Synthèse cours de Biologie Cellulaire et Moléculaire UE 5.2 2014

Cours de Biologie Cellulaire et Biologie Moléculaire 2014-2015
Préambule : le document ci-dessous est une presentation qui concerne les eucaryotes en
général et qui ne développe pas les particularismes ou spécificités d’espèce sauf mention
explicite.
La biologie moderne aborde de façon intégrative les phénomènes du vivant au niveau
cellulaire et au niveau moléculaire. Ceci concerne de façon particulièrement marquante les
fonctions associées au métabolisme des acides nucléiques.
L’enjeu de ce cours est de présenter les outils de base terminologiques, conceptuels,
mécanistiques et techniques indispensables à la compréhension de la gestion intégrée des
fonctions cellulaires que sont la proliferation, la réparation des lésions de l’ADN génomique
et la régulation de l’expression génique, dont les dérèglements conduisent aux désordres
physiologiques et aux pathologies.
Chapitre I : Introduction
Ce chapitre replace l’ensemble des fonctions associées aux acides nucléiques dans un
tableau élargi du flux de l’information génique qui, outre la triade canonique
“Réplication/Transcription/Traduction”, présente en particulier les fonctions de stockage, de
dégradation et d’édition des ARN, de régulation par miARN [ ]. Ce chapitre aborde aussi la
typologie des différentes formes des acides nucléiques (essentiellement les ADN, sous forme
de règle des “3”) permettant ainsi d’identifier, de décrire et de concevoir les manipulations sur
les acides nucléiques dans le cadre de la technologie de l’ADN recombinant. [ ]. De cette
description découle directement la typologie par “paire” des principales enzymes susceptibles
d’agir sur l’ADN aussi bien dans la cellule que dans le tube à essai [ ].
Volontairement, la transcription, qui est au centre de ce cours, en constituera le
dernier chapitre. En effet, il convient de replacer cette étape particulière au sein des 5
différents niveaux de régulation (chromatinien, transcriptionnel, post-transcriptionnel,
traductionnel et post-traductionnnel) [ ]. Il convient aussi de préciser que les progrès de
nos connaissances font ressortir l’incidence majeure de a) la régulation par les mécanismes
épigénétiques (modifications covalentes de l’ADN et des proteines histones ) [ ] qui
pre!cèdent ou accompagnent la transcription et de b) la régulation par les miARN qui y fait
suite (inhibition de la traduction ou destruction des ARN messagers) [ ]. La description des
mécanismes d’épissage et de leur régulation n’est pas traitée dans ce cours mais le sera en
Master.
Chapitre II : Chromosomes
Il faut considérer que le substrat primaire sur lequel se déroulent la réplication, la
réparation ou la transcription, est constitué d’une molécule d’ADN double brin (double hélice
de type B), linéaire chez les eucaryotes (exemple : le chromosome 1 humain, de taille 250 000
000 de paires de bases (pb), porteur de 2000 à 2100 gènes de protéines et 100 à 200 gènes de
miARN, et d’une longeur de 85 mm [ ]). Les chromosomes sont porteurs collectivement de
l’information génétique d’un individu (génome nucléaire chez l’homme : 2 fois 23
chromosomes [ ]). Ces chromosomes possèdent plusieurs types de zones fonctionnelles dont
les principales sont le centromère (mouvement du chromosome), les télomères (protection et
réplication des extrémités), la région pour l’insertion dans la lamina nucléaire, les origines
de réplication, et pour la transcription les promoteurs et zones régulatrices de l’expression
génique. Dans la cellule, l’ADN chromosomique est associé à un ensemble de protéines
structurales et régulatrices et forme la chromatine.
Globalement, il faut distinguer deux états chromatiniens, l’hétérochromatine ou
chromatine “fermée”, répressive d’une manière générale pour la transcription, et
l’euchromatine (« ouverte ») compatible avec la transcription des gènes [ ]. La balance entre
un statut non permissif et un statut permissif de l’état chromatinien d’un gène particulier est
au coeur de la régulation transcriptionnelle.
Pour compacter l’ADN génomique et gérer de manière coordonnée ses différentes
fonctions, deux niveaux d’organisation se superposent : celui associé au nucléosome et celui
associé aux domaines régulateurs.
Un nucléosome est forme! de deux tours de spire d’ADN autour d’un octamère
d’histones (H2A, H2B, H3 et H4). La presque totalité du génome est sous forme
nucléosomique. Néanmoins, certaines séquences ADN “nucléosomiques” demeurent
accessibles aux protéines régulatrices (“gene-specific transcriptional activators” souvent
associés à une activité modificatrice des histones) [ ]. En effet, le nucléosome est aussi une
unité structurale qui est la cible de modifications covalentes (épigénétique) permettant selon
les circonstances, le passage à un statut chromatinien fermé, ou bien à un statut ouvert. Ces
modifications covalentes constituent des signaux déclencheurs ou régulateurs de fonctions
telles que la transcription, la réplication ou la réparation.
Le positionnement de ces signaux se fait par des modifications post-traductionnelles
principalement sur les extrémités amino-terminales exposées des protéines histones
nucléosomiques. Les acétylations (en général signal d’activation transcriptionnelle), les
méthylations et les phosphorylations ...[ ] définissent un code “histone” qui guide par un
enchainement en cascade, le contrôle spatio-temporel d’une fonction considérée. (exemple :
induction de la réparation d’un coupure ADN double brin [ ]).
Le code histone est régit par un jeu d’écriture, de lecture et d’effaçage. Les principales
familles de molécules concernées pour l’écriture et l’effaçage sont les méthyl-transférases
(SET) et dé-méthylases (LSD, JMJ), les acétyl-transférases (GNAT, MYST, co-activateurs
P300/CBP, TAFII250) et dé-acétylases (SIRT I, II et III), les kinases et phosphatases. La
lecture de ces modifications est effectuée par des molécules (ex. adaptateurs, ...) ayant des
domaines de reconnaissance de type bromodomaine (pour les acétylations),
chromodomaine (pour les méthylations) et LDH (avec une reconnaissance plus diversifiée) [
].
A ces modifications covalentes et à leur lecture par des “adaptateurs” sont associées
des déplacements, des remplacements ou des évictions de nucléosomes catalysée par des
complexes de remodelage chromatinien. Quatre grandes familles de complexes peuvent être
identifiées (SWI/SNF, ISWI, CHD1, INO80) dont la composition en sous-unités est
dynamique et s’adapte au cours du de!veloppement et en fonction de la spécificité tissulaire [ ].
L’activité dynamique des complexes SWI/SNF est fondamentale dans l’activation ou la
répression de programme d’expression génique.
Enfin, pour être complet, la nature des histones constitutives des nucléosomes peut
être changée pour des histones mineures permettant d’assumer une fonctionnalité spécifique à
un instant donné (ex. réparation « DSB »). Cette substitution d’histone est réalisée ! par des
activités “chaperon moléculaire des histones”. Ce type d’activités participe aussi à l’apport
des histones lors de la mise place des nucléosomes au cours de la réplication.
d’information génétique (par recombinaison), soit l’induction de la mort cellulaire
programmée (par apoptose) [ ].
Les “domaines régulateurs” permettent une gestion coordonnée et controlée dans le
temps de l’expression des gènes constitutifs d’un domaine, gènes qui relèvent souvent d’une
même fonction (domaine “histone” pour la production des nucléosomes lors de la réplication [
], et domaine “béta-globine” pour l’expression des gènes de béta-globine au cours du
développement [ ]).
La présence d‘origines “constitutives”, “flexibles” et “dormantes” permet une
adaptation de la mobilisation des origines de réplication aux circonstances pour faire face soit
à un besoin accru (embryogenèse), soit répondre à un arrêt de la synthèse d’ADN (stress
réplicatif) [ ].
Ces domaines correspondent à l’organisation du chromosome en boucles (40 000 à
100 000 pb) i) délimitées par des barrières de domaine qui isole un domaine du domaine
adjacent, ii) contenant des séquences MAR de fixation à la matrice nucléaire (réseau
fibrillaire protéique dans lequel les domaines régulateurs s’insèrent) et iii) présentant une
séquence “LCR” (Locus Control Region) qui contrôle l’expression de l’ensemble des gènes
présents dans le domaine concerné (ex. domaine béta-globine [ ]).
L’activation d’un LCR d’un domaine régulateur est associée à une perte de structure
nucléosomique et à l’apparition de sites hypersensibles à la Dnase I.
L’activation d’un gène, faisant suite à celle du domaine régulateur qui le contient, se
traduit par l’apparition de modifications épigénétiques suivies par le remaniement ou la
destruction de la structure nucléosomique au niveau du promoteur et des zones régulatrices
conduisant aussi à l’apparition de sites hypersensibles à la Dnase I.
La structuration nucléosomique du reste de la structure génique (nucléosome ou
solénoïde), une fois le promoteur disponible pour fixation de la machinerie transcriptionnelle,
n’est pas un obstacle pour la transcription grâce au comportement dynamique du
nucléosome [ ].
Le contrôle spatio-temporel de cette activation de domaine et des gènes
correspondants se fait par l’intermédiaire d’un “HUB” (ou plate-forme/pôle de focalisation)
qui organise des boucles de chromatine par repliement, plaçant en interaction le LCR (et ses
sites hypersensibles) et les promoteurs des gènes (du domaine) devant s’exprimer [ ].
Chapitre III : Réplication
La réplication chez les eucaryotes correspond à l’ouverture coordonnée de multiples
origines de réplication parmi un ensemble plus large d’origines potentiellement activables,
mises en place lors de la fin de phase M et lors de la phase G1 du cycle cellulaire.
Il faut distinguer les origines des eucaryotes simples (levure, virus eucaryotes)
constituées de séquences définies (A/T, ORE, DUE, Aux1 et Aux2). Les deux zones Aux1 et
Aux2 fixent des facteurs de transcription. Ceci donne une double fonctionnalité
“transcription/réplication” pour ce type de molécules (ex : rôle du facteur cellulaire Sp1 pour
l’origine du virus SV40).
La situation est différente pour les origines de réplication des eucaryotes complexes
qui ne sont pas caractérisées par des séquences spécifiques mais par une organisation
génomique. L’objectif prioritaire étant de dupliquer l’intégralité du génome en activant une
fois et une seule fois l’ensemble des origines sélectionnées pour éviter soit une perte
Au plan organisationnel, la réplication s’organise en réplicons domaines réplicatifs
comparables aux domaines de régulations transcriptionnels. De plus, les origines de
réplication semblent préférentiellement positionnées au voisinage des promoteurs, reliant
ainsi réplication et transcription (ex. embryon de souris [ 205]).
Au plan moléculaire la préparation (licencing) puis l’activation des origines de
réplication fait appel au recrutement séquentiel de facteurs multiples (ORC, cdt1, cdc6,
MCM2-7 (hélicase), Dpb1, GINs, cdc45 et MCM10). Ces recrutements et l’activation des
origines nécessitent l’action d’histone méthyl-transférase (SET8/H4K20me1), d’histone
acétylase (HBO1), de kinase (cdk2), de complexe de remodelage chromatinien. Les deux
étapes marquantes du démarrage la synthèse d'ADN réplicatif sont le recrutement des
enzymes de dépôt des amorces réplicatives (primases et polymérase ") et celui du PCNA
(Proliferating Cell Nuclear Antigen).
Les ADN polymérases réplicatives sont les polymérases epsilon et delta (# et $),
cette dernière dépendant totalement pour son activité du co-facteur PCNA (recrutement et
processivité). Ces polymérases sont capables d’auto-correction partielle de leurs erreurs
d’incorporation par leur fonction d’édition [ ].
Les réplicons sont regroupés en foyers réplicatifs pour la phase d’élongation,
participant à l’organisation fonctionnelle des territoires nucléaires.
Le fonctionnement intégré de ces différentes étapes du mécanisme de la replication en
particulier i) pour controler leur bon déroulement, ii) pour faire face aux menaces sur
l’intégrité du génome ou sur la survie cellulaire et iii) pour intégrer les informations
provenant de l’extérieur de la cellule telles que les messages hormonaux et les contacts
cellulaires, trouve son origine dans le cycle cellulaire et ses régulations multiples.