Explo complémentaire en Hémato C

Transcription

TISSU SANGUIN – Explorations Complémentaires en Hématologie Cellulaire
08/10/215
ACHILLE Flora L3
Tissu sanguin
Dr Lafage
CR : NIARE Sanaba
24 pages
Explorations complémentaires en hématologie cellulaire
Plan
A. Généralités d’une suspicion de leucémie
B. Leucémie myéloïde chronique (LMC)
I. Quelques caractéristiques de la LMC
II. Circonstances de découverte
III.
Le myélogramme
IV. Le caryotype
V. La RQ-PCR (Real time Quantitative Polymerase Chain Reaction)
VI.La technique de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
VII.
Le rôle de la protéine Abelson dans la LMC
VIII.
Traitements et suivi de la LMC en phase chronique
IX.La transformation de la LMC en phase aiguë
C. Leucémie aiguë lymphoblastique (LAL)
I. Quelques caractéristiques de la LAL
II. La cytométrie de flux (CMF)
III.
Classification
IV. Leucémie avec translocation 9-22 (Ph)
V. L’hyperdiploïdie
VI.Leucémie avec translocation 12-22 / TEL-AML1
VII.
La translocation t(4 ;11) / MLL-AF4
VIII.
La CGH
IX.Apport de la CMF dans le suivi de la maladie : étude de la maladie résiduelle
A. Généralités d’une suspicion de leucémie
La suspicion d'une leucémie se fait à travers des signes cliniques et biologiques diversement associés (tous ne
sont pas forcément présents).
Cliniquement, on note des signes d'insuffisance médullaire. En effet, les trois lignées rouge, granuleuse et
plaquettaire prennent naissance dans la moelle osseuse, ainsi si un phénomène néoplasique a lieu dans la moelle
osseuse, il va intéresser ces trois lignées ce qui va provoquer une anémie, un syndrome infectieux et/ou un
syndrome hémorragique.
On a ensuite des signes tumoraux touchant les organes concernés par l’hématopoïèse : douleurs osseuses,
splénomégalie et hépatomégalie (ces deux organes sont impliqués dans l’hématopoïèse embryonnaire mais
peuvent être réactivés et être envahis), une adénomégalie (surtout s’il s’agit d’une pathologie touchant la
lymphopoïèse), ou encore un syndrome médiastinal (dans les pathologies malignes impliquant les
lymphocytes T, le thymus étant l’organe de production des lymphocytes T).
Tous ces signes amènent à faire un hémogramme (NFS). Il faut ici penser à demander les réticulocytes afin de
caractériser l’anémie (régénérative ou non). On peut observer :
- Une anémie arégénérative (CR : évoquant donc un problème central)
- Une neutropénie
- Une thrombopénie
- Une hyperleucocytose (liée à un passage dans le sang des cellules tumorales plus ou moins
différenciées : si elles ne sont pas différenciées on parle de blaste, et on est dans le cas d’une leucémie
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aiguë ; si les cellules sont différenciées c’est une leucémie chronique).
En cas de suspicion d’hémopathie maligne, une exploration de la moelle osseuse sera effectuée. A partir d’un
prélèvement (CR : on pique donc le patient une seule fois) , on effectuera :
- Un myélogramme (frottis), c’est lui qui fait le diagnostic,
- Un immunophénotypage (sur tube EDTA) pour chercher les marqueurs membranaires ou
intracellulaires (ce qui peut permettre par exemple de différencier une leucémie B ou T dans le cas
d’une leucémie aiguë),
- Un caryotype (technique de cytogénétique) à partir d’un prélèvement sur héparine non toxique pour
permettre les mitoses et la culture cellulaire. On pourra compléter par une étude d’hybridation in situ en
fluorescence (FISH).
NB : le caryotype ne peut se faire sur du sang circulant et nécessite un prélèvement de moelle osseuse,
car les anomalies recherchées sont somatiques et ne concernent que certaines populations clonales.
- De la biologie moléculaire (sur tube EDTA) pour mettre en évidence des transcrits anormaux, des
mutations etc…
B. Leucémie myéloïde chronique
I. Quelques caractéristiques de la LMC
La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne qui touche la cellule souche
hématopoïétique. Elle fait partie des syndromes myéloprolifératifs chroniques (SMP) ou néoplasies
myéloprolifératives selon la nouvelle appellation de l’OMS.
Elle a une évolution naturelle en trois phases : phase chronique, phase d’accélération et phase aiguë
(transformation en leucémie aiguë). C’est donc un très bon modèle de cancérogénèse.
Rappel sur l’hématopoïèse, dont il est important d’avoir en tête un schéma :
- La cellule souche hématopoïétique se différencie soit en cellule souche lymphoïde soit en cellule souche
myéloïde.
- La cellule souche lymphoïde va se différencier soit vers la lignée B soit vers la lignée T.
- La cellule souche myéloïde va se différencier vers une lignée des éléments figurés du sang.
Ce schéma explique pourquoi on oppose souvent les lignées myéloïde et lymphoïde (on dira par exemple
souvent « leucémie non lymphoïde » pour désigner une leucémie myéloïde, de plus, le traitement est différent).
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Ce schéma est très simplifié, il y en a un plus détaillé sur l’ENT « pour l’étudier tranquillement » mais celui-ci
est suffisant.
La leucémie myéloïde chronique se caractérise par une anomalie cytogénétique, le chromosome Philadelphie
(Ph), responsable de la création d’un nouveau gène chimère codant pour un nouveau transcrit BCR-ABL (se dit
« BCR-Abelson »), détectable en biologie moléculaire. Ce transcrit va donner naissance à une protéine BCRABL qui a une activité tyrosine-kinase exacerbée. Il est détectable en biologie moléculaire, ce qui permet
d’administrer au patient des anti-tyrosine-kinase (ATK) (thérapie ciblée très efficace pour compléter ou
remplacer la chimiothérapie douce ou forte parfois inefficace)
Au niveau épidémiologique, c’est une maladie avec une faible incidence : 10 nouveaux cas/ an/ million
d’habitants, mais avec une prévalence en augmentation du fait de la diminution du taux de mortalité (progrès
thérapeutiques : les ATK). La LMC n’est pas une maladie que l’on guérit (ce qui nécessiterait une greffe de
moelle) mais avec laquelle on peut vivre, en rémission sur des années.
Les facteurs de risque sont ceux qui entraînent des cassures de l'ADN (benzène, solvant, radiations...).
On dit que c'est une pathologie de l'homme d'âge mûr puisqu'elle touche plus les hommes que les femmes
(1,4 homme pour 1 femme) et l'âge moyen de diagnostic est 54 ans. Mais on peut la voir à tous les âges, bien
que ce soit très rare chez l'enfant et exceptionnel avant 5 ans.
II. Circonstances de découverte
On découvre une LMC soit chez une personne qui souffre d'asthénie soit lors d'un hémogramme systématique
(médecine du travail...). L'examen clinique, s'il est fait au début de la maladie, est normal le plus souvent mais
si la maladie a déjà commencé à évoluer on peut voir des signes tumoraux en particulier une splénomégalie et
des signes liés à l'hyperleucocytose qui est installée depuis un moment et peut entraîner des thromboses
veineuses ou artérielles.
Exemple de frottis sanguin : il est beaucoup trop riche, on a une hyperleucocytose (100G/L) due à une
polynucléose neutrophile et une myélémie (présence de cellules immatures dans le sang, précurseurs de la
lignée myéloïde et plus précisément de la lignée granuleuse, normalement absentes du sang).
À l'hémogramme, tout ce qui est en gras est anormal :
- Globules rouges 5,5 T/L (Norme (N) : 4,5 – 6,2 (homme))
- Hémoglobine 15,5 g/dL (N : 13 -18 (homme))
- Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine 30 pg (N : 27 +/- 2)
- Volume Globulaire Moyen 90 μ3 (N : 82 - 98)
-
Globules blancs 64 G/L (N : 4-10)
Polynucleaires neutrophiles 58 % soit 37G/L (N :1,7-7)
Polynucleaires éosinophiles 2 % soit 1,3 G/L (N : 0,05 – 0,5)
Polynucleaires basophiles 4 % soit 2,6 G/L (N : 0 – 0,05)
Monocytes 2 % soit 1,3 G/L (N : 0,1 - 1)
Lymphocytes 6 % soit 3,8 G/L (N : 1,5 -4)
Myeloblastes 1 % soit 0,6 G/L
Promyelocytes 3 % soit 1,9 G/L
Myelocytes 18 % soit 11,5 G/L
Metamyelocytes 6 % soit 3,8 G/L
-
Plaquettes : 510 G/L (N : 150-400)
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Ici, la lignée rouge n’est pas touchée alors que la lignée granuleuse l’est particulièrement car il s’agit d’une
anomalie de la cellule souche qui donne un avantage de prolifération à la lignée myéloïde, et au sein de cette
lignée, surtout à la lignée granuleuse neutrophile.
Cet hémogramme est très caractéristique et ne nécessite pas de faire un immunophénotypage. On fera donc
un myélogramme, un caryotype (qui peut cette fois aussi être réalisé à partir de sang circulant du fait de la
myélémie qui implique que des cellules normalement retrouvées dans la moelle sont ici présentes dans le sang,
on peu donc prélever du sang au lieu de faire un prélèvement de moelle osseuse), et de la biologie moléculaire.
CR : Les myéloblastes sont des cellules de la moelle et ne doivent pas à l'état physiologique être présentes dans
le sang.
III. Le myélogramme
On observe une moelle très riche.
Les mégacaryocytes sont anormaux, avec un noyau monolobé et de petite taille.
Le plus important dans le myélogramme est le pourcentage des cellules immatures, qui varie en fonction de la
phase de la maladie :
- Phase chronique : myéloblastes <10%
- Phase accélérée : 10% < myéloblastes < 20%
- Phase de leucémie aiguë myéloïde : myéloblastes > 20% ; (c'est la définition de la leucémie aigüe).
Le myélogramme ne fait pas le diagnostic mais aide à la démarche, on fera ensuite un caryotype.
IV. Le caryotype
Le chromosome Ph a été découvert en 1960, c'était le premier marqueur clonal d'une hémopathie maligne. C'est
un tout petit chromosome, beaucoup plus petit que les autres.
Ce chromosome est une anomalie acquise dans les cellules du sang (elle est dite somatique, et ne se retrouve
pas dans une biopsie de peau par exemple à l’inverse d’une mutation germinale, constitutionnelle).
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Rappel sur la technique du caryotype :
Pour obtenir ces images, le prélèvement de moelle osseuse et de sang (si cellules anormales) doit être stérile.
La seringue est héparinée pour éviter la coagulation du prélèvement mais ce n'est pas l’héparine que l'on trouve
dans les gazométries, ici elle est sans conservateur toxique puisqu'on doit cultiver les cellules.
Le transport doit se faire rapidement et à température ambiante car les cellules doivent rester vivantes pour la
culture.
La mise en culture se fait sous une hotte stérile et on met le prélèvement dans un flacon de culture. On essaie de
recréer un environnement qui ressemble à la moelle osseuse avec antibiotiques et/ou des mitogènes.
Le caryotype se fait en 1 à 3 jours.
On arrête la culture en métaphase avec de la colchicine (poison du fuseau mitotique) et on peut éventuellement
faire une synchronisation des cultures. Puis on transvase les flacons de culture pour centrifuger le contenu et on
fait un choc hypotonique (pour détruire les globules rouges et parallèlement permettre un gonflement cellulaire
pour un étalement maximum des chromosomes).
Enfin on étale sur des lames, on fait des colorations pour avoir les bandes (bandes G ou bandes R qui sont
l’inverse l’une de l’autre, qui s’obtiennent suite à des processus de digestion des protéines associées aux
chromosomes) et on observe au microscope pour classer les chromosomes grâce aux bandes.
En observant le chromosome Philadelphie, on s’aperçoit en 1973 (avec l’apparition des techniques de bandes)
que c’est en fait un chromosome 22 raccourci « par le bas ») (bras q ou bras long) suite à une translocation
avec le chromosome 9 t(9;22)(q34;q11).
CR : Le chs 22 est donc tout petit car un morceau est « parti » sur le chs 9.
La prof n’a pas plus expliqué cette formule, mais la première parenthèse indique qu’il y a eu une translocation
d’une partie du chs 22 sur le chs 9. La deuxième parenthèse (à lire « q trois quatre ; q un un ») indique les
points de cassure au niveau des bandes et sous bandes sur les chromosomes respectifs (donc par exemple pour
le chromosome 9, le point de cassure se situe sur le bras long, sur la bande 3 et la sous bande 4).
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La découverte du chromosome de Philadelphie donne le diagnostic de leucémie myéloïde chronique avec
certitude et permet de donner au patient un traitement ATK.
Pour servir au diagnostic et avant de rendre le résultat, on doit faire au moins 20 mitoses afin de s’assurer de
l’absence d’autres anomalies chromosomiques qui pourraient être le signe cytogénétique d’une accélération.
En 1980, de nouvelles études ont montré l’existence d’un proto-oncogène ABL avec son équivalent viral vABL
(décrit par M. Abelson). La même séquence existe dans le génome humain en 9q34, et c’est la moitié de cette
séquence qui va se transloquer sur le chromosome 22, dans un gène inconnu qu’on a alors appelé BCR
(breakpoint cluster region = région de point de cassure).
NB : il y a une nouvelle nomenclature des gènes, ABL est maintenant appelé ABL1, mais on peut rencontrer les
deux appellations ; le gène BCR n'a pas changé de nom.
Il existe différents types de transcrit :
–
MBCR : (M pour Major) le plus fréquent (99% des LMC). Le point de cassure se situe après l'exon b2
(aujourd'hui nommé e13) ou b3 (e14 dans la nouvelle nomenclature) sur BCR et un point de cassure
entre les exons a1 et a2 sur ABL. Cela crée deux transcrits, b2a2 ou b3a2 qui sont très peu différents et
ont la même activité TK, très augmentée par rapport à la protéine Abelson et va augmenter la
prolifération de manière incontrôlée.
–
mBCR : (m pour minor) exceptionnellement le point de cassure sur BCR est beaucoup plus en 5' (en
e1) donc le transcrit est beaucoup plus petit.
–
μBCR : exceptionnellement le transcrit est beaucoup plus long puisque le point de cassure sur BCR est
complètement en 3' du gène (en e19)
Tous ces transcrits ont une activité TK très augmentée, surtout le mBCR.
Le chromosome Philadelphie ne se retrouve pas que dans les LMC, mais aussi dans 1/3 des leucémies aiguës
de l’adulte (mais on aura plus de mBCR que de MBCR) dans lesquelles on pourra aussi donner un traitement
ATK.
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Les points de cassures mis en évidence vont pouvoir servir d’amorce pour la PCR, et ainsi permettre de voir de
nouvelles choses.
V. La RQ-PCR (Real time Quantitative Polymerase Chain Reaction)
La PCR est une technique très sensible, on peut détecter 1 cellule sur 1 million. Le prélèvement se fait le plus
souvent sur le sang (grâce à la sensibilité), mais on peut aussi le faire sur de la moelle, ou des ganglions dans le
cas de lymphomes.
Ce qui est important de comprendre avec ces techniques est leur complémentarité. Par exemple, le caryotype et
la PCR peuvent tous les deux montrer la présence d’un chromosome Philadelphie, mais la PCR sera beaucoup
plus sensible. En revanche le caryotype permet de voir d’autres anomalies chromosomiques comme par
exemple une trisomie 8 associée qu’on ne peut pas voir en PCR si on ne la recherche pas spécifiquement. Ces
techniques ont chacune leur spécificité : pour le myélogramme c’est le pourcentage de myéloblastes, pour le
caryotype ce sont les anomalies associées au chromosome Ph, pour la RQ-PCR, on va pouvoir quantifier le
transcrit.
On extrait l'ADN et/ou de l'ARN à partir des cellules nucléées. 1mL de sang normal contient :
- 10 millions de cellules nucléées
- 30 à 50µg d’ADN
- 1 à 10µg d’ARN utilisé en RT-PCR pour l’analyse des transcrits
Quand on travaille sur l'ARN, étant donné qu'il est très fragile on le transforme rapidement en ADNc grâce à la
reverse transcription. Ensuite on applique les techniques de PCR c'est-à-dire des polymérisations en chaîne
grâce à l'ADN polymérase.
Mais maintenant on peut avoir des techniques de RQ-PCR, c'est une PCR en temps réel qui est en plus
quantitative. On peut voir sur une cinquantaine de cycles la fluorescence augmenter à chaque cycle si un
transcrit est identifié. Elle permet donc de quantifier le transcrit dans l’échantillon. Ce n'est pas vraiment utile
au diagnostic mais ça l'est pour apprécier le taux de maladie résiduelle après traitement (suivi), on doit voir une
diminution de ce transcrit au fur et à mesure du temps.
On fait tout en dupliqué, tous les tubes sont en 2 exemplaires avec des témoins positifs (plasmide qui contient la
séquence BCR-ABL) et des témoins négatifs.
On utilise des amorces correspondant aux points de cassure cités plus haut.
Cela permet de quantifier mais pour réellement quantifier il faut faire le rapport avec un gène contrôle qui est
exprimé de façon ubiquitaire qui peut être GUS ou ABL (présent sur l'autre chromosome 9 resté intact ;
paradoxalement, le gène ABL intact est ubiquitaire et exprimé de façon très stable, c’est un très bon contrôle).
On fait donc le rapport BCR-ABL / ABL qui va nous servir au diagnostic. C’est un témoin de qualité de
l’ADN.
→ Si le transcrit BCR-ABL et le contrôle ABL sont négatifs, on ne peut pas rendre de résultat, l’ADN
est trop dégradé.
→ Si le transcrit BCR-ABL est positif mais le contrôle mauvais, on peut rendre un résultat positif mais
on ne pourra pas quantifier (ce qui peut arriver car le transcrit est beaucoup plus solide que le contrôle ABL).
Dans le suivi on fera le rapport de ce qu'on trouvera au suivi avec ce qu'on avait trouvé au diagnostic afin de
voir la diminution au cours de la maladie. En revanche cette quantification ne servira pas au diagnostic ni au
pronostic.
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Exemple de résultat :
VI. La technique de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Dans 10% des cas, le chromosome Ph est absent au diagnostic :
– dans 5% le transcrit BCR-ABL est positif en PCR
– et dans les 5% autres, le transcrit est négatif en PCR. Pour ces derniers cas où la clinique et le
myélogramme sont très évocateurs d'une LMC, on complète le caryotype et la PCR par la FISH.
Intérêt de la FISH :
Le caryotype est une analyse globale mais assez grossière du génome c'est-à-dire qu'un caryotype
hématologique a 500 bandes (1 bande = 5 à 10 000 kb ; 1 gène = 10 à 1000 kb). Donc il faut qu'il manque
beaucoup de gènes pour que l'on voie quelque chose. De même certains échanges de chromosome sont trop
petits pour être vus.
Pour faire l'hybridation, les préparations cytogénétiques sont déposées sur des lames. On commence par une
co-dénaturation (CR : dénaturation des sondes et des chromosomes)
–
–
–
–
–
–
Dépôt de la sonde sur la lame,
Élévation de la température à 75°C pendant 5 min : cela permet de dénaturer l'ADN de la sonde et des
chromosomes.
Retour à 37°C : les sondes simples brins vont se mettre sur les chromosomes simples brins.
Lavages pour enlever toute hybridation non spécifique,
Contre-colorations pour que les chromosomes et les noyaux soient bleus
Enfin analyse au microscope et analyseur d'image
On prend une sonde moléculaire qui contient une séquence BCR et une autre qui contient une séquence ABL,
chacune marquée d'une couleur différente. S'il y a une translocation entre les chromosomes 9 et 22, on verra la
juxtaposition des deux signaux sur le chromosome Ph.
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On peut aussi faire de la FISH sur noyaux : FISH interphasique (par analogie avec la FISH métaphasique)
Dans le cas du donneur sain, on peut voir les points de fluorescence séparés, alors qu’ils peuvent être collés
pour le patient LMC.
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Dans le cas où le caryotype est normal (CR :alors que le patient a tout de même une LMC), on observe en
FISH (sur la photo, en couleur sur l’ENT) un chromosome 22 anormal « der(22) » (der pour « dérivé ») qui
porte un signal de fusion : le signal rouge du chromosome 9 est venu sur le chromosome 22. Ce n'est pas dû à
une translocation mais à une insertion: il y a deux points de cassure sur le chromosome 9 (qui incluent tout le
gène ABL) et un sur le 22 (dans la région BCR). Le segment (trop petit pour être vu au caryotype) qui s'excise
du chromosome 9 s'insère dans le chromosome 22, ce qui recrée un gène BCR-ABL sur le chromosome 22.
Cela ne change rien au pronostic. En revanche c'est important à savoir pour le suivi qui se fera par
hybridation in situ.
Il peut aussi y avoir une insertion de 22 dans le 9, cela aura le même résultat : création d’un gène chimérique
BCR-ABL.
5% des patients ayant une LMC ont ce phénomène, mais cela représente aussi 5% des patients ayant une
leucémie aiguë (mais pas obligatoirement avec BCR-ABL, on connaît une centaine de gènes de fusion).
Le paragraphe suivant vient du ronéo de l’an dernier mais est intéressant :
Il faut toujours utiliser au moins deux techniques (caryotype, PCR, FISH) pour faire le diagnostic car il
implique une prise en charge très lourde que le patient prend pratiquement à vie (on ne parle pas encore de
guérison mais de rémission très prolongée).
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En résumé : si le chromosome Ph est absent au caryotype,
→ le plus souvent BCR-ABL est positif (Ph masqué ou cryptique dû à une insertion submicroscopique
visible uniquement en FISH) et le patient va répondre au traitement ciblé.
→ Plus rarement, si BCR-ABL est négatif (PCR et FISH) mais que cela ressemble vraiment à une
LMC, on est face à une forme atypique (frontière entre syndromes myéloprolifératif et myélodysplasique
(SMP/SMD)) où le traitement ciblé n'aura pas d'effet donc le patient prendra plutôt des traitements classiques
de chimiothérapie et peut-être même une greffe de moelle osseuse si le patient est jeune.
CR : Il est donc important d'évaluer le coût global de ces examens et de ne pas faire d' exploration inutile. Si
on détecte le chromosome Ph sur le caryotype on ne fera pas de FISH et on affirmera le diagnostic de LMC.
VII. Le rôle de la protéine bcr-abl dans la LMC
Si on injecte à une souris un rétrovirus qui contient la séquence BCR-ABL,
après irradiation de la souris, on observe une LMC au bout de quelques
semaines. Ce gène n'est donc pas un épiphénomène, c'est bien l'élément
responsable de la maladie.
La protéine abl fait partie des protéines tyrosine-kinases, donc un grand
nombre sont impliquées dans des hémopathies malignes et contre lesquelles
on pourra donner des traitements ATK.
La protéine abl normale est une protéine de 145kDa, avec un domaine SH
(pour src homology, car ce domaine ressemble à un autre oncogène src ayant
une activité tyrosine kinase).
Lorsqu'elle fonctionne normalement, la protéine abl doit fixer une molécule
d'ATP sur son domaine SH pour être active.
Dans la protéine bcr-abl, l'ATP est fixé de façon permanente, donc
l'activité ne s'arrête plus.
Le fait de remplacer la partie N-terminale de la protéine Abelson par la partie N-terminale de bcr permet une
dimérisation de la protéine qui entraîne une activation constitutive non régulée de la protéine bcr-abl.
Cette activation crée une cascade d'autres activations permettant la prolifération, la diminution de l'apoptose
(d’où l’hyperleucocytose à polynucléaires de la LMC), et une perte de l'adhérence cellulaire (ce qui explique
la sortie de la moelle des cellules immatures).
Dans les quelques cas où le traitement ATK ne marche pas, on peut envisager des molécules ciblant les voies
activées par la cascade : voie Ras…. On peut aussi avoir des ATK qui ciblent aussi des voies en aval, même si
dans l'idéal il est plus intéressant d'agir en amont.
CR : On parle maintenant de « kinome », terme très utilisé dans la recherche de tyrosine-kinases impliquées
dans les pathologies tumorales comme la protéine kinase Jak2.
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VIII. Traitements et suivi de la LMC en phase chronique
Tous les traitements suivants peuvent être utilisés actuellement :

L'Hydréa est une chimiothérapie douce qui freine la prolifération cellulaire et que l'on donne tout
de suite au patient avant d'avoir le résultat du caryotype, cela permet de baisser la leucocytose très
rapidement mais la maladie est toujours là. C’est le traitement le plus ancien qui est toujours
d’actualité.
CR : la leucocytose entraîne des risques de phlébite et d'infarctus.
 L’allogreffe est encore utilisée en dernier recours pour les patients qui résistent au traitement par
inhibiteur des tyrosines-kinases (rare car on dispose actuellement de nombreuses molécules). Si c'est
un patient jeune il faut penser à l'allogreffe dans la première année. Elle soulève des problèmes de
tolérance car elle peut laisser des séquelles et entraîne le décès dans 10% des cas, même si dans les
90% restants on parle de rémission complète.
 L'interféron est une molécule qui existe depuis les années 90, c'est de l'immunothérapie. On arrivait
à avoir des patients en rémission complète mais il y en avait très peu (10%) donc on l'a arrêtée
depuis qu'on a l'inhibiteur.
 Anti-tyrosine kinase : le plus connu est Imatinib (Glivec®), il est très bien toléré et très efficace
(90% des patients en rémission complète) mais certains patients résistent au traitement donc on peut
être amené à utiliser des ATK de 2ème génération qui sont plus efficaces mais moins bien tolérés,
voire de 3ème génération si ceux de 2ème ne marchent pas ou sont contre-indiqués.
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Fonctionnement des ATK :
La protéine BCR-ABL a une poche dans laquelle l'ATP entre ce qui active la protéine.
L'imatinib mime l'ATP et se met à sa place dans la poche. L'ATP ne peut alors plus entrer donc la protéine n'est
plus activée.
Les polynucléaires meurent et tout ce phénomène normalement s'arrête, l’hématopoïèse normale va pouvoir
reprendre le dessus.
Dans les premiers mois on surveille par le caryotype c'est-à-dire qu'on essaie d'avoir une réponse
cytogénétique complète.
Une réponse cytogénétique partielle est acceptable à 3 et 6 mois et correspond à 1-35% de chromosomes Ph
mais à 1 an, il faut une rémission cytogénétique complète (0% Ph, nécessite d’avoir trouvé un Ph au
diagnostic).
Lorsqu’on a atteint une réponse cytogénétique complète, on va aller plus loin et chercher une réponse
moléculaire majeure ou complète en RQ-PCR : le rapport BCR-ABL/ABL doit avoir nettement diminué.
Le facteur de conversion ou rapport de standardisation du laboratoire permet de comparer les résultats de PCR
de différents laboratoires (si le malade change de ville par exemple).
Le taux de maladie résiduelle correspond au rapport du nombre de copies du transcrit et de la valeur trouvée
au diagnostic (valeur de référence).
Ici, le patient a répondu de 3 log décimaux (10-3), soit 0.1% ce qui indique une réponse moléculaire majeure.
Après un an de réponse moléculaire complète, on peut envisager l’arrêt du traitement.
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Les ATK peuvent donner comme effet secondaire des œdèmes, car ils vont aussi agir sur la protéine abl
normale.
CR : Ces patients ont ainsi le visage gonflé.
Si le patient n’est pas en réponse hématologique complète (RHC), cela ne sert à rien de faire une PCR ou un
caryotype. On va de la technique la moins sensible à la plus sensible. De même, le caryotype nécessite un
myélogramme, geste invasif, donc dès que le patient sera en rémission cytogénétique complète, on passera à la
RQ-PCR sur sang, beaucoup plus confortable pour le patient.
Si après 3 mois de traitement, l'hémogramme indique que le patient n’est toujours pas en RHC, c’est un échec
thérapeutique.
Il faut s’assurer de la compliance du patient et le cas échéant doser le traitement dans le sang pour voir si le
patient ne le catabolise pas trop.
Si le patient ne répond pas au traitement, on va chercher des mutations dans le gène chimère BCR-ABL, au
niveau de la poche de l’ATP. On changera alors d’ATK. Par exemple, il existe une mutation T315 qui imposera
de prendre directement un ATK de 3ème génération.
La première image est à bien connaître : il faut savoir à quoi chaque technique sert, sa place dans le diagnostic
et le suivi de la LCM, le prélèvement nécessaire etc…
La deuxième image n’est pas à savoir par cœur mais il faut avoir compris le principe du suivi.
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IX. La transformation de la LMC en phase aiguë
Cette transformation est devenue exceptionnelle grâce au traitement ATK. Dans les cas où elle a lieu, au niveau
cytologique on observe qu'il n'y a que des cellules immatures à grand rapport nucléo-cytoplasmique (blastes).
On a donc un aspect monomorphe.
On peut avoir soit une transformation en leucémie aiguë lymphoïde (précurseur en général de type B qui s’est
arrêté dans la voie de différenciation) ou alors plus souvent, dans les 2/3 des cas, c'est un précurseur ou un
progéniteur de la lignée myéloïde en particulier la lignée qui donne les neutrophiles et les monocytes, c'est une
leucémie aiguë myéloïde.
Au niveau du caryotype, à la phase chronique on voit un chromosome Ph isolé. S'il y a une accélération ou une
acutisation, la plupart des cas on voit des anomalies chromosomiques clonales additionnelles (ACA) en plus
du chromosome Ph.
Par exemple ci-dessous il y a en plus un chromosome iso17q (isochromosome) c'est-à-dire que le chs 17 a
perdu ses bras court et a dupliqué ses bras longs. Or sur ces bras courts on trouve le gène codant pour la p53
aussi nommée tp53 (ça faisait longtemps –'). De plus, l’allèle homologue est souvent muté.
Il y a donc une prolifération incontrôlée, qui se transforme très vite en leucémie aiguë.
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Ces anomalies se retrouvent de façon récurrente en plus du chromosome Ph :
- Anomalie de nombre : trisomie 8 ou 19
- Anomalie de structure : isochromosome 17q ou isodicentrique, isochromosome Ph ou une translocation
3-21
- Anomalie de nombre et de structure : duplication du Ph
S’il y en a une à retenir c’est celle de la p53.
Ce ne sont pas les mêmes gènes qui sont exprimés pendant la phase aiguë et la phase chronique, certaines voies
peuvent être altérées (comme celle de la p53).
BCR/ABL fait partie des anomalies de classe I qui entraînent un avantage de prolifération et survie sur les
autres lignées sans empêcher la différenciation. Ces anomalies ne permettent pas à elles seules de déclencher
une transformation en leucémie aiguë, elles doivent être associées à des anomalies de classe II (par exemple
l’isochromosome q17) qui vont entraîner un arrêt de la différenciation et de l’apoptose.
Il existe aussi des mutations héréditaires prédisposant aux hémopathies malignes, aux cancers… comme chez
certains patients une anomalie congénitale de la p53 appelée syndrome de Li-Fraumeni qui donne de multiples
cancers souvent très précoces. Mais il n’existe pas de chromosome Ph congénital.
Les patients atteints de trisomie 21 (syndrome de Down) ont une prédisposition aux hémopathies malignes.
C. Leucémie aiguë lymphoblastique (LAL)
I. Quelques caractéristiques de la LAL
Ces leucémies se développent aux dépens des progéniteurs de la lignée lymphoïde, B ou T. On parle de LAL B
(75% des cas) ou de LAL T (25% des cas).
La LAL est une maladie rare mais c'est la plus fréquente des hémopathies malignes, (et même des cancers)
chez l'enfant. Il s'agit d'une urgence diagnostique et thérapeutique car les plaquettes vont baisser très
rapidement, ce qui peut entraîner des hémorragies. De plus s’il y a beaucoup de blastes dans le sang, il peut y
avoir des CIVD (coagulation intravasculaire disséminée).
Chez l'enfant on guérit 85% les LAL. On fait des thérapeutiques adaptées qui dépendent des examens
complémentaires.
Les signes que l'on suspecte sont toujours les mêmes, on fait un hémogramme en urgence et s'il est inquiétant
on fait des explorations de la moelle osseuse :
- Myélogramme : résultats du frottis dans les 2h
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-
Immunophénotypage ou CMF (cytométrie en flux) : résultats le lendemain matin
Cytogénétique : résultats dans la semaine
Biologie moléculaire : On verra des transcrits (comme BCR-ABL surtout chez l’adulte mais aussi chez
l’enfant), et rechercher des réarrangements IG-TCR.
Le réarrangement IG-TCR permet le suivi de la maladie, et aide donc à définir le pronostic. C’est un
réarrangement d’immunoglobulines avec le récepteur T, qui va être caractéristique d’un clone de cellules
différenciées. En effet, la cellule aura réarrangé son TCR ou son Ig lors de sa différenciation. Elle va proliférer
pendant sa transformation et donner naissance à un clone qui aura le même réarrangement. Au fur et à mesure
de la prise du traitement, le clone dominant doit diminuer pour revenir au niveau d’expression des autres
réarrangements.
Dans le cas de la LAL, on fera toujours un immunophénotypage afin de savoir s’il s’agit d’une leucémie B
ou T (traitement, pronostic, anomalies chromosomiques… différents).
Classification de l’OMS :
On peut déceler une LAL dans un syndrome tumoral : lymphome dans les ganglions ou le thymus. Si la
présentation tumorale domine et qu’il y a moins de 20% de blastes dans le sang, on parlera de lymphome, sinon
de leucémie.
Les leucémies B sont ensuite classées selon qu’on leur a trouvé des anomalies génétiques récurrentes ou non.
Par exemple, on peut trouver comme anomalie récurrente la translocation BCR-ABL chez 30% des adultes et
3% des enfants.
Pour les leucémies T, on ne détaille pas encore la génétique.
II. La cytométrie de flux (CMF)
Elle permet le typage des blastes.
Le prélèvement peut être fait sur tout tissu envahi : du sang, de la moelle osseuse, des liquides biologiques (par
exemple on peut détecter une leucémie aiguë via un épanchement pleural) mais également un ganglion (mis en
milieu humidifié), sous la direction des anatomo-pathologistes (possibilité de faire aussi de la FISH ou un
caryotype).
CR : Normalement, le prélèvement doit être assez gros pour pouvoir envoyer un échantillon au laboratoire de
cytogénétique ainsi qu'un échantillon au labo d'anatomo-pathologie.
On prélève sous anticoagulant (le plus souvent de l'EDTA, parfois de l'héparine).
Lorsque le prélèvement est liquide on peut faire une cytocentrifugation pour concentrer les cellules.
Pour la CMF, les cytologistes ont environ 350 anticorps qu'ils peuvent appliquer sur des suspensions cellulaires
pour typer leur cellule. Ils ne les utilisent pas tous à chaque fois, en fonction de ce qu'on suspecte ; ils utilisent
des panels d'anticorps. En général il y a une 20aine ou une 40aine d'anticorps par analyse afin de bien typer la
leucémie aigüe. Les anticorps sont marqués en général par des fluorochromes. Il existe 8 fluorochromes
différents donc on peut tester 8 anticorps monoclonaux différents à la fois.
Ces anticorps vont aller se fixer sur les CD (Cluster de Différentiation) notamment le CD10 (ou antigène
Calla) dans la LAL B de l'enfant qui va permettre de voir le degré d'immaturité de la cellule. Les CD19 et
CD20 sont les marqueurs du LB, alors que le CD3 marque le LT.
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L’échantillon passe dans le cytomètre cellule par cellule et le laser analyse pour chaque cellule les anticorps
accrochés. La seconde image montre ce que l’ordinateur rend après analyse des informations. Chaque point
correspond à une cellule. En abscisse, le marquage CD45 est important pour différencier les cellules matures
des cellules immatures, et en ordonnée SS indique la taille des cellules. Puis pour chaque nuage on analyse les
anticorps qui se sont accrochés en faisant des fenêtres sur chaque fluorochrome.
Selon les fenêtres, les images ont différents aspects. On peut analyser jusqu'à 105 cellules. Cela ne sert pas au
diagnostic (on fera plutôt sur 103 ou 102 cellules) mais est intéressant pour le suivi.
Pour chaque leucémie, on définit un profil antigénique associé (LAP :Leukemia associated profile).
Par exemple pour la lignée B :
Ce profil correspond à :
- l'intensité d'expression de certains antigènes
- l'asynchronisme de maturation
- des infidélités de lignée : par exemple on peut
avoir des LAL B ou T avec un marquage CD13
ou CD33 qui sont des marqueurs myéloïdes (ne
se voit jamais si la cellule est normale)
- l'évolution du clone
III. Classification
Il existe une classification européenne appelée EGIL qui classe les leucémies selon leur phénotype (B ou T,
mature ou immature).
Par exemple pour une LAL B, on aura selon le profil phénotypique 4 possibilités de LAL :
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•
•
•
•
Pour la BI, la cellule maligne ayant arrêté sa différenciation est un progéniteur B CD10- donc très
immature. C’est une leucémie de pronostic défavorable dans laquelle on va trouver des anomalies
génétiques bien spécifiques.
Lorsque la cellule est CD10+, c’est le plus souvent une leucémie B commune, celle avec le meilleur
pronostic (90%-95% de rémission chez l’enfant).
La BIII concerne une cellule un peu plus mature CD10+ qui présente des chaines µ intracytoplasmiques.
Il y a enfin des LAL B matures qui ont une morphologie particulière, c’est les Burkitt, qui ont en plus
des Ig de surface. L’OMS en revanche classe ces LAL dans les lymphomes, car même si on a bien
affaire à des blastes, ces cellules sont déjà assez matures, pas par la morphologie mais par le phénotype,
du fait des Ig de membrane. De plus, cette classe de maladie est très particulière avec des anomalies
génétiques, un traitement, une évolution qui leur est propre.
De même pour les T :
Bien que ces cellules soient anormales, on essaye de les classer selon la maturité qui correspond à leurs
antigènes normaux de surface.
Pour les LAL il existe aussi des anomalies génétiques que l’on retrouve aussi bien chez l’adulte que chez
l’enfant. Elles ont un but diagnostic et très souvent pronostic. Elles ne sont cependant pas réparties de la même
façon chez l’adulte et l’enfant : par exemple, on retrouve le transcrit BCR-ABL dans 25% des LAL de l’adulte,
alors qu’il n’est présent que dans 3% de celles de l’enfant. De plus, les leucémies de l’enfant (diploïdie ou
TEL-AML1) ont un bien meilleur pronostic (80% de survie à 5 ans) que celles de l’adulte (40% de survie à 5
ans), sans doute parce que l’organisme des adultes a déjà été « fatigué » par des pathologies.
On va maintenant voir 3 entités au sein des LAL B :
- Leucémie avec translocation 9 – 22 (Ph)
- Translocation 12 – 21 / TEL-AML1
- La translocation t(4;11) / MLL-AF4
IV. Leucémie avec translocation 9-22 (Ph)
C'est une anomalie rare chez l'enfant et commune chez l'adulte.
On peut faire un caryotype, mais contrairement aux LMC, les chromosomes sont beaucoup plus difficiles à
avoir car on ne possède pas de facteur de croissance pour les blastes T ou B lors de la culture.
On utilisera aussi la FISH (mais avec des sondes différentes de la LMC) où l'on verra des anomalies sur les
chromosomes et sur les noyaux et on peut aussi faire de la PCR.
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C’est une anomalie de mauvais pronostic, mais très amélioré depuis que sont apparus les ATK. La différence
par rapport à la LMC est que dans les 2/3 des cas le point de cassure est mBCR. Les inhibiteurs tyrosine-kinase
marchent aussi dans ces LAL à condition qu'on ait bien le chromosome Ph.
Depuis qu'il y a l'Imatinib, on a 80% de survie à 2 ans alors qu'avant on était à 30% de survie même avec la
greffe de moelle. Cependant, contrairement à la LMC, l’inhibiteur de tyrosine kinase ne suffit pas, le patient
doit aussi suivre une lourde chimiothérapie.
Sur les caryotypes des patients, on retrouve la translocation t(9;22), mais on peut également retrouver plusieurs
autres anomalies clonales additionnelles :
- Des gains tels qu'une hyperdiploidie, une duplication du chromosome Ph, une trisomie 8.
- Des pertes telles qu'une monosomie 7, délétion 7p qui contient le gène Ikaros ou IKZF1. La délétion de
ce gène (soit entier, soit une partie) est associe à un mauvais pronostic.
V. L’hyperdiploïdie
L’hyperdiploïdie (>50 chromosomes) peut être rassurante mais il faut s’assurer qu’il n’y a pas aussi de
chromosome Ph.
Il existe une hyperdiploïdie commune, sans chromosome de Philadelphie, qui représente 25% des LAL chez
l’enfant et 7% chez l’adulte.
Le profil chromosomique n’est pas aléatoire, il existe des profils de gains de chromosomes qui sont
caractéristiques (+X, +4, +10, +14, +17, +18, +21, +21).
Le pronostic est très bon : la survie à 5 ans est de 85% chez l’enfant et 50% chez l’adulte.
VI. Leucémie avec translocation 12-21 /TEL-AML1
C'est la 2ème forme la plus importante chez l'enfant. Elle est rare chez l'adulte.
Cette translocation ne se voit pas au caryotype (anomalie cryptique, bien que le caryotype soit le plus souvent
anormal) parce que les segments échangés sont de même taille et de même coloration : c'est la dernière bande
du bras court du 12 qui s'échange avec la dernière bande du bras long du 21. On la voit uniquement en
hybridation in situ (signal de fusion entre 2 sondes TEL et AML1) ou en RT-PCR (mise en évidence du
transcrit TEL-AML1).
Le pronostic est très favorable : 86% de survie à 5 ans.
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VII. La translocation t(4 ;11)/MLL-AF4
Il existe des formes de très mauvais pronostic, elles impliquent un gène appelé MLL (myeloid lymphoid
leukemia).
Ce n'est pas très fréquent mais on le retrouve dans 80% des LAL du nourrisson (moins de 1 an) (« infant
leukemia »).
Dans ce cas, l’arrangement a eu lieu in utero, et ne nécessite pas d’anomalie de classe II. C’est un gène qui peut
être réarrangé avec de nombreux autres, il est « multi-partenaire » et peut entraîner des LAL et LAM. Le plus
souvent MLL est recombiné avec le gène AF4 sur le chromosome 4.
Cela se voit au caryotype, il y a une translocation entre le 4 et le 11 (11q+ et 4q-).
On peut le voir aussi en FISH mais cette fois ci on a 2 types de sondes possibles : les sondes de fusion (comme
pour ABL) et les sondes de séparation que l'on utilise pour MLL car il a 70 partenaires. On utilise le gène luimême qui est marqué en 5' et en 3' et si on a une translocation, les deux signaux se séparent.
CR : Quand c'est normal on a un signal de fusion et quand c'est anormal les deux signaux sont séparés.
Le pronostic est défavorable, le plus souvent c'est une indication d'allogreffe de moelle.
Cette translocation se voit aussi chez l'adulte même si c'est plus rare.
VIII. La CGH
Enfin il existe des techniques encore plus récentes que l'on appelle CGH (hybridation génomique comparative)
ou puces (à ADN, ARN,...). Cette méthode est aussi basée sur l'hybridation.
On fait l'hybridation sur des lames qui contiennent des gènes, des séquences et selon l'intensité d'hybridation
par rapport à un témoin normal on verra le nombre de copie du gène. C'est donc surtout pour voir des nombres
de copie (pertes, gains).
On peut faire avec cette technique un diagnostic d'hyperdiploïdie (> 50) mais pour les leucémies MLL on ne
voit rien car ça ne met pas en évidence des réarrangements chromosomiques, des anomalies de structure, on ne
peut voir que des pertes ou des gains.
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Sur ce schéma on a rapporté les chromosomes en ordonnée et les types d'anomalie en abscisse :
On peut voir qu'il existe des leucémies hypodiploïdes. Avec cette technique on peut voir par exemple des
délétions de gènes comme dans la majorité des cas de translocation 9 – 22 la perte d'ikaros (IKZF1), qui
entraîne un pronostic défavorable dans une LAL B. Mais les anomalies sont souvent combinées et le pronostic
est défavorable, sauf si le patient a aussi une hyperploïdie > 50, ou un transcrit TEL-AML1….
On peut aussi voir cette perte dans 10% des cas de leucémies aiguës BCR-ABL négatives.
IX. Apport de la Cytométrie en Flux dans le suivi de la maladie : étude de la maladie résiduelle
MRD : minimal residual disease :
C’est la maladie résiduelle minime, qui correspond au nombre de cellules anormales persistant après les
traitements. C’est un très petit nombre, détectable en dessous du seuil de la cytologie. Elle est recherchée après
chaque phase de chimiothérapie :
→ à l’induction (J30 post diagnostic),
→ à la 1ère consolidation (J60)
→ et à la 2ème consolidation (J90)
Grâce à l’immunophénotypage, dans 90% des cas on trouve des marqueurs antigéniques permettant le suivi.
Si la MRD persiste, le pronostic est mauvais et on peut envisager une allogreffe.
Une autre technique est utilisée pour le suivi des patients. C'est une technique moléculaire appelé suivi par IgTCR. Les progéniteurs lymphoïdes dans les LAL sont déjà engagés dans la différenciation donc ils ont souvent
commencé à réarranger leurs Ig. Toutes les cellules tumorales ont le même réarrangement ce qui va nous
permettre de les suivre mais il faut repérer ce réarrangement dès le diagnostic. Chaque patient a un
réarrangement différent que l'on caractérise par les techniques de PCR et de séquençage.
Dans quasiment 100% des LAL B et LAL T on trouve un réarrangement qui permet de suivre la maladie.
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CONCLUSION :
Quand on fait le bilan d'une hémopathie maligne au diagnostic on fait toutes ces analyses génétiques car on sait
qu'il y a des anomalies cytogénétiques ou moléculaires acquises dans la majorité des hémopathies malignes.
Elles ont une valeur diagnostique (Ph dans les LMC qui induit une indication thérapeutique) et pronostique
(hyperdiploidie chez l'enfant, réarrangement MLL,...).
Ces marqueurs de clonalité établis au diagnostic vont nous permettre de suivre le patient.
CR : A Flora parce que … bravo !
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Explo complémentaire en Hémato C

Transcription

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