LA RÉGÉNÉRATION IN VITRO DU FRAISIER (FRAGARIA X
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LA RÉGÉNÉRATION IN VITRO DU FRAISIER (FRAGARIA X
49 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1999, 138, 49-74 LA RÉGÉNÉRATION IN VITRO DU FRAISIER (FRAGARIA X ANANASSA DUCH.) (*) II - Les possibilités offertes par la culture in vitro E. M. EL HAMDOUNI (1) , A. LAMARTI (1) , A. BADOC (2) La culture de méristèmes et d’apex a été appliquée avec efficacité pour l’élimination des virus et pour le développement de la production à large échelle de plants de Fraisier (Fragaria X ananassa Duch.) par micropropagation. De même, des protocoles de régénération par organogenèse directe ou indirecte sur divers types d’explants ont été mis au point chez un grand nombre de variétés cultivées à travers le monde. Ces protocoles peuvent être potentiellement utilisés pour l’amélioration de cette plante fruitière à travers la variation somaclonale et permettre de sélectionner des clones résistants aux maladies, aux ravageurs, au gel ou présentant des caractères désirables (qualité du fruit, rendement, etc.). Par ailleurs, un certain nombre de cultivars ont pu être transformés génétiquement par l’intermédiaire d’Agrobacterium tumefaciens. (*) Manuscrit reçu le 2 novembre 1999 (1) Laboratoire de Biotechnologie et d'Amélioration des plantes, Département de Biologie, Faculté des Sciences Mhanach II, BP 2121 Tétouan, 93002 Maroc. (2) Laboratoire de Mycologie et Biotechnologie végétale, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2, 3, place de la Victoire, 33076 Bordeaux Cedex. 50 INTRODUCTION La plupart des fraises du commerce proviennent du Fraisier cultivé, Fragaria X ananassa Duch., espèce octoploïde issue d’un hybride spontané entre deux espèces octoploïdes originaires d’Amérique, Fragaria chiloensis Duch. et F. virginiana L. . La recherche de variétés résistantes présentant une meilleure qualité du fruit et leur production de masse ont conduit tout naturellement à l'utilisation des différentes techniques de culture in vitro. Ces dernières sont successivement passées en revue pour le Fraisier cultivé. GERMINATION IN VITRO Les akènes du Fraisier montrent souvent un pourcentage variable et/ou faible de germination. De même, l'émergence des plantules peut être étalée sur une période allant de 2 à 12 semaines après l’ensemencement [34,92,106]. Les akènes de Fraisier germent mieux s’ils proviennent de fruits mûrs et s’ils ont été [28], en particulier de la partie basale et médiane du fruit [13,26] stockés un minimum de temps [1,15]. Plusieurs traitements ont été utilisés dans le but d’améliorer la germination des akènes du Fraisier. Un stockage au froid des akènes [1,9,12,15,28,44,92,100,107,etc.], l'humidité [35], l’exposition à la lumière [28,64,90-91,100], notamment la lumière rouge [44], une forte pression osmotique [27] favorisent la germination. Il en est de même de l’acide gibbérellique [13,26,64,100], l’ethephon l’eau oxygénée [66] et les acides comme HCl, HNO3 et H2SO4 [13,66,93,107,109,etc.]. [28,34,106], 51 Chellappa [13] a testé une scarification mécanique en limant les akènes et le pourcentage de germination augmente en utilisant non pas des akènes entiers, mais des portions d’akènes mûrs de Fraisier renfermant l’embryon avec l’apex et la radicule [56]. MICROPROPAGATION Les travaux sur la micropropagation du Fraisier visaient à obtenir au départ des plants indemnes de virus et ont conduit à la production de masse de jeunes plants. Adams [2] a réalisé le premier l’obtention d’un nombre illimité de plantules à partir d’un seul méristème par utilisation d’une cytokinine dans le milieu de culture. Cependant, il n’a pas obtenu un grand nombre de plantules, n’ayant utilisé qu’une faible concentration de benzyladénine (0,1 mg/l BA) dans le milieu de culture. Puis Nishi et Ohsawa ont proposé une technique de régénération de bourgeons sur des cals induits à partir de méristèmes apicaux, mais cette technique a favorisé l’apparition de plantes présentant des altérations phénotypiques. C'est pourquoi Boxus [10] a mis au point une technique évitant la formation de cal et permettant la prolifération de bourgeons axillaires multiples par l’utilisation dans le milieu de benzyladénine à une concentration dix fois plus élevée que celle utilisée par Adams [2]. Les bourgeons séparés sont facilement enracinés par l’omission de cytokinine dans le milieu de culture. Ainsi, Boxus [11] a décrit un protocole pour la production de millions de plantules à partir d’un seul méristème et l’a testé sur 74 variétés. Ce protocole a été adopté pour la propagation de masse du Fraisier et a été modifié et adapté pour divers cultivars. Il passe par quatre phases, d’établissement, de prolifération, d’enracinement et d’acclimatation décrites dans la première partie de cette revue [16]. Culture de tissus Des travaux de régénération à partir de divers explants ont été menés avec succès par organogenèse directe (Tableau I) ou par culture de cals (Tableau II). Ainsi, des plantules ont été régénérées à partir de la culture de cotylédons [55], de tissus foliaires (limbe, pétiole ou stipules) [4-5,17,23,33,39-40,46,51,6768,70,80,86,96,98,etc.], de stolons ou de pédoncules [39,50-51], d’anthères [14,79,83,85,99,etc.], d’ovaires non pollinisés ou de pétales [6,82], d’akènes immatures [49]. Les Tableaux I et II mentionnent différentes solutions minérales et balances phytohormonales utilisées ainsi que les cultivars étudiés. 52 Tableau I : Organogenèse directe sur divers explants de Fraisier Cultivar ou génotype Explant utilisé S o l u t i o n minérale étudié Balance phytohormonale Auxines (µM) Références Cytokinines (µM) ‘Allstar’ Disque foliaire LS 2,46 AIB Segment de stolon LS+KNO3 11,41 AIA 11,09 BA 44,38 BA Liu et Sanford, 1988 ‘Honeoye’ Segment de stolon LS+CH 2,46 AIB 22,19 BA ‘Redcoat’, 'Veestar' Disque foliaire MS 10 AIA 10 BA ‘Brighton’, Fleur non ‘Douglas’, ‘Fern’, pollinisée ‘Honeoye’, Pétale ‘Parker’ MS 2,7-10,8 ANA 0,9-2,3 2,4-D 2,2-22 BA Liu et Sanford, 1988 Nehra et al., 1989 Predieri et al., 1989 ‘Rapella’ Disque foliaire MS 1 2,4-D 4,4 BA ‘Redgauntlet’, ‘Senga Sengana’ Akène immature LF 0,54 ANA 2,22 ou 0,045 2,4-D 3,55 BA Lis, 1990 ‘Redcoat’ Disque foliaire MS 1 ANA 10 BA Nehra et al., 1990a ‘Brighton’ Ovaire non pollinisé MS 2,3 2,4-D 11 BA ‘Tioga’, ‘Allstar’, Disque foliaire ‘Tribute’, Segment de ‘Earlidawn’ stolon, de pétiole ou d’hypocotyle LS 1 2,4-D 14 BA Battistini et Rosati, 1991 Jelenkovic et al., 1991 ‘Chandler’ Disque foliaire N30K [52] 2,46 AIB ‘Redgauntlet’, ‘Senga Sengana’, ‘Surprise des Halles’ Pédoncule floral LF Segment de stolon ‘Hiku’, ‘Jonsok’ Disque foliaire James et al., 1990 8,8 BA Barceló et al., 1993 0,54 ANA 0,89 BA Lis, 1993 MS 0,49 AIB 13,3 BA Sorvari et al., 1993 ‘Totem’, ‘Tristar’ Disque foliaire MS 2,85 AIA 8,8 BA Mathews et al., 1995 ‘Chandler’ N30K 2,4 AIB 8,8 BA Barceló et al., 1998 Disque foliaire LF : Lee et Fossard [46] ; LS : Linsmaier et Skoog [48] ; MS : Murashige et Skoog [63] ; AIA : acide 3-indolacétique ; AIB : acide 3-indolbutyrique ; ANA : acide naphtalène acétique ; 2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique ; BA : benzyladénine 53 Tableau II : Organogenèse sur cals issus de divers types d’explants de Fraisier Cultivar ou génotype étudié Explant utilisé Milieu de régénération Solution minérale Références Phyto hormones (µM) ‘Bogota’, ‘Brighton’, JILA33, ‘Ostara’, ‘Redgauntlet', ‘Rapella’ Disque foliaire Segment de feuille MS 0,9 2,4-D 11,11 BA Jones et al., 1988 ‘Allstar’ Disque foliaire LS 2,46 AIB 11,11 BA ‘Redcoat’ Disque foliaire MS 1 ANA 10 BA Liu et Sanford, 1988 Nehra et al., 1990a ‘Redcoat’ Disque de feuille MS immature ‘Pajaro’ Anthère GD3 [24] 15 ANA 0,05 Kinétine Quarta et al., 1992 ‘Hokowase’ Jeune feuille MS 0,45 2,4-D 4,40 BA Toyoda et al., 1991 ‘Addie’, ‘Dana’, ‘Gea’, ‘Santana’ Stipule B5 [21] ou MS 2,5 AIB 10 BA Rugini et Orlando, 1992 ‘Aiko’, ‘Dana’, 'Gorella', Disque foliaire ‘Premial’ Segment de pétiole MS 4,5 2,4-D 22 BA Isac et al., 1994 F32025, F77109, ‘Hecker’, ‘Redgauntlet’, ‘Senga Sengana’, ‘Tribute', ‘Zefyr’ LS 5 BA Svensson et Johansson, 1994 ‘Muir’, ‘Pajaro’, ‘Selva’ Filament Ω (‘Dana’ X ‘Tribute’), d’anthère 85.30.5 GD3 15,1 BA 0,046 Kinétine Damiano et al., 1995 ‘Aiko’, ‘Premial’, ‘Gorella’ MS 4,5 2,4-D 4,40 ; 13,3 ; 22,2 BA Popescu et al., 1997 Anthère Disque foliaire Segment de pétiole 5 ou 10 2,4-D Nehra et al., 5 ou 10 BA 1990c LS : Linsmaier et Skoog [48] MS : Murashige et Skoog [63] BA : benzyladénine = benzylaminopurine 2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique AIB : acide 3-indolbutyrique ANA : acide naphtalène acétique 54 Le taux de prolifération des bourgeons in vitro varie suivant le génotype et de ce fait le milieu de culture doit être adapté pour chaque variété [95]. De plus, les explants prélevés sur des plantes jeunes répondent mieux à la régénération et la prolifération des bourgeons que ceux prélevés sur des plantes âgées [70]. Embryogenèse somatique Les embryons issus d’un tissu non constitué de cellules zygotiques sont dits somatiques et relèvent d’une embryogenèse asexuée ou somatique. Les premiers travaux ont été réalisés par Reinert [84] et Steward et al. [97] chez la Carotte domestique en 1958. Pour induire cette embryogenèse, l’explant doit être placé dans un premier temps dans un milieu primaire renfermant des auxines pour que les cellules subissent un processus de différenciation,puis transféré sur un milieu secondaire sans auxine afin de permettre le développement des embryons. L’embryogenèse somatique est un processus par lequel des cellules somatiques se développent en plantes différenciées à travers les stades embryonnaires caractéristiques des embryons zygotiques [105]. Les récentes découvertes de dessiccation, de conservation et de réhydratation des embryons somatiques peuvent avoir un certain impact sur les espèces cultivées, et ce en relation directe avec la technologie de production de “ graines artificielles ”. Chez le Fraisier, l’embryogenèse somatique est une alternative aux méthodes actuelles de micropropagationet à la propagation classique par stolons. Si la micropropagationpar culture d’apex ou de méristèmes permet la production d’un million de plantules par an à partir d’un seul méristème [10], l’embryogenèse somatique, en rapport avec la technologie des graines artificielles, peut délivrer potentiellement des millions “ d’akènes de Fraisier ” en quelques semaines. Wang et al. [104] ont étudié l’embryogenèse somatique à partir d’embryons zygotiques immatures et ont observé un taux d’apparition de tissu embryogène élevé en présence de 5 mg/l de 2,4-D, 0,5 mg/l de BA et 500 mg/l d’hydrolysat de caséine, mais peu de développement en embryons somatiques. Suspensions cellulaires L’établissement de suspensions cellulaires est réussi par transfert des cals friables sur un milieu nutritif liquide approprié tout en assurant une agitation orbitale servant à la fois pour l’aération et la dispersion des cellules. Chez le Fraisier, des protocoles d’établissement de suspensions cellulaires à partir de cals ont été mis au point (Tableau III). La majorité des travaux ont concerné la biosynthèse de métabolites secondaires. Ainsi, Hong et al. [30] ont décrit des processus pour 55 l’établissement et le développement de suspensions cellulaires initiées à partir de cals issus de fruits immatures du cultivar ‘Brighton’ ; ils ont comparé trois systèmes de culture par mesure de la consommation d’oxygène et de saccharose et du gain en poids de matière sèche durant deux semaines de culture ; ils ont mis en évidence des différences entre cultivars quant à leur Tableau III : Induction du cal et établissement de suspensions cellulaires chez le Fraisier Cultivar ou génotype étudié Explant utilisé Milieu d’établissement Solution minérale et vitamines / phytohormones d’un cal friable MS 5 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l BA Références de la suspension cellulaire Fruit immature ‘Pajaro’ Disque foliaire B5 [21] 10,7 µM ANA 4,6 µM Kinétine Blando et al. 1993 B5 2,3 µM de 2,4-D ‘Shikinari’ Méristème LS apical 0,5-5 mg/l 2,4-D Disque foliaire 0-2 mg/l BA Segment de pétiole LS ‘Shikinari’ Disque foliaire LS 1 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l BA ‘Pajaro’, ‘Selva’, ‘Muir’, Ω (‘Dana’ X ‘Tribute’), 85.03.5 Segment de pétiole GD1 [24] ‘Shikinari’ Méristème apical MS 1 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l BA 2 mg/l ANA 5 mg/l kinétine LS : Linsmaier et Skoog [48] ANA : acide naphtalène acétique 2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique MS 1 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l BA Hong et al. 1989 ‘Brighton’ Mori et al., 1993 1 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l BA LS 1 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l BA Mori et al., 1994a, 1994b ; Mori et Sakurai, 1994, 1995 B5 0,5 mg/l 2,4-D 0,2 mg/l BA Damiano et al., 1995 LS 1 mg/l 2,4-D 0,1 mg/l BA Sato et al., 1996 MS : Murashige et Skoog [63] BA : benzyladénine 56 capacité d’initiation de cals et de production d’anthocyanes en suspension cellulaire. La même équipe a démontré ultérieurement la possibilité de production de composés volatils (butanol, butyrate d’éthylbutanol et butyrate de butyle) en ajoutant au milieu des précurseurs [31]. Pour leur part, Damiano et al. [14] ont établi des suspensions cellulaires et étudié le polymorphisme enzymatique chez les plantes régénérées à partir de cals. Plusieurs travaux ont porté sur la stimulation et l’amélioration de la production d’anthocyanes par divers facteurs sur des suspensions cellulaires [57-62,87,89,108,etc.]. Ainsi, Nakamura et al. [65] ont observé que de faibles concentrations de 2,4-D dans le milieu de culture ont un effet négatif sur la croissance cellulaire et augmentent aussi bien la production que la méthylation des anthocyanes. Des méthodes de néoformation de plants de Fraisier à partir de suspensions cellulaires ont été mises au point [19,101]. PROTOPLASTES L’hybridation interspécifique chez le genre Fragaria en utilisant les techniques de sélection classiques nécessite plusieurs années. Une solution attrayante peut être la combinaison de divers génomes ou le transfert de gènes extrachromosomiaux de Fragaria, à travers la fusion des protoplastes, un protoplaste étant une cellule sans paroi pouvant fusionner avec un autre protoplaste pour aboutir à une plante hybride [81]. Cependant, le développement d’un protocole efficace de fusion de protoplastes nécessite la réalisation d’un certain nombre d’étapes pouvant chacune constituer une barrière : - Choix de la source des explants et du tissu. - Développement d’un système enzymatique efficace pour se débarrasser de la paroi pectocellulosique. - Développement d’un milieu approprié pour la survie des protoplastes. - Exécution du protocole de fusion pour la production d’hybrides somatiques. - Sélection du produit de fusion. - Développement d’un milieu permettant la régénération de la paroi des cellules sélectionnées et éventuellement de plantes complètes. 57 Chez le Fraisier, aucune publication n’a porté à notre connaissance sur l’hybridation somatique. Cependant, Binding et al. [7] ont reporté la possibilité de régénération des plantes à partir de protoplastes isolés de l’apex. Nyman et Wallin [75-76] ont étudié les facteurs affectant le rendement, la survie, la culture et la régénération des protoplastes issus de mésophylle ainsi que la détermination du contenu en ADN chez les plantes régénérées. Dans cette dernière étude, un rendement élevé en protoplastes a été obtenu à partir des feuilles de plantules cultivées in vitro sur un milieu sans phytohormone et avec une faible concentration en sucres, et ce après traitement du tissu foliaire par une solution enzymatique contenant 1,0 % (p/v) de cellulysine et 0,05 % (p/v) de pectolyase. Sur un milieu contenant 1,0 mg/l de 2,4-D et 0,5 mg/l d’AIB, ces protoplastes isolés régénèrent leur paroi et commencent leur division formant ainsi des colonies cellulaires et des plantes entières ont été régénérées sur le milieu de Murashige et Skoog [63] solide additionné de 0,2 mg/l d’ANA et 5-10 mg/l de BA. De même, Janeckova et al. [37] ont obtenu des propagules par division des protoplastes chez le cultivar ‘Bounty’. L'avenir de la technologie des protoplastes dans l’amélioration du Fraisier passe par le développement de systèmes efficaces d’isolement et de régénération de protoplastes pour chaque variété cultivée et également pour les espèces apparentées ou sauvages, reconnues comme sources de résistance aux maladies et aux stress environnementaux. VARIATION SOMACLONALE Les procédés de culture in vitro peuvent entraîner une instabilité génétique qui se manifeste par l’apparition de variants dont les caractères morphologiques, structuraux, etc. diffèrent de ceux de la plante mère. Ces modifications affectent de manière plus ou moins importante le phénotype et le génotype [41]. Ces variations constatées parmi les plantes régénérées et nommées variations somaclonales [45] peuvent être le résultat d’une modification du nombre chromosomique, d’une mutation, d’une délétion ou d’une méthylation des séquences d’ADN [3,47]. Le terme de variant est utilisé quand la nature du changement n’est pas connue et que son comportement héréditaire est inhabituel, par opposition à un caractère transmis par la méiose selon les lois de l’hérédité. 58 Chez le Fraisier, plusieurs variants intéressants par leurs caractères ont été produits (Tableau IV). Ainsi, Simon et al. [94] observent approximativement 10 % de plantes issues de la culture d’anthères présentant une tolérance au mildiou, alors que la variété étudiée était susceptible à cette maladie. Des régénérants résistants au Fusarium ont été sélectionnés à partir de cals issus de feuilles [102] ; les plantules ainsi obtenues ont été transplantées sur un champ infecté par le germe pathogène et ont montré un développement normal et ce pendant trois générations. Lors d’un screening de 29 clones issus de la régénération in vitro d’ovaires non pollinisés du cultivar ‘Brighton’, des somaclones moins susceptibles au Phytophtora cactorum que le clone original ont été obtenus [6]. Faedi et al. [18] ont retenu sur un total de 1484 pieds issus de la culture in vitro d’anthères du cultivar ‘Pajaro’ 36 plantes (2,4 %) pour leurs caractères agronomiques : rendement élevé, taille importante des fruits et faible susceptibilité au mildiou. Janeckova et al. [37] ont obtenu par régénération sur disques foliaires des clones différant du cultivar ‘Senga Sengana’ par le taux de floraison et le rendement en fruits. Des différences significatives dans la vigueur, la floraison, le rendement et la capacité de formation de stolons ont été signalées par Merkle [54] dans une étude sur l’effet de diverses combinaisons phytohormonales sur le comportement au champ de plants du cultivar ‘Senga Sengana’ régénérés in vitro. Damiano et al. [14] ont signalé que les plantes régénérées à partir de cals issus de la culture des filaments d’anthères montrent un polymorphisme enzymatique vis-à-vis de la peroxydase, de l’acide phosphatase et de la glutamate déshydrogénase. Popescu et al. [80] ont obtenu par culture de cals issus de tissus foliaires de 3 cultivars des clones montrant des variations phénotypiques de caractères comme la vigueur, la couleur des feuilles et des fruits, la formation de stolons ou le rendement en fruits. Orlando et al. [78] ont développé un protocole de sélection de plantes résistantes à Rhizoctonia fragariae et Botrytis cinerea par l’addition, au milieu de sélection, d’enzymes pectiques de ces champignons. Bien que les variations phénotypiques puissent apparaître aussi chez les plantes issues de la culture de méristèmes [42,88], il est généralement admis que les variations génétiques sont associées à la régénération à partir des cals, que la fréquence des variations somaclonales est généralement faible et que plusieurs facteurs puissent être responsables de ces variations tels le génotype, la balance phytohormonale dans le milieu ou l’âge du cal [69,80]. 59 Tableau IV : Exemples de quelques variations somaclonales chez le Fraisier Cultivar ou génotype étudié Explant utilisé Variations observées Références ‘Brighton’ Ovaire non pollinisé - Résistance au Phytophthora cactorum Battistini et Rosati, 1991 ‘Pajaro’ Anthère - Apparition d’aneuploïdes parmi les régénérants Quarta et al., 1992 ‘Hokowase’ Jeune feuille - Résistance au Fusarium oxysporum f. sp. fragariae Toyoda et al., 1991 ‘Redcoat’ Disque foliaire - Vigueur - Forme et nombre de feuilles - Nombre de stolons Nehra et al., 1992 ‘Pajaro’ Anthère Faedi et al., 1993 ‘Senga Sengana’, ‘Redgauntlet’ Disque foliaire - Nombre de fleurs - Rendement Janeckova et al., 1993 Lignée 77101 Protoplaste - Niveau de ploïdie (plantes 16x et 12x) - Forme et taille des feuilles et des fruits - Capacité de production de stolons Nyman et Wallin, 1992a ; Nyman 1993 - Polymorphisme enzymatique - Capacité de régénération Damiano et al., 1995 ‘Pajaro’, Filament ‘Selva’, ‘Muir’, d’anthère Ω (‘Dana’ X ‘Tribute’), 85.30.5 ‘Gorella’, ‘Aiko’, ‘Premial’ - Résistance au mildiou - Rendement en fruits - Taille, forme et couleur des fruits Disque foliaire - Couleur des fruits Segment de - Rendement en fruits pétiole - Capacité de production de stolons - Vigueur de la plante Popescu et al., 1997 60 TRANSFORMATION GÉNÉTIQUE La transformation génétique vise à créer des plantes transgéniques exprimant des gènes leur conférant des caractères agronomiques. Avec le progrès qu’a connu la culture des tissus et la technologie de recombinaison de l’ADN, la transformation génétique est devenue maintenant une réalité. Deux stratégies principales ont été développées pour le transfert de gènes étrangers aux plantes supérieures ; le transfert indirect de gènes par l’intermédiaire d’Agrobacterium tumefaciens et le transfert direct de gènes par microinjection, par voie bolistique ou par électroporation. Tandis que le transfert direct est devenu une excellente méthode chez les Monocotylédones(Blé, Maïs, Riz, etc.), Agrobacterium tumefaciens s’est avéré être un véhicule efficace pour le transfert de gènes à l’intérieur d’une large gamme de Dicotylédones dont le Fraisier [20]. La bactérie Agrobacterium tumefaciens renferme un plasmide Ti qui interagit avec les cellules de la plante et permet le transfert de gènes à l’intérieur des cellules. Le Ti sauvage renferme des gènes qui causent la formation de tumeurs ou galles au niveau du site d’infection de la plante. Cependant, l’utilisation des techniques de recombinaison d’ADN permet de remplacer facilement ces gènes par des gènes d’intérêt et des gènes marqueurs permettant l’optimisation des techniques de transfert. La susceptibilité de la plante hôte à Agrobacterium est la première condition à remplir pour le lancement du protocole de transfert de gènes. Il a été signalé que le Fraisier octoploïde (Fragaria X ananassa Duch.) est susceptible à l’infection par des souches d’Agrobacteriumtumefaciens [38,103]. Le tableau V cite quelques travaux portant sur la transformation génétique du Fraisier. James et al. [36] ont décrit la transformation génétique d’une importante variété européenne de Fraisier, ‘Rapella’, par deux vecteurs, pBIN6 et pSS1. Le premier contient les gènes nptII (néomycine phosphotransférase), qui confère une résistance à la kanamycine, et nos (nopaline synthase) ; les plantules transformées croissent en présence de kanamycine et le transfert et l’expression des gènes ont été confirmés par des tests enzymatiques. Le deuxième présente les gènes nptII et ipt (isopentényltransférase), ce dernier stimulant la synthèse des cytokinines. La nature transgénique des explants à été confirmée par leur 61 croissance en présence de kanamycine et par l'absence d'enracinement sur un milieu sans phytohormone. Nehra et al. [67-68] incubent des explants foliaires du cultivar ‘Redcoat’ avec une souche d’Agrobacterium tumefaciens portant un plasmide pBI121 vecteur binaire contenant deux gènes marqueurs, nptII et GUS. Ce dernier code pour la β-glucuronidase qui produit une précipitation bleue caractéristique chez les cellules et tissus de plantes lorsqu’ils sont incubés en présence d’un colorant glucuronidé comme substrat ; il permet une vérification rapide de la transformation génétique et une visualisation de la localisation de l’expression du gène dans les cellules transformées. L’expression fonctionnelle et l’intégration stable de ces deux gènes dans le génome a été confirmée par divers tests biochimiques, enzymatiques et par l’hybridation de Southern. Jelenkovic et al. [39] ont développé une procédure pour la transformation génétique de certains génotypes de Fraisier en utilisant divers types d’explants et la souche LBA4404 portant 3 vecteurs, pGV3850, pGV3850::1103 et pBI121. Graham et al. [22] ont développé un protocole de régénération à partir de segments de tige en utilisant les gènes GUS et CpTi. [Cowpea protease Trypsin inhibitor]. Ce dernier permet une inhibition de la trypsine, détectée par la réduction ou l'élimination de la couleur jaune due à l'hydrolyse d'un substrat en p-nitroaniline. Mathews et al. [53] ont rapporté une incorporation stable d’un gène contrôlant la biosynthèse de l’éthylène chez ‘Totem’ par l’intermédiaire des souches EHA101 ou EHA105 portant des vecteurs avec les gènes nptII ou hpt, qui induit une résistance à l'hygromicine B, et chez ‘Tristar’ par l’intermédiaire des souches LBA4404 ou EHA101 portant des vecteurs binaires avec les gènes nptII et uidA. Récemment, El Mansouri [17] et Barceló et al. [4] ont décrit un protocole de régénération du cultivar ‘Chandler’ à partir de disques foliaires et leur transformation génétique par l’intermédiaire de la souche LBA4404 d’Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide non oncogène pAL4404 et le vecteur binaire pBI121 contenant le gène nptII de résistance à la kanamycine et un gène chimérique. 62 Tableau V : Transformation génétique du Fraisier Cultivar ou génotype transformé explant utilisé Mode de transformation / souche Références ‘Rapella’ Disque foliaire Segment de pétiole Agrobacterium tumefaciens souche : LBA4404 [29] James et al., 1990 ‘Redcoat’ Disque foliaire Agrobacterium tumefaciens souche : MP90 [43] Nehra et al., 1990b ‘Tioga’, ‘Allstar’, ‘Tribute’, ‘Earlidawn’, NJ8327-2, NJ8343-6, NJ8333-1 Disque foliaire Segment d'hypocotyle, de pétiole ou de stolon Agrobacterium tumefaciens souche : LBA4404 Jelenkovic et al., 1991 Lignée 77101 Protoplaste Électroporation Nyman et Wallin, 1992b ‘Melody’, ‘Rhapsody’, ‘Symphony’ Segment de tige Agrobacterium tumefaciens souche : LBA4404 Graham et al., 1995 ‘Tristar’, ‘Totem’ Méristème Disque foliaire Segment de pétiole Agrobacterium tumefaciens Mathews et al., souches : LBA4404, EHA101 1995 ou EHA105 ‘Chandler’ Disque foliaire Agrobacterium tumefaciens souche : LBA4404 El Mansouri, 1997 ‘Chandler’ Disque foliaire Agrobacterium tumefaciens souche : LBA4404 Barceló et al., 1998 Comme alternative à la transformation indirecte par l’intermédiaire d’Agrobacterium, Nyman et Wallin [77] ont fait appel à l'introduction de gènes étrangers dans les protoplastes du Fraisier (lignée 77101) par électroporation. Dans cette procédure, le vecteur pRT88HPT contenant les gènes hpt et GUS a été utilisé. Ce dernier permet d'optimiser les paramètres d’électroporation pour la distribution des gènes à l’intérieur des protoplastes. Les protoplastes électroporisés sont sélectionnés en présence de 10 mg/l d’hygromycine B pour obtenir des cals et par suite des plantes transformées. 63 Le développement des protocoles de transfert des gènes par l’intermédiaire d’Agrobacterium et de l’électroporation a ouvert de nouveaux horizons pour l’amélioration du Fraisier. Il est dorénavant possible de produire par transformation génétique des variétés présentant des caractères d’intérêt agronomique, tels la résistance aux herbicides, aux ravageurs (virus, insectes, champignons, etc.) ou la tolérance aux stress environnementaux. PRODUCTION DE PLANTES HAPLOÏDES Les techniques de production de plantes haploïdes sont connues sous le nom d’haplométhodes. Elles permettent tout particulièrementen amélioration des plantes un gain du temps. Ainsi, la production de plantes homozygotes peut être obtenue en un seul cycle de culture par culture in vitro (par culture d’anthères, par exemple), alors que par sélection classique, il faut une période de 8 à 10 années. Guha et Maheshwari [25] ont reporté l’induction d’haploïdes par culture d’anthères coupées de Datura innoxia. Depuis, la culture d’anthères a été utilisée avec succès pour la production de plantes haploïdes [32]. Chez le Fraisier octoploïde (2n = 8x = 56), l’induction de plantes polyhaploïdes in vitro à partir de la culture d’anthères de différents cultivars est prometteuse et peut être un outil rapide et efficace pour l’amélioration de cette plante. Ainsi, plusieurs auteurs [72,83,85;etc.] ont tenté de produire des polyhaploïdes par culture d’anthères, mais il s’est avéré que les plantes obtenues sont généralement octoploïdes et dans la plupart des cas les cals dont elles dérivent sont issus plutôt des tissus somatiques des anthères que des microspores. Pour remédier à ce problème, Svensson et Johansson [99] ont étudié les facteurs environnementaux et la composition du milieu de culture qui peuvent affecter les divisions des microspores et la production des cals ; sur un total de 105 clones analysés, 92 ont été octoploïdes (8x), 2 heptaploïdes (7x), 7 hexadécaploïdes (16x) et 4 probablement mixoploïdes (4x-8x). Pour leur part, Owen et Miller [79], ont pu obtenir des plantes polyhaploïdes à travers la culture d’anthères chez trois cultivars de Fraisier (‘Chandler’, ‘Honeoye’ et ‘Redchief’) lors d’une étude comparative de l’effet de différents milieux de culture sur la fréquence de régénération des plantes. Des alternatives sont la gynogénèse in vitro ou encore le croisement interspécifique et la pollinisation par du pollen irradié, pouvant être associés à la 64 culture in vitro pour éviter un avortement précoce des embryons. Des essais d'induction de parthénogénèse haploïde par du pollen irradié ont été entreprises à l'INRA d'Avignon ; quelques polyhaploïdes ont été obtenus mais ils se diploïdisent rapidement (Risser Georgette, comm. pers.). Il est évident qu’il reste à faire des efforts pour pouvoir développer des méthodes efficaces de production de plantes polyhaploïdes désirables pour les programmes d’amélioration. RÉFÉRENCES 1- Adam (J.), Wilson (D.), 1967. - Factors affecting the germination of strawberry seed. - Annu. Rep. - Long Ashton. Res. Stn., 1966, 1967, 9095. D'après Hortic. Abstr. 38(1968)494. 2- Adams (A.N.) - An improved medium for strawberry meristem culture. - J. Hortic. Sci., 1972, 47(2), 263-264. 3- Bajaj (Y.P.S.) - Biotechnol. Agric. 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II Possibilities offered by in vitro culture The meristem and shoot culture has been applied with efficacy to eliminate viruses and develop large scale production of strawberry plants (Fragaria X ananassa Duch.) by micropropagation. Processes of regeneration by direct or indirect organogenesis on various explants have been settled for numerous cultivars around the world. These processes can be potentially used for the improvement of this fruit species by somaclonal variation and allow the selection of clones resisting diseases, pests, frost or presenting desirable characters (quality of fruit, yield, etc.). Moreover, some cultivars have been genetically transformed through Agrobacterium tumefaciens. Key-words : cell suspension, Fragaria X ananassa, in vitro culture, micropropagation, organogenesis, somaclonal variation, strawberry, transformation. _________