Le voyage Intracellulaire des Protéines

Transcription

Cours BCP Pierre Barbero
Janvier 2007
Biologie
Cellulaire
Mars 2014
[email protected]
Le voyage Intracellulaire des Protéines
Production de
protéines
Prise en charge
du Fret (Cargo)
Adressage vers les
compartiments
Sécrétion
1
Janvier 2007
I- Rappels sur
l'organisation de la cellule
eucaryote.
La cellule eucaryote
Membrane Plasmique (MBP)
• Lipides
Phospholipides (majoritaire)
Glycolipides
Cholesterol
2
Janvier 2007
Lipides membranaires
Hydrophile
Hydrophobe
Phospholipides
= glycerol ou shingosine
+ lipides
Glycolipides
= lipides + oses
(glucose ou galactose)
Cholesterol
= noyau stéroïde
+ chaîne hydrocarbonée
La bicouche lipidique est en perpétuel mouvement
7,5nm
lymphocyte T
hématie
3
Janvier 2007
Organisation particulière au niveau de la MBP
les radeaux lipidiques
(lipid rafts)
régions riches en cholesterol et sphingolipides
Perméabilité membranaire
Les bicouches lipidiques vont empêcher la
diffusion des ions et des molécules polaires de
PM>15 Da.
4
Janvier 2007
Perméabilité membranaire
molécules
hydrophobes
petites
molécules
non chargées
polaires
grosse
molécules
non chargées
polaires
IONS
O2, CO2, N2
benzene
urée, H2O,
glycerol
glucose, sucrose
H+, Na+, K+, Ca2+
HCO3-, Mg2+, Cl-
Systèmes de transport
la cellule eucaryote
Membrane Plasmique
• Lipides
•Protéines
d
c
a
b
5
Janvier 2007
Fonctions des protéines membranaires
la cellule eucaryote
• Lipides
d
c
• Protéines
a
b
•Les Glucides
(glycolipides, glycoprotéines)
+
- Glycosaminoglycanes
(GAGs)
- Protéoglycanes
6
Janvier 2007
Les glycosaminoglycans (GAGs) sont de longs
polymères non ramifiés de disacharides.
Les protéoglycans sont constitués de nombreux GAGs
reliés à une protéine.
7
Janvier 2007
Le cytosquelette
cellule eucaryote animale
Actine
Filaments
intermédiaires
Microtubule
Compartiments
intra-cellulaires
et
voies de sécrétion
8
Janvier 2007
Volume relatif des principaux
compartiments intracellulaires
Pourcentage du
Nombre
Compartiment intracellulaire volume total de la approximatif
cellule
par cellule
Cytosol
Mitochondrie
Saccules du RE rugueux
Saccules du RE lisse plus
saccules de Golgi
Noyau
Peroxysomes
Lysosomes
Endosomes
54
22
9
1
1700
1
6
6
1
1
1
1
1
400
300
200
Noyau
Siège de la réplication (ADN) et de
la transcription (ARN)
Renferme la quasi totalité de l’ADN.
Constitué d’une double membrane
dont les bicouches lipidiques
fusionnent au niveau des pores
nucléaires.
Mitochondries
Conversion énergétique et production
d’ATP. Support de la chaîne respiratoire.
Voir cours de métabolisme…..
replication
Peroxysomes
transcription
Lysosomes
TGN
traduction
Mito
Golgi
ERGIC
Noyau
RE
9
lipides, polysaccharides,
ADN, ARN, protéines
Janvier 2007
Peroxysomes
Rôle très important dans la
détoxification (cell. hépatiques et
rénales).
Produisent et dégradent le
péroxyde d’hydrogène lors de
l’oxydation
de
substrats
organiques
(alcool,
acide
formique....etc).
Acides gras, glycerol,
bases, monosaccharides,
nucléosides, AA
Hydrolases Acides
nucléases
protéases
glycosidases
lipases
phosphatases
sulfatases
phopholipases
H+
pH ≈ 5
Lysosomes
Sites principaux de la
digestion intracellulaire.
Peroxysomes
Enzymes Oxydatives
Lysosomes
RH2 + O2
TGN
Mito
H2O2 + R’H2
R + H2O2
R’ + 2H2O
Golgi
ERGIC
Noyau
RE
Reticulum Endoplasmique RE
(lisse ou rugueux)
Site d’entrée dans la voie de sécretion.
Appareil de Golgi
Une face d’entrée (Cis) et
une face de sortie (trans).
Une extension en réseau
tubulaire: le réseau transGolgien (TGN).
Le Golgi assure, entres
autres:
- les modifications de
chaines oligosaccharidiques
- la sulfatation
- la phosphorylation
- l’endoprotéolyse
Protéines membranaires et lipides de
nombreux compartiments (RE, Golgi,
lysosomes, MBP) y débutent leur
synthèse.
Synthèse des oligosaccharides et
glycosylation des protéines.
Peroxysomes
Lysosomes
TGN
Mito
Golgi
ERGIC
Noyau
RE
10
Janvier 2007
En résumé
• Noyau
patrimoine génétique,
production d'ARN
• Mitochondries
production d'énergie
• Reticulum Endoplasmic synthèse des lipides
et protéines
• Golgi
glycosylation
• Lysosomes
dégradation
• Peroxisomes
dégradation,
détoxification
Sécrétion
constitutive
Sécrétion
régulée
Peroxysomes
EXOCYTOSE
Endosomes
Lysosomes
Sécrétion
lysosomiale
TGN
Mito
Golgi
ERGIC
Noyau
RE
ENDOCYTOSE
Cytoplasme
11
Janvier 2007
Animal
Végétal
Différents mais avec une même organisation …
Animal
Végétal
Une même organisation avec quelques différences…
12
Janvier 2007
Centrosome = principal centre organisateur
des microtubules.
Impliqué dans:
forme et polarité de la cellule,
motilité,
transport intracellulaire
Vacuole = réserve nutritive et d'eau
Paroi = enveloppe la plus externe
composée essentiellement de polymères
glucidiques ( cellulose et pectine)
II- Synthèse
et
mise en conformation 3D
des protéines
13
Janvier 2007
Synthèse proteique eucaryote
ARNm
3’
3’
5’
5’
ARNt
facteurs
d’elongation
ribosome
Acides
Aminés
3’
40S
5’
Acquisition
structure 3D
60S
N
Orientation vers le
bon compartiment
D. Goodsell, Scripps Resarch Institute
14
Janvier 2007
3’
5’
• Chaperon qui lie les
peptides naîssants
NAC
Hsp70
N
Nascent polypeptide Associated
Complex
• lie le ribosome
• affinité pour les polypeptides
naissants
• bloque liaison ribosome/RE
SRP
MSF
• lie spécifiquement le peptide signal
• arrete l'élongation
• dirige les polypeptides vers les
membrane du RE (liaison avec RSRP)
• Chaperon oriente les
protéines naissantes
vers la mitochondrie
Synthèse proteique eucaryote
3’
ARNm
3’
5’
5’
ARNt
facteurs
d’elongation
Acides
Aminés
N
40S
Le FOLDING
60S
Acquisition
structure 3D ou 4D
15
Janvier 2007
Mise en conformation tridimensionnelle
"Folding"
résidus
non
polaires
résidus polaire
développant liaison H
résidus
polaires
région
hydrophobe
polypeptide déroulé
polypeptide en conformation
dans un environnement aqueux
Mise en conformation tridimensionnelle
"Folding"
Le Lysozyme
16
Janvier 2007
-Le lysozyme est dénaturé (+ Urée) ou dénaturé et réduit par le
Dithiothreitol (+ Urée + DTT).
- Puis dilué dans un tampon de renaturation (refolding) contenant
différentes concentrations de molécules « encombrantes ».
in vitro
<0.1 mg/ml
cytosol
~340 mg/ml
(+ Urée)
(+ Urée + DTT).
Mesure du refolding du lysozyme dénaturé et réduit en
présence de concentrations croissantes de la protéine PDI
( Protein Disulfide Isomerase)
17
Janvier 2007
La majorité des protéines vont pouvoir se folder de manière
autonome. Les protéines présentant des structures IIIaire
complexes ou IVaire nécessiteront l’intervention de protéines
chaperons.
Hsp60
Les protéines chaperons
• Large famille de protéines retrouvées dans tous les
organismes.
• Les eucaryotes possèdent la plus grande diversité de
protéines chaperons.
• Mise en évidence par élévation de niveau de synthèse
suite à choc de température.
• Stress variés capables d'induire cette réponse.
L'élévation de synthèse des HSP observée également
lors de diverses situations physio-pathologiques (fièvre,
infections, lésions neuronales, vieillissement).
18
Janvier 2007
Activités Famille des chaperons
• Désassemblage
et dénaturation ATP dépendante pour la
dégradation des protéines.
• Maturation des récepteurs aux hormones stéroïdes et
transduction du signal.
• Prévention agrégation et déstabilisation lors
de chocs thermiques.
• Folding et contrôle qualité des protéines
glycosylées dans le RE (calnexine et
calréticuline)
19
Janvier 2007
Activités des protéines chaperons
(Hsp70/DnaK; Hsp60/GroEL)
• Stabilisation ATP dépendante des régions
hydrophobes exposées sur les polypeptides
naissant.
• Aide
à
la
mise
en
conformation
tridimensionnelle (Folding) des protéines néosynthétisées.
• Aide à la translocation au travers des
membranes.
Action des chaperons Hsp70
polypeptide
non "foldé"
polypeptide
"foldé"
N
C
N
N
N
Hsp70 N
N
5'
C
ARNm
3'
20
Janvier 2007
Famille Hsp60: les chaperonines
Elles assurent la mise en conformation des protéines,
naissantes ou dénaturées, en les séquestrant dans une
cavité
cylindrique,
les
protégeant
ainsi
de
l’environnement complexe cytoplasmique.
Coopération Hsp70/Hsp60
ATP
Hsp60
ADP
transfert
à Hsp60
Hsp70
polypeptide
partiellement
"foldé"
ATP
ADP
polypeptide
complètement
"foldé"
21
Janvier 2007
III- Adressage
Intracellulaire
des protéines.
Ou comment amener
une protéine au bon
endroit!!
22
Janvier 2007
1- La protéine transportée est
complètement traduite et foldée.
non terminée.
CYTOSOL
Peroxysomes
Noyau
2 types de signaux PTS
(peroxysomal targeting signal):
23
Janvier 2007
III-1a Adressage cytosolique
Interactions : prot. / prot. ; lip./ lip. ; prot. / lip.
• Motifs présents sur protéines
motifs protéiques - domaine PH (PiP2)
- domaine SH2 (phospho-tyr)
• Modifications post traductionnelles
motifs lipidiques
Phosphorylation
phosphatase
- myristylation glycine N-term
- farnesylation cysteine C-term
- interférences stériques
- créations de sites de liaison
- changement 3D
P P
kinase
Ca2+
Ca2+
24
Janvier 2007
Recrutement d'une protéine par interaction
protéine/protéine
un événement va créer des sites d'interaction
spécifiques sur les protéines.
Ex: domaine SH2 et phospho-tyrosyl
Tyr
Tyr P
kinase
SH2
protéine/lipide
Les phospholipides membranaires peuvent jouer le rôle
d'adaptateur. Se lient avec des protéines contenant des
domaines PH (pleckstrin homology domain).
PIP2 PIP3
PIP3
PI3K
PH
phosphatidyl inositol biphosphate
25
Janvier 2007
lipide/lipide
Ca2+
Ca2+
Tyr kinase
TyrP
SH2
P P
phosphatase
PIP2
PI3K
PIP3
PIP3
PH
Ca2+
Ca2+
kinase
26
Janvier 2007
IIIIII-1b Direction le noyau.......
noyau.......
Transport nucléo-cytoplasmique
• Acides Nucleïques (ARN)
• Protéines (ADN polymérases,
protéines signal…)
• Ions et métabolites (nucléotides)
27
Janvier 2007
Le pore nucléaire (NPC)
Structure massive
≈ 125 MDa
(≈ 400 prot.)
filament
cytoplasmique
Cytoplasme
- Une 30aine de nucléoporines
différentes.
- Nucléoporines caractérisées par
répétitions peptidiques FxFG.
panier
nucléaire
lamine
nucléaire
- Concentration très importante
en motifs FG (plus de 1000
copies) à l’intérieur du canal
Noyau
28
Janvier 2007
Pore ouvert à la libre diffusion des solutés de faibles
tailles (5kDa et moins).
(diam. canal libre diffusion 5nm)
En revanche, diffusion devient impossible pour molécules
sphériques ≈ 30 kDa.
Or, mesure pour une Prot de 100kDa de 800 évènements
de translocation / NPC
Résumé de l’épisode précédent:
- Rappels sur les compartiments cellulaires (noyau,
mitochondries, peroxysomes, RE, ERGIC, Golgi, TGN,
lysosomes, endosomes).
- Existence des voies de sécretion (constitutive, régulée,
lysosomale).
- Le folding, importance des protéines chaperons (Hsp70).
- Adressage de protéines totalement traduites et foldées:
- Adressage cytosolique
- Transport nucléo-cytoplasmique…
… direction
le noyau
29
Janvier 2007
Transport passif
molécules.
pour
les
petites
Pour les grosses molécules transport
facilité (interactions avec adapteurs
/transporteurs) et spécifique (signaux
présents sur les protéines)
Transport facilité consomme de l’énergie
Signaux de localisation nucléaire
NLS = nuclear localization signal
NES = nuclear export signal
- NLS
+ NLS
30
Janvier 2007
Immuno-fluorescence
Détection et visualisation à l'aide d'anticorps
spécifiques de l'objet étudié.
Anticorps 1er
Anti-protéine A
Anticorps 2re
Anti-anticorps 1er
Signal
de détection
Protéine A
Une molécule fluorescente est couplée à l'anticorps secondaire.
Signaux de localisation nucléaire
NLS = nuclear localization signal
NES = nuclear export signal
Mis en évidence par expériences de micro-injection
de protéines recombinantes et mesure de cinétique
d'accumulation.
- NLS
+ NLS
31
Janvier 2007
Signal de localisation nucléaire (NLS)
Signal de localisation nucléaire (NLS)
Exemples de signaux NLS classiques:
* antigene T du SV40:
PKKKRKVE
* nucleoplasmine:
KRPAATKKAGQAKKKKLD
Pas de véritable séquence consensus.
On observe des motifs basiques, hydrophobes..........
De longueur variable, plus ou moins espacés.........;
32
Janvier 2007
Récepteurs/Transporteurs nucléaires
les macromolécules sont transportées à travers
les NPCs par des récepteurs / transporteurs
spécifiques.
Les membres de la famille des importines β
assurent la majorité des processus de transport.
Fret (cargo)
Fret
adaptateur
transporteur
Les récepteurs/transporteurs
fonctions:
assurent
3
1°) se lient au fret par le domaine C term ( via NLS)
2°) interagissent avec les nucléoporines à motifs FG
constituant le canal du NPC
3°) régulent cette association par interaction avec
une petite protéine G (RAN), via leur domaine Nterm.
33
Janvier 2007
Import des protéines à travers le NPC
Les récepteurs/transporteurs assurent 3
fonctions: :
1°) se lient au fret par le domaine C term (via NLS)
2°) interagissent avec les nucléoporines à motifs FG
constituant le canal du NPC
3°) régulent cette association par interaction avec
une petite protéine G (RAN), via leur domaine Nterm.
34
Janvier 2007
Model de transport nucléocytoplasmique
interaction
NLS
progression
motifs FG
libération
RAN
La vectorialité du transport est assurée
par des petites protéines G
Cycle des petites Protéines G de la
super-famille de Ras
Petite PG ACTIVE
Guanine
GTPase
Activating
Protein
nucleotide
Exchange
Factor
Petite PG INACTIVE
Ras
Rho/Rac
Rab
ARF-Sar
Ran
Rad
signal transduction
cytoskeleton regulation
regulator of vesicle formation
and traffic
nuclear transport
cycle cellulaire
35
Janvier 2007
Cycle des petites Protéines G de la
super-famille de Ras
Guanine
GTPase
Activating
Protein
nucleotide
Exchange
Factor
Ras
Rho/Rac
Rab
ARF-Sar
Ran
Rad
signal transduction
cytoskeleton regulation
regulator of vesicle formation
and traffic
nuclear transport
cycle cellulaire
Cycle de la Ran GTPase
36
Janvier 2007
Cytoplasme
RanGAP
[ RanGTP ]
La
vectorialité
du
transport assuré par:
- Gradient de RANGTP (inversion du
gradient: inversion du
transport)
RAN GTP
Noyau
RanGEF
[ RanGTP ]
- Gradient de nucléoporine dont l’affinité
avec les importines
augmente du cytosol
vers le noyau
Régulation du transport nucléaire
Nombreux mécanismes (protéolyses, modifications posttraductionnelles, formations de complexes, changements
de conformations 3D, etc…) aboutissent à la mise en
évidence d'un signal qui était masqué, à la libération
depuis un point d'ancrage, …etc…
"Ancre"
T
C
C
kinase
C
C
P
T
protéase
T
Membrane nucléaire
37
Janvier 2007
CYTOSOL
Peroxysomes
Noyau
III-2 La protéine transportée est non terminée.
CYTOSOL
Mitochondries et RE
Translocation à travers les bi-couches lipidiques
38
Janvier 2007
Contraintes des machineries
de Translocation
1) Sélectionner les polypeptides portant les
signaux adéquats.
2) Assurer leur transport à travers les
membranes sans compromettre l’intégrité
du compartiment.
3) Assurer leur mise en conformation ou leur
maturation
dans
la
lumière
des
compartiments.
III-2a Vers la mitochondrie
Cellule eucaryote
matrice
membrane
externe
membrane
interne
39
Janvier 2007
La machinerie de transport mitochondriale
• Maintient des polypeptides
dans un état compatible avec
la translocation (cHsp70).
• Dirige les protéines vers les
mitochondries
(séquences
signals
et
récepteurs
membranaires; 2 voies)
• Assure le transport à travers
les
deux
membranes
mitochondriales ( TOM et TIM
complexes, mtHsp70)
• Retire la séquence signal et
termine
le
folding
(chaperonines)
Nterm basique
Cytosol
(MSF)
Complexe de
translocation
membrane
externe (TOM
complexe)
Complexe de
translocation
membrane
interne (TIM
complexe)
membrane
externe
espace
intermembranaire
membrane
interne
Matrice
40
Janvier 2007
3’
5’
• Chaperon qui lie les
peptides naîssant
• ATPase
Hsp70
N
+
+
+
+
MSF
• Chaperon
oriente
les
protéines naissantes vers la
mitochondrie.
Interaction
avec TOM70
Interaction avec récepteurs
présents sur la membrane
externe des mitochondries
(TOM 20 – 22)
41
Janvier 2007
Insertion des protéines mitochondriales
membranaires
III-2b Entrée dans la voie de sécrétion
le reticulum endoplasmique
ER / MITO
42
Janvier 2007
La machinerie de transport vers le RE
• Dirige les ribosomes en cours de synthèse
vers la membrane du RE (séquence signal,
interaction SRP/SR)
• Assure le transport à travers la membrane du
RE ( Sec61p complexe = le translocon)
• Coupe la séquence signal et assure le folding
de la protéine (peptidase du signal, BiP…)
Les 4 étapes de la translocation
post- ou co-traductionnelle
1) adressage
2) association
3) entrée dans RE
4) folding (3D)
43
Janvier 2007
Le Translocon
Eléments nécessaires
et suffisants:
- Sec61 α, β, γ =
Sec61p
- Tram (translocation
associated membrane
protein)
Eléments associés:
- Signal peptidase SP
-Oligosaccharyltransferase
OST
Translocation Co-traductionnelle
Peptide signal
SRP
cytosol
GDP
GTP
translocon
Protéines foldées
BiP
SR
Signal peptidase
Lumière du RE
- Fixation SRP/ribosome/peptide signal. Arrêt Synthèse protéique
- Interaction SRP/récepteur (SR) présent sur membrane du RE. Hydrolyse du
GTP engendre libération du ribosome.
- Insertion de la chaîne polypeptidique dans le pore du translocon
- BiP est relargué, ouvrant le pore et permettant le passage du polypeptide
dans la lumière du RE. Le peptide signal est coupé.
- BiP avec rôle chaperon; rôle « moteur » pour la translocation.
44
Janvier 2007
Une fois dans le RE,
les protéines pourront:
- y résider
- en sortir ( 2 possibilités)
IV- du RE
à la
membrane plasmique
(l'exocytose)
45

Le voyage Intracellulaire des Protéines

Transcription

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