Exercice de biochimie et biologie moléculaire

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Master – Pr Chap
Université Paul Sabatier - Faculté de Médecine de Toulouse-Purpan
Master 1ère année – Domaine Sciences de la Vie et de la Santé
Option Physiopathologie Cellulaire Intégrée et Physiopathologie
U.E. : « Biologie et Physiopathologie Moléculaires de la Cellule »
(Pr. Hugues Chap)
RAPPELS DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE
EXERCICE D’APPLICATION
Cet exercice est inspiré de la publication suivante :
Zheng, B., Chen, D., and Farquhar, G. (2000) MIR16, a putative membrane
glycerophosphodiester phosphodiesterase, interacts with RGS16. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
97, 3999-4004.
Les auteurs de ce travail s’intéressent à des protéines, parmi lesquelles RGS16, qui
modulent la transduction du signal par une famille de récepteurs membranaires couplés aux
protéines G. A l’aide d’une technique de clonage que nous décrirons plus loin dans le cours
sur la transcription (double hybride pour two-hybrid), ils ont isolé un ADNc qui code pour
une protéine interagissant avec RGS16 et appelée MIR16, pour Membrane Interacting
protein for RGS16. Les résultats sélectionnés de cette publication illustrent la caractérisation
de cet ADNc et de son produit MIR16.
1) Soit la Fig. 1 ci-dessous et sa légende :
Le commentaire suivant est proposé par les auteurs : «…The full length cDNA isolated from a
rat lung cDNA library encodes an ORF (open reading frame) of 331 aa with a calculated
molecular mass of 37 kDa and was later named MIR16 (Fig. 1).
Kyte-Doolittle analysis predicted that MIR16 contains two hydrophobic regions, one
at the N terminus (amino acids 8-45) and the other close to the C terminus (amino acids 243276 ; Fig. 1). The N-terminal hydrophobic region is a putative signal peptide (based on a
signal peptide prediction program), and the second hydrophobic region is a strong candidate
for a membrane-spanning region (based on MACVECTOR von Heijne helix transmembrane
prediction). Two putative N-glycosylation sites (-N-X-S/T-) were also found (Fig. 1) ».
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a) Qu’est-ce qu’un « full length cDNA » ?
b) Qu’est-ce qu’un « open reading frame » ?
c) Qu’est-ce qu’un « signal peptide » ?
d) Quest-ce qu’un « strong candidate for a membrane-spanning region » ?
e) Qu’est-ce qu’un site de N-glycosylation ?
f) L’adjectif « putatif » est utilisé 2 fois par les auteurs. Pourquoi ?
g) Quelles informations essentielles tirez-vous de ces résultats et de ces
commentaires ?
2) Soit la Fig. 2 et sa légende :
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Les commentaires des auteurs sont les suivants : « Human and mouse orthologs of
rMIR16, including an unknown gene from human chromosome 16, and several mouse and
human expressed sequence tags were identified from data-bases. Two expressed sequence tag
clones containing human and mouse orthologs of MIR16 were obtained from the American
Type Culture Collection and sequenced. The deduced human and mMIR16 amino acid
sequences showed 94 % and 99 %, respectively, overall similarity with rMIR16. A BLAST
search with the amino acid sequence of MIR16 indicated that MIR16 has significant
homology with GP-PDEs from E. coli and Haemophilus influenzae, suggesting that MIR16
may have GPE-PDE enzymatic activity. Up to now, no mammalian GP-PDE has been cloned.
From the alignment shown in Fig .2, it can be seen that the N-terminal region of MIR16
(amino acids 70-150) immediately after the putative signal peptide (amino acids 8-45) is
highly conserved (40-61 % similarity), suggesting that it may contain residues critical for
enzymatic activity, i.e. the catalytic cycle ».
L’abréviation GP-PDE signifie glycerophosphodiester phosphodiesterase, c’est-àdire une enzyme agissant sur des composés dérivés de la dégradation des phospholipides tels
que la glycérophosphorylcholine, selon la réaction suivante :
HO—CH2

HO—CH

O
||
CH3

+
CH2—O — P—O—CH2—CH2—N —CH3


−
O
CH3
+
H2 O
Glycérophosphocholine
HO—CH2

HO—CH
O

||
CH2—O — P—O—H

O−
+
Glycérol-3-phosphate
CH3

+
HO—CH2—CH2—N —CH3

CH3
Choline
Cette enzyme est connue depuis longtemps dans des bactéries, telles qu’Escherichia
coli, où son gène a été cloné. Elle permet à la bactérie de récupérer des substrats énergétiques
tels que le glycérol (après déphosphorylation du glycérol-3-phosphate). Une activité de ce
type a été caractérisée chez les mammifères, y compris l’homme, en particulier dans le
cerveau et le rein. Chez les mammifères, il a été proposé qu’elle puisse également servir à
récupérer la choline.
a) Qu’est-ce qu’un gène orthologue ?
b) Qu’est-ce qu’un EST (expressed sequence tag) ?
c) Qu’est-ce qu’une recherche de type BLAST ?
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d) Quelle est la conclusion essentielle tirée par les auteurs de la Fig. 2 et des
données contenues dans les commentaires correspondants ?
e) Sur la base des résultats présentés, les auteurs n’ont manifestement pas la
preuve formelle que la protéine MIR16 possède une activité GP-PDE ? Quelle
expérience suggérez-vous pour le démontrer ?
f) Supposons que la réponse à la question (e) soit positive. Pouvez-vous
commenter comment un ADNc peut être isolé de manière fortuite ? Quelle démarche
aurait dû être entreprise pour cloner l’ADNc codant pour une GP-PDE par un
chercheur, par exemple un neurobiologiste, s’intéressant à la GP-PDE du cerveau ?
Pourquoi un neurobiologiste s’intéresserait-il à une GP-PDE ?
3) Soit la Fig. 3 et sa légende :
Commentez les résultats présentés en donnant les grands principes des opérations
effectuées.
4) Les expériences suivantes ont été réalisées à l’aide de deux anticorps dont la
description est donnée ci-dessous.
Antibodies : « MIR16 cDNA fragment (amino acids 46-331) was subcloned into the pET28
vector (Novagen), and the resulting plasmid was transformed into E. coli. Recombinant
6xHis-tagged fusion protein was purified on Ni-NTA agarose beads (Qiagen) according to the
manufacturer’s instructions and used to immunize New Zealand White rabbits. IgG was
purified from antiserum by Affi-Gel Protein A agarose beads (Bio-Rad) according to the
manufacturer’s instructions. Monoclonal antibody 16B12 against the hemagglutinin (HA)
epitope was purchased from Babco.
Remarques : le vecteur pET28 est adapté à la préparation de protéines recombinantes en
fusion avec une étiquette de 6 résidus consécutifs d’Histidine placés en N- ou C-terminal.
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Cette courte séquence de 6 His a une bonne affinité pour certains complexes de Nickel (NiNTA), permettant une purification facile de la protéine par chromatographie d’affinité.
L’épitope HA est une courte séquence d’hémagglutinine introduite dans des protéines
recombinantes sous forme d’étiquette à l’aide de vecteurs plasmidiques appropriés.
Définissez les deux anticorps décrits ci-dessus en décrivant éventuellement les
grandes lignes de leur préparation.
5) Soit la Fig. 4 ci-dessous obtenue à l’issue du protocole suivant : « HEK293 cells were
transiently transfected with a pCDNA3 construct containing MIR16 with a C-terminal HA
tag. At 48 h after transfection, cells were lysed by sonication and centrifuged at 1000 x g for
10 min to eliminate nuclei. The postnuclear supernatant (PNS) was then centrifuged at
100 000 x g for 30 min in order to separate a P100 pellet from the supernatant (S100).
Proteins associated with each fraction were separated by SDS/PAGE and immunoblotted with
anti-HA IgG ».
PNS S100 P100
HA-MIR16
Quelle est votre conclusion ? Avec quelle donnée de la question 1 est-elle
compatible ? Proposez un schéma illustrant les orientations possibles de la protéine dans
la membrane. Comment pourriez-vous vérifier vos hypothèses ?
6) Dans la Fig. 5 ci-dessous, des cellules GC (lignée immortalisée de cellules hypophysaires
de rat couramment utilisée par les auteurs et exprimant MIR16) ont été mises en culture et
récupérées. La fraction P100 préparée comme nous l’avons décrit ci-dessus est ensuite
incubée 30 min à 37°C en absence ou en présence d’endoglycosidase H (Endo H), une
enzyme qui clive spécifiquement les liaisons entre les chaînes glucidiques et les résidus
d’asparagine (Asn ou N) impliqués dans la N-glycosylation des protéines. La Figure cidessous montre les résultats d’un « Western blot » obtenu avec l’anticorps polyclonal décrit
plus haut.
−
+
Endo H
43 kDa
37 kDa
Commentez ces résultats et donnez votre conclusion. Avec quelle donnée de la
question 1 est-elle compatible ?
7) En supposant que la lecture de cet article vous ait convaincu de l’intérêt
d’approfondir l’étude de MIR16, quel programme de recherche proposez-vous de
développer ?