Technologies de marqueurs de l`ADN avec des bases de gel

MARS 1999
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les régions où l’on attrapait les mites, une population plus petite émergeait lors des générations ultérieures. Dans les régions
où on n’attrape pas les mites, la population continue de croître.
La troisième approche, tout aussi importante, a également été
suivie à la lettre. Au début, une lutte sans insecticides a été
adoptée en appliquant du Bt et des virus polyhédroses nucléaires (NPV.) Une lutte moins intense a été déployée se servant
des applications d’insecticides classiques utilisés couramment.
La population de vers de la capsule a diminué et, par conséquent, les niveaux seuils ont été revus afin de faire diminuer
encore davantage la population. Une des recommandations im-
portantes consiste à fonder les niveaux seuils sur la numération des œufs fécondés. On recommande que le coton soit pulvérisé uniquement si les œufs fécondés (jaune, brun ou couleur foncée) atteignent un compte de 50 pour 100 cotonniers.
Les données des deux dernières campagnes montrent que la
pression exercée par les ravageurs ainsi que les dégâts des capsules ont nettement diminué. L’approche peut aider à éviter le
problème de résistance sur une période plus longue et si le
programme continue, le Nord-Ouest ne connaîtra pas la même
situation que la vallée du Fleuve jaune.
Les références se trouvent à la page 12.
Technologies de marqueurs de l’ADN avec
des bases de gel pour le coton
S. Saha1, H. Tan2, M. Karaca2 et J. N. Jenkins1
USDA/ARS, agriculture de précision et de génétique, Laboratoire des recherches agricoles, P.O. Box 6367,
Etat du Mississippi, MS 39762, USA ; 2Sciences des plantes et podologie, Etat de l’Université
du Mississippi, Etat du Mississippi, MS 39762
1
Introduction
La cartographie génétique avec des marqueurs de l’ADN est
devenu un outil essentiel pour révéler la base génétique des
caractéristiques qualitatives et quantitatives dans les plantes.
Les marqueurs de l’ADN offrent des avantages particuliers par
rapport aux caractéristiques morphologiques pour l’analyse
génétique car normalement, ils sont polymorphiques, ne comportent pas d’effets pléiotropiques ni épistatiques, emploient
des méthodes non destructives exigeant de très petites quantités de matériel de la plante et il n’existe pas d’effet de l’environnement sur le phénotype. Un grand nombre des caractéristiques importantes du point de vue économique des plantes
sont contrôlées par des caractéristiques quantitatives complexes (QTL, d’après le sigle anglais). Une carte génétique exacte
et détaillée des marqueurs de l’ADN reliés aux QTL fournit un
outil très utile aux sélectionneurs pour utiliser des marqueurs
moléculaires lors de la sélection aidée par des marqueurs pour
leur permettre une sélection sur la base des marqueurs plutôt
que du phénotype QTL complexe. Récemment, plusieurs laboratoires aux Etats-Unis et à l’étranger ont mis sur pied des
initiatives spéciales sur les programmes de cartographie moléculaire des génomes du coton pour exploiter les configurations
génétiques disponibles et renforcer les ressources du plasma
germinatif amélioré (Cantrell et al., 1999 ; Yu et Kohel 1999 ;
Rungis et al. 1999 ; Cantrell et al., 1998, 1999 ; He et al.
1999 ;Wright et al. 1998 ;Luo et al. 1999 ; Akbari et Lyon,
1999).
Les chercheurs font face à trois grands défis pour élaborer les
cartes moléculaires du génome du coton : 1) mettre au point
une méthode d’extraction pour produire de l’ADN de haute
qualité convenant à l’analyse moléculaire ; 2) mettre au point
une méthode appropriée qui peut classer rapidement des nombres importants de marqueurs moléculaires polymorphiques et
3) créer une population convenant à la cartographie qui peut
être utilisée pour identifier des marqueurs moléculaires reliés
aux caractéristiques d’intérêt. Mais la méthode pour créer la
population cartographique appropriée varie selon le but de la
recherche. Le présent article a pour objet de traiter ces questions et de faire le point de l’état d’avancement actuel concernant la cartographie moléculaire du coton.
Extraction de l’ADN
Un ADN de haute qualité est essentiel pour le développement
de marqueur d’ADN dans le coton. Les tissus du coton sont
connus pour être récalcitrant à de nombreuses méthodes d’extraction de l’ADN suite aux niveaux élevés de composés
polyphénoliques (par exemple, le gossypol). Lorsque les cellules se modifient pendant l’égrenage de l’échantillon, les composés phénoliques interagissent avec les protéines et les acides nucléiques entraînant des problèmes dans l’analyse moléculaire. Par conséquent, des précautions doivent être prises lors
de l’extraction de l’ADN dans le coton (Callahan et Mehta
1991 ; Paterson et al., 1993). Mais ces méthodes demandent
soit des tissus frais ou des tissus gardés à des températures très
La mention de marque ou de patente ne représente pas une garantie du produit de la part du Département de l’Agriculture aux Etats-Unis
et ne n’implique son approbation au détriment d’autres produits qui risquent eux aussi de ne pas convenir.suitable.
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basses (-50o à –70oC). Saha et al., 1997, indiquent une méthode d’extraction de l’ADN utilisant des tissus cotonniers
séchés par congélation. Les tissus séchés par congélation peuvent être moulus sous forme de poudre sèche et gardés pendant aussi longtemps que souhaité à des températures de –20oC.
Récemment, la méthode a été modifiée pour permettre des analyses de l’ADN à grande échelle plus efficaces et qui prennent
moins de temps en utilisant une méthode légèrement modifiée
de Dneasy Plant Mini Kit (mini-matériel pour les plantes
Dneasy) ( Quiagen, Santa Clarita, Californie). Une poudre à
partir des tissus de feuilles de coton écrasées séchées par congélation (35mg) a été utilisée à la place du liquide N2. La méthode ensuite suit le protocole du fabricant. Cette méthode a
permis un ADN d’un poids moléculaire élevé qui est facilement digestible avec des enzymes de restriction et qui sert de
modèle pour l’amplification PCR.
Méthodes moléculaires pour le
génome
Quatre types différents de méthodes moléculaires ont été utilisés pour élaborer des marqueurs de l’ADN dans le coton, à
savoir polymorphismes de fragments de longueur pour restriction (RFLP, d’après le sigle anglais) ; ADN polymorphique
amplifié aléatoire (RAPD) ; répétition de séquences simples
(SSR) ; et polymorphismes amplifiés de fragments de longueur
(AFLP)
Polymorphismes de fragments de longueur
pour restriction
Les techniques RFLP impliquent la digestion de l’ADN en petits
fragments qui sont séparés par électrophorèse en un gel
d’agarose et transféré à un support solide ou un filtre (membrane de nitrocellulose) et détecté comme des bandes discrètes
suivant l’hybridation sur des sondes avec un radio-isotope ou
un non radio-isotope. Les allèles sont reconnues par les différences dues à la mutation sur les sites de restriction, de taille
des fragments de restriction auxquels sont hybridées les sondes. Les avantages de la méthode RFLP est qu’elle est généralement polymorphique et que les marqueurs sont co-dominants
pour distinguer l’hétérozygote de l’homozygote (Figure1). Mais
la détection classique du RFLP par l’analyse du Southern Blot
est laborieuse, longue, chère et demande toujours une quantité
suffisante d’ADN de bonne qualité et une sonde.
Reinisch et al. (1994) ont publié le premier rapport sur une
carte RFLP en utilisant des tétraploïdes interespèces cultivées
des espèces Gossypium spp. Ils ont indiqué 705 loci RFLP
assemblés en 41 groupes de liens couvrant 4675 cM. Ils ont
également localisé plusieurs marqueurs RFLP à des chromosomes différents utilisant les lignes de substitution des chromosomes aneuploïdes. Shappley et al (1996) ont indiqué 16
loci RFLP disposés en 6 groupes de liens dans une population
F2 intraespèce de coton Upland. Shappley et al. (1998) ont
présenté un autre compte rendu de 120 loci disposés en 31
groupes de liens couvrant 865 cM de coton Upland. Shappley
ICAC RECORDER
et al. (1998) ont également noté pour la première fois une carte
de liens RFLP-QTL en utilisant une population intraespèce de
coton Upland. Ils ont déterminé l’emplacement de 100 QTL
dans 24 groupes de liens. Ils ont également observé que plusieurs QTL sont situés dans la même position dans certains
des groupes de liens. Cela pourrait être dû à plusieurs raisons
dont un gène maître QTL contrôlant plusieurs caractéristiques,
le même effet génétique (QTL) mesuré de plusieurs manières
différentes ou à des liens très forts entre les loci QTL. Jiang et
al. 91998) ont signalé 261 marqueurs RFLP dans 27 goupes de
liens d’une cartograpgie de liens RFPL-QTL en utilisant une
population interespèce. Ils ont observé que 14 QTL affectant
les caractéristiques touchant à la fibre étaient situés dans le
groupe du sous-génome D. Ils ont mentionné que les gènes
relatifs aux fibres étaient déjà fixés dans le sous-génome A et
que la découverte de gènes à partir d’un génome non cultivé
(D) reflète une révolution génétique lors de la poliploïdisation
du coton tétraploïde. Nous avons signalé l’association de chromosomes de plusieurs marqueurs RFLP reliés à des QTL importants du coton Upland (Saha et al., 1998). Mais notre rapport avait indiqué une plus grande influence du sous-génome
A dans les QTL des fibres du coton Upland démontrant l’importance d’une enquête supplémentaire et l’introgression des
espèces diploïdes du génome A pour améliorer les caractéristiques de la fibre dans le coton Upland. Nos résultats ont également indiqué la force et la facilité de transférer les marqueurs
RFLP qui peuvent être utilisés entre deux populations différentes de coton intra et interespèces. La carte génétique à densité élevée de marqueurs RFLP et de QTL de régions de chromosomes définis sera très utile pour transférer des loci QTL
orthologues utiles parmi les espèces tétraploïdes cultivées de
coton. Wright et al. (1998) ont identifié les marqueurs RFLP
liés à l’allèle de résistance du pathogène de la brunissure bactérienne (Xanthomonas campestris pv. Malvacearum (Xcm).
Pour compléter les marqueurs RFLP classiques, des marqueurs
moléculaires ont été utilisés récemment sur les plantes en utilisant la technologie de la réaction en chaîne de la polymérase
(PCR). PCR est réalisé suite à une amplification enzymatique
de l’ADN génomique qui est flanqué de deux amorces
oligonucléotide synthétiques (extrêmes 3’ et 5’ de l’ADN) qui
hybride les couches complémentaires de la séquence ciblée de
l’ADN du modèle. Des cycles répétés de la dénaturation thermique du modèle de l’ADN brûlant les amorces et les extensions de ces dernières par Taq polymérase dans la réaction
PCRR entraînent une amplification du segment spécifique de
l’ADN génomique modèle défini par les amorces synthétiques
5’ et 3’. Normalement les modèles des bandes sont classés directement sous rayons ultra-violet après avoir soumis à l’électrophorèse les produits amplifiés PCR, colorés avec du bromure d’éthidium dans un gel d’agarose. Le polymorphisme
génomique est détecté suite à 1) des changements nucléotides
qui empêchent l’amplification suite à une union erronée des
bases sur les sites des amorces ; 2) la suppression d’un site
d’amorce ; 3) l’insertion ou la suppression de l’ADN modèle
qui change la taille des produits amplifiés et 4) l’insertion fai-
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sant que le site amorce est trop éloigné pour soutenir l’amplification. La méthode PCR est devenu l’un des outils les plus
populaires suite à sa facilité, sa vitesse, sa sensibilité et sa versatilité pour l’étude de populations importantes. Ces trois dernières années, trois types différents de marqueurs ADN – PCR
ont été utilisés pour le coton : RAPD, SSR et AFLP.
ADN polymorphique amplifié aléatoire
Techniques ADN à base de PCR utilisées le plus couramment
dans cette catégorie dans laquelle environ 10 à 15 amorces
arbitraires oligonucléotides de taille de base sont utilisées pour
l’amplification des segments ADN afin de développer les marqueurs moléculaires (Figure 1B). L’avantage de cette méthode,
c’est qu’elle ne demande aucune information préalable sur la
séquence ADN. Nos résultats utilisant du coton tétraploïde inter et intraespèce ont montré que normalement environ 8 à 12
marqueurs ADN allant d’une taille de 120 à 1000 bp par combinaison d’amorce sont générés avec la méthode RAPD (Figure 1B). Nous avons observé environ 2% à 10% de combinaisons de marqueurs/amorces polymorphiques dans le coton
Upland suivant les accessions. Les inconvénients lorsqu’on
utilise des marqueurs RAPD, c’est qu’ils sont des marqueurs
dominants produisant parfois des marqueurs ADN non spécifiques. Yu et al.(1998) ont identifié plusieurs marqueurs RFLP,
RAPD et SSR liés à la longueur des fibres et à d’autres propriétés dans une population interespèce. Wajahatullah et Stewart
(1997) ont évalué l’affinité génomique parmi les espèces
Gossypium choisies en utilisant la méthode RAPD.
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Répétitions de séquences simples
Les SSR sont des loci di, tri ou tétra nucléotides qui se répétent
en tandems dans un génome. Ces répétitions varient en nombre et se présentent sur un grand nombre de sites du génome.
L’analyse des loci de répétition courte en tandem (SSR) par
des méthodes PCR s’est avérée très utile à cause du degré élevé
de polymorphismes de numéros répétés dans un grand nombre
de loci du génome. Le développement des marqueurs SSR prend
du temps et exige la séquence du génome pour identifier les
amorces qui flanquent les marqueurs SSR. Le Laboratoire du
Docteur Ben Burr du Laboratoire national de Brookhaven a
développé plusieurs centaines de paires d’amorces SSR à partir du génome du coton disponible actuellement dans le commerce par le biais de Research genetics, Huntsville,
Alabama. Les amorces SSR ont également été développées de
la bibliothèque génomique enrichie en répétitions (GA)n
(Reddy et al., 1998). Les principales limitations de l’utilisation des marqueurs SSR sont leur coût de développement et la
présence de bandes sombres non spécifiques suite au glissement de la Taq polymérase pendant la PCR.
Agrawal et al. (1999) ont indiqué que les amorces SSR d’espèces croisées peuvent être utilisées pour détecter le polymorphisme dans le coton tétraploïde. Nous avons observé que les
marqueurs SSR peuvent être dominants, analogues à RAPD
(données inédites) ou co-dominants (Figures 2). Cantrell et al.
(1998) ont identifié l’emplacement des chromosomes de plus
de 50 marqueurs SSR du coton. Ils ont également utilisé cette
méthode pour élaborer une carte de liaisons des marqueurs
SSR et QTL dans le coton tétraploïde.
Polymorphismes amplifiés de fragments de
longueur
Figure 1A. Les flèches indiquent la présence de marqueurs
RFLP co-dominants dans des échantillons de TM-1, 3-79 et F1.
TM 1 est une lignée naturelle de G.hirsutum, 3-79 est une lignée
double haploide de G. barbadense et F1 est un hybride entre
TM-1 et 3-79.
Figure 1B. Photographie de l’analyse RAPD avec le gel Agarose
dans TM-1, 3-79 et F1. Les flèches indiquent la présence de
bandes polymorphiques dominantes.
AFLP est une méthode d’identification de l’ADN à base de
PCR. Cette méthode se fonde sur l’amplification sélective des
fragments de l’ADN génomique digérés par les enzymes de
restriction en utilisant différentes combinaisons d’amorces. En
comparaison d’autres méthodes, la méthode AFLP génère virtuellement des nombres illimités de fragments d’ADN des quantités nanogrammes d’ADN génomique. Les techniques AFLP
utilisent normalement des conditions PCR très strictes qui permettent une meilleure reproduction des résultats. Dans cette
méthode, les ADN génomiques sont digérés par deux enzymes
de restriction et, par la suite, les adapteurs oligonucléotides
spécifiques au site de restriction sont liés aux fragments d’ADN
digérés pour générer l’ADN modèle et ces modèles sont amplifiés en utilisant les amorces complémentaires à la séquence
des adapteurs. Nos résultats indiquent que la méthode de
l’AFLP peut être utilisée pour développer des marqueurs dominants et non dominants dans le coton en fonction de la combinaison d’amorces appropriées (données inédites). Généralement, la détection de l’AFLP demande un marquage radioactif
(Feng et al., 1997) ou un marquage fluorescent des amorces ou
encore une coloration d’argent du gel (Feng et al., 19997). Mais,
dans la coloration argent, les deux couches des produits PCR
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ICAC RECORDER
Figure 2. Le système capillaire automatisé électrophorétique (CE) montrant des marqueurs SSR polymorphiques amplifiés
marqués par fluorescence qui son visualisés comme des pics sur les électrophérogrammes. L’axe X représente la taille du
fragment de l’ADN et l’axe Y montre le volume de produits amplifiés. La présence de marqueurs de l’ADN co-dominants dans
F1 (B) indique la présence des fragments de l’allèle de l’ADN de même taille de TM-1 (A) et de Pima (C), les deux parents de
F1. Le système automatisé crée également le tableau montrant la taille des différents fragments de l’ADN.
sont détectées, d’où la création de modes de doubles bandes
multiples qui peuvent compliquer l’interprétation des résultats
de l’AFLP. De plus, nous avons observé qu’une faible sensibilité de coloration d’argent limite parfois le pouvoir de l’AFLP
détecté, surtout avec des fragments dans la fourchette inférieure de poids moléculaire.
Khan et al. (1998) ont utilisé les méthodes AFLP et RAPD
pour identifier les marqueurs ADN liés aux trois caractéristiques morphologiques. Ils ont construit une carte de liaisons
comprenant 51 groupes de liens couvrant 6663 cM avec 332
AFLP, 91 RAPD et 3 caractéristiques morphologiques. Feng
et al. (1997) ont identifié l’emplacement des chromosomes de
plusieurs marqueurs AFLP. Actuellement, nous utilisons des
marqueurs AFLP pour identifier des gènes de résistance du
nématode de la radicule du coton. (données inédites).
Génération suivante de marqueurs
d’ADN à base de PCR marqués avec
des fluorophores
Actuellement, nous utilisons un système capillaire
électrophorétique (CE) pour séparer les marqueurs de l’ADN
amplifiés marqués de manière fluorescente qui sont visualisés
comme des pics sur les électrophérogrammes en utilisant l’analyseur génétique ABI PRISM 310 de la PE-Applied Biosystems,
équipé avec un logiciel d’analyse appelé Genotyping et
GeneScan (PE Applied Biosystem, Foster City, Ca ; Figure 2A,
2B et 2C). Le système de détection fluorescente multiple dans
CE permet la correction de la variation rangée à rangée par
électrophorèse d’un ADN standard de taille interne marqué
par un colorant différent de celui de l’échantillon. Chargement
automatique des échantillons, résultat digitalisé de la position
pic, collecte et analyse informatisées des données et pas de
préparation de gel sont autant d’éléments rendant le processus
CE intéressant pour traiter de larges nombres d’échantillons
en très peu de temps pour l’analyse. Cette méthode est suffisamment sensible pour détecter des différences dans une ou
deux paires de fragments d’ADN base une/deux entre les allèles d’un marqueur ADN. Cette caractéristique rend la méthode
plus intéressante pour distinguer un nombre important de marqueurs polymorphique qui ne peuvent pas être détectés dans
un gel d’agarose normal.
Les marqueurs SSR ont reçus de Research Genetics, Huntsville, AL et la méthode PCR a été utilisée conformément au
protocole du fabricant en présence d’une base ou d’une amorce
marquée de manière fluorescente. L’analyse de l’AFLP a été
faite en utilisant un module d’amplification sélective AFLP
pour des génomes de plante de taille importante de PE Applied
Biosystem (Foster City, CA 94404). La méthode AFLP générale a été réalisée conformément au protocole du fabricant.
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Tableau 1 : Marqueurs polymorphiques de l’ADN dans le coton
Nombre de
combinaisons
d’amorces
Nombre de
marqueurs
de l’ADN
Nombre de
marqueurs
polymorphiques
de l’ADN
Nombre de
combinaisons de
marqueurs/amorces
de l’ADN
Combinaisons
marqueurs/amorces
polymorphiques
de l’ADN
%
polymorphisme
Type de
marqueur
interspécifique
intraspécifique
interspécifique
intraspécifique
interspécifique
intraspécifique
interspécifique
intraspécifique
interspécifique
intraspécifique
interspécifique
intraspécifique
AFLP
10
10
607
631
256
166
60.7
63.1
25.6
16.6
42.17
26.30
SSR
10
10
150
130
79
53
15
13
7.9
5.3
52.66
40.77
Cette enquête préliminaire a été réalisée avec les lignées de TM-1, HS-46 et MARCABUCAG8US-1-88 (G. hirsutum) et 3-79 (G. barbadense).
D’après les observations, les marqueurs SSR dans CE peuvent
produire environ 3 à 4 fois plus de marqueurs ADN comparés
à la détection dans le gel d’agarose. Cette méthode non radioactive demande de très petites quantités en nanogrammes
de produits amplifiés, très peu de temps pour l’analyse des
échantillons et, par conséquent, elle est très rapide et efficace
par rapport aux coûts. Cette méthode est également capable de
visualiser des produits amplifiés différents du même échantillon dans un échantillon de différents marqueurs multiplexés
marqués par des techniques de marquage fluorescentes de
multiples couleurs. Le système de marquage de l’ADN dans le
coton utilisant CE est un outil efficace remplaçant l’électrophorèse de gel. Le système est rapide, sensible et peut être
reproduit rapidement car il demande moins d’intervention humaine et également pour l’automatisation du système. L’avantage de la collecte et de l’analyse informatique des données de
l’échantillon des marqueurs de l’ADN rend facile l’analyse
d’un nombre important d’échantillons. Actuellement, nous utilisons régulièrement CE pour dépister un nombre important de
plasma germinatif pour les analyses SSR et AFLP (Figure 2).
Mais ce système CE n’est efficace que pour détecter les fragments de l’ADN dont la taille oscille entre 40 et 500bp.
au niveau interspécifique du coton tétraploïde (tableau 1). Sept
marqueurs SSR polymorphiques au niveau interspécifique en
comparaison de 5 marqueurs SSR polymorphiques au niveau
intraspécifique du coton tétraploïde ont également été observés (tableau 1).
Nos résultats préliminaires avec CE ont détecté environ 25
combinaisons de marqueurs polymorphiques/amorces AFLP
Les références se trouvent à la page 12.
En conclusion, nos résultats ont démontré que la méthode AFLP
a détecté plus de marqueurs polymorphiques comparés à la
technique SSR (Tableau 1). Par conséquent, nous proposons
d’utiliser la méthode AFLP comme outil très utile pour le dépistage du plasma germinatif dans le coton. Nous avons également observé que les marqueurs de l’ADN amplifiés et et automatisés, marqué avec des fluorescents, utilisant PE Applied
Biosystem ABI 310, pourraient être une solution de remplacement pour le marqueur de l’ADN à base de gel afin de dépister
un nombre important d’échantillons de coton.
Remerciements
Nous tenons à faire mention de l’aide apportée par M. D. Dollar aux extractions de l’ADN et également aux Docteurs Allan
Zipf et Jack McCarty pour leurs suggestions utiles sur le manuscrit.
Système de protection technologique
La production commerciale de variétés Bt et autres variétés
tolérantes aux herbicides dépendait d’une commission devant
être versée au propriétaire de gènes. Dans le cas des variétés
transgéniques résistantes aux insectes lépidoptères, les producteurs américains ont payé des frais technologiques de 80$ à
l’hectare. On partait du principe que le gène Bt allait économiser plus de 80$ par hectare en coûts d’insecticides. La capacité
du cotonnier à tolérer les applications d’herbicide sur le haut
de la plante et la capacité à produire une toxine particulière
nuisible pour divers vers de la capsule sont des caractéristi-
ques intrinsèques. Une fois ces gènes transplantés dans le cotonnier, ils sont automatiquement transmis à la génération suivante et les producteurs peuvent utiliser les variétés de semences chaque année. Mais ils doivent signer des accords avec des
sociétés biotechniques aux termes desquels ils ne peuvent pas
stocker puis planter les mêmes semences transgéniques une
année après l’autre. En outre, les producteurs n’ont pas le droit
de transférer les semences à d’autres exploitants.
Les sociétés biotechniques maintiennent une liste de leurs producteurs de coton transgénique. Les frais varient entre l’Aus-