Bartonella IFA IgM (En Français)(OUS)

Bartonella IFA IgM
(En Français)
IFA IgM Bartonella
REF IF1300M
Rev. K
Test d'Immunofluorescence Indirecte (IFA) pour la
Détection des Anticorps IgM Humains contre les
Infections à Bartonella
Cette notice est strictement réservée à l'exportation
et non pour la distribution aux États-Unis.
En dehors des Etats-Unis:
Pour Utilisation Diagnostique in vitro.
UTILISATION PREVUE
Le test Anticorps d'Immunofluorescence Indirecte (IFA) de Bartonella de Focus Daignostics est prévu comme une aide dans le diagnostic clinique des infections
à Bartonella. Ce produit utilise des cellules entières de B. henselae et B. quintana purifiées diluées dans du sac vitellin, ce qui permet la détection et la semiquantification des anticorps IgM du sérum humain contre Bartonella.
RESUME ET EXPLICATION DU TEST
Jusqu'à récemment, l'agent étiologique de la Maladie des Griffes du Chat (Cat Scratch Disease, CSD) a été controversé. Plusieurs agents potentiels ont été
associés avec cette maladie parmi lesquels Chlamydia sp. et Afipia felis. Il est maintenant généralement reconnu que la cause du CSD est en fait une bactérie
gram négative en bâtonnet du genre Bartonella (précédemment Rochalimaea) 1.
La maladie des griffes du chat est une maladie courante (0.77 à 0.86 cas par population de 100,000) ef affecte 22,000 personnes par an aux Etats-Unis2, 3. La
majorité des cas rapportés se sont produits chez des personnes de moins de 20 ans, qui sont généralement de sexe masculin. Les cas rapportés de CSD sont
généralement maximums en automne ou en hiver4.
CSD suit généralement un antécédent de griffe ou de morsure de chat qui démarre comme une lésion primaire à la surface de la peau. Celle-ci est souvent suivie
par un gonflement des ganglions lymphatiques proches qui se déversent éventuellement sur le site de l'infection primaire. La majorité des cas se limitent d'euxmêmes et sont résolus en 2 à 4 mois5.
Les formes atypiques de CSD représentent approximativement 11% des cas documentés6. Chez ces patients, une conjonctivite granulomateuse, un syndrôme
oculoglandulaire, une amygdalite, une maladie viscérale granulomateuse, une encéphalite, et une artérite cérébrale sont les plus fréquents6. Chez les personnes
immunodéprimées, B. henselae est le plus souvent associé avec le CSD classique, l'angiomatose bacillaire et la péliose hépatique7.
Traditionellement, le diagnostic était basé sur un antécédent de morsures ou de griffes de chat, la démonstration de l'organisme dans le tissu par une coloration à
l'argent de Warthin-Starry ou des tests cutanés positifs. Il est maintenant possible de confirmer les cas supectés de CSD en utilisant les méthodes de sérologie4.
Des études indiquent qu'approximativement 90% des cas suspectés de CSD résultent en titres IgG du sérum >1:64 par IFA, et/ou des titres IgM ≥ 1:20 au cours
de la phase aiguë8. Les titres de bruit de fond chez les personnes saines sont rares1.
Il y a eu récemment une résurgence d'intérêt pour une autre espèce du genre Bartonella, B. quintana. Cet organisme est l'agent causatif de la Fièvre des Tranchées
classique9. Actuellement, B. quintana est impliqué dans l'endocardite aiguë et l'angiomatose bacillaire chez les patients HIV positifs10, 11. Le diagnostic sérologique
de B. quintana est similaire à celui de B. henselae. Il existe une large réactivité croisée IgG entre ces deux espèces alors que la réponse IgM est plus spécifique d'espèce. Par
conséquent, la différenciation sérologique entre B. henselae et B. quintana est donc typiquement impossible lorsque seules les IgG sont détectées. Dans ces cas, il est
nécessaire de tester d'autres échantillons et de se fier à la présentation clinique.
La réponse immunitaire primaire à Bartonella est un anticorps de classe IgM qui apparaît tôt au cours de l'infection et est hautement diagnostique lorsqu'il est
présent. La réponse anticorps IgG suit de près la réponse IgM initiale. La réponse IgG ayant une large réactivité croisée entre les espèces, les résultats doivent
être interprétés avec précaution.
La lame IFA Bartonella de Focus Daignostics contient B. henselae et B. quintana. En observant la lame au microscope avec le côté givré à gauche, B. quintana
apparaît à gauche et B. henselae apparaît à droite.
PRINCIPE DU TEST
Le test anticorps d'immunofluorescence indirecte (indirect immunofluorescent antibody, IFA) est une procédure en "sandwich" en deux étapes. Dans la première étape,
le sérum de patient est dilué dans du Diluant de Prétraitement. Le Diluant de Prétraitement est une solution isotonique tamponnée contenant des anticorps anti-IgG
humaines qui éliminent à la fois les IgG libres et complexées du sérum. Le sérum dilué (prétraité) est ajouté dans les puits appropriés en contact avec le substrat et incubé.
Après l'incubation, la lame est lavée en tampon phosphate salin, ce qui élimine les anticorps du sérum non couplés. Dans la seconde étape, chaque puits d'antigène est
recouvert par un anticorps contre les IgM humaines et couplé à la fluorescéine. La lame est incubée afin de laisser les complexes antigène-anticorps réagir avec les anti-IgG
couplées à la fluorescéine. Après lavage, séchage et montage, la lame est observée au microscope à fluorescence. Les réactions positives apparaissent comme des bactéries
présentant une fluorescence vive vert-pomme. Les points de titration semi-quantitatifs sont obtenus en testant des dilutions en série d'échantillons positifs.
MATERIEL FOURNI
Le kit de Test de Focus Daignostics contient suffisamment de matériel pour réaliser 80 déterminations.
Lames Substrats IFA IgM Bartonella
REF
IF1302
Ag
Bartonella IgM Substrate Slide
Dix lames de huit puits chacune. Chaque puits contient deux dépôts: deux dépôts individuels consistant en bactéries resuspendues dans une matrice de sac
vitellin. Stocker les sachets de lames scellées entre 2 et 8°C. Les lames scellées sont stables jusqu'à la date indiquée sur les étiquettes des sachets de lames. Afin
d'éviter la condensation, laisser les lames revenir à température ambiante avant d'ouvrir les sachets scellés.
IFA IgM Bartonella
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Note: La majorité des microscopes à fluorescence inversent l'image de la
lame. Lorsque les antigènes sont examinés à travers le microscope, ils
apparaissent en ordre inverse, comme indiqué ci-dessous.
Conjugué IgM Double Espèce, 3.5mL
REF
IF0012
CONJ
IgM
IgM Conjugate-Dual Species
Une ampoule d'anticorps de chèvre anti-IgM humaines, spécifique de la chaine mu, mélangé avec un anticorps de chèvre contre les IgM de souris et couplé à la
fluorescéine. L'anticorps anti-IgG de souris a été standardisé afin de fournir un contrôle antigène spécifique. Contient du contre-colorant Bleu d'Evan, un
stabilisateur de protéines, et des conservateurs. Prêt à l'emploi. Stable entre 2 et 8°C jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette. Ne pas utiliser en cas de trouble, de
décoloration ou de toute autre indication d'une contamination bactérienne
Contrôle Décelable Polyvalent IFA Bartonella, 0.30mL
REF
IF1314
CONTROL
>
Bartonella Polyvalent Detectable Control
Une ampoule de sérum murin conditionné à la dilution du test. Contient des conservateurs. Stable entre 2 et 8°C jusqu'à la date d’expiration indiquée sur
l'étiquette. Ne pas utiliser en cas de trouble, de décoloration ou de toute autre indication d'une contamination bactérienne. Laisser revenir à température ambiante
avant ouverture. Ne pqs prétraiter.
Contrôle Non-Décelable IFA Bartonella, 0.25mL
REF
IF1313
CONTROL
<
Bartonella Non-Detectable Control
Une ampoule de sérum humain conditionné à la dilution du test. Contient des conservateurs. Stable entre 2 et 8°C jusqu'à la date d’expiration indiquée sur
l'étiquette. Ne pas utiliser en cas de trouble, de décoloration ou de toute autre indication d'une contamination bactérienne. Laisser revenir à température ambiante
avant ouverture. Ne pas prétraiter ou diluer. Les cycles répétés de congélation-décongélation sont nuisibles et doivent être évités.
Diluant de Prétraitement IgM, 12 mL
REF
IF0609
DIL
IgM
IgM Pretreatment Diluent
Un ampoule de PBS contenant un antisérum de chèvre monospécifique contre les IgG humaines, avec des conservateurs. Stable entre 2 et 8°C jusqu'à la date
d'expiration indiquée sur l'étiquette. Laisser revenir à température ambiante avant ouverture.
Liquide de Montage, 2.5mL
REF
IF0007
REAG
MONT
Mounting Medium
Une bouteille compte-goutte contenant du glycérol-tamponné en PBS à pH 7.2 ± 0.1. Contient des conservateurs. Stable entre 2 et 8°C jusqu'à la date d'expiration
indiquée sur l'étiquette de la bouteille. Laisser revenir à température ambiante avant utilisation.
PBS, 1L
REF
IF0005
BUF
PBS
Une ampoule de PBS (Phospate Buffered Saline) en poudre. Reconstituer avec un litre d'eau distillée (ou purifiée). La solution reconstituée est 0.01M à pH 7.2 ±
0.1. Avant et après reconstitution, stocker le PBS 2 et 8°C. Laisser revenir à température ambiante avant utilisation. Ne pas utiliser en cas de trouble, de
décoloration ou de toute autre indication d'une contamination bactérienne.
MATERIEL REQUIS, MAIS NON FOURNI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Lamelles 24 x 50mm
Tubes à essai et portoir, microtubes à centrifugation ou plaque de microtitration pour les dilutions de sérum
Centrifugeuse de paillasse
Incubateur à 35-37°C ou bain-marie pour les incubations
Refrigérateur 2 à 8°C
Pissette de lavage
Pipettes calibrées ou pipetmans avec embouts jetables
Cuves Coplin ou cuve à coloration avec portoir de lame
Eprouvette ou erlen gradué, 1 litre
Chambre humide pour l'incubation des lames
Eau distillée ou purifiée
Minuteur
Papier absorbant pour sécher les lames
Microscope à fluorescence, paramètres recommandés
Filtre d'Excitation
470-490nm
Filtre Barrière
520-560nm
Source Lumineuse
HBO 100W, mercure
Objectif
20-40X, qualité fluorescence, fort et à sec
IFA IgM Bartonella
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AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Cette notice est strictement réservée à l'exportation et non pour la distribution aux États-Unis. En dehors des Etats-unis, ce kit est conçu pour le
diagnostique in vitro.
Tous les produits sanguins doivent être traités comme potentiellement infectieux. Le matériel de départ dont ce produit a été dérivé (y compris le contrôle
non-décelable) a été testé pour l'antigène de surface de l'Hépatite B, l'anticorps de l'Hépatite C, et l'anticorps HIV-1/2 (SIDA) par des méthodes approuvées
par le FDA et s'est révélé négatif. Cependant, aucun test ne pouvant garantir à 100% que les produits dérivés du sang humain ne transmettront pas ces
agents infectieux ou d'autres, tous les contrôles, les échantillons de sérum, et les équipements entrant en contact avec ce matériel doivent être considérés
comme potentiellement infectieux et décontaminés ou éliminés en utilisant les précautions requises de Bio-Sécurité. Les CDC et les instituts nationaux de la
santé recommandent que des agents potentiellement infectieux soient manipulés au niveau 2 de Biosafety.12,13
Le Bleu d'Evans est un cancérigène ; toutefois, ce produit est présent à un taux inférieur au seuil à déclarer (moins de 0,1 %).
Ne pas substituer les réactifs avec d'autres kits ou des produits d'autres fabricants.
Utiliser uniquement les protocoles décrits dans cette notice. Des temps d'incubation ou des températures autres que ceux indiqués peuvent produire des
résultats erronés.
La contamination croisée des échantillons de patients sur une lame peut provoquer de faux résultats. Ajouter les échantillons de patients et manipuler les
lames avec précaution afin d'éviter le mélange des sera de puits adjacents.
La contamination bactérienne des échantillons de sérum ou des réactifs peut provoquer de faux résultats. Utiliser des techniques stériles pour éviter la
contamination microbienne.
Ce kit et ses composants sont spécifiquement formulés pour l'utilisation dans les déterminations d'IgM. Ne pas utiliser le kit ou ses composants pour des
déterminations d'IgG.
Le Liquide de Montage contient de 30 à 60 % de glycérol, ce qui pourrait produire des irritations après inhalation ou contact avec la peau. En cas
d'inhalation ou de contact, des mesures de premiers secours doivent être prises.
STOCKAGE ET MANIPULATION
1.
2.
3.
Les kits sont stables jusqu'à la fin du mois indiqué sur la date d'expiration lorsqu'ils sont stockés entre 2 et 8°C.
Ne pas utiliser les kits ou les réactifs après la date d'expiration.
Ne pas exposer les réactifs à la lumière vive au cours du stockage ou de l'incubation.
COLLECTE ET PREPARATION DES ECHANTILLONS
La source de l'échantillon est de préférence le sérum. La compatibilité du test avec d'autres spécimens n'a pas été testée. Les sera hyperlipidiques, hémolysés ou
contaminés peuvent causer de faux résultats; en conséquence, leur utilisation doit être évitée.
Collecte et Manipulation des Echantillons
Collecter les échantillons de sang de manière aseptique en utilisant les techniques approuvées de ponction veineuse par un personnel qualifié12. Laisser le sang
coaguler à température ambiante avant centrifugation. Transférer le sérum aseptiquement dans un récipient stérile hermétiquement fermé pour stockage entre 2 et
8°C. Si le test doit être retardé de plus de cinq jours, l'échantillon doit être congelé à –20°C ou moins. Des dommages dûs aux cycles de congélationdécongélation peuvent se produire si les échantillons sont conservés dans des congélateurs à dégivrage automatique. Décongeler et bien mélanger les échantillons
avant l'utilisation.
Prétraitement des Echantillons
Les anticorps IgG du sérum peuvent entrer en compétition avec les IgM résultant en faux négatifs. Des faux positifs peuvent résulter lorsque le facteur
rhumatoïde (IgG complexées) est présent dans l'échantillon. Par conséquent, le prétraitement du sérum est donc fortement recommandé afin d'éliminer les IgG
libres et complexées.
Préparer des dilutions au 1:20 des sérums de patients comme suit: mélanger 5µL de sérum de patient avec 95µL de Diluant de Prétraitement IgM dans des
microtubes ou une plaque de microtitration; et laisser au moins 5 minutes afin de laisser la réaction d'immunoprécipitation se produire. L'échantillon dilué peut
être utilisé tel quel, ou peut être centrifugé afin de clarifier le précipité du sérum. Le précipité n'interfèrera pas avec le test.
Afin de déterminer les points de titration, utiliser du PBS pour diluer en série la dilution du test prétraitée.
PROCEDURE DU TEST (Incubation à 37°C)
1.
2.
Sortir les Lames du réfrigérateur. Afin d'éviter la condensation, laisser les lames revenir à température ambiante avant d'ouvrir les sachets de lames.
Appliquer 20µL du Contrôle Décelable, tel qu’il est fourni (non-dilué), dans le puits approprié. Si un Contrôle de Lecture 1+ est désiré, utiliser du PBS
pour diluer le contrôle décelable (voir Contrôle de Qualité, ci-dessous). Appliquer 20µL de chaque dilution en série dans un puits approprié. Ne pas
prétraiter.
3. Appliquer 20µL du Contrôle Non-Décelable, tel qu’il est fourni, dans le puits approprié. Ne pas prétraiter.
4. Pour chaque échantillon de patient à tester, ajouter approximativement 20µL d'échantillon dilué (voir Prétraitement des Echantillons, ci-dessus) dans un
puits approprié. Annoter afin d'identifier chaque puits au moment de la lecture des résultats.
5. Incuber la(es) lame(s) dans une chambre humide pendant 90 ± 2 minutes entre 35 et 37°C.
6. Oter les lames de la chambre humide et rincer doucement chaque lame avec un filet de PBS. Ne pas diriger le filet de PBS directement sur les puits. Rincer
une rangée à la fois afin d'éviter le mélange des échantillons. Laver les lames en immergeant les lames rincées dans des cuves Coplin ou cuves à coloration
contenant du PBS pendant 10 minutes.
7. Tremper les lames lavées brièvement dans l'eau distillée ou purifiée, et laisser les lames sécher à l'air libre.
8. Ajouter approximativement 20µL du Conjugué IgM dans chaque puits.
9. Incuber les lames dans une chambre humide pendant 30 ± 2 minutes entre 35 et 37°C.
10. Répéter les étapes de lavage 6 et 7.
11. Placer quelques gouttes de Liquide de Montage sur la lame et couvrir avec une lamelle de 24 x 50mm. Oter les bulles d'air et l'excès de Liquide de
Montage avec du papier absorbant.
12. Observer les puits à l'agrandissement final 400 X avec un microscope à fluorescence approprié. Pour une fluorescence maximum, lire les lames le jour
même du test. Si cela n'est pas possible, stocker à l'obscurité entre 2 et 8°C pendant 24 heures maximum.
PROCEDURE DU TEST (Incubation à température ambiante)
1.
2.
3.
Sortir les Lames du réfrigérateur. Afin d'éviter la condensation, laisser les lames revenir à température ambiante avant d'ouvrir les sachets de lames.
Appliquer 20µL du Contrôle Décelable, tel qu’il est fourni (non-dilué), dans le puits approprié. Si un Contrôle de Lecture 1+ est désiré, utiliser du PBS
pour diluer le contrôle décelable (voir Contrôle de Qualité, ci-dessous). Appliquer 20µL de chaque dilution en série dans un puits approprié. Ne pas
prétraiter.
Appliquer 20µL du Contrôle Non-Décelable, tel qu’il est fourni, dans le puits approprié. Ne pas prétraiter.
IFA IgM Bartonella
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4.
Pour chaque échantillon de patient à tester, ajouter approximativement 20µL d'échantillon dilué (voir Prétraitement des Echantillons, ci-dessus) dans un
puits approprié. Annoter afin d'identifier chaque puits au moment de la lecture des résultats.
5. Incuber la/les lame(s) recouverte(s) pendant 90 ± 2 minutes à température ambiante.
6. Oter les lames de la chambre humide et rincer doucement chaque lame avec un filet de PBS. Ne pas diriger le filet de PBS directement sur les puits. Rincer
une rangée à la fois afin d'éviter le mélange des échantillons. Laver les lames en immergeant les lames rincées dans des cuves Coplin ou cuves à coloration
contenant du PBS pendant 10 minutes.
7. Tremper les lames lavées brièvement dans l'eau distillée ou purifiée, et laisser les lames sécher à l'air libre. Note: En cas d'utilisation d'un appareil
automatisant le processus de lavage, il pourrait ne pas être possible de laisser les lames sécher à l'air avant de leur ajouter le conjugué.
8. Ajouter approximativement 20µL du Conjugué IgM dans chaque puits.
9. Incuber les lames recouvertes pendant 30 ± 2 minutes à température ambiante.
10. Répéter les étapes de lavage 6 et 7.
11. Placer quelques gouttes de Liquide de Montage sur la lame et couvrir avec une lamelle de 24 x 50mm. Oter les bulles d'air et l'excès de Liquide de
Montage avec du papier absorbant.
12. Observer les puits à l'agrandissement final 400 X avec un microscope à fluorescence approprié. Pour une fluorescence maximum, lire les lames le jour
même du test. Si cela n'est pas possible, stocker à l'obscurité entre 2 et 8°C pendant 24 heures maximum.
CONTROLE DE QUALITE
Chaque test réalisé (une lame ou un groupe de lames) doit inclure à la fois un contrôle décelable et un contrôle non-décelable .
1.
Lorsqu'il est utilisé non dilué (tel qu'il est fourni) le Contrôle décelable doit présenter une fluorescence de 3 à 4+ sur les deux dépôts d'antigènes de B.
quintana et B. henselae.
2. Si un Contrôle de Lecture 1+ est désiré, diluer le Contrôle décelable (voir Procédure du Test, ci-dessus) au 1:8 et lire contre B. quintana. En raison des
conditions variables de laboratoire, y compris l'équipement, le Contrôle de Lecture 1+ peut varier d'un facteur de dilution de deux.
3. Le Contrôle non-décelable doit présenter une réactivité négligeable avec tous les dépôts.
Si les contrôles ne fournissent pas ces résultats, les résultats des tests de patients doivent être considérés comme invalides et le test répété.
INTERPRETATION DES RESULTATS DU TEST
L'optique du microscope, l'état et le type de la source de lumière détermineront l'intensité de la fluorescence et le point de titration. Lire les contrôles d'abord pour
chaque test afin d'assurer une interprétation correcte.
Lecture des Lames
Lire l'intensité de fluorescence des bactéries, et évaluer la fluorescence comme suit:
2 à 4+
1+
Négative
Fluorescence modérée à intense vert-pomme.
Fluorescence certaine mais faible équivalente à celle observée pour le Contrôle Décelable au point de titration de référence.
Pas de fluorescence ou fluorescence égale à celle observée dans le puits du Contrôle Non-Décelable .
Interprétation des Résultats d'Echantillons de Patients
La réciproque de la plus haute dilution de sérum donnant une fluorescence vert-pomme définie (1+) est appelée le point de titration du sérum.
≥1:20
<1:20
Les points de titration d'IgM de 1:20 ou plus sont indicatifs d'une infection récente ou en cours. La réponse IgM est spécifique d'espèce, bien
qu'une réactivité croisée de genre soit occasionnellement détectée.
Les points de titration d'IgM de moins de 1:20 suggèrent que le patient n'a pas d'infection en cours. Ceci peut s'observer soit chez les patients qui
n'ont pas d'antécédents d'infection à Bartonella soit chez ceux ayant une infection passée dont les taux d'anticorps ont chuté en deçà des taux
détectables.
Fluorescence non Spécifique
Occasionellement, un échantillon peut réagir avec le sac vitellin diluant. Lorsque cela se produit, le test n'est pas interprétable, si le titre anti-sac vitellin est égal
ou plus fort que le titre anti-Bartonella. Continuer à examiner toutes les dilutions de patients. Si le titre anti-sac vitellin est plus fort ou égal au titre antiBartonella, le résultat est invalidé.
LIMITATIONS
1.
2.
3.
Le titre anti-Bartonella est généralement détecté pendant la phase aiguë de la maladie. Il est essentiel que tous les résultats des sérologies Bartonella
corrèlent avec les antécédents cliniques et les autres données dont dispose le médecin.
L'optique du microscope, la condition et le type de la source de lumière détermineront l'intensité globale de fluorescence et les points de titration. Lire les
puits contrôles d'abord au cours de chaque test pour assurer une interprétation correcte.
Les échantillons obtenus trop tôt au cours de l'infection primaire peuvent ne pas contenir d'anticorps détectables. Si une infection à Bartonella est suspectée,
un deuxième échantillon doit être obtenu 10 à 21 jours plus tard et testé en parallèle avec l'échantillon original.
VALEURS ATTENDUES
Les anticorps IgM sont rarement observés dans la population normale8.
Characteristics d'exécution
Pour les clients hors des États-Unis, le characteristics d'exécution de produit est fourni comme une feuille séparée.
REFERENCES
1.
2.
3.
4.
5.
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Rev. K
Date de rédaction: 17 octobre 2016
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