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EasyLyse™
Erythrocyte-Lysing Reagent
Code No./ N° cat./ Code-Nr. S2364
ENGLISH
Intended use
For in vitro diagnostic use.
EasyLyse™ is intended for use in flow cytometry. EasyLyse™ is a buffered ammonium chloride reagent for red blood
cell lysis.
Introduction
Reagent provided
Storage
Precautions
EasyLyse™ provides complete and gentle lysis of erythrocytes after immunofluorescence labelling of cells from whole
blood, cord blood or leukapheresis samples, and prior to flow cytometric analysis (1). Owing to the optical matching
properties of EasyLyse™, the residual red cell debris does not need to be removed by centrifugation for most samples,
making the reagent suitable for use in both “wash” and “no wash” staining procedures. The reagent contains no fixative.
Figure 2. Dot plot showing a blood sample stained with Anti-CD3/FITC and lysed with EasyLyse™ without any
centrifugation step. No escapees are observed.
EasyLyse™ is provided as 6 vials each containing 5 mL of a 20 x concentrated solution. One vial is sufficient for
50 tests (2 mL diluted reagent per test).
Store the undiluted reagent at 2–8 °C. Do not use after expiration date stamped on vial. Once opened, the reagent is
stable for four months at 2–8 °C. Keep the vial tightly closed when not in use, as contact with air may reduce the shelf
life. After dilution the product is stable for 20 days when stored between 2 °C and 25 °C.
LYSING PROCEDURE
Procedure
The lysing procedure must be performed at room temperature.
1.
If the reagent is stored under any conditions other than those specified, the user must verify the conditions.
2.
NOTE: The pH of the reagent may increase during storage, which may affect the position of cells in an FSC/SSC plot.
The pH of the diluted reagent should be between 7.0 and 7.4. If the pH is above 7.4, it should be adjusted to 7.2 by
adding 0.2 mol/L KHCO3.
3.
Proceed with either A: Lyse-No-Wash Procedure or B: Lyse and Wash Procedure.
1. For professional users.
2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though
not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups
of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing.
A: Lyse-No-Wash-Procedure
4.
3. This product contains 16% ammonium chloride. At product concentrations, ammonium chloride does not require
hazard labelling. Safety data sheet available for professional users on request.
Escapees
Dilute the required amount of S2364 1+19 with deionized water1 of room temperature. Alternatively, mix the
contents of one bottle (5 mL) of S2364 with 95 mL of deionized water of room temperature.
Incubate the sample2 with fluorochrome-conjugated antibody prior to the lysing step, if antibody labelling of cells
is intended.
Immediately after incubation with the antibody, add 2 mL of diluted lysing reagent to 100 µL of test sample
(e.g. blood) and mix immediately.
Incubate the sample with the lysing reagent for 10-15 minutes at room temperature and then run the sample on
the flow cytometer.3 If the sample is not analysed within 45 minutes, it should be placed on ice and run within
2 hours.
B: Lyse and Wash Procedure
When EasyLyse™is used in the “lyse and wash” protocol, lymphocytes may form aggregates, also called “escapees”
with platelets and monocytes. The aggregates show higher forward (FSC) and sideward (SSC) light scatter properties
than single cell suspensions. If FSC/SSC gating is applied during analysis of data, the aggregated cells will escape
from the gate (2). Several parameters are affecting the amount of aggregation as described by Gratama et al. (2).
We have investigated this phenomenon further and found that the use of a lysing reagent without fixative in a “lyse and
wash” procedure may introduce the escapee phenomenon.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
To avoid cell aggregation it is recommended to use EasyLyse™ in a “no wash” protocol.
Incubate the sample with the lysing reagent for 15 minutes at room temperature.
Centrifuge the sample at 300 x g for 5 minutes and remove the supernatant.
Wash the sample in 2 mL phosphate-buffered saline (PBS).
Repeat step 5.
Add an appropriate amount of PBS to the sample.
Run the sample on the flow-cytometer.3
Procedural notes:
1.
2.
3.
Use deionized water and not tap water for dilution. Tap water is not compatible with the lysing reagent.
The recommended anticoagulant is EDTA. Heparin and citrate may be used but occasionally give more debris.
It is recommended to run a normal test sample together with the patient sample to verify that the lysing process
has been performed correctly.
FRANÇAIS
Utilisation prévue
Pour utilisation en diagnostic in vitro.
EasyLyse™ est destiné à un usage en cytométrie en flux. EasyLyse™ est un réactif tamponné de chlorure
d’ammonium pour la lyse des globules rouges.
Figure 1. An example of the “escapee phenomenon”. Normal blood is stained with Anti-CD3/FITC (DakoCytomation
code No. F0818), lysed with EasyLyse™ and centrifuged twice. Some CD3 positive cells have changed their FSC and
SSC properties, because they have formed aggregates with activated monocytes and granulocytes. If a gate had been
set around the lymphocyte gate, these positive events would have escaped.
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Introduction
EasyLyse™ assure une lyse douce des érythrocytes après un marquage par immunofluorescence des cellules du sang
total, du sang de cordon ombilical ou d’échantillons prélevés par leucophérèse et avant l’analyse en cytométrie en flux
(1). En raison des propriétés optiques de mise en correspondance de EasyLyse™, dans la plupart des échantillons, les
résidus de globules rouges subsistants n’ont pas besoin d’être éliminés par centrifugation, ce qui rend ce réactif
approprié pour une utilisation dans les procédures de marquage « avec lavage » et «sans lavage». Le réactif ne
contient aucun fixateur.
Réactif fourni
EasyLyse™ est fourni sous forme de 6 flacons contenant chacun 5 mL d’une solution concentrée x 20. Chaque flacon
suffit pour effectuer 50 tests (2 mL de réactif dilué par test).
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Conservation
Conserver le réactif non dilué entre 2°C et 8°C. Ne pas utiliser après la date de péremption mentionnée sur le flacon.
Une fois ouvert, le réactif est stable pendant quatre mois s’il est conservé entre 2°C et 8 °C. S’il n’est pas utilisé,
conserver le flacon fermé hermétiquement puisque tout contact avec l’air peut réduire la durée de vie. Après dilution, le
produit est stable pendant 20 jours lorsqu’il est conservé entre 2 °C et 25 °C.
PROCÉDURE DE LYSE
Procédure
1.
Dans le cas où le réactif est conservé dans d’autres conditions que celles spécifiées, les conditions doivent être
vérifiées par l’utilisateur.
2.
REMARQUE: Le pH du réactif peut augmenter pendant le stockage, ceci peut affecter la position des cellules dans un
diagramme FSC/SSC. Le pH du réactif dilué doit se trouver entre 7,0 et 7,4. Si le pH est supérieur à 7,4, il doit être
ajusté à 7,2 en ajoutant du KHCO3 à 0,2 mol/L.
Précautions d’emploi
3.
Diluer la quantité requise de S2364 1+19 avec de l’eau déminéralisée1 à température ambiante. Il est également
possible de mélanger le contenu d’une bouteille (5 mL) de S2364 avec 95 mL d’eau déminéralisée à température
ambiante.
Afin d’effectuer un marquage de l’anticorps, laisser incuber l’échantillon2 avec l’anticorps conjugué au
fluorochrome avant l’étape de lyse.
Immédiatement après incubation avec l’anticorps, ajouter 2 mL de réactif dilué à 100 µl de l’échantillon à tester
(par ex. sang) et mélanger immédiatement.
Traiter avec la Procédure A : lyse-sans-lavage ou Procédure B : Procédure de lyse et lavage.
1. Pour utilisateurs professionnels.
2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), un produit chimique hautement toxique sous forme pure. Aux
concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, l’azide de sodium peut réagir avec le cuivre et le
plomb des canalisations pour former des accumulations d’azides métalliques hautement explosifs. Lors de
l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation d’azide métallique dans les canalisations.
A: Procédure de lyse-sans-lavage
4.
3. Ce produit contient du chlorure d’ammonium à 16 %. Aux concentrations rencontrées dans ce produit, le chlorure
d’ammonium ne nécessite pas d’étiquetage de produit dangereux. Fiche Toxicologique disponible sur demande pour
tout usage professionnel.
Agrégats
La procédure de lyse doit être effectuée à température ambiante.
À température ambiante, laisser incuber l’échantillon dans le réactif de lyse pendant 10–15 minutes puis traiter
l’échantillon sur le cytomètre en flux.3 Si l’échantillon n’est pas analysé dans les 45 minutes, il doit être placé sur
de la glace et traité dans les 2 heures.
B: Procédure de lyse et lavage
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Lorsque l’EasyLyse™ est utilisé dans le protocole «de lyse et lavage», les lymphocytes peuvent former, avec les
plaquettes et les monocytes, des agrégats, également appelés «escapees» en anglais. Les agrégats présentent des
propriétés plus élevées pour les paramètres de taille (FSC = forward light scatter) et de granulosité (SSC = sideward
light scatter) que les suspensions formées d’un seul type cellulaire. Si des filtrages FSC/SSC sont appliqués pendant
l’analyse des données, les cellules agrégées échapperont au filtre (2). Plusieurs paramètres affectent le taux
d’agrégation comme décrit par Gratama et al. (2). Nous avons effectué d’autres recherches sur ce phénomène et
avons trouvé que l’utilisation d’un réactif de lyse sans fixateur dans une procédure de «lyse et lavage» peut entraîner le
«phénomène d’agrégation».
À température ambiante, laisser incuber l’échantillon dans le réactif de lyse pendant 15 minutes.
Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
Diluer l’échantillon avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
Répéter l’étape 5.
Ajouter la quantité appropriée de PBS dans l’échantillon.
Traiter l’échantillon sur un cytomètre en flux.3
Remarques sur la procédure:
Pour éviter l’agrégation des cellules, il est recommandé d’utiliser l’EasyLyse™ dans un protocole «sans lavage».
1.
2.
3.
Pour la dilution, utiliser de l’eau déminéralisée et non de l’eau du robinet. L’eau du robinet est incompatible avec
le réactif de lyse.
L’anticoagulant recommandé est l’EDTA. On peut utiliser l’héparine et le citrate mais occasionnellement ils
donnent plus de résidus.
On conseille de traiter un échantillon normal de test en même temps que ceux du patient afin de vérifier que la
procédure de lyse a été effectuée correctement.
DEUTSCH
Verwendungszweck
Zur In-vitro Diagnostik.
EasyLyse™ ist für die Verwendung bei der Durchflusszytometrie vorgesehen. EasyLyse™ ist eine gepufferte
Ammoniumchloridlösung für die Zytolyse der Erythrozyten.
Figure 1 : Un exemple du « phénomène d’agrégation ». Du sang normal est coloré avec l’Anti-CD3/FITC
(DakoCytomation n° cat. F0818), lysé avec l’EasyLyse™ et centrifugé deux fois. Les propriétés de FSC et de SSC ont
changé pour certaines cellules CD3+, car ces cellules ont formé des agrégats avec des monocytes et des granulocytes
activés. Si un filtre avait été défini autour du filtre des lymphocytes, ces événements positifs n’auraient pas été inclus.
Einführung
EasyLyse™ bewirkt eine vollständige und sanfte Lysierung der Erythrozyten vor der durchflusszytometrischen
Untersuchung und nach der immunfluoreszenten Markierung von Zellen aus peripherem Blut, Nabelschnurblut oder
Leukapherese-Proben (1). Durch die optischen Abstimmungseigenschaften von EasyLyse™ müssen die
zurückbleibenden Erythrozytenpartikel in den meisten Proben nicht durch Zentrifugierung entfernt werden, daher eignet
sich das Reagenz für Färbeverfahren mit und ohne Waschschritt. Das Reagenz enthält kein Fixiermittel.
Mitgelieferte Reagenzien
EasyLyse™ wird in 6 Fläschchen zu je 5 mL einer zwanzigfach konzentrierten Lösung geliefert. Ein Fläschchen ist
für 50 Proben (2 mL der verdünnten Lösung pro Test) ausreichend.
Aufbewahrung
Das unverdünnte Reagenz bei 2–8 °C aufbewahren. Nach Ablauf des auf dem Fläschchen aufgedruckten
Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Nach dem Öffnen bleibt das Reagenz bei 2–8 °C 4 Monate lang stabil. Das
Fläschchen bei der Aufbewahrung fest verschlossen halten, da Kontakt mit Luft die Haltbarkeit der Lösung vermindert.
Nach Verdünnung bleibt das Produkt bei 2–25 °C 20 Tage lang stabil.
Wird das Reagenz nicht entsprechend den angegebenen Bedingungen aufbewahrt, müssen die Bedingungen vom
Anwender geprüft werden.
Der pH-Wert des Reagenzstoffs kann sich während der Aufbewahrung erhöhen, was sich auf die Lage der Zellen in
einer FSC/SSC-Darstellung auswirken kann. Der pH-Wert der verdünnten Lösung muss zwischen 7,0 und 7,4 liegen.
Ist er höher als 7,4, muss er durch Zugabe von 0,2 mol/L KHCO3 auf 7,2 eingestellt werden.
Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur für Fachpersonal bestimmt.
2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von
Natriumazid können auch in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und
Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser
nachspülen, um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen.
3. Dieses Produkt enthält 16%iges Ammoniumchlorid. Bei dieser Konzentration ist für Ammoniumchlorid keine
Gefahrenkennzeichnung erforderlich. Auf Anfrage ist für Fachpersonal ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich.
Ausreißer
Figure 2 : Nuage de points présentant un échantillon sanguin coloré avec l’Anti-CD3/FITC et lysé avec l’EasyLyse™
sans aucune étape de centrifugation. Aucun agrégat n’est observé.
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Wird EasyLyse™ in einem Lysierungsverfahren mit Waschschritt verwendet, können sich Aggregate, sogenannte
„Ausreißer“, aus Lymphozyten mit Thrombozyten und Monozyten bilden. Diese Aggregate weisen eine stärkere, nach
vorne gerichtete (FSC-) und seitliche (SSC-) Lichtstreuung auf als Suspensionen aus einzelnen Zellen. Bei Einsatz
eines FSC/SSC-Gatings während der Datenanalyse werden die zusammengeballten Zellen vom Gatter nicht erfasst
(2). Wie von Gratama et al. beschrieben, wird der Grad der Aggregatbildung durch verschiedene Parameter beeinflusst
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(2). Wir haben dieses Phänomen eingehend untersucht und ermittelt, dass die Verwendung eines lysierenden
Reagenzstoffs ohne Fixiermittel in einem Lysierungsverfahren mit Waschschritt zur Entstehung des AusreißerPhänomens führen kann.
8.
9.
Zur Vermeidung der Zellaggregatbildung wird daher empfohlen, EasyLyse™ nur in Verfahren ohne Waschschritt zu
verwenden.
Verfahrenshinweise:
1.
2.
3.
Eine ausreichende Menge PBS zur Probe hinzugeben.
Die Probe auf dem Durchflusszytometer durchlaufen lassen.3
Zur Verdünnung kein Leitungswasser, sondern entionisiertes Wasser verwenden. Leitungswasser ist nicht mit
dem Lysierungsreagenz kompatibel.
Der empfohlene Gerinnungshemmer ist EDTA. Heparin oder Zitrat können auch verwendet werden, allerdings
entstehen dadurch mehr Zellrückstände.
Es wird empfohlen, eine normale Testprobe zusammen mit der Patientenprobe mitzuführen, um zu verifizieren,
dass der Lysierungsvorgang korrekt durchgeführt wurde.
References/ Références/ Literatur
Abbildung 1. Ein Beispiel für das „Ausreißer-Phänomen“. Normales Blut wird mit Anti-CD3/FITC (DakoCytomation
Code-Nr. F0818) gefärbt, mit EasyLyse™ lysiert und zweimal zentrifugiert. Einige der CD3-positiven Zellen haben
durch die Bildung von Aggregaten mit aktivierten Monozyten und Granulozyten ihre FSC- und SSC-Eigenschaften
verändert. Wäre um das Lymphozyten-Gatter ein weiteres Gatter definiert worden, so hätten diese positiven Ereignisse
nicht gemessen werden können.
1.
Muirhead KA, Wallace PK, Schmitt TC, Frescatore RL, Franco JA, Horan PK. Methodological considerations for
implementation of lymphocyte subset analysis in a clinical reference laboratory. Clinical Cytometry. Ann NY Acad
Sci 1986;468:113-27.
2.
Gratama JW, van der Linden R, van der Holt B, Bolhuis RLH, vand de Winkel JGJ. Analysis of factors
contributing to the formation of mononuclear cell aggregates (”Escapees”) in flow cytometric immunophenotyping.
Cytometry 1997;29:250-60.
Explanation of symbols/ Légende des symboles/ Erläuterung der Symbole
Catalogue number
Référence du catalogue
Bestellnummer
Temperature limitation
Limites de température
Zulässiger Temperaturbereich
In vitro diagnostic medical device
Dispositif médical de diagnostic
in vitro
In-Vitro-Diagnostikum
Batch code
Code du Lot
Chargenbezeichnung
Consult instructions for use
Consulter les instructions
d’utilisation
Gebrauchsanweisung beachten
Use by
Utiliser jusque
Verwendbar bis
Manufacturer
Fabricant
Hersteller
Abbildung 2. Dot-Plot-Darstellung einer mit Anti-CD3/FITC gefärbten und mit EasyLyse™ lysierten Blutprobe ohne
Zentrifugierung. Es treten keine Ausreißer auf.
LYSIERUNGSVERFAHREN
Verfahren
Das Lysierungsverfahren muss bei Raumtemperatur erfolgen.
1.
2.
3.
Die benötigte Menge von S2364 im Verhältnis 1:19 mit entionisiertem Wasser1 bei Raumtemperatur verdünnen.
Wahlweise kann der Inhalt des Fläschchens (5 mL S2364) mit 95 mL entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur
verdünnt werden.
Falls eine Antikörper-Zellmarkierung beabsichtigt ist, muss die Probe2 mit einem fluorochromkonjugierten
Antikörper vor dem Lysierungsschritt inkubiert werden.
Sofort nach der Inkubation mit dem Antikörper 2 mL verdünntes Lysierungsreagenz zu 100 µL der zu
untersuchenden Probe (z. B. Blut) zugeben und sofort mischen.
Entweder mit A: Lysierungsverfahren ohne Waschschritt oder B: Lysierungsverfahren mit Waschschritt fortfahren.
A: Lysierungsverfahren ohne Waschschritt
4.
Die Probe mit dem Lysierungsreagenz 10–15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren und dann im
Durchflusszytometer3 durchlaufen lassen. Wenn die Probe nicht innerhalb von 45 Minuten analysiert wird, muss
sie auf Eis gelegt und innerhalb von 2 Stunden verarbeitet werden.
B: Lysierungsverfahren mit Waschschritt
4.
5.
6.
7.
Die Probe mit dem Lysierungsreagenz 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
Die Probe 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Die Probe in 2 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
Schritt 5 wiederholen.
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