Kit enzymatique pour la détermination de l`acide L

Kit enzymatique pour la détermination de l’acide L-ascorbique
Principle:
L’acide L-Ascorbique et d’autres substances forment en présence de MTT un complexe de couleur violette (formazane).
PMS
L-Ascorbate + autres substances + MTT
→ Dehydroascorbate + formazane + H⁺
Pour une analyse précise de l’acide L-Ascorbique , il est nécessaire de déterminer les interférences dues aux autres substances.
Pour cela, on réalise une double mesure en éliminant l’acide L-Ascorbique par ajout d’ascorbate oxidase (AAO).
L-Ascorbate+ 1/2 O2
AAO
→
Dehydroascorbate + H2O
La différence entre les 2 résultats correspond à la concentration en acide L-Ascorbique.
Contenu du coffret pour 50 analyses:
Flacon
Composition
Quantité
A.
Tampon
100 ml
R2 correspond au Flacon B et il est prêt à l’emploi.
B.
MTT/PMS
16 ml
Solution d’ascorbate oxidase: dissoudre 1 tube C avec 10 ml du Flacon D.
C.
AA0
2 tubes
D.
Diluant
20 ml
STD.
Standard
1 tube
Preparation des réactifs:
R1 correspond au Flacon A et il est prêt à l’emploi.
Stabilité de la solution d’ascorbate oxidase: 3 mois une température de 2 à 8°C.
Préparation des échantillons à analyser:
Tous les échantillons à analyser doivent être traités au formaldéhyde avant analyse.
Ajouter 50 µl (une goutte) d’une solution de formaldéhyde à 10% dans 10 ml d’échantillon à analyser et agiter.
Après 5 minutes, pipeter 400 µl de l’échantillon traité au formaldéhyde dans 2 tubes.
Dans le premier ajouter 400 µl de la solution d’ascorbate oxidase et dans le second 400 µl d’eau distillée. Agiter les deux tubes.
Apres 5 minutes, le s échantillons peut être analysé et la différence entre les deux résultats correspond à la concentration en acide L-ascorbique.
Préparation du contrôle d’acide L-Ascorbique:
Peser 150 mg du tube Standard et dissoudre dans une fiole jaugée de 100 ml avec de l’eau distillée.
Cette solution est stable une semaine si elle est conservée à une température de 2 à 8°C.
Avant chaque contrôle, diluer la solution ci-dessus 10 fois pour obtenir une solution d’acide L-ascorbique à 150 mg/l .
Cette solution doit être considérée comme un control à 300 mg/l pour tenir compte de la dilution par 2 des échantillons avant analyse.
Performances:
Ce kit a été développé pour déterminer des concentrations en acide L-Ascorbique comprises entre 0 et 300 mg/l.
Lorsque les valeurs dépassent 300 mg/l, les échantillons doivent être pré-dilués et le résultat obtenu multiplié par le facteur de dilution.
Stockage et stabilité des réactifs :
Les réactifs sont stables jusqu’a la date de péremption, à condition de les stocker entre 2 et 8 °C et en évitant toute contamination.
Ne pas congeler les réactifs!
Avertissements et précautions:
Ne pas avaler. Eviter tout contact avec la peau et les muqueuses.
Prendre les précautions nécessaires à l’utilisation des réactifs de laboratoire.
Mode opératoire
Longueur d’onde: 578 nm.
Cuve: Semi-micro 1 cm de trajet optique (plastique ou verre)
Température: 20 – 37°C
Mesure contre l’eau ou l’air
Echantillon A
Echantillon B
R1
1000 μl
1000 μl
Echantillon
40 μl
40 μl
Agiter et lire la DO1
R2
160 μl
160 μl
Agiter, attendre 15 minutes puis lire la DO2
Calculs:
Pour une concentration en acide L-Ascorbique comprise
entre 0.0 et 300 mg/l appliquer les calculs suivants :
[Acide L-Ascorbique] mg/l = 625,3 x ∆DO
∆DO = (DO2-DO1)vin B - (DO2-DO1)vin A