D-Glucose - R

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D-Glucose - R

D-Glucose
BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM
Chimie alimentaire / Bio-analyses enzymatiques
METHODE UV
Pour la détermination du D-glucose dans les aliments et autres
matériaux
Pour usage in-vitro uniquement
Réf. 10 716 251 035
Coffret de réactifs pour environ 3 x 45 déterminations
Pour des recommandations sur la méthode et les procédures
d'utilisation, voir bibliographie (A2, B2, C2, D2)
Stocker à 2-8°C
Principe (réf. A1)
Le D-glucose est phosphorylé en glucose-6-phosphate (G-6-P) en
présence d'hexokinase (HK) et d'adénosine-5’-triphosphate (ATP) :
(1) D-glucose + ATP
HK > G-6-P + ADP
En présence de glucose-6-phosphate deshydrogénase (G6P-DH),
le glucose-6-phosphate est oxydé par le nicotinamide-adéninedinucléotide phosphate (NADP) en gluconate-6-phosphate. Il se
forme du nicotinamide-adénine-dinucléotide phosphate réduit
(NADPH) (2) :
G6P-DH > Gluconate-6-phosphate + NADPH
+
+H
La quantité de NADPH formée au cours de la réaction est
proportionnelle à la quantité de D-glucose. On la mesure par
l'augmentation de l'absorption à 334 nm, 340 nm, ou 365 nm.
(2) G-6-P + NADP
Pipeter dans les cuvettes
Blanc réactif
Échantillons
1,000 ml
1,000 ml
----
0,100 ml
2,000 ml
1,900 ml
Solution 1
Échantillon*
Eau bi-distillée
Mélanger**. Après env. 3 min, lire l'absorbance (A1) des solutions.
Déclencher la réaction par addition de :
Suspension 2
0,020 ml
0,020 ml
+
Mélanger**, attendre la fin de la réaction (env. 10 à 15 min.) et lire
l'absorbance (A2) des solutions
Si la réaction n'est pas terminée après 15 min, continuer à lire les
absorbances de 2 min en 2 min jusqu'à ce que l'augmentation
d’absorbance soit constante sur 2 min***.
Composition du coffret
*
1. Trois flacons n°1 contenant chacun env. 7,2 g de réactif en
poudre composé de : tampon triéthanolamine à pH 7,6 ; NADP
env. 110 mg ; ATP env. 260 mg ; sulfate de magnésium
Rincer la pipette ou l'embout de pipette avec la solution échantillon avant le
pipetage
**
Avec une spatule ou en agitant la cuve après l'avoir recouverte de paratilm®
(marque déposée de American Can Company, Greenwich, Ct. USA).
***
Une réaction non-spécifique peut avoir lieu de manière occasionnelle. Elle est
le plus souvent provoquée par le contenu de l'échantillon comme des
enzymes ou des colorants. Ces substances interférentes peuvent être
éliminées lors de la préparation des échantillons.
2. Trois flacons n°2 contenant chacun env. 1,1 ml de suspension
composée de : hexokinase env. 320 U ; Glucose-6-phosphate
déshydrogénase env. 160 U
3. Flacon n°3 contenant une solution de contrôle (standard) de
D-glucose (le contrôle n'est pas nécessaire pour le calcul des
résultats). Utiliser le contrôle sans le diluer (concentration sur
l'étiquette). Péremption: voir étiquette du coffret.
Préparation des solutions
1. Dissoudre le contenu d'un flacon 1 avec 45 ml d'eau
bi-distillée.
2. Utiliser le contenu d'un flacon 2 sans diluer.
Stabilité des solutions
Le contenu des flacons 1 est stable entre 2 et 8°C (voir péremption
du coffret). Après reconstitution, la solution 1 est stable 4 semaines
de +2 à +8°C ou 2 mois de -15 à -25°C. Ramener la solution 1 à
20-25°C avant utilisation.
Le contenu des flacons 2 est stable entre 2 et 8°C (voir péremption
du coffret).
Si l'on observe pour A2 des augmentations d'absorbance
constantes, extrapoler les absorbances au temps de l'addition de
la suspension 2 (HK/G6P-DH).
Déterminer les différences d’absorbances (A2 – A1) du blanc et des
échantillons. Déduire la différence d'absorbance du blanc de celle
des échantillons :
∆ Aglucose = (A2 – A1)Échantilllon – (A2 – A1)blanc
Les différences d'absorbance mesurées doivent être au moins
égales à 0,100 pour obtenir des résultats précis (voir les
paragraphes "1. Instructions pour la réalisation du test" et
"3. Sensibilité et limite de détection".)
Calcul des résultats
La formule générale pour le calcul des concentrations est la
suivante :
c
V x PM
=
x ∆A (g/l)
ε x d x v x 1000
Mode opératoire
SAS CAP 38 112 € - RC LYON B 399 135 425 (FGU 2010.01.04)
1
Longueur d'onde : 340 nm, Hg 365 nm ou Hg 334 nm
2
Cuvette :
1 cm de trajet optique
Température :
20-25°C
Volume final :
3,020 ml
Mesure :
Contre l'air (pas de cuvette dans le trajet
optique) ou contre l'eau
3
Échantillon :
1.0 – 100 µg de D-glucose par test
(dans 0,1 à 2,0 ml de volume échantillon).
V =
v =
PM =
d =
ε =
volume final (ml)
volume de l'essai (ml)
poids moléculaire de la substance à doser (g/mol)
trajet optique (cm)
coefficient d'absorption du NADH :
-1
-1
340 nm = 6,3 (I x mmole x cm )
-1
-1
Hg 365 nm = 3,4 (I x mmole x cm )
-1
-1
Hg 334 nm = 6,18 (I x mmole x cm )
On obtient pour le D-glucose :
1.
2.
3.
L'absorption maximale du NADH se situe à 340 nm. La mesure s'effectue à
340 nm avec un photomètre à spectre continu, et à 334 nm ou 365 nm avec
un photomètre à spectre discontinu.
A la place des cuves de verre, on peut utiliser des cuves en plastique à
usage unique.
Voir les instructions pour la réalisation du test.
c=
3,020 x 180,16
x ∆ A = 5,441 x ∆ A
ε x 1,00 x 0,100 x 1000
ε
(g D-glucose/l solution échantillon)
R-Biopharm France – 5A rue Claude Chappe - 69370 Saint-Didier-au-Mont-d’Or (France)
www.r-biopharm.com - Tél : +33 (0)4 78 64 32 00 - Fax : +33 (0)4 78 47 84 04 - Mail : [email protected]
1/4
D-Glucose
Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de
l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution F.
6. Reconnaissance des interférences dans les tests
Dans le cas d'échantillons solides ou semi-solides, effectuer le
calcul à partir des quantités pesées lors de la préparation :
Contenu
Glucose
CD-glucose [g/l échant]
=
x 100 [g/100 g]
poidséchant. [en g/l préparation]
1. Instructions pour la réalisation du test
La quantité de D-glucose dans la cuvette doit être comprise entre
2 µg et 100 µg (mesure à 365 nm) ou 1 µg et 50 µg (mesure à 340
ou 334 nm). Diluer l'échantillon de manière à ce que la
concentration en D-glucose se situe respectivement entre 0,15 et
1,0 g/l ou 0,08 et 0,5 g/l.
Tableau de dilution
Quantité estimée de D-glucose
par litre
340 ou 334 nm
365 nm
< 0,5 g/l
0,5 – 5,0 g/l
5,0 – 50 g/l
> 50 g/l
< 1,0 g/l
1,0 – 10,0 g/l
10,0 – 100 g/l
> 100 g/l
Dilution avec
de l’eau
--1+ 9
1 + 99
1 + 999
Facteur de
dilution F
1
10
100
1000
Si la différence d'absorbance mesurée (∆ A) est trop faible
(< 0,100), il est nécessaire de refaire la préparation d'échantillon
(augmenter la pesée initiale ou diluer moins), ou d'augmenter le
volume d'échantillon dans le test jusqu'à 2,0 ml. Le volume d'eau à
rajouter sera alors réduit de manière à obtenir le même volume
final dans les cuvettes du blanc et des échantillons. Tenir compte
du nouveau volume échantillon (v) pour le calcul.
2. Spécificité (réf. A 1)
Le test est spécifique du D-glucose.
Lors de l'analyse de D-glucose anhydre (PM de 180,16 g/mol) et
de D-glucose monohydrate (PM = 198,17 g/mol) achetés dans le
commerce, on obtient des résultats < 100 % car ces matériaux
absorbent l'humidité.
6.1 Si la conversion du D-glucose a été réalisée entièrement dans
le temps défini par la procédure, on peut conclure de façon
générale qu'il n'y a pas d'interférence.
6.2 Après la fin de la réaction, le test peut être redémarré en en
ajoutant du D-glucose (qualitativement ou quantitativement) : si
l'absorbance est modifiée suite à l'ajout du standard, il s'agit
d'une indication supplémentaire comme quoi il n'y a pas eu
d'interférence.
6.3 Des erreurs dues à l'opérateur, ou bien dues à la présence de
substances inhibitrices dans l'échantillon, peuvent être mises
en évidence en testant deux volumes d'échantillon différents
(par ex. 0.100 et 0.200 ml) : les différences d'absorbance ∆ A
mesurées doivent être proportionnelles au volume d'échantillon
utilisé.
Si l'on teste des échantillons solides, il est recommandé de
peser différentes quantités (par ex. 1 g et 2 g) dans des
flacons
volumétriques
de
100 ml.
Les
différences
d'absorbances mesurées et le poids des échantillons doivent
être proportionnels pour un volume v identique dans le test.
6.4 Des interférences éventuelles dues aux échantillons peuvent
être reconnues en utilisant un standard interne comme
contrôle : en plus de l'échantillon, du blanc et du contrôle, on
peut tester l'échantillon et le standard simultanément dans le
même test. Le recouvrement est ensuite calculé à partir des
différences d'absorbances mesurées.
6.5 Des pertes éventuelles peuvent être reconnues en effectuant
des tests de recouvrement : l'échantillon doit être testé avec et
sans standard ajouté (standard interne). Le standard rajouté
doit être retrouvé quantitativement dans les limites de la
méthode.
7. Manipulation des réactifs
Les réactifs utilisés pour la détermination du D-glucose ne sont pas
dangereux pour la santé au sens des "Hazardous Substances
Regulations", de la directive européenne CE 67/548/EEC, ou de
leurs modifications, suppléments ou guides d'applications.
Néanmoins, il faut appliquer les précautions habituelles pour la
manipulation de substances chimiques.
Après utilisation, les réactifs doivent être éliminés comme déchets
de laboratoire en respectant les règlements en vigueur localement.
Les emballages peuvent être recyclés.
3. Sensibilité et limite de détection
La plus petite différence d'absorbance mesurable est de 0,005 (A).
Ceci correspond, pour un volume d'échantillon maximum
v = 2,000 ml et une mesure à 340 nm, à une concentration en
D-glucose de 0,2 mg/l (si v = 0,100 ml, ceci correspond à 4 mg/l).
La limite inférieure de détection de 0,4 mg/l est calculée à partir de
∆ A = 0,010 (mesuré à 340 nm) et d'un volume d'échantillon
maximum v = 2,000 ml.
8. Informations générales sur la préparation des
échantillons
Utiliser des échantillons clairs, transparents et au pH pratiquement
neutre tels quels, ou après une dilution effectuée selon la table de
dilution, avec un volume jusqu'à 2.000 ml.
Filtrer ou centrifuger les solutions troubles.
Eliminer le gaz carbonique des échantillons gazeux par agitation
ou filtration.
4. Linéarité
Ajuster les échantillons acides à env. pH 8 avec KOH ou NaOH.
Le test est linéaire de 1 µg de D-glucose par test (soit 0,4 mg/l
pour v = 2,000 ml) jusqu'à 100 µg de D-glucose par test (soit 1 g/l
pour v = 0,100 ml).
Ajuster les échantillons acides et faiblement colorés à env. pH 8
avec KOH ou NaOH et incuber pendant env. 15 min.
5. Précision
Si l'on teste un échantillon en double, on peut observer une
différence de 0,005 à 0,010 (A). Avec un volume v = 100 µl et une
mesure à 340 nm, ceci correspond à une concentration en
D-glucose de env. 4 à 8 mg/l. (Si l'échantillon est dilué durant la
préparation de l'échantillon, le résultat doit être multiplié par le
facteur F. Si l'échantillon est pesé lors de la préparation, par
exemple à 1 g / 100 ml = 10 g/l, on peut s'attendre à une différence
de 0,04 à 0,08 g / 100 g).
Les données suivantes ont été publiées dans la littérature:
(voir dans chaque coffret la fiche technique originale en anglais)
Mesurer les échantillons colorés (ajustés si nécessaire à
env. pH 8) contre un blanc échantillon (= tampon ou eau distillée
plus l'échantillon), ajuster le photomètre à 0,000 avec le blanc.
Les échantillons très colorés, lorsqu'ils sont testés sans dilution ou
avec un volume augmenté, doivent être décolorés avec du PVPP
(Polyvinyl Polypyrrolidon) ou avec du polyamide à raison de
1 g / 100 ml).
Broyer et homogénéiser les aliments solides ou pâteux. Après
extraction ou dissolution dans l’eau ; filtrer si nécessaire ou
éliminer la turbidité ou la coloration par une clarification de Carrez.
Déprotéiniser les échantillons contenant des protéines avec de
l'acide perchlorique ou par la clarification de Carrez
2/4
D-Glucose
Extraire les échantillons riches en matières grasses avec de l’eau
chaude (à une température supérieure au point de fusion des
graisses). Refroidir pour obtenir la séparation des graisses,
compléter avec de l’eau jusqu’à la marque. Conserver le flacon sur
de la glace ou au réfrigérateur pendant 15 min, éliminer la phase
lipidique et filtrer la phase aqueuse. On peut aussi, après
l'extraction, clarifier ces échantillons avec la réaction de Carrez.
Détermination des carbohydrates dans la bière
diabétiques (Glucose total après hydrolyze) (réf. A 2.4)
Clarification de Carrez :
Pipeter l’échantillon liquide dans une fiole jaugée de 100 ml
contenant environ 60 ml d’eau. Ou, peser une quantité suffisante
d’échantillon solide ou pâteux dans une fiole jaugée de 100 ml et
ajouter environ 60 ml d’eau. Ensuite, ajouter 5 ml de solution I de
Carrez (hexacyanoferrate-II de potassium; 85 mM = 3,60 g
K4[Fe(CN)6] x 3H2O/100 ml), puis 5 ml de solution II de Carrez
(sulfate de zinc heptahydrate; 250 mM = 7,2 g ZnSO4 x 7 H2O
/100 ml). Mélanger après chaque addition. Ajuster à un pH de 7,5
à 8,5 en ajoutant par exemple 10 ml de NaOH (0,1 M). Compléter
jusqu’à la marque, mélanger et filtrer.
Les échantillons contenant des protéines ne peuvent être
déprotéinisés à l'acide perchlorique ou trichloro-acétique que
s'ils ne contiennent pas de sucrose ou de maltose, car ces
disaccharides sont partiellement ou totalement hydrolysés
lors du traitement acide, ce qui libère du D-glucose. La
clarification de Carrez est la méthode généralement
recommandée.
9. Exemples d'applications
Détermination du D-glucose dans le lait
Introduire 20 ml de lait dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter
10 ml solution I de Carrez (voir point 8), 10 ml de solution II de
Carrez (voir point 8) et 20 ml d'hydroxyde de sodium (0,1 mol/I) en
agitant vigoureusement après chaque adjonction. Compléter
jusqu'à la marque avec de l'eau distillée, mélanger et filtrer. Utiliser
1 ou 2 ml du filtrat comme échantillon.
pour
Mélanger 300 à 500 ml de bière pour éliminer le gaz carbonique et
filtrer à travers un filtre plissé. Transférer 50 ml dans un flacon de
250 ml ajouter 10 ml d'HCl (25%; d = 1,125) et 50 ml d'eau, faire
bouillir 3 h sous reflux dans un bain-marie en ébullition. Ramener à
20-25°C, ajuster à env. pH 6-7 en rajoutant NaOH (5M). Transférer
dans un flacon volumétrique de 250 ml, remplir à la marque avec
de l'eau bi-distillée, mélanger et filtrer. Utiliser le filtrat comme
échantillon, après dilution au 1:10 (1+9) avec de l'eau bi-distillée.
Détermination du D-glucose dans la levure boulangère, les
épices et les mélanges de sel
Peser avec précision l'échantillon dans un flacon volumétrique et
dissoudre dans de l'eau, ou extraire si nécessaire pendant 30 min
à 60-70°C. Clarifier par la méthode de Carrez. Utiliser la solution
comme échantillon, en suivant le tableau de dilution si nécessaire.
10. Autres applications
La méthode peut aussi être utilisée pour analyser des produits
cosmétiques (réf. B 3.10), des produits pharmaceutiques
(réf. B 3.6), le papier (réf. D 2.2) et le tabac (réf. C 3.7), ou en
recherche pour l'analyse d'échantillons biologiques. Pour plus
d'informations concernant la stabilité et le traitement des
échantillons, consulter les références A 1.1 et A 1.2.
Détermination du D-Glucose dans les milieux de fermentation
et de culture
Placer l'échantillon (si nécessaire après centrifugation) dans un
bain-marie à 80°C pendant 15 minutes pour bloquer les réactions
enzymatiques. Centrifuger et utiliser le surnageant (diluer selon le
tableau de dilution si nécessaire) pour l'essai. Il est possible
d'effectuer une déprotéinisation avec les réactifs de Carrez, ou
avec l'acide perchlorique en absence de disaccharides (voir les
exemples mentionnés ci-dessus).
Homogénéiser les milieux à base de gélatine avec de l'eau et
traiter ensuite comme décrit
11. Bibliographie
Voir dans chaque coffret la fiche technique originale en anglais.
3/4
Solution de contrôle de D-glucose (flacon 3)
Concentration* : voir étiquette sur le flacon
3. Standard interne
La solution de contrôle D-glucose est une solution aqueuse
stabilisée contenant du D-glucose. Elle sert de contrôle qualité lors
de la détermination par voie enzymatique du D-glucose dans des
échantillons alimentaires.
La solution de contrôle peut être utilisée comme standard interne
pour valider la réalisation du test (pas d'erreurs majeures) et pour
vérifier l'absence d'inhibiteurs dans un échantillon donné:
Applications:
1. Utilisation de la solution de contrôle comme témoin (contrôle
qualité)
Dans le mode opératoire décrit plus haut, on teste la solution de
contrôle comme échantillon témoin (0,100 ml de solution de
contrôle D-glucose).
2. Redémarrage de la réaction
Lorsque la réaction d'un échantillon est terminée et que la mesure
A2 a été effectuée, rajouter 0,050 ml de solution de contrôle dans
la cuvette. Lire l'absorbance A3 après la fin de la réaction
(env. 15 min). Calculer la concentration à partir de la différence
(A3 – A2) d'après la formule générale de calcul (loi de BeerLambert). Attention de bien prendre en compte les volumes
modifiés dans le calcul. A cause de l'effet de dilution provoqué par
le rajout, la valeur trouvée diffère de la valeur cible indiquée sur le
flacon, mais de manière insignifiante.
Pipeter dans les
cuvettes
Blanc
solution 1
échantillon
contrôle (3)
eau bi-distillée
1,000 ml
2,000 ml
Échantillon
Standard
Échantillon
+ standard
1,000 ml
0,100 ml
1,900 ml
1,000 ml
0,100 ml
1,900 ml
1,000 ml
0,050 ml
0,050 ml
1,900 ml
Mélanger puis lire les absorbances A1 après env. 3 min. Continuer
comme décrit plus haut dans le "mode opératoire", en tenant compte
des remarques indiquées. Suivre aussi les instructions contenues
dans le paragraphe "1. Instructions pour la réalisation du test".
Le recouvrement est calculé selon la formule suivante:
Recouvrement =
2 x ∆ A Échant.+ Standard – ∆ A Échant.
∆ A Standard
X 100 (%)
* Exprimé en D-glucose anhydre
4/4

D-Glucose - R

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