galactosamine
GH: Growth hormone
GlcA: Acide glucuronique
GlcNac: N-acétyl glucosamine
GPC: Glypican
GPI: glycosylphosphatidylinositol
HA : Acide hyaluronique
HBGF: Heparine binding growth factor
HGF/SF: Hepatocyte growth factor/scattor factor
HME : Hereditary binding growth factor
HNF: Hepatocyte nuclear factor
HS: Héparane sulfate
HSPG: Héparane sulfate protéoglycanne
Id : Inhibitor of differentiation
IdoA: glucuronate ou Iduronate
Ig: Immunoglobuline
IGF: Insulin growth factor
IGFBP: Insulin growth factor binding protein
kDa : kiloDalton
KS : Kératane sulfate
KSPG: Kératane sulfate protéoglycanne
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LAP : Latency associated peptide
LIF : leukaemia inhibitory factor
LMWH: Low molecular weigth heparin
LTBP: Latent TGFβ weigth protein
MADS : MCMI Agamous deficiens serum
MAPK(K): Mitogen activated protein kinase (kinase)
MEC: Matrice extracellulaire
MEF: Myocyte enhancer factor
MNF : Myocyte nuclear factor
MRF: Myogenic regulatory factors
MyHC: Myosin heavy chain
MyLC: Myosin light chain
NDST: N-deacétylase- N-sulfotransferase
OST: O-Sulfotransferase
p.c: post coïtum
PDGF: Platelet derived growth factor
PG: Protéoglycanne
PKC: Protéine kinase C
PLC: Phospholipase C
Rb: Rétinoblastome
RGTA: ReGeneraTing Agent
RMN: Résonance magétique nucléaire
TAK: TGFβ activated kinase
TGFβ: Transforming Growth Factor β
TPA: 12-O-tetradecanoylphorphol-13-acétate
UFH: Héparine non fractionnée ou héparine standard
Wg : Wingless
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PREAMBULE
Les muscles constituent des organes originaux en raison de leurs nombreuses caractéristiques
morphofonctionnelles particulières. Aux premières études les concernant, portant notamment
sur leurs organisations tissulaires et leurs traits histologiques, se superposèrent des approches
expérimentales permettant de mieux cerner les aspects métaboliques et les propriétés
électrophysiologiques des divers tissus musculaires. L’utilisation conjuguée de diverses
méthodes modernes d’investigation (microscopie confocale, RMN, outils de la biologie
moléculaires, ...) a permis d’accéder à une meilleure compréhension de la physiologie de la
cellule musculaire, notamment au niveau moléculaire. Au cours de ces dernières années, sans
pour autant négliger l’étude même des cellules musculaires, de nombreuses recherches ont
porté sur la connaissance de la matrice extracellulaire (MEC), structure qui n’avait jusqu’alors
que suscité un intérêt modéré. La nature des constituants matriciels ainsi que le rôle
physiologique de ces derniers sur le comportement cellulaire ont suscité récemment de
nombreuses recherches. Parmi les composants matriciels, les protéoglycannes (PG) et leurs
glycosaminoglycannes associés (GAG) ont fait l’objet d’une attention nouvelle, d’autant plus
que divers membres de ces familles moléculaires furent caractérisés au niveau des membranes
cellulaires. Ces constituants non seulement assurent des rôles structuraux importants mais
sont également capables de contracter des liaisons spécifiques avec de nombreux composés
biologiques, et en particulier des facteurs de croissance dont certains sont intimement
impliqués dans les processus myogéniques et le fonctionnement musculaire. Le travail
présenté dans ce mémoire concerne l’étude de l’effet de mimétiques structuraux et
fonctionnels des GAG comme agents favorisant la régénération du muscle lésé via une
modification de la constitution qualitative et quantitative des PG présents à la surface
cellulaire et dans le microenvironnent des cellules musculaires. Cette étude a été dans un
premier temps réalisé sur du matériel biologique en culture (cellules satellites en culture
primaire, lignée myoblastique C2.7) et dans un deuxième temps dans un modèle in vivo de
régénération musculaire suite à un écrasement mécanique de muscles de pattes postérieurs de
rat (EDL pour « Extensor Digitorium Longus » et Soléaire). Ces mimétiques fonctionnels sont
obtenus par synthèse chimique et ont été nommés RGTA pour « ReGeneRaTing Agent » en
raison de leurs effets stimulateurs sur les processus de régénération et de cicatrisation
cellulaire. En effet, ces mimétiques des héparanes sulfates et de l’héparine, dépourvus
d’activité anticoagulante présentent comme leurs analogues naturels, des affinités vis-à-vis de
nombreux facteurs de croissance, entraînant des effets protecteurs et/ou potentialisateurs pour
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des derniers (Burgess et al. 1986 ;Yayon et al. 1991). Ainsi, de nombreux travaux réalisés in
vitro et/ou in vivo ont montré que les RGTA stimulaient la cicatrisation cutanée (Meddahi et
al. 1994), la réparation de l’os crânien (Blanquaert et al. 1995), la résistance à l’étirement
mécanique d’anastomoses coliques (Meddahi et al. 1996). En ce qui concerne les tissus
musculaires, il est apparu que ces molécules étaient capables d’assurer la protection du
muscle cardiaque infarcié (Yamauchi et al. 2000), la stimulation de la myogenèse et des
processus régénératifs (revascularisation et réinnervation de muscles striés lents (soleus) et
rapides (EDL)(Gautron et al. 1995, Aamiri et al. 1995(b), Desgranges et al. 1999). Par
ailleurs, d’autres travaux ont montré que les RGTA modulaient in vitro la prolifération
cellulaire et la biosynthèse de molécules matricielles comme les collagènes, jouant un rôle
important de régulateurs dans le développement de fibroses (Mestries et al. 1998).
Ces différentes données suggèrent que les RGTA peuvent agir comme des modulateurs de
l’homéostasie tissulaire et cellulaire, notamment en régulant les activités des facteurs de
croissance et des enzymes de l’inflammation qui se manifestent lors d’une lésion tissulaire, le
tout aboutissant à un remodelage de la MEC des tissus lésés (Ledoux et al. 2000).
C’est dans ce contexte que ce travail a été effectué, en portant une attention toute particulière
aux éventuelles influences que pourraient exercer les RGTA sur la biosynthèse des PG et sur
celle d’une classe de GAG, les héparanes sulfates tant dans des approches in vitro qu’in vitro.
Le manuscrit comporte 4 grandes parties.
Une introduction constituée par une approche élargie du sujet, regroupe divers aspects du
domaine de recherche abordé. Après quelques rappels concernant certaines caractéristiques du
muscle squelettique, des données relatives à la régénération musculaire sont développées avec
notamment mention du rôle de quelques facteurs de croissance durant les processus
myogéniques. Un regard est donné sur la composition des matrices extracellulaires et
notamment celle relative à la lame basale. Cette partie introductive s’achève sur une revue
concernant les propriétés structurales et fonctionnelles des GAG et PG associés et des
mimétiques synthétiques, les RGTA.
La partie consacrée aux Matériels et Méthodes, présentes les principales techniques mises en
oeuvre pour la réalisation de ce travail, dont certaines d’entre elles sont originales et ont fait
l’objet d’une mise au point expérimentale.
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La partie « Résultats » regroupe les articles publiés ou en cours de rédaction concernant les
travaux effectués. Trois des articles ont trait à l’action des RGTA sur le compartiment des
cellules myogéniques et sur le métabolisme des GAG. Un quatrième article est d’ordre
méthodologique et décrit une méthode originale d’analyse qualitative et quantitative de GAG
extraits d’échantillons biologiques, cellulaires et tissulaires.
La dernière partie propose, à partir d’une approche critique des résultats obtenus, de nouvelles
perspectives de recherche en utilisant les différents modèles d’étude choisis lors de la présente
étude.
En effet, les données concernant le rôle des polysaccharides naturels dans le tissu musculaire
sont à ce jour peu nombreuses. Une meilleure compréhension de l’importance occupée par ces
molécules dans la biologie musculaire devrait aider à saisir leur rôle lors de dérèglements
pathologiques, et l’utilisation de mimétiques de synthèse ouvre d’éventuelles perspectives en
thérapeutique humaine.
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INTRODUCTION
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I.
Le muscle squelettique
I.1. Constitution générale du muscle
Chez de nombreux organismes, nous pouvons distinguer 3 types de tissus musculaires, d’une
part ceux à contraction involontaire : les muscles lisses, le muscle cardiaque, et d’autre part
les muscles squelettiques ainsi dénommés de par leur attachement aux structures osseuses, et
qui jouent un rôle important dans le maintien et les mouvements du squelette.
Les muscles striés squelettiques représentent une masse pondérale importante de l’ordre de 40
à 50 % de l’ensemble de l’organisme chez les Vertébrés. Le tissu musculaire est constitué de
fibres musculaires striées multinucléées et fusiformes ayant la capacité de se tendre ou de se
détendre sous l’influence d’un stimulus d’origine volontaire ou réflexe, de tissu conjonctif
unissant les fibres, comportant de nombreux vaisseaux et des structures nerveuses
responsables de l’innervation motrice et de l’innervation sensitive.
L’ensemble du muscle est enveloppé d’une couche de tissu conjonctif épais, l’épimysium ou
aponévrose, constitué de fibres de collagène disposées en plans superposés (Figure 1). Dans
chaque plan la direction des fibres est perpendiculaire à celle du plan voisin. L’orientation des
fibres de collagène est déterminée par les forces qui s’appliquent sur l’aponévrose lors des
mouvements de contraction ou de relâchement du muscle.
Le périmysium issue de la partie profonde de l’épimysium correspond à des cloisons
conjonctives qui découpent le muscle en faisceaux musculaires.
L’endomysium est l’ensemble du tissu conjonctif qui dans un faisceau primaire enveloppe
chaque fibre et la sépare des fibres voisines. Il est formé de fibres de collagène qui s’accolent
à la lame basale de chaque fibre.
I.2. Diversité des fibres musculaires
Une des caractéristiques principales du muscle squelettique est sa diversité. Au sein d’un
même organisme, chaque muscle diffère de son voisin par sa couleur, sa taille, sa vitesse de
contraction et sa résistance à la fatigue. Le muscle étant formé d’un ensemble de fibres
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musculaires, c’est l’existence de différents types de fibres et la proportion respective de
chacune d’entre elles au sein d’un muscle qui sont à l’origine de cette diversité.
I.2.1. Généralités
Dès la fin du 19ème siècle, Ranvier (1873, 1874) observait que l’aspect microscopique des
fibres de muscles striés blancs à contractions rapides était différent de celui des fibres de
muscles striés rouges à contractions lentes. Des études histologiques révélèrent ensuite qu’à
l’intérieur d’un même muscle les fibres différaient entre elles par leur morphologie (Knoll,
1891) et leur structure (Krüger, 1952). Ce n’est que dans les années 1960-1970 que différents
types de fibres ont été définis en fonction de leurs propriétés contractiles et métaboliques.
Les fibres musculaires striées sont des cellules multinucléées de forme généralement
cylindrique, structure caractérisant l’unité fonctionnelle du muscle. Le centre du muscle est
notamment constitué de fibres d’aspect fusiforme ou effilé alors qu’au niveau du tendon on
trouve essentiellement des fibres d’aspect conique. Les fibres musculaires se présentent donc
comme des fuseaux longs et fins ayant un diamètre de 10 à 100 µm et une longueur pouvant
aller jusqu’à 30 cm. Le diamètre des fibres est variable, les fibres constituant la périphérie du
muscle étant d’un diamètre inférieur à celles présentes au centre du muscle. D’un point de vue
mécanique, un muscle est d’autant plus puissant qu’il est composé de fibres longues à grand
diamètre.
Chaque fibre multinucléée est entourée d’une membrane ou sarcolemme formée par
l’association d’une membrane plasmique et d’une épaisse lame basale riche en glycoprotéines
et en fibres conjonctives, l’ensemble constituant une architecture à haute résistance
mécanique.
Le cytoplasme de la fibre ou sarcoplasme est dans sa presque totalité rempli de faisceaux
d’éléments contractiles : les myofibrilles. Celles-ci forment de longs cylindres de 1 à 2 µm de
diamètre qui présentent une striation transversale périodique caractéristique qui est à l’origine
de la dénomination de muscle strié. Cette striation est due à un arrangement particulier de
deux types de constituants du système contractile : la myosine et l’actine. Ces filaments sont
organisés dans des éléments répétitifs appelés sarcomères limités par des bandes Z (figure 2).
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Chaque sarcomère présente une alternance de filaments épais (constitué majoritairement de
myosine) et de filaments plus mince (actine), ces derniers étant attachés aux bandes Z. La
superposition de ces filaments détermine l’organisation en bandes A (foncées, anisotropes) et
I (claires, isotropes).
A l’état natif, la myosine est un oligomère de 500 kDa constitué de deux chaînes lourdes de
200 kDa et de quatre chaînes légères de 15 à 30 kDa selon leur origine (Gershman et al. 1969;
Weeds and Lowey 1971). Les deux chaînes lourdes sont associées par leur région C-terminale
sur laquelle viennent s’associer deux chaînes légères. La diversité des chaînes lourdes sera
traitée dans le paragraphe I.2.3. La myosine porte une activité ATPasique intrinsèque qui est
activée par son interaction avec l’actine et assure ainsi la transduction mécanochimique.
La contraction musculaire se produit par glissement des filaments épais entre les filaments
fins suite à l’interaction des structures globulaires des molécules de myosine avec les
molécules d’actine.
I.2.2. Propriétés contractiles et métaboliques
Elles dépendent essentiellement des myosines dont les propriétés moléculaires permettent une
contraction lente ou rapide, prolongée ou brève. En 1967, Barany montrait ainsi que la vitesse
de contraction de muscles entiers était proportionnelle à l’activité ATPasique de leurs
myosines. La classification des différents types de fibres en fonction de leurs propriétés
contractiles a donc été basée sur l’activité ATPasique de l’actinomyosine. Les différences de
sensibilité de celle-ci au pH ont permis de distinguer les fibres ayant une vitesse de
contraction rapide (type II) ou lente (type I), pour lesquelles les activités ATPasiques sont
respectivement inhibées à des pH acides ou alcalins (Guth and Samaha 1969).
Par ailleurs, l’analyse de muscles constitués essentiellement d’un type de fibres a révélé que
les muscles rapides, peu irrigués, pauvres en mitochondries, utilisent essentiellement la
glycolyse anaérobie pour couvrir leurs besoins énergétiques alors que les muscles lents,
abondamment vascularisés et riches en mitochondries, puissent leur énergie dans les
mécanismes oxydatifs (revue, Bacou and Vigneron 1988). Ces différentes propriétés sont en
rapport avec les fonctions de ces muscles. Les muscles lents, impliqués essentiellement dans
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la posture, doivent être capables de contractions soutenues et économiques alors que les
muscles rapides, qui contribuent à des mouvements de courte durée, nécessitent une
couverture énergétique immédiatement disponible. Des mesures d’activités d’enzymes
impliquées dans l’une ou l’autre de ces voies (par exemple la phosphorylase pour la glycolyse
et la succinate deshydrogénase pour la voie oxydative) ont permis de distinguer des fibres
oxydatives, des fibres oxydoglycolytiques et glycolytiques.
A l’heure actuelle, l’appréciation des activités ATPasique et métaboliques, l’utilisation de
diverses approches méthodologiques (immunologies, de biologie moléculaire), permettent de
classer schématiquement les fibres des muscles adultes selon la nomenclature suivante :
Les fibres de type I, qui sont capables de contractions lentes et sont caractérisées par leur
métabolisme essentiellement oxydatif,
Les fibres de type II, capables de contractions rapides et qui se subdivisent en sousgroupes :
les fibres IIA à métabolisme oxydoglycolytique,
les fibres IIB à métabolisme glycolytique,
les fibres IID/IIX (présentes chez le rat, la souris, prédominantes chez le lapin et
l’homme) aux propriétés intermédiaires (Hamalainen and Pette 1993; Aigner et al. 1993)
Les fibres musculaires ainsi classées tirent leurs propriétés d’isoformes spécifiques des
diverses protéines contractiles qu’elles expriment. L’utilisation de techniques comme
l’immunohistologie et celles de la biologie moléculaire, et certaines techniques biochimiques
appliquées à des fibres isolées, ont rendu possible l’identification de ces isoformes. Il est ainsi
apparu que, outre la présence d’isoformes de protéines de l’appareil contractile telles que la
myosine, la troponine et la tropomyosine, existaient aussi des isoformes de protéines
impliquées dans la régulation de la vitesse de contraction des fibres, via la concentration en
Ca 2+ intracellulaire.
I.3. Origine des cellules musculaires
Les tissus musculaires squelettiques des mammifères ont comme origine des cellules souches
embryonnaires ayant de nombreuses fonctions encore peu connues. Ces cellules souches sont
dérivées des somites (Grinnell 1995 ; Buckingham 2001). Elles sortent des bords hypaxiaux
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de la partie dorsale des somites (Buckingham et al. 2003) et migrent vers les bourgeons des
membres où elles prolifèrent tout en exprimant de nombreux facteurs de détermination
myogénique et se différencient par la suite en cellules du tissu musculaire squelettique
(Figure 3).
I.4. La myogenèse
La myogenèse est l’ensemble des processus qui contribuent à la formation du muscle. Elle
débute donc par la multiplication active de cellules musculaires mononucléées ou myoblastes,
qui se distinguent des autres types cellulaires par l’expression de protéines comme les facteurs
de transcription myogéniques de la famille MyoD, des protéines telle la βénolase et des
protéines de structure comme la desmine et la dystrophine. Sous l’influence de facteurs
externes, les myoblastes sortent du cycle cellulaire et, bloqués en phase G1, s’engagent dans
la voie de la différenciation terminale. D’un point de vue morphologique, cette étape
correspond à la fusion des myoblastes en structures plurinucléées, les myotubes. Cette étape
s’accompagne d’une différenciation biochimique caractérisée par l’expression de protéines
impliquées dans la structure et la fonction de la future fibre musculaire (actine, myosine,
troponine, récepteurs de l’acétylcholine...) et par l’expression d’enzymes impliquées dans la
voie énergétique musculaire, comme l’isoforme M de la créatinine phosphokinase. Au cours
de la vie fœtale, les myotubes se développent progressivement pour former les fibres
musculaires qui acquièrent, dans les premières semaines postnatales, leurs caractéristiques
adultes sous l’influence de facteurs externes (nerveux, hormonaux, fonctionnels...).
Chez les vertébrés supérieurs, la myogenèse se déroule en deux temps au cours duquels se
forment des fibres qualifiées respectivement de première et de seconde génération. Les fibres
de première génération dérivent de la maturation de myotubes primaires, qui eux même
résultent de la fusion synchrone de myoblastes présents au cours des phases précoces de
l’embryogenèse (8-10 semaines de développement)). A la périphérie de ces myotubes
primaires, une deuxième génération de myoblastes va se multipler pour progressivement
fussionner et former le long des myotubes primaires une deuxième série de myotubes, les
myotubes secondaires (11 à 18 semaines de développement)(Barbet et al., 1991). Mais en
aucun cas, les myotubes secondaires fusionnent avec les myotubes primaires (Ontell and
Kozeka 1984, Harris et al. 1989). Ces derniers, étroitement liés aux myotubes primaires par
une matrice extracellulaire commune, des interdigitations ce leurs membranes et des jonctions
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communicantes, vont par la suite, s’individualiser et générer les fibres de seconde génération
qui constituent l’essentiel des fibres d’un muscle adulte (Duxson et al. 1989).
I.4.1. Diversité des myoblastes
Les myoblastes qui contribuent à la formation des muscles périphériques présentent des souscatégories distinctes mises en évidence par des techniques de culture clonale de cellules
musculaires. Les premiers travaux dans ce domaine ont été réalisés par Hauschka 1974 puis
White en 1975 à partir de bourgeons de membres d’embryons de caille et de poulet (White et
al. 1975). Ces travaux montrent que des myoblastes prélevés à différents stades du
développement se distinguent par leurs exigences nutritionnelles lorsqu’ils sont amenés à se
différencier, et par leur index de fusion. D’une façon générale, Hauschka et collaborateurs
distinguent ainsi des myoblastes « précoces » (5-6 jours in ovo) qui nécessitent un contact
prolongé avec un milieu nutritif conditionné par des cellules musculaires et ont un faible
index de fusion, et les myoblastes « tardifs » (9 jours in ovo) peu exigeants d’un point de vue
nutritionnel et capables de former de longs myotubes comportant un plus grand nombre de
noyaux. En raison de leurs stades de prélèvement, les qualitatifs de myoblastes « précoces » et
« tardifs » furent remplacés respectivement par ceux d’embryonnaires et fœtaux chez les
Mammifères (Stockdale and Miller 1987).
D’autres critères permettant distinguer des myoblastes embryonnaires des fœtaux vinrent par
la suite s’ajouter aux critères nutritionnels et morphologiques (Tableau 1). Ces critères
reposent sur l’expression préférentielle ou spécifique de protéines dans l’un ou l’autre type de
myoblastes. Certaines de ces protéines, comme la desmine et la sous unité α7 de l’intégrine,
apparaissent dès le stade prolifératif. D’autres ne sont exprimées que par des myotubes
dérivés de ces différents types de myoblastes et sont pour l’essentiel représentés par les
isoformes de chaînes lourdes de myosine. Par ailleurs, les myoblastes embryonnaires se
distinguent aussi des myoblastes foetaux en fonction de leur capacité à proliférer et/ou à se
différencier en présence de certaines subtances (phorbol-esters, par exemple) ou facteurs de
croissance (FGF et TGFβ) auxquels, ils sont plus ou moins sensibles. Depuis les années 1980,
la filiation entre les myoblastes embryonnaires et fœtaux est l’objet de nombreuses études. En
raison de leur apparition successive au cours du développement, il était tentant d’imaginer
que, l’environnement des cellules évoluant, les myoblastes fœtaux dérivaient des myoblastes
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embryonnaires. Or, les myoblastes embryonnaires conservent leurs caractéristiques quel que
soit le type d’environnement auquel ils ont été expérimentalement soumis (Womble and
Bonner 1980), et quel que soit le nombre de cycle qu’ils réalisent en culture au cours de
passages successifs (Mouly et al. 1987). Il semble donc que les myoblastes embryonnaires ne
génèrent pas les myoblastes fœtaux.
Tableau 1 : Critères permettant de distinguer in vitro les myoblastes embryonnaires et foetaux
Type de cellules myoblastiques
Caractères
Myoblastes
Myoblastes
Stade
distinctifs
embryonnaires
foetaux
(a)
α7 intégrine
-
+
(b)
desmine
+
++
Myoblastes
(c)
sensibilité au
non
oui
Prolifératif
Myotubes issus
TGFβ
(d)
MLC2 lente
+
-
(d)
MLC2 rapide
-
+
(e)
MyHC néonatale
-
+
de différents
types de
myoblastes
différenciés
D’après les références: (a): George-Weinstein et al., 1993 ; (b) Yablonka- Reuveni et Nameroff (1990) ;
Kaufman et al., 1991 ; (c) : Cusella De Angelis et al., 1994 ; (d) : Mouly et al., 1987 ; Toutant et al., 1984 ; (e) :
Smith et Miller (1992) ; Cho et al., 1993 ; Pin et Merrifield (1993)
-: absence de la protéine
+: présence de la protéine
Le nombre de croix indique le niveau d’expression de la protéine.
Ainsi, au cours de la vie embryonnaire et fœtale, la formation des muscles squelettiques
périphériques, et sans doute axiaux, mobilise au moins deux classes de myoblastes
appartenant à des lignages distincts et dont les précurseurs migrent à des stades différents du
développement (Seed and Hauschka 1984). Comme nous le verrons par la suite, une troisième
population de myoblastes, les cellules satellites, se met en place au cours du dernier tiers de la
gestation. Elle contribue à la croissance postnatale des fibres préalablement formées par les
myoblastes embryonnaires et fœtaux, et à la régénération des tissus musculaires lésés chez
l’adulte.
Page -25-
I.4.2. Mécanismes moléculaires de l’engagement myogénique et de la
différenciation
Des études, pour la plupart assez récentes, ont permis d’identifier des facteurs spécifiques
jouant un rôle essentiel dans le processus de la myogenèse (Figure 4). Les membres de la
famille Wnt qui sont produits par le tube neural dorsal en combinaison avec d’une part « sonic
hedgehog » issu de la notocorde et de la plaque ventrale du tube neural, et d’autre part, divers
facteurs ectodermiques, auraient un rôle important dans l’induction des cellules précurseurs
myogéniques dans les somites (Lassar and Munsterberg 1994; Lassar and Munsterberg 1996 ;
Molkentin and Olson 1996). Les mécanismes par lesquels ces signaux inductibles activent la
voie myogénique sont inconnus.
Une avancée significative sur la compréhension de l’engagement des cellules dans la voie
myogénique a été la découverte de facteurs de transcription spécifiques du muscle
squelettique et homologues du protooncogène c-myc (Molkentin and Olson 1996 ; Olson and
Klein 1994). Transfectés dans des cellules non-musculaires variées, ces facteurs myogéniques
de structure basique hélice-boucle-hélice (bHLH), tels que myf-5, MyoD, myogénine et
MRF4, ont tous la capacité de conférer des caractéristiques de cellules musculaires
squelettiques (Molkentin and Olson 1996 ; Olson and Klein 1994). Ces polypeptides,
regroupés dans une famille dénommée la famille MyoD, se dimérisent, grâce à leur région
HLH, avec les produits du gène E2A qui sont exprimés de façon ubiquitaire et qui ont
également une structure bHLH. Ces hétérodimères se lient, par leur région basique, à la
séquence consensus CANNTG (appelée E-box) dans les régions régulatrices des gènes
spécifiques du muscle squelettique, et activent leur transcription (Molkentin and Olson 1996 ;
Olson and Klein 1994). Ils permettent aussi la transcription de certaines protéines musculaires
comme la créatinine kinase musculaire, les α-actines cardiaque et squelettique, diverses
chaînes de myosine, la troponine I, la troponine T, les tropomyosines, la sous-unité α du
récepteur de l’acétylcholine, la desmine). La capacité des membres de la famille MyoD de se
lier à l’ADN est influencée par la présence du peptide Id (« Inhibitor of differentiation »),
apparenté également à c-Myc (Benezra et al. 1990). Id est une protéine HLH à laquelle il
manque la région basique adjacente au domaine HLH essentielle pour la liaison spécifique à
l’ADN. En milieu riche en sérum, les myoblastes prolifératifs expriment des niveaux élevés
de protéines Id. Ces protéines qui vont pouvoir s’associer spécifiquement aux facteurs de
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transcription bHLH de la famille de MyoD formeront des complexes hétérodimériques non
fonctionnels, incapables de se fixer à l’ADN du fait de l’absence de domaine de liaison à
l’ADN dans la structure de la protéine Id (Benezra et al. 1990). Ainsi la régulation à la baisse
de l’expression des facteurs Id est nécessaire pour la différenciation, et la surexpression des
protéines Id inhibent la myogenèse (Benezra et al. 1990 ; Jen et al. 1992).
L’expression des gènes spécifiques du muscle squelettique ne nécessite pas seulement leur
activation par les facteurs myogéniques bHLH, mais également une interaction coopérative de
ces facteurs avec des membres de la famille MEF2 (« Myocyte Enhancer Factor-2 »)
(Figure5) ( Molkentin et al. 1995).
Chez les Vertébrés, il y a 4 membres de la famille MEF2 qui sont produits par des gènes
séparés, mef2a, mef2b, mef2c et mef2d. Les facteurs MEF2 appartiennent à la famille des
facteurs de transcription MADS box (« MCM1-Agamous-Deficiens-Serum response factor
box »). Ils possèdent deux domaines : le domaine MADS et MEF2. Ces domaines adjacents et
très conservés permettent leur liaison à l’ADN et leur dimérisation avec les protéines de la
famille MyoD. Les produits du gène MEF2 se lient aux régions riches en A/T dans les
promoteurs et les « enhancers » des gènes spécifiques du muscle squelettique et il est suggéré
que ces facteurs jouent un rôle dans l’amplification et le maintien de l’expression des gènes
spécifiques du muscle squelettique (Molkentin et al. 1995). Les mécanismes potentiels
permettant l’activation des gènes musculaires par les facteurs de transcription de la famille
MyoD en coopération avec les autres facteurs de transcription MEF2 sont indiqués Figure 5.
Dans les cellules musculaires en culture, MEF2D est exprimé dans les myoblastes
prolifératifs avant le début de la différenciation (Breitbart et al. 1993), tandis que, MEF2A
apparaît quand les cellules entrent dans la voie de différenciation. MEF2C est exprimé
tardivement dans le programme de différenciation. La signification de ces différences
d’expression des protéines MEF2 n’est pas claire. Cependant, les produits du gène MEF2 ne
sont pas spécifiques du muscle squelettique et, à la différence des facteurs myogéniques
bHLH, ils sont incapables d’induire la myogenèse quand ils sont transfectés seuls dans des
fibroblastes (Molkentin et al. 1995 ; Molkentin and Olson 1996).
Il a été découvert un autre facteur de transcription myogénique, le facteur MNF (« myocyte
nuclear factor ») appartenant à la famille de facteurs de transcription de type « winged-helix »
ou HNF-3 (hepatocyte nuclear factor-3)/ « fork head » (Bassel-Duby et al. 1994). MNF est le
premier membre de la famille de protéines à être exprimé exclusivement et de façon sélective
dans les cellules précurseurs du muscle squelettique cardiaque et squelettique durant le
Page -27-
développement embryonnaire. Cette expression est transitoire, puisque quand les cellules sont
différenciées son expression chute. De plus, l’expression de MNF est plus abondante dans les
cellules satellites, qui sont dans un état myogénique précoce précédant l’activation des
protéines bHLH de la famille de MyoD. L’expression de MNF dans ces cellules est
persistante dans le muscle à l’état postnatal (Garry et al. 1997). En fait, le facteur MNF est
maintenant appelé MNF-α, depuis la découverte d’une autre isoforme, nommé MNF-β. La
proportion relative de ces deux isoformes diffère en fonction de l’étape du programme
myogénique. En effet, MNF-β est régulé à la hausse au moment de l’arrêt du cycle cellulaire
et l’initiation de la différenciation myogénique. Il se lie à l’ADN sur des séquences
spécifiques et fonctionne comme répresseur de la transcription de gènes (Yang et al. 1997).
MNF-α, au contraire, est exprimé à l’état prolifératif quand les myoblastes ne sont pas
différenciés. MNF-α ne se lierait pas directement à l’ADN, mais pourrait agir comme coactivateur ou bien comme co-répresseur en relation avec d’autres facteurs encore
indéterminés.
D'
autre part, l’expression spatio-temporelle des facteurs de détermination myogénique tels
que la myogénine, myf5, MRF4 ainsi que les membres des familles de MyoD, Wnt et Pax en
présence de molécules de signalisation comme les facteurs de croissance IGF, FGF-2, FGF-4
et TGFβ coordonnent la prolifération et la différenciation myogénique des cellules (Rudnicki
and Jaenisch 1995; Buckingham 2001).
I.4.3. La différenciation myoblastique est-elle irréversible?
La différenciation des cellules myoblastiques en myotubes puis en fibre est l’étape finale de la
myogénèse. Suite à des observations in vitro, Moss et Leblond en 1971 montrent que la fibre
musculaire mature, bien que multinucléée, est incapable de se diviser. Or, de récents travaux
sur les Urodèles ont montré qu’il existe une possible dédifférenciation des cellules
multinucléées en cellules mononucléées (Lo et al. 1993 ; Stocum 1999). Il est à noter,
toutefois qu’il existe une grande différence entre les fibres musculaires des Urodèles et celles
des Mammifères. Effectivement, les noyaux des fibres musculaires des Urodèles peuvent
s’activer et rentrer de nouveau dans le cycle cellulaire par adjonction, dans le milieu de
culture, de sérum et de facteurs extracellulaires, ce qui n’est pas le cas en ce qui concerne les
cellules de souris (Tanaka and Brockes 1998).
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Par ailleurs, il a été montré que des noyaux de myotubes de Mammifères sont capables
d’entrer en phase S par sur-expression d’une oncoprotéine virale EIA ou SV4O large T
antigène (Endo and Nadal-Ginard 1998). Ces observations laissent à penser qu’il manquerait
dans les conditions normales un signal de transduction permettant cette dé-différenciation,
comme celle obtenue chez les Urodèles (Tanaka and Brockes 1998, Hughes 2001). On peut
donc se poser la question de savoir, quelles différences existent entre ces deux organismes a
propos de ces mécanismes de régulation et si un signal extracellulaire est capable d’induire ce
phénomène.
De récents travaux effectués sur les cellules murines C2C12 (lignée cellulaire myogénique
primaire) montrent qu’il existe une nouvelle molécule encore peu étudiée, la myoseverine,
permettant de déclencher le retour (ou la dé-différenciation) de l’état de myotube (phase
terminale de la différenciation myogénique) à l’état de cellules myoblastique primaires
(Rosania et al. 2000). De plus, ce phénomène de réversibilité des C2C12 s’accompagne d’une
augmentation des cellules graisseuses (Ross et al. 2000) ou des ostéoblastes (Katagiri et al.
1994) suite à la modification de signaux extracellulaires. Ce mécanisme fait intervenir une
suppression de l’expression des MRFs ou de leurs activités, ceci pouvant être obtenu par une
expression forcée de E1A activée, de ras ou de Msx1 (Enkemann et al. 1990; Haider et al.
1994).
Enfin, d’autres études réalisées sur les C2C12 montrent que l’expression de Msx1 (Odelberg
et al. 2000) inhibe la différenciation terminale et induirait la division des myotubes ave une
perte de l’expression d’aux moins trois types de MRFs connus.
Ces phénomènes peuvent être résumés dans la figure 6 ci-après
Les facteurs en bleu favorisent la myogenèse, les facteurs en rouge favorisent la dédifférenciation et les facteurs
en noir favorisent la différenciation
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Figure 6 : Facteurs impliqués dans les étapes de prolifération, différenciation et de
dédifférenciation (Hughes 2001).
I.4.4. Prolifération et différenciation, événements mutuellement exclusifs ?
Le passage de la prolifération à la différenciation implique une régulation du cycle cellulaire,
liée à la myogenèse. Nous venons de voir que, dans les myoblastes, l’action myogénique des
facteurs de la famille des MRF était bloquée par les protéines Id induites par les facteurs de
croissance. Une avancée significative a été effectuée par la découverte que les facteurs de
transcription spécifiques du muscle peuvent interagir directement avec le produit du gène Rb
(rétinoblastoma), un élément clé de la machinerie cellulaire (Gu et al. 1993). Rb est un facteur
nucléaire ubiquitaire qui alterne entre des formes phosphorylées, hypophosphorylées ou nonphosphorylées (Chen et al. 1989 ; Gu et al. 1993). Quand il n’est pas phosphorylé, Rb
fonctionne comme un suppresseur de la croissance et agit en phase précoce G1 du cycle
cellulaire (Chen et al. 1989 ; Gu et al. 1993). C’est sous cette forme que Rb interagit
parallélement avec l’expression de MyoD ou la myogénine, ce qui bloque la prolifération et
stimule la différenciation (Gu et al. 1993). Cependant, en milieu et fin de G1, juste avant
l’initiation de la synthèse d’ADN, Rb devient phosphorylé. Il ne peut plus inhiber la
croissance, et ne peut plus se lier à MyoD ou à la myogénine, de sorte que la différenciation
est inhibée (Sherr 1994). Rb est phosphorylé par des kinases dépendantes des cyclines (cdk)
qui peuvent être inhibées par des protéines inhibitrices, dénommées cdkI. L’expression de ces
inhibiteurs bloque la prolifération, favorise la différenciation et, inversement, la mise en place
du programme myogénique est corrèlée avec leur augmentation. Durant la différenciation et le
développement du myotome, il y a induction des cdkI (p21 et de p27) (Zabludoff et al. 1998).
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La surexpression de p21 favorise la différenciation même en présence de sérum, cette
surexpression étant activée par MyoD (Figure 7).
Figure 7 : Action de p21 sur les facteurs myogéniques au cours de la prolifération et de la
différenciation myogénique
Les gènes de ces facteurs de transcription sont exprimés au cours du développement selon une
chronologie précise (Figure n° 8). Les myoblastes se distinguent de leurs précurseurs- les prémyoblastes- par l’expression des protéines de différenciation myogénique MyoD et Myf-5
(Weintraub 1993; Lassar and Munsterberg 1994). En générale, MyoD et Myf5 sont exprimés
dans les myoblastes en prolifération, alors que la myogénine et MRF4 sont principalement
exprimés dans les myoblastes lors de la sortie du cycle cellulaire.
Par des expériences de « knock-out », il a été montré que la myogénine est essentielle à la
formation des fibres musculaires et que son absence ne peut être compensée par d’autres
protéines de la même famille (Rawls et al. 1995).
MyoD, MRF4, Myf5 et la myogénine ont des rôles biologiques distincts, et avec des
différences d’expression, ils contrôlent le développement du muscle squelettique. Le rôle
différentiel semble confirmé par les résultats obtenus par Chakraborty et al. 1991, attribuant
Page -31-
aux domaines amino- et carboxy-terminaux de la région bHLH, la spécificité de chaque
facteur myogénique.
II.
La régénération musculaire
Au cours de l’existence, le muscle squelettique subit un certain nombre de traumatismes
d’origines accidentelles ou génétiques. Dans tous les cas, les cellules musculaires s’activent
après la lésion, ce qui permet une reconstruction tissulaire précise.
II.1.Les cellules myogéniques : les cellules satellites
II.1.1. Structure
Dans le muscle mature, les cellules satellites sont en contact étroit avec la fibre musculaire, et
sont localisées entre la membrane plasmique de cette dernière et sa lame basale (figure n°9)
(Mauro 1961). La membrane de la fibre musculaire présente une dépression en regard de la
cellule satellite. L’espace existant entre les membranes plasmiques de la cellule satellite et de
la fibre adjacente est réduit à environ 20 nm, rendant impossible, par observation en
microscopie photonique, la distinction entre les noyaux des fibres musculaires (appelés
« myonuclei ») et ceux des cellules satellites (Schmalbruch et al. 1991). Le contour des
cellules satellites contre la fibre n’est pas régulier mais montre des extensions cytoplasmiques
enchâssées dans des sillons formés par la membrane plasmique des fibres musculaires. La
proportion volumétrique noyau/cytoplasme est faible (environ 0,63) (Watkins and Cullen
1986). Le cytoplasme très réduit contient quelques mitochondries, du réticulum
endoplasmique rugueux, un appareil de Golgi, des filaments intermédiaires et des vésicules
lysosomales, ces organites étant faiblement développés par rapport à d’autres types
cellulaires. (Mauro 1961 ; Watkins and Cullen 1986).
Dérivées du mésoderme somitique (Armand et al. 1983), les cellules satellites apparaissent à
la fin de la vie fœtale. Elles ont été aussi qualifiées de « myoblastes adultes » (Stockdale
1992) en raison de leur capacité à reproduire in vivo, (au cours de la régénération musculaire)
Page -32-
et in vitro (prolifération des myoblastes, différenciation en myotubes et formation de fibres
musculaires) les différentes étapes de la myogenèse.
II.1.2. Origine des cellules de la régénération
II.1.2.1. Origine embryonnaire
Par des expériences de greffes hétérospécifiques de somites de caille chez le poulet, il
a été montré que les cellules satellites ont, comme les myofibres, une origine somitique et on
en a conclu qu’elles faisaient partie de la lignée myogénique (Armand et al. 1983).
Cependant, le même type d’expérience indique que les cellules satellites extraites de muscles
postnataux ne peuvent pas participer à la myogenèse embryonnaire et qu’elles constituent
donc par rapport aux myoblastes embryonnaires, une classe distincte de cellules myogéniques
(Chevallier et al. 1986; Auda-Boucher and Fontaine-Perus 1994). Cette notion est renforcée
par l’existence d’un ensemble de différences phénotypiques entre les cellules satellites et les
myoblastes précoces ou tardifs après leur mise en culture (revue : Grounds 1991; Schultz and
McCormick 1994). On peut citer l’expression du récepteur de l’acétylcholine dans les
myoblastes adultes et les cellules satellites, qui s’avére absente dans les myoblastes précoces
et tardifs (Cossu et al. 1987), l’expression différentielle d’isoformes de la chaîne lourde de
myosine (MyHC) après formation de myotubes (Hartley et al. 1991; Smith and Miller 1992)
ou la différence de sensibilité au TPA (12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate) qui inhibe la
différenciation in vitro des myoblastes précoces ou adultes (Cossu et al. 1988).
II.1.2.2. Distribution des cellules satellites en fonction du type de muscle
et de l’âge
Eléments cellulaires constitutifs des muscles squelettiques, les cellules satellites présentent
une distribution qui varie selon l’âge, le type de muscles et la fibre donnée.
Chez les animaux nouveau-nés, les noyaux des cellules satellites représentent environ 30%
des noyaux musculaires totaux. Ce pourcentage diminue progressivement avec l’incorporation
des cellules satellites dans les fibres pré existantes pour atteindre chez l’adulte des valeurs
comprises entre 1,9 et 9,6% selon les espèces (Tableau 3) (Schmalbruch and Hellhammer
Page -33-
1977 ; Gibson and Schultz 1983). Avec l’âge, le pourcentage de cellules satellites continue de
diminuer légèrement. Cette diminution est le résultat d’une augmentation des myonucléi
(myofibres oxydatives et glycolytiques) et d’une diminution du nombre total de cellules
satellites (myofibres glycolytiques) (Bischoff 1994 ; Schultz and McCormick 1994). Pour
Snow (1977), certaines cellules satellites passeraient alors dans l’espace interstitiel des fibres
musculaires; pour Schultz and McCormick 1994, cette diminution pourrait être aussi attribuée
au remplacement des noyaux des fibres par des cellules satellites non renouvelées par la suite.
Le nombre de cellules satellites et leur proportion relative à l’ensemble des noyaux d’un
muscle est plus important dans les muscles oxydatifs ou de type lent que dans les muscles
glycolytiques ou de type rapide (Gibson and Schultz 1983; Barjot et al. 1995). Cette
distinction serait reliée à leur composition en différents types de fibres puisqu’il apparaît
qu’aux fibres oxydatives est associé un plus grand nombre de cellules satellites qu’aux fibres
glycolytiques (Schmalbruch and Hellhammer 1977). En conséquence, la proportion de
cellules satellites relatives à un muscle d’un type donné dépend indirectement des facteurs
impliqués dans l’acquisition du phénotype (rapide ou lent) de ce muscle. L’innervation et/ou
l’activité motrice joueraient un rôle important (Schultz 1984).
Il est difficile d’expliquer l’origine de ces différences. Certains auteurs ont suggéré qu’elles
puissent être liées aux caractéristiques de croissance intrinsèque à chaque type de fibres. Kelly
en 1978 a montré que la croissance des fibres oxydatives est essentiellement hyperplasique
alors que celle des fibres glycolytiques est plutôt hypertrophique. La croissance des fibres
oxydatives requiererait ainsi un plus grand nombre de cellules satellites que celle des fibres
glycolytiques. De plus, chez le rat, la croissance du soléaire est plus rapide que celle de l’EDL
Alors que l’incorporation des cellules satellites dans le soléaire est maximale au troisième
mois postnatal, les cellules satellites continuent à s’incorporer progressivement dans l’EDL
jusqu’au dixième mois postnatal (Gibson and Schultz 1983).
II.1.2.3. Hétérogénéité des cellules satellites
Les cellules satellites d’un même muscle mises en culture donnent des clones de tailles très
hétérogènes. La distribution de ces tailles varie en fonction de l’âge du donneur : chez le rat,
la taille des clones diminue jusqu’à trois mois pour rester stable ensuite (Schultz and Lipton
1982). On observe aussi une diminution de la taille des clones après des régénérations
Page -34-
successives provoquées par un myotoxique (Schultz and Jaryszak 1985). Ces observations
indiquent que les cellules satellites peuvent avoir un nombre de mitoses limité et que leur
participation à la croissance ou à la régénération entraîne une réduction de leur capacité
proliférative. Elles suggèrent aussi qu’il peut exister deux populations de cellules satellites,
une avec une grande capacité proliférative jouant le rôle de cellules souches et une autre se
divisant moins et se différenciant rapidement. Cette hypothèse est confortée par les
expériences de Rantanen, qui interprète le décalage qu’il observe entre la prolifération et
l’apparition de marqueurs myogéniques, par l’existence chez le rat, de deux populations de
cellules précurseurs : des cellules satellites prêtes pour une différenciation immédiate sans
division préalable et des cellules souches proliférant pour d’une part se perpétuer et d’autre
part se différencier (Rantanen et al. 1995). Deux populations similaires, l’une « prédifférenciée », l’autre conservant un phénotype proche de cellules satellites originelles, sont
présentes dans les cultures de cellules satellites humaines (Baroffio et al. 1996).
A la lumière de leurs observations sur la capacité de différenciation des cellules satellites de
souris MyoD(-/-), Sabourin et ses collaborateurs, relient ces deux populations à l’expression
initiale des gènes de détermination myogénique MyoD et myf-5. Ils proposent que
l’expression initiale de MyoD dans des cellules engage celles-ci vers la différenciation alors
que des cellules exprimant initialement myf-5 se multiplient. L’arrêt de l’expression de myf-5
dans ces cellules les ferait retourner à l’état quiescent alors que l’expression secondaire de
MyoD entraînerait leur différenciation (Sabourin et al. 1999).
Les cellules satellites présentes dans les muscles rapides ou lents pourraient aussi constituer
des populations différentes. Un certain nombre d’expériences, chez les oiseaux et les
rongeurs, indiquent qu’il existe deux sous-lignées de cellules satellites correspondant aux
fibres lentes ou rapides. Ces expériences sont basées sur l’expression de protéines spécifiques
des fibres lentes ou rapides (généralement les isoformes de la myosine) ou d’autres caractères
phénotypiques dans des cellules satellites en culture primaire (Matsuda et al. 1983; Feldman
and Stockdale 1991; Barjot et al. 1995; Lagord et al. 1998; Martelly et al. 2000) ou au cours
de la régénération (Cantini et al. 1993; Dolenc et al. 1994). Martelly et al., ont montré qu’in
vitro, à des temps de culture identique, l’expression des mRNA des FGFR1 et FGFR4 ou de
certains facteurs de différenciation (MRF) était différente en fonction de l’origine des cellules
satellites (EDL ou soléaire) (Martelly et al. 2000).
Page -35-
II.1.3. Le déroulement de la régénération
La régénération musculaire est caractérisée par deux phases : la myolyse et l’histogenèse
(Faulkner and Carlson 1986; Schmalbruch 1986). La myolyse commence par une lyse des
fibres lésées, accompagnée par l’invasion de cellules inflammatoire. En fonction de la lésion,
la structure musculaire est plus ou moins profondément atteinte. Au cours de ce processus
lytique, seuls ne persistent que la lame basale, elle-même plus ou moins altérée et des cellules
myogéniques mononucléées, les cellules satellites élément qui seront primordiaux pour
permettre la reconstruction des fibres musculaires.
La régénération d’un muscle squelettique implique des mécanismes différents de ceux du
développement embryonnaire. Lors d’une lésion, la réaction inflammatoire, associée à une
invasion de macrophages et de polynucléaires neutrophiles, participe à la myolyse des fibres
lésées et laisse plus ou moins en place le tube endomysial. L’activation des cellules satellites
en myoblastes proliférants ainsi que la disparition de l’innervation sont deux phénomènes
également impliqués dans ce processus. Ces activités sont régulées par l’hormone de
croissance (GH) (Ullman and Oldfors 1991) ou des facteurs de croissance (Husmann et al.
1996) qui agissent sur des récepteurs membranaires, ce qui provoque l’activation des gènes de
régulation myogénique, les MRF. La sarcolyse induite par injection de venins (notexine,
cardiotoxine, taïpoxine,...) ou de produits myotoxiques (marcaïne, menadione,...) a été
souvent utilisée afin de préserver le tube endomysial (Schmalbruch and Hellhammer 1977;
Caldwell et al. 1990; Robertson et al. 1990; McCall and Duncan 1994) (tableau 2).
Tableau 4 : Extension histologique de la destruction tissulaire selon la nature du protocole
expérimental de lésion utilisé d’après Carlson and Gutmann 1976; Maltin et al. 1983;
Kouyoumdjian et al. 1986; Harris and Cullen 1990; Robertson et al. 1990; Bassaglia and
Gautron 1995
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Réponse tissulaire
Réseau
Protocole
Système
Fibrose
vasculaire nerveux
Cellules
Destruction
satellites
totale
expérimental
de
la
fibre
Venins de serpent :
cardiotoxine, notexine,
taïpoxine, bothropstoxine,
-
-
-
-
non
bupivacaïne,
-
-
-
-
non
mépivacaïne,
+
-
-
-
non
lipocaïne
-
-
-
-
non
procaïne
-
-
-
-
non
écrasement total
+
+
+
-
oui
écrasement focalisé
-
-
-
-
non
éminçage
+
+
+
-
non
microponction
-
-
-
-
non
coupure
-
-
-
-
non
-
-
-
-
non
greffes libres innervées
+
-
+
-
non
greffes libres standards
+
+
+
-
non
Anesthésique locaux :
Mécanique :
Thermique :
congélation
Ischémique :
Un écrasement total du muscle avec dénervation, induit une myolyse complète des myofibres
existantes (Bassaglia and Gautron 1995). Contrairement aux modèles de lésion mécanique
locale (Robertson et al. 1990; Kami et al. 1993) ne permettant que des études histologiques,
ce modèle de régénération présente l’avantage d’être utilisable pour des études très variées à
l’échelle histologique et/ou moléculaire.
II.1.3.1. Dégénérescence et élimination des fibres lésées
Quelques minutes après l’agression tissulaire, les parties endommagées des fibres musculaires
se contractent fortement sous l’effet d’une entrée de calcium extracellulaire (Carpenter and
Karpati 1989). En regard de la lésion, les myofibrilles se contractent et se désorganisent par
individualisation des sarcomères au niveau des stries Z. Ces sarcomères forment ensuite des
amas denses de myofilaments contractés qui vont limiter la fuite du contenu intracellulaire
Page -37-
vers l’extérieur de la fibre, lorsque celle-ci est particulièrement endommagée (Echeverria et
al. 1987; Carpenter and Karpati 1989). Alors que la membrane plasmique est lésée, le
manchon de lame basale persiste englobant les débris membranaires, les amas de myofibrilles
et les myonuclei nécrotiques, qui seront éliminés par des macrophages. Le temps nécessaire
aux macrophages et neutrophiles pour envahir les fibres nécrotiques est fonction de l’intégrité
vasculaire au niveau de la lésion. Dans le cas d’une injection de marcaïne dans un muscle de
rat, les neutrophiles arrivent au site de lésion au bout de quelques heures et les macrophages,
au bout de deux ou trois jours (Orimo et al. 1991). L’intervention des macrophages, qui
persistent au site de lésion beaucoup plus longtemps que les neutrophiles, est indispensable à
la régénération musculaire. En effet, tout dysfonctionnement de leur fonction phagocytaire
entraîne au niveau musculaire une persistance des débris cellulaires et une perturbation
importante de la régénération de fibres (Grounds 1991). Après phagocytose, la lame basale,
bien que persistante, subit des modifications biochimiques (collagènes, laminine, héparanes
sulfates protéoglycannes) (Gulati et al. 1983).
II.1.3.2. Régénération de fibres ou de parties de fibres lésées
Pendant la phase initiale de myolyse, les cellules satellites sont activées et proliférent. Les
macrophages présents produisent du PDGF, du FGF2, du TGFβ ou du LIF qui semblent avoir
à la fois un effet chimiotactique et mitogène sur les myoblastes adultes (Cantini et al. 1995 ;
Grounds 1991; Husmann et al. 1996). Le ou les signaux responsables de l’activation initiale
des cellules satellites ne sont pas clairement définis. Le facteur SF/HGF présent dans des
extraits de muscle écrasé est capable de provoquer l’activation des cellules satellites (Bischoff
1990, Allen et al. 1995 ; Gal-Levi et al. 1998). Après leur activation et leur prolifération, les
cellules satellites fusionnent pour former des myotubes qui vont combler l’intérieur du
manchon (Figure 10) (McGeachie et al. 1993 ; Bischoff and Heintz 1994). La lame basale
définit l’orientation de ces myotubes (Caldwell et al. 1990). Les cellules satellites s’alignent
en chaîne ou en anneau à la face interne de l’ancienne lame basale (Vracko and Benditt 1972).
Dans les myotubes, les sarcomères s’assemblent et les triades se forment. Le nombre de
ribosomes diminue avec le développement de l’appareil contractile. Pendant la phase de
maturation, les fibres musculaires régénérées acquièrent les caractéristiques biochimiques et
physiologiques des fibres adultes. Les premiers stades de la régénération ont lieu
indépendamment de l’innervation, mais l’absence d’une innervation pendant la maturation
Page -38-
entraîne l’atrophie des fibres et leur disparition. La réinnervation est donc un facteur
important pour la qualité de la régénération.
Parmi les différents facteurs de croissance (PDGF, EGF, IGF-2, FGF) initialement testés sur
des fibres isolées en culture, seuls les FGF (FGF1 ou FGF6) ont un effet sur l’activation
initiale, bien que tous ces facteurs augmentent la prolifération une fois qu’elle est déclenchée
(Bischoff 1986). Yablonka-Reuveni et ses collaborateurs soutiennent l’idée d’un rôle possible
du FGF2 dans l’entrée des cellules satellites dans le cycle cellulaire. Le FGF6 pourrait être
aussi impliqué dans l’activation des cellules satellites. Effectivement sur des souris FGF6(-/-),
on observe un processus de régénération déficient attribué à une absence d’activation ou de
stimulation de la prolifération des cellules satellites (Floss et al. 1997). Le facteur de
croissance le SF/HGF réduit le délai d’entrée des cellules satellites dans le cycle cellulaire
(Allen et al. 1995 ; Gal-Levi et al. 1998). Il est présent dans les muscles intacts (et donc dans
les extraits de muscle écrasé) (Tatsumi et al. 1998) et son récepteur, c-met, est présent sur les
membranes des cellules satellites quiescentes (Allen et al. 1995 ; Cornelison and Wold 1997).
II.1.3.3. Régénération après écrasement total
Les modèles de dégénérescence et de régénération existants ne permettent pas d’étudier les
variations de protéines matricielles (protéoglycannes, collagènes, laminine, etc...) présentes
dans les basales puisque celle ci n’est pas altérée. C’est pourquoi, le modèle d’écrassement
total mis au point par Bassaglia et Gautron en 1985 semblent être un outil performant dans
notre étude.
Le modèle de régénération musculaire après écrasement a été mis au point au laboratoire
(Bassaglia and Gautron 1995). Il est caractérisé par une dégénérescence complète du muscle
suivie d’une reconstruction. Il a été montré que la capacité de régénération de l’EDL après
écrasement total diffère de celle du soléaire. L’EDL subit une myolyse lente et régénère
lentement mais parfaitement. Il retrouve une structure normale dès 16 jours après la lésion
(figure 11 A et B). Les nouvelles fibres se forment dans l’espace limité par les anciennes
basales dont les constituants sont renouvelés progressivement. Les fibres néoformées sont
réinnervées 16 jours après la lésion. Des cellules mononucléées desmine positives sont
présentes au 3ème jour de régénération et des myotubes sont visibles au 6ème jour après
Page -39-
l’écrasement (Bassaglia and Gautron 1995 ; Aamiri et al. 1995(b)). A l’inverse, le muscle
soléaire passe par une phase de régénération qui stagne vers 16 jours, probablement à cause
d’une réinnervation défectueuse des fibres régénérées (Aamiri et al. 1995(a)). Il est connu que
la réinnervation des fibres régénérées se produit au niveau des anciennes plaques motrices
(Brown and Hopkins 1981). Dans le cas du soléaire, la lame basale est altérée et la
reconstitution de véritables plaques motrices échoue à partir du 13ème jour. A 4 jours, de
nombreux éléments desmine-positifs apparaissent dans le soléaire, parmi lesquels des
myotubes sont identifiés. Sur des coupes transversales de soléaire à 7 jours de régénération,
plusieurs myotubes néoformés sont visibles dans l’ancien espace endomysial. Chacun de ces
myotubes est entouré de sa propre lame basale. Une telle image, caractéristique du soléaire en
régénération, ne se voit pas dans l’EDL (Bassaglia and Gautron 1995 ; Aamiri et al. 1995(b)).
II.2.Les facteurs de croissance dans la régénération musculaire et la myogenèse
II.2.1. Les « Fibroblast Growth Factors” (FGF)
Parmi les facteurs de croissance polypeptidiques impliqués comme régulateur de la
prolifération et de la différenciation myogénique, le FGF est un puissant mitogène pour les
cellules musculaires, aussi bien in vitro que in vivo et il inhibe habituellement aussi la
différenciation myogénique (Clegg et al. 1987).
Les FGF constituent une famille de facteurs de croissance. Ils ont été purifiés grâce à leur
affinité pour l’héparine (Gospodarowicz et al. 1987). Les FGF acide (aFGF) et basique
(bFGF), maintenant appelés FGF1 et FGF2, sont les formes les plus répandues des facteurs de
croissance se liant l’héparine.
La famille des FGF contient à ce jour 21 membres (FGF-1 à FGF-21). Leurs points communs
sont :
a) une haute affinité pour l’héparine ou les héparanes sulfates ;
b) deux cystéines conservées dans leur séquence d’acides aminés ;
c) 30 % d’homologie dans leur constitution (Baird and Klagsbrun 1991). Les
FGF possèdent des propriétés angiogéniques, neutrophiques et mitogènes
(Burgess and Maciag 1989).
La diversité des FGF est encore augmentée par le fait que certains gènes peuvent donner
naissance à différentes formes : un seul ARNm de FGF2, par exemple, code selon le codon
Page -40-
d’initiation utilisé, pour des protéines de taille variable (24,23,22 et 18 000 D), dont les
différences fonctionnelles ne sont pas encore connues.
II.2.1.1. Les FGF dans la myogenèse et la régénération musculaire
L’expression des FGF a été démontrée in vivo et in vitro, à différents stades du
développement musculaire (Olwin et al. 1994 ; Hannon et al. 1996).
Parmi les différents membres de la famille des FGF, certains sont exprimés dans le muscle
squelettique. Leurs rôles dans le développement et la régénération sont complexes et sans
doute variables selon l’espèce et l’état physiologique.
Les ARNm des FGF1, FGF2, FGF6 et FGF7 sont exprimés dans les myoblastes de souris en
prolifération (Hannon et al. 1996). Cependant, au cours de la différenciation, seuls sont
présents les ARNm des FGF5, FGF7 et à un taux moindre ceux de FGF6. Dans les
expériences de Hannon et collaborateurs, l’expression des ARNm des FGF3, FGF4 et FGF8
n’a pas pu être détectée, ni pendant la phase de prolifération, ni pendant la phase de
différenciation. Parmi les FGF sans peptide signal (FGF1, FGF2 et FGF9), seuls les FGF1 et
FGF2 sont impliqués dans la myogenèse (Hannon et al. 1996).
Les voies de transduction impliquées dans ces actions du FGF sur les cellules musculaires ont
été longuement étudiées. Comme le FGF est fortement mitogénique sur ces cellules et qu’en
plus il est capable d’activer la cascade MAP kinases/ERK considérée comme une voie
principalement proliférative (Campbell et al. 1995 ; Milasincic et al. 1996 ; Weyman and
Wolfman 1998), il est logique de penser que c’est cette voie qui est empruntée après la liaison
du FGF sur son récepteur. Le rôle essentiel de la voie MAPK dans le signal transmis par le
FGF2 pour réprimer la différenciation musculaire et/ou le maintien de la prolifération des
myoblastes a été montré par Campbell et al. 1995. De même, Weyman et ses collaborateurs
(1998) ont montré que le FGF2 inhibait la différenciation des myoblastes 23A2 grâce à une
forte stimulation de l’activité des MAPKK et des MAPK/ERK. L’inhibiteur des MEK, le PD
098059, restaure leur différenciation en présence de FGF2. Ces résultats suggèrent que le
FGF2 permet de stimuler l’activation des MEK et des MAPK/ERK, ce qui a pour
conséquence l’inhibition de la différenciation musculaire.
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In vivo, il a été montré que le FGF4 et le FGF6 sont impliqués dans les processus
myogéniques pendant la vie embryonnaire et foetale (deLapeyriere et al. 1993 ; Laufer et al.
1994). Pizette et ses collaborateurs ont montré que le FGF6 est exprimé dans les cellules
satellites de souris (Pizette et al. 1996), et des expériences plus récentes fondées sur
l’invalidation du gène FGF6 (Floss et al. 1997) suggèrent que le FGF6 peut être une molécule
de signalisation importante pendant la régénération musculaire postnatale. Effectivement, les
souris sauvages sur-expriment FGF6 après une blessure musculaire et ceci va de pair avec une
restauration complète du muscle. Au contraire, les souris mutantes FGF6(-/-) montrent un
défaut sévère de régénération avec une fibrose et une dégénérescence des myotubes (Floss et
al. 1997).
II.2.1.2. Les récepteurs aux FGF (FGFR)
Les FGF peuvent agir selon deux façons différente sur les cellules, soit en déclenchant des
voies de transduction par l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase, soit en stimulant
directement des cibles nucléaires par des FGF déjà présents dans la cellule ou des FGF
exogènes internalisés par l’intermédiaire de protéoglycannes à héparanes sulfates (HSPG).
En particulier, les différentes cibles du FGF2 ne sont pas uniquement liées au type de facteur
de croissance, mais aussi à la voie de signalisation : les HSPG et les récepteurs spécifiques
des FGF transmettent des signaux différents à la cellule (Roghani and Moscatelli 1992 ;
Reiland and Rapraeger 1993). Les protéines endogènes de haut poids moléculaire agissent
intracellulairement sur la croissance des cellules, indépendamment de la présence des
récepteurs membranaires aux FGFs côté extracellulaire (Bikfalvi et al. 1995).
II.2.1.2.1. Les récepteurs de haute affinité
On peut distinguer deux groupes de récepteurs de haute affinité : des récepteurs à activité
tyrosine kinase, codés par quatre gènes (FGFR1 à FGFR4), et un récepteur riche en cystéines
(CFR) (Burrus et al. 1992 ; Blanquet and Jonet 1996). Les quatre récepteurs à activité
tyrosine kinase identifiés se lient avec différentes affinités aux FGF (Partanen et al. 1991 ;
Mansukhani et al. 1992).
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La structure de chaque récepteur est relativement constante : une partie extracellulaire pour
l’association avec le ligand, un seul domaine transmembranaire et une partie cytosolique
portant l’activité tyrosine kinase. La structure de la région extracellulaire des FGFR comporte
trois domaines en boucle similaires à ceux des Ig. La première boucle peut être supprimée par
épissage alternatif, ce qui conduit à l’obtention d’une forme extracellulaire courte du
récepteur. Ce changement dans le domaine extracellulaire pourrait moduler l’affinité pour
certains FGF (Wang et al. 1995). L’épissage alternatif des messagers de l’ARN du FGFR
aboutit à 4 isoformes différentes de récepteurs qui possèdent de ce fait des spécificités
différentes d’association au ligand (Werner et al. 1992 ; Ornitz et al. 1996). La boucle IgIII
du FGFR4 est codée par les exons IIIa et IIIc (Vainikka et al. 1992). Pour les FGFR1 et 2, la
boucle Ig III est codée par l’exon IIIa et l’exon IIb ou IIIc selon l’épissage (Chellaiah et al.
1994). Les récepteurs avec le domaine IIIa, ne formant pas de boucle entière, sont des
récepteurs extracellulaires solubles dont la fonction est encore inconnue. Les récepteurs avec
les domaines IIIb ou IIIc, se situent à la surface extracellulaire et fixent les FGF exogènes.
Leur expression est tissu-spécifique : la forme IIIb est limitée aux cellules épithéliales et la
forme IIIc aux tissus mésenchymateux. Le domaine carboxy-terminal de la boucle IgIII est
remarquablement conservé pour les récepteurs FGFR1 à 3 (Chellaiah et al. 1994).
Pendant le développement du muscle squelettique des membres postérieurs de poulet, les
FGFR1 à 3 sont exprimés d’une façon séquentielle très précise. Les ARNm de FGFR1 sont
localisés dans du tissu mésenchymateux non-différencié et en prolifération. Le FGFR2 se
trouve également dans des amas cellulaires de précartilage et FGFR3 dans des nodules de
cartilage en différenciation (Szebenyi et al. 1995). En outre, FGFR1 est nécessaire pour la
prolifération de cellules embryonnaires et pour l’organisation axiale de l’embryon. En cas de
déficience de FGFR1, les embryons ont une croissance retardée et meurent avant la
gastrulation (Deng et al. 1994).
La disparition des récepteurs aux FGF au cours de la différenciation terminale des muscles
des membres est une étape primordiale de la différenciation myogénique (Itoh et al. 1996). La
quantité du FGFR1 est prédominante pendant la phase proliférative d’une multitude de
lignées myogéniques et diminue pendant la maturation des fibres musculaires in vivo et in
vitro (Moore et al. 1991). Il semble même que l’expression des FGFR dans les cellules
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satellites de rat, active les cellules quiescentes pour les faire entrer dans le cycle cellulaire, en
les rendant ainsi sensibles aux facteurs mitogènes (Johnson and Allen 1995).
La transduction du signal par les récepteurs des FGF nécessite en premier une dimérisation
qui est suivie par une autophosphorylation de la partie cytosolique (Ornitz et al. 1992 ;
Partanen et al. 1991). Par ailleurs, une mutation affectant une seule cystéine, dans le domaine
extracellulaire du récepteur, mène aussi à une dimérisation et à une activation de la tyrosine
kinase des récepteurs (Neilson and Friesel 1996). La dimérisation des récepteurs FGFR1 et 2
peut également être effectuée par action croisée des FGF1 et 2 (Bellot et al. 1991), ce qui
conduit aussi à une autophosphorylation. Il existe sept sites de phosphorylation connus dans le
domaine intracellulaire du récepteur FGFR1 (Mohammadi et al. 1996), dont deux sont
essentiel pour l’association à la phospholipase C (PLC) et pour la stimulation de l’hydrolyse
du phosphatidylinositol (Mohammadi et al. 1992). Le rôle des autres sites de phosphorylation
est, à ce jour, inconnu. L’activation du récepteur β du PDGF (Platelet-Derived Growth
Factor), qui mène à la stimulation de la MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) et la
surexpression des gènes précoces (Jun, Fos), ne sont pas suffisante pour inhiber la
différenciation musculaire. Il est probable que le signal du FGF2 doit passer par une autre
voie de transduction pour stimuler la prolifération et inhiber la différenciation des myoblastes
(Kudla et al. 1995).
II.2.1.2.2. Les récepteurs de basse affinité
Les HSPG, soit localisés dans la matrice extracellulaire, soit associés à la face externe de la
membrane plasmique, constituent des sites de basse affinité pour le FGF (Nugent and
Edelman 1992). Cette association entre les HSPG et les FGF est essentielle pour la
biodisponibilité des facteurs (Rapraeger et al. 1991 ; Yayon et al. 1991). L’interaction des
FGF avec les HSPG est cruciale pour la présentation et l’association entre les facteurs de
croissance et leurs récepteurs (Yayon et al. 1991 ; Rapraeger et al. 1991). Le rôle de
présentation des FGF aux récepteurs est accompli de préférence par les HSPG de la surface
cellulaire, ce qui favorise une interaction rapide avec les récepteurs (Schlessinger et al.
1995). La spécificité de l’association du FGF avec son récepteur est due aux chaînes
glycosaminoglycannes des HSPG (Nurcombe et al. 1993). Le FGF-2, sous forme dimérique
(Venkataraman et al. 1996), induit la dimérisation du récepteur, ce qui est nécessaire pour la
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transduction du signal (Mascarelli and Courtois 1993). Certains di- et trisaccharides
synthétiques dérivés de l’héparane pourraient induire la dimérisation des récepteurs (Ornitz et
al. 1996). Des héparines-décasaccharides induisent la dimérisation du FGF2, dont la
conformation est importante pour l’activité biologique.
Il a été montré que le perlécan, un protéoglycanne caractéristique de la lame basale, est le
principal acteur des HSPG associés au FGF2 permettant de stimuler l’effet mitogène,
l’angiogénèse et l’association du ligand FGF2 à son récepteur (Aviezer et al. 1994). Dans le
même groupe des HSPG, il existe des récepteurs membranaires de basse affinité tel que le
syndécan. Une surexpression de syndécan-1 inhibe la stimulation de la prolifération par le
FGF2 (Mali et al. 1993).
En ce qui concerne le rôle joué par l’héparine, il existe des dires contradictoires. Ainsi les
travaux de Roghani et al., 1994 montrent que la présence d’héparine favorise l’affinité des
FGF pour les récepteurs, mais n’est pas essentielle à la formation d’un dimère et à l’activation
du récepteur alors que Spivak-Kroizman et al. 1994 rapporte une nécessité de l’héparine ou
des héparanes sulfates pour la dimérisation et l’activation des récepteurs aux FGF.
Des expériences in vitro ont montré que l’héparine protège le FGF1 et le FGF2 contre leur
inactivation par des protéases, augmentant ainsi leur biodisponibilité (Meddahi et al. 1996).
Ainsi, in vitro, l’héparine ou des dérivés de dextranes substitués ou d’oligosaccharides, en
protègant les facteurs de croissance d’une dégradation chimique et protéolytique, améliorent
l’activité mitogène des FGF (Tardieu et al. 1989 ; Tardieu et al. 1992 ; Gambarini et al.
1993).
II.2.2. Le Transforming Growth Factor β (TGFβ
β)
Ce facteur est produit par tous les types cellulaires de l’organisme. Il régule la prolifération et
la différenciation des cellules, le développement embryonnaire, la réparation tissulaire et
l’angiogenèse (Blobe et al. 2000). Il existe cinq gènes de TGFβ : TFGβ1 à TGFβ5 présentant
plus de 70% d’homologie de structure. Des études chez des souris « knock-out » ont montré
que les TGFβ sont essentiels pour la survie de l’animal, la suppression d’un des gènes
correspondant entraînant la mort embryonnaire ou périnatale (Letterio and Bottinger 1998).
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Depuis de nombreuses années le TGFβ est connu pour jouer un rôle important au cours de la
différenciation myogénique (Olson et al., 1986). Cependant, son action reste encore mal
définie, puisque le TGFβ a été montré comme ayant des effets positifs et négatifs sur le
développement des cellules musculaires. Quant aux voies de signalisation intervenant au
cours de la différenciation musculaire, elles sont quasiment inconnues. D’une façon très
générale comme c’est le cas pour d’autres facteurs de croissance, le TGFβ se lie à des
récepteurs spécifiques ce qui entraine l’activation de différentes voies intracellulaires.
II.2.2.1. Le TGFβ
β dans la myogenèse et la réparation tissulaire
Par ses activités de contrôle de la croissance, le TGFβ joue un rôle important pour la
myogenèse aussi bien in vitro que in vivo. Cependant les données concernant l’effet du TGFβ
sur les myoblastes sont contradictoires : le TGFβ a été décrit comme un mitogène (Robertson
et al. 1993 ; Maley et al. 1995) ou comme un inhibiteur de la prolifération des myoblastes
(Pampusch et al. 1990). Son action inhibitrice sur la différenciation myogénique peut
indirectement favoriser la prolifération des myoblastes. Par contre, en synergie avec des
mitogènes, le TGFβ est capable d’induire la différenciation des myoblastes (Zentella and
Massague 1992). Au cours de cette différenciation, l’Insulin growth factor I » (IGFI) inhibe
l’expression des TGFβ3 et non celle du TGFβ1, en se liant TGFRI (Bosche et al. 1995).
L’inhibition de la différenciation nécessite une présence constante de TGFβ dans le milieu et
passe par un blocage indirect des ARNm des MRF (Riquelme et al. 2001).
L’inhibition de la différenciation par la présence d’un TFGRII tronqué n’empêche pas
l’expression de quelques marqueurs de différenciation myogénique, indiquant l’existence
d’une autre voie possible pour la différenciation (Filvaroff et al. 1994).
De plus, des études récentes indiquent que le TGFβ inhibe la différenciation des cellules
myogéniques seulement quand ces dernières croissent à haute densité. Dans ces conditions, le
TGFβ permet la translocation du facteur de transcription MEF2C du noyau au cytoplasme
(mais pas de myoD, de la myogénine ou de p21), ce qui aurait pour conséquence d’empêcher
MEF2C de participer au complexe transcriptionnel avec les protéines myogéniques bHLH
(De Angelis et al. 1998). Les mécanismes d’action du TGFβ sur le contrôle de la myogenèse
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ne sont pas entièrement élucidés. Brennan et ses collaborateurs en 1991 ont montré que
lorsque l’expression de la myogénine est produite par un vecteur d’expression constitutif, le
TGFβ agit comme un inhibiteur de l’activité transcriptionnelle de la protéine myogénine et
ceci sans affecter sa capacité de se lier à l’ADN.
II.2.2.2. Caractéristiques des TGFβ
β et de leurs récepteurs
Les TGFβ font partie d’une super-famille de polypeptides qui sont importants dans beaucoup
de processus biologiques différents. Les membres de la super-famille incluent entre autres, les
« bone morphogenic proteins » (BMP), l’activine et la myostatine récemment identifiée.
Le TGFβ existe sous une forme de haut poids moléculaire qui est composée de trois sousunités (Flaumenhaft and Rifkin 1992) : le TGFβ actif, son propeptide ou LAP (« latencyassociated peptide ») et une protéine nommée LTBP (« latent TGFβ binding protein »)
(Figure 12). Le TGFβ actif (25kDa) est un homodimère de 112 acides aminés dérivé de la
partie C-terminale de la préprotéine. Le TGFβ mature et le LAP restent associés par des
interactions non covalentes. Sous cette forme, dite latente, le TGFβ est incapable d’interagir
avec son récepteur. La protéine LTBP est un glycopeptide de 125 à 250 kDa qui est associé
par des ponts disulfures au TGFβ latent par l’intermédiaire du LAP. Elle est synthétisée
séparément, mais s’associe avec le TGFβ latent avant d’être sécrétée par les cellules.
Comme les autres membres de cette super-famille, les ligands TGFβ transduisent des signaux
par leur liaison à des récepteurs spécifiques à la surface cellulaire. Il existe trois types de
récepteurs principaux au TFGβ1 : les récepteurs de type I (TβRI), de type II (TβRII) et de type
III (TβRIII).
II.2.2.2.1. Récepteur de type I et II à haute affinité
Les
TβRI de
poids moléculaire 65-70
kDa
sont des
sérine/thréonine
kinases
transmembranaires apparentées se trouvant exprimées sur la majorité des types cellulaires. Ce
sont des glycoprotéines constituées d’un court domaine extracellulaire liant le TGFβ, d’un
domaine transmembranaire et d’un domaine intracellulaire à activité sérine/thréonine kinase.
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Ces récepteurs permettant la transduction du signal de tous les membres de la famille des
TGFβ sauf le GNDF (« Glial cell line-derived Neutrophic Factor ») (Bottner et al. 2000). Il
existe chez les mammifères sept molécules différentes de récepteurs de type I au TGFβ
nommées ALK (Activin receptor-Like Kinase) (Miyazono et al. 1994), celles-ci pouvant être
exprimés sur une même cellule. Les TβRI ont besoin des TβRII ou des récepteurs de
l’activine (membre de la famille des TGFβ ) pour lier leurs ligands. Un seul récepteur au
TGFβ de type II a été cloné (Miossec and Guerne 1999).
II.2.2.2.2. Récepteur de type III à basse affinité
Les TβRIII, également appelés bêtaglycane ou endogline sont lesTβR les plus abondants. Ce
sont des protéoglycannes à héparanes sulfates transmembranaires possédant un court domaine
cytoplasmique. Les TβRIII lient le TGFβ et le transfèrent aux récepteurs responsables de la
transduction du signal, TβRI et TβRII.
II.2.2.2.3. Polymérisation des récepteurs I et II et transduction de signal
Le seul rôle connu des TβRII est d’activer les TβRI responsables de la transduction du signal.
Le TGFβ se lie au TβRII qui est une sérine/thréonine kinase constitutivement active qui
phosphoryle le TβRI. Le TGFβ se lie soit au TβRIII qui présentent le TGFβ au TβRII, soit
directement sur le TβRII. Les TβRII vont alors se lier aux TβRI et les phosphoryler
(Figure 13) (Wrana et al., 1995). Les TβRI sont alors activés et vont phosphoryler « les
receptor-regulated Smads » (R-smads) qui se complexent avec des « Common-partner
Smads » (Co-Smads). Ce complexe Smad est transloqué dans le noyau où il se lie à l’ADN
entrainant la régulation de la transcription des gènes cibles (Miyazono et al. 1994 ; Blobe et
al. 2000).
D’autres voies de signalisation ont été décrites dont la mieux caractérisée est celle de la
famille des sérine/thréonine kinases JNK/SAPK (« C-jun N terminal kinase/stress-activated
protein kinases ») (Atfi et al. 1997, Hocevar et al. 1999). L’activation de JNK/SAPK par le
TGFβ peut être peut être médiée par les petites protéines G que sont Cdc42, Rac1 et avec une
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participation moins importante, RhoA (Atfi et al. 1997). MEKK1 est alors activée par ces
protéines par un mécanisme encore inconnu. Ensuite MEKK1 active MKK4, qui à son tour
active les JNK/SAPK.
Récemment, TAK1 (« TGFβ-activated Kinase I ») (Yamaguchi et al. 1995), un composant
potentiel des voies de signalisation du TGFβ et de BMP4, a été rattaché à la famille des
MAPKK Kinases (MAPKKK). TAK1 agit dans les voies des cascasdes JNK/SAPK et
p38/SAPK en phosphorylant MKK4, MKK3 et MKK6 (Figure 13, ci dessous).
Figure 13 : Principales voies de signalisation mobilisées par le TGF β (Wang et al., 1997)
II.2.3. Les « Insulin-like Growth Factors » (IGF)
La famille des « insulin-like growth factors » (IGF) se compose de deux membres principaux,
l’IGF-I et l’IGF-II, connus également sous le nom de somatomédines (Humbel 1990). Le nom
de ces facteurs de croissance indique leurs effets mitogènes in vitro, leurs effets similaires à
l’insuline (dans les tissus adipeux et musculaires), ainsi que leur homologie structurale à la
pro-insuline (Rinderknecht and Humbel 1978).
L’action des IGFs dépend de 6 protéines d’association , les IGFBP, qui peuvent s’associer
avec une grande affinité aux IGF-I et II. Les IGFBP sont considérés comme des protéines
porteuses et des modulateurs de la bioactivité des IGF dans la circulation sanguine (Zapf
1995). Ainsi les IGFBP peuvent conférer, par leur présence, une spécificité tissulaire aux IGF,
éviter les actions métaboliques des IGF libres et augmenter la demi-vie de ceux-ci dans la
circulation.
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Les IGF sont uniques par le fait que se sont les seuls facteurs de croissance qui stimulent à la
fois la prolifération et la différenciation des cellules musculaires squelettiques. Ce double
effet des IGF est particulièrement intéressant parce que ces deux processus sont mutuellement
exclusifs dans ce tissu ainsi que dans une grande variété de types cellulaires. Les mécanismes
par lesquels les IGF influencent la décision des myoblastes de proliférer ou de se différencier
sont incomplètement compris.
II.2.3.1. Les IGF et la myogénése
Bien que les deux IGF soient exprimés dans le muscle squelettique, l’IGF-II est le principal
IGF exprimé dans ce tissu. L’expression des peptides IGF dans le muscle est régulée au cours
du développement, durant le processus de différenciation et influencée par divers facteurs.
Des études ont permis de corréler l’expression des IGF et la différenciation à partir de cellules
d’origine musculaire, incluant les lignées cellulaires de souris C2 (Yaffe and Saxel 1977) et
Sol8 (Mulle et al. 1988) et une lignée de rat L6 (Yaffe 1968). Ces cellules expriment les
caractéristiques biochimiques et morphologiques des cellules musculaires primaires et ont été
utilisées de façon extensive comme des systèmes modèles pour l’étude des événements qui se
produisent pendant la prolifération des myoblastes et leur différenciation.
L’ARNm de l’IGF-II est faiblement détectable dans les myoblastes et augmente
remarquablement quand la différenciation est induite par le retrait du sérum (Rosenthal
1991a). L’expression d’IGF-II endogène apparaît comme un événement relativement précoce
du processus de différenciation. Rosen et ses collaborateurs ont montré que l’augmentation
des niveaux d’ARNm d’IGF-II précède l’expression des gènes des protéines contractiles mais
suit l’activation du gène de la myogénine (Rosenthal et al., 1993).
La vitesse de différenciation spontanée des différentes lignées de myoblastes, semblent
dépendante de leur niveau d’expression d’IGF-II. Ainsi, les myoblastes qui se différencieront
le plus rapidement et de façon spontanée, après l’enlèvement du sérum, sont ceux qui
sécrètent les quantités les plus importantes d’IGF-II (Florini et al. 1991).
La production par les cellules musculaires d’IGF-II endogène est nécessaire à leur
différenciation. C’est d’ailleurs ce qui a été démontré par des expériences (oligonucléotides
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antisens, transfection de vecteurs antisens) visant à annuler la production endogène d’IGF-II
(Florini et al. 1991 ; Montarras et al. 1993 ).
L’expression du gène de l’IGF-I est moins importante que celle de l’IGF-II dans les myocytes
différenciés de la lignée BC3H1 (Rosenthal 1991b). La sécrétion d’IGF-I par les cellules C2
en cours de différenciation augmente dix fois moins que celle d’IGF-II (Tollefsen et al. 1989).
Donc, les cellules différenciées in vitro, expriment beaucoup moins d’IGF-I que d’IGF-II.
Ces changements de l’expression des IGF sont retrouvés durant la myogenèse in vivo
observée au cours de la régénération musculaire faisant suite à une blessure (Edwall et al.
1989 ; Marsh et al. 1997). Une blessure ischémique d’un muscle squelettique adulte de rat
conduit à une augmentation d’ARNm de l’IGF-I dans ce tissu pendant le processus de
régénération. Des études par hybridation in situ montrent une augmentation d’ARNm de
l’IGF-I transitoire dans les myoblastes prolifératifs et dans les cellules satellites de muscle
(Edwall et al. 1989). Levinovitz et al. 1992 ont montré que pendant le processus de
régénération les niveaux d’ARNm d’IGF-I et d’IGF-II sont transitoirement induits et leur
cinétique d’apparition est différente. En effet, l’expression de l’IGF-I précède celle de l’IGFII, aussi bien au niveau des ARNm qu’à celui des protéines.
Les IGF exogènes ont, en fonction de la concentration, un effet biphasique sur la prolifération
et la différenciation. La différenciation est stimulée par de faibles concentrations d’IGF, alors
qu’elle est progressivement inhibée par de fortes concentrations d’IGF (supérieures à 100
ng/ml d’IGF-8).
II.2.3.2. Les récepteurs aux IGF
Les effets de l’insuline et des IGF-I et II sur la prolifération et la différenciation des
myoblastes passent par des récepteurs aux IGF de type 1 (IGF-R1) qui peuvent fixer ces trois
peptides. L’action du IGF-II peut activer le récepteur de type 2 (IGF-R2), qui est présent lors
de la différenciation musculaire (Tollefsen et al. 1989). L’expression du IGF-R1 diminue au
cours de la différenciation, alors que celle de IGF-II augmente (Rosenthal 1991a). Il est à
noter que le FGF-2 pourrait inhiber la différenciation en supprimant l’expression de IGF-II et
en augmentant celle du IGF-R1 (Rosenthal 1991b).
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Les deux actions opposées l’IGF-I sur la prolifération et la différenciation de peuvent
s’expliquer par l’existence de deux voies de transduction de signal de l’IGF-I. La voie
impliquant les MAP-kinases est faiblement stimulée par l’IGF-I dans les myoblastes in vivo.
Cette voie, utilisée aussi pour la transduction de signal par le FGF-2, mène à une réponse
mitogène (Milasincic et al. 1996).
III. La matrice extra-cellulaire
La matrice extracellulaire (MEC) a longtemps été considérée comme ayant un rôle
essentiellement de charpente relativement inerte qui stabilisait la structure physique des tissus.
Il est maintenant admis qu’elle joue un rôle beaucoup plus actif et plus complexe dans la
régulation du comportement des cellules qui sont à son contact, en agissant sur leur
développement, leur polarité, leur migration, leur prolifération, leurs formes et leurs
fonctions.
La matrice extracellulaire constitue un réseau complexe de macromolécules enveloppant les
cellules composant les différents tissus. Chaque tissu est caractérisé par différents types de
macromolécules matricielles présentes en quantité variable. Leur mode d’organisation dans la
matrice dépend du tissu.
III.1. Principaux composants de la matrice extra-cellulaire
III.1.1. Les collagènes
III.1.1.1. Structure et organisation générale
Les collagènes sont des composants majeurs de la matrice extracellulaire (Prockop et
Kivirikko, 1995). Ils constituent une famille hétérogène de protéines, fibrillaires ou non,
sécrétées par les cellules de tissus conjonctifs et par d’autres types cellulaires. Au niveau du
muscle squelettique, la présence de nombreux types de collagène a été démontrée in situ
(Mayne and Sanderson 1985 ; Sund et al. 2001), ainsi qu’in vitro au niveau de cultures de
myocytes (Beach et al. 1985).
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Les collagènes sont les protéines les plus abondantes dans le monde animal et représentent
près de 25% à 30% des protéines totales chez les Mammifères. Ils jouent un rôle essentiel
dans le maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle de nombreux tissus et organes. Ils
constituent le composant principal de la peau et des os. Ils sont impliqués dans
l’organogenèse, la chémotaxie, l’adhésion et la différenciation cellulaire. Ils participent à de
nombreux processus physiologiques comme l’hémostase et la cicatrisation (Le Blay et al.
1996). Leur renouvellement obéit à un équilibre entre synthèse et dégradation qui correspond
au remodelage matriciel.
Les collagènes sont des homo- et hétérotrimères constitués de trois chaînes polypeptidiques
appelées chaînes α qui s’assemblent en une super-hélice comprenant des régions globulaires
de nature glycoprotéique. Cette configuration confère aux molécules de collagène des
propriétés de résistance mais aussi de flexibilité (Bateman et al., 1996) (Figure 14).
Jusqu’à présent 20 types de collagène génétiquement distincts et ayant chacun des structures
et des spécificités différentes ont été identifiés. Trente-quatre chaînes α ont été clonées et
séquencées, chacune étant codée par un gène distinct (Aumailley and Gayraud 1998). Au
moins quatre chaînes supplémentaires ont été caractérisées (Myllyharju and Kivirikko 2001),
codant pour une chaîne « collagen-like » formant des fibrilles, deux chaînes FACIT
« collagen-like » (FACIT pour « Fibril Associated Collagen with InterruptedTriple hélices »)
et une chaîne de type XIII « collagen-like ».
Les collagènes fibrillaires sont majoritaires (95%). Ils se retrouvent dans les tissus conjonctifs
et regroupent les collagènes de type I, II, III, V et XI (Bateman et al., 1996).
Des collagènes associés aux fibrilles relieraient les fibrilles entre elles ou bien moduleraient
les interactions avec d’autres composants de la matrice (Shaw and Olsen 1991). Ils regroupent
les collagènes de type IX, XII et XIV.
Les collagènes non-fibrillaires qui forment des réseaux sont des collagènes à chaîne courte et
regroupent les collagènes de type IV, VIII et X.
Le collagène micro-fibrillaire est représenté par le collagène VI. Il forme un réseau de
microfilaments dans la MEC des tissus conjonctif.
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Les fibres d’ancrage présentent aux niveau des hémidesmosomes des structures épidermiques
s’étendent de la lamina densa aux plaques d’ancrage du derme. Le collagène de type VII est
le collagène majeur des fibres d’ancrage.
Les autres types de collagènes regroupent les collagènes de type XIII, XV, XVI, XVII, XVIII
et XIX et sont des protéines transmembranaires.
III.1.1.2. Types et distribution des collagènes dans le tissu musculaire
Dans le muscle squelettique, les collagénes fibrillaires de type I et III sont majoritaires au
niveau de l’épimysium et du périmysium, le collagène de type V est aussi présent mais en
plus faible proportion (Mayne and Sanderson 1985).
Au niveau de la lame basale, on distingue les collagènes I, III, IV et V. Le collagène IV ( MM
550 à 600 kDa) est la protéine collagénique la plus importante dans les basales où il a été en
particulier essentiellement localisé au niveau de la lamina densa, de la basale entourant les
fibres musculaires striées (Hantai et al. 1983). Sa présence a toutefois été signalée au niveau
de la lamina rara. Il forme un réseau lamellaire relativement stable auquel peuvent se lier
d’autres molécules de la MEC comme la laminine ou certains PG (perlécan). Il est composé
de trois domaines : un domaine N terminal, une triple hélice avec de courtes interruptions de
la séquence Gly-X-Y et un domaine globulaire C terminal. Le domaine globulaire C terminal
est lié à un autre domaine globulaire C terminal d’une autre molécule par des ponts disulfures,
et quatre domaines N terminaux s’associent en liaison croisée. Les interruptions de séquence
de la triple hélice s’entrelacent avec des domaines C terminaux et forment des structures
super-enroulées. Six chaînes α de type IV ont été identifiées, α1 à α6. Ces chaînes s’associent
en hétérotrimères.
Un dysfonctionnement du métabolisme des collagènes ou des mutations génétiques conduit à
la synthèse de protéines défectueuses pouvant entraîner des dystrophies musculaires, ceci par
altération des collagènes de types I, III, IV, VI et XIII (Hantai et al. 1983 ; Kvist et al. 2001).
Dans le cas des myopathies de Bethem et de Ullrich, c’est le collagène de type IV qui est
fortement alteré. Ces deux myopathies congénitales provoquent chez les patients une faiblesse
musculaire, de nombreuses contractures des jonctions proximales, une hypersensibilité des
jonctions distales et un état d’épuisement intense. Les myopathies de Bethlem sont dues à
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une mutation du gène codant pour la chaîne α1 du collagène, entraînant la délétion d’une
base au niveau des mRNA ainsi que l’introduction d’un codon stop. Le mRNA mutant est
instable et totalement absent au niveau des fibroblastes (Lamande et al. 1998). Les
myopathies de Ullrich, très proche de celles de Bethlem sont dues à trois mutations sur le
gène codant pour les chaînes α2 et α3 du collagène (Zhang et al. 2002 ;Ishikawa et al. 2002 ;
Higuchi et al. 2003). De plus, cette déficience en collagène IV provoque une faible expression
des molécules d’adhésion neurales et des MyHC néonatale, caractéristiques des muscles en
régénération et une accumulation matricielle de microfibrilles de collagènes non liées en
hélice. Ces observations permettent de comprendre les phénomènes de régénération ou de
maturation anormales dans les cas de dystrophies musculaires de Ullrich et de Bethlem.
III.1.2. Les glycoprotéines
III.1.2.1. La laminine
La laminine, molécule volumineuse de masse molaire de 850 kDa, est impliquée dans
l’ancrage des cellules à la lame basale. C’est la glycoprotéine non collagénique est la plus
largement représentée. Elle est essentiellemt présente dans les membranes basales. Constituée
de trois chaînes polypeptidiques, α (MM 400 kDa), β (MM 210 kDa) et γ (MM 200 kDa),
cette molécule se présente sous forme d’une croix avec deux bras courts et un bras long
(Figure 15) (Burgeson et al. 1994). Les trois bras courts formés par les parties N-terminales
de chacune des chaînes polypeptidiques ont des domaines globulaires, séparés par des parties
en bâtonnets. Le bras long est formé par les trois chaînes assemblées en hélice α superenroulée. Les chaînes β et γ se terminent avec la partie linéaire du bras long, et la chaîne α,
plus longue, se termine à son extrémité carboxylée, par un domaine pluriglobulaire, constitué
par cinq motifs homologues, les domaines G (Beck et al. 1990).
La laminine présente de nombreux sites de liaisons à des récepteurs cellulaires variés. Ainsi,
l’interaction cellule-laminine constitue un système versatile du contrôle des mouvements
cellulaires. La réponse d’un type cellulaire dépend de la structure de la laminine rencontrée,
du type de récepteur exprimé et du type de signal transmis à la cellule.
Les principaux sites actifs de la laminine, grâce auxquels elle interagit, sont les fragments P1
(Terranova et al. 1984), E8 qui inclut le fragment E3, E4, la séquence RGD (Arg-Gly-Asp), et
la séquence YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg).
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Un certain nombre de molécules apparentées ont été découvertes, c’est le cas la mérosine, la
S-laminine et S-mérosine. D’un point de vue structural, la différence entre la laminine et la
mérosine est due au remplacement de la chaîne α par une chaîne homologue de type M. Ces
glycoprotéines ont une distribution différentielle. La laminine se trouve essentiellement au
niveau de l’épithélium, l’endothélium et les muscles lisses. La mérosine est exprimé
préférentiellement dans les muscles striés et les nerfs périphériques. La S-laminine est
rencontré au niveau des synapses et du glomérule, enfin la S-mérosine un l’un des
constituants des jonctions myotendineuses et des trophoblastes.
Les laminines ont un rôle important dans les membranes. Au niveau structural, elles
interagissent avec les autres constituants de la lame basale tels le nidogène (ou entactine), le
collagène de type IV et les HSPG. In vitro, les laminine favorisent l’adhérence, l’étalement, la
migration, la croissance et la différenciation cellulaire.
III.1.2.2. La Ténascine
La ténascine est un autre composant de la lame basale. Il existe 5 isoformes de ténascine (C ;
R ; W ; X et Y) (Figure 16). C’est une protéine hexamérique de taille comprise entre 190 à
300 kDa. Elle est composée de 6 branches émanant d’un cœur central (Erickson 1994), les
parties proximales de ces branches étant minces et rigides, les parties distales étant épaisses et
flexibles avec des extrémités de type globulaire.
Cette glycoprotéine de structure de la MEC intervient dans l’adhérence cellulaire et est
présente dans les jonctions neuromusculaires. Les isoformes C, X et Y de la ténascine sont
présentes au niveau du muscle squelettique (Matsumoto et al. 1994). Les ténascine X et Y
sont impliquées dans la myogenèse (Hagios et al. 1999), et l’expression de la ténascine C est
modulée pendant la régénération musculaire (Jarvinen et al. 2000), mais aussi dans les cas de
dystrophies musculaires, d’inflammations ainsi que dans ceux de myopathies congénitales
(Settles et al. 1996 ; Ringelmann et al. 1999).
Il a été observé que l’expression de ténascine C était corrélée à l’invasion des macrophages
dans le cas des dystrophies musculaires de Duchenne (Gullberg et al. 1997). Elle est aussi
exprimée dans les jonctions neuromusculaires suite à une lésion ou à une malformation et
durant la période de réinnervation consécutive à un traumatisme (Cifuentes-Diaz et al. 1998;
Cifuentes-Diaz et al. 2002). La ténascine Y est exprimée dans l’endomysium entourant les
fibres musculaires uniques et dans les gaines périmysiales autour des faisceaux de fibres. Il a
été observé que lorsque le muscle squelettique subit un stress mécanique important,
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l’expression des mRNA de ténascine C augmente parallèlement à une diminution de
l’expression des mRNA de ténascine Y (Fluck et al. 2000).
III.1.2.3. La fibronectine
La fibronectine est une glycoprotéine de 450 à 500 kDa, présente sous forme fibrillaire dans
la MEC et sous forme soluble dans les liquides biologiques comme le plasma sanguin
(Terranova et al. 1984). La principale propriété de la fibronectine est de moduler les
interactions entre la MEC et les cellules. Elle est constituée de 2 chaînes polypeptidiques
homologues liées de façon parallèle par deux ponts disulfures à proximité de l’extrémité Cterminale. Elle est composée de trois types de domaine comme l’indique la figure 17. Chaque
chaîne est composée de 12 modules de type I répartis sur les régions N- et C-terminales et de
2 modules de type II dans la région N-terminale. Entre les deux extrémités sont regroupés 15
à 17 modules de type II (Borsi et al. 1986).
Cette glycoprotéine d’adhérence extracellulaire contient des domaines de liaison à la surface
cellulaire ainsi qu’à de nombreux composants de la MEC. La relation structure-fonction est
bien connue : les modules I sont des sites de liaison à la fibrine et à l’héparine. Certains
modules I (I-6 à I-9), en association avec les modules II, forment un site de liaison aux
collagènes. Les modules III possèdent des séquences constituant des sites d’attachement aux
cellules via des intégrines membranaires (RGDS et un site d’épissage IIIC. Pour avoir une
adhérence cellulaire maximale, le peptide RGDS fonctionne en synergie avec une autre
séquence peptidique PHSRN (Pro-His-Ser-Arg-Asn) localisé au niveau du neuvième module
III.
III.1.2.4. Les protéoglycannes
Les protéoglycannes (PG) sont des complexes de glycosaminoglycannes bâtis autour d’un
« cœur » protéique (Figure 18). Ils constituent un ensemble hétérogène dont certains
représentants ont été spécifiquement localisés dans les basales. Les localisations
ultrastructurales des PG de la basale montrent que ces composants existent à tous les niveaux
(lamina rara, densa et reticularis).
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Figure 18 : Réprésentation schématique d’un protéoglycannes. Les différentes chaînes de
GAG sont attachées au core protéique (d’après GlycoWord)
Leurs structures et leurs fonctions seront détaillés dans le paragraphe IV.2.
III.2. La lame basale
La lame basale (ou basale) est un complexe essentiellement protéique que l’on observe soit à
la base des structures épithéliales séparant ces dernières du tissu conjonctif sous jacent, soit
entourant certains types cellulaires (cellules musculaires, adipocytes, cellules de Schwann) ou
bien encore en position de barrière entre des structures épithéliales comme au niveau du
glomérule rénal.
La structure matricielle de la lame basale est très importante lors de la régénération
musculaire.
Les cellules satellites à l’origine de la régénération musculaire sont insérées entre la
membrane plasmique et la lame basale de la fibre musculaire. La nécrose cytoplasmique des
fibres laisse à ces cellules un espace disponible. Le principal rôle attribué à la lame basale au
cours de la régénération musculaire est celui de modèle architectural aidant à la reconstruction
du muscle.
A l’échelle ultrastructurale, la lame basale est constituée d’une superposition de trois
ensembles morphologiquement distincts, ayant une importance relative variable.
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Au contact de la membrane plasmique, la lamina rara (= lamina lucida) est optiquement vide
en microscopie électronique. Son épaisseur est faible (15 à 65 nm). Seuls quelques filaments,
souvent en continuité avec la lamina densa, peuvent ponctuer de façon discrète cet espace
clair ceignant les cellules.
La lamina densa sous-jacente est plus importante. Sa présence suffit à signaler l’existence
d’une basale. Son épaisseur est très variable (15 nm dans le cas du muscle, jusqu’à 6 µm dans
le cas de la membrane de Reichert). C’est l’ensemble constitué par la lamina rara et lamina
densa, qui forme à la base ou autour de certaines cellules une structure continue, que l’on
désigne sous le nom de lame basale (Sanes and Chiu 1983).
On distingue parfois une couche supplémentaire, la lamina fibro-reticularis (= parsfibroreticularis) qui apparaît comme un ensemble lâche de filaments et de granules. Son épaisseur
est mal définie : une transition morphologiquement insensible conduit cette structure au tissu
conjonctif située en continuité de celle-ci.
La lame basale est composée d’un réseau lamellaire constitué principalement de collagène IV
stabilisant et d’un réseau auto-organisé de glycoprotéines telle que la laminine plus labile, de
la fibronectine, de la tenascine, etc.... Ces réseaux sont liés par de nombreuses interactions à
d’autres protéines résidentes de la lame basale, notamment l’entactine (nidogene) et des PG
(Timpl and Brown, 1995) (Figure 19)
Figure 19 : Modèle courant représentant la stucture moléculaire d’une lame basale (Alberts et
collaborateurs, La cellules, 1994). La lame basale est formée par des intéractions spécifiques
entre collagène de type IV, laminine et l’entactine, auxquels s’ajoutent le perlécan (PG)
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De nombreuses interactions de type recepteur-ligand relient les constituants membranaires de
la fibre musculaire avec différents éléments structuraux de la lame basale.
Au cours de ces dernières années est apparu le rôle important de la lame basale au niveau du
développement et de la physiologie des tissus, notamment musculaire. En effet, la
séquestration de protéines biologiquement actives tels les facteurs de croissance peuvent
activer la myogenèse (Jansen and Fladby 1990), la synaptogenèse (Anderson and Fambrough
1983) et la régénération (Husmann et al. 1996).
IV. Les glycosaminoglycannes
D’après Yanaghishita en 1993, les premières études consacrées aux glycosaminoglycannes
(GAG) datent de 1861 avec les travaux de Fischer et Boedeker qui permirent l’isolement de la
chondroïtine sulfate (CS) a partir de tissus cartilagineux. Au début du 20ème siècle, le
développement de la chimie des sucres à permis la découverte d’autres GAG comme l’acide
hyaluronique (HA) (Meyer et al., 1934), le dermatane sulfate (DS) (Meyer et al., 1941) et les
kératanes sulfates (KS I et II) (Meyer et al., 1953). Des études plus approfondies ont permis
également de distinguer deux chondroïtines différentes parmi d’autres, les chondroïtine A et
C (Meyer et al., 1956). Les bases de la structure des GAG, nommées à cette époque
mucopolysaccharides acides, étant établies, la deuxième moitié du 20ème siècle fut consacrée à
l’étude de leur nature physico-chimique et de leurs fonctions biologiques.
IV.1. Structure des glycosaminoglycannes
Les GAG sont composés d’unités disacharidiques répétées qui, assemblées entre elles,
forment de longues chaînes polysaccharidiques non ramifiées. Un des deux résidus
glucidiques du motif disaccharidique est un glucide aminé, la N-acétylglucosamine (GlcNAc)
ou la N-acétylgalactosamine (GalNAc) qui peut être sulfaté. Le second sucre est un sel
d’acide uronique comme le glucuronate (GlcA) ou l’iduronate (IdoA).
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Cinq principaux groupes de GAG (Figure 20) ont été établis suivant la nature de leurs résidus
glucidiques, le type de liaison entre ces résidus et le nombre et la position des groupements
sulfates :
l’acide hyaluronique
les chondroïtines sulfates (chondroïtine-4-sulfate ou CSA et la chondroïtine-6sulfate ou CSC)
le dermatane sulfate (ou chondroïtine sulfate B ou CSB)
le kératane sulfate (KS)
l’héparine et les héparanes sulfates (HS)
A la différence des autres GAG qui forment des glycoconjugués protéiques nommés
protéoglycannes (PG) l’acide hyaluronique est le seul GAG à ne pas être lié par une liaison
covalente à une protéine.
En général les GAG, chargés négativement du fait de la présence de groupements sulfates ou
carboxyles, sont très hydrophiles. Ils sont localisés à la surface cellulaire ou bien dans la
MEC. Du fait de la viscosité qu’ils confèrent au milieu, les GAG limitent les forces de
compression et se présentent comme l’agent lubrifiant idéal pour les articulations. De même,
en raison de leur rigidité due à leur conformation induite par leur charges électriques, ils
assurent un maintien de la structure des tissus et créent des espaces intercellulaires pouvant
favoriser de possibles migrations cellulaires. Ils interviennent également dans le remodelage
tissulaire lors de l’embryogenèse ou de processus de cicatrisation.
IV.1.1. L’acide hyaluronique ou hyaluronan (HA)
C’est en 1934 que Karl Meyer et son assistant, John Palmer, ont décrit une méthode
permettant d’isoler un nouveau GAG de l’humeur vitrée des yeux de bovins (Meyer et
Palmer, 1934). Ils ont montré que cette substance contenait un acide uronique et un glucide
aminé, mais qu’il n’était pas sulfaté. Selon leur propre citation : « Nous proposons, par
convention, le nom d’acide hyaluronic (HA), pour hyaloid (vitreous) + acide uronique ».
Actuellement, cette macromolécule est plus fréquemment rencontrée sous le nom de
« hyaluronan », reflétant ainsi le fait qu’il existe, in vivo, comme un polyanion et non sous la
forme d’acide protoné.
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Il a fallu 20 années pour que la structure chimique de base des motifs disaccharidiques
formant l’HA soit totalement identifiée (Weissman et al., 1954). Durant ces années, il a été
montré que l’acide uronique et le glucide aminé du motif disaccharidique était,
respectivement, un acide D-glucuronique et une D-N-acétylglucosamine liés entre eux de
façon très stable par une alternance des liaisons glucosidiques en β(1-4) et β-(1−3) (Figure 21
A).
L’enzyme nécessaire à la synthèse de l’HA est la hyaluronan synthase. En présence de ses
substrats, l’acide glucuronique et l’UDP-N-acétylglucosamine, elle synthétise les motifs
répétés de disaccharides nécessaires à la formation de grandes chaînes linéaires d’acide
hyaluronique par addition alternée de GlcA et de GlcNAc. Le nombre « n » des répétitions
disaccharidiques dans la molécule finale d’HA peut atteindre 25 000, avec une masse molaire
d’environ 4 000 kDa (chaque disaccharide a une masse molaire d’environ 400 Da). La
longueur moyenne d’un disaccharide est d’environ 1nm. Ainsi, une molécule d’HA composée
de 10 000 unités disaccharidiques peut atteindre une longueur de 10 µm d’un bout à l’autre
(Figure 21 B).
L’HA est présent chez tous les Vertébrés. Il est aussi présent au niveau de la capsule de
certains Streptocoques. Il est un composant essentiel de la matrice extracellulaire de
nombreux tissus et de par sa composition, il confère un certain nombre de propriétés de
viscoélasticité à certains d’entre eux. Il est parfois le composant majoritaire de quelques
compartiments biologiques : c’est le cas de l’humeur vitrée de l’œil humain (0,1 à 0,4 mg/g de
poids frais) ou du liquide synovial des articulations (3 à 4 mg/ml).
Au niveau du muscle, l’HA est retrouvé autour des fibres individuelles, dans l’endomysium
et le périmysium des fibres musculaires (Laurent et al. 1991).
Dans la plupart des cas, l’HA est organisé à l’intérieur de la matrice extracellulaire par des
interactions spécifiques avec d’autres macromolécules de la matrice.
IV.1.2. Les galactosaminoglycannes
IV.1.2.1. La chondroïtine et les chondroïtines sulfates (CS)
D’un point de vue structural, la chondroïtine diffère de l’HA par la substitution du GlcNAc en
GalNAc ainsi que par sa masse moléculaire plus faible (20 000 à 50 000 Da). Elle est donc
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composée de motifs disaccharidiques répétés de GalNAc et de GlcA liés entre eux par des
liaisons β(1-3) et β(1-4). Comme nous l’avons signalé précédemment, la chondroïtine fût
isolée par l’équipe de Meyer en 1954.
On distingue également d’autres types de chondroïtines qui différent entre eux par l’existence
de groupements sulfates sur le GalNAc. C’est la position des groupements sulfates sur le
carbone (C) qui détermine les noms des molécules (Figure 22). On trouve donc la
chondroïtine sulfate A (CSA) ou chondroïtine 4-sulfate, la chondroïtine sulfate C (CSC) ou
chondroïtine 6-sulfate, la chondroïtine sulfate D (CSD) ou chondroïtine 2-3-disulfate et la
chondroïtine sulfate E (CSE) ou chondroïtine 4-6-disulfate.
IV.1.2.2.Le dermatane sulfate (DS)
Le DS a été isolé en 1941 par Meyer à partir de la peau de porc. Il a été appelé chondroïtine
sulfate B (CSB) puisqu’il était semblable aux isomères des CSA et CSC. Effectivement, les
trois font partie de la famille des galactosaminoglycannes.
Au niveau structural, les DS possède une quantité variable d’acide α-iduronique (α-IdoA)
provenant de l’epimérisation de l’acide β-D-glucuronique (β-GlcA) (Figure 20). Cette
configuration ainsi que la présence de groupements sulfates en position C2 de l’IdoA, font
que le DS est un GAG proche de la famille des HS/héparine. Effectivement, de par la quantité
de sulfate présent au niveau de sa chaîne, le degré de sulfatation du DS est généralement plus
élevé que celui des CS. Le dermatane sulfate présente une activité anticoagulante, ce qui
explique l’autre nom donné au DS à savoir la β-héparine (Marbet et Winterstein, 1951).
Dans l’organisme, la distribution du DS diffère aussi de celle des CS. On le trouve en grande
quantité dans les tissus conjonctifs, la peau, l’intestin, les vaisseaux sanguins, le tendon, le
cœur, le périmysium et l’endomysium des fibres musculaires. Bien que le DS soit un
galactosaminoglycanne comme les CS, les différences existantes entre eux permettent
d’affirmer qu’il n’appartient pas à la famille des CS.
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IV.1.3. Les glucosaminoglycannes
IV.1.3.1.Le kératane sulfate (KS)
Le kératane sulfate a aussi été isolé par Meyer et ses collaborateurs en 1953. Ces molécules
sont des polymères constitués d’une séquence répétitive de disaccharides. Au niveau
structural, on trouve principalement deux types d’unité disaccharidique, le GlcNAc et le
galactose (Gal), ce dernier remplaçant l’acide uronique présent dans les autres types de GAG.
Les groupements sulfates sont apportés par des quantités variables de GlcNAc et de Gal sur
lesquels ils sont positionnés sur le carbone 6 (figure 20). Au niveau stœchiométrique, le
contenu en groupements sulfates est peu variable et ils ne sont jamais supérieurs à une unité
par disaccharide. Les unités non sulfatées tels que la N-acétylactosamine sont présentes sur
des glycoprotéines référencées comme étant des polylactosaminoglycannes. La masse
moléculaire de la chaîne polysaccharidique des KS se situe entre 4 000 à environ 22 000. De
par leur similitude structurale avec les glycoprotéines, les KS se lient plus facilement aux
protéines.
Il existe deux types de KS. Ceux-ci se distinguent l'
un l'
autre par la manière dont ils se fixent
aux protéines. Le kératane sulfate I, uniquement trouvé au niveau de la cornée, est lié à la
protéine par une liaison GlcNAc asparagine (Seno et al., 1965). Ainsi, il a été suggéré que le
mode de biosynthèse des protéoglycannes à kératane sulfates de la cornée était similaire a
celui des glycoprotéines sériques, puisqu’un inhibiteur connu, la tunicamycine, inhibait leur
synthèse (Hart et Lennarz,1978). Le kératane sulfate II se trouve quant à lui uniquement au
niveau de deux tissus squelettique, le cartilage et les disques intervertébraux. Il se lie au cœur
protéique par une liaison O-glycosidique
IV.1.3.2.Les héparanes sulfates et l’héparine
Des GAG particuliers comme l’héparine (Figure 23), présents sous forme soluble, et leurs
analogues plus ubiquitaires, les héparanes sulfates (HS) sont doués d’interactions avec
certains facteurs de croissance (FC) ce qui entraine une potentialisation de leurs effets. Ils
peuvent également inhiber la prolifération de certains types cellulaires notamment celle des
cellules myogéniques.
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Figure 23 : Unités disaccharidiques répétées de l’héparine
C5-épimérisation ; R= H, SO3- ou COCH3. D’après GlycoWord
L’usage des GAG dans le traitement de certaines pathologies a conduit au développement
d’analogues de synthèse, mimétiques des HS et de l’héparine, ouvrant de nouvelles
perspectives dans le domaine de la cicatrisation et de la réparation tissulaire, mais également
dans le traitement de maladies thrombotiques comme l’athérosclérose (Figure 24).
IV.1.3.2.1. L’héparine
L’héparine est un glycosaminoglycanne découvert en 1916 par J. McLane. Ce polysaccharide
est formé par une répétition d’unités disaccharidiques sulfatées renfermant une glucosamine
(GlcN) et un acide uronique qui vont subir un certain nombre de modifications. Les résidus
GlcN subissent une N-déacétylation et une N-sulfatation. Les résidus GlcA adjacents
subissent une épimérisation en C-5 aboutissant à des résidus IdoA. Des réactions d’Osulfatation ont lieu en C-2 des IdoA et en C-6 des GlcN (Vives et al. 1999). La plupart des
GlcN sont N-sulfatés et la majorité des acides uroniques sont des IdoA sulfatés.
L’importance de la N-sulfatation de l’héparine et la présence de nombreux résidus IdoA et de
groupements O-sulfatés confèrent au polysaccharide une organisation en domaines de type S
formés d’amas de disaccharides N-sulfatés (Vives et al. 1999). La chaîne principale,
constituée d’une succession de résidus liés en α ou β (1-4), est liée en α (1-6) à d’autres
chaînes d’héparine donnant à la molécule une grande flexibilité.
L’héparine est synthétisée de manière endogène et stockée sous forme intracellulaire dans les
granules basophiles des mastocytes présents dans la plupart des tissus chez les mammifères.
L’héparine est présente en grande quantité dans le foie, les poumons et l’intestin.
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Les effets anticoagulant et anti thrombotique de l’héparine se produisent par une interaction
héparine-antithrombine III (ATIII). A des concentrations thérapeutiques, seulement le tiers
d’une dose d’héparine se lie à l’ATIII, cette fraction étant responsable de l’effet anticoagulant
de l’héparine. La liaison héparine-ATIII induit un changement de conformation de cet
inhibiteur de sérine-protéases et accélère l’interaction entre l’ATIII et diverse sérine-protéases
dans la cascade de la coagulation. Un pentasaccharide est nécessaire au minimum pour que la
fixation entre héparine et ATIII ait lieu (Kandrotas et al. 1992). La structure de ce
pentasaccharide est la suivante : GlcNAc, 6S-GlcA-GlcNSO3-, 3S-IdoA, 2S-GlcNSO3-.
L’héparine existe sous différentes formes. L’héparine standard ou non fractionnée (UFH), est
extraite de la muqueuse intestinale de porc ou de poumon de bovidés. Les préparations
d’héparine non fractionnée sont composées d’un mélange de chaînes polysaccharidiques de
longueurs variables allant de 3 000 à 30 000 Da. L’UFH est utilisée en chirurgie, en
cardiologie et en hématologie où elle joue un rôle majeur comme agent anticoagulant.
Afin de réduire le risque hémorragique et assurer une meilleure reproductibilité thérapeutique,
l’héparine standard a été fractionnée par coupure chimique ou digestion enzymatique, donnant
ainsi naissance à des héparines de bas poids moléculaire (LMWH) (Praillet et al. 1998). Les
poids moléculaires des différentes préparations obtenues s’échelonnent entre 4 000 et 6 000
Da. Les LMWH possèdent une activité antithrombotique tout en ayant un pouvoir
anticoagulant limité. Elles sont utilisées dans les traitements prophylactiques, contre les
thromboses veineuses, les maladies inflammatoire et prolifératives.
Actuellement, il existe un développement de pentasaccharides, d’héparines modifiées
chimiquement, de dérivés d’héparines et de dérivés synthétiques de type héparino-mimétiques
qui vise à éviter notamment certaines complications dues à des thérapies à base d’héparine
comme les hémorragies ou la thombocytopénie.
Outre son activité anticoagulante, l’héparine possède également des effets anti-inflammatoires
(Figure 25). En effet, l’héparine diminue la production de médiateurs de l’inflammation tel le
TNFα et inhibe la migration des cellules inflammatoires comme les lymphocytes ou
polymorphonucléaires vers le site lésé. Dans les premières phases du processus
inflammatoire, les leucocytes produisent une héparinase qui clive les GAG, composés
importants de la barrière endothéliale, favorisant ainsi l’attachement des leucocytes à la
membrane. L’UHF en se liant aux cellules endothéliales se substitue ainsi aux GAG et
renforçe ainsi la barrière endothéliale, et de bloque l’endocytose de l’héparinase.
Page -66-
Un autre mécanisme inhibant l’extravasion des cellules de l’inflammation consiste en la
liaison de l’UHF ou des LMWH aux L et P-sélectines se trouvant à la surface endothéliale
empêchant ainsi l’adhésion des leucocytes à la paroi des vaisseaux.
L’héparine est également utilisée en chromatographie d’affinité en raison de son affinité pour
les facteurs de croissance, les cytokines pro-inflammatoires, de nombreuses protéines de la
MEC et les protéases leucocytaires. Ces interactions peuvent s’expliquer par l’importante
charge négative de l’héparine induite par la présence de nombreux groupements
polyanioniques.
IV.1.3.2.2. Les héparanes sulfates
Les héparanes sulfates sont des GAG qui présentent de grandes similitudes structurales avec
l’héparine. L’unité disaccharidique répétée des héparanes sulfates est constituée d’α, β(14)GlcN et d’acide uronique (Figure 26). Le polymère est formé de 50 à 200 unités
disaccharidiques (25-100 kDa).
Si la GlcN est N-acétylée (GlcNAc), celle ci est liée en α(1-4) à un acide glucuronique. En
revanche, si les résidus GlcN sont N-sulfatés, l’acide uronique est préférentiellement un IdoA.
La structure des HS se complexifie avec l’addition de groupements O-sulfates. La majorité
des HS contient en quantité égale des disaccharides N-acétylés et N-sulfatés mais ils ne sont
pas distribués uniformément dans la chaîne des GAG (Gallagher 1996).
La différence entre l’héparine et les HS est due au degré de sulfatation beaucoup plus
important de l’héparine. Les HS sont ubiquitaires. Ils sont localisés au niveau de la rate, du
foie et des muscles lisses et striées, associé à la réticuline ou collagène III. Ils sont in vivo
considérés comme l’anticoagulant physiologique (Praillet et al. 1998).
Les héparanes sulfates se présentent comme des régulateurs cellulaires multifonctionnels. Ils
interagissent avec une grande variété de protéines comme les facteurs de croissance, les
enzymes, les protéines de la MEC et les protéines localisées à la surface d’agents pathogènes
(Figure 27). Les héparanes sulfates interviennent dans les interactions protéines/protéines
Page -67-
comme des co-récepteurs pour les facteurs de croissance et dans la séquestration de ligands à
la surface cellulaire et dans la MEC (Turnbull et al. 2001).
Les héparanes sulfates peuvent protéger les protéines de la dégradation, réguler leur transport
au travers des membranes basales (Dowd et al. 1999) et favoriser l’internalisation de celles-là
(Reiland and Rapraeger 1993).
La synthèse et les fonctions des HS feront l’objet d’un développement particulier dans le
chapitre IV.2.2.
IV.2. Les protéoglycannes
La biosynthèse d’un protéoglycanne (PG) débute par la formation de la protéine centrale ou
cœur protéique. Sur certains résidus sérine de la protéine est greffée une séquence Xyl-GalGal-(1er disaccharide) par l’établissement d’une liaison O-glycosidique entre le xylose et la
fonction hydroxyle des sérines. C’est à partir de cette structure que la polymérisation des
GAG s’effectue (Praillet et al. 1998).
Les PG sont classés selon la nature moléculaire des chaînes de GAG attachées à la chaîne
polypeptidique. On distingue ainsi, des PG à héparanes sulfates ou HSPG, des PG à
chondroïtines sulfates ou CSPG, des PG à dermatanes sulfates ou DSPG, des PG à kératanes
sulfates ou KSPG. Il existe de nombreux hybrides, sachant que des GAG de différents types
de peuvent se lier au même coeur protéique. C’est par exemple le cas de l’agrécane, de la
décorine ou du phosphacane.
Les PG peuvent être classés en différents groupes
Tableau 4: Classification des protéoglycannes selon leur localisation ([Nietfeld, 1993, Praillet
et al. 1998) ;
Groupe de PG
Nom
Protéine coeur
GAG
Page -68-
Localisation
Interactions
PG extracellulaire
220 kDa
100 chaînes CS (20-
Agrécane
Trois domaines
30 kDa) + 100
Cartilage, Tendon sclérotique
(50 mg d’agrégats par g de
(PG-H)
globulaires G1, G2
chaînes de KS (10-15
tissu) sous forme d’agrégats
Protéine de liaison
et G3
kDa) 90% de la
avec l’HA
HA
masse du PG
Versicane
(PG-400)
Beaucoup moins de
265 kDa
chaînes que
Fibroblastes humains (peau et
PG formant des
Domaines G1 et G3
l’agrécane
vaisseaux sanguins)
agrégats
de l’agrécane
(15-20 chaînes de
intersticiels
Protéine de liaison
CS/DS)
HA
Neurocane
139 kDa
CS
Tissu nerveux
Brévicane
99 kDa
CS ou aucun GAG
Tissu nerveux
Décorine
1 seule chaîne
(PS-S2, PG-II,
de CS ou DS
Petits PG
PG-40)
intersticiels à
Biglycane
40 kDa
protèine riche en
(PG-S1, PG-1)
Répétitions riches
2 chaînes de CS ou
en leucine
DS
leucine
Collagènes I, II, III,
Ubiquitaire
V, VI, XV
TGFb
Fibromoduline
4 chaînes de KS
Ubiquitaire
Collagène I et TGFβ
Tendon, cartilage et cornée
Collagènes
Cornée, valves cardiaques
Collagénes
Plusieurs chaînes de
Lumicane
KS
(en moyenne 4)
Lui-même, Laminine
Perlécan
400 kDa
3-4 chaînes d’HS ou
Nombreux modules
d’HS + DS sur
PG des lames
protéiques
l’extrémité amino-
basales
conservés au cours
terminale
HSPG autres
Lames basales
Collagène IV
Ancrage de l’ACH au
niveau de la jonction
neuromusculaire
de l’évolution
Barrière anionique
(Voisins du
Membranes glomérulaires
perlécan)
pour les protéines
sèriques, Laminine
Collagène IV
Syndécans-1
31 kDa
Syndécans-2
20 kDa
3-4 chaînes d’HS et 2
Cellules épithéliales
chaînes de CS/DS
3-4 chaînes d’HS
cytosquelette
Fibroblastes
fibroglycane
Syndécans-3
Ancrage
N-syndécans
(actine..)
Cytokines
PG
Membranaires
Protéines du
38 kDa
3-4 chaînes d’HS
Tissu nerveux
(FGF2, IFNγ)
Mésenchyme
Autres composants
au cours du développement
hydrophobe
matriciels
(collagènes I, III, V ;
Syndécans-4
amphiglycane
Fibronectine)
20 kDa
3-4 chaînes d’HS
ou ryudocane
Fibroblastes
Enzymes inhibiteurs
cellules épithéliales
de protéases (ATIII)
Virus (HIV, HSV)
β -glycane
92 kDa
N-terminal
TGF β
2 chaînes d’HS et CS
Page -69-
Ubiquitaire
cf.endogline
C-terminale
cf.uromoduline
PG
Cérébroglycane
59 kDa
5 sites potentiels
Système
Membranaire
Site de liaison au
d’attachement de
nerveux central
Ancrage
GPI
chaînes d’HS
64 kDa
Site de liaison au
4 chaînes d’HS
Ubiquitaire
GPI
PG
inter-
Serglycine
cellulaire
des neurones au cours
du développement
par un GPI
Glypicane
Αide à la migration
Αide à la migration
des neurones au cours
du développement
10-15 kDa
10-15 chaînes
la plus courte
HP dans les
Granules intercellulaires des
peptidases, histamine
Protéases carboxy-
constituée par 24
mastocytes mûrs des
cellules hématopoïtiques et
dans les granules de
répétitions de
tissus conjonctifs
mastocytaires
stockage des
Ser-Gly
CS très sulfaté dans
mastocytes
les mastocytes
circulants
PG : Protéoglycanne
GPI : Glycosylphosphatidylinositol
HSPG : PG à héparanes sulfates
ACH : Acétylcholinestérase
CSPG : PG à chondroïtines sulfates
HA : Acide hyaluronique
DSPG : PG à dermatanes sulfates
CS : chondrïtines sulfates
KS : Kératane sulfate
DS : dermatanes sulfates
HS : Héparane sulfate
TGFβ : facteur de croissance transformant
Les PG intersticiels formant des agrégats sont des PG de grande taille capable d’interagir avec
l’AH. Les chaînes de GAG peuvent alors se lier aux molécules extracellulaires, cations,
molécules d’eau. Du fait de leurs charges négatives et de leur agencement, ces chaînes
confèrent aux tissus une résistance aux forces de compression et de déformation.
Les PG de la lame basale, tel que le perlécan (protéoglycanne à héparanes sulfates),
interagissent avec la laminine et le collagène de type IV.
Les PG membranaires se distinguent par leur type d’association contracté avec la membrane
cellulaire. Les PG sont soit directement ancrés à la membrane (ancrage hydrophobe), soit liés
à la membrane par une liaison glycosylphosphatidylinositol (GPI). Ces PG peuvent tels, les
syndécans former des ponts transmembranaires entre le cytosquelette (actine) et la MEC. plus,
ces PG peuvent par leur GAG se lier à divers ligands matriciels comme à la fibronectine qui
possédent des domaines de liaison à l’héparine. Ainsi ils peuvent interférer dans les liaisons
spécifiques ligands/récepteurs lors des processus de migration cellulaire (Bertram et al.,
Page -70-
1995). Enfin, ces PG membranaires peuvent se lier à des FC et à des cytokines et agir de ce
fait comme régulateurs de l’activité de ces facteurs.
Les PG intracellulaires quant à eux sont très sulfatés et forment des granules anioniques
concentrant des protéases intracellulaires, des carboxypeptidases et de l’histamine. Les PG
régulent alors la libération de ces derniers lors de mécanismes de défense de l’organisme et
lors de la réparation tissulaire.
IV.2.1. Les « Small Leucine-Rich Proteoglycans » ou (SLRP)
La decorine, le biglycane, la fibromoduline, le lumicane, le keratocane et le mimecane sont
des membres de la famille des SLRP (« Small Leucine-Rich Proteoglycans »)(Figure 28).
Leurs coeurs protéiques sont composés à plus de 70% de leucine. Les SLRP sont synthétisés à
l’intérieur des cellules puis sécrétés à l’extérieur où ils se retrouvent essentiellement dans la
MEC. La décorine est une PG d’environ 75 kDa. Des CS ou des DS sont rattachés à son coeur
protéique. La sulfatation du DS constituant la décorine est essentiellement localisée à
l’extrémité C terminale de la chaîne de GAG et en position 4. La décorine a un rôle important
dans l’assemblage des protéines de la MEC et au cours de la prolifération cellulaire. Le coeur
protéique de la décorine à la capacité d’interagir avec de nombreuses molécules comme la
fibronectine, la trombospondine, les collagènes I, II et IV, les récepteurs à l’EGF et les trois
isoformes du TGFβ (Olguin et al. 2003).
Dans le muscle squelettique, la décorine est présente essentiellement dans le périmysium. Des
études ont montré que la décorine jouait un rôle dans l’inhibition de la migration des
myoblastes permettant ainsi la différenciation myogénique. Effectivement, l’inhibition de la
synthèse de décorine entraîne une augmentation de l’expression de myogènine et des cpk d’où
une activation de la différenciation myogénique. Dans la même étude, il a été montré que
l’action inhibitrice de la différenciation par le TGFβ était fortement diminuée en absence
d’expression de décorine. Il en résulte donc, que la décorine joue un rôle primordial dans le
contrôle de la différenciation des myoblastes en myotubes au cours de la myogénèse et que la
voie de régulation passant par le TGFβ est dépendante de son interaction avec la décorine
(Riquelme et al. 2001, Olguin et al. 2003).
Page -71-
IV.2.2. Les protéoglycannes héparanes sulfates
Il existe une grande variété de cœur protéique sur lesquels un ou plusieurs groupements HS
peuvent se fixer. La nature de l’axe protéique et le nombre de groupements HS fixés
définissent la structure et la fonction de chaque HSPG. Dans le muscle squelettique, il existe
plusieurs HSPG (Figure 29).
Ils se divisent en deux groupes suivant leur localisation : les HSPG membranaires et les
HSPG des lames basales.
Les HSPG membranaires peuvent être transmembranaires tels le syndécan et le bétaglycan ou
liés à la membranes par un glycosylphosphatidylinositol tel le cérébroglycane ou le glypican.
Leur localisation à l’interface entre cytosquelette et matrice leur confère un rôle de contrôle
dans les interactions cellule/cellule (prolifération, différenciation), cellule/matrice (adhérence,
migration,...) et cellules/médiateurs solubles (Praillet et al. 1998).
La fixation à certains composants de la matrice extracellulaire ou aux facteurs de croissance
peut être effectuée par des mécanismes dépendant de la nature du cœur protéique ou de la
séquence des HS ou des deux à la fois.
Les HSPG constituent la majeure partie des PG de la lame basale des muscles squelettiques et
sont fortement représentés à la surface cellulaire (Sanes and Chiu 1983 ; Brandan and
Inestrosa 1987). Ils sont aussi retrouvés majoritairement dans des cultures de myotubes in
vitro (Noonan et al. 1986 ; van Kuppevelt et al. 1992).
Les HSPG de la lame basale du muscle squelettique sont essentiellement constitués par du
collagène XVIII (c’est le seul collagène à faire partie des HSPG) (Hafter et al., 1998), du
perlécan (Iozzo et al. 1994) et de l’agrine. A la surface des cellules musculaires, on trouve
deux PG de la famille des HSPG, les syndecans (Bernfield et al. 1992) et des glypicans
(Campos et al. 1993) (Figure 30). Les HSPG jouent un rôle essentiel dans le développement
et la régulation de l’homéostasie musculaire.
IV.2.2.1.Agrine
L’agrine est un HSPG de la lame basale constitué d’un cœur protéique de 220 à 250 kDa et de
deux sites d’attachement aux GAG (Tsen et al. 1995). Au niveau des neurones, l'
agrine est
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indispensable à la capture et à l'
expression des récepteurs de l'
acétylcholine (AchR) au niveau
des membranes post synaptiques (Meier et al. 1998). Elle est aussi impliquée dans le
regroupement en vésicule de l'
AchE (Wallace et al. 1985). L'
agrine interagit avec de
nombreux facteurs de croissance, des protéines de la lame basale ainsi qu'
avec des protéines
de la surface cellulaire.
L'
agrine est un élément indispensable pour le bon fonctionnement des jonctions
neuromusculaires où elle interagit avec les récepteurs MuSK tyrosine kinase (Herbst and
est là son rôle essentiel.
Burden 2000). C'
IV.2.2.2.Les syndécans
Les syndécans constituent une famille transmembranaire de protéoglycannes à héparanes
sulfates, dans laquelle 4 membres homologues ont été identifiés chez les vertébrés, la
drosophile et C. elegans (Figure 31). Ce sont des protéines constituées d’une partie
intracytoplasmique courte, d’une partie transmembranaire et d’une partie extracellulaire qui
possède plusieurs sites de liaison pour les glycosaminoglycannes ainsi qu’un site de clivage
protéolytique.
Les syndecans ont des séquences d’acides aminés hautement conservées dans les domaines
transmembranaires et cytoplasmiques ainsi qu’une organisation exon-intron identique au
niveau de l’ADN génomique, ce qui laisse suggèrer que les 4 syndécans existants possèdent le
même gène ancestral. Les syndécans sont impliqués dans les interactions entre les cellules et
leur environnement. Ils interagissent avec de nombreux ligands tels les facteurs de croissance
de la famille des FGF, HGF et midkine mais aussi avec des constituants de la matrice
extracellulaire tels que la fibronectine, la tenascine, la laminine et les collagènes. Ils doivent
ces propriétés à la composition de leurs chaînes de GAG associées. Effectivement, les
syndécans ont la particularité de porter plusieurs types de glycosaminoglycannes
simultanémment. Ainsi, le syndécan-1 porte des HS vers son extrémité C-terminale et des CS
à proximité de la membrane cellulaire (Kokenyesi and Bernfield 1994), ou bien le syndécan –
4 peut porter indifféremment sur un même site de glycosylation, soit des HS, soit des CS
(Shworak et al. 1994).
En dehors de ces interactions avec les facteurs de croissance et les composants matriciels, les
syndécans sont impliqués dans la régulation de la prolifération et de la différenciation
cellulaire.
Page -73-
De récents travaux ont montré que les syndécans pourraient être impliqués dans l’organisation
du cytosquelette et l’activation des cascades de transduction de signal (revue Okayama et al.,
1998) puisqu’il a été démontré qu’il existait une dimérisation (figure 32) ou la
multimérisation des syndécans-3 et 4 (Asundi and Carey 1995), une phosphorylation du
domaine cytoplasmique du syndecan-2 (Itano et al.,1996) et une activation de la protéine
kinase C (PKC) par interaction avec le syndecan-4 (Oh et al., 1997).
Figure 32 : Représentation schématique de la dimèrisation des syndécans. D’après Okayarra
et al., 1998.
Au niveau des muscles squelettiques, les 4 types de syndécans sont présents mais exprimés de
manière différentielle. Les syndécan I et II ont un rôle important au cours de la prolifération
des myoblastes par interaction avec le FGF. Ils sont essentiellement exprimé au cours de la
phase embryonnaire au cours du développement des muscles squelettiques. Effectivement, il a
été montré qu’une diminution de l’expression du syndécan I et II atténuerait la signalisation
transmise par le FGF2 et donc favoriserait la différenciation. Présent en forte quantité, ils
inhibent la différenciation myogénique et favorisant la prolifération (Larrain et al. 1997;
Larrain et al. 1998 ; Cornelison et al. 2001).
Les syndécans 3 et 4 sont exprimés essentiellement par les cellules satellites adultes et sont
impliqués dans le maintient de l’intégrité musculaire et la régénération musculaire. Leurs
Page -74-
expressions sont accentuées dans les cas de lésions musculaires où ils interagisssent avec les
facteurs de croissance par leurs groupements HS (Cornelison et al. 2001). Des « knock-out »
pour le syndécan 3 et 4 montrent une diminution de la différenciation cellulaire et donc une
diminution de la formation des fibres a cours de la régénération musculaire (Cornelison et al.
2001).
IV.2.2.3.Les Glypicans
Les glypicans appartiennent à la famille des HSPG. Ils sont liés à la membrane cellulaire par
un ancrage GPI (Figure 33, ci dessous).
Figure 33 : Réprésentation schématique du glypican et de son ancrage à la membrane (Filmus
and Selleck 2001).
Actuellement, il existe 6 membres (GPC1 à GPC6) connus chez l’homme (Figure 34)
(Veugelers et al. 1999) et 2 chez la drosophile (Nakato et al. 1995 ; Baeg et al. 2001). Les
tailles des cœurs protéiques des glypicans sont très proches (60 000 à 70 000 Da) et, sauf
exception, tous possèdent un peptide signal sécrétoire à l’extrémité N-terminale et un
domaine hydrophobe nécessaire à la fixation du GPI à l’extrémité C-terminale. Le degré
d’homologie de la composition en acides aminés des 6 glypicans est moyen, par contre la
position de leur 14 cystéines est très conservée, ce qui suggère que la structure
tridimensionnelle des 6 glypicans est identique. Une autre caractéristique commune à tous les
glypicans est la localisation des sites de fixation des chaînes d’héparanes sulfates, qui semble
être restreinte à 50 amino acides dans la partie C-terminale, permettant ainsi aux chaînes de
GAG de se retrouver proches du site d’attachement à la membrane (Veugelers et al. 1999).
Page -75-
De manière générale, les glypicans sont exprimés préférentiellement au cours du
développement. Le niveau d’expression change selon le stade de développement et selon le
tissu où se situe l’expression, ce qui suggère que les glypicans sont impliqués dans la
régulation de la morphogenèse (Saunders et al. 1997 ; Pellegrini et al. 1998). Il semble aussi
que ces HSPG de surface interagissent comme « co-récepteurs » pour les FGF (Yayon and
Klagsbrun 1990), l’EGF (Higashiyama et al. 1993), les Wnts (Higashiyama et al. 1993) et les
membres de la super famille des TGFβ (Jackson et al. 1997), en facilitant l’interaction de ces
facteurs avec leurs récepteurs spécifiques. Ceci montre l’importance des interactions entre les
HSPG et de facteurs de croissance au cours de la régulation des systèmes de signalisation.
Le GPC1 a été identifié pour la première fois in vitro dans des cultures néonatales de cellules
de Schwann (Carey et al. 1993). Il est aussi exprimé au cours du développement dans les
muscles lisses et squelettiques (Brandan et al. 1996). L’expression de GPC2 est limitée au
développement des tissus nerveux, incluant le cerveau, la moëlle épinière, les ganglions
rachidiens et les nerfs crâniens (Ivins et al. 1997). Les GPC1 et GPC2 ne sont pas exprimés
dans les tissus correspondants chez l’adulte. Le GPC3 est exprimé en forte concentration au
cours du développement des mammifères dans tous les tissus à l’exception du système
nerveux (Pellegrini et al. 1998). Le GPC4 est exprimé essentiellement au niveau
embryonnaire (Watanabe et al. 1995) et plus particulièrement en faible quantité au niveau de
l’épithélium tubulaire rénal, des glandes surrénales, des muscles lisses intestinaux ainsi que
dans les régions mandibulaires ou maxillaires. Le GPC5 est quant à lui, exprimé faiblement
au stade embryonnaire (Saunders et al. 1997) au niveau des ganglions rachidiens, des
bourgeons des membres et du mesonéphros. Le GPC6 est localisé en faible quantité au niveau
rénal, gastrointestinal et dans les vaisseaux sanguins (Veugelers et al. 1999).
Des mutations touchant la biosynthèse des héparanes sulfates ou une modification de leur
structure entraîne chez la drosophile des perturbations très importantes sur la signalisation
médiée par Wingless (Wg) (Baeg et al. 2001). Wg est un membre de la famille Wnt, essentiel
pour la mise en place des structures embryonnaires et post-embryonnaires. Le fait que la
biosynthèse des héparanes sulfates soit indispensable à l’activité normale de Wg suggère
qu’un ou plusieurs PG participent directement au processus faisant intervenir les membres de
la famille Wnt (Filmus and Selleck 2001).
Page -76-
IV.2.2.4.Le perlécan
On ne connaît qu’une seule famille chez l’homme et la souris, bien qu’il en existe plusieurs
variantes résultant d’épissages alternatifs. Le noyau protéique peut porter jusqu’à trois GAG,
le plus souvent des héparanes sulfates. Ce perlécan est présent dans la lame basale des
organismes. Parmi les principales cellules productrices de perlécan, on peut citer les cellules
musculaires lisses vasculaires et les cellules du système nerveux central lors du
développement embryonnaire.
IV.3. Dynamique d’expression des PG durant le développement du muscle
squelettique
A un stade précoce du développement musculaire, un large CSPG de type PG-versican est
produit aussi bien dans des cultures de cellules myogéniques qu’in vivo. Par des techniques
radiographiques, ce large CSPG a été localisé dans des régions péri-cellulaires autour des
muscles squelettiques. Alors qu’aucune biosynthèse de ces molécules n’est détectée dans les
muscles squelettiques matures, cette synthèse est réinitialisée durant la régénération
musculaire (Carrino 1998).
A un stade plus tardif du développement, de petits DSPG de type décorine sont synthétisés.
Ces derniers ont la capacité de se fixer aux fibres de collagène et d’affecter la formation des
fibrilles. La décorine est initialement localisée dans les tissus conjonctifs fibreux entourant les
muscles squelettiques et parfois autour des myotubes.
Les HSPG de type syndécan, glypican et perlécan sont aussi très présents dans le muscle
squelettique. Ils jouent un rôle primordial dans la transduction de signaux médiée par les
facteurs de croissance de type FGF ou SF-HGF au cours de la prolifération cellulaire.
Au cours de la différenciation des cellules myoblastiques en myotubes, on détecte une
augmentation de la synthèse des HSPG proportionnellement à une diminution des CSPG et de
l’acide hyaluronique. Effectivement aux stades myoblastes et myotubes précoces, on détecte
des larges CSPG alors qu’au stade myotubes contractiles, on détecte uniquement des petits
DSPG et des HSPG (Carrino and Caplan 1982) (Figure 35).
Page -77-
V.
Glycosaminoglycannes : synthèse et fonctions
Le schéma proposé pour la biosynthèse des HS consiste en une série de réactions catalysées
par différentes enzymes, chacune responsable d’une étape spécifique (Figure 36) (Lindahl et
al. 1998 ; Selleck 2000 ; Sugahara and Kitagawa 2000).
V.1. Biosynthèse des héparanes sulfates
La synthèse des HS suit les grandes étapes de la biosynthèse des glycoprotéines. Celle-ci
débute par la traduction d’un ARN messager dans le réticulum endoplasmique rugueux (RER)
où a lieu la synthèse du noyau protéique. Puis, le noyau protéique enchassé dans la membrane
du réticulum endoplasmique est transféré vers la face « cis » de l’appareil de Golgi grâce à
des vésicules de transport. La synthèse de la partie saccharidique du protéoglycanne dans
l’appareil de Golgi peut alors se faire. La néosynthèse des HSPG terminée, ceux-ci sont
véhiculés vers leur destination finale (membrane cellulaire, matrice extracellulaire, vésicules
de sécrétion) grâce à des vésicules de transport qui bourgeonnent à partir de la face « trans »
de l’appareil de Golgi (Figure 37).
Les héparanes sulfates PG se démarquent cependant des glycoprotéines. Ainsi, leurs chaînes
glucidiques sont linéaires et ont une longueur moyenne de 80-100 unités disaccharidiques,
contre une quinzaine de monosaccharides au maximum pour celles des glycoprotéines, qui de
plus présentent des ramifications. De même, alors que les PG peuvent contenir jusqu’à 95%
de glucides en poid, les glycoprotéines n’en contiennent que de 1% à 60% (Alberts et al.
1990). Les PG possèdent ainsi le plus souvent une masse moléculaire élevée, de l’ordre de 1
000 kDa, alors que les glycoprotéines atteignent rarement une masse de l’ordre de 100 kDa
(elles sont le plus souvent aux alentours de 10 kDa). Enfin, leur biosynthèse dans l’appareil de
Golgi présente des différences notables. En effet, bien qu’on ne connaisse pas encore la
localisation exacte des différentes enzymes nécessaires à leur biosynthèse, la construction de
la fraction glucidique des PG débute vraisemblablement dans l’appareil de Golgi par
l’assemblage de l’oligosaccharide de liaison, à l’extrémité non réductrice duquel a lieu
l’élongation d’un polymére « natif » de GlcA et de GlcNAc au niveau du Golgi médian. Ce
polymère subit ensuite diverses modifications (N-déacétylations, O- et N- sulfatations,
épimérisations) au cours d’un processus dit de maturation qui a lieu dans le compartiment
« trans « de l’appareil de Golgi (Lindahl et al. 1998).
Page -78-
L’ensemble du processus de biosynthèse des HS et de l’héparine nécessite au moins 12 types
différents d’activités enzymatiques, et il peut exister différentes isoformes d’enzymes pour
une même activité (Gallagher et al., 1989). Participant à cette synthèse, on reléve :
Pour la synthèse de l’oligosaccharide de liaison, une xylosyl transférase, les galactosyl
transférases I et II, et la D-glucuronyl transférase I.
Pour la polymérisation du polymère initial : la D-glucuronyl transférase II et la N-acétyl Dglucosamine transférase.
Pour l’étape de maturation du polymère initial : une N-acétyl D-glucosaminyl Ndéacétylase, une N-acétyl D-glucosaminyl N- sulfotransférase, , une hexuronosyl épimérase,
une hexuronosyl 2-O-sulfotransférase, une D-glucosaminyl 6-O-sulfotransférase et une Dglucosaminyl 3-O-sulfotransférase.
De plus, un certain nombre d’enzymes cytoplasmiques sont nécessaires afin de catalyser et
former les monosaccharides (UDP-Xyl, UDP-Gal, UDP-GlcA, UDP-GlcNAc) et produirent
des groupements sulfates (PAPS). A cela s’ajoute de nombreux transporteurs membranaires
permettant l’importation des constituants du cytosol vers la lumière de l’appareil de Golgi
(Hirschberg et al.,1998 ; Berninsone et al., 2000). Le processus d’assemblage dépend de la
disponibilité du GlcN et des sucres.
V.1.1. Synthèse du tétrasaccharide de liaison Protéine-GAG
L’initiation de la synthèse des GAG débute donc par la formation et l’attachement du
tétrasaccharide, GlcA(β1,3)Gal(β1,3)Gal(1,4)Xyl(β1-, sur un résidu sérine du cœur protéique
des PG (Bourdon et al. 1987 ; Dolan et al. 1997; Sugahara and Kitagawa 2000). Le
tétrasaccharide est formé par addition successive de chaque résidu monosaccharique sur
l’extrémité non-réductrice de la chaîne en croissance grâce à leurs glycosyltransférases
spécifiques.
La première réaction enzymatique débute par la O-xylosylation de certains acides aminés
sérine des noyaux protéiques, suivie par l’ajout de deux unités D-galactose (Esko and Zhang
1996). La région de fixation subit en parallèle une phosphorylation en C2 du xylose et une
sulfatation en C4 et C6 (Figure 38) sur le résidu galactose, mais la conséquence fonctionnelle
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de cette modification n’est pas encore bien connue Sugahara and Kitagawa 2000. La
phosphorylation peut être transitoire ce qui lui suggère un rôle au cours de la sécrétion ou la
régulation du processus d’assemblage.
Figure 38 : Représentation schématique de la phosphorylation en C2 du Xylose et des
sulfatations
en
C4
et
C6
des
deux
galactose
du
tétrasaccharide
GlcA(β1,3)Gal(β1,3)Gal(1,4)Xyl(β1 coeur protéique). (GlycoWord).
V.1.2. Elongation de la chaîne de GAG
Après la formation du tétrasaccharide, une α-GlcNAc transférase ou une β-GlcNAc
transférase ajoute respectivement une unité GlcNAc par simple liaison (α1-4) ou β(1-4), ce
qui détermine et engage la synthèse des GAG vers la voie des HS/Hep ou des CS/DS (Figure
36). Il existe donc une compétition entre ces deux enzymes.
V.1.3. Les « Exostose tumor suppressors » ou EXT
La synthèse de GAG a dominante HS se fait donc par l’addition successive de résidus GlcA et
de GlcNAc en β(1-4) et α(1-4), le tout catalysé par des protéines maintenant connues comme
appartenant à la famille des « Exostose tumor suppressors » (EXT) (Duncan et al. 2001).
La famille des EXT est composée de 5 membres : EXT1, EXT2, EXTL1, EXTL2 et EXTL3
(Figure 39).
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Comme il est montré dans la figure 36, EXT1 et EXT2 interviennent en amont de la voie de
synthèse des GAG et sont déterminants dans la composition finale des GAG (HS/Hep ou
CS/DS). EXT1 et EXT2 ont été mis en évidence dans des cas de HME (« Hereditary Multiple
Exostose »), maladie autosomale dominante caractérisée par une malformation des os et plus
particulièrement dans la région juxta-épiphysale des os long (McCormick et al. 1999). La
HME résulte de la mutation d’un ou des deux gènes homologues EXT1 et EXT2.. Les EXT et
les EXTL sont des protéines ayant des séquences homologues au niveau de leur région Cterminale. Cependant, il n’a pas été montré qu’une altération des gènes codant pour les EXTL
ou EXT-like pouvait être responsable d’HME.
Deux études parallèles ont montré qu’il existe une relation entre les HS synthétisés par les
glycotransférases et les gènes de la famille des EXT. Ces derniers ont été identifiés comme
étant des gènes capables de restaurer la synthèse des HS dans des cellules mutantes
déficientes en HS (McCormick et al. 1999). Le séquençage du peptide produit par la HS copolymérase purifiée à partir de sérum bovin a permis d’identifier l’enzyme comme étant un
homologue de EXT2 (Lind et al. 1998). En même temps, chez la drosophile, le gène tout velu
(ttv), un homologue de EXT1, a été montré comme étant impliqué dans la diffusion de
hedgehog, qui s’effectue selon un processus GAG-dépendant au cours du développement
embryonnaire (Bellaiche et al. 1998).
Des études plus récentes ont mis en évidence que les formes recombinantes de EXT1 et EXT2
ont aussi une activité transférase α(1,4)GlcNAc (GlcNAcT-II) et β(1,4)GlcA (GlcAT-II),
respectivement (Senay et al. 2000). Elles sont primordiales pour l’élongation de la chaîne des
GAG et pour le choix entre la GlcNAcT-I et la GlcAT-I qui effectueront le transfert du
premier résidu GlcNAc ou GlcA sur la région de fixation correspondante (Figure 40).
D’autre part, il a été indiqué qu’une déficience en EXT1 ou EXT2 provoque une HME, ce qui
tend à prouver que EXT1 et EXT2 sont des glycosyltransferases essentielles à la biosynthèse
des GAG.
EXTL1, EXTL2 et EXTL3 codent aussi pour des GlcNAc transférases, qui sont aussi
impliquées dans la biosynthèse des HS (Kitagawa et al. 1999 ; Kim et al. 2001).
Des formes tronquées de EXTL1, EXTL2 et EXTL3 auxquelles il manque la partie Nterminale transmembranaire et le domaine cytoplasmique, sont exprimées de façon éphémère
dans des cellules COS-1, et semblent posséder une activité α(1,4)Glc transférase.
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La forme tronquée de EXTL1 permet de passer de α(1,4)GlcNAc au N-acetylheparosan
oligosaccharide GlcAβ(1,4)GlcNAcα1-(4GlcAβ1,4GlcAcα1-)n qui représente la croissance
de la chaîne de HS, ce qui lui confère une activité de type GlcNAcT-II (Kim et al. 2001).
La forme tronquée de EXTL3 utilise non seulement le N-acetylheparosan oligasaccharide
mais aussi le GlcAβ(1,3)Galβ1-O-C2H4NHCbz, comme substrat synthétique de l’αGlcNAc
transférase I, pour l’initiation de la synthèse des HS ou de l’héparine, ayant à la fois une
activité GlcNAcT-I et GlcNAcT-II (Kim et al. 2001).
De plus, la protéine EXTL2 permet de passer du résidu α(1,4)GlcNAc au résidu
l’αGlcAβ(1,3)Galβ1-O-naphtalenmethanol (Kitagawa et al. 1999), analogue artificiel de la
région
de
fixation
du
tétrasaccharide
initial
sur
le
coeur
protéique
(GlcAβ(1,3)Galβ(1,3)Galβ(1,3)Xylβ1-O-Ser).
EXTL2 semble être un bon candidat pour l’enzyme clé, la GlcNAcT-I, d’où l’orientation de la
synthèse des GAG de manière préférentielle vers la voie de synthèse des HS ou de l’héparine
et par conséquence empêche ou diminue fortement celle des CS ou du DS.
Enfin, il n’a jamais été observé d’activité glucuronyltransférase pour EXTL1 et EXTL3. D’où
le rôle de EXTL3 dans l’initiation et l’élongation des chaînes, et le rôle de EXTL1 dans
l’élongation des chaînes de HS et/ou Hep uniquement.
En conclusion, les 5 membres de la famille des gènes EXT sont capables d’avoir une activité
glycosyltransferase contribuant à la synthèse des HS et de l’héparine.
V.1.4. Synthèse de la chaîne finale des héparanes sulfates ou de l’héparine
La structure de base des héparanes sulfates est par la suite modifiée par de nombreuses
enzymes qui permettent de passer de la molécule de HS non active à des molécules de HS
actives, contenant un ou plusieurs domaines fonctionnels. Ces domaines possédent des
séquences dites uniques de GlcA et IduA ainsi que des groupements N-acetylés, N-sulfatés et
O-sulfatés à différents endroits de la molécule et dans des combinaisons différentes (Habuchi
et al. 2000 ; Selleck 2000; Esko and Lindahl 2001).
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V.1.4.1. Les N-deacétyl/N-sulfotransferases (NDST).
La première modification du polysaccharide de base est effectuée par une enzyme
bifonctionnelle, la glucosaminyl N-deacétylase/N-sulfotransferase (NDST). C’est une
glycoprotéine d’environ 97 kDa isolée et purifiée à partir d’un homogénat de foie de rat. Elle
a depuis été purifié et cloné à partir de plusieurs lignées cellulaires et est connue actuellement
sous quatre isoformes (Orellana et al. 1994 ; Aikawa and Esko 1999). Il s’agit pour chacun
d’elles de glycoprotéines transmembranaires de type II enchassées dans la membrane de
l’appareil de Golgi et présentant une courte région intracytoplasmique à leur extrémité Nterminale, une zone transmembranaire à traversée unique, et une partie luminale importante
comportant le site de catalyse.
Les NDST sont donc les premières enzymes qui interviennent car elles seules sont capables
d’accepter comme substrat les séquences disaccharidiques GlcA-GlcNAc. Elles permettent
donc d’effectuer une N-déacétylation et une N-sulfatation sur des résidus GlcNAc
sélectionnés, ce qui est considéré comme un pré-requis pour les autres modifications.
Les NDST1 et NDST2 ont une distribution tissulaire étendue (testicules, reins, foie, rate,
poumon, muscles squelettiques, coeur, cerveau) (Kusche-Gullberg et al. 1998 ; Aikawa et al.
2001), alors que la NDST3 et la NDST4 montrent une expression plus restrictive (cerveau,
foie, rate). Il a été observé qu’une interruption (Fan et al. 2000 ; Ringvall et al. 2000) ou une
diminution de l’expression (Aikawa and Esko 1999) des gènes codant pour la NDST1
provoquait une diminution significative du taux de N-sulfatation des HS. Une déficience de la
NDST1 provoque la mort de souris durant la période néonatale par insuffisance respiratoire.
Une déficience de la NDST2 ne montre aucune altération visible des HS chez la souris, mais
elle est plutôt capable de synthétiser une grande quantité héparine (Humphries et al. 1997 ;
Forsberg et al. 1999). Ces résultats montrent ainsi l’importance de la NDST1 et de la NDST2
au cours de la synthèse des HS et de l’héparine, respectivement.
V.1.4.2. Les épimérases
La deuxième modification enzymatique du polysaccharide de base consiste en une
épimérisation en C5 de l’acide D-glucuronique (D-GlcA) en acide L-iduronique (L-IdoA)
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effectuée par l’enzyme l’hexuronosyl C5-épimerase (Crawford et al. 2001 ; Li et al. 2001).
Lors de cette réaction, l’hydrogène situé sur le carbone 5 de l’acide D-glucuronique est libéré
et remplacé par un proton provenant du milieu. Cette réaction a pour caractéristique d’être
réversible, et le rapport acide D-glucuronique/acide L-iduronique déterminé in vitro est
compris entre 1,5 et 2,5 (Hagner-Mcwhirter et al. 2000).
L’hexuronosyl C5-épimérase a été partiellement purifiée pour la première fois à partir du
surnageant de culture de mastocytes de souris (Malmstrom et al. 1980) et de foie de boeuf
(Campbell et al. 1994), bien qu’il s’agisse d’une glycoprotéine transmembranaire de
l’appareil de Golgi (PM= 52 kDa). Elle a été clonée depuis, à partir d’un extrait de poumon de
boeuf (Li et al. 1997), de mastocytes de souris (Rong et al. 2000), ainsi que d’un extrait de
foie de souris (Li et al. 2001). Il a également été démontré que c’est la même isoforme de
l’enzyme qui est impliquée tant dans la biosynthèse de l’héparine que dans celles des
héparanes sulfates. Il n’existerait ainsi qu’une seule isoforme de la C5-épimérase (Li et al.
2001).
V.1.4.3. Les O-sulfotransférases
Après cette étape d’épimérisation, le polysaccharide subit une 2-O-sulfatation des résidus
d’acide uronique (IdoA ou GlcA) réalisée par l’héparane sulfate 2 sulfotransferase (HS2ST ou
2OST). Cette enzyme transfert un groupement O-sulfate en position 2 sur des unités d’acide
L-iduronique, à partir du donneur de sulfates, le PAPS. Il s’agit également d’une
glycoprotéine transmembranaire de l’appareil de Golgi (PM= 44kDa), dont le site catalytique
se trouve du côté de la lumière de l’organite. Purifiée et caractérisée pour la première fois
(Kobayashi et al. 1996) à partir d’un extrait cellulaire de cellules d’ovaires d’hamster chinois
(CHO) et de cellules pgsF-16 déficientes en 2-0- sulfatation (Bai and Esko 1996), il n’est
connu qu’une seule isoforme. Elle a depuis été clonée à partir de cette même lignée cellulaire
(Kobayashi et al. 1997), ainsi qu’à partir de cellules de mastocytome murin (Rong et al.
2000).
Des souris déficientes pour cette enzyme présentent une malformation rénale qui par la suite
occasionne une mortalité néonatale (Bullock et al. 1998).
La quatrième modification est une 6-O-sulfatation des résidus glucosamine réalisée par
l’activation de la D-glucosaminyl 6-O-sulfotransférase (HS6ST ou 6OST). Elle transfert un
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groupement sulfate en position 6 des unités de D-glucosamine, à partir du donneur de sulfates,
le PAPS. Isolée et purifiée pour la première fois à partir de microsomes de mastocytes de
souris, cette enzyme s’est avérée être une glycoprotéine transmembranaire d’environ 60 kDa,
capable de sulfater non seulement les unités D-glucosamine en position 6 mais également les
unités d’acide L-iduronique en position 2. Elle a depuis été purifiée à partir de surnageants de
cultures de cellules CHO et clonée (Habuchi et al. 1998). Actuellement, trois isoformes de
cette enzyme sont connues, la 6-OST1, la 6-OST2 et la 6-OST3, qui ont toutes été clonées
chez la souris (Habuchi et al. 2000), et ne possédent aucune activité de type 2-OST. La 6OST1 est principalement exprimée au niveau du foie et la 6-OST2 au niveau du cerveau ainsi
que dans la rate. La 6-OST3 a une expression ubiquiste.
L’expression de ces isoformes est donc « tissu-spécifique » et chaque isoforme a une
spécificité de substrat différente, ce qui suggère un rôle important de cette enzyme au cours de
la synthèse des épitopes des HS « tissu-spécifiques ».
La dernière étape consiste en une 3-O-sulfatation des résidus glucosamine catalysée par une
D-glucosaminyl 3-O-sulfotransférase (3-OST). De toutes les enzymes de la maturation des
GAG, c’est celle qui a été le plus étudiée. Comme son nom l’indique, elle a pour rôle de
transférer un groupement sulfate en position 3 des unités de D-glucosamine, à partir du
donneur de sulfate, le PAPS. Après isolement et purification à partir de milieux de culture de
fibroblastes murins (3-OST1), elle s’est avérée être une glycoprotéine de 46 kDa environ (Liu
et al., 1996). Son clonage à partir de cette lignée cellulaire, ainsi qu’à partir de cerveau
humain, a permis de l’identifier comme une protéine située dans la lumière de l’appareil de
Golgi, et non de type transmembranaire (Shworak et al. 1997). De nouvelles isoformes de
l’enzyme ont été découvertes depuis (3-OST-2, 3OST-3a, 3OST-3b et 3-OST4), et ont été
clonées à partir de cellules de carcinome embryonnaire de souris, les cellules F9. Ces
isoformes, par contre, se sont toutes avérées être des glycoprotéines transmembranaires de
type II de l’appareil de Golgi (Shworak et al. 1999), et elles sont impliquées, chez les cellules
F9, dans la biosynthèse des héparanes sulfates.
Le grand nombre de modifications réalisées sur le polysaccharide de base fait des HS des
biopolymères à dense information, avec lesquels de nombreuses protéines peuvent interagir
par fixation sur des séquences spécifiques de sa chaîne (Lindahl et al. 1998 ; Bernfield et al.
1999, Tumova et al. 2000 ; Turnbull et al. 2001 ; Gallagher 2001).
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Il existe encore très peu, voir aucunes données sur les variations de ces enzymes au cours de
la myogenèse et de la régénération musculaire.
V.1.5. Dégradation des héparanes sulfates
Le catabolisme des héparanes sulfates peut être résumé dans la figure 41 La majorité des
HSPG de surface est endocytée et suit la voie de dégradation pré-lysosomale et lysosomale
classique. Après l’endocytose, la protéolyse et la dégradation endoglycosidique des HSPG
sont assurées par l’héparanase dans un environnement à pH neutre. Partiellement clivés, les
HSPG sont à nouveau dégradés par l’héparanase mais cette fois-ci en milieu acide. La
dernière étape est une dégradation exoglycosique assurée par les sulfatases. Les HSPG sont
alors présents dans les vésicules lysosomales sous forme de monosaccharides et de sulfates
libres. Les cœurs protéiques après avoir ou non transité par le réticulum endoplasmique
rugueux via des vésicules issues du Golgi sont véhiculés jusqu’à la membrane plasmique.
Figure n° 41: Dégradation intracellulaire des HSPG (d’après GlycoWord)
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V.1.6. Sulfatases et héparanases
V.1.6.1. Les sulfatases
Une des deux voies de dégradation endogène des GAG naturels est liées à l’intervention des
sulftases. Ces enzymes sont capables d’hydrolyser les groupements ester sulfates des chaînes
polysaccharidiques. Il existe 3 type d’enzymes lyssomales :
Enzyme de type I : Aryl sulfatase C : enzyme microsomiale insoluble rarement
détecté dans les fluides corporels
Les enzymes de type II : aryl sulfatases A et B. Ces deux enzymes sont d’origine
lysosomale et sont présentent dans tous les tissus chez les Mammifères. L’aryl sulfatase A est
une N-acétylglucosamine sulfate sulfatase et a comme substrat le sphingolipide cérébroside 3sulfate (sulfatide). L’aryl sulfatase B est une N-acétylgalactosamine-4-sulfate sulfatase, elle
dégrade les groupements sulfates en position 4 présent sur les galactosaminoglycannes.
Enzyme de type III : La 6-sulfatase ou la N-acétylglucosamine 6 sulfate sulfatase
dégrade les groupements sulfates en position 6 présent sur glucosaminoglycannes.
Une déficience de l’une de ses enzymes provoque de nombreuses maladies de types
autosomales.
V.1.6.2. les héparanases
Les héparanases sont des endo-β-glucuronidases impliquées dans la dégradation des HS. On
distingue trois sous-espèces d’héparanases. L’héparitinase I dégrade essentiellement les GAG
possédant des liaisons α-N-acétylglucosamine-acide D-glucuronique et est inefficace sur les
disaccharides disulfatés telle l’héparine. L’héparitinase II coupe au niveau des liaisons α-Nacétylglucosamine-acide D-glucuronique et acide L-iduronique des HS et de l’héparine,
produisant ainsi des oligosaccharides insaturés. L’héparitinase III ou heparinase dégrade les
disaccharides si et seulement si ils possédent un groupement sulfate en position 2 de l’acide
uronique comme c’est le cas de l’héparine.
L’héparanase est synthètisée sous une forme latente de 65 kDa. Cette forme latente est
internalisée dans des vésicules d’endocytose où elle subit une protéolyse. La protéolyse
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produit une forme active de 50kDa (Nadav et al. 2002). Les héparanases sont impliquées dans
les phénomènes inflamatoires, l’angiogenèse tumorale et le développement de métastases.
V.1.7. Rôles physiologiques des héparanes sulfates
Un grand nombre de séquences uniques de HS sont formées, ceci étant dû à la diversité des
profils d’expression au niveau des tissus et à la spécificité de substrat des différentes
isoformes de glycosyltransférases et de sulfotransférases. La distribution inter ou intraorganes des épitopes de HS a été montrée au cours de différents stades du développement
(van Kuppevelt et al. 1998; Jenniskens et al. 2000; Dennissen et al. 2002 ; van de Westerlo et
al. 2002, Jenniskens et al. 2003).
Pour les HS, les séquences consensus de certains des épitopes, ainsi que de domaines
impliqués dans la fixation de facteurs de croissance et de l’ATIII (Antitrombine III) ont été
élucidées (Habuchi et al. 1992 ; Turnbull et al. 1992 ; Guimond et al. 1993 ; Lyon et al.
1994 ; Ashikari et al. 1995 ; Kreuger et al. 2001).
Les rôles essentiels des HS au cours du développement et dans un certain nombre de voies de
signalisation ont été récemment démontrés par l’identification de certaines mutations sur des
enzymes biosynthétiques des HS chez la Drosophile et Caenorhabditis mais aussi dans la
lignée cellulaire CHO (Sugahara and Kitagawa 2000 ; Filmus and Selleck 2001). De plus, la
construction de souris « knock-out » déficientes pour de nombreux cœurs protéiques de PG ou
pour des protéines impliquées dans la biosynthèse des HS, a permis de comprendre plus
précisément les rôles physiologiques des HS (Forsberg and Kjellen 2001).
En effet, les HSPG spécialement par le taux de sulfatation de leur HS constitutifs sont
considérés comme étant des régulateurs puissants de processus de signalisation cellulaire
ayant lieu au cours du développement embryonnaire (Selleck 2000; Dhoot et al. 2001).
Grâce à leur affinité vis-a-vis d’un grand nombre de protéines (Tableau 4), les HS ou
l’héparine qui résident dans la MEC ou à la surface des cellules (cf. supra), sont impliqués
dans de nombreux processus cellulaires tels la prolifération cellulaire normaux et
pathologiques, la différenciation cellulaire, l’angiogenèse, les métastases, le développement
tumoral, la réparation tissulaire, le remodelage tissulaire, l’adhésion tissulaire, l’invasion
microbienne, l’infection virale, l’endocytose, le métabolisme des lipoprotéines et l’expression
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protéique (Williams and Fuki 1997 ; Iozzo 1998; Lyon and Gallagher 1998; Bernfield et al.
1999 ; Park et al. 2000 ; Perrimon and Bernfield 2000 ; Tumova et al. 2000).
Tableau 4 : Groupes de protéines pouvant se lier à des GAG
Enzymes
Enzymes lipolytiques
Kinases
Phosphatases
Hydrolases, carbohydrates, éliminase, transférases
Protéases et estérases
Nucléases, polymérases, topoisomérases
Autres enzymes, oxydases, synthétases, dismutases
Enzymes inhibitrices
Inhibiteurs des serines protéases (serpines)
Lipoprotéines
VLDL
Apolipoprotéines
Facteurs de croissance (FC)
FGF
EGF
HGF
PDGF
TGF
VEGF
Chemokines
CXC chemokines
CC chemokines
Sélectines
Protéines de la MEC
Collagène
Fibronectine
Laminine
Thrombospondine
Vitronectine
Fibrilline
Récepteurs protéiques
Récepteurs stéroïdiens
Récepteurs des FC
Protéines canal
Protéines d’enveloppe virale
HIV
HSV
Dengue
Protéines nucléaires
Histones
Facteurs de transcription
Autres Protèines
Protéine du Prion
Protéine amyloïde
Fibrine
Canal ionique
Source provenant de Gunay et Linhardt, 1999
V.1.8. Les HS dans la myogenèse
Avant d’attribuer des fonctions spécifiques et individuelles à chaque type de PG de la matrice
extracellulaire, de nombreuses études ont reconnu l’implication des composants de la MEC au
cours du développement du muscle squelettique (Jansen and Fladby 1990), et plus
spécialement, les HSPG, dont les rôles au cours du développement ont été clairement
envisagés (Perrimon and Bernfield 2000). La mise en évidence d’une régulation de la
synthèse des PG et des HS durant la myogenèse in vitro suggére que celle-là peut jouer un
rôle comme rôle possible dans des processusmyogéniques fondamentaux (Noonan et al.
1986 ; Miller et al. 1987; Larrain et al. 1997; Larrain et al. 1997 ; Jenniskens et al. 2000).
Une régulation similaire de l’expression des HS in vivo consolide l’implication individuelle
des HSPG ou des épitopes de HS durant la myogenèse (Velleman et al. 1999; Charbonnier et
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al. 2000 ; Gallagher 2001 ; Olguin and Brandan 2001; Jenniskens et al. 2002a). Dans des
expériences in vivo, il a été montré que l’héparine inhibait la croissance du muscle
squelettique (Kardami et al., 1988), cependant que l’addition d’héparine, de HS ou de HS
mimétiques à des cultures de cellules satellites augmente la différenciation des myoblastes en
myotubes (Rapraeger et al. 1991 ; Papy-Garcia et al. 2002). Des cellules satellites issues de
souris mdx montrent un taux élevé de récepteurs HSPG pour le FGF (Crisona et al. 1998). De
plus, Unc-52, un homologue du perlécan chez Caenorabditis elegans (Rogalski et al. 1993),
est montré comme étant impliqué dans le maintien de l’intégrité musculaire (Rogalski et al.
1995). Actuellement, il semble évident qu’il existe une synergie entre les protéines
régulatrices et les HS présents dans de nombreuses structures, permettant d’obtenir ainsi un
environnement extracellulaire propice à la myogenèse.
V.1.9. Interaction entre HS et facteurs de croissance
Les héparanes sulfates représentent les polysaccharides les plus communs des membranes
plasmiques. Ils constituent des récepteurs à de nombreux facteurs de croissance présentant
une forte affinité de liaison à l’héparine et nommés Heparin Binding Growth Factors (HBGF).
Une séquestration dans la MEC et au niveau de la membrane cellulaire de ces facteurs par
leur liaison avec des HS permet de les protéger de dégradations thermiques ou enzymatiques,
de les stabiliser et de réguler leur biodisponibilité.
V.1.9.1. Interaction HS-FGF2
Le FGF2 est l’un des membres de la famille des FGF qui, comme nous l’avons indiqué
auparavant (cf § II.4.1), stimule la croissance, la migration et la différenciation de nombreux
types cellulaires (pour revue, voir Powers et al. 2000). Une des propriétés utilisées notamment
pour purifier les FGF, est leur possibilité de se lier à l’héparine et aux HS de la matrice
péricellulaire.
Une séquence oligosaccharidique spécifique est requise pour qu’il y ait interaction entre l’HS
et le FGF2. Cette séquence a été établie par digestion enzymatique des domaines sulfatés des
HS par l’héparitinase et l’utilisation d’une chromatographie d’affinité-FGF2 afin d’isoler les
fractions de plus fortes affinités. La séquence obtenue est un oligosaccharide de 14 résidus,
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nommé Oligo-H : GlcA- GLcNSO3- - [IdoA,2S-GlcNSO3-]5 – IdoA – GlcNAc (Gallagher
1994). La séquence saccharidique minimale requise pour activer le FGF2 varie entre 2 à 12
résidus saccharidiques (Pye and Gallagher 1999).
Un certain nombre de modèles ont été envisagé quant aux interactions HS-FGF2-FGFR
susceptibles de déclencher une réponse biologique.
Un de ces modèles concerne la liaison de deux molécules de FGF2 à une séquence
oligasaccharidique d’HS de manière à présenter le dimère FGF2 à son récepteur (FGFR) et de
cette façon permettre le rapprochement et la dimérisation des récepteurs de haute affinité et
leur transphosphorylation (Miao et al. 1996).
Les HS permettent de prolonger la stimulation par le FGF en le protégeant d’éventuelles
dégradations et favorisent le stockage du FGF. Les HS situés à la surface des cellules sont
nécessaires à la liaison du FGF2 à ses récepteurs de haute affinité (Yayon et al. 1991).
Des traitements de cellules en culture dans un milieu contenant de l’héparine, par des
héparanases ou des protéases comme la plasmine ou la thrombine libèrent du FGF2 de la
MEC sous une forme biologiquement active (Benezra et al. 1992).
Un autre modèle suggère que l’HS joue un rôle de pont entre une molécule de FGF2 et son
récepteur (Guimond et al. 1993). En effet, il semblerait que l’unité minimale requise induisant
une action mitogène serait un complexe monomérique HS-FGF2 (Pye and Gallagher 1999).
Plus récemment, l’hypothèse de modèles de dimères 2FGF-2FGFR stabilisés par l’addition
d’un HS a été avancée (Venkataraman et al. 1999 ; Stauber et al. 2000, Turnbull et al. 2001).
(Figure 42)
V.1.9.2. Interaction entre HS et TGFβ
β1
La molécule active de 26 kDa de TGFβ1 interagit avec de multiples sites de liaison à la
surface des cellules mais aussi avec des composants matriciels comme la fibronectine, la
thrombospondine, le collagène IV et les domaines protéiques de PG comme la décorine et le
biglycan (Schultz-Cherry et al. 1994). La forme active du TGFβ1 s’associerait aux HSPG
suivant des mécanismes différents : soit directement (McCaffrey et al. 1992), l’héparine se
liant alors directement au TGFβ1 et empêchant son association avec l’α2-macroglobuline, soit
via une protéine de 60 kDa (Butzow et al. 1993).
De plus, parmi les trois récepteurs du TGFβ1, le récepteur de type III ou bétaglycan est un PG
situé à la surface cellulaire et riche en HS et CS. Il constitue un récepteur de stockage et
Page -91-
présente le TGFβ1 aux récepteurs de type I et II, ce qui déclenchent ensuite une cascade
réactionnelle conduisant à l’effet biologique (cf § II.4.2).
V.2. Héparanes sulfates protéoglycannes (HSPG) et HS dans les pathologies
musculaires
Durant ces dernières années, nous avons vu apparaître un nombre croissant de myopathies
non héréditaires touchant un nombre non négligeable de protéines de la MEC du muscle
squelettique, mais aussi de HSPG présents à la surface cellulaire ou au niveau de la lame
basale, et qui sont impliqués dans les myopathies (Tableau 5).
Ainsi, chez des souris mdx, animaux modèles de la dystrophie musculaire de Duchenne, on
observe une sur-production de nombreuses molécules de la MEC. Le gène codant pour le
perlécan est muté dans la myotomie chondrodystrophique ou syndrome de Schwartz-Jampel
(Nicole et al. 2000) et dans la dysplasie disegmentaire de type Silverman-Handmaker
(Arikawa-Hirasawa et al. 2001). Dans le syndrome de Schwartz-Jampel, on observe une
diminution significative du nombre de molécules de perlécan tronquées au niveau de la lame
basale des fibres musculaires striées. Cette variation produit une détérioration de la fonction
du perlécan causant ainsi une myotomie myopatique, surtout que l’on sait que le perlécan est
essentiel à la mise en réserve de l’AchE au niveau des jonctions neuromusculaires (ArikawaHirasawa et al. 2002). De plus, une mutation du gène Unc-52 du C.elegans provoque une
létalité ou aboutit à une paralysie (Rogalski et al. 1993).
Des souris « knock-out » pour l’agrine montre une aberration dans la synaptogenèse (Gautam
et al. 1996). Par ailleurs, il a été montré que la restauration de l’expression de l’agrine par un
mini-gène artificiel semble pouvoir abolir la dystrophie musculaire congénitale dans un
modèle de souris (Moll et al. 2001).
Le syndrome de Simpson-Golbi-Behmel est quant à lui attribué à un défaut de synthèse ou de
fonctionnement du glypican-3 (Pilia et al. 1996 ; Cano-Gauci et al. 1999).
Tableau 5 : Différentes myopathies résultant de malformation héréditaire ou expérimentale
des constituants de la surface cellulaire ou de la lame basale.
Cible
Agrine
Causea
Myopathie interstitiel
Références
A
Dystrophie musculaire congénitale
Moll et al., 2001
A
Déficience de la synaptogenèse musculaire
Gautam et al., 1999
Collagene VI
H
Myopathie de Bethelem
Lamandé et al., 1998
Collagene XII
A
Myopathie progressive
Krist et al., 2001
Glypican-3
H
Symdrome de Simpson-Golbi-Behme
Pilia et al., 1996
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Laminine-2
H
Dystrophie musculaire congénital Merosine
Tome et al., 1994
Negative
Laminine –α2
H
Dystrophie musculaire congénitale
Herrman et al., 1996
Laminine -β1
H
Dystrophie musculaire de la gaine des
Li et al., 1997
membres
A
MuSK
Déficience de la synaptogenèse
Gautam et al., 1999
neuromusculaire
Perlécan
H
Syndrome de Schartz-Jampel
Nicole et al.,2000
H
Dysplasie disegmentaire de Silverman-
Arikawa-Hirasawa et al., 2001
Handmaker
A
Défaut de séquestration de l’AchE
Arikawa-Hirasawa et al., 2001
Tenascine-C
A
Défaut des jonctions neuromusculaires
Cifuentes - Diaz et al., 1998
Unc-52**
A
Perte de l’intégrité musculaire et paralysie
Rogalski et al., 1995
Pour chaque maladie la référence la plus récente a été citée
a
A : artificielle ou provoquée ; H : héréditaire
* HSPG protéoglycanne
** homologue du perlécan chez C. elegans
V.3. Analogues de synthèse : mimétiques d’héparanes sulfates ou RGTA
De nombreux HBGF comme le PDGF, l’EGF, les FGF ou le TGFβ, jouent un rôle majeur
dans la réparation et la régénération tissulaire après leur sécrétion par les cellules
inflammatoires locales ou circulantes et leur relargage associée aux HSPG dans la MEC où ils
sont stockés et protégés de la protéolyse. Une fois libérés, ces facteurs de croissance agissent
comme agents de cicatrisation et compte tenu du rôle protecteur et stabilisateur de l’héparine
vis-à-vis des FGF et des interactions FGF-héparine, l’idée d’utiliser des biomatériaux comme
transporteurs et stabilisateurs de ces facteurs de croissance a conduit à développer des
composées mimétiques d’héparanes sulfates. Le laboratoire d’étude sur la Croissance
Cellulaire, la Réparation et la Régénération Tissulaires (CRRET) a envisagé l’utilisation de
polymères chimiquement modifiés comme mimétiques des héparanes et dépourvus d’activité
anticoagulante, dans divers modèles in vivo. Ces molécules ont été appelées RGTA pour
ReGeneraTing Agents en raison de leurs effets stimulateurs sur le processus de cicatrisation et
de régénération chez l’animal.
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Le caractère polysaccharidique de ces molécules naturelles laisse envisager que de molécules
synthétiques ayant une structure similaire, doivent être aussi puissants, ou plus, que ces
polyanions naturels.
Il a été reporté qu’une famille de dextranes modifiés, regroupant des mimétiques structuraux
des HS appelés RGTA (ReGeneraTing Agent) ou héparane sulfate mimétique (HSM),
possède la capacité de stimuler la réparation tissulaire. Ces molécules fonctionnent comme
stabilisateurs, protecteurs et potentialisateurs vis-à-vis des facteurs de croissance cités cidessus.
VI.
Les RGTA. Analogues de synthèse des héparanes sulfates
VI.1. Structure des RGTA et analogie avec les HS
Les RGTA sont des biopolymères à squelette polysaccharidique. Ils sont obtenus par
modifications chimiques du dextrane afin de lui attribuer des propriétés structurales et
fonctionnelles comparables à celles des HS. Ces molécules ont une structure globalement
homogène et statistiquement définie. Elles contiennent tout au long de leurs chaînes des
groupements O-sulfate, carboxylate et alcool, ce qui, en plus de leurs squelettes
polysaccharidiques, les rend structurellement très rapprochées des HS naturels (Figure 43) ci
dessous.
séquence spécifique d'HS
séquence répétitive d'HSM
Motif glycosidique richement sulfaté
Motif glycosidique moyennement sulfaté
Motif glycosidique peut sulfaté
Figure 43 : Représentation simplifiée des analogies de séquences entre les HS naturels et les
HS mimétique de synthèse
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En effet, les HS naturels sont constitués d’une répétition de motifs disaccharidiques. Chaque
motif est composé d’une β-D-glucosamine et d’un acide β-D-glucuronique ou α-Liduronique. La liaison entre l’hexosamine et l’acide uronique est uniformément de type 1-4.
Pour les autres espèces de GAG, cette liaison est alterné avec celle de type 1-3. Les HS
naturels possèdent une quantité et une répartition très variée de leurs groupements sulfates ce
qui fait d’eux une sous famille de molécules très hétérogène, à l’inverse des autres GAG et du
RGTA. Effectivement, les degrés de substitution en groupements sulfate et carboxylate des
différents RGTA sont très spécifiques et ces groupements sont distribués de une façon
statistiquement homogène. La figure 44B montre une représentation des trois unités
glucosidiques possibles présents dans une chaîne de RGTA en fonction de la nature des
groupements présents en position C2. Pour une facilité de compréhension, ces unités ont été
disposées de manière arbitraire. Les proportions respectives indiquées en pourcentage (%) de
chaque unité dans le polymère est fonction du degré de substitution de chaque groupement. R
représente la proportion de chaque groupement dans l’ensemble des positions C3 et C4.
Le present travail à été réalisé avec un RGTA nommé RGTA D120. La figure 44B représente
la structure du pentasaccharide statistiquement le plus représenté au long de la chaîne
polysaccharidique de la molécule RGTA D120 (Papy-Garcia et al, publication en cours) et
celle correspondant au pentasaccharide d’héparine connue comme ayant des affinités avec
l’ATIII responsable de son activité anticoagulante. Il est intéressant d’indiquer que malgré
leur ressemblance, le RGTA D120 possède une activité anticoagulante 10 fois inférieure à
celle de l’héparine.
VI.2. Fonctions des RGTA
In vitro, il a été démontré que les RGTA possèdent des analogies de fonctions avec le HS visà-vis de facteurs de croissance présentant une affinité pour l’héparine ou HBGF. Ces
polysaccharides modulent la biodisponibilité et l’activité des facteurs de croissance présents
dans l’organisme. Ils stabilisent et protègent entre autres le TGFβ1 et le FGF2, contre des
dégradations enzymatiques, pHmétriques et thermiques (Tardieu et al. 1989; Tardieu et al.
1992) et potentialisent leurs effets biologiques. Les RGTA possèdent des propriétés antiinflammatoires. Ils inhibent l’élastase leucocytaire, la plasmine mais également la trypsine
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(Meddahi et al. 1995; Meddahi et al. 1996 ; Ledoux et al. 2000) et l’héparinase. L’inhibition
observée en ce qui concerne la plasmine notamment est d’autant plus importante que le
polymère présente un taux de substitution de groupements élevé.
Dans des études menéesin vitro sur des muscles en régénération ont montré que les RGTA
améliore la réparation tissulaire par anticipation du phénomène. Dans des muscle en
régénération, en présence de RGTA, l'
expression des ARNm de MyoD et de la myogénine est
plus précose (Husmann et al. 1996).
L'
effet des RGTA n'
est pas seulement limité aux facteurs de croissance. Comme il agit tôt
dans la régénération, le RGTA pourrait agir sur la réaction inflammatoire en inhibant l'
action
des TGFβ, qui amplifie la réaction inflammatoire et favorise le dépôt de constituant matriciels
sur le site de lésion. Ainsi le phénomène de fibrose pourrait être également atténué par l'
action
des RGTA sur le TGFβ. C'
est d'
ailleurs ce qui a été observé dans d'
autres modèles réalisés au
laboratoire. Dans le cas de fibroses intestinales radio induites, les RGTA possèdent une action
antifibrotique en régulant l'
expression phénotypique des collagènes et la production de TGFβ
(Alexakis et al. 2001).
VII.
Dystrophie musculaire et thérapie existante
Les résultats obtenuent suite à l’utilisation de RGTA dans les différents modèles constituent
une première approche pour de nouvelles thérapies. Ils permettent de croire que des molécules
au pouvoir régénératif et non immunogène pourront avoir des actions protectrices vis-à-vis
des facteurs myogéniques. Ceci pourrait permettre de potentialiser la régénération ou la
réparation musculaire via ces interactions avec les facteurs de croissance. C’est l’une des
préoccupations qui a guidé notre étude sur les effets du RGTA (ReGeneRaTing Agent) sur la
myogenèse. Cette stratégie pourrait être appliqué dans le cas de maladies neuromusculaires
impliquant une altération des constituants de la matrice extracellulaire. Dans la suite de ce
chapitre nous ne détaillerons que le cas des dystrophies musculaires, tout en sachant qu’il
existe bien d’autre pathologies musculaires (Syndrome de Walker-Werburg (WWS), la
dystrophie musculaire de type congénital de Fukuyama (FCMD), ou la maladie muscle-oeilcerveau (MEB), ainsi qu’une stratégie thérapeutique, la transplantation de myoblaste.
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VII.1. Cas particulier des dystrophies musculaires
Les dystrophies musculaires sont des maladies qui atteignent les muscles squelettiques.
Quelques myopathies héréditaires, liées au chromosome X, sont dues à des défauts dans le
complexe dystrophine-glycoprotéines (Worton 1995).
La dystrophine, exprimée dans tous les types de muscles, est située sous le sarcolemme des
fibres musculaires (Fabrizzio et al., 1994). Elle fait partie d’un complexe appelé dystrophine –
glycoprotéines qui lie le cytosquelette (F-actine) à la matrice extracellulaire (laminine)
(Ervasti and Campbell 1993). La partie glycoprotéique est constituée d’α- et β-dystroglycanes
(ces dystroglycanes proviennent du même gène et diffèrent par suite de modifications posttraductionnelles, Ibraghimov-Beskrovnaya et al. 1993), auqels sont associés un complaxe
formé de sarcoglycanes (α, β, γ et δ-sarcoglycanes) transmembranaires (Noguchi et al. 1995)
(Figure 45).
De nombreux types de dystrophies musculaires sont liés à un défaut dans l’une de ces
protéines. Une forme modérée (maladie de Becker) est causée par une dystrophine modifiée
ou tronquée. Le cas le plus connu est celui de l’absence de dystrophine (maladie de Duchenne
ou DMD), ce qui interrompt la liaison entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire. Des
modèles animaux couramment utilisés existent pour l’étude de cette dystrophie : la souris mdx
et le chien xmd.
Compte tenu de la gravité des maladies liées à son altération, il semble que le complexe
dystrophine-glycoprotéines joue un rôle essentiel dans le fonctionnement normal du muscle.
VII.2. Thérapie myoblastique : la transplantation myoblastique
Il existe très peu de stratégie efficace permettant d’intervenir dans le cas des myopathies.
Depuis quelque temps, des espoirs semblent être permis en ce qui concernent l’utilisation de
cellules souches. Ces cellules d’origine diverses (hématopoïétique, musculaire, neuronales,
etc...) semblent avoir la capacité de proliférer et de se différencier en cellules spécialisées
lorsqu’elle sont recrutés par un tissu endomagé. Ceci est le cas de la régénération musculaire.
Dans le cas de myopathie, il est donc interressant de savoir si l’apport de cellules souches ou
de cellules spécialisées (cas des cellules satellites) saine peuvent permettre une régénération
durable.
Page -97-
La transplantation de myoblastes consiste à injecter des cellules satellites saines, dans un tissu
dystrophique par exemple afin de permettre, après fusion des cellules, la formation de fibres
exprimant la dystrophine.
A partir d’expériences réalisées chez des souris mdx transplantées avec des myoblastes
normaux, certains auteurs rapportent des scores de 90% de fibres exprimant la dystrophine
dans les muscles ayant reçu des cellules satellites saines (Vilquin et al. 1995). Chez ces
souris, il a été observé, 1 mois après l’injection, que les fibres musculaires altérées suite à un
effort brusque étaient uniquement les fibres dystrophines négatives, les fibres dystrophine–
positives étant complètement épargnées (Brussee et al. 1998).
Les premières expériences encourageantes menées chez la souris ont abouti à la mise en place
de banc d’essai cliniques chez des patients atteint de la DMD (Gussoni et al. 1992 ; Huard et
al. 1992 ; Miller et al. 1997). Le meilleur résultat observé est l’obtention de 10% de fibres
dystrophine positives dans un muscle transplanté (Mendell et al. 1995). Lors d’un essai
clinique les tests fonctionnels n’ont montré, dans le meilleur des cas, qu’une élévation
transitoire de la force musculaire chez seulement quelques patients (Huard et al. 1992).
Un des inconvénients majeurs de cette technique est le problème du rejet cellulaire qui semble
néanmoins pouvoir être surmonté compte tenu de découvertes récentes en immunothérapie et
dans le domaine des cultures cellulaires (Skuk and Tremblay 2000). Le traitement de souris
mdx avec le FK506 permet d’obtenir jusqu’à 95% de fibres dystrophine positives un mois
après la transplantation de myoblastes normaux (Kinoshita et al. 1994). Le FK506 permet
également de contrôler la réponse immunitaire chez le singe après transplantation de
myoblastes (Skuk et al. 1999). L’immunosuppression n’est toutefois pas la meilleure solution
car les immunosuppresseurs utilisés ont une toxicité importante.
Des stratégies ne nécessitant pas l’emploi d’immunosuppresseurs ont également été
développées. Ainsi, des auto-transplantations de myoblastes génétiquement corrigés ex vivo
par transfection avec un adénovirus contenant le mini-gène ou le gène entier codant pour la
dystrophine humaine ont été réalisées (Floyd et al. 1998 ; Moisset et al. 1998). Mais cette
technique peut aussi entraîner des réactions immunologiques contre le vecteur viral (Vilquin
et al. 1995) ou contre la dystrophine elle-même (Braun et al. 2000 ; Ferrer et al. 2000).
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D’une manière générale, les myoblastes transplantés ont un faible taux de survie (environ
10%) et, à l’inverse de ce qui se passe in vitro, ils sont difficilement capables de fusionner
pour produire de la dystrophine (Gussoni et al. 1997). Les myoblastes injectés se caractérisent
également par une faible capacité de migration ce qui nécessiterait des centaines voire des
milliers d’injections pour les muscles les plus importants pour pallier cette insuffisance.
Dès lors, d’autres types cellulaires ont été testés pour surmonter la faible capacité proliférative
des myoblastes DMD. Les fibroblastes peuvent être transformés en myoblastes par
introduction du gène myoD1 qui est important dans la régulation myogénique comme nous
l’avons vu auparavant. Des fibres musculaires hybrides sont capables de se former après
injection intramusculaire (Huard et al. 1998). Les précurseurs myogéniques issus de la moelle
osseuse peuvent également participer à la régénération musculaire et constituent donc un outil
potentiel pour le traitement des myopathies (Ferrari et al. 1998 ; El Fahime et al. 2000).
Page -99-
MATERIELS ET METHODES
Page -100-
Toutes les manipulations nécessitant des animaux ont été effectuées sur des rats mâles Wistar
âgés de 2 mois et demi environ. Les conditions d’élevage, d’anesthésie et de mise à mort des
animaux ont été réalisées selon les règles imposées par la Communauté européenne.
I.
Culture de cellulaire
I.1. Culture primaire de cellules satellites
La mise en culture des cellules satellites de rat adulte est faite selon une méthode dérivée de
celle de Bischoff (1974) utilisant la pronase (Alterio et al. 1990 ; Lagord et al., 1993).
I.1.1. Prélèvements des muscles
Le rat est sacrifié par injection de pentobarbital (Sanofi Synthélabo) à une dose mortelle de
0,5ml/ 100g (poids de l’animal) puis lavé au savon bactéricide et badigeonné d’alcool 70°. Il
est maintenu face dorsale vers le haut. La dissection est faite sous hotte à flux laminaire
vertical. La peau, puis les muscles peaussiers sont incisés depuis le talon jusqu’à la cuisse,
pour mettre à nu les muscles de la jambe. Les instruments de dissection sont changés après
l’ouverture du plan cutané.
Les muscles sont prélevés, en règle générale dans l’ordre suivant : Soleus (SOL), Extensor
Digitorum Longus (EDL), ensemble gastrocnémien, plantaire, tibial. Ils sont déposés au fur et
à mesure de leur prélèvement dans du PBS- 1X. Pour certaines manipulations exigeant un
nombre de cellules élevé, en particulier pour les dosages de FGF sur des cultures jeunes,
l’ensemble des muscles de la cuisse a été prélevé en plus.
I.1.2. Dissociation mécanique
Les muscles maintenus dans le PBS- 1X sont débarrassés sous la loupe de leurs tendons,
vaisseaux et amas graisseux. Ils sont ensuite hachés à sec à l’aide de ciseaux.
Le hachis est rincé pendant 10 minutes au PBS- 1X, sous agitation à température ambiante.
L’ensemble est ensuite centrifugé 3 minutes à 90g pour décanter les morceaux. Ce rinçage est
Page -101-
répété deux fois, l’obtention d’un surnageant clair est le signe de l’élimination de la plupart
des hématies.
I.1.3. Dissociation enzymatique
Une solution de pronase (protéase type XXV = pronase E, de Streptomyces griseus, SigmaAldrich) à 0,15% dans du HAMF’S F12-Hepes est filtrée (filtre 0,2 µm Sterivex) et complétée
par des antibiotiques (0,4 % v/v) et 10% sérum de veau fœtal (Gibco-BRL). Les morceaux de
muscle sont mis à incuber dans cette solution, à environ 40 ml pour 10 cm3 de muscles, dans
une étuve à 37°C pendant 2 heures. Toutes les 30 minutes environ, les morceaux sont agités et
dissociés progressivement par 10 allers et retours avec une pipette de 10 ml.
I.1.4. Récupération des cellules et mise en culture
Quand la dissociation est suffisante, les débris résiduels sont décantés par une centrifugation
légère (3 min à 90g). Le surnageant est récupéré, puis dilué de moitié avec du milieu DMEM.
Une centrifugation (20 minutes à 350g) permet de sédimenter les cellules. Deux lavages dans
du DMEM du culot cellulaire sont réalisés par centrifugation à 350g durant 20 minutes. La
suspension cellulaire obtenue est ensuite repris dans un faible volume de milieu de culture
(composition, voir annexes). Les cellules sont comptées à l’hématimètre de Malassez puis
ensemencées sur des supports gélatinés (solution de gélatine à 0,5% dans de l’eau, stérilisée à
l’autoclave ; boites de Petri (Nunc, Falcon), flacon (Falcon), lamelle de verre à une densité
d’environ 2000 cellules/cm2.
Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37°C en atmosphère de CO2 à 5% saturée
en eau.
I.2. Culture de la lignée établie C2.7
Les cellules C2.7 sont des cellules issues de la transformation de lignées de cellules
myoblastiques de souris mises au point par Pinset et Montarras en 1988.
Page -102-
I.3. Mesures de croissance cellulaire
I.3.1. Détermination des conditions optimales de mise en culture des C2.7
Les cellules C2.7 sont décongelées. Elles sont mises en culture dans du DMEM complet et
placées dans un incubateur à 37°C, 12% CO2 et 95% d’humidité relative.
Bien avant la confluence, les cellules sont trypsinisées puis ensemencés en plaque de 24 puits
à fond plat à différentes densités dans un volume final de 1ml. Différentes densités
d’ensemencement permettrent de déterminer les cinétiques de croissance et surtout le moment
de sous-confluence.
Le repiquage des cellules C2.7 pour l’étude des différents métabolismes doit toujours se faire
en période de sous-confluence. Effectivement, ces cellules myoblastiques ont la capacité de se
différencier spontanément en myotubes au bout de quelques jours (6 à 7 jours) en milieu
complet.
I.3.2. Comptage cellulaire par « Coulter-counter »
Les cinétiques de croissance des cellules satellites et des cellules myoblastiques C2.7 sont
effectuées en dénombrant les cellules à l’aide d’un compteur automatique de particules
(Coulter counter ZM, Coultronics), préalablement étalonné à l’aide d’une cellule de Malassez,
au diamètre moyen des cellules satellites et des C2.7. Chaque dénombrement correspond à la
moyenne des mesures réalisées sur 3 puits. Les cellules sont décollées de la surface du puits
par 500 µl d’une solution de trypsine 1%/EDTA.
Les cinétiques de croissance sont établies en absence ou en présence des effecteurs (héparine,
RGTA) à différentes concentrations allant de 0,1 à 25µg/ml.
La croissance nette représente la différence entre le nombre de cellules dénombrées et le
nombre de cellules initialement ensemencées. Les conditions témoins correspondent aux
cultures réalisées en absence d’effecteurs.
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I.3.3. Evaluation de la prolifération par incorporation de thymidine
L’incorporation de thymidine tritiée au cours de la phase S du cycle cellulaire par des cellules
en phase proliférative sert à mesurer leur activité de réplication de l’ADN (Plouët et al.,
1984). Le taux d’incorporation est proportionnel au taux de réplication. Les cellules en
prolifération ont préalablement été mises en culture dans un milieu dépourvu de sérum mais
contenant 1% de BSA pendant 24h. Ensuite, du sérum, des RGTA et des facteurs de
croissance sont ajoutés.
Après une incubation des cellules pendant 2h à 37°C avec 1µCi (activité spécifique
50Ci/mmol) par puits de thymidine tritiée (ICN), le milieu radioactif est éliminé et les
couches cellulaires sont lavées trois fois au PBS. Les cellules sont fixées avec 0,5 ml de TCA
10% par puits pendant 20 minutes à 4°C. Après plusieurs rinçages à l’eau bi-distillée, les
cellules sont lysées avec 250µl de NaOH 0,3 M par puits et incubées soit pendant une heure à
37°C, soit la nuit à température ambiante.
Pour le comptage de la radioactivité, 500µl de liquide scintillant sont ajoutés par puits. Les
puits sont isolés l’un de l’autre en mettant un adaptateur dans chaque puits. Les plaques sont
fermées avec un film autocollant avant d’être mises sur les portoirs pour le comptage dans un
compteur µbeta (Wallac). Le comptage s’effectue pendant une minute par puits.
I.3.4. Dosage de l’ADN par la méthode du DAPI
Le dosage de l’ADN par la technique du DAPI se base sur la capacité d’incorporation de la
molécule fluorescente entre les bases A et T de l’ADN.
Les couches cellulaires sont rincées trois fois par du PBS 1X puis grattées dans 1ml de
tampon d’extraction.
La solution de DAPI est utilisée à une concentration finale de 150µg/ml. Les échantillons sont
ensuite traités à la protéinase K (Merck) à une concentration de 50 µg/ml en tampon K2HPO4
pH 6,8 pendant 24 h à 56°C. La réaction enzymatique est ensuite arrêtée par chauffage à 90°C
pendant 10 minutes.
Le dosage est réalisé sur plaque à partir de 50µl de surnageant auquel on ajoute 100µl de la
solution finale de DAPI. La réaction se fait à l’obscurité pendant 30 minutes. La lecture est
réalisée sur un Fluorescane (Labsystems, IEMS).
Page -104-
La quantité d’ADN des échantillons préalablement traités à la protéinase K se mesure par
rapport à une gamme étalon réalisée soit à l’aide d’ADN de sperme de saumon (Boehringer),
soit à l’aide de l’ADN de foie de rat (extraction au laboratoire).
I.3.5. Viabilité des cellules
La viabilité des cellules satellites et des C2.7 en cours de prolifération en présence ou en
absence d’effecteurs (héparine, RGTA) est réalisée par le test au bleu Trypan (SigmaAldrich). Les cellules vivantes excluant le bleu trypan, toutes les cellules bleues sont
comptées comme des cellules mortes à l’inverse des cellules blanches et réfringentes.
I.4. Traitement par les RGTA
I.4.1. Effet sur la prolifération cellulaire
Les cellules myoblastiques (cellules satellites et cellules C2.7) ont été traitées avec différentes
concentrations de RGTA allant de 0,1 µg/ml à 25 µg/ml. Un dénombrement cellulaire sur
plusieurs temps de croissance (J1 à J8 pour les C2.7 et de J1 à J15 pour les cellules satellites)
ainsi qu’un test de viabilité cellulaire ont été réalisés pour chaque concentration testée de
RGTA. Les meilleurs résultats ont été obtenus pour une concentration de 0.5 µg/ml de RGTA.
Nous avons donc choisi d’utiliser cette concentration durant toute notre étude.
I.4.2. Conditions de traitement au RGTA durant la prolifération et la
différenciation
Les effets quantitatifs et /ou qualitatifs des RGTA et de l’héparine sur la synthèse des GAG
ont été étudiés au cours de la prolifération et de la différenciation des cellules C2.7 et des
cellules satellites. Pour l’étude de l’effet sur la prolifération, l’héparine ou le RGTA est ajouté
1heure après la mise en culture des cellules (J0) dans du milieu de croissance. La dose,
administrée en une seule fois, est de 0,5µg/ml pour le RGTA et de 10 µg/ml pour l’héparine.
Ce dosage à été établi comme étant, dans une gamme de concentration testée allant de 0,1
µg/ml à 25 µg/ml, celui qui entraîne les effets optimum pour chacun des 2 types cellulaires.
Page -105-
Chaque série comporte 5 boites de Pétri de 60 cm de diamètre afin d’effectuer le dosage des
GAG, l’évaluation de la quantité d’ADN, le dosage des aryl sulfatases, l’étude des PG et de
procéder à une RT-PCR des enzymes de la biosynthèse des GAG. Une expérience comporte
au moins 6 séries expérimentales. L’étude des GAG au cours de la prolifération se fait à partir
de la couche cellulaire et dans des milieux de culture, ceci pendant 5 jours (J2, J3, J4, J5 et
J6), sans changement des milieux.
L’étude de l’expression des GAG au cours de la différenciation se fait dans des conditions de
milieux de différenciation appauvris en sérum (cf. annexes) auxquels sont ajoutés les
effecteurs. Les cellules sont mises dans ce milieu de différenciation 4 jours après leurs mises
en culture et les couches cellulaires ainsi que, les milieux de culture correspondantssont
étudiés après 24, 38 et 48 heures.
I.5. Evaluation de la différenciation par le dosage des créatinine kinases
L’état de différenciation des cellules C27 en présence d’effecteur est évalué par le dosage des
différentes isoformes de créatinine kinase (MM, MB, BB)) au niveau de la couche cellulaire
par rapport à des témoins non traités (Lagord et al., 1993). L’apparition de l’isoforme MM
montre l’état de différenciation des cellules.
L’extraction des CPK cellulaires se fait dans un tampon d’extraction TrisHCl 50 mM
contenant du PMSF 2mM, du ß-mercaptoéthanol 5 mM, pH 7,5.
La détection des CPK est réalisée par un Kit de détection Biotrol. L’évaluation par l’étude des
différentes isoformes de la différenciation non induite expérimentalement se fait à partir de
cultures de cellules satellites et de cellules C2.7 à 5 et 4 jours de culture, respectivement, en
milieu de croissance complet. Ces cultures ont lieu en présence ou en absence d’effecteurs
(RGTA 0,5µg/ml, héparine 10 µg/ml).
L’activité totale des CPK sur les extraits est déterminée par la microméthode Biotrol. La
séparation des différentes isoformes se fait à partir d’1 µl d’échantillon contenant une même
activité totale CPK, par migration électrophorétique sur gel d’agarose à 1%. Une fois
séparées, les bandes correspondant aux différentes isoformes sont révélées par l’exposition du
gel sous lampe UV (365nm). Une photo est réalisée puis scannée. La quantification des
Page -106-
différentes isoformes est réalisée à partir d’un programme spécifique (GeneTools) de
l’analyseur Syngéne.
I.5.1. Devenir des RGTA après administration aux cellules en culture
Le comportement des RGTA en présence de cellules en culture (cellules satellites en culture
primaire) a été analysé grâce à l’utilisation de RGTA marqué à la fluoresceine (0,013 M
FITC/molécule de glucose) déposé dans le milieu de culture (molécule offerte par la société
OTRIII). Le marquage de la molécule n’entraîne pas de perte de son activité biologique.
Le protocole appliqué est le suivant : les cellules vivantes sont incubées en présence de
10µg/ml de RGTA-FITC pendant différents temps (1, 6 et 24h) dans du PBS1x. Dans certains
cas, entre 6h et 24h, une chasse est réalisée avec du RGTA non marqué 1000 fois plus
concentré. La même expérience est réalisée en présence de dextran-FITC et de FITC seul. Des
observations en microscope confocale (Biorad 1024 MRC) ont été réalisées soit sur des
cellules vivantes (pendant la première heure de traitement), soit après rinçage, sur des cellules
fixées au paraformaldéhyde 4%, en tampon phosphate 0,1M, sur lesquelles les noyaux sont
colorés au Topro4 (Molecular Probes).
L’observation et l’analyse sont réalisés par microscopie confocal.
II.
Etude des glycosaminoglycannes au cours de la myogenèse in
vitro et in vivo
II.1.Méthode d’extraction
II.1.1. Extraction des PG
Les cellules à différents stades de prolifération ou de différenciation sont rincées 3 fois par du
PBS- 1X, puis récupérées à l’aide d’un grattoir dans un volume final de 500 µl de tampon de
lyse (Tris HCl 50 mM contenant 150 mM NaCl, 1 % Triton® X-100 pH 8,0, et des inhibiteurs
de protéases (Aprotinin (1-2 µg/ml), Leupeptin (1-2 µg/ ml), Pepstatin A (1 µg/ml), PMSF
Page -107-
(100 µg/ml) et/ou EDTA (1 mM)). Après avoir été conservés à 4°C pendant 10 minutes, les
extraits cellulaires sont centrifugés et les surnageants contenant les PG sont conservés à -20°C
jusqu’à l’analyse, les culots contenant tous les débris cellulaires étant éliminés.
II.1.2. Extraction des glycosaminoglycannes
Les cellules sont rincées en place au PBS- 1X (2 fois) puis récupérées par grattage dans du
tampon K2HPO4 pH 6,8. Les extractions se font aux différents temps déterminés
préalablement pour l’étude de la prolifération et de la différenciation. Les muscles congelés
sont mis dans 1 ml de tampon K2HPO4 pH 6,8.
Les couches cellulaires, les milieux de culture et les muscles sont digérés par la protéinase K,
24 heures à 56°C. La protéinase K est ensuite inactivée par chauffage à 90°C pendant 10
minutes.
Le dosage des GAG totaux, des HS et des CS s’éffectuent sur des échantillons cellulaires,
musculaires et le milieu de culture, préalablement filtrés sur des tubes Eppendorfs filtrant
Amicon (Millipore).
II.2.Méthodes de dosage des glycosaminoglycannes
II.2.1. Dosage des glycosaminoglycannes par complexation au Bleu de1,9diméthylméthyléne
La même méthode est appliquée quel que soit le type d’extraits biologiques utilisés.
Le principe du dosage par le bleu de 1,9-diméthylméthyléne (DMMB) est basé sur la capacité
d’interaction spécifique du DMMB avec les sulfates présents au niveau des chaînes de GAG
(Farndal et al., 1982).
La mise au point du dosage des GAG par le DMMB est détaillée dans l’article 2 « Improved
and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts
and its use in skin and muscle tissue studies », (Glycobiology, 2003) (cf résultats p 125).
Page -108-
II.2.2. Détermination des rapports héparanes sulfates/chondroïtine sulfates
Le dosage du rapport HS/CS est basé sur les travaux de Bosworth et Scott (1994). Le dosage
se fait par traitement des extraits à l’acide nitreux. Effectivement, l’acide nitreux coupe de
façon spécifique les liaisons N-sulfates des HS. Le dosage est réalisé sur 100µl d’extrait
préalablement traité à la proteinase K à 50µg/ml. La réaction se fait par addition de 100 µl de
nitrate de sodium (5%) et de 100 µl d’acide acétique (33%). Les échantillons sont
vigoureusement agités au Vortex et la réaction se fait à température ambiante pendant 1 heure.
La réaction est ensuite arrêtée par addition de 100 µl de sulfamate d’ammonium (12.5 %). Le
dosage des GAG O-sulfatés (CS et DS) est réalisé par le DMMB selon la méthode décrite
dans l’article 2.
II.2.3. Dosage des glycosaminoglycannes totaux par HPLC
II.2.3.1. Conditions de marquage à l’acide anthranilique
L’acide anthranilique (Fluka) a la spécificité de se fixer sur les fonctions réductrices libres
présentes à l’extrémité de chaque chaîne de GAG. Par définition, une unité arbitraire de
fluorescence (UAF) correspond à une chaîne de GAG.
Les échantillons cellulaires sont préalablement traités à la protéinase K puis filtrés. La
solution de marquage est composée d’un excès d’acide anthranilique (1M) dilué dans de
l’éthanol absolu, et du réducteur de cet acide, le cyanoborohydrate de sodium (NaCNBH4 à
1M) dilué dans du tampon K2HPO4 pH 6,8. La préparation des deux composants de la
solution de marquage se fait séparément. La solution finale se prépare extemporanément par
mélange des deux solutions contenant respectivement l’acide anthranilique et son réducteur.
La réaction est réalisée sous agitation à 37°C pendant 24 heures. Le marquage est réalisé sur
50 µl d’échantillon auquel on ajoute 200 µl de solution de marquage. La réaction est ensuite
stoppée par addition de 250 µl d’eau bi-distillée.
Page -109-
II.2.3.2. Conditions de détection
La détection se fait par HPLC sur colonne de gel filtration TSK 3000 PWL permettant la
séparation des différents GAG en fonction de leur taille. Le tampon d’élution est du NaCl 1M
(débit 1ml/min). La détection en sortie de l’HPLC se fait par spectophotomètrie UV. Les
varations de fluorescence sont analysées par le logiciel RadioStar.
II.3.Etude des enzymes du métabolisme des héparanes sulfates
L’étude des enzymes du métabolisme des GAG est réalisé par RT-PCR.
II.3.1. Extraction des ARNm totaux des cellules myogéniques
Les cellules sont lysées dans 500µl de tampon RNA Insta-Pure (Eurogentec) contenant du
phénol. Les échantillons sont ensuite incubés pendant 15 minutes à 4°C avec 200 µl de
chloroforme. Après centrifugation à 12 000g, la phase aqueuse est récupérée et les ARN sont
précipités avec 1 volume d’isopropanol. Les culots d’ARN sont lavés par de l’éthanol à 70°
puis solubilisés dans 25 µl d’eau. La concentration d’ARN est ensuite dosée par
spectrophotométrie à 260 et 280 nm afin de voir s’il existe une contamination par des
protéines.
II.3.2. Electrophorèse des ARNm totaux
Une électrophorèse des ARN sur gel d’agarose à 2% est réalisée avant de débuter la RT-PCR.
Ceci permet de savoir si les ARN extraits ne sont pas dégradés.
II.3.3. Protocole de RT-PCR
Le protocole, les produits et la technique de RT-PCR proviennent d’une collaboration avec le
laboratoire du Dr. J. Turnbull de l’Université de Birmingham.
La RT-PCR a été réalisée sur des transcrits extraits de cellules C2.7 en prolifération et en
différenciation codant pour les enzymes de la synthèse des héparanes sulfates (NDST1 et 2,
Page -110-
6OST1,2 et 3) (protocole et tampon, cf annexe). Une étude uniquement qualitative de ces
enzymes a été réalisée. Les témoins négatifs de RT-PCR ont été réalisés dans les mêmes
conditions en absence d’hybrides ARN /ADN.
Les primers utilisés sont référencés dans le tableau 6 ci-dessous :
Primer
Gene
Species
Accession
Forward/
Sequence (5’-3’)
5’ Position
Tm
Anneal
attaaggagacggaaacaaggag
595
62.1
55
Reverse
2OSTfp1
HS2OST
Mouse
AF060178
Forward
2OSTrp1
HS2OST
Mouse
AF060178
Reverse
gaagggtggtgacacagtcaag
1164
58.9
55
HS6OST1fp1
HS6OST1
Mouse
AB024566
Forward
accagcaactctttctatccc
2186
57.9
55
HS6OST1rp1
HS6OST1
Mouse
AB024566
Reverse
agcaatacccaccagcatc
2720
56.7
55
HS6OST2fp1
HS6OST2
Mouse
AB024565
Forward
tccttcagacccatttcc
1257
53.7
55
HS6OST2rp1
HS6OST2
Mouse
AB024565
Reverse
cccacacacagcataacac
1702
56.7
55
HS6OST3fp1
HS6OST3
Mouse
AB024567
Forward
tgaatgagagcgagcggaac
1093
59.4
55
HS6OST3rp1
HS6OST3
Mouse
AB024567
Reverse
tggattggaaatgaaggcagag
1679
58.4
55
NDST1RTfp
NDST1
Mouse
AF074926
Forward
cttgagccctcggcagatgc
63.5
58
NDST1RTrp
NDST1
Mouse
AF074926
Reverse
ctacctcactgggccgtgtc
63.5
58
NDST2RTfp
NDST2
Mouse
AF074925
Forward
aggaacccttgcctctgccc
63.5
58
NDST2RTrp
NDST2
Mouse
AF074925
Reverse
cggctagggcgggtgagatg
65.5
58
58
NDST3RTfp
NDST3
Mouse
AF221095
Forward
gaaagtgaagtctctgggcgg
61.8
NDST3RTrp
NDST3
Mouse
AF221095
Reverse
gcttggatgatttggtcacacg
60.3
58
NDST4RTfp
NDST4
Mouse
AB036838
Forward
aacaggaaatgacacttattgaaa
58.5
58
NDST4RTrp
NDST4
Mouse
AB036838
Reverse
actttggggcctttggtaatatg
58.9
58
II.4.Dosage de l’activité aryl sulfatase A et B
La détermination des activités aryl sulfatases A et B (N-Acetylgalactosamine 4-Sulfatase) a
été effectuée à partir de la technique décrite par Baum en 1959. Après élimination du milieu
de culture, le tapis cellulaire est rincé 3 fois dans du PBS1x puis gratté à 4°C dans 1 ml de
tampon d’extraction composé d’acétate de sodium (250 mM pH 6.0). La réaction complète de
lyse et d’extraction se fait pendant 1 h dans la glace. Le lysat cellulaire est ensuite centrifugé
10 minutes à 10000 g à 4°C. Le surnageant (500 µl) est ensuite dialysés en boudins de dialyse
(6000-8000 dalton) 18 heures à 4°C contre un 2 litres de tampon sodium acétate 50 mM
contenant 1mM d’acétate de baryum à pH 6. Les protéines sont dosées selon la méthode
décrite auparavant. Le dosage de l’aryl sulfatase A sur des échantillons contenant 50 µg est
réalisé dans un tampon (A) composé de 10 mM de sodium pyrophosphate, 1.7 M de NaCl, 0.5
M d’acétate de sodium, pH 5.0. Le NaCl à 1,7 M et le sodium pyrophosphate ont la propriété
d’inhiber l’activité aryl sulfatase B. L’activité aryl sulfatase B est déterminé dans un tampon
(B) composé de 0.5 M d’acétate de sodium, 10 mM acétate de barium, pH 6.0. L’acétate de
Page -111-
barium inhibe partiellement l’activité aryl sulfatase B. Le substrat utilisé pour la mesure des
activités sulfatases A et B est dans les deux cas le nitrocatéchol sulfate (10 mM, Sigma). La
réaction est stoppée par un ajout de NaOH 1M. Cette réaction libère du nitrocatéchole qui est
alors déterminé par lecture spectrophotomètrique à 540 nm à des temps de réaction différents,
60 minutes pour l’aryl sulfatase A dans les condition de tampon A et 30 minutes et 90
minutes pour l’aryl sulfatase B dans les condition de tampon B.
Une gamme étalon allant de 0,25 à 5 mmol à vérifier d’un standard de 4-catechol, permet de
quantifier l’activité de l’aryl sulfatase A, et une gamme allant de 12.5 and 125 nmol est utilisé
pour la quantification de l’activité aryl sulfatase B.
II.5.Immunolocalisation des héparanes sulfates
L’immunolocalisation des héparanes sulfates est réalisée sur des coupes de muscles en
régénération (6-7µm) réalisées au cryostat ainsi que sur des cellules satellites et des cellules
C2.7 cultivées sur lamelle de verre à différents stades de prolifération et de différenciation
fixées à l’air.
Les cellules sont rincées dans du PBS1x, trois fois 10 minutes, puis saturées dans du PBS1x
contenat de la BSA à 0,1% pendant 20 minutes. Une première incubation en présence
d’anticorps anti HS couplé à c-myc (HS1, HS2 ou HS3) dilués au 1/5, est réalisée durant 90
min à température ambiante. Après trois lavages au PBS1x, le 2èmeanticorps, un anticorps
polyclonal anti c myc (ou A14) fabriqué chez le lapin (Tébu), dilué au 1/40 est déposé
pendant une heure à température ambiante. Le marquage est ensuite réalisé par l’anticorps
anti IgG de lapin obtenus chez la chèvre et conjugés à l’Alexa 488 dlué au 1/5, pendant 1
heure.
Les cellules sont ensuite rincées au PBS, puis sécher. La coloration des noyaux au Hoescht
peu se faire juste avant le montage des lamelles au Mowiol. L’observation est réalisée au
microscope à fluorescence (Olympus BH2) après montage au mouviol.
Les dilutions des différents anticorps sont réalisées dans un tampon PBS1X contenant de la
BSA à 6%.
Page -112-
II.6.Dosage des différents epitopes de HS par une technique dérivée d’ELISA
Des anticorps anti-héparanes sulfates (anti HS) appelés RB4CD12, AO4BO5 et AO4F12,
obtenus par la technique de « phage display » sont utilisés dans ce test (Jenniskens et al.
2000). Il s’agit de fragments variables simple chaîne (scFv) auxquels est fixé la protéine cmyc qui permettra leur détection. Ces anticorps reconnaissent des épitopes de HS différents.
Les GAG totaux des échantillons biologiques sont extrait selon la méthode décrite dans le §
II.1 du matériel et méthodes. La quantité totale des GAGs est déterminée selon la méthode
décrite dans le chapitre I des résultats (dosage de GAG par DMMB).La détection des
différents épitopes de HS présents dans les extraits est réalisée sur une quantité connue de
GAG totaux (1 à 10µg) extraits. Les GAG totaux son greffés sur de la BSA (1mg/ml) dans un
tampon phosphate (100 mM, pH 8) contenant un réducteur le cyanoborohydrate de sodium
(NaCNBH4) à 5 mg/ml. La réaction est réalisée à 37°C sous agitation modérée pendant 18
heures. Le produit de la réaction est ensuite dialysé dans des boudins de 6000-8000 Dalton
contre un tampon, Tris HCl à 50 nM contenant 12,5 nM d’EDTA, pH 7,4. Le complexe
GAG-BSA est ensuite immobilisé dans les puits d’une plaque EIA (98 puits) à une
concentration de 2,5 µg de protéine correspondant au complexe BSA-GAG/ml par puits
pendant une nuit à 4°C.
La détection quantitative et qualitative des différents épitopes de HS immobilisés sur la
plaque est réalisée par la technique ELISA. Cela consiste en une détection immunologique,
similaire à celle réalisée sur les cellules ou les coupes de muscles (cf. § immunodétection),
des différents épitopes de HS par des anticorps spécifiques. Après trois lavages des plaques au
PBS1x contenant de la BSA à 0,1% et du Tween à 0,5%, une incubation avec l’un des antiHS (1/10) est effectuée pendant 90 min à 37 °C. Après lavages, les plaques sont incubées avec
l’anticorps anti-c-myc (1/600) (9E10, Sigma) pendant 60 min à 37°C. Le complexe est révélé
un avec un anti IgG couplé à la peroxydase (1/50 000, Jackson). Tous les anticorps sont dilués
dans un tampon PBS1x-BSA1%. La détection des anticorps est réalisée par lecture de
l’absorbance à 450 mm après révélation à l’aide du Kit TBM (Pierce).
Page -113-
II.7.Etude de l’expression des PG par Western Blot
II.7.1. Dosage des protéines totales
Le dosage protéique des échantillons a été réalisé par une méthode dérivée de Lowry. Cette
technique contrairement au dosage protéique de type Bradford proposé par le système de
BCA permet de quantifier les protéines totales directement dans le tampon dénaturant
(Laemmli 1X : Tris 0,01M contenant 0,5 % de SDS, 1% de ßmercaptoéthanol, 20% de
Glycérol, 0,005% de Bleu de Bromophénol) ou dans le tampon d’extraction utilisé pour
l’immunoprécipitation des PG. La BSA utilisé pour l’établissement de la gamme étalon est
diluée dans les mêmes tampons que les échantillons.
II.7.2. Immunoprécipitation des protéoglycannes
Le même protocole (µMACS, Miltenyi Biotec) décrit ci dessous peut être appliqué pour tous
les types de PG. Dans notre étude, nous l’avons appliqué qu’a la détection et à la
quantification du syndécan I.
Les étapes de l’immunoprécipitation sont montrées dans la figure 46:
E
A
B
C
F
D
Figure 46: Protocole de purification des syndécans par immunoprécipitation (µMACS,
Miltenyi Biotec)
A : Lyse des cellules dans le tampon d’immunoprécipitation
B : Transfert du lysat dans un tube Eppendorf de 1,5 ml
C : Immunoréaction : extraits cellulaires + anticorps anti-syndecan (2µg) (Tebu) + protéine G
(50µl) (µMACS, Miltenyi Biotec)
Page -114-
D : Séparation magnétique
E : Elution des syndécans par du Laemmli 1X bouillant
F : Gel SDS-PAGE
II.7.3. Western Blot
Cette technique permet de détecter les protéines d’un mélange à la suite d’une électrophorèse
effectuée en gel de polyacrylamide (PAGE pour polyacrylamide gel electrophoresis) en
présence de dodécylsulfate de sodium (SDS). Les protéines séparées en fonction de leur
masse sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose et sont révélées à l’aide
d’anticorps.
Les western blots sont réalisés avec des protéines issue de lysats cellulaires préparés à partir
de différents stades de prolifération et de différenciation de cellules en culture.
II.7.3.1. Electrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (SDS-PAGE)
Des gels de migration d’acrylamide/bis-acrylamide à 8% et à 12% ont été réalisés pour
visualiser respectivement des protéines de grosse taille (protéoglycannes tel le Syndecan 1) et
des protéine de taille inférieure (Troponine T). Un gel de concentration à 3%
d’acrylamide/bis-acrylamide est déposé au dessus du gel de migration (cf annexe). Lors de
l’immunoprécipitation les échantillons se retrouvent directement dans le tampon de charge
Laemmli, ils sont ensuite bouillis à 100°C pendant 5 minutes puis déposés dans les puits du
gel. L’électrophorèse s’effectue sous une tension de 100 Volt dans le gel de concentration,
puis de 150 Volt dans le gel de migration et est poursuivie jusqu’à ce que le front de
migration coloré par le bleu de Bromophénol atteigne la base du gel.
II.7.3.2. Transfert sur membrane en nylon
Le transfert des extraits protéiques est réalisé sur une membrane de nylon ou PVDF
(immobilon-P Transfert Membranes, Millipore) dans un tampon de transfert TrisGlycine/méthanol (cf annexe). Le transfert est réalisé une nuit à 4°C et à 30 V.
Page -115-
II.7.3.3. Immunobloting
La membrane, après transfert, est rincée dans du PTL (solution de PBS1x contenant du
Tween 0,2% et du lait écrémé à 4%). Après la temps de saturation (1 à 2 heures) dans le
tampon PTL, la membrane est incubée avec les anticorps de détection : anti-syndecan I (Tebu)
fabriqué chez le lapin dilué au 1/100 et l’anticorps anti troponine (Sigma) fabriqué chez le
lapin dilué au 1/100, dans du tampon PTL, 1h à température ambiante, sous agitation.
Après lavages dans le tampon PTL, la membrane est incubée 30 minutes à 37°C avec un
deuxième anticorps couplé à la péroxydase (anti-IgG de lapin dilué au 1/50 000)(Jackson). La
membrane est ensuite rincée. La révélation s’effectue par chimiluminescence avec un kit ECL
(Enhanced Chimiluminescence, Amersham Pharmacia Biotech), technique basée sur la
catalyse de l’oxydation du luminol par la péroxydase. L’émission lumineuse à 428 nm du
produit d’oxydation est détectée par autoradiographie.
II.7.3.4. Deshybridation du Western-Blot
Afin de réutiliser un Western Blot pour une deuxième détection immunologique de protéines,
la membrane peut être deshybridée (jusqu’à trois fois). La membrane est lavée 25 minutes
dans du tampon de déshybridation (cf annexe) à 56°C sous agitation. Ensuite, la membrane
est lavée abondamment avec le PTL avant d’être réutilisée pour une nouvelle détection.
III. La régénération musculaire
La régénération musculaire est induite consécutivement à un traumatisme, où le muscle est
écrasé sur toute sa longueur (« crush total ») (Bassaglia et Gautron, 1995). Pour l’étude de
l’expression des GAG au cours de la régénération, les muscles EDL et Soléaire de rat ont été
choisis. Après écrassement, les muscles sont replacés dans leur position d’origine.
Page -116-
III.1. Modèle de l’écrasement total
III.1.1. L’écrasement du muscle
L’opération est effectué sur des rats adultes mâles (souche Wistar, âgés de 2 mois et demi
environ, et qui sont anesthésiés au pentobarbital (100 µl/100 g de poids corporel). Comme
pour l’extraction des cellules satellites, l’animal est lavé au savon antibactérien, désinfecté à
l’alcool et tondu sur les pattes postérieures. Il est mis face dorsale vers le haut sur le plan
opératoire préalablement désinfecté. Après avoir incisé la peau et dégagé le muscle à traiter de
son lit, le nerf afférent à ce dernier est coupé au ras du muscle et toutes les adhérences
environnantes sont détruites. Le muscle est ensuite écrasé sur toute sa longueur (de tendon à
tendon) à l’aide d’une pince de Péan fermée au deuxième cran. La pression de la pince est
maintenue pendant environ 5 secondes à chaque niveau d’écrassement.
III.1.2. Méthode d’injection
L’injection de 100µl de la solution à tester a lieu directement au centre du muscle (Figure 47),
dans son enveloppe, après écrasement. Une solution de RGTA D120 à une dilution de
100µg/ml en sérum physiologique est ainsi injectée. Des rats témoins dont les muscles sont
écrasés recoivent une injection de sérum physiologique, le volume de sérum physiologique
injecté est identique à celui de la solution de RGTA. Le muscle est ensuite remis dans son lit
et les muscles peaussiers sont suturés au fil résorbable.
Figure 47: A : Injection de la solution à tester au centre du muscle EDL (le protocole est
identique sous le muscle soléaire)
B : Prélèvement des EDL (haut : muscle contralatéral intact; bas : muscle écrasé )
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III.1.3. Le prélèvement
Après différents temps de régénération du muscle, soit 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 14, 21, 26 et 31
jours, les rats sont sacrifiés à l’aide de pentobarbital. Comme pour l’opération, le rat est
disposé face dorsale vers le haut et après avoir incisé la peau au niveau de la cicatrice, le
muscle opéré est dégagé de sa loge en éliminant tous les tissus conjonctifs périphériques et les
deux tendons sont ensuite coupés.
Le muscle lésé et son témoin contralatéral sont prélevés et pesés dans une boite de culture.
Les muscles sont ensuite congelés directement dans de l’azote liquide et conservés à –80°C
jusqu’à l’extraction des GAG.
III.1.4. Histologie par coloration au trichrome de Gomori
Les muscles utilisés pour les études immunocytologiques sont déposés sur un support de liège
couvert de Tissue-Teck (Miles) et congelés dans de l’isopentane maintenu en équilibre de
phase solide/liquide (-150°C) dans un bain-marie d’azote liquide. Ils sont en ensuite transférés
dans un tube préalablement refroidi et stockés dans un congélateur à –80°C.
L’étude de la morphologie des muscles en régénération est réalisée par la coloration au
Trichrome de Gomori de coupes faites au cryostat (6-7µm) sur des moitiés de muscles, les
autres moitiés étant utilisées pour des dosages biochimiques.
Les coupes de muscles, longitudinales et transversales sont colorées pendant 5 à 10 minutes à
l’hématoxyline de Harris, puis rincées à l’eau. Une incubation jusqu’à 20 minutes dans le
trichrome de Gomori est suivie par un bain de 1-2 minutes dans de l’eau acétique à 1% final,
puis par des bains d’alcool et des bains de xylène successifs avant le montage au baume du
Canada.
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RESULTATS
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CHAPITRE I :
Article 1 : Stimulation de la prolifération in vitro des cellules satellites par des
mimétiques des glycosaminoglycannes.
« Glycosaminoglycan mimetics (RGTA) modulate adult skeletal muscle satellite cell
proliferation in vitro ». J Biomed Mater Res, 62, 46-55, 2001
Les phénomènes de régénération musculaire se produisent après une altération du muscle
d’origine accidentelle (écrasement, ischémie) ou génétique (cas de la dystrophie musculaire
de Duchenne chez l’homme ou des souris mdx). La régénération est assurée par des cellules
souches du muscle, présentes à l’état quiescent dans le muscle intact. Ces cellules s’activent,
prolifèrent et se différencient en myotubes qui seront à l’origine de nouvelles fibres
musculaires. Elles sont localisées entre la lame basale et le sarcolemme des fibres musculaires
(Mauro 1961) et sont couramment désignées sous le terme de cellules satellites.
Leur capacité à proliférer et à se différencier fait intervenir un certain nombre d’interactions
physiques (contact cellule-cellule ; interaction cellule- matrice extracellulaire) (Buckingham
1994). La prolifération et la différenciation sont régulées par des facteurs de croissance (FGF,
SF-HGF, TGFβ, IGF)(Husmann et al. 1996; Hannon et al. 1996; Robertson et al. 1993) et des
facteurs de régulation myogénique (myf5, MyoD, myogénine et MRF4) (Molkentin and
Olson 1996; Olson and Klein 1994).
Les RGTA « ReGeneraTing Agents », polymères mimétiques d’héparanes sulfates, fabriqués
au laboratoire, ont montré des effets protecteurs et potentialisateurs vis-à-vis de certains
facteurs de croissance du type Heparin-binding (HBGF), tels que le FGF et le TGFβ,
impliqués dans la régulation de la myogenèse (Tardieu et al. 1992). De plus ces facteurs
accélèrent et améliorent la régénération musculaire du muscle squelettique (Gautron et al
1995, Aamiri et al 1995, Desgranges et al 1999)
Ceci suggère que les cellules satellites impliquées dans la régénération puissent être une cible
potentielle des RGTA.
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Nous avons donc étudié l’effet des RGTA sur la prolifération des cellules satellites ainsi que
leur rôle potentialisateur un facteurs de croissance : le FGF2.
Les résultats obtenus sont les suivants :
Le RGTA 1192 de type CMBS augmente (de 50% environ) la prolifération des cellules
satellites en culture primaire par rapport aux cultures non traitées. Des intermédiaires de
synthèse tels le RG1100 (CM) et le RG1106 (CMB) n’ont pas d’effet sur la prolifération des
cellules satellites. Le CMBS diffère des autres molécules par la présence de groupements
sulfates au niveau structural. C’est sous cette forme que les RGTA sont les plus proches des
GAG naturels.
Des résultats comparables sur la prolifération des cellules satellites sont obtenus après
addition de glycosaminoglycannes naturels (dermatane sulfate, héparane sulfate et kératane
sulfate)
Des cellules satellites carencées en sérum reprennent un cycle cellulaire lorsqu’elles sont
remises en condition sérique. La présence de RGTA 1192 augmente l’efficacité de cette
reprise. Ceci suggère que ce RGTA potentialise les facteurs de croissance présents dans le
sérum.
Dans des conditions expérimentales équivalentes, l’apport de FGF2 dans le milieu de
culture permet une reprise du cycle cellulaire après une carence en sérum. La présence de
RGTA 1192 amplifie l’efficacité de FGF2 ajouté dans le milieu de culture.
De même le RGTA stimule l’incorporation de 3H-thymidine dans ces cellules carencées
en sérum lorsqu’on les traite seulement avec du RGTA 1192. Ceci suggère que le RGTA
potentialise des facteurs de croissance synthétisés par les cellules elles même. Il s’agit
principalement du FGF2.
Après une hyposulfatation des héparanes sulfate par un traitement au chlorate des cellules,
la prolifération est réduite. L’apport de FGF exogène et de RGTA permet de rétablir
partiellement la capacité de prolifération des cellules satellites comparé au sérum. Ceci
signifie que le RGTA est capable de compenser partiellement les effets de l’hyposulfatation.
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Par leur structure les RGTA sont des mimétiques des héparanes sulfates. Ils se comportent
aussi comme des mimétiques fonctionnels des HS puisque, comme les HS naturels, ils
potentialisent les effets du FGF2 sur les cellules satellites.
L’une des raisons qui pourrait expliquer l’effet potentialisateur du RGTA sur le FGF2 serait
qui le RGTA favorise la dimérisation du facteur de croissance, le rendant ainsi plus apte à se
fixer sur son récepteur et transmettre un signal conduisant à une prolifération cellulaire. Des
études récentes réalisées au laboratoire ont montré en effet, que les RGTA, parmi ceux-ci le
RGTA de type 1192, favorisent la dimérisation du FGF2 in vitro (communication personnelle,
Vincent Rouet).
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CHAPITRE II
Article 2 : Mise au point d’une méthode quantitative de détermination des
glycosaminoglycannes au niveau d’extraits cellulaires et des tissus biologiques.
« Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in
biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies ». Glycobiology 13 (9) :647653, 2003.
Les PG sont des composants multifonctionnels de la matrice extracellulaire où ils jouent un
rôle important dans la régulation de la prolifération et de la différenciation cellulaire (Lyon
and Gallagher 1998; Selleck 2000; Turnbull et al. 2001). Les PG sont composés d’un cœur
protéique auquel sont attachées des chaînes plus ou moins longues de GAG. Les effets
régulateurs des PG sont dûs à la capacité des GAG à fixer de façon non covalente des
protéines biologiquement active telles que les facteurs de croissance (David and Bernfield
1998).
A l’exception de l’acide hyaluronique, tous les GAG possèdent des groupements N- et Osulfatés fixés aux unités disaccharidiques. Ces chaînes de GAG sulfatés se lient de façon
covalente à des serines située sur le coeur protéique, cet ensemble formant ainsi les PG. La
sulfatation des glycosaminoglycannes confère aux PG une charge hautement négative.
Comme nous l’avons démontré dans le chapitre précédent, les GAG ont la capacité de
potentialiser les facteurs de croissance au cours de la myogenèse. Il semble donc important de
connaître la nature, la composition et la quantité de GAG impliqués dans les mécanismes de
la myogenèse in vivo et in vitro.
Dans la littérature, il existe de nombreuses méthodes spectrophotométriques permettant une
détermination quantitative des GAG sulfatés présents dans des extraits biologiques. La plupart
de ces techniques sont basées sur une modification de l'
absorption spectrométrique du bleu de
méthylène (1-9 diméthylméthylene bleu ou DMMB) lors de sa fixation aux GAG (Farndale et
al. 1982; Whitley et al. 1989). Des études récentes montrent que l'
utilisation du DMMB est
plus sensible et efficace que l'
utilisation du bleu de toluidine ou du bleu Alcian.
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Les différentes techniques classiques appliquées soit à nos modèles de régénération
musculaire après écrasement, soit sur des extraits issus de cultures primaires de cellules
satellites ou de la lignée myoblastique C2.7 donnent des résultats peu reproductibles. Nous
nous sommes aperçus qu'
il existait un certain nombre d'
inconvénients à ces techniques.
D’une part, les solutions utilisées pour le dosage ainsi que les produits de réaction étaient très
peu stables. Le dosage de grandes séries d'
échantillons n’était donc pas possible dans les
conditions préconisées classiquement (Farndale et al. 1982; Whitley et al. 1989). En effet, les
méthodes existantes utilisant le DMMB étaient peu sensibles, ce qui rendait impossible la
détection et la quantification de faibles quantités de GAG, notamment pour les extraits
provenant de cultures primaires de cellules satellites. Enfin, des interactions avec l'
ADN ainsi
que d'
autres molécules chargées négativement, présents dans le matériel biologique,
interféraient avec le DMMB et rendaient impossible la quantification exacte des GAG dans
les échantillons biologiques.
Pour résoudre ces difficultés et pouvoir quantifier les GAG de manière fiable et reproductible,
nous avons cherché des conditions permettant de stabiliser les interactions entre les GAG et le
DMMB.
Il a été ainsi possible de préparer un réactif contenant le DMMB qui reste stable pour une
durée supérieure ou égale à quatre mois (comparé à demi-journée pour les méthodes
classiques). Notre méthode permet donc de former un complexe stable entre les GAG et le
DMMB palliant ainsi l’inconvénient de l’instabilité de ce complexe observée lors de
l’utilisation des méthodes décrites jusqu’alors.
La technique que nous avons mise au point est basée sur la formation d'
un complexe insoluble
et stable entre le DMMB et les groupements sulfatés présents au niveau des disaccharides des
chaînes de GAG. Ce complexe est ensuite isolé par centrifugation, ce qui permet d’éliminer le
DMMB en excès. Nous avons établi des conditions permettant la dissociation du complexe
formé entre les GAG et le DMMB présent dans le culot de centrifugation. La quantification
des GAG consiste alors à mesurer la quantité de DMMB libérée par analyse
spectrophotométrique à 656 nm (pic maximum d’absorption du bleu décomplexé par le
propanol-1).
Notre méthode permet également de faire la différence entre les héparanes sulfates et les
CS/DS présents dans les extraits cellulaires ou dans les tissus. Ceci est rendu possible grâce à
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la spécificité de clivage de l’acide nitreux sur les liaison O-sulfatées des HS. Les différentes
solutions utilisées pour la formation de l’acide nitreux n’interférent pas avec le DMMB.
Nous avons aussi amélioré la sensibilité du dosage, puisque nous avons dosé des échantillons
ne contenant que 0.025µg de GAG totaux alors que les techniques existantes ne pouvaient
détecter les GAG qu’à partir de 1µg.
Enfin, les interactions pouvant exister entre l’ADN ou des molécules chargées négativement
d’une part et le DMMB d’autre part, ont été abolies par l’utilisation de guanidine suivie d’une
filtration.
Notre méthode de détermination des GAG sulfatés a été validée biochimiquement par sa
précision, reproductibilité, sa sensibilité, son exactitude et sa linéarité sur différentes
concentrations de GAG rencontrés dans les tissus biologiques.
La précision de la méthode est définie par la eproductibilité de la méthode. Elle est réalisée
sur un nombre supérieur ou égal à 5 expériences effectuées à des jours différents et dans les
mêmes conditions de traitement des échantillons (standard et biologique) et de dosage.
L’évaluation de la sensibilité de la méthode à été établie à partir du dosage de GAG standards
dilués selon une gamme de concentration allant de 1 à 0,01µg. La limite de sensibilité est de
0.025µg de GAG totaux.
L’exactitude de la méthode à été montrée à partir d’extraits de muscle. Sur une quantité
connue de GAG totaux évaluée à partir des extraits et allant de 1 à 5µg, nous avons rajouté
une quantité variable mais déterminée de chondroïtine sulfate ou d’héparane sulfate. Les
GAG totaux sont ensuite quantifiés. Les résultats obtenus dans tous les tests pratiqués ont un
pourcentage d’erreur inférieur à 10%.
La validation biologique de la méthode à été réalisée sur différents modèles biologiques
comme le tissu musculaire, la peau, des cellules myoblastiques en cours de prolifération et de
différenciation et les différents standards de GAG existants (HS, DS, CS).
Récemment, notre technique a aussi permis d’évaluer et d’estimer l’index de greffage de
molécules de HS ou de mimétiques d’HS sur des billes magnétiques. Elle permet aussi grâce à
sa spécificité de formation du complexe GAG-DMMB, de purifier les GAG totaux, en vue de
leur immobilisation sur plaque, dans le but de les utiliser pour le dosage de différentes espèces
de HS par des techniques ELISA.
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La technique étant fiable et sensible, elle a été mise en œuvre dans une étude permettant de
connaître et d’évaluer les variations des GAG naturels impliqués dans la prolifération et la
différenciation des cellules myogéniques.
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CHAPITRE III
Article 3: Les RGTA mimétiques synthétiques de GAG modulent le métabolisme des
GAG naturels au cours de la myogenèse (soumis J Cell. Biol.).
Synthetic glycosaminoglycan mimetic (RGTA) modulates natural glycosaminoglycan
metabolism during myogenesis.
Il existe très peu d’information dans la littérature à propos des variations qualitatives et
quantitatives de la teneur des GAG pendant la myogenèse. L’analyse quantitative et
qualitative des GAG au cours de la myogenèse in vivo et in vitro devrait permettre d’établir
les variations spatio-temporelles de la distribution des héparanes sulfates PG (HSPG), au
niveau de la surface cellulaire au cours du développement embryonnaire. La connaissance de
ces variations aiderait à mieux comprendre les processus d’interactions entre les GAG et les
facteurs de croissance. Par ailleurs, la variation et l’importance de ces GAG au cours de
certaines pathologies musculaires pourraient être établies grâce à ce typed’approche
analytique.
Dans le chapitre I, nous avons montré que les RGTA, mimétiques des héparanes sulfates
naturels, stimulaient la prolifération des cellules myoblastiques. Le RGTA stimule également
la prolifération des cellules C2.7 utilisées dans cette étude. De plus, le RGTA induit une
différenciation précoce des myoblastes en myotubes.
Dans ce contexte, il était intéressant de savoir quels GAG étaient présents sur les cellules et
comment variaient la quantité et la qualité des GAG au cours de la myogenèse. D’autre part,
nous voulions savoir si les RGTA étaient susceptibles de modifier la teneur GAG au cours de
la myogenèse. Dans l’affirmative, se pose la question de savoir quels types de GAG sont
modifiés. Dans le cas des HS, nous savons qu’il existe plusieurs formes ayant des épitopes
différents (Jenniskens et al., 2000). Pour essayer de savoir si les RGTA modifient la qualité
des HS, l’apparition de trois épitopes de HS a été suivie au cours des phases de prolifération
et de différenciation.
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A l’aide de la technique de dosage par le DMMB détaillée dans le chapitre II, nous avons
donc quantifié et déterminé les GAG au cours de la prolifération et la différenciation de
cellules myogéniques appartenant à la lignée C2.7.
Comme avec les cellules satellites, le RGTA augmente la prolifération et la différenciation
en myotubes des cellules C2.7. L’augmentation de la différenciation est attestée par le suivi
de 2 marqueurs de différenciation. L’augmentation de l’activité créatinine phosphokinase
(CPK), ainsi que l’augmentation de l’isoforme M de cette enzyme, et la variation de
l’expression du syndecan I.
La teneur en GAG sulfatés augmentent lors de la différenciation. Le traitement des
cellules par le RGTA accentue cette augmentation (de l’ordre de 70%). Cette molécule a aussi
un effet sur l’expression relative des différents types de GAG. Au cours de la différenciation,
le taux de HS est augmenté, le RGTA stimule encore plus cette augmentation.
A l’aide d’anticorps anti-HS dirigés contre trois épitopes différents de HS, nous avons
observé par microscopie confocale qu’il existait une répartition différente de ces HS. Les trois
épitopes sont présents à la surface des myoblastes mais revêtent des aspects différents et sont
localisés dans des zones déterminées. L’un des trois épitopes d’HS est plus particulièrement
augmenté par la présence de RGTA. Cet épitope se trouve associé à la zone de contact étroit
existant entre deux cellules préfusionnelles.
En conclusion, les RGTA comme mimétique naturels des GAG ont un effet sur la teneur en
GAG naturels. La question non résolue est de savoir comment les GAG synthétiques
modulent les taux des GAG naturels.
En annexe à cet article, nous montrerons par ailleurs les résultats de dosage de GAG ainsi que
la localisation des HS par immunocytologie au niveau de culture primaire de cellules
satellites. De même, nous avons observé que le RGTA utilisé au cours de cette étude à la
capacité de pénétrer à l’intérieur de la cellule.
Une autre des hypothèses de travail était que ls RGTA puisse avoir une action sur
l’expression des ARNm codants pour les enzymes de synthèse des GAG (NDST, OST).
Avant quantifier ces enzymes et de voir un effet eventuelle des RGTA sur leurs synthèses,
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nous avons voulu savoir s’il était possible de les détecter, mais aussi voir lesquels de ses
enzymes étaient exprimées dans notre modèle de myogenèse in vitro.
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Synthetic glycosaminoglycan mimetic (RGTA) modulates natural glycosaminoglycan
metabolism during myogenesis.
Isabelle Barbosa, Mustapha Oudghir*, Arlette Duchesnay, Guido Jenniskens**, Gilles
Carpentier, Jose Cebrian, Jean-Pierre Caruelle, Toin van Kuppevelt***, Isabelle Martelly and
Dulce Papy-Garcia
Laboratoire CRRET, CNRS FRE-2412, Université Paris 12-Val de Marne,
61 Avenue du Général de Gaulle, 94010 Créteil cedex, France
*Faculty of Sciences, University Cadi Ayyat, Marrakech, Marocco
** Division of Bioengineering and environmental health, Massachusetts Institute of
technology, Cambridge, MA 02139, USA.
*** Department of Biochemistry194, University Medical Centre, NCMLS, P.O. Box 9101,
6500 HB Nijmegen, The Netherlands.
Correspondence should be addressed to Isabelle Martelly,
e-mail: martelly @univ-paris12.fr
Requests for RGTA should be addressed to Dulce Papy-García;
e-mail : [email protected].
Key words: Glycosaminoglycans, myoblast, RGTA,
Abbreviations used
GAG, glycosaminoglycan; DNA, desoxyribonucleic acid; HS, heparan sulfate; CS,
chondroitin sulfate; RGTA, regenerating agent; DAPI, diamino phenyl indole; DMEM,
Dulbecco Modified Eagle Medium; FBS, fetal bovine serum; BSA, bovine serum albumin;
sd, standard deviation
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Abstract
Crucial events in myogenesis rely on the highly regulated spatio-temporal distribution of
cell surface heparan sulfate proteoglycans to which are associated growth factors that
create a specific microenvironment around muscle cells. Most of growth factors
involved in control of myoblast growth and differentiation are stored in the extra-cellular
matrix through interaction with specific sequences of glycosaminoglycans (GAG)
oligosaccharides, mainly heparan sulfate (HS). Different HS subspecies, revealed by
specific antibodies, have been shown to present spatio-temporal regulation during
muscle development. We have previously shown that GAG mimetics called
ReGeneraTing Agents (RGTA), stimulates muscle precursor cell growth and
differentiation. These data suggest an important role of GAG during myogenesis
however, little is known today about their composition.
We therefore quantitated GAGs during myogenesis of C2.7 cells and studied the effect
of RGTA on GAG synthesized by these cells. RGTA, which stimulated both growth and
differentiation of C2.7 cells, increased total GAGs amount produced by these cells
without significantly altering their rate of sulfation. Along with stimulation of
differentiation, distribution of GAG species was modified, HS was particularly
increased, and changes in HS subspecies were observed.
These studies showing that effects of RGTA on myoblast growth and differentiation, act
in part through alteration of GAG composition, might be an important insight in the
comprehension of normal or pathologic myogenic processes.
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Introduction
Basal lamina (BL) surrounding muscle fibres fulfils many developmental and physiological
roles (Sanes et al. 1986; Sanes et al. 1990; Sanes 2003). The BL networks are interconnected
with resident and cell surface proteins and proteoglycans (PG). These PG consist in a core
protein to which glycosaminoglycan (GAG) moieties are covalently linked. Heparan sulfate
proteoglycans (HSPG) constitute the major portion of proteoglycans of the BL of skeletal
muscle cell surface (Brandan et al. 1991; Brandan et al. 1996) (Larrain et al. 1997;
Cornelison et al. 2001). Highly regulated spatio-temporal distribution of BL components and
of cell surface HSPG such as collagen, agrin, perlécan, glypicans or syndecans (Sanes et al.
1990) create a specific microenvironment around muscle cells that is determinant for the
events of myogenesis in particular by regulating bio-availability of growth factors. A growing
body of evidences indicates that most growth factors involved in control of cellular growth
and differentiation, can be stored in the extra-cellular matrix through specific interaction with
glycosaminoglycans (GAG), essentially heparan sulfates (HS). Heparin or HS stabilized and
protected growth factors from degradation (Sommer and Rifkin 1989) and their activity may
even be potentiated (Lyon and Gallagher 1998; Rahmoune et al. 1998; Rapraeger 2002)).
From these binding sites, these growth factors designated as Heparin Binding Growth Factors
(HBGF), could be released and accomplish cellular activating functions.
The control of bio-availability of HBGF may in part be mediated by an affinity of these
factors to specific sequences in the sugar moiety of proteoheparan sulfates. In particular the
rate of sulfation regulates the affinity of growth factor to HS (Kreuger et al. 1999; Kreuger et
al. 2001) (Fernig et al. 2000; Ford-Perriss et al. 2002). Interestingly, it has been
demonstrated, using phage display antibodies that HS belongs to a family of molecules that
present a spatiotemporal regulation in cells such as skeletal muscle cells, thus suggesting a
subtle regulating role of these molecules in cellular environment (Jenniskens et al. 2000;
Dennissen et al. 2002; Jenniskens et al. 2002). Indeed, several growth factor binding
oligosaccharides sequences have been established (Olwin and Rapraeger 1992; Allen et al.
2001; Kreuger et al. 2001). They govern the activity of growth factors on cells as it has been
shown for Fibroblast growth factor 2 (FGF2) for instance (Rapraeger et al. 1991) (Berry et al.
2003).
We have used substituted polymers which mimic HS on the basis of their ability to interact
with and to protect several HBGFs against proteolysis (Meddahi et al. 1995; Meddahi et al.
1996).These polymers were shown to enhance tissue repair in various in vivo models
including skin (Meddahi et al. 1996)), bone (Blanquaert et al. 2003)), or colon (Meddahi et al.
2002). They highly stimulate regeneration of denervated and crushed EDL and Soleus skeletal
muscles (Aamiri et al. 1995) (Gautron et al. 1995) (Zimowska et al. 2001) as well as prevent
most of the damages resulting from acute skeletal or cardiac muscle ischemia (Desgranges et
al. 1999) (Zakine et al. 2003). Therefore these polymers were designated as RGTA (for
ReGeneraTing Agent). Experiments performed with satellite cells (also called as muscle
precursor cells) in primary cultures have shown these GAG mimetics stimulate satellite cell
growth and differentiation (Papy-Garcia et al. 2002) (Stockholm et al. 1999).
Taken together, these results suggest the GAG moiety of certain proteoglycan might regulate
the differentiation process of myoblasts and their differentiation into myotubes. However,
little is known about the GAG composition associated to myoblasts and myotubes. CS and HS
syntheses are highly increased in mdx satellite cells compared to normal muscle satellite cells
(Crisona et al. 1998; Alvarez et al. 2002). The reduction of GAG sulfation by chlorate
treatment of C2C12 myoblasts was shown to reduce their growth capacity (Papy-Garcia
et al. 2002) and differentiation capacity (Melo et al. 1996).
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These results prompted us to study changes in GAG amounts during myoblast differentiation
in vitro and to identify their species, using C2.7 cell line. We also investigated whether RGTA
would alter GAG composition in relation to its effects on myoblast growth and differentiation.
Materials and Methods
Materials
The RGTA used in this study, called D120, had the following structure (fig. 1) as determined
by 1H RMN, acid-base titration, infra red microscopy and HPLC gel filtration-light diffusion
detection as in (Ledoux et al. 2003).
Myoblast cell line C2.7, a subclone of C2 myoblasts obtained by D. Yaffe (Yaffe and Saxel
1977) was isolated by Pinset and Montaras (Pinset et al. 1988). Dulbecco Modified Eagle
Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), horse serum and phosphate buffer saline PBS
10X were from Gibco-BRL-Life Technologie, (Cergy-Pontoise, France). Sodium acetate,
sodium formiate, formic acid, anthranilic acid and proteinase K were from Merck
(Darmstadt,Germany), propan-1-ol was from Prolabo-VWR (Strasbourg, France). Filters
Ultrafree-MC Amicon was from Millipore (Bedford, Massachusetts). Paraformalhehyde,
gelatin, mowiol, p-Nitrocatechol sulfate, Chondroitinase ABC and all other chemicals were
from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Heparitinase I was from Seikagaku (Tokyo,
Japon). Protein assay kit was from Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules (California, USA).
ECL was from Amersham Pharmacia Biotech, (Amersham, United Kinddom). µMACS
technology was from Miltenyi Biotec, (Bergish Gladbach, Germany).
Epitope-specific antibodies against HS were produced by phage display technique (Jenniskens
et al. 2000). Anti c-myc tag rabbit polyclonal IgG (A-14) was from Sigma, anti syndecan-1
was from Santa Cruz Biotechnologie (Tebu, Paris, France). Alexa 488-conjugated goat antirabbit IgG was from Molecular Probes (Eugene, USA). Electrophoresis material and products
were from Biorad. Spectroscopic data were colleted using a scanning spectrophotometer PU
8740 UV/Vis (Phillips, Paris, France), HPLC material was composed with a TSKgel G3000
PWXL 7,8 mm ID x 30 cm column from Tosohaas, fluorescence detector LC240 was from
Perkin Elmer, HPLC pump was from Kontron instruments (Germany), analyse of HPLC
peaks was performed with RadioStar software. Confocal microscopy images were acquired
with a Zeiss LSM 410 laser scanning confocal Axiovert 135M inverted microscope.
Cell cultures
C2.7 was maintained as sub-confluent monolayers in Dulbecco Modified Eagle Medium
(DMEM) containing 1 g/l glucose and 4 mM L-glutamine supplemented with 20% fetal
bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin and 10 µg/ml streptomycin. Cells cultures were
incubated at 37°C in 12 % CO2. Samples of proliferating cells (myoblasts) were taken during
the following 5 days after plating. To induce differentiation, the medium was changed at subconfluence (days 3 or 4 after plating) to DMEM supplemented with 0.25 % FBS and 0.25 %
horse serum. Samples of differentiated cells were taken at the indicated times during the 48
hours following medium shift.
Evaluation of myoblast proliferation or differentiation
At the indicated times, cultures were trypsinized and the number of cells was measured by
Coulter Counter. In other cases, culture growth was determined by DNA content evaluation
using a diaminophenyl indole (DAPI) assay Brunk et al. 1979.
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In order to evaluate differentiation, total creatine kinase (CK) activity of cellular extracts was
determined by a micromethod using reagents of Biotrol. Samples containing equivalent
amounts of CK activity in 1 µl were loaded onto 1 % agarose gels, and isoform separation
was achieved by electrophoresis (Lagord et al. 1993). Gels, illuminated with UV light (365
nm) were photographed and negatives were scanned and analysed by Gene Tool program. In
other cases, syndecan 1 was evaluated using Western blotting analysis as further described.
Syndecan 1 analysis by Western blotting
At the indicated times, protein extracts were preformed in buffer containing 150 mM NaCl, 1
% Triton® X-100, 50 mM Tris HCl (pH 8.0) and anti-protease (aprotinin (1 µg/ml), leupeptin
(1 µg/ ml), pepstatin A (1 µg/ml), PMSF (100 µg/ml) and EDTA (1 mM).
Extracts were incubated in the presence of heparitinase (5 mU) and chondroitinase (25 mU)
overnight at 37°C. Reaction was stopped by heating at 90°C, for 5 min. The extracts were
centrifuged 10 min at 12 000 t/min in a microfuge ((Bioblock Scientific, Illkirch, France). The
final supernatant was used for total protein measurement using the Bio-Rad RCDC protein
assay kit and immunoprecipitation. These protein extracts were mixed with anti- syndecan-1
(2 µg/ml) and complex was specifically retained using protein G MicroBeads (µMACS)
according to manufacturer indications. The eluted protein samples were analyzed by SDSPAGE electrophoresis (8 % polyacrylamide) and Western blotting. Membranes were blocked
for 2 hours in buffer containing 1x PBS, 4 % milk, 0.20 % Tween-20 and placed in antisyndecan antibody diluted at 1/ 200 in blocking buffer overnight at 4°C. Membranes were
washed three times. Primary antibody was detected using peroxydase-labeled rabbit anti IgG
(1/50 000, Jackson) and visualized with the enhanced chemiluminescent detection system
ECL (Amersham).
Preparation of GAG extracts
At the indicated times, cellular extracts and conditioned medium were selected and treated as
in (Barbosa et al. 2003). In brief, cellular layer extracts were performed by scrapping the cells
K2HPO4 (50 mM, pH 8.0). Cellular extract was then digested in a solution of 50 µg/ml
proteinase K in 100 mM PO4 buffer pH 8.0 at 56°C over night. Proteinase K was then
inactivated by heating the preparation 10 minutes at 90°C. Digested tissue was filtered
through an Ultrafree filter in order to eliminate DNA and tissue debris from the extract. This
preparation was used for sulphated GAG quantification. The amount of DNA in samples was
determined before filtration through Ultrafree filter by diaminophenyl indole (DAPI) assay
using salmon sperm DNA as standard Brunk et al. 1979. Conditioned medium of each plate
was lyophilized and dry powder was dissolved in 100 mM PO4 buffer and treated with
proteinase K as described above. These extracts were used for GAG quantification
Quantification of GAG
Total sulfated GAGs and HS or CS were quantified, using a method based on
dimethylmethylene blue co-precipitation with GAGs according to (Barbosa et al. 2003).To
take into account the presence of synthetic sulfated GAG (RGTA) in extracts, the value
corresponding of the added RGTA in cultures was subtracted from the total GAG amount
measured. HS was quantitated after nitrous acid treatment of total GAG preparation since, it is
known that this treatment selectively eliminates HS (Bosworth and Scott 1994). The GAG
remaining in the sample represented O-sulfated GAGs including CS. The N-sulfated GAGs
Page -151-
(HS) content was then calculated as the difference between the total GAGs and the O-sulfated
GAGs in each sample.
Preparation of GAG labeled with anthranilic acid and HPLC analysis.
In order to enhance sensibility of GAG detection using HPLC technique, we prepared GAG
samples which were tagged with anthranilic acid by a reductive amination. Therefore, 100 µl
of proteinase K-treated GAG samples were incubated during 24 hours at 37°C under slow
agitation with 200 µl of a 1:1 mixture containing anthranilic acid (1M) in ethanol and sodium
borohydrate (1M) in ammonium acetate. The reaction was stopped by addition of 300 µl of
water and filtered through Ultra-free MC filters. Twenty µl of the filtrate were injected in
HPLC (TSK gel G3000). GAGs were eluted at 1.0 M NaCl at 1ml/min and detected with
fluorescence detector LC240. Total GAG amounts, analyzed with Radiostar program
(Berthold, Germany), represent the sum of the areas under each peak which eluted between 6
and 18 min.
Aryl sulfatase assay
The method for determination of arylsulfatase A and B was adapted from (Baum et al. 1959).
In brief, cells were homogenized in sodium acetate buffer (250 mM pH 6.0) containing 0.5%
Triton X100. The samples were kept in ice for 1 hr and centrifuged at 10 000g, 10 min.
Extracts were then dialysed 18 hrs against distilled water. Proteins were then measured using
BCA reagent (Biorad). Arylsulfatase A was determined by colorimetry as followed: 50 µg of
protein of cellular samples in water, were added 50 µl buffer A (10 mM sodium
pyrophosphate, 1.7 M NaCl, 0.5 M sodium acetate pH 5.0), 50 µl nitrocatechol sulfate (10
mM) diluted in buffer A. Reaction was allowed to occur 60 min at 37°C and was stopped by
addition of 50 µl NaOH 1 M. The liberated nitrocatechol was measured at 540nm. As
standard, 4-catechol was used between 0.250 and 5 nmol in the same buffer condition. Aryl
sulfate B was measured in similar conditions but in buffer B (0.5 M sodium acetate, 10 mM
barium acetate pH 6.0). Nitrocatechol sulfate was used at 50 mM in buffer B. Standard curve
with 4-catechol was performed between 12.5 and 125 nmol. Two set of assays were prepared
in order to perform incubation during 30 and 90 min. The liberated 4-nitrocatechol was
measured as described above. The evaluation of aryl sulfatase B under these conditions was
as described in (Aqrabawi et al. 1993).
Immunohistochemistry
The cell layers (myoblast or myotubes) was fixed with 4% paraformaldehyde, 20 min. Cells
were washed three times with PBS 1X and treated with 2 ml of NH4Cl (50 mM) in PBS
during 10 min and then washed three times with PBS/0,2% gelatin, and incubated with anti
heparan sulfate antibodies (RB4CD12, AO4F12, AO4BO5) (Jenniskens et al 2000) for 90
min. The following steps were as in Jenniskens et al 2003. Observations were performed
using confocal microscopy.
Image analysis on Confocal microscope
For both transmission and fluorescence modes, the 488 nm emission ray of a Ar/Kr laser was
used as lighting and excitation source. No emission filter was employed for transmission
mode. A 515 nm emission filter was used for fluorescence mode. Images of cells were
obtained with 63x objective with a 2 fold zoom scanning. Stacks of 40 slices of 0,25 µm of
Page -152-
thickness were acquired to make a maximum projection on the Z axis. The final images
contain the informations from the base to the top of cells. Image treatment and analysis were
performed on a Macintosh computer G4 using the public domain program Object-Image,
which is an extended version of NIH Image, developed at the U.S. National Institutes of
Health and at the University of Amsterdam.
The following original procedures were performed to improve the quality of confocal images
in transmission and fluorescence modes.
Transmission images: correction of shading was performed on as following. A deblurring
based on the method known as "unsharp mask filtering" allows to remove shading. In certain
conditions of use, we found unsharp mask filtering usefull to make a correction of shading on
images. Indeed, it is generally admited that this method of filtering extracts details which size
is in the order of the size of the matrix of convolution used. In transmission images, most of
details consist in refringent areas which are relatively smalls. So, we found that a mask of
details, obtained with an unsharp mask using a 15x15 gaussian matrix (sd = 4,5) contains the
essential of the image informations. This step acts as a high and medium pass filter. The
shading, which is composed in large and diffuse areas, is completely removed by this
operation. A stretch of the image histogram, allows to restore an appropriate contrast (called
bellow image A).
The image A, was improved by adding the details contained in the initial image. For that, a
composite image resulting by the sum of three masks of details obtained with unsharp mask
filtering (gaussian convolution matrix size 5x5, sd=1,1 ; 7x7, sd=1,2 ;
15x15, sd=4,5), was used. This composite mask of details, added to image A, permits to keep
a large panel of detail sizes, ensure the optimum enhance of details structures, without adding
noise. Removal of artifactual horizontal stripes was performed using fast Fourrier transform
(FFT). First, a fast Harley transform procedure was performed on a squared 512x512 image,
with swapping the quadrants of power spectrum. A filtering using a mask in the frequency
domain was performed (Bracewell). The vertical rectangular area used as mask, was centred
on the vertical axis of symmetry, and covers about 0,98 % of the spectrum. This mask, used
as a filter (zero value), eliminates the periodic structures on the Y axis whatever was their
frequencies on Y axis, and with a very low frequency in the X axis. Furthermore, it centrered
the histogram by subtracting the mean grey level of the image. The inverse FFT was
performed after using a gaussian transition (Reeves 1990). The final image was then free of
horizontal periodic artefacts.
Fluorescence confocal images : The z axis projections images obtained were improved by the
same deblurring procedure described above for transmission images with the following
modifications : the images were treated by a gaussian convolution used as a low pass
frequency filter (3x3 matrix, sd=0,4) to limit the noise which was increased by the debluring.
The final image resulting of the un-sharp mask filtering is scaled in grey level according to
the modal minimum and maximum values of the histogram of the initial images.
Evaluation of HS subspecies by ELISA assay
The GAG containing extracts were used for further HS subspecies determination determined
by ELISA assay. Therefore, GAGs were grafted on BSA as following : 100µl extract
containing 1 to 10 µg/ml of GAG were mixed to 100 µl BSA (1 mg/ml) diluted in phosphate
buffer (100 mM, pH 8.0) and 390 µl phosphate buffer. Then 10 µl of a solution of reducing
agent (NaCNBH4) prepared extemporaneously at 5 mg/ml in phosphate buffer were added.
The mixture was kept at 37°C overnight under moderate agitation. The BSA-GAG complex
(10 µl) was used at 2.5µg protein /ml to coat ELISA plates overnight at 4°C. The plates were
then rinsed 3 times with PBS-Tween 20 (0.05 %). Then BSA (3 %) in PBS was added 1 hr at
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room temperature. After 3 washes in PBS-Tween 20, anti HS diluted at 1/10 in PBS BSA 1 %
was added. Incubation was performed at 37°C for 1.5 hours. After 3 washes in PBS-Tween
20, anti c-myc diluted at 1/600 in PBS-BSA 1% was added and plates were further incubated
1 hr at room temperature, then, after wash, peroxydase labeled anti IgG were added (Jackson)
and incubation at room temperature (30 min) was further performed. The plates were again
washed 3 times and TBM kit reagent (Pierce) was used according to manufacturer indications.
Absorbance in wells was measured at 450 nm. As control, CS or HS from commercial source
were included in the assays.
Results
Effect of RGTA on myoblast proliferation and differentiation
Previous studies have shown that RGTA was a potent stimulating agent for proliferation and
differentiation of rat satellite cells in primary cultures (Papy et al 2002, Stockholm et al
1999). To provide a basis for additional studies we determined the proliferating and
differentiating effects of RGTA of C2.7 mouse cell line. Since RGTA is a GAG mimetic and
that some of its effects were considered as similar to heparin effect, a heparin control
treatment was included in most of the following experiments. RGTA applied just after plating
stimulated proliferation of C2.7 myoblasts in a dose-dependent manner (fig.2 A). The optimal
doses for maximal proliferation stimulation were between 0.5 µg/ml and 1 µg/ml. The
decrease in cell n umber for high doses of RGTA was partially to some cell lots and to
cellular differentiation which was visible. Kinetic of cell growth in presence 0.5 µg/ml RGTA
or 10µg/ml heparin is shown on fig. 2B. Compared to control both treatments increased cell
growth, but RGTA appeared more efficient that heparin. Indeed the efficient concentrations of
RGTA were presently about 6 to 12 nM, whereas that of heparin was about 670 nM. Between
days 4 and 5, cell growth was stopped and cultures began to differentiate spontaneously under
our conditions of cultures. RGTA increased differentiation of cells that were shifted to low
serum containing medium (fig. 3). Within 24 hrs after medium shift from high to low serum,
numerous myotubes were seen in RGTA-treated cultures (fig. 3A-4) whereas myotubes were
still rare in control cultures (fig. 3A-3). The increased differentiation in the presence of RGTA
was proved also by an increase in creatine kinase activity and an increase in the proportion of
the muscular isoform (M) of this enzyme (fig. 3B). The proteoglycans syndecan-1, has been
shown to be down regulated upon myogenic differentiation (Larrain et al. 1998). In our
conditions, syndecan-1 was highly expressed in control cultures at the moment of medium
shift or 24 hrs after, its amount decreased at 36hrs and 48 hrs. In RGTA-treated cultures, the
amount of syndecan-1 core protein was already lower at time 0 than in controls, and was more
rapidly reduced than in controls to disappear at 48 hrs (fig 3C).
These different results showed that RGTA increased C2.7 growth and also stimulated their
differentiation. We have chosen to focus our study on the effect of RGTA (used at 0.5 µg/ml)
more specially at the myoblast to myotubes transition, i.e. between day 3 and day 6 after
plating.
RGTA increased GAG content upon proliferation and differentiation of C2.7
Using the DMMB technique, total GAG content and HS and CS amounts were measured in
C2.7 cells between days 3 and 6 in cultures either continuously grown in high serum medium
or in cultures that where triggered to differentiate by shifting cultures from high to low serumcontaining medium. In high serum conditions, referred to as proliferating cells, total GAG
content in cellular extracts did not change significantly during this period of observation in
control cultures. A moderate increase of total GAG was noticed at day 6. RGTA treatment
increased the amount of total GAG compared to controls (fig. 4A). In these proliferating cells,
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GAGs were proportionally less important in the medium than at the cellular level. RGTA
increased the amount of GAGs at the cellular level compared to medium (fig. 4B).
We also studied GAG changes in cultures in which differentiation was stimulated by a shift to
a low serum medium. In this medium condition, total GAG content of cellular extracts in
controls was increased within the 48 hrs after medium shift (fig. 4C). RGTA further increased
this amount of total GAGs (fig. 4D) .
Sulfation rate of total GAGs was not altered by RGTA
The technique which was used to assay so called total GAG content in cell extracts was based
on the affinity of sufated GAG to cationic DMMB dye. In order to check if RGTA would
increased overall GAGs and not specially sulfated GAGs, we performed another GAG
determination using HPLC chromatography of GAG molecules that have been tagged by a
fluorescent chromophore (anthranilic acid). This method gives a signal directly proportional
to the amount of GAG molecules. It allowed to quantify total GAG, including unsulfated
species such as hyaluronic acid. In these experiments, results have shown that RGTA or
heparin increased total GAG amount compared to controls. Heparin was always less efficient
than RGTA in increasing GAG content. These increases measured here in the presence of
RGTA were in similar proportion that the increases measured using DMMB assay (fig. 5).
This suggested that RGTA stimulated overall GAG synthesis as well as its sulfation.
In order to further analyse the possible effect of RGTA on GAG metabolism, we measured
aryl sulfatase A and B activities in control and RGTA-treated cultures during differentiation.
This class of enzymes might indeed be involved in changes of sulfation rates of GAG. Aryl
sulfatase A specific activity did change significantly in differentiating cultures (fig. 6A).
Interestingly, aryl sulfatase B decreased by about 4 fold in the course of differentiation in
controls. RGTA treatment of cultures slightly reduced this decrease (fig. 6 B).
RGTA altered GAG composition during the myogenic process
Since RGTA increased overall GAG amounts produced by cells, we analysed GAG
composition when cells changed from proliferating to differentiating state, taking advantage
that nitrous acid selectively degrades HS from total GAG extracts (Bosworth and Scott 1994).
Indeed, GAG composition changed differently in control and in RGTA treated cultures (fig. 7
A and B). In control cultures, CS was proportionally more important than HS during
proliferation. HS increased progressively upon differentiation. In proliferating cells, RGTA
increased by 2 to 3 fold both HS and CS when cells were post-mitotic (days 4-5) (fig. 7A). In
differentiating medium, RGTA increased also and only HS amount by 2 to 3 fold over
controls, whereas CS was not significantly altered (fig. 7B). Similarly, but to a less extent,
heparin also altered GAG composition compared to control cultures (not shown).
HS sub-species and localisation in differentiating myoblasts
It has been demonstrated that HS GAG belongs to a family of molecules. HS species
composition change in cell environment in biological processes, particularly during myogenic
differentiation (Jenniskens et al 2000). Using three HS antibodies which recognise different
HS subspecies, we tested GAG composition in an ELISA assay (fig. 8). It is shown that
among these three antibodies, AO4F12 antibody was the less reactive. Interestingly, the
composition of HS in RGTA-treated cells changes since at 36 hrs after medium shift, its
reactivity to AO4F12 antibody increased whereas the response to the other antibodies did not
change significantly.
Page -155-
Immunocytological analyses of these HS subspecies also revealed subtle changes in
localisation in myoblasts as illustrated in fig. 9. In differentiated cultures, HS antibodies
labelled a network which overlaid the cells. This network was more accentuated between
myotubes and myoblast (not shown). In myoblasts, RB4CD12 antibody principally sub
lineated the periphery of cells (fig. 9 A). A04 BO5 and AO4F12 antibodies decorated more
specially cell-to –cell contacts. Whereas AO4F12 was mainly seen in pseudopodia structures,
AO4BO5 was often seen in tight contact between two cells as illustrated (Figure 9 A and
details in B).
Discussion
In the present study, using several methodological approaches for GAG quantification and
analysis, we observed that GAG composition changed in cultures of C2.7 myoblasts shifting
from proliferation to differentiation states. These alterations concerned the overall GAG
content, its distribution between medium and cell layer and its composition. We have shown
indeed that GAGs and more specially HS were increased during differentiation. The key
findings of our study were that the presence in cell environment of RGTA, a GAG mimetic,
which it increased both myoblast proliferation and differentiation, emphasized these changes
either in GAG amount, composition and localisation. Heparin always proved to be less
efficient than RGTA.
The questions of how RGTA would alter GAG synthesis and whether GAG changes are the
causal or the consequences of RGTA effect on proliferation and differentiation are open.
RGTA could act at first extracellularly, as do natural GAGs such as heparan, by increasing
bioavailability of GF and by potentiating GF - mediated proliferation and differentiation.
Interestingly, we have observed, using the same RGTA labelled with FITC, that this molecule
remains several hours in the cellular environment of myoblasts as a dense network (Martelly
unpublished results). From this location, it could mediate growth and also induce phenotypic
changes in cells indirectly via growth factor stimulation. We have previously shown that
RGTA stimulates proliferation of satellite cells in primary cultures and that this effect was
partially caused by FGF2 potentiation RGTA was also shown to partially substitute to hyposulphated GAGs in chlorate-treated cultures and to mediate FGF2 growth response (PapyGarcia et al. 2002). This result could be related to the observation made by others, that
chlorate-induced reduction of sulfation of HS chains of the perlécan proteoglycan in C2C12
myoblasts, reduced their differentiation capacity (Villar et al. 1999). Stimulation of
proliferation has been shown to correlate with an increase in matrix protein ((Porcionatto et
al. 1998) and HSPG ((Weiss and Randour 2002) secretions in endothelial cells. Conversely,
changes in HS sulfation might alter HBGF synthesis and intracellular processing. This has
been demonstrated with bFGF (Sperinde and Nugent 1998).
The original finding of the present study was that GAG mimetics stimulated myoblast growth
and differentiation, along with changes in the natural GAG composition of cellular
environment and that RGTA more specially increased HS amount. We could hypothesised
that RGTA would indirectly modulate GAG pattern, possibly through the protection of
growth factors such as TGFβ or FGF (Meddahi et al. 1996; Meddahi et al. 1996).
TGFβ activity is known since a long time to be regulated by proteoglycans present in the
extracellular matrix and, in turn, to regulate synthesis ECM components (Rapraeger 1989;
Dubaybo and Thet 1990; Ogawa et al. 1990; Rapraeger et al. 1991; Anastassiades et al. 1996;
Nishikawa et al. 2000) Similarly growth factors, including FGF, have been shown to alter HS
composition produced by smooth muscle cells (Emoto et al. 1998; Li et al. 2002).
In addition to that, RGTA could alter expression of enzymes involved in synthesis or
degradation of GAG synthesis. We have presently shown that RGTA did not alter aryl
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sulfatase activity in a sense which could take into account the increase in sulfated GAGs due
to the presence of RGTA. An interesting issue, that we currently explored, is that RGTA
would alter heparanase synthesis or activity (Meddahi personal communication). Such
hypothesis is supported by studies showing that heparin was able to reduce heparanase
activity in CHO cells (Tumova and Bame 1997) and/or may cause a reduced intracellular
degradation of HS through inhibition of endogenous heparinase as in smooth muscle cells
(Potter-Perigo and Wight 1996).
RGTA was observed to enter into cells in vesicles where it remains at least 24 hours. We
cannot excluded that RGTA could further modify phenotypic cells from the intracellular
stores through an unknown mechanism (Martelly et al in preparation), and alter synthesis of
several enzymes involved in GAG synthesis, especially HS. Among these enzymes, the Ndeacetylase/N-sulfotransferase (NDST) isozymes would present a specific interest to study
since all the other modifications of the chain such as O-sulfation and uronic acid
epimerisation depend on NDST activity. Depletion in NDST-1 alters muscle development and
mice knock-out for this enzyme die neonatally due to respiratory distress (Ringvall et al.
2000). Interestingly, the 5’untranslated region (5’-UTR) of mRNAs coding for enzymes
involved in HS synthesis such as NDST and HBGF share in common specific 5’UTR
sequence involved in translational regulation (Grobe et al. 2002). This suggests a
sophisticated regulation at both transcriptional and translational levels of regulating factors
that have the property to stimulate synthesis of HS and molecules that would bind to it.
RGTA would participate to this reciprocal regulation.
The complexity of the system is further emphasized by the fact that HS sub-species revealed
by specific antibodies were differently changed in RGTA or control culture conditions. We
presently have shown indeed that HS antibodies detect different HS subspecies in
differentiating cells stimulated by RGTA. These HS antibodies, recognizing different
epitopes, decorated differently the cells. This suggests sophisticated changes in HS synthesis
during myogenesis. Either by an extra or intra cellular locations, RGTA would participate to
these regulations by altering different set of enzymes involved in HS synthesis.
Taken together, the present result, showing combined effects of RGTA on myoblast growth
and differentiation, through alteration of GAG composition, might be an important insight in
the comprehension of myogenesis process, especially occurring in pathological situation such
as skeletal muscle dystrophy or in muscle repair.
Acknowledgments: This work was partially supported by the Association Française contre
les Myopathies (AFM), by the CNRS and by the Ministry of Foreign Office (Action intégrée
France-Maroc) . I.B. had an AFM grant (n° 8552). We wish to thank Dr E. Planus for
initiation with the basic commands for the LSM 410. Special thanks are addressed to Dr P.
Karasinski and Dr E. Delechelle for their critical reading of image processing methods.
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Page -161-
Legendes to figures
Figure 1 : RGTA structure (D120) used in this study
Figure 2: Effect of RGTA on C2.7 cell growth
A: Effect of different concentrations of RGTA (0.1 to 20 µg/ml) on C2.7 cells proliferation.
Cells were counted at day 4, each value is the mean +/- sd of 4 cultures.
B: Growth of C2.7 myoblasts in the presence of heparin (10µg/ml) or RGTA (0.5µg/ml). At
the indicated times, DNA was measured in cellular extracts. Each point is the mean +/- sd of 3
determinations on 3 cultures.
Figure 3:Effect of RGTA on C2.7 differentiation
A : Aspect of cultures C2.7 grown in high concentration of serum at day 4 without treatment
(1) or in presence of RGTA at 0,5µg/ml (2). C2.7 at 24 hours in differentiation medium
(0,25% SVF+0,25%SC) without treatment (3) or in presence of RGTA at 0,5µg/ml(4)
B: Isoforms and CK activity at day 4 of culture of C2.7 cells. CK specific activity a d
isoenzymes analysis were performed as described in Material and methods.
C: Western blotting of syndecan-1 in differentiating C2.7 cells
Cells were grown in the absence or presence of RGTA (0.5µg/ml) added at day 0 of plating.
At day 4, medium was shifted from high to low containing serum medium and Western blot
analysis for syndecan 1 as described in Materials and methods.
1,2,3 and 4: cellular extracts of control culture performed at 0, 24, 36 and 48 hours after
medium shift, respectively. 5,6,7 and 8: cellular extracts of RGT-treated cultures (0.5 µg/ml)
performed at 0, 24, 36 and 48 hours after medium shift, respectively.
Figure 4: Effect of RGTA on total sulfated GAG in cellular extracts.
Total sulfated GAG determination during proliferation and differentiation in presence or
absence of RGTA 0.5µg/ml were performed with DMMB assay.
A: Total GAG during proliferation of C2.7.
B: Ratio cell/medium of total GAG during proliferation.
C: Total GAG during differentiation of C2.7.
D: Ratio cell/medium of total GAG during differentiation.
Figure 5: Measure of total GAG by HPLC. GAGs were tagged by antranilic acid as detailed
in Materiels and Methodes. The GAGs in samples which were quantitated by HPLC were
normalized by amount of DNA in the culture. The result is in arbitary units of fluorescence.
Figure 6: Aryl sulfatase specific activity in differentiating C2.7 cells.
Aryl sulfatase A (A) and B (B) were assayed in extracts performed at the indicated times after
medium shift to low serum containing medium. Each value is mean +/- sd of duplicated
determinations performed with 3 independent cultures.
Figure 7: Changes in GAG composition induced by RGTA.
HS and CS were measured in cellular extracts of proliferating and differentiating cells in
presence or absence of RGTA 0.5µg/ml. Ratio of HS/CS content in RGTA treated cells versus
controls were calculated. A: HS/CS amounts during proliferation of C2.7; B: HS/CS amounts
in differentiation C2.7.
Figure 8: ELISA assay of HS species extracted from differentiating controls or RGTAtreated cells.
Page -162-
GAGs prepared from differentiating cultures were grafted on BSA and tested in an ELISA
assay using different HS antibodies (RBACD12, AO4BO5 and AO4F12) as described in
Materials and methods.
Figure 9: Immunolocalisation of HS in C2.7 myoblasts using RBACD12, AO4BO5 and
AO4F12 antibodies. Transmission and fluorescence images were obtained by confocal
microscopy and analysed as detailed in Materials and methods. Notice the differential
labelling of HS either at the periphery of cells (RB4CD12) or at cell-cell contacts with the two
other antibodies. AO4BO5 or AO4F12 however labelled differentially cell- to-cell contacts.
Page -163-
Figure 1
O
O
O
O
O
O
O
Page -164-
Figure 2
A
50000
nb of cells/dish
40000
30000
20000
10000
0
C
0,1
0,5
1
5
10
15
20
RGT A µg/ml
70
60
µg DNA/dish
50
control
40
Heparin
RGT A
30
20
10
0
2
3
4
day of culture
Page -165-
5
Figure 3
1
2
3
4
0,50
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
C 0,1 1
5 10 15 20
B
CK spec. activity
(mOD/cell)
% CK isoforms
A
%M
%B
RGTA (µg/ml)
Culture treatment
Page -166-
CK activity
Figure
PROLIFERATING CELLS
DIFFERENTIATING CELLS
0,8
0,6
***
0,4
**
Control
RGT A
0,2
0
3
3.5
4
4.5
**
**
µgGAG/µgDNA
µgGAG/µgDNA
A
0,8
0,6
0,4
Control
0,2
RGTA
0
0
24
38
48
time in differentiating
medium (hours)
5
culture time (days)
D
**
*
6
**
Control
RGT A
3
3.5
4
4.5
5
Total GAG
(ratio
cell/medium)
Total GAG
(ratio cell/medium)
B
6
5
4
3
2
1
0
C
**
*
4
2
0
0
24
38 48
time in differentiating medium
(hours)
culture time (days)
Page -167-
Control
RGT A
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
***
***
Control
RGT A
3
3.5
4
4.5
UAF/µgDNA
UAF/µgDNA
Figure 5
**
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Control
RGT A
0
5
24
time in differentiationg medium
culture times (day)
Page -168-
Figure 6
A
0,06
control
0,04
RGTA
0,02
0
0
24
36
48
times in differentiation medium (hrs)
B
0,5
nmol/hr/µg prot.
nmol/hrs/µg prot.
0,08
0,4
control
0,3
RGTA
0,2
0,1
0
0
24
36
time in differentiation medium (hrs)
Page -169-
48
Figure 7
PROLIFERATING CELLS
3
HS
CS
1
0
3.5
4
4.5
***
***
2
3
B
A
5
Fold increase/control
Fold increase/control
**
DIFFERENTIATING CELLS
3
HS
2
CS
1
0
0
24
38
48
time in differentiating medium
(hours)
culture time (days)
Page -170-
Figure 8
225
200
RB4CD12
AO4BO5
RGTA/Control ( %)
175
A04F12
150
125
100
75
50
25
0
0
24
36
time in differentiation medium (hrs)
Page -171-
48
Figure 9
Page -172-
Document annexes en complément de l’article III
Effet des RGTA sur l’expression des GAG au cours de la prolifération et de la
différenciation de cellules satellites de rat issu de culture primaire
Des cellules satellites de rat après isolement sont mises en culture dans du milieu DMEM
contenant 10 de sérum de cheval et 10% de sérum de veau fœtal. Le RGTA n’est administré
au cellules que deux jours après l’ensemencement. Ce temps de latence correspond au temps
nécessaire afin les cellules satellites puissent adhérer à la structure plastique des boites de
pétri. L’évaluation de la teneur en GAG est réalisée selon le même protocole que pour les
cellules de la lignées C2.7. Cette étude a été réalisé au cours de la différenciation spontannée
des cellules satellites.
Les résultats obtenus montrent une augmentation de la teneur en GAG totaux de 30 à 40% par
rapport à celui obtenu pour les cellules satellites non traitées au RGTA (Figure 1).
Ces résultats comparable à ceux obtenus avec la lignée de cellule C2.7 (cf article III) semblent
confirmer que les deux types cellulaires sont relativement proches. Nous pouvons donc
espérer qu’au niveau d’un muscle, les variations quantitatives et qualitatives des GAG
induites par le RGTA seront du même ordre.
La détection des 3 épitopes de HS au niveau des cellules satellites viennent consolider nos
hypothèses, puisque que nous avons obtenu, là aussi, les mêmes réponses au cours de la
prolifération et la différenciation des deux types cellulaires étudiés (Planche 1).
Figure 1 : Effet des RGTA sur la teneur en GAG au cours de la différenciation spontannée des
(µg GAG/µg DNA)/Témoin
cellules satellites
160
140
120
100
80
60
40
20
0
J4
J7
Jours de culture
Différenciation spontannée
Page -173-
J9
Figure 2 : Marquage immunocytologique des HS sur des cellules satellites de rat en
prolifération et en différenciation.
Myotubes
Myoblastes
RB4CD12
AO4BO5
A04F12
Desmine
Page -174-
Laminine
Devenir des RGTA au niveau intracellulaire.
Au cours de ce travail, nous avons démontée que les RGTA permettent de potentialiser les
facteurs de croissance de type FGF et augmenter la synthèse des GAG totaux et plus
particulièrement des HS au cours de la différenciation in vitro. Ces résultats ne nous
permettent pas de savoir si le RGTA a une action exogène et/ou endogène sur toutes les
variations observées au cours de la myogenèse. Pour cela, à l’aide d’un RGTA marqué à la
fluorescéine, nous avons montré que les RGTA avaient la capacité de pénétrer à l’intérieur de
la cellule. Cette pénétration est supposée être réalisée par un processus d’endocytose comme
c’est le cas pour les HSPG naturels.
Nous avons observé que le RGTA marqué au FITC, forme un feutrage autour des myoblastes
mais pas des myotubes (Planche 2). Ce feutrage persiste au moins une heure, avant que la
molécule ne soit internalisée. Seuls les myoblastes internalisent le RGTA.
L’image correspondant au dextran-FITC indique que le marquage observé au niveau cellulaire
correspond à la présence du RGTA-FITC.
Ces dernières observations permettront peut-être d’observer et de comprendre les mécanismes
par lesquels le RGTA agit sur les facteurs de croissance et les variations observées sur la
teneur et la qualité des GAG au cours de la myogenèse in vitro et in vivo.
Page -175-
Planche 2 : Marquage au RGTA-FITC des cellules satellites à l’état myoblastique et à
l’état de myotube. Observation au microscope confocal (Biorad 1024 MRC).
Dextran-FITC
1hr
6hrs
24hr
s
Page -176-
Etude de l’expression qualitative des ARNm des enzymes de la synthèse des GAG au
cours de la prolifération et de la différenciation myogénique des cellules C2.7
Les résultats observés montrent qu’il est possible dans notre modèle de C2.7 en prolifération
et en différenciation de détecter les différents ARNm codant pour les enzymes impliquées
dans la biosynthèse des HS (). Il serait intéressant de pouvoir quantifier chaque ARNm au
cours des différentes étapes de la myogenèse.
Figure 1 : Détection par RT-PCR des ARNm codant pour les enzymes de la biosynthèse des
GAG au cours de la myogenèse in vitro des cellules C2.7
C2.7
Prolifération
Différenciation
6OST2
C2.7
Prolifération
Différenciation
20ST
C2.7
Prolifération
Différenciatio
C2.7
Prolifération Différenciation
6OST1
NDST1
Page -177-
CHAPITRE IV
Résultats in vivo: Teneur en héparane sulfate au cours de la régénération d’un muscle
écrasé : effet de mimétiques de GAG (RGTA)
The fate of Heparan Sulfate in crush-induced regeneration of the EDL muscle: effect of
glycosaminoglycan mimetics (RGTA)
De nombreuses études portent sur les différentes étapes de la dégénérescence ou de la
régénération des muscles squelettiques à la suite de traumatismes musculaires provoqués ou
de modifications génétiques. Cependant, la chronologie précise d’apparition de différentes
molécules associées à la membrane des cellules ou à la lame basale les entourant n’est pas
clairement établie durant les phénomènes de régénération musculaire.
Dans le chapitre précédent, nous avons montré qu’un traitement de myoblastes par du RGTA
augmente la prolifération, la différenciation de ces cellules. Corrélativement ce traitement
augmente la teneur en GAG et plus particulièrement celle des HS dans les myoblastes en
différenciation (cf. chapitre III).
D’après des travaux antérieurs, il est reconnu que l’injection de RGTA permet de stimuler la
régénération d’un muscle écrasé (EDL et Soléaire) et d’améliorer la qualité de sa
reconstruction tissulaire (Gautron et al. 1995; Aamiri et al. 1995(b); Desgranges et al. 1999).
Ces molécules améliorent aussi la qualité de la réinnervation (Aamiri et al., 1995 a).
Dans ce contexte, il a paru intéressant de savoir si in vivo, lors de la régénération musculaire,
des variations de teneur en GAG pouvaient être observées et comparées à celles détectées au
cours de la différenciation in vitro des myoblastes.
Notre étude utilise le modèle de régénération établie par Bassaglia et Gautron (Bassaglia and
Gautron 1995). Celui-ci consiste à provoquer une dégénérescence musculaire mécaniquement
par écrasement du muscle à l’aide d’une pince de Pean (cf Matériels et Méthodes). Le muscle,
bien qu’entièrement écrasé de tendon à tendon et totalement dénervé, conserve un périmisium
intact. Par contre, les basales entourant les fibres musculaires sont altérées par l’écrasement.
Page -178-
Nous avons déterminé la quantité de GAG présente dans un muscle EDL intact, et dans un
EDL au cours des différentes phases de dégénérescence et de régénération. Compte tenu du
fait que les RGTA augmentent la teneur en GAG dans l’environnement cellulaire des
myoblastes en culture, nous avons aussi cherché à savoir si le RGTA injecté dans le muscle
in vivo modifiait la teneur en GAG par rapport à celle d’un muscle en régénération non traité.
Au cours des premiers jours après la lésion, correspondant à une myolyse accompagnée
d’une réaction inflammatoire, la quantité totale de GAG chute de façon considérable dans le
muscle blessé. Il faut remarquer qu’une diminution de GAG totaux est aussi observée au
niveau du muscle contralatéral non lésé. Cette diminution est transitoire et le muscle retrouve
rapidement les teneurs en GAG trouvées dans un muscle intact d’un animal non opéré.
Durant la phase de régénération, la quantité de GAG totaux augmente à un niveau 3 fois
supérieur à celui observé dans un muscle intact aux jours 5 et 21 (Figure 1). Un changement
dans la qualité des GAGs se produit au cours de cette phase de reconstruction. Les CS
majoritaires au cours des 9 premiers jours après la lésion, deviennent minoritaires, au profit
des HS jusqu’au 31ème jour de régénération.
L’injection in situ de RGTA le jour de l’écrasement augmente d’un facteur 2, par rapport au
témoin, la quantité de GAG totaux observée dans les muscles en régénération. Les RGTA
semble avoir un effet sur les proportions en CS et HS. Effectivement, nous pouvons observer
que l’augmentation des GAG totaux durant les premiers jours de régénération est
essentiellement due à une augmentation des CS. Cette tendance s’inverse à partir du 9ème et
jusqu’ a la fin de la période de régénération. C’est la période correspondant à la formation des
nouveaux myotubes qui donneront par la suite les nouvelles fibres.
L’étude immunocytologique d’un épitope de HS testé sur les coupes de muscles EDL
correspondant à 15 jours de régénération. Le marquage montre une expression accrue de HS,
répartie de manière uniforme sur toute la coupe, pour les muscles traités au RGTA. A
l’inverse, le témoin ne présente qu’un faible marquage pour l’épitope de HS testé. De plus,
nous pouvons observer que les HS sont localisés autour des vaisseaux sanguins et non autour
des fibres musculaires nouvellement formées (Figure 3). Les autres anticorps anti HS ont
aussi été testé sur des temps de régénération différents et correspondant au dosage des GAG
réalisé par le DMMB. Nous avons observé qu’au jours trois, il y avait absence total de
Page -179-
marquage. Ce résultat confirme donc celui obtenu lors de la quantification des GAG par le
DMMB. En ce qui concerne le temps intermédiaire (9 jours), nous avons observé une
augmentation du marquage des HS. Ceux ci semblent avoir une localisation spécifique à
chaque type d’épitope testés.
Page -180-
Figure 1 : Variation de la teneur en GAG au cours de la régénération musculaire, proportion
de HS et CS correspondant
Ecr = muscle écrasé
NE= muscle contralatéral
non écrasé
Cinétique GAG Totaux, HS,CS
2
[GAG]µg/mg poids frais
1,8
1,6
1,4
GAG TOTAUX
1,2
1
CS
0,8
HS
0,6
0,4
0,2
E
J4 E
N
E
J5
N
E
J6
N
E
J8
N
E
J9
N
J2 E
1
N
J2 E
6
N
J3 E
1
N
E
N
J3
J1
N
L
ED
Ec
r
J9
Ec
r
J8
Ec
r
J6
Ec
r
J5
Ec
r
J4
Ec
r
J3
J1
E
J2 cr
1
E
J2 cr
6
E
J3 cr
1
Ec
r
0
muscle sain
Figure N°2 : Effet des RGTA sur les variations de la teneur en GAG, HS et CS au cours de la
régénération musculaire.
Variation de l'expression des HS et CS au cours de la
régénération musculaire en présence de RGTA
([HS, CS]µg/µg DNA) /
Témoin
600
500
400
300
200
CS
100
HS
0
J3
J8
J15
Muscle écrasé
Jours de régénération
Page -181-
J8
J15
Contralatéral
Figure N°3 Immunocytochimie d’un épitope de HS ( RB4CD12) à trois temps de
régénération.
Muscle EDL intact
Muscle en
régénération
Témoin
à 15 jours
Traité RGTA
à 15 jours
Page -182-
DISCUSSION ET CONCLUSION
Page -183-
Rappels de la problématique et des principaux résultats
Les muscles squelettiques adultes possèdent une capacité remarquable de se régénérer après
une lésion qui peut être de nature accidentelle, génétique ou provoquée expérimentalement.
Cette propriété d’auto réparation est due à l’existence d’une population cellulaire à potentiel
myogénique, les cellules satellites (Mauro 1961). Ces cellules quiescentes, dans un muscle
sain, s’activent, prolifèrent, migrent, fusionnent en myotubes et se différencient en nouvelles
fibres musculaires dans un muscle lésé. Ces différentes étapes sont sous le contrôle de
nombreux de facteurs de croissances (FGF, SF-HGF, TGFβ, IGF, PDGF….) ainsi que des
facteurs de régulations myogénique (MRF). Il a été évoqué depuis peu la participation de
cellules souches multipotentes d’origines diverses, hématopoïetique et même osseuse,
neuronales ou dermique dans la régénération musculaire (Ferrari et al. 1998 ; Beauchamp et
al. 1999 ; Goldring et al. 2002).
La plupart des facteurs de croissance impliqués dans la réparation musculaire ont la capacité
d’interagir avec l’héparine ou la partie glycosidique des PG (Roghani et al. 1994 ; Husmann
et al. 1996 ; Turnbull et al. 2001), d’où le nom d’HBGF donné à ces facteurs de croissance.
Par exemple, le FGF2, l’un des facteurs le plus étudié dans la myogenèse, qui stimule la
prolifération des myoblastes, interagit avec les GAG de type HS des PG. Effectivement, il a
été démontré que les HS interviennent dans la dimérisation du FGF favorisant ainsi la
formation du complexe ternaire HS/FGF/FGFR (Turnbull et al. 2001).
Durant ces dernières années, nous avons vu apparaître un nombre croissant de myopathies
touchant un bon nombre de protéines de la MEC des muscles squelettiques, mais aussi les
HSPG présents à la surface cellulaire ou au niveau de la lame basale. Ceci souligne
l’importance de ces molécules pour le maintien de l’intégrité du muscle. De nombreuses
données bibliographiques montrent un rôle croissant des protéoglycannes membranaires ou
matriciels au cours du développement et de la régénération musculaire (Carrino 1998 ;
Cornelison et al. 2001 ; Velleman 1999, Osses and Brandan 2002, Olguin et al. 2003). Ainsi,
la synthèse des PG est augmentée dans les muscles de souris mdx (Caceres et al. 2000). De
plus, les cellules satellites de ces souris expriment un taux élevé de HSPG (Crisona et al.
1998), ce qui suggèrent un rôle important des HSPG dans la myogenèse. Il est généralement
admis que la partie GAG des PG confère un environnement cellulaire favorable à la
myogenèse. Toute tentative visant à maintenir l’intégrité de l’environnement cellulaire en
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GAG dans un contexte de muscle en régénération permettrait peut-être d’améliorer l’efficacité
des thérapies génique et cellulaire préconisées dans le cas de pathologies neuromusculaire.
Notre travail se situe dans cette perspective.
Des polysaccharides dérivés de dextranes, nommée RGTA pour ReGeneRaTing Agents ont
été synthétisés. Ils sont constitués dextrane substitués par différents types de groupements
comme des carboxyméthyles, des sulfates ou des benzylamines. Ils ont une structure
moléculaire proche des HS ou de l’héparine (Papy et al, non publié). Ces RGTA présentent
des propriétés semblables à celles de l’héparine mais sont dépourvus d’activité
anticoagulante.
Des travaux du laboratoire ont montré que les RGTA ont des effets potentialisateurs vis à vis
des facteurs de croissances de type HBGF (Tardieu et al. 1992) ainsi que des effets
protecteurs contre des dégradations protéolytiques des HBGF occasionnées par différentes
enzymes protéolytiques (Meddahi et al. 1995). Les RGTA améliorent la réparation de
nombreux tissus in vivo, comme la peau (Meddahi et al. 1996), les os (Blanquaert et al.
1995), le colon (Meddahi et al. 1996), la cornée (Fredj-Reygrobellet et al. 1994). De plus, ils
modulent les enzymes de l’inflammation telles que l’élastase leucocytaire, la plasmine
(Meddahi et al. 1996, Ledoux et al. 2000), pouvant jouer un rôle dans le remodelage de la
matrice extracellulaire (MEC) des tissus lésés (Desgranges et al. 1999). L’injection de RGTA
in vivo, dans un modèle d’écrasement musculaire (Gautron et al. 1995) ou d’ischémie a
montré une amélioration de la régénération musculaire dans ces deux modèles.
Compte tenu de la structure moléculaire des RGTA d’une part, de l’effet de ces molécules sur
les facteurs de croissance et de leur action sur les enzymes de l’inflammation d’autre part, les
RGTA ont été définis comme étant des mimétiques de synthèse des HS.
Le travail présenté a pour but d’apporter des éléments de compréhension sur les effets du
RGTA au cours de la myogenèse. Les résultats obtenus sur la régénération musculaire
suggèrent que les RGTA ont une action sur les cellules d’origine myoblastiques et sur les
mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération musculaire.
Dans un premier temps, nous avons monté que les RGTA stimulent la prolifération et la
différenciation des cellules myogéniques (cellules satellites et cellules C2.7)(cf chapitres I et
III). L’effet stimulateur des RGTA sur la prolifération cellulaire est lié à la présence des
groupements sulfates sur ces molécules. De plus, les RGTA potentialisent le FGF2 et peuvent
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se substituer partiellement aux GAG naturels hyposulfatés par un traitement des cellules au
chlorate en permettant la prolifération des cellules en présence de FGF2 (Papy-Garcia et al.
2002). Ces observations sont à rapprocher des résultats obtenus avec d’autres types
cellulaires. La prolifération des cellules humaines MCF7 est stimulée par le FGF2.
L’hyposulfatation des HS induite par le chlorate abolit cet effet. L’ajout d’HS exogène rétablit
l’effet prolifératif du FGF2 (Delehedde et al. 1996). Par contre, les cellules MDA à fort
potentiel tumoral qui expriment davantage de GAG que les MCF7 réagissent au FGF2 de
manière opposée. L’effet du chlorate favorise la prolifération des cellules MDA (Delehedde et
al. 1996, Fernig et al. 2000). Ceci suggère que la présence de HS ainsi que leur taux de
sulfatation est déterminant dans l’interaction avec le FGF2 et conditionnent la réponse
cellulaire (Figure 48). Dans notre modèle de cellules myogéniques, les RGTA peuvent se
substituer aux GAG naturels et favoriser l’effet du FGF2 sur la prolifération. Ainsi, les RGTA
analogues de structure des HS naturels, sont aussi des analogues fonctionnels des HS. En
effet, d’autres études au sein de notre laboratoire ont montré que les RGTA, comme les HS
naturels, favorisaient la dimérisation du FGF2 (Rouet, communication personnelle).
Bien que la nature et la quantité de GAG semblent déterminants dans les régulations de la
myogenèse, il existe très peu de données concernant l’évolution des GAG au cours de la
prolifération et de la différenciation des myoblastes in vitro et in vivo.
Nous avons essayé de déterminer, au cours de la myogenèse in vitro et de la régénération
musculaire in vivo, les variations qualitatives et quantitatives des GAG présents à la surface
des cellules et dans leur environnement, en absence et en présence de RGTA.
In vitro, au cours de la prolifération des cellules C2.7 le taux de GAG totaux sulfatés ne varie
pas de façon significative. Ces GAG contiennent des quantités équivalente de HS et de CS.
Au cours de la différenciation et dans des conditions témoins, la quantité de GAG totaux
augmente d’environ 80%, la proportion de HS est nettement supérieur à celle des CS. Le
traitement par les RGTA augmente encore plus cette teneur en GAG totaux. Cette
augmentation concerne essentiellement les HS.
La différenciation des myoblastes en myotubes est aussi plus précoce en présence de RGTA
selon des critères morphologiques et biochimiques. Il y a une corrélation entre l’effet
stimulateur des RGTA sur la teneur en GAG, et plus particulièrement en HS, et l’effet sur la
prolifération et la différenciation (Barbosa et al., soumis).
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In vivo, au cours de la régénération de l’EDL, des changements qualitatifs et quantitatifs des
GAG sulfatés sont observés. Comme in vitro, le traitement au RGTA des muscles écrasés,
augmente la teneur en GAG totaux au cours de la régénération et en particulier celle des HS
au cours de la phase de reconstruction.
Validité des modèles et des techniques utilisés.
Les résultats obtenus in vivo et in vitro n’ont d’intérêt que si les modèles et techniques
utilisées présentent une certaine pertinence par rapport aux objectifs scientifiques.
Le modèle expérimental in vitro qui a été principalement choisi dans cette étude est celui des
cultures primaires des cellules satellites de rat. Le principal inconvénient des cultures primaire
est le risque de contamination avec des fibroblastes. Les cellules satellites sont très fragiles et
ont un démarrage lent en culture cellulaire. A l’inverse les fibroblastes s’adaptent très
rapidement aux conditions de culture cellulaire et risquent d’envahir les cultures. La méthode
d’extraction des cellules satellites a été mise au point au laboratoire et consiste à utiliser de la
pronase, cette enzyme permet une digestion des fibres musculaires par l’intérieur et libère les
cellules satellites sans altérer les autres tissus dans lequel se trouve les fibroblastes (Lagord et
al. 1993).
Au terme de l’extraction la pureté des cellules satellites à été vérifié par l’estimation du degré
de myogénicité sur des cultures de type clonale (Lassalle et al., 1989). De plus, les cellules
satellites isolées expriment à 97% la desmine, marqueur caractéristique des cellules
myoblastiques. Ces observations permettent de s’assurer de la qualité des cultures primaires.
Différentes lignées de myoblastes sont disponibles au laboratoire : les cellules L6, les Sol 8 et
les C2. Sachant que la lignée cellulaire L6 est dépourvu de récepteurs aux FGF et que la
lignée cellulaire Sol 8 est dépourvue de dystrophine, ces deux lignés présentaient donc des
caractéristiques trop éloignées des cellules satellites en cultures primaires. La lignée C2 et
plus particulièrement les C2.7, semble la mieux adaptée à notre étude.
Les cellules C2.7 ont été obtenues par Pinset et Montarras en1988 (Pinset et al. 1988). Se sont
des sous clones de myoblastes de souris C2 isolées initialement par Yaffé et Saxel (Yaffe and
Saxel 1977). Les cellules C2 possèdent des caractères de myoblastes semblable à ceux des
cellules satellites en culture primaire. L’avantage de l’utilisation de ces cellules par rapport
aux cultures primaire est de pouvoir travailler sur une lignée cellulaire à croissance cellulaire
rapide et non limitée.
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Il est clair que d’autres modèles cellulaires auraient pu être développés dans notre
problématique. Effectivement, nous n’avons utilisé que des cellules primaires provenant de
rats jeunes et des lignées cellulaires de souris. Dans les modèles murins ou humain, la
capacité à proliférer, des myoblastes issus de sujets âgés est diminuée. Il serait donc
intéressant de voir si les RGTA peuvent ralentir la sénescence de ces myoblastes en stimulant
leur croissance et leur différenciation, notamment en stimulant la synthèse des GAG.
L’identification de la composition en GAG pourrait être un paramètre supplémentaire dans
l’étude du vieillissement cellulaire.
De même, il serait intéressant d’étudier des cellules provenant de muscles dystrophiques, tels
que ceux provenant de souris mdx. Nous savons que la synthèse des protéoglycannes est
augmentée dans ces muscles (Caceres et al. 2000). D’après nos résultats obtenus chez le rat,
l’augmentation des HSPG dans les muscles mdx pourrait être associée aux vagues de
régénération qui les caractérisent. Il n’en reste pas moins que la qualité des HSPG et des
GAGs associés pourrait être altérée chez ces souris mdx. Un traitement aux RGTA pourrait
avoir un effet sur quantité et la qualité des HS synthétisés L’utilisation des anticorps anti-HS
(Jenniskens et al. 2000 ;Jenniskens et al. 2002a) permettrait de détecter des différences
éventuelles dans la qualité des HS présents chez les mdx traités ou non au RGTA.
Enfin, il serait nécessaire de connaître les effets des RGTA sur la prolifération, la
différenciation et la synthèse des constituants matriciels par les cellules satellites provenant de
biopsies musculaires humaines. Ceci serait un préalable à l’utilisation éventuelle de ces
molécules comme traitement complémentaire ou substitutif à des thérapies musculaires.
L’étude in vivo de l’effet des RGTA sur la composition et les variations en GAG au cours de
la régénération à été effectuée sur deux types de muscle, l’EDL et Soléaire, après écrasement
exhaustif et dénervation. Le protocole d’écrasement des muscles à été mis au point au
laboratoire par Yann Bassaglia et Jean Gautron en 1995. Contrairement à l’utilisation de
drogue (notexine) utilisé par beaucoup qui induit une myolyse mais qui laisse intacte la lame
basale, l’écrasement et la dénervation provoque une altération des basales des fibres
musculaires. Ce modèle permet donc d’étudier les variations de composition en GAG et leurs
rôles au cours de la reconstruction de la lame basale et de la régénération du tissu musculaire.
De plus, chez le rat, les muscles EDL et Soléaire présentent des phénotypes rapides et lents
respectivement beaucoup plus marqué que chez la souris, ils possèdent aussi des
caractéristiques différentes de régénération (Bassaglia and Gautron 1995). Ces particularités
peuvent être intéressantes dans l’étude des effets RGTA sur la régénération.
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Une partie du travail présenté concerne les muscles en régénération traitée par une injection
unique de RGTA effectuée le jour de l’écrasement. L’injection des RGTA pourrait se faire
également par voie intra-musculaire (IM), par voie intra péritonéale (IP) ou par voie intraveineuse (IV). Des études pharmacologiques ont montré que les RGTA radioactifs injectés
par voie IM ou in situ se fixent au niveau des sites de la lésion musculaire. Stables et non
dégradés au niveau de la lésion, les RGTA en excès sont rapidement éliminés (Meddahi et al.
2002). Il est raisonnable de penser que la qualité de la régénération dépend d’événements
précoces qui suivent l’écrasement. Nos résultats montrent que la teneur en GAG s’effondre
durant les premiers jour après la blessure. La présence des RGTA à ce moment compenserait
la perte de GAG naturel et favoriserait l’activation des cellules satellites. C’est pourquoi ce
traitement précoce des muscles écrasés a été préféré à un traitement plus tardif.
Une grande partie de ce travail concerne la quantification des différents GAG au cours de la
myogenèse.
Les techniques d’extractions et de séparation des GAG exposées dans la littérature ont peu
évolué depuis les années 80 (Takahashi et al., 1985, Volpi et al., 1993). Dans la plupart des
techniques, l’extraction des GAG totaux est réalisée suite à une digestion enzymatique par la
papaïne. Les extraits digérés sont ensuite traités à l’acétone afin d’éliminer les protéines et les
lipides puis précipitées 2 à 3 fois à l’éthanol afin de récupérer les GAG totaux.
La séparation des GAG est par la suite réalisée par électrophorèse en gel d’agarose suivit
d’une coloration du gel au bleue d’Alcian ou à l’Azure A (van de Lest et al. 1994). Si les
GAG ont été marqué préalablement au 35S-sulfate de sodium et à la 3H-glucosamine, chaque
bande présente sur le gel, et correspondant à un type de GAG, est découpée et la quantité de
radioactivité est dosée. Récemment, la sensibilité de cette type de technique a été amélioré,
mais la procédure reste toujours fastidieuse dans sa réalisation (Volpi and Maccari 2002).
En complément de l’analyse électrophorétique, les GAG totaux sont quantifiés par une
succession de colonnes chromatographiques d’échangeuse d’anions et de gel filtration. Les
différentes espèces de GAG sont déterminées après à un traitement enzymatique par les
chondroïtinase ABC et l’héparitinase.
Dans notre modèle, le traitement à la papaïne ne semblait pas être suffisant pour digérer les
extraits musculaires riches en protéines. De plus les précipitations successives à l’éthanol
provoquent une perte avoisinant les 50% du matériel total extrait des muscles. D’autre part, il
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était impossible par cette méthode de détecter les GAG totaux extraits à partir des cellules
satellites.
Afin de contourner ces difficultés, nous avons mis au point une technique d’extraction basée
sur l’utilisation de la protéinase K, enzyme puissante, qui permet de digérer totalement tous
types de tissus. Le traitement à la protéinase K permet de dégrader de façon exhaustive les
protéines et libérer les GAG qui peuvent être quantifiés sans précipitation préalable à
l’éthanol. La protéinase K permet aussi de neutraliser les enzymes de dégradation des GAG
éventuellement présentes dans les extraits cellulaires et tissulaires.
Les méthodes d’analyses quantitatives des GAG totaux utilisées et mises au point au cours de
ce travail sont simples, sensibles et reproductibles. Ces techniques regroupent la
quantification des GAG sulfaté par le DMMB et la quantification par HPLC des GAG
marqués à l’acide anthranilique. La quantification par le DMMB se base sur une interaction
entre le composé chimique et les sulfates présents sur les chaînes de GAG. Cette méthode est
applicable au dosage des GAG résistants à l’acide nitreux (CS). La quantification par HPLC
est basée sur l’évaluation de la quantité d’acide anthranilique fixé à l’extrémité réductrice des
GAG. Cette quantité reflète le nombre de chaînes de GAG, quelles soient ou non sulfatés.
La quantification et la qualification des GAG obtenus par la technique du DMMB après
l’acide nitreux doit être confirmées par une analyse par les deux méthodes après des
traitements enzymatiques à la chondroïtinase et/ou à l’héparanase des GAG totaux.
La connaissance des variations d’espèces de GAG doit être complétée par la détermination
des cœurs protéique auxquels ils sont associés. Ce travail n’a été que partiellement initié.
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Mécanismes d’action possibles des RGTA
Les principaux résultats obtenus in vivo et in vitro en présence de RGTA montrent un effet de
ces molécules sur la myogenèse d’une part, et sur la teneur en GAG d’autre part.
La première explication, et la plus étayé par de nombreux résultats obtenus au laboratoire, est
que les RGTA interagissent avec les facteurs de croissance de type HBGF. Parmi les HBGF,
les effets du RGTA sur le FGF2 ont été discutés (voir plus haut).
Dans un modèle de cellules musculaire lisses irradiées, les RGTA diminuent la synthèse de
collagène fibrotique. Cet effet est associé à une diminution du TGFβ1 dans l’environnement
cellulaire (Alexakis et al. 2001). Transposé au modèle myogénique, ces résultats permettent
de supposer que les RGTA pourraient aussi favoriser la différenciation en diminuant le TGFβ
membranaire. L’une des raisons de cette diminution pourrait provenir de l’augmentation des
HS induite par le RGTA. On sait en effet que le TGFβ est essentiellement affin aux PG de
type CS (décorine)( Riquelme et al. 2001).
Les RGTA in vivo accélèrent et améliore la régénération des muscles EDL et soléaire dans le
modèle de l’écrasement. Des observations immunocytologiques réalisée à des temps précoces
de régénération sur des coupes de muscles EDL et solaire écrasés, ont montré une disparition
de HS naturels identifiés par des anticorps anti HS reconnaissant différents épitopes de ces
GAG (cf chapitre IV). Les RGTA administrés au moment de la blessure remplaceraient ces
HS naturels permettant une meilleure régénération de ces muscles. Il serait donc intéressant
de pouvoir réaliser, sur des coupes de muscle en régénération, une co-localisation entre le
FGF2 et les HS naturels et/ou de leurs mimétiques de synthèse.
Des études au laboratoire ont montré que les RGTA inhibent les enzymes impliquées dans des
réactions inflammatoires (Meddahi et al. 1995; Ledoux et al. 2000) ou l’élastase leucocytaire
(Meddahi et al. 1996) et résistent à la dégradation enzymatique occasionnée par les
héparitinases.
Une autre hypothèse permettant d’expliquer l’augmentation des HS par les RGTA implique
un effet de ces molécules sur les enzymes agissant sur la dégradation des GAG telles que les
sulfatases et l’héparanases. Très peu de données bibliographiques sont disponibles concernant
les sulfatases. Dans un modèle de peau de rat, une diminution de l’activité aryl sulfatase B est
corrélé avec une diminution de la synthèse des GAG (Cechowska-Pasko et al. 2002). Nos
résultats sur les cellules C2.7 montrent que le traitement par RGTA ne modifie pas les
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activités aryl sulfatases A et B. Ceci indique que la régulation de l’expression de ces enzymes
n’est pas liée à l’action des molécules de type HS contrairement au modèle de peau de rat.
En ce qui concerne l’héparanase, il a été reporté que pour être cette enzyme l’héparanase doit
subir une maturation protéolytique. Il est généralement admis que cette protéolyse se produit
dans les vésicules d’endocytose Un excès d’héparine dans des cultures de fibroblastes inhibe
l’endocytose de l’héparanase et par conséquent empêche son activation. (Nadav et al. 2002).
De la même manière l’héparine provoque une accumulation des HS dans des cellules
musculaires lisses par une inhibition des héparanases endogènes (Potter-Perigo and Wight
1996). De plus les interactions entre le FGF2 et les HS empêchent la dégradation des GAG
par l’héparanase de CHO (Tumova and Bame 1997). De la même manière, il a été montré
récemment que les RGTA inhibent l’activité enzymatique de l’héparanase (Medhahi et al., en
préparation)(Figure n°49). En se basant sur ces observations, nous pouvons penser que les
RGTA, grâce à leur similitude structurale et fonctionnelle avec l’héparine, agissent de la
même manière pour inhiber l’héparanase dans les cellules musculaires. Dans ce contexte,
l’augmentation des HS observée dans le modèle cellulaire C2.7 pourrait être liée
effectivement à l’inhibition de l’héparanase.
Les RGTA augmentent la teneur en GAG totaux in vivo et in vitro. Cette augmentation est
essentiellement liée à une augmentation des HS. L’une des hypothèses serait que les RGTA
agissent directement sur la stimulation de la voie de synthèse de ces GAG. Parmi les enzymes
impliquées dans la synthèses des HS, les EXT sont déterminantes et pourraient être
augmentés par les RGTA (Figure n°49). Une augmentation de HS impliquerait aussi
l’augmentation des NDST. Celles-ci pourraient être sur-exprimées suite à l’augmentation des
EXT spécifiques. En effet, de nombreuses enzymes codant pour des protéines impliquées
dans la synthèse des HS présentent une similitude de structure dans les régions 5’UTR (5’
Untranslated region) des ARNm. Il a été suggéré l’existence d’une régulation coordonnée de
l’expression des EXT et des NDST. D’après Grobe et Esko, cette régulation se ferait au
niveau traductionnel via les régions 5’-UTR spécifiques présentes au niveau des ARNm
codant pour toutes ces protéines (Grobe and Esko 2002). Cette même étude suggère une
régulation coordonnée non seulement des enzymes impliquées dans la synthèse des HS mais
aussi desmolécules interagissant avec les HS à savoir les HSPG et les facteurs de croissance
eux même.
Dans cette hypothèse, les RGTA pourraient avoir un effet sur la régulation coordonnée de
l’expression des enzymes impliquées dans la synthèse des HS et aussi au niveau de
l’expression des corps protéiques des HSPG. Nous pourrions alors prolonger la présente étude
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par une analyse au niveau des transcrits et des protéines de ces enzymes et des HSPG. Des
résultats préliminaires obtenus par RT-PCR montrent qu’il est possible de détecter les
transcrits des différentes isoformes de NDST et d’OST dans notre modèle cellulaire de C2.7.
Il n’existe pas actuellement de sonde disponible pour les EXT. Des études quantitatives de
l’expression de ces ces enzymes au cours de la myogenèse restent à faire.
Le mécanisme par lequel les RGTA pourraient réguler de manière coordonnée l’expression de
ces différentes protéines est encore inconnue. Cette régulation pourrait être indirecte via des
facteurs de croissance. Cependant, des résultats récents
montrent que les RGTA sont
internalisés par endocytose par des myoblastes pré-fussionnels (Martelly et al, en
préparation). Plus directement, à partir de ses vésicules d’endocytose, les RGTA pourraient
être transférés dans le Golgi et ainsi moduler l’activité de ces enzymes.
Les résultats présentés, montrant un effet combiné des RGTA sur la croissance et la
différenciation des myoblastes et sur la composition des GAG, apportent des informations
originales sur les mécanismes de la myogenèse. Les RGTA pourraient représenter un outil
thérapeutique potentiellement intéressant dans les cas de pathologies musculaires.
Les effets possibles des RGTA sont repris dans deux schémas récapitulatifs à la suite de cette
discussion.
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Figure n° 49 : Effets possibles du RGTA sur le catabolisme (1 et 1’) et l’anabolisme (2 et 3)
des protéoglycannes et des glycosaminoglycannes.
Les cœurs protéiques des protéoglycannes synthétisés au niveau du réticulum transitent par le
Golgi Cis et Médian. Les GAG subissent ensuite une élongation et une maturation dans le
Golgi Trans pour être véhiculés par la suite vers la membrane plasmique par exocytose. Le
turnover des protéoglycannes et de ses GAG associés se poursuit par une endocytose de ces
derniers puis seront dégradés par les endoglycosidase dans des endosomes actif ou des
lysosomes. Les monosaccharides et les sulfates libres ainsi libérés seront par la suite recyclé
dans le trans Golgi où ils seront les éléments constitutif d’une nouvelle synthèse de GAG.
1) Dans le milieu extracellulaire, les protéoglycannes ancrés aux membranes plasmiques
et leurs GAG associés peuvent être partiellement dégradés
par de l’héparanase
exogène avant d’être exocytés ou non dans la cellule. Dans le cas d’une dégradation
exogène excessive, les PG et les GAG sont alors incapable d’interagir avec des
facteurs de croissance, par exemple. La présence de RGTA dans le milieu
extracellulaire peut réduire l’activité endoglycosidique de cette enzyme.
1’) Dans des conditions de catabolisme normal, les PG et leurs GAG associés sont
endocytés dans des endosomes. Les molécules de RGTA peuvent être endocytées
simultanément pourrait réduire la dégradation de ces derniers. Ainsi, des fragments moins
dégradés ainsi que du RGTA se retrouvent dans le Golgi Trans.
Les RGTA peuvent ainsi modifier le turnover des GAG-PG aussi bien dans le milieu
extracellulaire que dans le milieu intracellulaire.
2) Véhiculé dans le Golgi Trans, les RGTA peuvent aussi avoir une action directe sur
l’activité des enzymes impliqué dans l’élongation et la maturation des GAG, soit les
EXT, les NDST ou les OST.
3) Par un mécanisme indirect, les RGTA permettrait peut être une régulation positive de
la traduction des messagers des enzymes de synthèse des GAG (EXT, NDST, OST) et
de certains facteurs de croissance (FGF) via les séquences 5’UTR présentent au niveau
des mRNA de ces enzymes (Grobe and Esko 2002).
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5346-50.
Yayon, A., M. Klagsbrun, et al. (1991). "Cell surface, heparin-like molecules are required for
binding of basic fibroblast growth factor to its high affinity receptor." Cell 64(4): 841-8.
Zabludoff, S. D., M. Csete, et al. (1998). "p27Kip1 is expressed transiently in developing
myotomes and enhances myogenesis." Cell Growth Differ 9(1): 1-11.
Zapf, J. (1995). "Physiological role of the insulin-like growth factor binding proteins." Eur J
Endocrinol 132(6): 645-54.
Zentella, A. and J. Massague (1992). "Transforming growth factor beta induces myoblast
differentiation in the presence of mitogens." Proc Natl Acad Sci U S A 89(11): 5176-80.
Page -216-
ANNEXES
Page -217-
Milieux d’isolement des cellules satellites
Le milieu d’extraction et d’isolement utilisé pour les cellules satellites est le Ham’s F12, Lglutamine1% tamponné par de l’hépes 10 mM (pH 7,3). A ce milieu est ajouté des
antibiotiques (pénicilline/streotomycine 1% final (Gibco)) et des antifongiques (fongizone
0,1% final (Gibco)) afin de diminuer toutes les contaminations lié au culture primaire.
Milieux de culture des différents types cellulaires (cellules satellites et C2.7)
Milieu de Dulbecco modifié (DMEM, Gibco)
rouge de phénol
L-Glutamine 4mM
glucose 1g/l
Penicilline/streotomycine 1% (Gibco)
Fongizone 0,1% (Gibco)
Sérum de veau foetal 10% (Gibco)
Sérum de cheval 10%
Milieux de différenciation
Milieu de Dulbecco modifié (DMEM, Gibco)
rouge de phénol
L-Glutamine 4mM
glucose 1g/l
Penicilline/streotomycine 1% (Gibco)
Fongizone 0,1% (Gibco)
Sérum de veau foetal 0,25% (Gibco)
Sérum de cheval 0,25%
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Tampon d’extraction pour le dosage de l’ADN par la technique de DAPI
Tampon Tris HCl 10 mM contenant :
NaCl 100 mM
EDTA 10 mM
QSP 1 litre
pH = 7
Pour la quantification de l’ADN, la solution de DAPI doit être utilisée à 150 ng /ml.
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Procedure for Extraction of RNA and HS from Tissues
1. Grind tissue in Trizol reagent (1 ml per 100 mg of tissue or 1 ml per 10cm2 dish or 1 ml
per 5 x 106 cells in a pellet)
2. Incubate samples 5 minutes at R.T.
3. Add 0.2 ml of chloroform per 1 ml original trizol reagent used.
Shake vigorously for 15 seconds
5. Incubate 2-3 minutes at R.T.
6. Centrifuge at no more than 12000xg for 15 minutes at 4°C
7. Remove upper, aqueous phase, do not remove the organic phase or the proteinaceous
interphase.
8. Add to aqueous phase 0.5 ml of isopropanol per ml of Trizol originally used
9. Mix, centrifuge at 12000xg for 10 minutes at 4°C. Pellet contains RNA
10. Wash RNA pellet once with 1 ml 75% ethanol per ml Trizol originally used. Mix by
vortexing and centrifuge at 7500 x g for 5 minutes at 4°C
11. Air dry pellet for 10 minutes, store -70°C or redissolve in dH2O and store at -70°C
RT PCR using Invitrogen Superscript II RT and Taq DNA polymerase
1. Determine concentration of RNA
Set Spec to 260 nm
Measure OD
An OD of 1=40 ug/ml of RNA
Determine concentration of RNA based on above and any dilution factors e.g an OD of 0.4
was obtained for a sample that was diluted 1:10 from the original RNA sample. So
0.4x40=10 ug/ml. 10ug/ml x 10 (dilution factor)= 100 ug/ml
2. RT reaction
a. Add the following to a PCR tube
RNA (1 µg) ?
Oligo dT primer 1µl
dNTP 1µl
dH2O
up to 12 µl
Incubate at 65C for 5 minutes
Immediately chill on ice
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b. Add the following to the above
5x reaction buffer 4µl
DTT 2µl
RNAase inhibitor 1µl
Incubate at 42C for 2 minutes
c. Add the following to the above
Superscript 2 RT 1µl
Incubate 42C for 50 minutes then 70C for 15 minutes
3. PCR reaction
Add the following to a PCR tube (* can be made in a master mix); scale can also be halved
to give 25λ reactions
*10x buffer minus Mg 5µl
*10 mM dNTP mixture 1µl
*50 mM MgCl2 1.5µl
Primers 10 uM 1µl each
Template (from RT reaction) 2µl
*Taq polymerase (5U/λ) 0.25µl
*dH2O 38.25µl
Total
50µl
Use the following PCR program
1 cycle of :
94C for 3 minutes
35 cycles of:
94C for 45 seconds
55C for 30 seconds (for 2, 6OSTs, 58C for NDSTs)
72C for 1 minute
1 cycle of:
72C for 10 minutes
4. Analyze samples by agarose electrophoresis
Notes
Also perform a “no RT” control, where an RT reaction is performed without adding any
Enzyme at the last step. All other sections of the RT step should be followed. The products
of this control reaction should be included in the PCR procedure as a control for DNA
contamination of the RNA prep
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Détermination des activitées aryl sulfatases A et B dans des extraits cellulaires et dans
du milieu de culture.
Préparation des extraits cellulaires
Gratter les cellules à 4°C dans 1 ml du tampon acétate de sodium 250 mM pH 6.0
contenant 0.5% triton X-100.
(Ou dans un tampon tris 50 mM. 150 mM NaCl contenant 1% triton).
Laisser environ 1 h dans la glace.
Centrifuger 10 minutes à 10000 g (4°C).
Congeler éventuellement
Dialyser dans la chambre froide sur 6000-8000 dalton contre 2 litres de l’eau 18h à
4°C. Les boudins contenant 500µl de l’extrait chacun
Récupérer l’extrait dialysé et doser les protéines
Congeler à –80°C tiroir éventuellement.
Préparation du milieu de culture
Récupérer le milieu de culture.
Le laisser environ 1 h dans la glace.
Centrifuger 10 minutes à 10000 g (4°C).
Suivre le protocole comme pour les cellules (dialyse)
Mesure de l’activité aryl sulfatase A/B
Préparer les solutions suivantes :
Tampon A 0.5 M sodium acétate contenant 0.5 mM sodium pyrophosphate et
1.7 mM NaCl. Le pH 5 est ajusté avec de l’acide acétique.
Tampon B 0.5 M sodium aéetate contenant 10 mM barium acétate pH 6 ajusté avec de
l’acide acétique.
(Réactif A) Solution de nitrocatéchol sulfate A : 10 mM nitrocatéchol sulfate (PM=
311.3, sigma) dans le tampon A.
Soit 31.13 mg de nitrocatechol sulfate dans 10 ml de tampon A
(Réactif B) Solution de nitrocatéchol sulfate B : 50 mM nitrocatéchol sulfate (PM=
311.3, sigma) dans le tampon B.
Soit 31.13 mg de nitrocatéchol sulfate dans 10 ml de tampon B
(Standard) Solution de 4-nitrocatéchol: 0.25 µM nitrocatéchol (PM= 155.1, sigma)
dans l’eau.
Soit 38.7 mg de nitrocatéchol dans 10 ml d’eau (sol. mère 25 mM) et faire
des dilutions jusqu’à 0.25 µM (dil 1/10000)
Solution d’arrêt de la réaction: NaOH 1.0 M
Mode opératoire
Préparation de la gamme
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Point gamme Volume de la solution initiale à 0.25µM (µl) Vol H2O (µl)
1
0
1000
2
100 (25 nM)
900
3
200 (50 nM)
800
4
400 (100 nM)
600
5
600 (150 nM)
400
6
800 (200 nM)
200
7
1000 (250 nM)
0
Mesure l’activité Aryl sulfatase A
Ajouter dans un tube eppendorf
300 µl du réactif A (Nitrocatechol sulfate dans tampon A)
300 µl de l’extrait (ou standard de la gamme étalon)
mélanger
37°C / 1h
300 µl de réactif d’arrêt de la réaction
Mesure de la DO à 540nm
Mesure de l’activité aryl sulfatase B
Ajouter dans chaque tube eppendorf :
300 µl du réactif B (Nitrocatechol sulfate dans tampon B)
300 µl de l’extrait (ou standard de la gamme étalon)
mélanger
série de tube 1 : 37°C / 30 minutes
série de tube 2 : 37°C / 90 minutes
la réaction est arrêtée par ajout de 300 µl de réactif d’arrêt de la réaction
Mesure de la DO à 540nm
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Gels de polyacrylamide
Solutions stocks :
Acrylamide/Bis-Acrylamide : Biorad 30 %
TRIS 1M, pH 8.8 12,1 g pour 100 ml. Ajuster à HCl concentré.
TRIS 1M, pH 6.8 12,1 g pour 100 ml. Ajuster à HCl concentré.
Persulfate d'
Ammonium 10 % : 1 g dans 10 ml d'
eau
TEMED : pur
Pour deux mini-gels : prévoir 15 ml de Running et 10 ml de Stacking
Running (15 ml)
Stacking (10 ml)
( TRIS à pH 8,8)
% du gel
Acryl/Bis 30 %
(ml)
8%
4
(TRIS à pH 6,8)
10%
5
12%
6
12,50%
6,25
3%
1
4%
1,34
TRIS 1M
(ml)
6
6
6
6
1,25
1,25
H20
(ml)
4,895
3,895
2,895
2,645
7,64
7,3
SDS 20%
TEMED
(µl)
(µl)
75
15
75
15
75
15
75
15
50
10
50
10
Persulfate 10 %
(µl)
15
15
15
15
50
50
(Rq : le persulfate peut monter à 50, voire 75)
Tampon de Laëmli à pH 6,8.
SDS
ß-mercaptoéthanol
1X
(pour 100 ml)
0,5 g
(0,5 %)
1 ml
(1 %)
10 X
(pour 50 ml)
2,5 g
(5 %)
5 ml
(10 %)
TRIS
Glycérol
0,121 g
20 ml
(0,01 M)
(20 %)
0,605 g
10 ml
(0,1 M)
(20 %)
Bleu de Bromophénol
Eau
0,005 g
80 ml
(0,005 %)
0,025 g
40 ml
(0,05 %)
Tampon de migration TRIS-Glycine/ 0,1 % SDS
pour un litre de 10 X : glycine : 144 g
TRIS : 30 g
SDS :
10 g
(ou ne pas mettre de SDS, et ajouter lors de la dilution 4 ml de SDS à 20 %)
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Tampon de transfert
TRIS-Glycine / méthanol
Pour 1 l final : TRIS 3 g (25 mM)
Glycine 14.4 g (192 mM)
Méthanol 200 ml (20 %)
Eau qsp
Tampon de déshybridation des membranes (plus stringent)
Tampon 1X, pH 6,7,
pour 500 ml
pour 100 ml
ß-mercaptoéthanol 100 mM
3,5 ml
SDS
2%
10 g
20 %
Tris
62,5 mM
3,78 g
1M, pH 6,8
Page -225-
700 µl
10 ml de SDS
6,25 ml Tris
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Page -227-
Page -228-
Page -229-
Page -230-
Figure n°1: Constitution générale du muscle squelettique
D’après le site http://cours.cegep-st-jerome.qc.ca
(A)
A: Anatomie macroscopique du muscle squelettique
Wilmore et Costille, Physiologie du sport et de
l’ exercice, 1994
(B)
(C)
B: Anatomie microscopique d’une partie de
fibre musculaire
Marieb, Anatomie et physiologie humaine, 1992
Sarcomère
C: Filaments d’actine et de myosine d’un sarcomère
Albert et collaborateurs, La cellule, 1994
Figure n°2
Anatomie macroscopique et microscopique du muscle squelettique
Dermomyotome
paraxiale
Muscles intercostaux
et paraspinaux
Dermomyotome hypaxial
Muscles des membres et
de la ceinture
Cartilages, os,
vertébres, côtes
Figure n°3
Représentation schématique d’un somite
Le somite épithéliale se subdivise pour donner le sclérotome à l’ origine du cartilage, des vertèbres, des
côtes et des os et le dermomyotome à l’ origine des muscles squelettiques et du derme.
Hawke et Garry, 2001
a
b
Figure n°4
Schéma récapitulatif de l’action des différents facteurs myogéniques au cours de
myogenèse embryonnaire (a) et la régénération musculaire chez l’adulte (b)
Figure n°5
Mécanismes potentiels pour l’activation de la transcription des gènes du muscle
squelettique par MEF2 et les facteurs myogéniques bHLH (comme MyoD)
(1) MEF2 peut interagir avec les hétérodimères MyoD/E12 lié à l’ ADN.
(2) Les hétérodimères MyoD/E12 peuvent interagir avec MEF2 lié à l’ ADN.
(3) MEF2 et les hétérodimères MyoD/E12 peuvent lier des sites adjacents pour activer la
transcription de façon synergique.
(4 ) MEF2 et les hétérodimères MyoD/E12 peuvent lier des sites non adjacents et activer
la transcription coopérativement par des interactions protéine-protéine.
D’ après Molkentin et al., 1995
Zone de lésion
Dégénérescence de la zone lésée
Activation et prolifération des
cellules satellites
Fusion des cellules satellites
Maturation de la zone régénérée
Figure n°10
Réprésentation schématique du processus
de la régénération musculaire après une lésion
D’après Snow et al., 1977
Figure n° 8
L’évolution des MRF au cours du développement d’embryon de poulet. L’expression des
différentes protéines bHLH myogéniques suivent des profils différents.
D’après Venuti et Cserjesi (1996)
Tableau 3: Détermination du nombre de cellules satellites dans les muscles squelettiques.
D’ après Schmalbruch et Hellhammer, 19977; Gibson et Schultz (1983)
Model
Rat
Rat
Rat
Rat
Human
Muscle
Age and Protocol
TA
Soleus
Diaphragm
LD
Soleus
Soleus
Soleus
EDL
EDL
EDL
EDL
EDL
EDL
7-9 wk
7-9 wk
7-9 wk
adult
1 mo
1 yr
2 yr
1 mo
1 yr
2 yr
4 mo
Hypothyroid
Hypothyroid; chronic
stimulation
Control patients
DMD patients
%SC
4
11
8
4,5
9,6
6,6
4,7
7
2,9
1,9
3,8
3,8
7.9-13.8
SC#/muscle
5.2 ×
7.3 ×
5.4 ×
3.1 ×
2.1 ×
1.3 ×
105
105
105
105
105
105
15
25
SC: Cellule satellite; TA: tibialis anterieur, LD: latissimus dorsi, EDL: extensor digitorum longus,
DMD: dystrophie musculaire de Duchenne
A
B
Figure n°9 (A)
A: Localisation schématique de la cellule satellite (Hawke et Garry, 2001)
B: Image en microscopie électronique. Image réalisée par
CS: cellules satellites; Ca: capillaire sanguin; MN: myonucleus
Photo Y. Bassaglia
Figure 9 (B)
(1) Coupe longitudinale de muscle de rat adulte. Le réticulum granuleux de la cellule satellite
contient un matériel moyennement dense aus électrons. CS: cellules satellites; r: réticulum;
tête de fléche:lame basale
(2) Coupe transversale de muscle de rat adulte. Le cytoplasme de cette cellules satellite proche
d’ un capillaire montre une intense activité membranaire. La fibre musculaire adjacente est
également active. Ca : capillaire, CS: cellule satellite; Fi:Fibre musculaire
(3) Coupe transversale de muscle de rat adulte. Le réticulum granuleux (r), en continuité avec
la membrane nucléaire, occupe une part importante du cytoplasme.
Photo Yann Bassaglia
Zone de lésion
Dégénérescence de la zone lésée
Activation et prolifération des
cellules satellites
Fusion des cellules satellites
Maturation de la zone régénérée
Figure n°10
Représentation schématique du processus
de la régénération musculaire après une lésion
D’après Snow et al., 1977
1, 3 : marquage laminine; 2, 4: marquage desmine
EDL 2 jours de régénération
L’ ensemble des lames basales est bien conservé (1). Par contre, le marquage en desmine a disparu (2).
3
4
EDL 7 jours de régénération
La régénération progresse de façon centripète. Les myotubes de la zone externe (Zext) sont réguliers.
Dans la zone interne (Zint), on observe une colonisation de basales préexistante. Toutefois, il est rare
de voir deux myotubes dans une même basale (fléche)
Figure 11 A:
Régénération après écrassement total. Immunocytochimie de la laminine et de la desmine
Image et marquage Yann Bassaglia (1991)
1, 3 : marquage laminine; 2, 4: marquage desmine
EDL 16 jours de régénération
Noter une bonne structuration du muscle, et l’ absence de fibrose. La desmine tend à devenir
périphérique dans certaines fibres.
EDL 68 jours de régénération
Les fibres ont retrouvé leur allure polyèdrique. L’ irrigation capillaire est bien visible
Figure 11 B:
Régénération après écrassement total. Immunocytochimie de la laminine et de la desmine
Image et marquage Yann Bassaglia (1991)
TGFβ1
LAP
Figure n°12
β1-LAP-LTBP )
Représentation du petit (TGFβ
β1-LAP) et grand (TGFβ
complexes latents du TGFβ
β1
Le TGF β1 est sécrété et stocké à la surface et dans l’ environnement cellulaire
sous forme d’ un petit complexe latent TGFβ1-LAP et d’ un grand complexe latent
TGFβ1-LAP-LTBP.
D’après Feige et al, 1996)
hélice Télopeptide
(non hélicoïdal)
Propeptide
(globulaire)
Triple hélice
Télopeptide
(non hélicoïdal)
Propeptide
(globulaire)
Figure n°14
Structure en triple hélice du procollagène I.
Les extrémités N et C terminales sont des propeptides globulaire
D’ après Bateman et al, 1996
(A)
Structure schématique d’ une molécule de laminine. Les chaînes A, B1 et
B2 ainsi que leurs sites de fixation à d’ autres membres sont indiqués
(Alberts et al., La cellule, 1994)
Micrographie électronique de molécules de laminine ombrée au platine. La
flexibilité de ces chaînes A, B1 et B2 est à remarquer. Cette glycoprotéine
organisée en multidomaines est composée de trois polypeptides assemblés par des
ponts disulfures dans une structure asymétrique en forme de croix (Alberts et al., La
(B)
cellule, 1994).
Figure n°15
Structure de la laminine
Figure n° 16: Structures des ténascines
(A) Micrographie électronique de la molécule héxamèrique de ténascine ombrée au platine.
(B) Représentation des sites de liaisons des ténascines aux protéines de la MEC et aux facteurs
de croissance. Les 6 branches de la ténascine possèdent les mêmes sites de liaisons.
(C) Représentation de la structure des gènes codant pour les 5 isoformes de ténascines
D’ après Jones et al., 2000
(A)
(B)
(C)
Figure n° 17
Structure d’un dimère de fibronectine
(A) Les deux chaînes polypeptidiques de la fibronectine sont similaires mais pas identiques. Elles
sont liées par deux pont disulfures à proximité de l’ extrémité
(B) Micrographie électronique de molécules individuelles de fibronectine ombrées au platine. Les
flèches rouges indiquent les extrémités carboxyterminales liées par des pont disulfures
(C) Structure tridimensionnel d’ une répétition de type III de la fibronectine déterminé par RMN
D’ après Alberts et collaborateurs, la Cellule, 1994
Figure n°20
Structure des différentes chaînes de glycosaminoglycannes (GAG)
Les différentes positions des sulfates pour chaque GAG sont indiquées par les encadrés
rouges.
D’ après Prydz et Dalen, 2000
a
b
(A) Relation entre le β-D-Glucose (a) et le motifs disaccharidique répétitif
de l’ HA, le -D-acide glucuronique-β-1, 3-N-acétylglucosamine-β-1, 4 (b).
D’ après GlycoWord
(B) Micrographie tridimentionnelle de la structure de l’ acide hyaluronique.
D’ après Mayne and Brewton 1994
Figure n° 21 :
Composition chimique et structure de l’acide hyaluronique
OSO-3
4
Chondroïtine 4-sulfate
(GlcAβ 1-3GalNAcβ 1-4)n
OSO-3
6
Chondroïtine 6-sulfate
(GlcAβ 1-3GalNAcβ 1-4)n
OSO-3
4
Dermatane sulfate
(IdoAα1-3GalNAcβ1-4)n
OSO-3
2
Chondroïtine sulfate D
OSO-3
6
(GlcAβ1-3GalNAcβ1-4)n
OSO-3
OSO-3
4 6
Chondroïtine sulfate E
(GlcAβ1-3GalNacβ1-4)n
Figure n° 22
Les différents types de chondroïtine sulfates déterminés en fonction de la position des
groupements sulfates sur le disaccharide.
D’ après GlycoWord
Figure N° 24
Illustration du développement d’analogues de l’héparine,
d’ après Fareed et al., 2000
1
(1)
Renforcement de la barrière endothéliale par les GAG
(2)
Inhibition des molécules d’ adhésion L et P-selectines
(3)
Réduction de l’ adhésion des leucocytes suite à la diminution des ICAM-1
(4)
(molécules d’ adhésion
intercellulaire endothéliales)
(4)
Inhibition de l’ élastase neutrophile empêchant la diapédèse des neutrophiles
(5)
Diminution des cytokines pro-inflammatoires
(6)
Diminution de la production de ROM ( Réactive Oxygen Métabolites)
Figure N° 25
Effets anti-inflammatoire de l’héparine.
D’ après Papa et al., 2000
Figure N° 26
Unités dissacharidiques N acétylé et N-sulfaté des héparanes sulfates.
D’ après Gallagher J.T., 1996
Figure N° 27
Les héparanes sulfates : régulateurs multifonctionnels des activités protéiques
d’ après Turnbull et al., 2001
Figure n° 28
Évolution et relations structurales entre les gènes des différents composant de la
famille de SRLP.
D’ après Iozzo 1999
Agrine
Perlecan
Collagène XVIII
Glypican
Syndécan
NtA, agrine N terminal
Récepteur LDL classe A
FS, domaine follastine
domaine Ig-like identique à N-CAM
LE, laminine – EGF like
LamB, petit bras de la laminine 1
ST, sérine/thréonine
SEA, proteine de sperme,
hétérokinase, agrine
EG, EGF like
LamG, domaine laminine G-like
Domaine collagénique
Endostatine
protéine de fixation GPI
Région transmembranaire
Chaînes de HS
Figure n° 29
Représentation schématique des HSPG présent dans le muscle.
Au total, il existe 3 gènes qui codent pour l’ agrine, le perlecan, le collagène
XVIII, 6 isoformes de glypican et 4 isoformes de syndécans
Schéma modifié d’ après Iozzo, 2001
Figure N° 30
Représentation schématique des protéoglycans de la famille des syndecans et des glypicans.
Les sites potentiels d’ attachement des GAG correspondent aux traits rouges.
D’ après Rosenberg et al., 1997
Figure N° 31
Structure des Syndécans
A: Schéma illustrant la structure des 4 syndécans existant chez les vertèbres et un homologue
chez la drosophile. Le nom entre parenthèse est le premier à avoir été donné. La masse moléculaire
a été déterminé à partir du cDNA du core protéique. La masse moléculaire entre parenthèse correspond
À celle obtenue sur gel SDS-Page après digestion par les enzymes qui dégrade les GAG
B: Séquence d’ aminoacides au niveau des domaines transmembranaire et cytoplasmique
C: Schéma illustrant la correspondance fonctionnelle entre les domaine du coeur protéique
et l’ organisation des exon
D’ après Okayama et al., 1998
Figure n° 34
Représentation schématique des structures des 6 membres de la famille des
glypicans
D’après Song et Filmus., 2002
Cellules Satellites >>>> >>>>>>
Prolifération et migration
des myoblastes
>>>>>> Différenciation
en myotubes
Type de protéoglycans exprimés au 3 stades de la myogenèse
Large CS-PG
(versican)
-------------------
Petit DS-PG
(décorine)
------------------------- HS-PG
(syndecan, glypican)
GAG présent sur leur cœurs protéiques
CS
DS
HS
Type d’interactions avec les facteurs de croissances
?
TGFβ
β
FGF
Figure n° 35
Interactions entre les protéoglycannes avec les facteurs de croissance
en fonction du type de GAG qui les constitues
Figure N° 36: Biosynthèse des heparosan et modification des HS
D’après Lindahl et al., 1998 ; Selleck, 2000 ; Sugahara et Kitagawa, 2000
Figure N°37: Organisation de l’appareil de Golgi (Cis, médian et trans).
Lieu de biosynthèse des chaînes polysaccharidiques des protéoglycannes et GAG associés.
D’après GlycoWorld
Figure N° 39
Homologie entre les 5 gènes de la faille des EXT
D’après GlycoWorld
Figure N° 40
Séquence d’intervention des différentes enzymes de la famille
des EXT au cours la biosynthèse des HS.
D’après GlycoWorld
Figure N° 42: Type d’interaction possible entre les HSPG et les FGF
D’après Turnbull et al., 2001
-
O
HO
-OOC
O 3SO
O
O HO
OSO 3-
O
-
-OOC
O 3SHN
O
-
O
HO
OH
A
O 3SO
O
O 3SO
O
-
O 3SHN
O
Fragment de l’ héparine
O
O
O
O
O
O
O
B
Héparanes sulfate mimétique de type D120
O
O
O
O
O
O
O
O
O
C
Héparane sulfate mimétique benzylaminé de type RGTA 1106
Figure n° 44
Structure des RGTA
Structure et analogie structurale entre l’ héparine (A) et l’ héparanes sulfates mimétique D120 (B) et
RGTA benzylaminé (C ). Cette analogie est basée sur la similitude entre les groupements associées aux
Chaînes polysaccharidique de la molécules naturelle et celle de synthèse.
Figure n° 45
Représentation schématique du complexe protéique associé à la dystrophine dans le
muscle strié squelettique.
Le complexe forme un lien indirect entre la matrice extra-cellulaire (chaîne α2 de la
laminine) et le cytosquelette intracellulaire (filaments d’ actine). Le complexe protéique de
associé à la dystrophine comprend trois sous-groupes: les dystroglycanes (α et β,
transmembranaire), les sarcoglycanes (α et ε, également transmembranaires) et les
synthrophines (cytoplasmiques), auxquels s’ ajoutent le sarcopasarcpan, l’ enzyme nNos et les
dystrobrévines
D’après De la Porte et al., 1999; Peters et al., 1997; Rybakava et al., 1997
Figure 48
Intéractions possibles entre un facteur de croissancele FGF, l’héparine, les HS et le RGTA.
L’ héparine (bleu), les hs (vert) et le RGTA (rouge) ont la capacité d’ interagir avec le FGF, ce qui provoque
une dimérisation de ce dernier. Il se forme ensuite un complexe ternaire actif, lorsque le FGF associé au
RGTA, à l’ héparine ou aux HS se fixe sur son récepteur. Le complexe ainsi formé provoque
la phosphorylation des tyrosine kinase des recepteur au FGF, qui permet la transduction d’ un signal
conduisant à la réponse cellulaire.
Figure n°49:
Effets possibles du RGTA sur le
catabolisme (1 et 1’ ) et/ou l’ anabolisme (2 et 3)
des protéoglycannes et des glycosaminoglycannes
RGTA
+?
+?
RGTA
cœ ur protéique
EXT
RGTA
2
1’
RGTA
Lysosome
+ - ?
internalisation
Noyau
mRNA
RGTA
RER
mRNA
Héparanase
1
(EXT, NDST, FGF,…)
5’ UTR
Effet indirect du RGTA sur la traduction des
3
enzymes de synthèse des GAG et du FGF
+ activation
-inhibition
? hypothèse
-