ED Biologie moléculaire

ED Biologie moléculaire
E. Turpin
J. Lehmann-Che
5-6 novembre 2007
PCR
•1983: Kary Mullis
•Amplification in vitro par une méthode enzymatique d'un fragmentd'ADN
en présence de deux oligonucléotides spécifiques de la séquence à amplifier.
•Succession de 20 à 40 cycles thermiques:
1/dénaturation
2/hybridation des oligonucléotides
3/extension par une Taq DNA polymérase
Dénaturation (95°C)
ADN cible :1 copie
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
Hybridation (50 à 60 °C)
3’
5’
Amorces 5’
3’
5’
3’
3’
5'
5'
3’
3’
5’
10 picomoles de chaque amorce: 10x10-12x6.02x1023
= 6.02x1012 molécules de chaque primer
Extension (68 à72°C)
ADN cible :2 copies
5’
3’
3’
5’
: ADN Polymérase
A C G T:
4 désoxyribonucléotides
5’
3’
5’
3’
4 copies
Cycle 3
8 copies
5’
3’
Amplicon
3’
Cycle 2
5’
Exercice: dessiner des amorces de PCR
La séquence présentée est celle d’une partie du gène de la β globine humaine
comprenant le promoteur, l’exon 1 et une partie de l’intron 1. Sur cette
séquence de 315 pb (paires de bases), le n° 100 (A s ur le brin codant)
correspond au début de la transcription, de 150 à 153 est l’ATG initiateur de
la traduction et le n° 241 est le G de fin de l’exo n 1.
On veut amplifier par PCR le fragment commençant à 36 et se terminant à 302
suivant la numérotation indiquée au dessus du brin codant 5’ 3’.
1) Quelles amorces seront utilisées?
2) Quels sont les différents constituants nécessaires à la réaction de PCR?
3) Quelles sont les différentes étapes d’une réaction de PCR? A quoi serventelles?
4) Comment peut-on mettre en évidence le produit de PCR?
5) Quelle est la taille attendue pour le produit de PCR?
Région 5’ du gène de la β globine humaine
10
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
20
30
40
50
5’-GTGGAGCCAC ACCCTAGGGT TGGCCAATCT ACTCCCAGGA GCAGGGAGGG
60
70
80
90
100
CAGGAGCCAG GGCTGGGCAT AAAAGTCAGG GCAGAGCCAT CTATTGCTTA
110
120
130
140
150
CATTTGCTTC TGACACAACT GTGTTCACTA GCAACCTCAA ACAGACACCA
160
170
180
190
200
TGGTGCACCT GACTCCTGAG GAGAGGTCTG CCGTTACTGC CCTGTGGGGC
210
220
230
240
250
AAGGTGAACG TGGATGAAGT TGGTGGTGAG GCCCTGGGCA GGTTGGTATC
260
270
280
290
300
AAGGTTACAA GACAGGTTTA AGGAGACCAA TAGAAACTGG GCATGTGGAG
310
ACAGAGAAGA CTCTT - 3’
Correction
1/ Oligonucléotides à commander:
Sens:
5’ AGGA GCAGGGAGGG CAGGAG 3’
Anti sens: 5’ GTCTCCACATGCCCAGTTTC 3’
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
5’-AGGA GCAGGGAGGG CAGGAGCCAG
3’-TCCT CGTCCCTCCC GTCCTCGGTC
GGTTGGTATC AAGGTTACAA GACAGGTTTA AGGAGACCAA TAGAAACTGG GCATGTGGAG
CCAACCATAG TTCCAATGTT CTGTCCAAAT TCCTCTGGTT ATCTTTGACC CGTACACCTC
•
•
AC - 3’
TG - 5’
GGCTGGGCAT AAAAGTCAGG GCAGAGCCAT CTATTGCTTA CATTTGCTTC TGACACAACT
CCGACCCGTA TTTTCAGTCC CGTCTCGGTA GATAACGAAT GTAAACGAAG ACTGTGTTGA
GTGTTCACTA GCAACCTCAA ACAGACACCA TGGTGCACCT GACTCCTGAG GAGAGGTCTG
CACAAGTGAT CGTTGGAGTT TGTCTGTGGT ACCACGTGGA CTGAGGACTC CTCTTCAGAC
CCGTTACTGC CCTGTGGGGC AAGGTGAACG TGGATGAAGT TGGTGGTGAG GCCCTGGGCA
GGCAATGACG GGACACCCCG TTCCACTTGC ACCTACTTCA ACCACCACTC CGGGACCCGT
Cinétique de la PCR
Comparaison PCR en point final/ QPCR
Modes de détection du produit d’amplification
SYBR Green
Sondes marquées
Sondes TaqMan®
(sondes d’hydrolyse)
Sondes d’hybridation
Principe du FRET
Sonde intacte: Q absorbe l’énergie de
R qui n’émet pas de fluorescence
Lors élongation, activité 5’
exonucléasique de la Taq
hydrolyse la sonde
Q ne peut plus absorber l’énergie de R
qui émet une fluorescence,
proportionnelle à la quantité d’ADN
nouvellement synthétisée.
Comment passer d’une fluorescence à un résultat? (1)
1/ Détermination des Ct
Ct= intersection
entre la courbe
d’amplification et la
barre de seuil
Bruit de fond
Barre de seuil
Comment passer d’une fluorescence à un résultat? (2)
2/ Comparaison des Ct
Quantification absolue
Résultat en nombre de copies
Nécessite une courbe standard
Quantification relative
Résultat: rapport entre Ct
ou par rapport au calibrateur
Pas de standards mais
-un contrôle endogène
-un calibrateur
Quantification absolue (1)
Y= (1+E)n X
Qté initiale de la cible
Qté de produits de PCR
Nbre de cycles
Y=
2n X
Doublement à
chaque cycle
Quantification absolue (2)
Quantification relative (1)
Contrôle endogène:
reflet de la qté de matrice par puit
doit être identique pour tous les échantillons analysés
permet de normaliser les qtés de matrice indroduites
Si on met 2x plus de matériel qu’au départ?
Quantification relative (2)
Les pentes des 2 gènes ne sont pas équivalentes
Ici, le ∆CT n’est pas constant quelque soit la
quantité de cDNA
À retenir: les PCR des 2 gènes (d’intérêt et endogène) doivent avoir une efficience
proche (donc une pente équivalente) pour pouvoir calculer des ∆CT
ξ Ct
Erreur en fonction de l’Efficacité de la
réaction PCR
1
2
3
3,32
4
Efficacité
99%
1%
1%
2%
2%
2%
95%
3%
5%
8%
9%
11%
90%
5%
11%
17%
19%
23%
85%
8%
17%
26%
30%
37%
5
6
7
8
9
10
3%
3%
4%
4%
5%
5%
13%
16%
19%
22%
26%
29%
29%
36%
43%
51%
59%
67%
48%
60%
73%
87%
102%
118%
80% 75%
11% 14%
23% 31%
37% 49%
42% 56%
52% 71%
69%
88%
109%
132%
158%
187%
Efficience de 85%
pour une différence de 1∆CT, l’erreur est de 8%
95%
123%
155%
191%
233%
280%
70%
18%
38%
63%
72%
92%
125%
165%
212%
267%
332%
408%
Quantification de l’ARNm d’un gène: Q-RT-PCR
Transcription
Traduction
ADN
ARN
Gène
messager
Amplifications géniques
Q PCR
Amorces- sondes
modifications
d’expression
protéine
Présence et
localisation
Q RT-PCR
Immunohistochimie
analyse du transcriptome
(microarray)
Tissue array
Anticorps
Reverse transcription des ARNm cDNA
Reverse trancription d'un ARN messager
en ADN complémentaire
ARNm
5’
AAAAAA
3’
5’
5’
Hybride ARNm/ADNc
AAAAAA
: Reverse transciptase
Oligonucléotide: spécifique
hexamers
oligo(dt)12-20
3’
3’
PCR après RT
5’
Hybride ARNm/ADNc
AAAAAA
3'
3’
5’
Dénaturation
5’
AAAAAA
Hybridation
3'
5’
Extension
3'
PCR classique
5’
3’
Exemples d’application de la Q PCR ou Q-RTPCR
Détermination de la charge virale
ex: HIV-1 en suivi du SIDA
Détermination de l’amplification d’un gène QPCR
ex: HER-2 dans le cancer du sein
Détermination de la surexpression d’un gène Q RT-PCR
ex: ERα dans le cancer du sein
Exemples
Exemple 1:
-1/ Quel est l’échantillon de cDNA le plus concentré et combien de fois?
- 2/ Quel organe exprime le plus d’IL10 et combien de fois plus?
Correction 1
Question 1:
-Le CT du gène endogène est un reflet de la quantité de cDNA dans l’échantillons
Ici le 18S rRNA est le gène endogène ou gène de ménage
L’échantillon le plus concentré est celui qui a le CT le plus petit donc le cerveau.
-Il existe une différence de 16 -14 = 2 cycles entre les 2 échantillons
22 = 4
donc l’échantillon du cerveau est 4 fois plus concentré que celui du foie
Question 2:
On compare les ∆CT des 2 échantillons :
l’IL10 est plus exprimé dans le foie que dans le cerveau
Il existe une différence de 6 CT entre les 2 échantillons
donc l’IL-10 est exprimé 64 fois plus dans le foie
Exemples
Exemple 2:
Une culture cellulaire subit un traitement par une drogue. On compare
l’expression d’un gène au cours du temps après traitement.
Quelle est l’action de la drogue
sur l’expression du gène
d’intérêt, en fonction du temps?
Expression en 2 -∆∆CT
Correction 2
On calcule les ∆CT pour chaque temps:
∆CTt0= 35-15 =20
∆CTt12= 30-15 =15
∆CTt24= 24-9 =15
∆CTt48= 34-14 =20
On compare par rapport au temps T0:
T12= ∆CTt12-∆CTt0= -5 25=32
T24= 15-20= -5
T48= 20-20=0
Conclusion: la drogue active l’expression du gène d’intérêt d’un facteur 32 entre
12 et 24h après administration. On constate un retour à l’expression basale 48h
après traitement.