INFLUENCE DES NITRATES, DE LA SALINITÉ ET DU STRESS

235
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 235-250
INFLUENCE DES NITRATES, DE LA SALINITÉ
ET DU STRESS LUMINEUX SUR LA TENEUR EN
ACIDES GRAS ET EN ß−CAROTÈNE DE
DUNALIELLA SALINA (*)
Jam ila RIY AHI ( 1 ) , Y oussef HAOUAZINE ( 1 ) , Rachida
AKALLAL ( 1 ) , Ahl am MOURADI ( 1 ) , Anne CREACH ( 2 ) , T hierry
GIVERNAUD ( 3 ) , Azi za MOURADI ( 1 )
Cultivée vingt jours sur milieu de Johnson modifié et aéré à
32°C, Dunaliella salina a présenté en présence de 30 % de NaCl
un maximum de ß-carotène et d’acides gras pour 1 à 2 mM de
nitrate de potassium. En présence d’1 mM de nitrate de potassium,
les concentrations en ß-carotène et en acides gras sont d’autant
plus importantes que la teneur en NaCl est élevée.
Le temps de stress lumineux a peu d’influence sur le profil
des acides gras. Les acides palmitique (31,4 %), linolénique
(22,1 %) et linoléique (15,8 %) sont les plus représentés.
(*)
(1)
(2)
(3)
Manuscrit reçu le 13 mars 2006.
Laboratoire de Biochimie et Biotechnologies marines, Faculté des Sciences,
Université Ibn Tofaïl, BP 133, 14000 Kénitra, Maroc.
[email protected], [email protected], ahlemmouradi@hotmail.
com, mouradi [email protected]
Laboratoire de Cytophysiologie végétale et Phycologie, UPRESA-CNRS 8013,
Université de Lille I, Bât. SN2, 59655 Villeneuve d'Ascq Cedex, France.
[email protected]
Laboratoire de culture d'algues marines, SETEXAM, 14000 Kénitra, Maroc.
[email protected]
236
INTRODUCTION
Les microalgues marines renferment une grande variété d’acides
gras
La composition est cependant homogène au sein d’une même
classe d’algues [26]. Certains acides gras sont des descripteurs spécifiques
de peuplements phytoplanctoniques [12] et la composition en acides gras des
espèces a un intérêt taxonomique [19].
[31 ].
Parmi ces microalgues, Dunaliella salina, Chlorophycée
unicellulaire halotolérante qui vit dans les salines (salinité voisine de
350 g/l), est capable d’accumuler du ß-carotène. Ce pigment d’origine
naturelle, dix fois plus actif que le ß-carotène de synthèse, est utilisé comme
colorant alimentaire, source de vitamine A dans l’alimentation animale et
humaine et additif en cosmétologie. Les carotènes sont des
pro-vitamines A favorisant la vision de nuit et inhibant les radicaux libres
produits par les ultraviolets, grâce à leur potentiel antioxydant [20 ]. Ils
offrent ainsi une protection aux phospholipides membranaires des cellules
de la peau.
Dunaliella salina peut aussi être source d’acides gras polyinsaturés
utiles en aquaculture [2] ou comme complément alimentaire chez l’homme
[1]. Le profil de ces acides gras pourrait dépendre des conditions de culture
[21].
Le présent travail a pour but d’étudier l’effet des nitrates et de la
salinité sur la production de ß-carotène et d’acides gras et l’effet du stress
lumineux sur la composition en acides gras de Dunaliella salina.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Dunaliella salina Teodoresco est isolée à partir des salines
commerciales de la Société chérifienne des sels à Larache, sur la côte
atlantique marocaine à une vingtaine de kilomètres au sud de Tanger.
Pour tester les nitrates et la salinité, les algues sont cultivées vingt
jours dans des Erlenmeyers avec 500 ml de milieu Johnson modifié [9].
L’aération et le brassage sont assurés par une arrivée d’air continue
provenant d’un compresseur industriel et distribué par un ensemble de
tuyaux en plastique souple. Les cultures sont exposées à une lumière
continue (400 µM photons.m -2.s-1) en salle climatisée à 32°C.
237
Pour l’effet des nitrates (0, 0,5, 1, 1,5 et 2 mM KNO3), NaCl est
maintenu à 30 %.
Pour l’effet du chlorure de sodium, la concentration en nitrates étant
fixée à 1 mM, les cellules sont cultivées initialement à une salinité de
11,5 % puis transférées après 5 jours à 10, 15, 20 et 30 % de NaCl.
Pour le suivi de la croissance des cultures et par suite de la densité
cellulaire, un comptage cellulaire est réalisé régulièrement pour estimer le
nombre de cellules par unité de volume. Le dénombrement des cellules est
effectué par comptage direct sous microscope optique à l’aide d’un
hématimètre : cellule de Thomas.
Pour tester le stress lumineux, l’algue est préalablement cultivée dix
jours à 30 % de NaCl et 1 mM de nitrates à 32°C pour atteindre la phase
exponentielle de croissance, puis transférée 24 h dans un maturateur. Ce
dernier est un réacteur rectangulaire en plexiglas (38 x 18 cm) dont le
réservoir a une largeur de 14 mm afin d’exposer les algues à un maximum
de flux lumineux. La lumière est fournie par deux lampes halogènes (MTILF250W, Mazda) situées chacune à 20 cm de part et d’autre du réacteur et
qui fournissent une énergie de 1100 µM photons. m -2.s-1. Une circulation
d’eau (10 volumes/volume de matière/heure) dans des chemises situées de
part et d’autre permet de stabiliser la température du milieu de culture à 30 ±
1°C. Un bullage d’air enrichi à 1 % en CO2 permet d’homogénéiser la
suspension cellulaire [29].
Photo 1 : Dispositif pour tester le stress lumineux.
238
Les pigments sont extraits de l’algue après centrifugation 5 min à
4000 tours/min et récupération du culot dans 2 ml d’un mélange
méthanol/dichlorométhane (3/1, v/v). Une fois les solvants évaporés à sec et
sous vide, les pigments sont repris à l’obscurité dans 400 µl de
dichlorométhane et 800 µl d’eau distillée. Après centrifugation dans des
Eppendorfs 3 min à 13000 tours/min (microcentrifugeuse Sigma 1-13), il se
forme une phase supérieure aqueuse et salée et une phase inférieure
dichlorométhanique renfermant les pigments. Cette dernière est prélevée à
l’aide d’une seringue et filtrée à l’obscurité sur une membrane PTFE de
13 mm et de 0,45 µm de porosité (Interchim), puis séchée sous azote U. On
reprend avec 100 µl de méthanol.
L’analyse est effectuée ensuite par injection de 50 µl par
chromatographie liquide haute performance (colonne phase inverse Zorbax
C18 5 µm, 250 mm x 4,6 mm) avec un détecteur à barrettes de diodes (UVVis, 190-800 nm, Waters 911-25, Milleford, États-Unis).
Les lipides totaux sont extraits selon la méthode de Quessada et
Pionetti [27] adaptée de celle de Bligh et Dyer [8], version simplifiée de la
méthode classique de Folch et al. [15 ], en utilisant 10 ml de suspension
algale.
L’extraction des lipides a été réalisée sur des cellules conservées par
congélation à -30°C. Après chaque prélèvement, les algues sont plongées
immédiatement quelques minutes dans l’azote liquide pour arrêter tous les
processus métaboliques, puis elles sont conservées à -30°C jusqu'au moment
de l’extraction.
Le milieu de culture est éliminé après décongélation par une
centrifugation à 1200 g 10 min à 4°C. Le culot cellulaire est repris et les
cellules, qui sont dénuées de paroi [10], sont cassées de manière efficace par
congélation-décongélation à l’aide de l’azote liquide.
Pour environ un gramme de culot cellulaire, on ajoute 3,75 ml de
méthanol/chloroforme (2/1 ; v/v). Après une nuit à température ambiante,
on centrifuge. Le surnageant S1 est conservé et le culot est repris par
4,75 ml de mélange méthanol/chloroforme/eau (2/1/0,8 ; v/v/v). On agite
vigoureusement, puis on centrifuge 10 min à 1500 g. Le surnageant obtenu
est réuni avec S1 et 2,5 ml d’eau puis 2,5 ml de chloroforme y sont ajoutés.
L’ensemble est agité vigoureusement puis centrifugé 10 min à 3000 g pour
séparer la phase aqueuse supérieure et la phase organique inférieure
contenant les lipides qui sera prélevée et supplémentée de 20 µg de C17:0
comme étalon interne (l’acide heptadécanoïque ne se trouve pas à l’état
naturel). L’ensemble est séché sous un courant d’azote anhydre afin d’éviter
l’oxydation des doubles liaisons des acides gras en présence de l’oxygène
atmosphérique [18] et à forte température.
239
Pour hydrolyser les liaisons esters, libérer les acides gras et former
des esters méthylés des acides gras, un mélange méthanol/acide sulfurique
(9,75/0,25 ; v/v) a été utilisé. 3 ml de ce mélange sont ajoutés aux résidus
lipidiques secs. Le mélange est maintenu 45 min à 70°C dans un bain-marie.
En fin de réaction, après refroidissement dans un bain de glace, les esters
méthyliques d’acides gras sont extraits par 3 ml d’hexane et 1 ml d’eau
distillée. Le mélange est agité vigoureusement à la main, puis laissé
décanter avant de prélever la phase organique supérieure qui contient les
acides gras méthylés. La solution ainsi obtenue est évaporée sous azote et le
résidu sec est repris dans 10 à 20 µl d’hexane puis 1 µl du mélange est
injecté dans le chromatographe.
Le dispositif adopté est un chromatographe Shimadzu GC-14A muni
d’une colonne capillaire (BPX70, 30 m x 0,2 mm) à phase stationnaire
polaire composée de 70 % de biscyanopropyl polysilphénylène-siloxane et
d’un détecteur à ionisation de flamme. Le gaz vecteur est l’hélium à 2
ml/min. Le gradient de température est de 90°C pendant 2 minutes, puis
10°C/min jusqu’à 140°C suivis de 2°C/min jusqu’à 210°C, température
finale maintenue constante pendant 5 min.
L’identification des acides gras est réalisée par comparaison avec des
standards (Sigma) et la masse des acides gras totaux est estimée par le
rapport de la surface de leurs pics à celle du pic de C17:0.
RÉSULTATS
Effet de la concentration en nitrates
Pour une salinité fixe de 30 %, la concentration de nitrates optimale
pour la production de ß-carotène correspond à 1 mM (Figure 1A) et à
12,46 pg/cellule). La production est moyenne pour 0,5 mM et inefficace
pour les autres concentrations.
240
Fig. 1 : Effet du nitrate de potassium sur la production de ß-carotène (A) et
d’acides gras totaux (B) chez Dunaliella salina cultivée vingt jours sur le
milieu Johnson modifié à 32°C en présence de 30 % de NaCl.
La teneur en acides gras reste quasiment nulle en absence de nitrates
(Figure 1B). Elle augmente au cours de la culture en présence de nitrates.
Les plus fortes concentrations (1-2 mM) sont plus efficaces que 0,5 mM.
Effet de la salinité
Le contenu cellulaire en ß-carotène augmente avec les
concentrations en sel : les plus fortes concentrations en ß-carotène sont
obtenues avec 30 % de sel (Figure 2A). On observe un plateau à partir du
quinzième jour de culture.
241
Fig. 2 : Effet de la salinité sur la production de ß-carotène (A) et d’acides
gras totaux (B) chez Dunaliella salina cultivée vingt jours sur le milieu
Johnson modifié à 32°C en présence d’1 mM de nitrate de potassium.
De même, la production cellulaire d’acides gras totaux augmente
avec la quantité de sel (Figure 2B). Au vingtième jour de culture, elle est de
50 µg/ml pour 10 % de sel contre 250 µg pour 30 %.
Effet du stress lumineux
On observe une baisse de la teneur en acides gras pendant les
premières heures de stress lumineux (Tableau I). Elle est maximale à 10
heures et la teneur réintègre plus ou moins sa valeur initiale à 24 heures.
242
Tableau I :
Teneurs (µg/ml) en acides gras en fonction de la durée du stress
lumineux de Dunaliella salina en phase exponentielle de croissance sur
milieu Johnson modifié en présence de 30 % de NaCl et 1 mM de
KNO3.
Acides gras
0h
5h
10 h
24 h
Moyenne
14:0
2,84
1,79
1,53
2,82
2,24
16:0
134,68
104,71
62,82
116,25
104,61
trans-16:1
1,49
1,01
0,65
0,95
1,02
cis-16:1
13,89
9,21
4,90
10,55
9,63
trans-16:2
6,21
4,72
2,22
3,69
4,21
cis-16:2
26,97
15,28
8,45
12,07
15,69
16:3
2,23
3,21
1,24
2,46
2,28
16:4
32,47
21,74
12,70
26,37
23,32
18:0
4,92
6,71
4,55
7,35
5,88
trans-18:1
39,83
31,64
12,44
20,79
26,17
cis-18:1
0,00
0,00
3,75
7,66
2,85
trans-18:2
78,17
55,69
28,09
54,73
54,17
cis-18:2
0,00
0,00
2,76
0,00
0,69
18:3
97,92
67,95
43,66
86,41
73,98
18:4
5,32
5,63
1,53
4,07
4,13
20:0
0,83
1,56
0,00
0,00
0,59
20:5
6,32
3,81
2,32
4,06
4,12
22:0
0,73
0,35
0,00
0,00
0,27
22:2
1,06
0,30
0,30
0,50
0,54
Total acide gras saturés
144,00
115,12
68,90
126,42
Total acide gras insaturés
311,87
220,19
125,00
234,30
Total
455,87
335,31
193,90
360,72
Les acides gras les plus représentés (Tableau II, Figure 3) sont à
24 heures l’acide palmitique (16:0, 32,2 %), suivi des acides linolénique
(18:3, 24,0 %), linoléique (trans-18:2, 15,2 %), hexadécatétraénoïque (16:4,
7,3 %), oléique (trans-18:1 5,8 %), hexadécanoïque (cis-16:2, 3,4 %) et
stéarique (18:0, 2,0 %).
Le temps de stress lumineux a peu d’influence sur le profil. Le
pourcentage d’acides gras saturés tend à augmenter par rapport à celui
d’acides gras insaturés avec le stress lumineux (Tableau II).
243
Tableau II :
Pourcentages d’acides gras en fonction de la durée du stress lumineux
de Dunaliella salina en phase exponentielle de croissance sur milieu
Johnson modifié en présence de 30 % de NaCl et 1 mM de KNO3.
Acides gras
0h
5h
10 h
24 h
Moyenne
14:0
16:0
trans-16:1
0,62
29,54
0,33
0,53
31,23
0,30
0,79
32,40
0,33
0,78
32,23
0,26
0,68
31,35
0,30
cis-16:1
3,05
2,75
2,53
2,92
2,81
trans-16:2
1,36
1,41
1,15
1,02
1,23
cis-16:2
5,92
4,56
4,36
3,35
4,55
16:3
0,49
0,96
0,64
0,68
0,69
16:4
7,12
6,48
6,55
7,31
6,86
18:0
1,08
2,00
2,35
2,04
1,86
trans-18:1
8,74
9,43
6,41
5,76
7,58
cis-18:1
0,00
0,00
1,93
2,12
1,01
trans-18:2
17,15
16,61
14,49
15,17
15,83
cis-18:2
0,00
0,00
1,42
0,00
0,35
18:3
21,48
20,27
22,52
23,95
22,06
18:4
1,17
1,68
0,79
1,13
1,19
20:0
0,18
0,47
0,00
0,00
0,16
20:5
1,39
1,14
1,19
1,13
1,21
22:0
0,16
0,10
0,00
0,00
0,06
22:2
0,23
0,09
0,15
0,14
0,15
Total acide gras saturés
31,58
34,33
35,54
35,05
Total acide gras insaturés
68,42
65,67
64,46
64,95
Le pourcentage de trans-18:1 diminue alors que celui de cis
augmente : en 10 heures, le premier passe de 8,7 à 6,4 % alors que le
deuxième passe de 0 à 1,9 %. Par ailleurs, le cis-18:2 n’a été détecté qu’à 10
h d’éclairement. Les acides gras saturés à longue chaîne de carbone, 20:0
(éicosanoïque ou arachidique) et 22:0 (décosanoïque ou béhénique), sont
présents à de faibles pourcentages entre 0 et 5 heures et sont non détectés
après (Tableau II).
244
Fig. 3 : Effet du temps de stress lumineux sur la composition en
acides gras de Dunaliella salina en phase exponentielle de croissance sur
milieu Johnson modifié en présence de 30 % de NaCl et 1 mM de KNO3.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Pour une salinité fixe de 30 %, la teneur en ß-carotène est apparue
faible et n’a pas varié en absence de nitrates. Au contraire, Ben-Amotz et al.
[6] ont observé sur un milieu pauvre en nitrates une croissance de Dunaliella
salina accompagnée d’une production importante de ß-carotène. Ces auteurs
ont constaté qu’en condition de stress (milieu pauvre en nitrates, salinité
élevé, exposition à de fortes intensités lumineuses), le rapport
ß-carotène/chlorophylle totale augmente et est inversement proportionnel à
la croissance. De même, Phadwal et Singh [25] ont trouvé que la diminution
de la concentration en nitrates, phosphates et sulfates diminue le taux de
croissance et le contenu chlorophyllien, mais augmente le taux de
ß-carotène. Ces derniers auteurs ont aussi observé une augmentation du taux
d’acides gras avec des teneurs croissantes de nitrates, en accord avec nos
résultats.
245
Au cours de ce travail, les taux d’acides gras et de ß-carotène ont
augmenté avec la concentration en sel. Ces résultats concordent avec ceux
de Ben-Amotz et al. [6], ou encore d’Haouazine et al. [17] qui ont montré
que la concentration en ß-carotène est proportionnelle à la concentration en
chlorure de sodium et confirment la capacité de cette algue à croître dans
son milieu naturel saumâtre.
L’élaboration du ß-carotène est corrélée avec une augmentation de
l’activité d’une pyrophosphatase inorganique liée à l’augmentation de la
salinité du milieu [24 ]. La pyrophosphatase hydrolyse le pyrophosphate
produit au cours de la caroténogenèse, pyrophosphate dont l’accumulation
inhibe la phytoène synthase et par conséquent la synthèse de ß-carotène.
L’algue répond au stress osmotique par régulation du flux de
carbone entre la synthèse d’amidon dans le chloroplaste et la production de
glycérol (CH2OH-CHOH-CH2OH) dans le cytoplasme [5]. Le glycérol
intracellulaire sert à équilibrer osmotiquement le sel extracellulaire [3].
Dans les organismes vivants, le glycérol est un composant important
des glycérides (graisses et huiles) et des phospholipides. Quand les graisses
stockées sont utilisées comme source d'énergie, du glycérol et des acides
gras sont libérés.
L'algue halotolérante Dunaliella répond au stress hyperosmotique
par la synthèse de quantités massives de glycérol [11,33].
Le ß-carotène accumulé aux fortes intensités lumineuses chez
Dunaliella salina [4] a pour fonction la protection de la cellule contre les
radiations excessives [22]. Les autres espèces de Dunaliella sont par contre
incapables d’accumuler une grande quantité de ß-carotène sous une forte
irradiation [7]. L’accumulation de ß-carotène par Dunaliella salina se fait à
l’intérieur de petits globules lipidiques dans les espaces interthylakoïdes des
chloroplastes [28]. Les acides gras favorisent ainsi la stabilité de la structure
des globules.
L’algue s’adapte au stress lumineux et réintègre en 24 heures sa
teneur initiale en acides gras. Le stress lumineux a peu d’effet sur la
composition en acides gras, les acides gras polyinsaturés représentant
environ le double des saturés.
246
La composition en acides gras de la souche de Dunaliella salina
étudiée est proche de celles décrites par d’autres auteurs [16,30,32], à
l’exception de l’acide myristique (14:0) dont le faible pourcentage (0,62%)
contraste avec les proportions élevées trouvées par Mooney et al. [23 ]
(23,14 % chez Dunaliella tertiolecta) et Mendoza et al. [21] (24,8 % chez
D. salina). Les différences de profil peuvent s’expliquer par les conditions
environnementales [13] ou les différentes phases de croissance en culture
[14].
Nos résultats confortent l’utilisation de Dunaliella salina comme
organisme modèle pour la bioproduction en grande quantité de produits
chimiques d’intérêt industriel.
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ABSTRACT
Influence of nitrates, salinity and luminous stress on the level of fatty
acid and ß-carotene in Dunaliella salina
Cultivated 20 days on modified Johnson medium aerated at 32°C,
Dunaliella salina with 30% NaCl gave a maximum level of ß-carotene and
fatty acids for 1 to 2 mM potassium nitrate. With 1 mM KNO3, ß-carotene
and fatty acids increased with higher NaCl concentrations.
Light stress duration had little influence on the fatty acid profile.
Palmitic (31.4%), linolenic (22.1%) and linoleic acids (15.8%) were the
most represented.
Key-words: ß-carotene, Dunaliella salina, fatty acids, light stress,
nitrates.
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