Détermination de la teneur en acide propionique

Transcription

Agence fédérale
pour la Sécurité
de la Chaîne alimentaire
Laboratoire de Liège
MET-LFSAL-122
DETERMINATION DE LA TENEUR EN ACIDE
PROPIONIQUE ET SES SELS DANS LE PAIN
Version
Date d’application
05
2012-12-01
Rédaction par :
Thierry De Tandt (Expert technique) (26/11/2011)
Vérification par :
Marianne Aubry (Quality Manager) (28/11/2011)
Autorisation de publication par :
Fabian Etienne-Thewissen (Chef de section) (27/11/2011)
Gestion et localisation de la
version valide :
LFSAL : disque local M:\Qualité\ Méthode\LAB 23 I-MET
LFSAL 122 AC.PROPIONIQUE.doc
Destinataires :
Membres du personnel de la section Phyto-Résidus.
Mots clefs :
Acide propionique – Propionate - Pain – chromatographie
- FID
LAB 23 I-MET LFSAL 122 AC.PROPIONIQUE v.05 1/20
Aperçu des modifications
Révision
par/date*
De Tandt Thierry
2011/05/06
De Tandt Thierry
2011/05/30
De Tandt Thierry
2011/07/07
De Tandt Thierry
2011/08/05
De Tandt Thierry
2012/11/26
*
Motif de la révision
Partie du texte/portée de la révision
Première version
Remarques de l’audit
interne du 25/05/11 par A.
Dubois
Remarques de l’audit
Belac du 11/06/11 +
adaptations nouveau
template
Points 1 - 2 – 3 et remplacement de
« calibration » par « étalonnage » et de
« level » par « niveau »
Points 1 - 6 (répétabilité,
reproductibilité, justesse et incertitude
de mesure). Les adaptations au
nouveau template (première page et
titres) ne seront pas marquées.
11. Contrôle de la qualité
Indication de la réalisation
ème
ème
et 3
des contrôles 2
ligne.
- Adaptations des
6. Indicateurs de prestations
indicateurs de prestation
suites aux essais
supplémentaires (500
mg/kg) ajoutés au dossier
de validation.
-Modification du critère sur 11.1.4 Contrôle des échantillons dopés
le rendement du dopé.
L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.
DETERMINATION DE LA TENEUR EN ACIDE
PROPIONIQUE ET SES SELS DANS LE PAIN
1
OBJECTIF .......................................................................................................................... 4
2
CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4
3
DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 4
4
DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS ................................................................................... 4
5
PRINCIPE........................................................................................................................... 5
6
INDICATEURS DE PRESTATION..................................................................................... 5
7
CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUE ............................................. 6
8
REACTIFS ET SOLUTIONS .............................................................................................. 6
8.1 RÉACTIFS ....................................................................................................................... 6
8.2 SOLUTIONS ..................................................................................................................... 6
8.2.1
Solution de standard interne ................................................................................ 6
8.2.2
Solutions de contrôle ........................................................................................... 6
8.2.3
Solutions d'étalonnage ......................................................................................... 6
9
EQUIPEMENTS ................................................................................................................. 7
10 METHODE.......................................................................................................................... 7
10.1
10.2
10.3
10.4
10.5
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS INCONNUS (FLOWCHART EN ANNEXE 3) .................... 7
PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON DOPÉ ....................................................................... 7
PRÉPARATION D’UN BLANC MÉTHODE........................................................................... 7
CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES .......................................................................... 8
SÉQUENCE D’INJECTION DES SOLUTIONS ..................................................................... 8
11 CONTROLE DE LA QUALITE........................................................................................... 8
11.1
CONTRÔLES DE PREMIÈRE LIGNE ................................................................................. 8
11.1.1 Identification des pics ........................................................................................... 8
11.1.2 Contrôle du blanc méthode .................................................................................. 8
11.1.3 Contrôle de la droite d’étalonnage ....................................................................... 9
11.1.4 Contrôle des échantillons dopés .......................................................................... 9
11.2
CONTRÔLES DE DEUXIÈME ET TROISIÈME LIGNE ........................................................... 9
12 CALCUL ET RAPPORTAGE........................................................................................... 10
13 RÉFÉRENCES AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES
OU LISTES Y AFFÉRENTS .................................................................................................... 10
13.1
FORMULAIRE ................................................................... ERREUR ! SIGNET NON DEFINI.
14 ANNEXES ........................................................................................................................ 11
14.1
14.2
14.3
ANNEXE 1 ................................................................................................................ 11
ANNEXE 2 ................................................................................................................ 11
ANNEXE 3 ................................................................................................................ 11
DETERMINATION DE LA TENEUR EN ACIDE PROPIONIQUE ET SES
SELS DANS LE PAIN
1
Objectif
La détermination de la teneur en acide propionique et ses sels dans le pain permet de
contrôler l’ajout de ces additifs alimentaires par rapport aux normes européennes et belges
en vigueur.
L’acide propionique, tout comme le propionate de sodium, de calcium ou de potassium, est
un conservateur qui peut être ajouté à la farine pour inhiber la croissance de « Bacillus
subtilis » ou de « Bacillus mesentericus » responsables du phénomène de « pain filant » dans
les produits de boulangerie. Les spores de ces microorganismes sont résistantes à la
chaleur, et donc seules les cellules végétatives sont détruites lors de la cuisson du pain.
L’acide propionique et les propionates, aussi utilisés pour inhiber les moisissures, ne causent
pas une diminution significative de la fermentation de la levure et n’affectent pas les qualités
organoleptiques du pain.
A la date de mise en application du présent document, les normes maximales sont 1000
mg/kg pour le pain emballé et 3000 mg/kg si celui-ci est préemballé et tranché. Ces normes
doivent être comparée à la somme de la teneur en acide propionique (E280) et de la teneur
en ses sels (propionate de sodium (E281), propionate de calcium (E282) et propionate de
potassium (E283)) exprimée en acide propionique.
2
Champ d’application
La méthode a été testée sur différents pains (sandwich, toast, pita, burger) et devrait pouvoir
s’appliquer à tout type de pain.
3
Documents légaux et normatifs
•
Fiche technique CODE TRA/605 et DIS/663 (accessible sur le site intranet de
l’AFSCA).
•
Scotter M.J., Thorpe S.A. ,Reynolds S.L., L.A. Wilson and P;R. Strutt ; « A rapid
capillary gas chromatographic method for the détermination of propionic acid and propionates
in bread and bread products » ; Food Additives & Contaminants : Part A,11:3,295-300.
•
DIRECTIVE 95/2/CE DU PARLEMENT EUROPÉEN ET DU CONSEIL du 20 février
1995 concernant les additifs alimentaires autres que les colorants et les édulcorants
(accessible sur internet via le lien http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/addit_flavor/flav11_fr.pdf).
•
Ministère des affaires sociales, de la santé publique et de l’environnement - Arrêté
royal du 01 mars 1998 relatif aux additifs autorisés dans les denrées alimentaires à
l'exception des colorants et des édulcorants. (accessible sur internet via le lien
http://faolex.fao.org/docs/pdf/bel14170.pdf).
4
Définitions et abréviations
FID : Flame Ionisation Detector
SI : Standard Interne
S/N : Signal to Noise, rapport entre l’intensité de la réponse du détecteur à un temps donné et
celle du bruit de fond mesuré autour de ce moment.
5
Principe
L’échantillon subit une extraction à l’acétate d’éthyle en présence d’acide orthophosphorique
(les propionates sont alors présents sous forme acide). Après filtration, la solution d’acétate
d’éthyle est analysée en chromatographie gazeuse sur une colonne capillaire de type
carbowax par détection en ionisation de flamme.
6
Indicateurs de prestation
Matrice
Gamme de quantification
Modèle mathématique
Nombre de niveaux d'étalonnage
pain
250 à 4000 mg/kg
linéaire
5
Critère sur l'étalonnage
± 10 %
Ecart maximum observé sur l'étalonnage
7,4 %
Critère sur l'identification par temps de rétention
Ecart maximum observé sur le temps de
rétention
Critère sur le rendement
Etalonnage
± 0,9 %
Spécificité
0,5 %
entre 80 et 110 %
Rendement le plus bas observé
95,3 %
Rendement le plus haut observé
107,7 %
Rendement moyen obtenu
Domaine de
validation
Justesse
101,7 3 %
Comparaison résultat avec laboratoire accrédité non significativement différent
LOQ
250 mg/kg
LOQ
LOD
125 mg/kg
LOD
à 500 mg/kg
7,9 mg/kg
à 1000 mg/kg
67,8 mg/kg
à 3000 mg/kg
73,5 mg/kg
à 500 mg/kg
16,2 mg/kg
à 1000 mg/kg
102,2 mg/kg
à 3000 mg/kg
371,8 mg/kg
à 500 mg/kg
7,83 %
à 1000 mg/kg
7,00 %
à 3000 mg/kg
12,04 %
Répétabilité
Reproductibilité
intra-laboratoire
Incertitude de
mesure élargie
Indicateurs de prestations provenant du dossier de validation.
7
Consignes de sécurité et mesures spécifique
•
Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et
dans le log book de l'appareil.
Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte.
•
8
Réactifs et solutions
8.1
Réactifs
•
•
•
•
•
Acétate d’éthyle (qualité HPLC)
3-MBA ou 3-méthylbutanoic acid ou acide isovalérique (pur)
Acide orthophosphorique (qualité PA 85% min)
Acide propionique (pur certifié)
Sulfate de sodium anhydre
8.2
Solutions
8.2.1
Solution de standard interne
Peser, à 0,1 mg près, environ 250 mg de 3-MBA dans un ballon jaugé 25 ml et compléter au trait à
l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.
8.2.2
8.2.2.1
Solutions de contrôle
Solution mère à 5 mg/ml
Peser, à 0,1 mg près, environ 250 mg du pur d’acide propionique dans un ballon jaugé 50 ml et
compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.
8.2.2.2
Solution de contrôle à 30 µg/ml (C1)
Prélever 120 µl de la solution mère d’acide propionique à 5 mg/ml en ballon jaugé de 20 ml
contenant déjà 200 µl de la solution de standard interne et compléter au trait à l’aide d’acétate
d’éthyle. Homogénéiser la solution.
8.2.2.3
Solution de contrôle à 150 µg/ml (C2)
Prélever 600 µl de la solution mère d’acide propionique à 5 mg/ml en ballon jaugé de 20 ml
contenant déjà 200 µl de la solution de standard interne et compléter au trait à l’aide d’acétate
d’éthyle. Homogénéiser la solution.
8.2.3
8.2.3.1
Solutions d'étalonnage
Solution mère à 2 mg/ml
Peser, à 0,1 mg près, environ 100 mg du pur d’acide propionique dans un ballon jaugé 50 ml et
compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.
8.2.3.2
Solutions d’étalonnage L1 à L5
Prélever V µl de la solution mère à 2 mg/ml, en ballon jaugé de 20 ml contenant déjà 200 µl de la
solution de standard interne et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la
solution.
Solution
L5
L4
L3
L2
L1
9
•
•
•
•
•
•
•
•
V (µl) sol. mère
2000
1000
500
250
125
Volume final (ml)
20
20
20
20
20
Equipements
Mixer.
Agitateur orbital.
Bain à ultra-sons.
Micropipettes.
Microfiltre 0,2 µm type acrodisc.
Balance analytique précise à 0,1 mg.
Verrerie de laboratoire.
Système de chromatographie gazeuse avec détecteur FID muni d’une colonne de type
Carbowax (ex : Stabilwax-DA de marque Restek) 15m x 0,32mm ; épaisseur de phase:
0,25 µm (ou colonne équivalente) et d’un injecteur split/splitless équipé d’un insert avec
rétrécissement côté colonne.
10 Méthode
10.1 Préparation des échantillons inconnus (Flowchart en annexe 3)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Homogénéiser l’échantillon avec le mixer.
Dans un flacon de 250 ml, peser environ 5 g d’échantillon homogénéisé, avec une
précision minimale de 0,01 g.
Ajouter précisément 1 ml de la solution de standard interne avec une micropipette.
Ajouter 100 ml d’acétate d’éthyle au verre à pied.
Ajouter environ 1 ml d’acide ortho phosphorique à la micropipette.
Ajouter environ 10 g de Na2SO4 anhydre.
Agiter mécaniquement 2 minutes avec l’agitateur orbital.
Passer 10 minutes au bain à ultra-sons.
Filtrer sur acrodisc de 0,2 µm dans un vial d’injection.
10.2 Préparation de l’échantillon dopé
A chaque séquence d’analyses, un échantillon de la série est dopé.
Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, mais ajouter
précisément à la micropipette 1 ml de la solution mère à 5 mg/ml (8.2.2.1) avant l’ajout des 100
ml d’acétate d’éthyle. Ce dopage correspond à un ajout de 1000 mg/kg.
10.3 Préparation d’un blanc méthode
A chaque séquence d’analyses, un blanc méthode est réalisé.
Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, mais n’ajouter ni
échantillon, ni standard interne dans le flacon de 250 ml.
10.4 Conditions chromatographiques
Les paramètres instrumentaux principaux sont les suivants (détail en annexe 2) :
•
•
•
•
•
•
•
volume d’injection: 1 µl
mode d’injection: split avec ratio 10
He (gaz vecteur) à débit constant : 2ml/min
température injecteur : 220°C
température détecteur FID : 250°C
débits gaz FID : Air : 300 ml/min – H2 : 30 ml/min – Make up (N2) : 30 ml/min
programmation du four (peut être adapté en fonction du chromatogramme obtenu) :
 température initiale: 50°C
 rampe 1: 8°C/min. → 140 °C
 rampe 2: 40°C/min. → 230°C
 isotherme pendant 11,5 minutes (durée totale d’une injection : 25 min)
10.5 Séquence d’injection des solutions
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
courbe d’étalonnage L1 → L5
contrôle 1
contrôle 2
blanc méthode
échantillon dopé
échantillons inconnus (max 8)
contrôle 1
contrôle 2
échantillons inconnus (max 10)
contrôle 1
contrôle 2
…
11 Contrôle de la qualité
11.1 Contrôles de première ligne
11.1.1 Identification des pics
Identifier l’acide propionique dans la solution d’échantillon en comparant le temps de rétention
avec ceux des solutions de contrôle l’encadrant. Les temps de rétention ne peuvent différer
de plus de 0,9 % (paramètre introduit dans le logiciel pour la reconnaissance des pics).
Cet écart a été déterminé de manière empirique afin d’éviter que le logiciel n’identifie à tort
comme acide propionique un tout petit pic, parfois présent dans la matrice, proche du temps
de rétention de l’acide propionique (juste avant). En cas de présence de ce pic, les essais de
validation ont montré qu’il était parfaitement séparé du pic d’acide propionique (voir
chromatogrammes en annexe 1).
11.1.2 Contrôle du blanc méthode
Le blanc méthode ne peut présenter de pic ayant un S/N>10 aux temps de rétention de
l’acide propionique ou de l’acide isovalérique (SI). Sinon, il faut nettoyer la colonne
(chauffage au maximum acceptable par la colonne) et, si un pic est encore présent, trouver
son origine (réactif, vaisselle,…) et l’éliminer.
11.1.3 Contrôle de la droite d’étalonnage
•
La quantité trouvée pour les injections de contrôle ainsi que pour les niveaux
d’étalonnage ne peut différer de plus de 10 % de la quantité théorique.
•
Le rejet d’un des points d’étalonnage est autorisé à condition que cela ne soit ni le
premier ni le dernier niveau.
•
Ces paramètres sont vérifiés via le formulaire LAB23 F543-PR40-PROPIONIQUE. Si un
des ces paramètre n’est pas respecté, il faut recommencer la préparation des solutions
de contrôle et/ou d’étalonnage et réinjecter la séquence.
11.1.4 Contrôle des échantillons dopés
Le taux de récupération obtenu pour l’échantillon dopé doit être compris entre 80 et 110 % ; ceci
est un fourchette de départ qui sera affinée sur base de l’exploitation de la carte de contrôle.
Si "n" est le nombre de rendements disponibles sur la carte de contrôle, la fourchette de rendement
acceptable est calculée pour "n = 8", puis revue pour "n = 15" et "n = 30", et enfin fixée pour "n =
50".
Une carte de contrôle est construite sur le rendement d’un échantillon de la série supplémenté en
acide propionique. Le dopage est réalisé en ajoutant 1000 mg/kg, dès lors, la concentration du
dopé sera toujours supérieure à 1000 mg/kg. L’incertitude de mesure la plus élevée correspondant
à cette gamme de concentration ( > 1000 mg/kg) est de 12,04 % (voir § 6. Indicateurs de
prestations). Le rendement devra donc être compris dans la fourchette de 100 ± 12,04 %.
Si le rendement obtenu est en-dehors de la fourchette acceptable, recommencer la préparation des
solutions d’échantillon y compris le dopé, et les réinjecter comme décrit dans la séquence
d’injections.
Taux de récupération (%) =
CA × 100
CT
où :
CA = concentration trouvée analytiquement dans l’échantillon dopé (en mg/kg)
CT = concentration théorique dans l’échantillon dopé (en mg/kg)
= CAND + (VD x CD x1000 / PD)
où
CAND = concentration trouvée analytiquement dans l’échantillon non dopé (en mg/kg)
VD = volume de solution de dopage (8.2.2.1) utilisé pour doper l’échantillon (en ml)
CD = concentration de solution de dopage (8.2.2.1) utilisée pour doper l’échantillon
(mg/ml)
PD = prise d’essai de l’échantillon dope (g)
11.2 Contrôles de deuxième et troisième ligne
Des contrôles deuxième et troisième ligne sont réalisés selon la procédure : « LAB 23 P 020
Gestion des contrôles qualité ».
12 Calcul et rapportage
Les valeurs à introduire dans le logiciel pour les niveaux d’étalonnage doivent correspondre à
la quantité (mg) d’acide propionique ajouté dans chaque niveau aux 200 µl de la solution de
standard interne. Elles sont calculées comme suit en fonction des dilutions de la solution
mère réalisées pour obtenir les niveaux d’étalonnage:
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 3
Niveau 4
Niveau 5
C x 0,125
C x 0,250
C x 0,500
C x 1,000
C x 2,000
Où C (mg/ml) = concentration exacte de la solution mère à 2 mg/ml (8.2.3.1)
= pesée (mg) x pureté (%) / 100 / volume (ml)
Pour calculer la teneur en acide propionique dans les échantillons, il faut tenir compte de la
pesée exacte de chaque échantillon inconnu et du fait que lors de la préparation de celui-ci,
on a ajouté 5 fois plus de solution de standard interne à la prise d’essai que dans les niveaux
d’étalonnage. Donc, le résultat obtenu à partir de la courbe d’étalonnage (X) doit être multiplié
par 5 puis divisé par la prise d’essai (P) et multiplié par 1000 pour obtenir la teneur en acide
propionique de l’échantillon en mg/kg :
Teneur en acide propionique et ses sels (mg/kg) = X (mg) x 5 / P (g) x 1000
Le rapport comportera les données brutes (surfaces et temps de rétention des pics), ainsi que
les contrôles visés au point 11 (contrôle de la qualité).
13 Références aux procédures, instructions, documents, formulaires ou
listes y afférents
13.1 Procédures
LAB 23 P 020 Gestion des contrôles qualité
13.2 Formulaires
LAB23 F543-PR40-PROPIONIQUE : Rapport d’exécution – Dosage de l’acide propionique
13.3 Listes
néant
14 Annexes
14.1 Annexe 1
Chromatogrammes des niveaux d’étalonnage 1 et 5, d’échantillon non dopé et d’échantillon
dopé à 1000 mg/kg.
14.2 Annexe 2
Paramètres de la méthode analytique (printscreens).
1. L’injecteur
2. EFC (Electronic Flow Control)
3. Le four
4. Le détecteur
5. Data handling
6. Integration parameters
7. Peak table
8. Calibration
9. Time events
14.3 Annexe 3
Flowchart de la préparation des échantillons.
Annexe 1 : Chromatogrammes (1/4)
Niveau 1 : vue d’ensemble (en haut) et zoom (en bas)
acide propionique à 7,627 min – acide isovalérique (SI) à 9,364 min.
Niveau 5 : vue d’ensemble (en haut) et zoom (en bas)
Sandwich non dopé : vue d’ensemble (en haut) et zoom (en bas)
Pas d’acide propionique à 7,61 min – acide isovalérique (SI) à 9,360 min.
Pic présent dans certains pains, bien séparé du pic d’acide
propionique (voir chromatogramme du dopé) mais nécessitant
une fenêtre restreinte (± 0,9 %) sur le temps de rétention pour
l’identification de l’acide propionique, ceci afin de ne pas le
confondre avec ce dernier dans le cas d’un échantillon qui ne
contiendrait pas d’acide propionique.
Sandwich dopé à 1000 mg/kg : vue d’ensemble (en haut) et zoom (en bas)
Mise en évidence de la bonne séparation entre le pic d’acide
propionique et un petit pic (présent dans certains pains) qui le
précède.
Annexe 2 : Paramètres de la méthode analytique (printscreens).
1) L’injecteur
2) EFC (Electronic Flow Control)
3) Le four
4) Le détecteur
5) Data handling
6) Integration parameters
7) Peak table
8) Calibration
9) Time events
Annexe 3 : Acide propionique et ses sels dans le pain – Flowchart
5 g échantillon homogénéisé + 1 ml Sol. SI
(+ 1 ml sol. à 5 mg/ml si échantillon dopé) + 100 ml
acétate d’éthyle + 1 ml H3PO4 + 10 g Na2SO4
2 min agitateur
Filtration sur acrodisc 0,2 µm
Injection GC-FID
10 min bain US

Détermination de la teneur en acide propionique

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