Module 11- Détection quantitative du soja Roundup - EU

Analyse d’échantillons alimentaires pour la
présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 11
Détection quantitative du soja Roundup Ready® par
PCR en temps réel
N. Foti
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L’EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Détection quantitative su soja Roundup Ready® par PCR en temps réel
2
Table des matières
Module 11
Détection quantitative du soja Roundup Ready® par PCR
en temps réel
INTRODUCTION
3
PCR EN TEMPS REEL UTILISANT LE THERMOCYCLEUR ABI PRISM® 7700
3
PCR EN TEMPS REEL UTILISANT LE THERMOCYCLEUR LIGHTCYCLER® (ROCHE)
9
REFERENCES
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
15
Module 11
Détection quantitative su soja Roundup Ready® par PCR en temps réel
3
Introduction
Les protocoles suivants sont des méthodes basées sur la PCR en temps réel pour la
quantification d’une lignée de soja GM spécifique (le soja Roundup Ready®) dans
les matières premières et les produits transformés. Les quantifications par PCR en
temps réel s’effectuent au moyen de deux thermocycleurs différents équipés pour
détecter une amplification en temps réel en mesurant la fluorescence : le
thermocycleur ABI PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystèmes) et le thermocycleur
LightCycler® (Roche).
La PCR en temps réel est utilisée pour amplifier une séquence d’ADN cible de
référence endogène (spécifique du soja), plus une séquence cible d’ADN indiquant la
présence de soja génétiquement modifié (soja Roundup Ready®).
Les deux essais impliquent deux systèmes PCR indépendants, chacun ayant des
amorces d’ADN spécifiques et des sondes marquées par un fluorochrome. L’un des
systèmes PCR détecte une séquence d’ADN cible spécifique de l’OGM, l’autre est un
système de référence endogène conçu pour servir de référence quantitative
détectant le soja GM et non GM.
Remarque : les protocoles qui figurent dans ce manuel ont été sélectionnés à des
fins didactiques et doivent être considérés comme des exemples de base de
quantification d’OGM par la méthode de la PCR en temps réel. Nous recommandons
de consulter périodiquement les sources et la littérature pertinentes afin d’obtenir des
informations sur les derniers protocoles mis au point et validés. Veuillez noter
également que ces protocoles ont été sélectionnés en fonction de l’équipement
disponible dans notre laboratoire. Le CCR et l’OMS n’encouragent en aucun cas le
recours exclusif à une société ou à une marque spécifique.
PCR en temps réel utilisant le thermocycleur ABI PRISM® 7700
Protocole de PCR en temps réel spécifique du soja RR : méthode PCR
multiplexe
Cette méthode consiste en une amplification/quantification du gène de référence de
la lectine et d’une partie du transgène inséré dans le soja RR au moyen d’une PCR
multiplexe (deux réactions PCR dans le même tube) (Foti et al., 2006). Les sondes
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4
TaqMan de lectine et de RR sont marquées respectivement avec les fluorochromes
VIC et FAM, ce qui permet de détecter l’amplification de plusieurs cibles dans le
même tube. Le fluorochrome rapporteur (FAM) se distingue du fluorochrome VIC en
raison de leurs différentes longueurs d’ondes d’émission maximale. Le thermocycleur
ABI PRISM® 7700 SDS est capable de détecter des fluorochromes multiples avec
différentes longueurs d’ondes d’émission.
La quantité de fluorochrome (FAM) du soja RR est normalisée par rapport à la
quantité de fluorochrome végétal (VIC) détecté dans chaque échantillon. On obtient
ainsi une valeur ∆CT, dont la moyenne est établie pour les échantillons répétés. Ces
valeurs sont comparées à une courbe d’étalonnage générée par le ∆CT des
standards de concentration connue de soja RR (méthode comparative CT, ou ∆∆CT).
Cette procédure a été mise en œuvre avec succès pour diverses matières premières,
ingrédients et aliments contenant du soja (par ex. aliments pour animaux, boissons à
base de soja, yaourts, farine, lécithine, etc.).
La performance analytique de la méthode a été contrôlée avec succès dans le cadre
de plusieurs procédures d’essai d’aptitude (par ex. FAPAS®, GIPSA).
Équipement et réactifs
•
Sequence Detector System ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems)
•
Plaques de réaction MicroAmp Optical à 96 cupules (Cat. N° N801-0560)
•
Couvercles MicroAmp Optical (Cat. N° N801-0935)
•
TaqMan® Universal Mastermix (Cat. N° 4304437) 2X contenant : tampon TaqMan 2x
AmpliTaq Gold® ADN polymérase (5 U/µl), UNG AmpErase® (1 U/ml), dNTP 200
µM avec dUTP, référence passive 1
•
Microcentrifugeuse
•
Centrifugeuse réfrigérée pour tubes coniques de 15 ml
•
Micropipettes
•
Agitateur vortex
•
Portoir pour tubes de réaction
•
Tubes microcentrifuges de 1,5 ml
•
Tubes centrifuges coniques de 15 ml en polypropylène
•
Eau exempte de nucléase
•
Amorces (Le-F et Le-R) et sonde (sonde Le) spécifiques du gène de référence
•
Amorces (RR-F et RR-R) et sonde (sonde RR) spécifiques du transgène
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5
Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le gène de référence
Séquence
Longueur (pb)
Poids moléculaire
Séquence
Longueur (pb)
Poids moléculaire
Séquence
Longueur (pb)
Poids moléculaire
Le-F
TCC ACC CCC ATC CAC ATT T
19
5586,0
Le-R
GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA
24
7532
Sonde Le
5’-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT
CG-(TAMRA)-3’
23
7019,0
Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le transgène
Séquence
Longueur (pb)
Poids moléculaire
RR-F
GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT
23
7014
Séquence
Longueur (pb)
Poids moléculaire
RR-R
GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C
25
7712
Séquence
Longueur (pb)
Poids moléculaire
Sonde RR
5’-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC
AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3’
33
10137
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6
Préparation du Mastermix
•
Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la quantité de réactifs requise pour
la réaction. Conserver les réactifs décongelés dans la glace.
•
Dans un tube de 15 ml conservé dans la glace, ajouter les éléments suivants dans
l’ordre indiqué ci-dessous (à l’exception de l’ADN) pour préparer les mastermix.
Chaque extrait d’ADN est analysé en « tripliquât » (3 répétitions). Veuillez noter que
quatre mélanges réactionnels supplémentaires sont préparés afin de faciliter le calcul
des erreurs de pipetage dues à la viscosité de la solution.
Tableau 1. Préparation du mastermix pour une plaque d’essai PCR multiplexe.
Eau déionisée stérile
TaqMan Universal Mastermix 2X
Mastermix
Concentration pour cuve
PCR
de réaction
(µl)
18,3
Mastermix
pour un
échantillon
(3 répétitions)
54,9
Mastermix
pour une plaque
(32+4
échantillons)
1976,4
1x
25
75
2700
Amorce Le-F (20 µM)
40 nM
0,1
0,3
10,8
Amorce Le-R (20 µM)
Amorce RR-F (20 µM)
40 nM
0,1
0,3
10,8
100 nM
0,25
0,75
27
Amorce RR-R (20 µM)
100 nM
0,25
0,75
27
Sonde Le (10 µM)
100 nM
0,5
1,5
54
Sonde RR (10 µM)
ADN
100 nM
50-250 ng
0,5
5
1,5
15
54
50
150
TOTAL
•
Mélanger doucement et centrifuger brièvement.
•
Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml pour chaque échantillon d’ADN à tester :
échantillons de courbe standard (soja RR CRM à 0,1, 0,5, 1,2, et 5 %) échantillons
inconnus et échantillons de contrôle (0 % soja RR, ADN de soja RR et contrôle sans
matrice).
•
Ajouter à chaque tube microcentrifuge la quantité de mastermix requise pour 3
répétitions (135 µl de mastermix). Ajouter à chaque tube la quantité d’ADN requise
pour 3 répétitions (c’est-à-dire 15 µl d’ADN). Passer chaque tube au moins trois fois
pendant env. 10 secondes dans l’agitateur vortex. Cette étape est primordiale, car
elle contribue à réduire au maximum la variabilité entre les trois répliquâts de chaque
échantillon.
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•
7
Centrifuger brièvement. Placer la plaque de réaction à 96 puits dans une base et
aliquoter 50 µl dans chaque cupule horizontalement de gauche à droite. Après avoir
ajouté les mastermix à une rangée verticale de puits, les couvrir avec des bouchons
au moyen de l’outil prévu à cet effet.
NB : ne rien écrire sur la plaque optique et ne pas toucher les bouchons.
•
Veiller à ce que les parties aliquotes de mastermix déposées se trouvent au fond des
puits, et à ce qu’il n’y ait aucune éclaboussure ou bulle sur le côté ou à l’intérieur des
bouchons.
•
Placer la plaque dans le thermocycleur ABI PRISM® 7700 ; ouvrir une nouvelle
fenêtre de configuration de plaque afin d’assigner le type d’échantillon à chaque
puit : le type d’échantillon IPC est associé au fluorochrome VIC et l’échantillon UNKN
(inconnu) à la couche FAM.
•
Soumettre les échantillons aux cycles décrits au Tableau 2.
Tableau 2. Programme de cycles pour l’essai multiplex du soja RR dans le thermocycleur
ABI PRISM® 7700 SDS
Configuration : mode PCR en temps réel
Volume de réaction : 50 µl
Étape
1
2
3
4
Phase
UNG
Dénaturation initiale
Amplification
Dénaturation
Hybridation &
Élongation
T °C
50 oC
95 oC
95 oC
60 oC
Durée
120 s
600 s
15 s
60 s
Acquisition
Non
Non
Non
Mesure
Cycles
1x
1x
45x
Analyse des données et interprétation des résultats
Une fois l’opération terminée, les données sont analysées à l’aide du logiciel ABI
PRISM® 7700 SDS pour déterminer les valeurs CT du fluorochrome rapporteur
respectif de chaque échantillon.
Il est essentiel de numéroter correctement les échantillons dans la fenêtre de
configuration des plaques du logiciel SDS. Chaque cupule doit se voir affecter un
numéro unique dans le champ « Replicate » ; les répliquâts d’un même échantillon
doivent se voir attribuer le même numéro.
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Procéder à l’analyse en sélectionnant « analyse » dans le menu Analyse pour
accéder automatiquement aux courbes d’amplification ; régler la valeur de seuil pour
les couches FAM et VIC.
Après analyse, exporter les résultats dans un fichier Microsoft® Excel. A l’ouverture
du fichier, un tableau contenant deux séries de données correspondant aux couches
de fluorochromes FAM et VIC indique les valeurs CT correspondant à chaque puit.
Calculer les moyennes CT (FAM) et CT (VIC) de chaque groupe de répliquâts pour
déterminer les valeurs ∆CT (CT FAM – CT VIC).
Pour chaque échantillon, le pourcentage d’OGM est calculé en analysant le ∆CT de
l’échantillon, en le comparant à la série de valeurs log (% OGM) et aux valeurs ∆CT
obtenues pour les échantillons de la courbe standard.
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PCR en temps réel en utilisant le thermocycleur LightCycler®
(Roche)
Protocole de PCR en temps réel spécifique du soja RR
La méthode consiste en une amplification/quantification du gène de référence de la
lectine et d’une partie du transgène inséré dans le soja RR, réalisée en deux
réactions PCR indépendantes (BgVV, Rapport d’appel d’offres UE, 2000). Les deux
systèmes PCR utilisent des sondes marquées par le fluorochrome FAM.
Pour chaque échantillon, la quantité de séquences spécifiques du soja GM et la
séquence du gène de référence (gène de la lectine) sont déterminées à partir des
courbes standard appropriées, élaborées à la fois pour le transgène et le gène de
référence. La teneur en soja GM est divisée par la quantité de gène de référence afin
d’obtenir une valeur de soja GM normalisée.
Équipement et réactifs
•
Système de thermocycleur LightCycler® Roche
•
Capillaires pour échantillons LightCycler®. Roche, cat. N° 1909339
•
Adaptateur de capillaires LightCycler®. Roche, cat. N° 1909312
•
Sondes d’hybridation LightCycler® FastStart DNA Master. Roche, cat. N° 3003248,
contenant : ADN Polymérase Taq FastStart, mélange dNTP (avec dUTP au lieu de
dTTP) et tampon de réaction, conc. 10x ; eau stérile, classe PCR
•
Sérumalbumine bovine (SAB), exempte de nucléase (exempte de DNase et de
RNase), par ex. Promega, cat. N° R9461 (1 µg/µl)
•
ADN Polymérase Taq Platinum 5 U/µl (avec le tampon 10x original et 50 mM de
MgCl2). Invitrogen – Life Technologies cat. N° 10966026
•
Microcentrifugeuse
•
Micropipettes
•
Agitateur vortex
•
Portoir pour tubes de réaction
•
Tubes microcentrifuges de 1,5 ml
•
Eau exempte de nucléase
•
Amorces (GM1-F et GM1-R) et sonde (sonde GM1) spécifiques du gène de
référence
•
Amorces (GM2–F, GM2-R) et sonde (sonde GM2) spécifiques du transgène
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Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le gène de référence
Séquence
GM1-F
5’-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3’
Séquence
GM1-R
5’-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3’
Séquence
Sonde GM1
5’-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3’
Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le transgène
Séquence
GM2-F
5’-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3’
Séquence
GM2-R
5’-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3’
Séquence
Sonde GM2
5’-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3’
Courbes standard
Pour chaque série, les deux courbes standard sont obtenues avec 5 dilutions
différentes d’ADN de référence (étalonnage). Une seule réaction est effectuée avec
chaque ADN standard d’étalonnage avec les deux mastermix.
Les courbes standard pour la quantification d’ADN de soja et de la séquence
spécifique de l’OGM sont obtenues avec des solutions d’ADN standard d’étalonnage
à des valeurs de concentration décroissantes partant de 2 % d’ADN de soja RR avec
un tampon TE (0,1 M, pH 8,0). Environ 100 ng d’ADN sont utilisés pour le premier
point des courbes standard. Les dilutions et les concentrations des courbes standard
sont indiquées au Tableau 3.
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Tableau 3. Quantité d’ADN et dilutions des courbes standard.
STD 1
STD 2
STD 3
STD 4
STD 5
Quantité d’ADN
(ng)/réaction
% d’ADN
de soja
% d’ADN
GM
Facteur de
dilution
100
50
25
12,5
6,25
100
50
25
12,5
6,25
2
1
0,5
0,25
0,125
1:2
1:4
1:8
1:16
Préparation du Mastermix
•
Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la quantité d’éléments requise.
Conserver les réactifs décongelés dans la glace.
•
Pour chaque système, ajouter les éléments suivants dans l’ordre indiqué ci-dessous
(à l’exception de l’ADN) à un tube microcentrifuge de 1,5 ml dans la glace afin de
préparer les mastermix. Veuillez noter que deux mélanges réactionnels comprennent
un excès de volume pour tenir compte des erreurs de pipetage dues à la viscosité de
la solution.
Tableau 4. Préparation du mastermix pour le système GM1.
Composant
Pol.ase Taq Platinum Tampon 10x
MgCl2 (50 mM)
dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM)
Amorce GM1-F (20 µM)
Amorce GM1-R (20 µM)
Sonde GM1 (10 µM)
SAB exempte de nucléase (1 µg/µl)
Pol.ase Taq Platinum (5 U/µl)
Eau exempte de nucléase
ADN
Volume total :
Concentration PCR
µl/réaction
1x
4 mM
0,8 mM
500 mM
500 nM
200 nM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
18 µl+2 µl ADN
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Total µl
(pour 18 réactions)
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
324,2 µl
(sans ADN)
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Tableau 5. Préparation du mastermix pour le système GM2
Composant
Concentration PCR
µl/réaction
1x
4 mM
0,8 mM
500 mM
500 nM
200 nM
0,1 mg/ml
0,8 U
#
2
1,6
4
0,5
0,5
0,4
2
0,16
6,85
2
Pol.ase Taq Platinum Tampon 10x
MgCl2 (50 mM)
dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM)
Amorce GM2-F (20 µM)
Amorce GM2-R (20 µM)
Sonde GM2 (10 µM)
SAB exempte de nucléase (1 µg/µl)
Pol.ase Taq Platinum (5 U/µl)
Eau exempte de nucléase
ADN
Volume total :
Total µl
(pour 18 réactions)
18 µl+2 µl ADN
36
28,8
72
9
9
7,2
36
2,9
123,5
324.2 µl
(sans ADN)
•
Mélanger doucement et centrifuger brièvement
•
Préparer deux tubes de réaction de 0,5 ml (un pour le système GM1 et un pour le
système GM2) pour chaque échantillon d’ADN à tester (échantillons de courbe
d’étalonnage et échantillons inconnus)
•
Ajouter à chaque tube de réaction la quantité de mastermix requise pour 2 répétitions
(36 µl de mastermix). Ajouter à chaque tube la quantité d’ADN requise pour 2
répétitions (c’est-à-dire 4 µl d’ADN). Passer chaque tube au moins trois fois pendant
env. 10 secondes dans l’agitateur vortex. Cette étape est primordiale, car elle
contribue à réduire au maximum la variabilité entre les répliquâts de chaque
échantillon.
•
Placer les capillaires dans l’adaptateur centrifuge préalablement refroidi.
•
Pipeter 20 µl du mastermix dans chaque capillaire conformément au procédé prévu à
cet effet (cf. le Tableau 6 « Configuration de la plaque – ordre de chargement » carrousel LightCycler® standard)
•
Centrifuger à basse vitesse (env. 1150 tr/mn). Cette étape assure la concentration du
volume total du mélange réactionnel dans l’extrémité du capillaire
•
Transférer les capillaires dans le carrousel LightCycler® (Roche)
•
Soumettre les échantillons aux cycles décrits au Tableau 7
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13
Tableau 6. Configuration de la plaque – ordre de chargement du carrousel LightCycler® :
positions 1 à 16 = système GM1, positions 17 à 32 = système GM2. Chaque échantillon
d’ADN en double pour les systèmes du gène de référence et du transgène (OGM)
Échantillon
(%)
Position
Position
Échantillon
(%)
Position
Échantillon
(%)
1
STD (100)
13
U2
25
STD (0,125)
2
STD (100)
14
U2
26
STD (0,125)
3
STD (50)
15
NTC
27
U1
4
STD (50)
16
NTC
28
U1
5
STD (25)
17
STD (2)
29
U2
6
STD (25)
18
STD (2)
30
U2
7
STD (12,5)
19
STD (1)
31
NTC
8
STD (12,5)
20
STD (1)
32
NTC
9
STD (6,25)
21
STD (0,5)
10
STD (6,25)
22
STD (0,5)
11
U1
23
STD (0,25)
12
U1
24
STD (0,25)
Tableau 7. Programme de cycles pour le système LightCycler®
Réglage : pente 20 °C/s à tous les paliers.
Mode d’affichage fluorescent : F1/1
Dénaturation :
Cycles:
1
Type:
None
Segment
Number
Temp.
1
96 °C
Fluorescence Display Mode:
Time
Slope
120 sec 20 °C/sec
F1/1
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
0 °C
0 °C
0
None
Cycles:
Cycles:
45
Type:
Quantification
Segment Temp.
Number
1
95 °C
Fluorescence Display Mode:
F1/1
Time
Slope
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
5 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
2
60 °C
15 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
Single
3
72 °C
15 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
Refroidissement:
Cycles:
1
Type:
None
Segment Temp.
Number
1
40 °C
Fluorescence Display Mode:
F1/1
Time
Slope
2° Target
Temp.
Step
Size
Step Delay
(Cycles)
Acquisition
Mode
30 sec
20 °C/sec
0 °C
0 °C
0
None
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14
Durant l’opération, cliquer sur le bouton EDIT SAMPLE et introduire les noms des
échantillons dans l’écran de chargement. Définir toutes les positions (y compris l’ADN
d’étalonnage) comme « Unknowns ».
Analyse des données et interprétation des résultats
•
Pour l’analyse des données, sélectionner « Fluorescence » F1/F2 dans la fenêtre
avant d’analyse des données.
•
Pour la quantification, cliquer sur le bouton quantification.
•
Le logiciel LightCycler® propose deux méthodes de quantification différentes : la
méthode « Second Derivative Maximum » et la méthode « Fit Points ». Pour la
quantification avec le kit de détection d’ADN de soja RR, il est préférable d’appliquer
la méthode « Fit Points ». Opérer les réglages suivants : réglage de base =
« Proportionnal » ; nombre de points = 2.
•
Sélectionner la courbe standard avec toutes les réactions d’échantillons inconnus
correspondantes.
•
Ouvrir le dossier « Step 2: Noise Band ».
•
Placer le seuil de bruit de fond à une de position 0,1. Le seuil de bruit de fond peut
être déplacé manuellement à l’aide de la souris ou en appuyant sur le bouton en
dessous du bouton « Chance Graph Settings ». Ce bouton ouvre la fenêtre « Manual
Cursor Adjustment » (réglage manuel du curseur) et la valeur du curseur peut être
réglée sur 0,1.
•
Ouvrir le dossier « Step 3: Analysis ».
•
A l’étape 3, les points d’intersection ainsi que les concentrations correspondantes de
solutions étalon et de matrices d’ADN inconnues sont calculés.
•
Contrôler la valeur « r » de la courbe standard. Les valeurs r ≥ -0,98 sont
acceptables ; valeur « r » optimale = -1.
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15
Références
EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as as well quantitative
detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize
products. Report of the EU tender n. XXIV/98/A3/001.
LightCycler® Operator’s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals).
User Bullettin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM® 7700
Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1997.
User Bullettin #5. Multiplex PCR with TaqM VIC probes .ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System. PE Applied Biosystems, 1998.
Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). RealTime PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in
raw material and processed food. European Food Research and Technology
Journal 222, 209-216.
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