The Amazing Virology

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The Amazing Virology
Virologie - Maîtrise de Biochimie Structurale de La Rochelle 2001-2002
1. Historique............................................................................................................................................................ 5
2. Définition des virus ............................................................................................................................................. 6
2.1. Les acides nucléiques viraux : ..................................................................................................................... 6
2.1.1. Les ADN viraux :................................................................................................................................. 7
2.1.1.1. Les virus à ADN monocaténaire :................................................................................................ 7
1.1.1.1.1. Virus à ADN monocaténaire circulaire : .............................................................................. 7
2.1.1.1.1. Virus à ADN monocaténaire linéaire : ................................................................................. 7
2.1.1.2. Virus à ADN bicaténaire.............................................................................................................. 7
2.1.1.2.1. Virus à ADN capables de se circulariser :............................................................................ 8
2.1.1.2.1.1. Les urophages :............................................................................................................. 8
2.1.1.3. Cartographie des ADN viraux.................................................................................................... 10
2.1.1.3.1. Avec des enzymes de restriction ........................................................................................ 10
2.1.1.3.2. Séquençage......................................................................................................................... 10
2.1.1.3.2.1. Méthode de Maxam et Gilbert.................................................................................... 10
2.1.1.3.2.2. Méthode de Sanger ..................................................................................................... 10
1.1.1.1.2. Clonage .............................................................................................................................. 10
2.1.2. Les ARN viraux................................................................................................................................. 11
2.1.2.1. Détermination de la structure primaire des ARN....................................................................... 11
2.1.2.2. Méthode des séquences.............................................................................................................. 11
2.1.2.3. Particularité structurale des ARN viraux de type eucaryote ...................................................... 11
2.1.2.3.1. Génome non fragmenté ...................................................................................................... 11
2.1.2.3.1.1. Structure en 5’ des ARN viraux ................................................................................. 11
2.1.2.3.1.2. Structure en 3’ des ARN viraux ................................................................................. 11
2.1.2.3.2. Virus à ARN non messager ................................................................................................ 11
2.1.2.3.3. Expression des gènes des virus à ARN .............................................................................. 12
2.1.2.3.3.1. Chez les phages ............................................................................................................... 12
2.1.2.3.3.2. Cas des virus eucaryotes ................................................................................................ 12
2.1.3. Les protéines capsidiales ................................................................................................................... 13
2.1.4. Les protéines internes du virion......................................................................................................... 13
2.1.4.1. Adénovirus................................................................................................................................. 13
2.1.4.2. Papovavirus................................................................................................................................ 13
2.1.5. Les enzymes ...................................................................................................................................... 14
3. Méthodes d'étude des virus ............................................................................................................................... 14
3.1. Purification des virus................................................................................................................................. 14
3.1.1. Choix de l'hôte ................................................................................................................................... 14
3.1.2. Tampon d'extraction .......................................................................................................................... 14
3.1.3. Clarification des extraits cellulaires................................................................................................... 14
3.1.3.1. Centrifugation à basse vitesse .................................................................................................... 14
3.1.3.2. Dénaturation thermique.............................................................................................................. 14
3.1.3.3. Utilisation de solvants organiques ............................................................................................. 14
3.1.4. Récupération des virions.................................................................................................................... 14
3.2. Utilisation des méthodes physico-chimiques d'étude des virus ................................................................. 15
3.2.1. Microscopie électronique................................................................................................................... 15
3.2.1.1. Observation du virion................................................................................................................. 15
3.2.1.2. Observation des acides nucléiques............................................................................................. 16
3.2.2. Diffraction aux rayons X ................................................................................................................... 16
3.2.3. Diffraction à neutron.......................................................................................................................... 16
3.2.4. Diffraction optique............................................................................................................................. 16
3.2.5. Electrophorèse ................................................................................................................................... 16
3.2.6. Ultracentrifugation............................................................................................................................. 16
3.2.7. Hybridation moléculaire .................................................................................................................... 17
3.2.8. Titrage des virus ................................................................................................................................ 18
3.2.8.1. Titrage des bactériophages......................................................................................................... 18
3.2.8.2. Titrage des virus animaux .......................................................................................................... 18
3.2.8.3. Dosage des antigènes viraux ...................................................................................................... 18
3.2.8.3.1. Les antigènes ...................................................................................................................... 18
3.2.8.3.2. Les anticorps ...................................................................................................................... 18
3.2.8.3.3. Divers types de réactions sérologiques............................................................................... 19
3.2.8.3.3.1. Immunoprécipitation .................................................................................................. 19
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3.2.8.3.3.2. Immunoprécipitation en gel........................................................................................ 20
3.2.8.3.3.3. Immunoélectrophorèse qualitative.............................................................................. 21
3.2.8.3.3.4. Immunoélectrophorèse quantitative : Méthode de Laurell ......................................... 21
3.2.8.3.3.5. Immunoélectrophorèse croisée ................................................................................... 21
3.2.8.3.3.6. Méthode de fixation des compléments ....................................................................... 21
3.2.8.3.3.7. Méthode d'agglutination ............................................................................................. 21
3.2.8.3.3.8. Radio Immuno Assay ................................................................................................. 22
3.2.8.3.3.9. Techniques immunoenzymatiques.............................................................................. 22
3.2.8.3.3.10. Séroneutralisation ..................................................................................................... 22
3.2.8.3.3.10. Révélation après un Western-Blot ............................................................................ 22
4. Classification des virus...................................................................................................................................... 24
5. Les interactions Virus-Cellule........................................................................................................................... 25
5.1. Cycle de multiplication.............................................................................................................................. 25
5.1.1. Adsorption ......................................................................................................................................... 25
5.1.1.1. Cas des myxovirus ..................................................................................................................... 25
5.1.1.2. Cas des bactériophages .............................................................................................................. 25
5.1.2. Pénétration ......................................................................................................................................... 25
5.1.2.1. Cas des bactériophages .............................................................................................................. 25
5.1.2.2. Cas des virus animaux................................................................................................................ 26
5.1.2.2.1. Pénétration par pinocytose ................................................................................................. 26
5.1.2.2.2. Pénétration par fusion membranaire................................................................................... 27
5.1.3. Multiplication .................................................................................................................................... 27
5.2. Permissivité cellulaire ............................................................................................................................... 27
5.3. Les différents types d’interaction Virus-Cellule........................................................................................ 28
5.3.1. Interaction productive ........................................................................................................................ 28
5.3.2. Interaction abortive ............................................................................................................................ 29
5.3.3. Interaction intégrative ........................................................................................................................ 29
5.3.4. Interaction persistante ........................................................................................................................ 29
5.4. Interactions entre les virus......................................................................................................................... 29
5.4.1. Les virus défectifs et les helpers ........................................................................................................ 29
5.4.1.1. La défectivité ............................................................................................................................. 29
5.4.1.2. La défectivité naturelle............................................................................................................... 30
5.4.1.3. Transcapsidation et pseudotype ................................................................................................. 30
5.4.1.4. Défectivité conditionnelle et complémentation.......................................................................... 30
5.4.2. Interactions ........................................................................................................................................ 30
5.4.2.1. L’interférence............................................................................................................................. 30
5.4.2.2. Stimulation (enhancement) ........................................................................................................ 30
5.4.2.3. Recombinaison génétique .......................................................................................................... 30
5.4.2.4. Réassortiment génétique ............................................................................................................ 30
5.4.2.5. Réactivation génétique............................................................................................................... 31
5.4.2.6. Hétérodiploïdie .......................................................................................................................... 31
5.4.2.7. Mélange phénotypique............................................................................................................... 31
5.5.3. Interférences entre virus et animaux .................................................................................................. 32
5.5.3.1. Interférence au niveau pénétration ............................................................................................. 32
5.5.3.2. Interférence homologue et particule D.I (Défectives Interférentes)........................................... 32
5.5.3.3. L’interférence avec la multiplication du virus assistant. ............................................................ 32
5.5.3.4. Interférence par exclusion entre virus hétérologues................................................................... 32
5.5.4. La réponse de la cellule à l’infection virale ....................................................................................... 33
5.5.4.1. Cas de la cellule bactérienne ...................................................................................................... 33
5.5.4.2. La production d’interféron ......................................................................................................... 33
5.5.4.2.1. Les interférons.................................................................................................................... 33
5.5.4.2.2. Les inducteurs d’INF.......................................................................................................... 33
5.5.4.2.3. Le mode d’action des INF .................................................................................................. 34
5.5.4.2.4. Autres fonctions des interférons......................................................................................... 36
6. Adsorption et pénétration des virus................................................................................................................... 37
6.1. Adsorption des virus.................................................................................................................................. 37
6.2. Pénétration du génome viral ...................................................................................................................... 37
7. Multiplication des virus et généralités............................................................................................................... 40
7.1. La phase de latence.................................................................................................................................... 40
7.2. Multiplication des virus à ADN................................................................................................................. 40
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7.3. Multiplication des virus à ARN................................................................................................................. 40
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1. Historique
La virologie fait son apparition suite à des observations d’Ivanowski (1892) sur les plants de tabac. Il dit que la
mosaïque du tabac était due à un agent ultrafiltrant (qui traversent les membranes les plus fines). Ivanowski
s’était basé sur des observations que Crove (1720) avait faites sur le panachage des tulipes qu’il appela le «
breaking ». En greffant une partie panachée sur une tulipe saine, le panachage se propage, une « animalcule »
semblerait agir….
En 1886, Meyer reprend les études de Crove, en l’appliquant à la mosaïque du tabac (ToMV : Tobacco Mosaic
Virus). L’utilisation d’alcool élimine le pouvoir infectieux (les acides nucléiques précipitent). Le « principe
infectieux » ainsi observé devait avoir toutes les caractéristiques des êtres vivants, ça devait être une bactérie
dotée de pouvoir spécifiques.
L’apparition de Virus Filtrant viendra de la filtration d’un broyat de plante marbrée sur système Chamberland
car l’agent pathogène doit être de taille inférieure à celle des bactéries.
Selon Beijewinck, l’agent responsable pouvait diffuser à travers de l’Agar et surtout, pouvait rester infectieux
même après un long temps passé sur la paillasse.
Une succession de découvertes de 1911 à nos jours vont ensuite faire évoluer la virologie :
1911 : Rous montre que les sarcomes de la poule sont dus à des agents ultrafiltrables.
1915-1917 : les bactéries peuvent être infectées par des agents plus petits (Twart/ Herelle).
Twart va ensemencer des milieux de cultures avec des pustules provoquées par la vaccine, il obtient des colonies
de Micrococcus. Ces colonies deviennent transparentes au bout d’un certain temps et cette transparence peut se
passer à des colonies saines et ce, jusqu’à une dilution de 10-6. C’est aussi un virus ultrafiltrant qui est à la base
de cette transparence.
Puisque ces virus ne se développent pas seuls, ils nécessitent un hôte, 3 interprétations sont alors possibles :
û La maladie bactérienne correspond à un stade de vie (trop complexe et peu convaincant)
û L’agent de la maladie est peut-être une enzyme capable de détruire les Microcoque. Cette
enzyme peut s’autodupliquer dans certains cas.
û La maladie est due à un virus qui se multiplie dans la bactérie et fini par détruire celle-ci.
En 1917, D’Herelle, qui faisait les mêmes découvertes que Rous en parallèle, affirme qu’une bactérie est
nécessaire pour que le virus puisse se développer.
Hallard va montrer qu’il y a précipitation au sulfate d’alumine et qu’il y toujours infection.
1925 : Dvorjak met en évidence l’antigénicité.
1933 : Des « bâtonnets » montrent une double réfraction.
1935 : Stanley précipite sélectivement au sulfate d’ammonium et obtient une protéine cristallisable présentant
toutes les propriétés infectieuses du virus.
1936 : Bowden montre que le VMT (agent autocatalytique qui nécessite une cellule vivante pour se reproduire)
est une nucléoprotéine (partie nucléique + partie protéique) dont la partie nucléique contient du ribose.
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2. Définition des virus
Virion : Unité structurale des virus composée d’une capside, d’une molécule d’acide nucléique et, dans certains
cas, d’une enveloppe. Les virions apparaissent sous forme de figure géométrique simple. Il est à noter que ce
sont des parasites absolus.
La particule virale est un virion. « Virion » a une connotation de virus fils et est le produit ultime de la phase de
développement viral, la particule infectante étant le virus père.
Un virion est défini selon Lwoff en 1953 par les 5 points suivants :
1. Il ne possède qu’un seul type d’acide nucléique, soit ADN, soit ARN.
2. Le virion se reproduit à partir de son seul acide nucléique.
3. Le virion est incapable de croître et de subir des divisions binaires.
4. Le virion ne possède aucune information génétique concernant les enzymes du métabolisme intermédiaire
producteur d’énergie.
5. La multiplication du virion nécessite l’utilisation des structures de la cellule hôte et plus spécialement de ses
ribosomes.
La classification de Lwoff ne tient pas compte du mode de propagation ni de la spécificité d’hôte.
L’acide nucléique du virion (ARN ou ADN,
simple brin ou double brin), associé à des
protéines (nucléoprotéines), est entouré par la
capside et parfois par l’enveloppe.
La capside est une enveloppe protéique qui
entoure le virion et le protège, composée de
sous-unités ou monomères apparemment
équivalents mais de compositions chimiques
souvent différentes. Le nombre de
monomères ou capsomères est constant chez
un virus. Au sein de cette capside, on peut
rencontrer certaines protéines nécessaires aux
premières phases de l’infection (ex : Reverse
Transcriptase, ARNpol/ARNdépendante…)
ou encore des protéines de structure
L’enveloppe est composée de plusieurs types
de molécules (protéines virales, protéines
cellulaires, et autres molécules d’origines
cellulaires (lipides et polysaccharides)). A la
surface de l’enveloppe ou de la capside, on trouve des spicules (spikes). Ces spicules peuvent avoir différentes
propriétés (reconnaissance de récepteur, antigène, enzyme).
L’acide nucléique viral, ses protéines associées et la capside forment la nucléocapside. Chez les virus nus, la
nucléocapside est le virus. Chez les virus enveloppés, le virus est formé de la nucléocapside et de l’enveloppe.
2.1. Les acides nucléiques viraux :
Ces acides nucléiques peuvent être de l’ADN ou de l’ARN circulaire ou linéaire, segmenté ou non segmenté.
Les acides nucléiques viraux sont directement ou indirectement infectieux. Par ex : les virus à ARN sont
ARN(+) ou (-). Seuls les ARN(+) sont directement codants.
Le génome de certains virus est fragmenté.
Dans certains cas, l’ARN peut être infectieux seul alors que dans d’autres cas, il nécessite la présence de
protéines virales.
En 1952, Hershey et Chase mettent en évidence le pouvoir pathogène de l’ADN du phage T2. Le virus n’a pas
besoin de ses protéines pour être infectieux (cf. schéma suivant).
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En 1956, le même phénomène est observé avec le TMV (Virus de la Mosaïque du Tabac) : une nécrose de la
plante est induite seulement avec l’ARN du TMV.
Chez les Paramyxovirus et les Rhabdovirus (virus à ARN), ce type d’induction avec l’ARN seul n’est pas
possible car dû à la présence d’une enzyme dans la capside qui copie l’ARN(-) en ARN(+) infectieux.
2.1.1. Les ADN viraux :
De structure similaire à l’ADN cellulaire, la double hélice est le plus souvent sous forme B droite, dextrogyre. Il
peut être sous forme Z (11 bases/tours au lieu de 10). Le DNA A (plus compacte que la B) à 11 nucléotides mais
le diamètre de la fibre est de 2,3 nm et d’hydratation forte (75%). L’ADN évolue constamment entre ces 3
formes du fait des variations de milimolarités locales. Souvent sous formes surenroulées et compactées, ils
peuvent être aussi circulaires ou linéaires. L’ADN viral est entouré d’une forte sphère d’hydratation.
La composition des ADN viraux est très caractéristique des virus.
Les intercalants et les topoisomérases peuvent agir sur l’ADN viral.
Les ADN viraux peuvent posséder un haut taux de modification (méthylation, glycosylation, …).
2.1.1.1. Les virus à ADN monocaténaire :
1.1.1.1.1. Virus à ADN monocaténaire circulaire :
Ex : ΦX174, fd, Geminivirus
Leur composition en base est assez inhabituelle : A?T et G?C. De plus, quand on chauffe, on n’observe pas
d’effet hyperchrome. Cela est caractéristique d’un ADN monocaténaire. La forme réplicative est toujours
bicaténaire, ainsi que la forme infectieuse (la transcription se fait sur l’un des 2 brins). Les géminivirus ont une
taille inférieure à celle de phages.
2.1.1.1.1. Virus à ADN monocaténaire linéaire :
Ex : Parvovirus
Ce sont des petits virus qui nécessitent le plus souvent un « helper », virus associé (Ex : Adénovirus pour
l’AAV). L’ADN fait 104 pb quand il est déroulé, il est plus petit car composé de 2 molécules de 5.103 pb de
polarités inverses.
2.1.1.2. Virus à ADN bicaténaire
Ce sont les plus nombreux. Il existe des virus à ADN linéaire, circulaire ou capable de se circulariser.
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2.1.1.2.1. Virus à ADN capables de se circulariser :
2.1.1.2.1.1. Les urophages :
û
Les phages ? :
En gradient de sucrose, on obtient deux formes :
Par chauffage de la forme circulaire et refroidissement rapide, on obtient
une forme linéaire. Par chauffage de la forme linéaire suivit d’un
refroidissement lent, on obtient une forme circulaire ainsi que des
concatémères. Cela est du à la présence de séquences complémentaires à
chaque extrémité du génome (les séquences cohésives ou séquences cos).
La forme linéaire et la forme pseudo-circulaire existent dans la nature.
û
Les phages T pairs
Ex : le phage T4
Ils possèdent un ADN linéaire double chaîne de 160 kpb. La forme circulaire est minoritaire. Les deux brins
portent globalement la même séquence, mais il peut y avoir des permutations circulaires dans le génome.
Ces différences de position de gène peuvent être dues à des erreurs de coupure lors de la réplication selon le
modèle du cercle roulant.
Parfois le système de coupure fait une erreur, on
peut obtenir des phages à grosse tête contenant des
acides nucléiques plus long que prévu.
û
Les Adénovirus
Ce sont des virus à ADN bicaténaire. Suivant le type d’extraction utilisé, on
trouve des formes linéaires et des formes circulaires. L’extraction à la guanidine
par exemple donne une forme circulaire alors qu’une extraction avec une
protéase donne une forme linéaire.
La circularisation est due à une interaction entre les protéines 55K que l’on
trouve à chaque extrémité 5’ de l’ADN. Les 55K sont liées de façon covalente à
la dCytosine terminale
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Une autre forme de circularisation peut exister : la structure en « queue de poêle ». C’est une
forme circulaire monocaténaire due à la présence de séquences répétées cohésives aux
extrémités 5’ et 3’ du brin d’ADN
û
Les herpèsvirus
L’ADN des herpèsvirus présente une partie sous forme bicaténaire et deux parties sous forme monocaténaire.
Les parties monocaténaires forment des boucle : une grande (L) et une petite (S).
û
Les poxvirus
Ce sont des virus à ADN bicaténaire. Les deux brins sont liés très fortement à
leurs extrémités.
On a alors deux formes possibles :
Soit les deux brins s’apparient, soit deux génomes s’apparient.
On peut également obtenir des structures en queue de poêle en conditions dénaturantes grâce à la présence de
séquences complémentaires aux extrémités du brin d’ADN.
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2.1.1.3. Cartographie des ADN viraux
2.1.1.3.1. Avec des enzymes de restriction
Il existe des profils de restriction spécifique. On a des profils différents en utilisant des enzymes de restriction
différentes.
2.1.1.3.2. Séquençage
2.1.1.3.2.1. Méthode de Maxam et Gilbert
Cette méthode historique utilise les propriétés d’enzymes de restriction qui ne coupent qu’après certaines bases.
L’ADN est marqué en 5’ par un ?32P (radioactif) grâce à la PNK. L’ADN est méthylé en A et en G, puis on
réalise un traitement alcalin. Cela a pour effet de couper après les G. Selon les conditions, on peut couper après
G si il est suivit de A, ou encore, après C. On réalise une électrophorèse avec les fragments obtenus.
2.1.1.3.2.2. Méthode de Sanger
C’est la méthode la plus utilisée actuellement, elle est basée sur une méthode d’élongation.
On introduit dans le milieu contenant la polymérase et les dNTP, un ddNTP qui, ne possédant pas de OH en 3’,
empêche l’élongation de la chaîne quand il est incorporé. On réalise quatre milieux contenant chacun un ddNTP
différent. On obtient ainsi des fragments de différentes longueurs selon l’endroit ou a été incorporé le ddNTP.
Les amorces nécessaires à la polymérase sont marquées à la biotine, avec un chromophore ou radioactivement.
Ceci permet la détection des fragments.
Cette méthode est beaucoup plus rapide, et permet de séquencer jusqu’à 500 nucléotides sur plaque et jusqu’à
1000 sur automate.
1.1.1.1.2. Clonage
Voir cours d’expression génétique.
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2.1.2. Les ARN viraux
Ils ont les mêmes structures que les ARN ordinaires. L’ARN est en général sous forme simple brin, bien qu’il
existe des exceptions. Les ARN peuvent avoir une activité ribozymique.
2.1.2.1. Détermination de la structure primaire des ARN
On utilise deux RNases :
• La RNase pancréatique, qui coupe après les nucléotides pyrimidiques.
• La RNase T1 qui laisse des G en position terminale.
On réalise ensuite une électrophorèse bidimensionnelle.
2.1.2.2. Méthode des séquences
On utilise différentes RNases (5 à 6). C’est une méthode très fastidieuse.
On préfère séquencer l’ADNc correspondant à l’ARN, avec la méthode de Sanger.
2.1.2.3. Particularité structurale des ARN viraux de type eucaryote
2.1.2.3.1. Génome non fragmenté
C’est le cas de la majorité des virus à ARN. Leur structure permet de dégager trois groupes :
- 1er groupe : coiffe en 5’ et polyA en 3’
- 2ème groupe : 5’ bloqué par une protéine et polyA en 3’. (Ex : poliovirus.)
- 3ème groupe : sans coiffe ni polyA. C’est le cas de nombreux virus de plantes et de nombreux virus de
procaryotes.
2.1.2.3.1.1. Structure en 5’ des ARN viraux
û Coiffe
C’est un nucléotide terminal méthylé, 7mG en général, bien que d’autres nucléotides puissent être méthylés et
que la méthylation puisse se faire sur d’autre position. La coiffe est nécessaire à la traduction.
û 5’ terminé par une protéine
La protéine terminale est liée à un U. Elle intervient dans la réplication et la protection. On en trouve chez les
plantes. Il y a un espace entre la protéine et le génome qui, bien que n’étant pas traduit, est indispensable. La
structure 3D joue un rôle très important ici (ex : picornaviridae).
2.1.2.3.1.2. Structure en 3’ des ARN viraux
û PolyA
Le polyA peut-être plus ou moins long. On le trouve chez les virus directement codants. Il a un rôle dans
l’adressage de l’ARN et dans la protection contre les nucléases.
û 3’ pouvant fixer un acide aminé
L’ARN se comporte de façon similaire à un ARNt. Le polyA doit être absent ou très court. La présence de
l’acide aminé est indispensable pour la traduction. Ce cas n’est pas observé chez les animaux.
û Rien en 3’
C’est le cas de nombreux virus de plante, de phage, et de virus à génome fragmenté.
2.1.2.3.2. Virus à ARN non messager
L’ARN du virus n’est pas directement codant.
û Virus à ARN bicaténaire
Aucun des deux brins ne possède de coiffe ni de polyA.
L’un des deux brins est transcrit par une transcriptase (ARNpol/ARNdépendante). Ceci produit un brin
d’ARN(+) (avec coiffe et polyA).
û Virus à ARN monocaténaire
Le passage par un ARNm grâce à une transcriptase est indispensable pour que le virus s’exprime.
û Virus à ARN passant par un ADN
C’est le cas chez les rétrovirus qui passent par un ADNc qui s’intègre au génome cellulaire.
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2.1.2.3.3. Expression des gènes des virus à ARN
Cistron : séquence codante pour une protéine
ORF (Open Reading Frame): cadre de lecture ouvert. Il commence par un AUG et fini par un codon stop.
2.1.2.3.3.1. Chez les phages
Ex : les phages MS2 et R17
Ils ont quatre cistrons. Seul l’AUG codant pour la protéine de capside est directement accessible ce qui met en
évidence l’importance de la structure 3D. Quand la protéine de capside est traduite, la réplicase est traduite à son
tour, quand celle-ci est produite en grande quantité, elle inhibe sa propre production (par fixation sur le site
d’entrée du ribosome), mais pas celle des protéines de capsides.
La protéine nécessaire pour rendre le phage infectieux n’est pas accessible directement sur l’ARN. Au moment
de la copie de l’ARN, l’AUG est disponible ce qui permet de produire la protéine qui rend infectieux.
2.1.2.3.3.2. Cas des virus eucaryotes
Il existe 3 systèmes :
- La maturation de l’ARNm
- La maturation de la protéine
- La maturation de l’ARNm et de la protéine
Notion de gènes chevauchants :
La synthèse d’une 2ème protéine part d’un 2ème AUG qui n’est pas en phase avec le 1er, les protéines seront donc
de composition complètement différentes. Les deux phases de lecture sont chevauchantes.
Notion de protéines de fusion :
Quand il y a deux gènes qui se suivent et que le codon stop n’est pas lu, on obtient une protéine de fusion. Les
protéines obtenues auront des extrémités NT identiques et des CT différentes.
Lorsque l’on a plusieurs AUG, on peut obtenir plusieurs protéines possédant des extrémités C-terminales
identiques mais des NT.
Rq : Certaines séquences peuvent augmenter la force du codon AUG. (Ex : CCACCAUG.)
Chez le Virus de la Mosaïque du Tabac:
Le TMV ARN comporte 3 gènes, à l’extrémité 3’ se trouve le gène de la protéine de capside et à sa gauche, le
gène de la protéine de 30K. Ces deux protéines ne sont jamais traduites dans un système in vitro, elles ne le sont
qu’à partir de ARN subgénomiques. La protéine 30K est traduite à partir de I2ARN qui contient en 3’ le gène de
la protéine capsidiale. Le cistron de la protéine de capside n’est traduit qu’à partir d’un très petit ARN
subgénomique, CPmARN. D’autre part, 2 protéines peuvent être obtenues, la 110K et la 165K, elles possèdent
les mêmes extrémités NT mais des CT différentes. Le codon stop du cistron de la 110K peut-être lu par un ARNt
suppresseur d’ocre présent dans les plantes ce qui permet la synthèse de la protéine 165K.
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2.1.3. Les protéines capsidiales
Elles sont associées entre elles de façon simple, par interaction protéine-protéine. Elles reproduisent souvent des
volumes réguliers (Ex: icosaèdre). La masse molaire des sous-unités est comprise entre 12 kD et 110 kD.
Il existe deux cas :
- La capside est composée des mêmes sous-unités (un seul
type de protéine)
- La capside est composée de différentes sous-unités. C'est
le cas le plus courant.
2.1.4. Les protéines internes du virion
Un assez grand nombre de virus à symétrie cubique possèdent des protéines internes associées à leur génome et
constituant un nucléoïde ou corps central (« core »).
2.1.4.1. Adénovirus
Les protéines V et VIII sont fortement liées à l'ADN et permettraient le repliement en
12 sphères à symétrie icosaédrique (cf. schéma précédent).
2.1.4.2. Papovavirus
L’ADN est associé à des histones sous forme de nucléosome qui assurent sa
condensation en un corps central (mini chromosomes) et confère une structure
particulière à ces virus
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2.1.5. Les enzymes
Il existe différents types d’enzymes associées aux virions, ce sont la transcriptase virale, la neuraminidase…
3. Méthodes d'étude des virus
On peut étudier les virus de façon qualitative ou quantitative.
3.1. Purification des virus
Il faut produire des virus en quantité suffisante et dans leur intégrité.
3.1.1. Choix de l'hôte
On cherche des cellules (permissives) qui puissent produire le virus, et le produire en quantité suffisante. Il est
possible d'utiliser un organe isolé ou un animal, mais on favorise les cultures cellulaires. Il est parfois intéressant
de cultiver un virus sur des cellules proches de leur hôte naturel (tel que le maïs pour le virus de la mosaïque de
la canne à sucre) ce qui permet une meilleure multiplication et surtout favorise leur extraction. On utilise parfois
un virus associé (ou helper) qui peut favoriser la culture du virus.
3.1.2. Tampon d'extraction
Le tampon doit permettre de récupérer le virus dans un état aussi proche que possible de l'état in vivo.
On joue sur les tampons pour mettre en évidence les différentes formes mais il faut contrôler les artefacts induits.
On évite les ultrasons pour l'extraction car ils peuvent détruire l'acide nucléique. On peut jouer sur la force
ionique mais il ne faut pas trop la diminuer ou augmenter pour ne pas abîmer le virus. On travail donc à une
force limite pour la cellule et avec du détergeant pour casser la cellule (lyse ménagée).
Le pH doit être maîtrisé car certains virus peuvent être détruits dés pH=7 ±1. Le pH peut également servir à
détruire les cellules.
3.1.3. Clarification des extraits cellulaires
La clarification permet d’ôter les organites et membranes cellulaires auxquelles les virus auraient pu se fixer.
Diverses techniques peuvent être employées :
3.1.3.1. Centrifugation à basse vitesse
Elle permet de rassembler les débris cellulaires au fond du tube. Il faut éviter les centrifugations trop longues
pour éviter que les virus ne soient pas entraînés dans le culot par l’ADN associé à des fragments cellulaires. Plus
un virus est gros et moins il nécessitera une centrifugation forte qui risquerait d’entraîner les composants lourds
pour les remplacer par des plus légers (risque d’enrichissement artificiel).
3.1.3.2. Dénaturation thermique
Elle est réalisée par chauffage ou congélation.
Pour casser les cellules, on fait une série de six congélations-décongélations lentes dans l'azote liquide sur un
culot cellulaire contenant peu de tampon.
Azote liquide : Evite la formation de microaiguilles de glace (-256°C)
Alcool + Carboglace : -180°C
En chauffant à 45°C, on fait précipiter les protéines. Certains virus sont détruits par la chaleur.
3.1.3.3. Utilisation de solvants organiques
û Ethanol-Fréon
Les virus sont dans la phase aqueuse. Ce mélange permet une bonne conservation des spicules. Une
centrifugation permet d'accélérer la séparation des phases.
û Butanol-chloroforme
On évite l'utilisation du phénol-chloroforme pour récupérer le virion. Le phénol-chloroforme sert plutôt à la
purification des acides nucléiques.
3.1.4. Récupération des virions
û
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Précipitation en haute salinité
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On augmente lentement la salinité pour éviter le choc osmotique (on commence à ˜ 0,3M). Historiquement, on
utilisait le NaCl, maintenant, on utilise le sulfate d'ammonium. Les concentrations sont augmentées
graduellement pour éviter d'avoir à éliminer trop de sel et permet une précipitation sélective.
On peut utiliser l'acétate d'ammonium car il se sublime sous vide, ce qui se rend l'élimination aisée. Les sels
peuvent également être éliminés sur membrane, mais on risque de perdre des virus sur la membrane de dialyse.
Les sels organiques ont un pouvoir tampon assez fort, ce qui les rend moins agressifs pour les virus.
û Précipitation au point isoélectrique
La diminution de la solubilité des protéines au pHi permet de les faire précipiter. On combine la salinité et le pH
pour ménager les virions.
û Précipitation par le PEG
On utilise des masses molaires entre 3 et 10 kD. Il se forme un précipité que l'on sépare par centrifugation. Cette
méthode convient bien aux virus les plus fragiles. La contamination des différentes fractions est très faible.
û Filtration sur gel
û Chromatographie d'échange d'ion
û Ultracentrifugation
Elle est réalisée en gradient de sucrose (saccharose) ou de chlorure de césium (CsCl), à 40000 tours/min pendant
12 à 14 heures. En gradient préformé, la centrifugation dure seulement 3 à 4 heures.
Cette technique donne des fractions de très haute salinité qui oblige à dessaler.
û Méthode sérologique
On utilise des anticorps. Les anticorps sont ensuite éliminés par chromatographie, choc osmotique, ou protéase.
3.2. Utilisation des méthodes physico-chimiques d'étude des virus
3.2.1. Microscopie électronique
Des sels lourds tels que l'acétate d'uranyl ou l'acide phosphotungstique servent de colorant.
3.2.1.1. Observation du virion
û Coloration négative
On forme un dépôt de métal lourd sur toute la surface de la grille sauf aux endroits où se trouvent les particules.
Une goutte de colorant (acétate d’uranyle, phosphotungstate de potassium) est déposée sur une grille qui porte
les particules à étudier et on laisse s’évaporer la plus grande partie de la goutte. Le colorant pénètre dans les
irrégularités à la surface de la particule. Le reste de la particule recueille peu de colorant. (Cf. Fig.A)
(A)
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(B)
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û Ombrage
La grille contenant l’objet est placée dans une chambre sous vide
dans laquelle va être chauffé un filament composé de métal lourd
(Platine) ce qui provoque son évaporation. Les objets qui font face
au filament vont être recouvertes de métal, elles diffracteront les
électrons. Celles qui étaient cachées dans l’ombre de l’objet vont
être non revêtues. Sur une photo prise en négatif, les zones
blanches seront les zones revêtues paraissant être « éclairées » par
une lumière vive. (Cf. Fig. B)
3.2.1.2. Observation des acides nucléiques
û Méthode de Kleinschmidt.
On enrobe l'acide nucléique avec une protéine (Ex: cytochrome C).
On peut différencier la simple chaîne de la double chaîne grâce à l'épaisseur du brin. Le simple brin apparaît plus
épais car les charges sont libres, ce qui facilite la fixation des protéines.
û Méthode de Dubochet
L'ADN s'étale car la grille est chargée positivement.
3.2.2. Diffraction aux rayons X
Cette technique permet l'observation des structures tridimensionnelles des macromolécules. Elle fonctionne
également pour les virions à condition de ceux-ci soient sous forme de cristaux.
Les rayons X sont diffractés sur les cristaux.
La longueur d'onde utilisée va jusqu'à 0,154 nm. On joue sur la résolution pour voir les acides aminé ou les
structures secondaires.
Pour augmenter la diffraction on incorpore des isotopes lourds. On obtient ainsi une image plus nette.
3.2.3. Diffraction à neutron
Les neutrons sont produits par une pile atomique et ont une longueur d’onde de 0.2 à 2 nm. En mettant les virus
dans un tampon contenant 40 à 50% d'eau lourde, on masque les protéines car la diffraction des protéines est
nulle à cette concentration. A 70%, seuls les acides nucléiques diffractent.
3.2.4. Diffraction optique
Le négatif d’une photographie de microscopie électronique est soumis à un faisceau de rayons lumineux
parallèles. L’étude du diagramme permet de distinguer la contribution de chacune des faces de l’objet dans
l’image plane, notamment dans le cas des virus à symétrie cubique ; dans le cas des virus à symétrie hélicoïdale
comme le ToMV, il y a superposition quasi parfaite des diagrammes provenant des deux faces.
3.2.5. Electrophorèse
û Séparation des virus aux différents pHi, en tube en U
û Gradient de pH et de densité en tube en U
Cette technique historique est encore très utilisée pour les virus fragiles.
û En gel
Le gel (le plus souvent agarose ou polyacrylamide) permet d'éviter les mouvements de convexion ce qui permet
d’obtenir une séparation plus nette, mais plus lente.
3.2.6. Ultracentrifugation
En gradient de sucrose ou CsCl continu, discontinu, préformé ou non.
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3.2.7. Hybridation moléculaire
On utilise des sondes d’ARN à marquage rapide.
û Hybridation compétitive
Deux sondes sont fabriquées : une marquée et une non marquée. On mesure la compétition.
û En microscopie électronique
On ajoute une sonde ADN correspondant à l'ARN. On observe des D-loop dues à la l'absence d'introns.
L’association de brins d’ADN présente des zones de séquence communes et d’autres différentes formes des
hétéroduplex. Leur observation en microscopie électronique à transmission permet d’observer certaines
différences entre les génomes.
û Hybridation in situ
Des sondes d’ADN marquées sont utilisées pour localiser des séquences complémentaires d’ARN ou d’ADN
dans un échantillon (cellule, tissu…). La révélation se fait par autoradiographie.
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3.2.8. Titrage des virus
3.2.8.1. Titrage des bactériophages
On réalise une suspension à forte concentration en bactérie. Une partie est mise en culture sur une boite et sert
de témoin. L'autre partie est mélangée avec la suspension de virus et mise en culture sur une boite également. On
compte le nombre de plages de lyses pour obtenir la concentration en phage. Seuls les particules infectantes sont
dénombrables, les particules défectives n’ayant pas de pouvoir cytolytique.
3.2.8.2. Titrage des virus animaux
Pour la détermination sur les animaux, on réalise des infections avec des doses croissantes sur des lots de 5 à 8
animaux. On met en évidence la DL50.
En culture cellulaire, la méthode est semblable à celle des phages. La culture se fait en agar mou pour ralentir la
propagation des phages. On compte les plages de lyse et on détermine le nombre d'UFP (Unité Formant Plage).
On peut calculer la DI50 (Dose Infectieuse = dilution pour laquelle 50% des cellules sont détruites). On réalise
plusieurs boites par dilution.
On utilise la technique des oeufs embryonnés pour les orthomyxovirus et les poxvirus. Il en résulte des tâches
grises organisées en foyer (Pock), équivalentes à des plages de lyse (hémolyses).
3.2.8.3. Dosage des antigènes viraux
Cette méthode, contrairement aux autres, rend compte de la population virale totale. La population infectieuse
est de l'ordre de 10 à 15% de la population.
3.2.8.3.1. Les antigènes
Un antigène est une substance (protéine, acide nucléique…), de poids moléculaire supérieur à 10000, étrangère à
l'organisme de l'animal auquel on l'injecte et qui déclenche la production d'un anticorps.
Un haptène est une petite molécule qui ne peut provoquer la formation d'anticorps à elle seule, mais qui associée
à un antigène, va permettre la production d'un anticorps. Elle change donc la spécificité de l'antigène.
Les enveloppes virales sont hautement antigéniques.
3.2.8.3.2. Les anticorps
Ce sont des globulines produites par les tissus lymphatiques.
- Les IgG: 7S (faible masse moléculaire)
- Les IgM: 19S
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- Les IgA: plus variées
On utilise les IgG. On peut détruire un virus en réalisant un couplage entre un toxique pour ce virus et un
anticorps dirigé contre ce virus.
On peut fabriquer des anticorps monoclonaux.
La fusion peut être faite au PEG ou avec des virus. Les anticorps produits sont purifiés par chromatographie
d'affinité. La culture en milieu HAT après la fusion cellulaire permet de sélectionner les cellules ayant fusionné
ainsi que les cellules spléniques n’ayant pas fusionné. On sélectionne enfin les clones producteurs de l’anticorps
grâce à un dépistage.
3.2.8.3.3. Divers types de réactions sérologiques
Toutes les techniques qui vont suivre sont réversibles, les anticorps et antigènes peuvent être intervertis.
3.2.8.3.3.1. Immunoprécipitation
Quand les antigènes et les anticorps sont mis en
contact dans des proportions convenables, il se
forme un précipité très net.
Si l'antigène est soluble, on observe un précipité
(cas des virus). Si l'antigène n'est pas soluble, la
précipitation est très forte. Il y a agglutination.
Les virus sont des antigènes
polyvalents
(complexes). Ils forment des réseaux avec les
anticorps. On obtient donc une précipitation très
forte.
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La formation du précipité dépend de la durée du contact et de la température.
Il existe un point de dilution limite: il faut une quantité minimum d'antigène et d'anticorps pour que le précipité
se forme. C'est la quantité d'anticorps minimum à ajouter pour que la précipitation soit détectable.
3.2.8.3.3.2. Immunoprécipitation en gel
En gel, la migration des antigènes et des anticorps est ralentie, ce qui favorise la formation du précipité.
Il existe différentes techniques:
Technique de diffusion simple
Technique de diffusion double
Trois cas sont possibles :
Cas N°1
Cas N°2
Cas N°3
Cas N°1 : Les virus sont identiques, du point de vue antigénique.
Cas N°2 : Les virus ont des épitopes semblables et d'autres non semblables.
Cas N°3 : Les virus n'ont pas d'épitopes semblables.
On peut de cette façon, déterminer la parenté entre virus.
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3.2.8.3.3.3. Immunoélectrophorèse qualitative
L'antigène est déposé dans les puits. On réalise ensuite l'électrophorèse, puis on dépose l'antisérum et on laisse
migrer.
3.2.8.3.3.4. Immunoélectrophorèse quantitative : Méthode de Laurell
La gélose contient l'antisérum. Plus la quantité d'antigène est grande et plus la distance de migration est
importante. L’antigène, déposé dans le puit, va migrer dans le gel grâce à un courant électrique. Lorsque le
rapport antigène-anticorps idéal va être atteint, le précipité va se former mais l’antigène continuant à migrer, le
précipité va se dissocier pour se reformer plus loin. On obtient alors des traînées de précipité formant des sortes
de « rocket ».
3.2.8.3.3.5. Immunoélectrophorèse croisée
Elle permet de faire une électrophorèse quantitative et qualitative.
On réalise une première électrophorèse dans un boudin de gélose. Le boudin est ensuite déposé sur une gélose
contenant l'antisérum.
3.2.8.3.3.6. Méthode de fixation des compléments
C'est un test extrêmement sensible et précis. Il n'y a pas d'effet de seuil.
Le complément est un complexe protéique thermostable qui peut s'associer au complexe antigène-anticorps.
On réalise une réaction virus-antigène en présence de complément. Le précipité contient donc du complément.
Le complément est ensuite dosé avec des globules rouges de mouton. Les globules rouges de mouton sont lysés
par le complément.
3.2.8.3.3.7. Méthode d'agglutination
Certains virus ont sur leurs capsides des hémagglutinines. Ces hémagglutinines permettent de fixer plusieurs
hématies ce qui a pour effet de former de gros réseaux qui précipitent, facilitant la lecture.
L'hémagglutinine peut être bloquée par un anticorps ce qui permet de doser quantité d'anticorps dans un sérum.
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3.2.8.3.3.8. Radio Immuno Assay
On réalise une compétition entre des antigènes marqués et les antigènes à doser. Les antigènes sont marqués
radioactivement ou non.
Les solutions contenant les antigènes marqués et les antigènes à doser sont mélangés. On leur ajoute une solution
d'anticorps de lapin dirigé contre cet antigène. On ajoute enfin des antigènes anti-anticorps de lapin pour
améliorer la précipitation. La radioactivité est mesurée dans le précipité.
3.2.8.3.3.9. Techniques immunoenzymatiques
On couple une enzyme à un anticorps. L'enzyme intervient dans une réaction colorée (Ex: peroxydase de Raifort,
phosphatase alcaline de E.Coli). L'enzyme et l'anticorps sont fixés par le glutaraldéhyde ou l'acide cyanhydrique.
Ex: ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).
C'est une technique très sensible, fiable et reproductible.
3.2.8.3.3.10. Séroneutralisation
Les virus induisent dans l’animal qu’ils infectent des anticorps dits neutralisants car ils inhibent le pouvoir
infectieux. La séroneutralisation correspond à l’inhibition du pouvoir pathogène du virus par l’antisérum
neutralisant spécifique. Elle permet d’évaluer le pouvoir neutralisant de l’antisérum vis-à-vis du virus
correspondant. D’après les travaux de Dulbecco et collaborateurs sur la séroneutralisation du poliovirus, on peut
tirer les conclusions suivantes :
- La neutralisation d’un virus est la conséquence de sa combinaison avec les anticorps neutralisants,
combinaison réversible dans certaines conditions, le virus récupérant alors son pouvoir pathogène ;
- La vitesse de la réaction est directement proportionnelle à la concentration en anticorps ;
- Une seule molécule (ou petit nombre de molécules) d’anticorps suffit à neutraliser une particule
virale ;
- Même lorsque les anticorps sont en large excès, il reste toujours un pouvoir pathogène persistant,
ou fraction persistante, qui subsiste si l’on ajoute encore des anticorps dans le système.
Cette fraction persistante est due à :
Des virions emprisonnés au sein d’un réseau formé par des Ac et d’autres virions.
Des virions qui ont fixé des Ac mais pas en assez grand nombre pour obtenir une neutralisation. Ils sont
facilement détruits par la fixation du complément.
La neutralisation bloquer les récepteurs et empêcher ainsi l'adsorption des virus. Les anticorps sont dirigés contre
les déterminants viraux. Ces anticorps empêchent aussi la fusion des membranes. L'acide nucléique est détruit si
il y a des anticorps fixés aux protéines au moment de sa libération ce qui empêche la multiplication des virus.
Bien que tous les Ac soient dirigés contre les Ag externes des virus, il existe différents types d’Ac intervenant :
- IgM de 19S, Ac précoces, ils ont une action rapide, peu spécifique et renforcée par le complément.
- IgG de 7S, ont une action plus lente mais plus spécifique. La vitesse peut être augmenté par le complément.
3.2.8.3.3.10. Révélation après un Western-Blot
Après un SDS-PAGE dans lequel l’Ag a migré, on transfert sur membrane de nitrocellulose et on fait agir des
Ac dirigés contre cette Ag. La réaction est rendue visible grâce à l’utilisation d’Ac marqué par un chromophore.
(cf. schéma suivant)
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4. Classification des virus
Les premières classification étaient basées sur les symptômes puis sont passées en fonction des propriétés des
virus pour finir enfin, en 1962, en fonction de la nature des acides nucléiques.
Lwoff, Jacob et Monod donnent 4 critères principaux :
-Nature du matériel génétique
-Type de symétrie de la capside
-Nature de la nucléocapside (nue ou enveloppée)
-Données quantitatives du virion (nombre de capsomères, longueur de l’acide nucléique…)
Les virus ne peuvent pas être classés en fonction des capacités immunologiques car les virus ont tous des
spécificités différentes.
Remarque : Lorsque l’on parle d’un sous-famille après avoir cité la famille, on ajoute le préfixe « inae » alors
que la famille portera le suffixe « idae » (ex : les papillomavirinae font partie des Parvoviridae)
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5. Les interactions Virus-Cellule
5.1. Cycle de multiplication
Quels que soient les types de virus, leur cycle de multiplication dans la cellule permissive comprend trois
phases :
5.1.1. Adsorption
Elle correspond à l’interaction d'un récepteur cellulaire avec des protéines de surface des virus. Cette première
étape est constante et obligatoire au cours de l'interaction virus - cellule.
Elle dépend de plusieurs facteurs :
û La température. L’adsorption est plus lente à 0°C qu’à 37 °C par exemple.
û Des charges électrostatiques de surface. Le pH par exemple fait varier les possibilités
d’adsorption.
û La sensibilité des cellules. Il faut la présence de récepteur spécifique pour que l’adsorption
puisse avoir lieu : il y a une spécificité d’adsorption. On peut grâce à la sensibilité des individus
au même virus déterminer des groupes de sous typage.
Une cellule permettant l’adsorption d’un virus est dites sensible au virus, ce qui est différent de permissive (cf.
chapitre 5.2.). Une cellule ne permettant pas l’adsorption d’un virus, est dites insensible au virus.
5.1.1.1. Cas des myxovirus
Le virus grippal est constitué par une nucléocapside de symétrie hélicoïdale, entourée d’une enveloppe sur
laquelle sont fixés des constituants glycoprotéiniques appelés hémagglutinines (Ha). Grâce à ces
hémagglutinines qui possèdent une affinité spéciale pour les mucopolysaccharides, les virus se fixent par
adsorption sur les cellules où ils rencontrent des récepteurs de cette nature (acide neuraminique).
5.1.1.2. Cas des bactériophages
Les bactériophages portent des fibres qui peuvent reconnaître des récepteurs cellulaires de la bactérie (en général
des LPS) et leurs permettent de se fixer à la paroi ou au flagelles. La spécificité de l’adsorption vient des oses
constitutifs de la bactérie.
Ex : Les phages M2 et M13 se fixent à l’extrémité des pilis sexuels d’E.coli. Cette spécificité rend les E. coli Finsensibles à ces phages.
û Mutants d’hôte et mutants cellulaire.
L’adsorption d’un virus à son hôte dépend de 2 facteurs : la spécificité d’un récepteur cellulaire pour un virion,
et le motif ou de l’organe d’attachement du virion. La modification de ce dernier peut engendrer une plus ou
moins grande spécificité du virion pour un spectre d’hôtes. Ces modifications résultent soit de mutations de la
cellule ou du virus (elles sont alors héréditaires), soit de modifications adaptatives, par exemple lors de passage
du virus chez un hôte nouveau. Dans ce cas, elles ne sont que temporaires. Les cas les plus fréquents de
modifications sont adaptatifs.
Ex Les paramyxovirus, s’ils sont passés sur cellules de rein de bovin (MDBK) entraîne la production de virions
non-infectieux qui possèdent une glycoprotéine F0 au lieu de 2 chaînes F1 et F2 trouvées sur les virions cultivés
sur embryons de poulet. L’infectivité est restaurée si on les repasse sur ces dernières. La perte d’infectivité
s’explique par le fait que la protéine F est synthétisée sous forme F0 (inactive) et c’est dans un système
protéolytique cellulaire présent dans les cellules de poulet (et non MDBK) qu’elle va être découpée en F1 et F2.
5.1.2. Pénétration
C’est durant cette phase que le virus entre dans la cellule.
C’est soit le virus seul qui pénètre, soit l’acide nucléique seul.
5.1.2.1. Cas des bactériophages
En 1952, Hershey et Chase mettent en évidence le pouvoir pathogène de l’ADN du phage T2 en montrant que
seul l’ADN pénètre et que la capside reste à l’extérieur de la bactérie (ghost).
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Après l’adsorption grâce aux fibres basales, les enzymes de la plaque basale attaque la paroi et la fragilise. La
gaine se contracte ensuite, le tube central transperce la paroi et la membrane plasmique. L’ADN est injecté dans
le cytoplasme.
5.1.2.2. Cas des virus animaux
La pénétration peut se faire par deux voies :
5.1.2.2.1. Pénétration par pinocytose
Après adsorption du virus sur la cellule, la membrane plasmique s’invagine pour former une vésicule de
pinocytose qui va migrer naturellement vers le noyau en suivant le cytosquelette. Cette vésicule va ensuite
fusionner avec plusieurs autres vésicules (endosome et lysosome) dont le contenu va déstabiliser la capside
virale. Le virus est finalement libéré dans le cytoplasme.
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C’est la voie de pénétration utilisée par les virus non enveloppés, mais elle existe également, même si elle est
minoritaire, chez les virus enveloppés.
5.1.2.2.2. Pénétration par fusion membranaire
Après l’adsorption du virus sur la cellule, la membrane plasmique et l’enveloppe virale fusionnent libérant
directement la nucléocapside dans le cytoplasme (Cf. schéma précédent). C’est la voie de pénétration majoritaire
chez les virus enveloppés.
5.1.3. Multiplication
(En construction)
5.2. Permissivité cellulaire
La permissivité est la capacité d’une cellule à permettre la reproduction d’un virus. Par exemple, l’Adénovirus
peut se reproduire sur presque toutes les cellules humaines mais pas sur les cellules de rein de rat. Le virus
rentre, se multiplie mais l’expression des protéines de capside est bloquée. Une cellule est dite résistante
lorsqu’elle ne présente pas de récepteurs pour ce virus.
Les facteurs intervenant dans la permissivité d’une cellule sont :
- La barrière d’espèce : c’est un facteur capital. Il peut exister, surtout chez les virus non enveloppés, une
permissivité inter-espèce du à la présence de récepteurs sur les cellules. Le virus a des affinités avec le type de
cellule qui l’a produite.
- Le génotype : Les virus peuvent être classés en fonction des cellules qu’il infecte. Ex : le VLM (Virus
Leucémogène Murin) qui peut infecter les cellules NIH, les cellules BalB/C ou même les deux.
- Etat de différenciation cellulaire : Un autre exemple est celui des Papillomavirus qui ne peuvent se multiplier
que dans les cellules non kératinisées (à l’intérieur de la verrue).
Cellules où se
multiplient les
papillomavirus
Cellules kératinisées
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5.3. Les différents types d’interaction Virus-Cellule
Du fait de leur parasitisme absolu, les virus ne peuvent se multiplier qu’au sein même des cellules vivantes, par
réplication de leur acide nucléique c’est en fait l’interaction du génome viral de la cellule qui aboutit à la
production du nouveau virion. Cependant, l’infection d’une cellule par un virus ne conduit pas obligatoirement à
la multiplication de ce dernier mais parfois à des formes de résistance ou de marquage (ex : Provirus).
Il existe 4 types d’interactions :
û L’interaction productive
û L’interaction abortive
û L’interaction intégrative
û L’interaction persistante
5.3.1. Interaction productive
La pénétration d’un virion ou d’une molécule d’acide nucléique viral dans la cellule conduit à la formation et à la
libération de nouveaux virions. Dans certains cas, la cellule est lysée, c’est le cycle lytique. Dans d’autres cas (ex
: rétrovirus), il y a multiplication sans mort cellulaire ; c’est le cycle végétatif. Le cycle viral possède trois
caractéristiques :
La multiplication du virus consiste en une autoréplication du génome. Il n’y a pas de liaison entre la réplication
cellulaire et la réplication virale.
La multiplication est un processus moléculaire et nécessite la synthèse de messagers et de protéines à partir du
génome avant la réplication.
Le virus, pour se multiplier, doit utiliser tout le système métabolique (NTPs, énergie…) de la cellule. Il détourne
le système cellulaire à son profit.
Pour se multiplier, le virus doit exprimer tous les gènes contenus dans le génome. L’expression des gènes du
virus est séquentielle.
Par convention, les gènes précoces s’expriment avant la réplication et les tardifs, après la réplication.
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5.3.2. Interaction abortive
Dans certaines circonstances, l’infection d’une cellule par un virus n’aboutit pas à la production de nouveaux
virions ; le cycle est abortif. La cellule ne permet pas le développement complet du cycle de multiplication : elle
est dite non permissive (ex : adénovirus sur cellule simienne). Ce type d’interaction a souvent lieu quand le virus
infecte un hôte non naturel (barrière d’espèce). Si dans une cellule la multiplication est interrompue, cela ne veut
pas dire que le virus est inactif. Le virus peut avoir transformé la cellule et entraîné une cancérisation.
5.3.3. Interaction intégrative
L’interaction conduit à une liaison intégrative et stable du matériel génétique viral à celui de la cellule. Dans ce
cas, le virus persistera et sera transmis ou pas à toute la descendance de la cellule. Cette persistance peut se faire
sous deux formes :
Soit sous forme intégrée par liaison covalente au génome (provirus).
Soit sous forme de plasmide libre.
L’intégration peut assurer l’expression permanente de certaines parties des gènes viraux. La transformation
maligne, chez l’animal, ou la conversion lysogénique, chez la bactérie, en sont des exemples particulièrement
connus. Suite à un changement (UV, multiplication cellulaire…) va avoir lieu l’induction.
Chez les virus à ADN, le génome ne va pas s’exprimer entièrement, seuls s’exprime les gènes d’expression
négative (NEF= Negative Expression Genes), ceux qui maintiennent le génome viral intégré.
Pour les virus à ARN, il peut y avoir interaction productive et intégrative en même temps.
5.3.4. Interaction persistante
Les tissus animaux sont fréquemment contaminés par des virus, comme le montrent les cultures cellulaires. Ils
n’en sont pas pour autant altérés. Dans les infections chroniques, toutes les cellules infectées par un virus non
cytolytique reproduisent parfois le virus en grande quantité sans subir de dommages ; dans l’état de porteur, une
faible proportion de cellules est contaminée.
û Infections virales persistantes en culture de cellules
Lors de la culture de cellules de reins de singe, ces cellules, apparemment en bonne santé, pouvaient être
porteuses et donc productrices d’un très grand nombre de virus. Plus de 50 virus simiens ont été découvert de
cette façon, dont le SV40. Ce phénomène ne se limite pas qu’aux cellules de singes, il s’étend à toutes les
espèces, (aviaire, murine…). Deux infections persistantes sont principalement observées en culture : l’infection
chronique (encore appelée « Steady state ») et l’état porteur (« carrier state »).
Dans l’infection chronique, toutes les cellules en culture sont infectées par un virus non cytocide et en produisent
des quantités parfois considérables, sans en paraître pour autant affectées.
Dans l’état porteur au contraire, la production de virus, qui peut-être ici cytocide, n’est le fait que d’une faible
minorité de la population cellulaire. On peut guérir une culture en son état porteur en la maintenant en présence
d’antisérum antiviral alors que c’est sans effet sur l’infection chronique. Cet état est caractérisé par une forte
production virale. La résistance de certaines cellules peut-être due à l’hétérogénéité génétique de celle-ci mais
aussi la présence d’autres substances (interféron…).
Ex : le SV5 infecte les cellules de rein de singe. Ces cellules permettent une expression normale des virus jusque
1500 PFU/cellule. C’est une régulation fine de la part du virus qui évite la lyse cellulaire et garde le génome de
la cellule (le ARN du virus représente 1% du ARN total cellulaire). Dés que la synthèse cellulaire est bloquée,
les synthèses virales augmentent entraînant ainsi une forte production virale.
Ex2 : Le génome de l’AAV est intégré dans les cellules. Une infection par un autre virus ne provoque rien,
contrairement à une infection par un adénovirus qui lui permet de s’exprimer.
5.4. Interactions entre les virus
5.4.1. Les virus défectifs et les helpers
5.4.1.1. La défectivité
Une virus défectif est un virus dont le génome est incomplet ayant donc perdu une ou plusieurs fonctions
nécessaires pour assurer la descendance soit sous forme virale, soit végétative. Il y a donc interruption du cycle
de multiplication avec production de virus défectifs ou production abortive.
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Ex : Les phages peuvent induire une lysogénie. Ils infectent une bactérie dans laquelle leur ADN va s’intégrer au
génome bactérien. Certains mutants « Vir » sont virulents car détruisent la bactérie dans une interaction
productive, ils sont lysogénie -.
5.4.1.2. La défectivité naturelle
Les virus ne peuvent se multiplier qu’à l’aide d’un helper (ex : AAV). Ces AAV sont défectifs pour la
réplication mais peuvent s’intégrer dans le génome de la cellule hôte.
Ex : Un virus satellite à génome court (1.2kb) ne code que pour la capside. Ce virus ne se multiplie que grâce au
STNV (Virus de la nécrose de la tomate).
5.4.1.3. Transcapsidation et pseudotype
Un exemple de transcapsidation (ou marquage phénotypique) est celui de l’Adénovirus et le SV40.
Le SV40 ne se multiplie que sur cellules simiennes alors que l’adénovirus ne s’y développe pas. SV40d, qui est
une souche de SV40 défective pour la synthèse des protéines de capside se multiplie sur cellule de singe qu’en
présence d’adénovirus. L’adéno pénètre dans la cellule de singe, se multiplie mais ses messagers tardifs ne sont
exprimés que grâce aux facteurs de transcription du SV40d. Il sort de la cellule un adénovirus et un SV40
(entouré d’une capside d’adénovirus).
Le SV40d capsidé par l’adénovirus ne sera pas détectable en microscopie, séroneutralisation. Seule une
extraction de l’ADN mettra en évidence la présence d’un SV40.
5.4.1.4. Défectivité conditionnelle et complémentation
La défectivité conditionnelle : Les mutants non sens. En bactéries Su+, ces mutants vont se répliquer mais pas se
multiplier.
La complémentation : Complémentation génétique. On met 2 défectifs, on va avoir production normale car on a
remplacement de la défectivité.
5.4.2. Interactions
Les interactions entre virus se produit dans le cas d’infection multiple d’une même cellule. Cela dépend du type
de cellule ou du génome. Ces interactions entre virus peuvent être différentes :
- Inhibition-multiplication (l’interférence)
- Stimulation (enhancement)
- Echange de matériel génétique (mélange de type recombinaison génétique)
5.4.2.1. L’interférence
C’est une résistance procurée par une infection virale à une surinfection par un second virus (au niveau
adsorption ou dans les autres étapes de multiplication).
5.4.2.2. Stimulation (enhancement)
L’entrée d’un virus permet la multiplication d’un autre virus (Herpesviridae – HIV)
On pense que le virus facilitant va abolir la production de la défense cellulaire, l’interféron (l’autre pourra se
multiplier).
5.4.2.3. Recombinaison génétique
C’est l’intégration d’une partie du matériel génétique d’un virus dans un autre virus.
La fréquence de recombinaison dépend de la distance entre les fragments insérés.
Ex de crossing over : les provirus (acquisition de fonction = transformation).
5.4.2.4. Réassortiment génétique
Deux cas sont possibles : Réassortiments et Recombinaison.
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Le virus doit être porteur de fragments (de 1 à 7-8) pour être variable. Un problème d’encapsidation peut avoir
lieu, certains seront défectifs car n’auront que 3-4 ou 5 fragments sur 7-8. Une surencapsidation est le résultat
d’un trop grand nombre de fragments insérés. Si on a 2 virus différents à génomes fragmentés, on peut avoir
échange de fragments possibles, c’est le réassortiment (fréquence 10-1 à 3.10-2).
5.4.2.5. Réactivation génétique
L’un des 2 virus est un virus inactivé. Il va tout de même produire des virus. Deux types de réactivation :
- Réactivation croisée
Dans les cas de 2 virus, les virus se
complémentent.
-
Réactivation par multiplicité
On prend une cellule infectée par plusieurs virus
inactivés. Si on est à faible multiplicité, on aura
de faibles chances de complémentation (•). Si on
est à forte multiplicité, on aura beaucoup de
recombinaison (‚).
5.4.2.6. Hétérodiploïdie
On a plusieurs nucléoprotéines dans la même capside pour les virus nus et plusieurs nucléocapsides dans la
même enveloppe si le virus enveloppé. Chez les rétrovirus, la diploïdie est systématique car pendant
l’encapsidation ou l’enveloppement, on a 2 copies d’ARN.
5.4.2.7. Hétérozygotie
Appelée hétérozyotie dans le cas des virus. Ex : chez les phages T pairs, sur un ADN double brin :
5.4.2.7. Mélange phénotypique
C’est l’infection par un virus et la multiplication des 2 virus. La capside est formée de plusieurs choses : capside
A (que des protéines A), capside B (que des protéines B), mais aussi, si les virus sont compatibles des capsides
AB (protéines A et B). AB aura soit le génome A, soit le génome B. On aura donc 6 possibilités en couplant une
capside A ou B et un génome A ou B. On peut avoir un mélange leucémogène et sarcomatogène. Les mélanges
phénotypiques peuvent passer la barrière des espèces.
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5.5.3. Interférences entre virus et animaux
L’interférence entre virus est une sorte de protection conférée à une cellule par un 1er virus appelé « virus
interférant » contre l’entrée d’une 2ème virus, le « virus d’épreuve ». Si les 2 virus sont du même type, on aura
interférence homologue, sinon c’est une interférence hétérologue (virus de types différents).
En 1957, Isaacs et Lindenmann montrent l’interféron. Ils ont travaillé sur les virus de la grippe. Ils ont dis qu’une
dose de virus grippal (appelée dose interférente) induisait les cellules à produire et sécréter une protéine
cellulaire capable d’apporter à d’autres cellules une protection contre le virus grippal mais aussi d’autres virus.
La mise en évidence de l’interférence a été faite par compétition entre 2 virus. On a compétition vraie entre 2
virus homologues et exclusion entre 2 virus hétérologues.
5.5.3.1. Interférence au niveau pénétration
L’infection par le 1er virus va soit bloquer les récepteurs, soit va les altérer ou même les détruire.
Ex : NDV (Newcastle Disease Virus) qui est un virus du poulet. Si on l’inactive aux UV, une surinfection par
des virus normaux n’est plus possible. Sur l’enveloppe du NDV, des spicules à neuraminidase (rappel : c’est un
myxovirus) détruisent le récepteur cellulaire ce qui protège de la surinfection. On utilise des NDVinactivés pour
protéger les poulets. Cela n’exclue pas la surinfection par d’autres virus.
5.5.3.2. Interférence homologue et particule D.I (Défectives Interférentes).
Si on fait une infection simultanée (coinfection) par 2 poliovirus de sérotypes différents, on a multiplication des
2 virus. Si on infecte par un 1er polyo (interférant), et qu’on surinfecte par un virus d’épreuve, la multiplication
du virus d’épreuve est inhibée. Il y a compétition entre les deux virus.
Les particules DI (à qui il manque une partie de génome) sont capables de provoquer une interférence (induisent
une protection). Elles peuvent avoir une délétion (jusque 70% du génome en moins).
La DI va dupliquer ou tripliquer son génome pour obtenir la taille initiale du génome. Elle peut intégrer une
partie d’ADN cellulaire. Leur défectivité va les rendre incapables de se multiplier par elles-mêmes. Elles vont
utiliser le virus standard dont elles dérivent. (~Virus helper).
5.5.3.3. L’interférence avec la multiplication du virus assistant.
Il va y avoir diminution de la production du virus aidant. Chez les DI du polyo, il va y avoir délétion qui va
provoquer un manque de production du précurseur de la protéine de capside. En fait, il est produit mais tellement
instable qu’il est dégradé de suite. Si on coinfecte un virus interférent DI et un virus d’épreuve, on obtient une
capside avec un génome défectif ou standard. Le DI aura donc la capside du standard (d’où des problèmes en
séroneutralisation).
Après plusieurs passages successifs en culture cellulaire, on obtient des DI (avec forte « m.o.i » pour multiplicity
of infection qui est le nombre de PFU/cellule). Chez le polyo A, la nature des cellules joue un rôle (présence
d’un facteur). Dans le cas de la grippe, si on multiplie sur des cellules MDBK (cellules de mammifère), même à
très forte m.o.i, on n’a presque aucune DI obtenue. Si on prend des cellules aviaires, on obtient beaucoup de DI
(près de 80-90%).
Certaines souches virales vont nécessiter +/- de passages. L’apparition de DI au cours de la multiplication est un
facteur génétique des souches virales. Dans le cas du polyo, on atténue les souches pour obtenir des souches
vaccinales (contiennent beaucoup de DI d’où faible virulence). Dans d’autres virus (grippe…), au fur et à mesure
qu’une épidémie va se développer, il y aura apparition de DI.
5.5.3.4. Interférence par exclusion entre virus hétérologues.
Appelée aussi interférence intrinsèque. Ex : Une cellule humaine infectée par un Adéno, on ajoute le virus de la
vaccine (primo infection par des adéno). On n’obtient pas de permissivité à la vaccine. L’adéno rentré dans la
cellule va bloquer l’entrée de la vaccine. Certaines protéines de capside bloquent la traduction des messagers de
poxvirus. (Interférence tardive car joue sur les messagers).
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5.5.4. La réponse de la cellule à l’infection virale
5.5.4.1. Cas de la cellule bactérienne
Les bactéries possèdent des défenses contre les ADN étrangers, ce sont des endonucléases (enzymes de
restriction). Le phage est détruit quand il a poussé sur des cellules bactériennes différentes. Ex : F T4 cultivé sur
E.coli M. Si on passe sur coli K12, l’ADN de T4 sera considéré comme étranger. SI on continue le repiquage sur
M, aucun problème. Le système de restriction ne va pas reconnaître l’ADN du phage car il y a u système dans la
bactérie d’origine qui va permettre de « marquer » l’ADN du phage comme étant de la famille, les phages sont
modifiés.
Cette modification est réversible, c’est un facteur d’hôte qui dépende de la cellule en culture.
La modification dépend de la cellule bactérienne utilisée (phénomène de méthylation des A et des C dans
certains domaines de l’ADN. Il va y avoir 2 enzymes :
- L’enzyme de restriction qui coupe l’ADN étranger à des sites.
- Une méthylase qui méthyle les ADN de la bactérie et du phage au fur et à mesure de leur synthèse.
Les méthylases protègent l’ADN.
Ex : Chez les phages T pairs, on peut avoir méthylation, glycosylation…S’il y a glycosylation, il y aura pousse
chez les Shigelles alors que sans glycosylation il y aura pousse chez les shigelles et les coli.
Les enzymes de type I (chez coli) nécessitent de l’ATP, Ca2+, SAM (S-Adénosyl Méthionine). Le type II
n’utilise que du Ca2+ (chez Haemophilus). Dans le type I, les 2 fonctions sont portées par la même protéine
(endonucléases et méthylase). Dans le type II, on a 2 molécules distinctes.
5.5.4.2. La production d’interféron
D‘autres systèmes que ceux qui précédemment vus ont été mis en évidence chez les eucaryotes.
5.5.4.2.1. Les interférons
Ils ont produits suite à une primo infection. Ce facteur diffusible est lié à la cellule hôte. Ces protéines antivirales
possèdent une activité spécifique très élevée. 3 pg peuvent protéger un rat contre toute infection virale. Ces
interférons (INF) sont indépendants du virus.
û
-
-
Caractéristiques des INF :
Ils sont inductibles par des acides nucléiques viraux naturels ou de synthèse.
Les INF produit par une cellule sont de même type quelque soit le virus infectant.
Si un même virus va infecter des cellules de nature, espèce différentes, les INF produits seront
différents.
L’INF synthétisé va dépendre de l’espèce cellulaire mais aussi de son type (ex : un virus infecte un
type de cellule qui va induire la synthèse d’INF a. Le même virus induit la synthèse de ß, a 1 et a 2
chez d’autres virus.
Certaines cellules n’en produisent pas (les cellules transformées…)
Le génome cellulaire doit être transcris pour induire la production d’INF.
Les cellules anucléés ne produisent pas d’INF.
Les hybrides somatiques cellules humaines/cellules murines produisent de l’INF murin et humain.
Ces messagers codant pour les INF ont été identifiés. On a pu les faire s’exprimer en culture
cellulaire.
L’unité biologique de l’INF correspond à la quantité d’INF nécessaire pour protéger 50% des
cellules infectées par le virus d’épreuve.
En général, les virus enveloppés sont plus sensibles que les virus nus.
5.5.4.2.2. Les inducteurs d’INF
Plusieurs facteurs interviennent (nature de la cellule, du virus…). Certaines dominantes ont été mises en
évidence : les 200 nt qui précèdent l’extrémité 5’ sont commun aux INF humains et murins. Cette séquence joue
un rôle dans l’induction et la régulation de l’INF. Les gènes codant pour les INF sont souvent silencieux.
Les inducteurs d’INF sont :
- Les virus vivants (surtout qui infectent peu ou pas les synthèses cellulaires). S’ils détournent les
synthèses, ils bloquent la synthèse d’INF. Si on inactive les virus par la chaleur ou les UV, ils
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-
permettent une bonne synthèse des INF, ce sont de bons inducteurs. Ceux inactivés par le phénol ne
sont pas de bons inducteurs.
Les polyribonucléotides sont de bons inducteurs. On a cherché des séquences très inductrices
d’INF. Il faut que ce soit un polyribonucléotide bicaténaire, un hybride poly rI/rC qui forme le
meilleur inducteur. L’induction d’INF n’est pas continue (~10h après le stimulus). Il y a une
résistance à une 2ème dose d’INF.
La restimulation n’et possible qu’après une division cellulaire. La cellule doit être en phase de transcription
active. L’arrêt de la production d’INF est dû à la destruction des messagers.
5.5.4.2.3. Le mode d’action des INF
Les INF n’agissent pas sur la multiplication des virus. Il agit sur l’état de la cellule hôte. Ils peuvent se fixer sur
différents récepteurs membranaires puis internalisation du complexe récepteur/INF. Il y a action sur différentes
voies de régulation ce qui provoque l’exctinction-allumage de certaines productions. Le chromosome 21 est
nécessaire à la synthèse des INF. La trisomie 21 induit une plus grande sensibilité aux INF humains. La
monosomie 21 déclenche une moins grande sensibilité aux INF (le taux de production reste le même, seul les
sensibilités varient).
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L’action se fait en plusieurs étapes :
- Au niveau cellulaire, un récepteur spécifique
- L’activation des PAV (Protéine Anti Virale) du type AMPc.
L’activation par les INF se fait en 2 étapes (2 cellules différentes entrent en jeu). Le virus rentre dans la 1ère
cellule, active le chromosome 5 ce qui provoque la synthèse d’INF. Cet INF sort de la cellule et va se fixer sur
les récepteurs d’une autre cellule pour stimuler le chromosome 21. Le chromosome 21 va permettre la synthèse
d’ARNm de PAV ce qui bloque l’entrée d’un virus d’épreuve.
Joklik (1966) et Méridal ont mis en évidence un phénomène important. L’interféron est aussi actif sur les virus à
ARN qu’à ADN. Le seul point commun est la traduction, les PAV bloquent donc cette traduction.
La mise en évidence chez le poxvirus a été faite par un blocage de la traduction au niveau de l’initiation.
Les PAV vont modifier le système de traduction de la cellule, cela ne bloque pas la traduction cellulaire car
sinon, tout serait basé sur la séquence de Shine Dalgarnow, spécifique des cellules.
Dans le cas des rétrovirus, il n’y a pas de baisse des protéines virales, il y a production des messagers viraux
mais c’est la traduction qui est bloquée.
Les PAV sont synthétisées sous formes inactives. Elles sont activées au niveau des infections virales. Pour
certains virus, on va vers un arrêt de la traduction alors que pour d’autres, on a dégradation des ARNm.
- Au niveau dégradation des messagers, on a une 2’-5’ oligo-ARN-Synthétase. Cette chaîne
ribonucléotidique pppA2’p5’A2’p5’A2’p va activer une endonucléase et dégrader les ARNm.
- Au niveau de l’arrêt de la traduction, une kinase va phosphoryler plusieurs protéines (eIF-2…) ce qui
va provoquer une inhibition de la formation des complexes d’initiation Met-ARNt-40S-ARNm et arrêt de la
traduction. On pense que l’activation de l’oligosynthétase est reliée à l’action de la kinase.
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Action au niveau de la kinase :
On a blocage de l’initiation si le complexe eIF-2GDP est phosphorylé par la PKR qui aura été,elle, activée par
l’INF.
Rq : GEF est bloqué par le complexe eIF-2-GDP-P.
5.5.4.2.4. Autres fonctions des interférons
En agissant comme des lymphokines, elles inhibent les facteurs de croissance, bloquent les cellules tumorales.
Elles dépendent de la nature de l’interféron, du temps d’exposition. Son action se ferait sur n’importe quel cycle
cellulaire. Son effet inhibiteur de croissance est réversible. L’action se fait sur les messagers cellulaires.
L’interféron ralentirait fortement la synthèse de messagers cellulaires et en particuliers au niveau des protooncogènes (c-myc, c-ras).
Les fonctions antimitotiques et antivirales sont distinctes. Cette action est transitoire et réversible (on fait une
stimulation des interféron endogène).
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6. Adsorption et pénétration des virus
6.1. Adsorption des virus
Il va y avoir interaction électrostatique entre le virus et la membrane cellulaire (besoin d’être à pH 7). La
température joue un rôle, les virus animaux préfèrent 37°C, les phages à 30°C. Il y a donc une spécificité de
l’adsorption. D’autres facteurs interviennent comme la sensibilité de la cellule, présence de récepteurs ou pas.
C’est le nombre de récepteurs qui définit le « spectre d’adsorption viral », « spectre d’infectivité » (varie selon
les récepteurs pour différents virus), « spectre de sensibilité. Le « spectre de permissivité » est à mettre à part. On
parle de sensibilité pour ce qui permet l’adsorption du virus. LA permissivité rend compte de la multiplication
virale. Une cellule peut être permissive mais insensible (si on injecte l’acide nucléique et qu’elle s’y multiplie).
La sensibilité rend compte de la barrière d’espèce. Ex : le RSV se fixe sur des fibroblastes aviaires mais pas les
humains. Elle rend compte aussi d’un sous typage (au sein d’une même espèce). La sensibilité est contrôlée par
un gène autosomal. Ex de récepteur mis en jeu : spicules, hémagglutinines, gp120, fibres…
La nature des récepteurs varie selon le virus. Certains seront communs à des récepteurs de la cellule (Ag
d’histocompatibilité).
Cas des myxovirus (hémagglutination) :
Ils forment des réseaux d’hémagglutination. Un virus va se fixer sur une hématie puis l’infecter, il en sort un
bourgeonnement qui montre la présence de protéines virales (HA). C’est l’hémadsorption (présence d’une
protéine d’HA à la surface de la cellule) qui va permettre à la cellule de créer des réseaux.
Hémagglutinine (HA) : protéine glycosylée formée de 2 sous unités
Un précurseur de 75 kD (HA0) va se scinder en HA1 de 50 kD et HA2 de 25 KD (dans le cas des
orthomyxovirus)
Cas des bactériophages :
Les récepteurs sont des lipopolysaccharides localisés sur la membrane externe. Leur spécificité dépend de
l’alignement des oses. Parfois localisés sur les pili ou flagelles.
Ex : Les phages filamenteux (fd ou M13) ont leurs récepteurs situés à l’extrémité des pilis des coli.
Les phages auront leur récepteur situé tout le long du pili. La bactérie femelle pili (–) ne peuvent par être
infectées.
Cas particulier : Les phage ?
C’est une protéine cellulaire qui est codée par le gène Lam B (opéron maltose). Au niveau de ces récepteurs, il
va y avoir des mutants d’hôtes et cellulaires.
L’adsorption d’un virus sur une cellule joue sur 2 spécificités : la spécificité cellulaire et la spécificité
d’attachement viral. Il suffit de modifier l’une des 2 spécificités pour inhiber l’attachement (l’adsorption). On a
soit des mutants viraux, soi t des mutants cellulaires.
Ex : Un virus sur cellule A va prendre les caractéristiques de la cellule A (surtout s’il est enveloppé). On le passe
sur la cellule B, les virions produits seront B ce qui prouve un changement de spécificité.
Ex de modification adaptative : Virus de Sendaï
Si on cultive ce virus sur cellule de rein de bovin, les virus perdent leur infectivité. Si on le fait pousser sur
cellule de poulet (embryon), on rétablit l’infectivité du virus. La modification est adaptive.
Dans le cas de la croissance sur cellules de rein de bovin, la protéine qui se fixe au récepteur cellulaire est
présente mais non maturée.
6.2. Pénétration du génome viral
Soir le virus pénètre avec la capside, soit seul l’acide nucléique pénètre seul.
Les phages sont un exemple de pénétration de l’acide nucléique. La plaque basale contient des protéases, la
gaine protéique se contracte et le tube central perfore la paroi bactérienne, il en résulte une injection de l’acide
nucléique.
Cas des virus animaux :
Le génome pénètre comme le virus entier. Il existe une différence entre virus complet et nu.
Virus nus :
Pénétration par endocytose. La vésicule de pinocytose déshabille le virus. Un sac membranaire va former les
clathrines. La vésicule membranaire se recouvre (coated pit) puis fusionne avec l’endosome qui déshabille le
virus. La fusion avec le lysosome relargue les particules déshabillées dans le cytoplasme.
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Cas des virus enveloppés :
La voie principale de pénétration est la voie de pénétration par fusion membranaire. On a attachement puis
fusion de l’enveloppe ce qui libère le génome. La capside est perdue et le corps nu (acide nucléique et protéines)
est retrouvé dans le cytoplasme.
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La 2nde voie est une voie d’endocytose (minoritaire) qui permet malgré tout de faire rentrer le virus. Le nucléoïde
peut être suivi dans son expression grâce à des antibiotiques (actinomycine).
Les messagers précoces sont nécessaires dans les premières étapes et les tardifs le sont pour la synthèse des
protéines.
Selon la famille virale, on peut avoir libération dans le cytoplasme ou directement dans le noyau (fusion avec le
noyau).
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7. Multiplication des virus et généralités
7.1. La phase de latence
La cellule infectée va reproduire le virion infectant (ou virus parental) à plusieurs centaines mêmes plusieurs
milliers de copies. Les virions fils sont identiques aux virus parentaux. (Excepté s’il y a mutation,
recombinaisons…).
La multiplication virale est exponentielle. On observe une phase silencieuse (phase de latence) entre pénétration
et expression virale. Elle correspond à une phase d’éclipse pouvant durer quelques heures à plusieurs années
selon le virus. Soit on s’aperçoit de l’infection, soit ça passe inaperçu. Certaines protéines virales seront amenées
au noyau mais sans qu’il y ait expression (éclipse). Les protéines virales ne sont pas sur la membrane cellulaire,
si en on a, on parle de phase silencieuse.
7.2. Multiplication des virus à ADN
Elle est composée de plusieurs phases :
- Multiplication protéique des virus,
- Migration des composants vers la membrane,
- Constitution du virus,
- Encapsidation,
- Excrétion du virus (par lyse cellulaire ou bourgeonnement).
Soit le nucléoïde se forme (ADN+ protéine), puis la capside se construit autour, soit le nucléoïde se fait à part
d’une précapside puis remplit cette capside qui se fermera ensuite.
7.3. Multiplication des virus à ARN
Soit on a des génomes codant (messagers ou (+) ), soit non codants (antimessagers ou (-) ).
Cas des ARN (+) :
Expression virale directe par synthèse des polypeptides précurseurs pour toutes les protéines virales. Soit on a
synthèse de messagers subgénomiques par épissage ou les deux (par des précurseurs qui seront clivés).
Cas des ARN (-) :
Soit on a fabrication d’un ARN(+) à partir du (-), soit on a fabrication d’un ADNc (intégration au génome
cellulaire pour qu’il y ait expression) puis synthèse de messagers.
La libération des virus varie selon le virus (lyse, excrétion...).
Ex : Chez le HIV, quand il se produit en petite quantité, il y a bourgeonnement alors qu’il provoque la lyse
cellulaire s’il se multiplie en très grande quantité.
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Fin des généralités
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