2009

Résumé
Dans cette expérience, nous nous sommes familiarisées avec la spectrophotométrie
d’absorption moléculaire (UV-Visible) à l’aide de la molécule de pyridoxine.
Introduction
La première partie de cette expérience consiste à déterminer les paramètres
analytiques λ et ε. Ensuite, la deuxième partie consiste à déterminer la constante
d’équilibre acide base Kab1 de la pyridoxine dans l’équilibre ci-dessous :
OH
HO
OH
OH
N
+
H
Forme acide
Kab1
-O
OH
OH
+
N
O
OH
N
H
Forme neutre
Forme basique
Finalement, la dernière partie consiste à déterminer la quantité de pyridoxine dans
un échantillon pharmaceutique de vitamine B6.
Page 1
Méthodologie
Détermination de la constante d'acidité:
7 solutions tampons ont été préparées de la manière suivante :
Solutions
tampons
Volume
total
préparé
[mL]
pH
Volume de
Na2HPO4 0.2M
[mL]
Volume
d’acide
citrique 0.1M
[mL]
1
100
2.2
30
1470
2
100
3
20.55
79.5
3
100
3.6
32.2
67.8
4
100
4.4
44.1
55.9
5
100
5
51.5
48.5
6
100
5.6
58
42
7
100
6.6
72.75
27.25
Page 2
Nous avons ensuite préparer des solutions de 50 ml de pyridoxine d’une
concentration de 10-4 M dans chacun des tampons ci-dessus.
10−4 M
V  pyridoxine−3
M
=
⋅50 ml= 5 ml .
10
10−3 M
Le volume de tampon est donc égal à : 50 ml- 5 ml= 45 ml.
Au moyen du pH-mètre correctement étalonné, nous avons alors contrôlé le pH
exact de chacune des solutions.
La solution tampon de pH4.4 a été utilisée comme blanc puis les absorbances des
solutions 1 et 7 ont été mesurées afin de déterminer les longueurs d’onde
analytiques λ1 et λ2 correspondant au maximum d’absorbance de la forme acide et
de la forme neutre de la pyridoxine.
Nous allons donc pouvoir déterminer les coefficients d’extinctions molaires grâce
aux spectres du pH le plus faible et du pH le plus fort. En effet, au pH le plus faible
réside la forme acide de la pyridoxine et au pH le plus fort réside la forme neutre de
cette molécule.
Dosage
quantitatif
pharmaceutique :
de
la
pyridoxine
dans
une
préparation
6 solutions étalons de 25mL contenant des concentrations croissantes de pyridoxine
ont été préparées : 10-5, 2.10-5, 4.10-5, 6.10-5, 8.10-5, 10-4.
Les absorbances ont été ainsi mesurées.
3 tablettes de vitamine B6 préalablement pesées ont été broyées puis dissoutes
chacune dans 50mL de tampon. Après filtration, les solutions ont été complétées à
250mL avec le tampon.
Les absorbances de ces solutions ont été mesurées.
tablette
A
B
C
Masse de la pastille
entière [g]
0.1943
0.1968
0.1919
Page 3
Masse de la pastille
broyée [g]
0.192
0.1942
0.1909
Résultats
Détermination des paramètres analytiques :
Solution
pH
1
1,55
2
2,5
3
3,16
4
3,97
5
4,64
6
5,24
7
6,4
A l’aide du spectre d’absorption des solutions de pH 1.55 et 6.6, on a pu déterminer
les longueurs d’onde judicieuses pour déterminer la constante d’équilibre K1.
La loi de Lambert-Beer sous sa forme additive s’écrit :
A λ = l (ε 1λ C1 + ε 2λ C 2 )
Avec
ε le coefficient d’extinction molaire de l’espèce i [l.cm-1mol-1]
Ci la concentration [mol/l]
On considère qu’à pH 1.55, il y a 100% de forme acide, on va donc calculer le
coefficient d’extinction molaire de la forme acide (εRH2+) d’après l’absorbance
mesurer.
Page 4
À pH 6.6, il y a 100% de la forme neutre.
λ nm
A(acide)
A(neutre)
ε(acide)
ε(neutre)
291
0,8121
0,6979
8453
2112
324
0
0,22
45
6979
On calcul ε avec la formule : ε = A/(l*C)
Sur le spectre d’absorption, on peut voir les deux points isobestiques, il s’agit des
intersections. A ces points l’absorbance des deux espèces est la même et ne dépend
pas du pH de la solution.
Détermination de la constante acide- base Kab1 :
Méthode 1
D’après la loi de Lambert-Beer :
On trouve [ Neutre ]=
 A 324⋅ε
291
291
291
291
A 291 =l  ε 291
acideC acideε neutreC neutre 
324
324
324
A 324 =l  ε 324
acideC acideε neutre C neutre
Acide
A 291 ε
− A 291⋅ε
324
neutre
Neutre
− A 324 ε
K 1ab=
Loi d’action de masse de Kab1 :
324
291
[ Acide ]
neutre
[ neutre ][ H  ] [ neutre ]10− pH
=
[ acide ]
[ acide ]

K 1ab=
A 324⋅ε
A
291
ε
291
324
Acide
− A 291⋅ε
neutre
−A
Page 5
324
ε
324
291
Neutre
neutre

10− pH
On calcul Kab1 pour chaque solution :
pH
Absorbance
291nm
Absorbance
324nm
[RH] M
[RH2] M
Kab1
[H+] M
pKa
2,5
0,8352
0,0195
2,16E-06
9,78E-05
6,98E-05
3,16E-03
4,16
3,16
0,8094
0,031
3,83E-06
9,62E-05
2,76E-05
6,92E-04
4,56
3,97
0,6963
0,1522
2,13E-05
7,87E-05
2,90E-05
1,07E-04
4,54
4,64
0,4972
0,346
4,93E-05
5,07E-05
2,23E-05
2,29E-05
4,65
5,24
0,3438
0,5464
7,82E-05
2,18E-05
2,06E-05
5,75E-06
4,69
Moyenne
4,52
Ecart
type
0,21
Méthode 2
[
Bilan de masse : ctot = AH 2
+
] + [ AH ] + [ A ]
−
[
Si on considère que [A-] est négligeable, on a ctot = AH 2
+
] + [ AH ]
[ AH ]
[ AH 2 ]
L’équation de Henderson-Hasselbalch donne :
A− A AH 2
[ AH ]
log
=log
A AH − A
[ AH 2 ]
pH = pKalog
Avec le graphique du log
A − AAH 2 +
en fonction du pH, on peut trouver la pKa.
AAH − A
Page 6
Pour λ=324nm
1.1
pH
Absorbanc
e 324nm
log((A-Aacide/
(Aneutre-A))
2,5
0,0195
-1,655
3,16
0,031
-1,401
3,97
0,1522
-0,568
4,64
0,346
-0,013
5,24
0,5464
0,554
1,55
0,0045
6,4
0,6979
111nm
log
1.1
-1.1
a
b
- 1 .1
=-1 .1111 ± 1 .11
=1 .11111 ± 1 .1111
-1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
pH
Page 7
1.1
1.1
pKa
4,6409
Erreur
0,4204
Ka
2,286E-05
Pour λ=291nm
pH
Absorbanc
e 291nm
log((A-Aacide/
(Aneutre-A))
2,5
0,8121
-1,25766412
3,16
0,8094
-1,22175196
3,97
0,6963
-0,51264500
6
4,64
0,4972
0,08533799
5,24
0,3438
0,57772741
3
1,55
0,8453
6,4
0,2112
0.5
291nm
log
0.0
-0.5
a
b
-1.0
2.5
3.0
3.5
4.0
pH
Page 8
=-3.255 ± 0.353
=0.71481 ± 0.0878
4.5
5.0
pKa
4,55372132
1
Erreur
1,67060718
3
Ka
2,79434E-05
On constate que l’erreur est grande, cela vient du fait qu’à 291nm on ne peut pas
considérer que la forme neutre n’absorbe pas.
Méthode 3
Cette méthode est graphique, on fait un diagramme de spéciation
1 .1
111 nm
Absorbance
1 .1
1.1
1.1
111nm
1.1
1
1
1
pH
1
1
On trouve pKa est environ égal à 4.85. Cette méthode est la plus rapide mais il y a
une imprécision à cause de la lecture graphique du résultat.
La valeur théorique de pKa est de 4.69. Donc toute les valeurs trouver sont proches,
les trois méthode sont donc efficaces.
Page 9
Dosage quantitatif de la pyridoxine dans une préparation
pharmaceutique :
Courbe de calibrage :
1.1
Absorption
1 .1
1 .1
1 .1
Coefficient values ± one standard deviation
a
=1 .111111 ± 1 .1111
b
=1111.1 ± 111
1 .1
1.1
1
11
11
11
Concentration M
11
-1
111x11
A partir de l’équation de la régression linéaire, on peut déterminer la concentration
de pyridoxine. Il s’agit d’un étalonnage externe.
Echantillon
Masse g
Absorbanc
e
Concentratio
nM
masse
pyridoxyne
g
m
pyridoxyne/mass
e tablette
0,188720722
1
0,1943
0,716
0,000713082
0,03666843
6
2
0,1968
0,6821
0,000678234
0,03487650
9
0,177218034
0,000662713
0,03407833
5
0,177583819
3
0,1919
0,667
L’intervalle de confiance (μ) à 95% se calcul d’après la formule : µ= X ±2σ( X )
Page 10
Moyenne g
0,03521
Ecart type
0,00133
Intervalle
de
confiance à
95%
0,00153
Théorique
40mg
La valeur expérimentale est un peu en dessous de la valeur théorique. Mais
l’intervalle de confiance et l’écart type sont bas. Nos résultats sont convenables.
Méthode des additions connus (étalonnage interne):
Echantillon 3
a
=-0.021529 ± 0.0325
b
=0.00057751 ± 0.000107
Delta Absorption
0.25
0.20
0.15
Echantillon 1
a
=0.029605 ± 0.0164
b
=0.00039991 ± 5.4e-005
0.10
Echantillon 2
a
=0.00094286 ± 0.00215
b
=0.00032063 ± 7.11e-006
0.05
0.00
0
100
200
300
Volume pyridoxyne ajouté mL
400
500
Grâce aux absorbance on a pu tracer la droite d’étalonnage interne. On a déterminé
le volume ∆V correspondant à une absorbance de 0. Puis, en prenant en compte les
dilutions, nous avons pu calculer la masse de pyridoxine dans la tablette.
Page 11
Volume L
Mole
Masse g
Echantillon1 5,32E-07 1,90E-04
3,90E-02
Echantillon2 5,26E-07 1,88E-04
3,86E-02
Echantillon3 2,99E-07 1,07E-04
2,19E-02
Il y a eu probablement un problème avec le dernier échantillon car la courbe n’est
pas linéaire (grande erreur). Donc nous avons fait la moyenne sur les deux
premières mesures, on trouve 38.8mg.
Moyenne
g
3,88E-02
Ecart
type
0,0002857
Intervalle
de
confianc
e
0,0004040
3
La valeur théorique est plus proche de 38.8 mg que 35mg, on en déduit que
l’étalonnage interne est plus précis. De plus l’intervalle et l’écart type sont plus
petits pour l’étalonnage interne.
Conclusion
Dans cette expérience nous avons pu déterminer le pK de la pyridoxine selon
différentes méthodes.
La première méthode consiste à déterminer les concentrations de la forme acide et
celles de la forme neutre en partant de la loi de Lambeer-Beer. Ceci est très
pratique et permet d'accéder à la concentration de l'inconnue avec très peu de
calculs.
La deuxième méthode consiste à tracer un graphique de l’absorbance en fonction
du pH pour les deux longueurs d’ondes maximale et minimale. Ceci est moins
Page 12
évidente à première vue, il faut se méfier des volumes ajoutés car une petite erreur
sur ces derniers se répercute directement sur les résultats.
Par la suite la concentration de la pyridoxine a été déterminée par une droite de
calibration externe puis interne (méthode des additions connus).
Ce travail pratique nous a donc montré quelques intérêts de l'absorption UV Visible
et les modes d’utilisations de cette méthode.
Annexes
[1] M. Borkovec. Lab journal of analytical chemistry II : Spectrophotométrie
d'absorption moléculaire. Etude et dosage de la vitamine B6, 2008
Page 13