ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
Dossier de demande d'allocation de recherche pour la rentrée 2012
Laboratoire d'accueil:
UMR GDEC 1095 INRA-Université Blaise Pascal.
Directeur du laboratoire :
Thierry Langin
Directeur de thèse :
Mohamed Fouad Bouzidi
[email protected]
Co-Directeur de thèse :
Said Mouzeyar
[email protected]
Date d'obtention de l'HDR du Directeur de thèse :
09 juillet 2007
Date d'obtention de l'HDR du co-directeur :
17 décembre 2000
Titre de la thèse :
Analyse fonctionnelle d’une E3 ubiquitine ligase de type RING dans la régulation du
développement du grain de blé.
Exposé du sujet proposé :
Le blé tendre (Triticum aestivum) est un des aliments de base de l’alimentation humaine et animale, il
est également utilisé dans l’industrie. Cependant, la production mondiale actuelle se heurte à des
changements climatiques et à une demande accrue due à l’accroissement de la population mondiale.
Ainsi, la taille finale du grain de blé constitue une cible privilégiée des programmes de sélection
variétale.
Pendant son développement, le grain de blé passe par différents stades au cours desquels il y a mise
en place de différents tissus qui seront ensuite remplis par des composés de réserves protéiques et
amylacés (Nadaud et al., 2010). Ce processus de développement est finement régulé par un
ensemble de signaux et de facteurs protéiques tels que les facteurs de transcription ou des enzymes
particulières comme les E3 ubiquitine ligases. Ces dernières appartiennent à la voie de protéolyse
ciblée par le protéasome 26S ou la voie UPS. Cette voie conduit à l’ubiquitination spécifique de
régulateurs protéiques et à leur dégradation ensuite par le protéasome. La spécificité de la réaction
d’ubiquitination est assurée par l’enzyme E3 ligase.
Lors d’une analyse transcriptomique portant sur 11 stades de développement du grain de blé, allant
de 2 à 30 jours après fécondation, nous avons identifié 174 E3 ubiquitine ligases différentiellement
exprimées. Certaines de ces E3 ligases semblent s’exprimer préférentiellement dans l’albumen alors
que d’autres dans l’embryon (Capron et al., 2011). Lors de cette étude nous avons également identifié
126 gènes impliqués dans les voies hormonales différentiellement exprimés.
Grâce à ce travail, nous avons identifié et cloné la séquence complète de l’ADN complémentaire de
Ta.14264, une E3 ligase potentielle de type RING préférentiellement exprimée dans la phase de
remplissage du grain de blé. La protéine codée par Ta.14264 est très conservée parmi les espèces
(environ 70% d’homologie avec ARI8 (AT1G65430) d’Arabidopsis thaliana, et environ 80%
d’homologie avec Os04g0492100 d’Oryza sativa japonica). Bien qu’aucune de ces protéines n’ait fait
l’objet d’études approfondies, ARI8 est plus exprimée dans les phases tardives du développement de
la graine d’Arabidopsis et son interacteur potentiel serait la protéine AHK2 (Arabidopsis Histidine
Kinase 2) un récepteur des cytokinines (Dortay et al., 2008 J Proteome Res, 7:3649-60) qui serait
impliqué notamment dans la taille des grains (Heyl et al., 2012 Eur J Cell Biol. 91:246-56).
L’analyse in silico de la protéine codée par Ta.14264 met en évidence un domaine RBR (Ring
Between Ring fingers) composé des domaines N-RING, IBR et C-RING, où le domaine IBR faciliterait
et stabiliserait les interactions avec les enzymes E2 et les protéines cibles à ubiquitiner.
Actuellement, nous réalisons les tests d’interactions entre la protéine codée par Ta.14264 et quatre
E2 de blé disponibles dans le laboratoire, par la technique de double-hybride, ainsi que l’étude de la
localisation subcellulaire (dans un système hétérologue, l’épiderme de feuille de tabac). En parallèle,
l’identification de protéines cibles en utilisant la protéine codée par Ta.14264 comme appât est en
cours, par un criblage d’une banque double-hybride couvrant plusieurs stades de développement du
grain de blé, mise en place au laboratoire.
Afin de poursuivre ce travail, l’étudiant s’intéressera au cours de sa thèse à la caractérisation et à
l’analyse fonctionnelle de cette protéine au cours du développement du grain de blé.
Les objectifs de la thèse seront :
A – Caractérisation de la protéine Ta.14462 :
1) Confirmer l’activité E3 ligase de la protéine recombinante par un test in vitro d’autoubiquitination.
2) Confirmer les interactions entre la protéine codée par Ta.14264 et les protéines cibles in vitro,
par la technique du CO-IP et in planta, par la technique du BiFC.
B – Analyse fonctionnelle :
1) Déterminer la localisation génomique de Ta.14264 et mettre en évidence une éventuelle colocalisation avec des QTL de rendement connus chez le blé (poids de mille grains, taille du
grain ou teneur en protéines par exemple) en utilisant les panels disponibles dans notre UMR.
2) Déterminer la fonction du gène en utilisant la transgenèse chez le blé (inactivation par RNAi et
surexpression) dans la plateforme « Transgenèse blé » de notre UMR.
3) Déterminer la fonction du gène et des cibles protéiques identifiées (interacteurs) en utilisant
parallèlement la plante modèle (Brachypodium : transgenèse) et les collections de mutants
SALK d’A. thaliana et de blé, notamment la collection disponible dans notre UMR constituée
d’environ 4000 individus.
Le candidat travaillera dans l’UMR GDEC 1095 qui a eu la note globale A+ à la dernière évaluation
par l’AERES et dans l’équipe « ABC : Adaptation du Blé aux Contraintes abiotiques » qui a obtenu la
note globale A (A au bilan et A+ au projet). Il utilisera les techniques classiques de biologie
moléculaire (clonage, PCR, RT-qPCR,...), de biologie cellulaire (localisation tissulaire, subcellulaire et
BiFC) et d’analyse fonctionnelle chez les plantes (génétique d’association, caractérisation de mutants,
transgenèse…), mais également des techniques biochimiques telles que le crible de banques par
double-hybride ou la technique de CO-IP pour identifier des protéines cibles.
L’ensemble des résultats devrait conduire en fin de thèse à proposer un modèle fonctionnel impliquant
la protéine Ta.14462 et ses interacteurs dans le développement du grain de blé tendre.
Liste des 8 meilleures publications du Directeur de thèse de 2007 à 2011
1) Capron D., Mouzeyar S., Boulaflous A., Girousse C., Rustenholz C., Laugier C., Paux E., Bouzidi
M. F. “Transcriptional profile analysis of E3 ligase and hormone-related genes expressed during wheat
grain development.”
BMC plant biology sous presse
Impact factor: 4.09
2) Nadaud I., Girousse C., Debiton C., Chambon C., Bouzidi M. F., Martre P., Branlard G. (2010)
“Proteomic and morphological analysis of early stages of wheat grain development.”
Proteomics 10:2901-2910
Impact factor: 4.43
3) Radwan O., Bouzidi M. F., Mouzeyar S. (2011) “Molecular characterization of two types of
resistance in sunflower to Plasmopara halstedii, the causal agent of downy mildew.”
Phytopathology 101:970-979
Impact factor: 2.22
4) Bouzidi M. F., Parlange F., Nicolas P., Mouzeyar S. (2007). “Expressed Sequence Tags from
Plasmopara halstedii, an obligate parasite of sunflower.”
BMC Microbiology 7:110
Impact factor: 2.96
Publications soumises, en cours de révision :
5) Bednarek J., Boulaflous A., Girousse C., Ravel C., Tassy C., Barret P., Bouzidi M. F., Mouzeyar S.
“Downregulation of the TaGW2 gene by RNA interference results in decreased final grain dimensions
and weight in wheat.”
Plant Physiology
Impact factor: 7.016
6) Vincent J., Dai Z. W., Ravel C., Choulet F., Mouzeyar S., Bouzidi M. F., Agier M., Martre P.
“dbWFA: a web-based database for functional annotation of wheat transcripts.”
Bioinformatics
Impact factor: 4.877
Liste des 8 meilleures publications du Co-Directeur éventuel de 2007 à 2011
1) Capron D., Mouzeyar S., Boulaflous A., Girousse C., Rustenholz C., Laugier C., Paux E., Bouzidi
M. F. “Transcriptional profile analysis of E3 ligase and hormone-related genes expressed during wheat
grain development.”
BMC plant biology sous presse
Impact factor: 4.09
2) Radwan O., Bouzidi M. F., Mouzeyar S. (2011) “Molecular characterization of two types of
resistance in sunflower to Plasmopara halstedii, the causal agent of downy mildew.”
Phytopathology 101:970-979
Impact factor: 2.22
3) Bouzidi M. F., Parlange F., Nicolas P., Mouzeyar S. (2007) “Expressed Sequence Tags from
Plasmopara halstedii, an obligate parasite of sunflower.”
BMC Microbiology 7:110
Impact factor: 2.96
Publications soumises, en cours de révision :
4) Bednarek J., Boulaflous A., Girousse C., Ravel C., Tassy C., Barret P., Bouzidi M. F., Mouzeyar S.
“Downregulation of the TaGW2 gene by RNA interference results in decreased final grain dimensions
and weight in wheat.”
Plant Physiology
Impact factor: 7.016
5) Vincent J., Dai Z. W., Ravel C., Choulet F., Mouzeyar S., Bouzidi M. F., Agier M., Martre P.
“dbWFA: a web-based database for functional annotation of wheat transcripts.”
Bioinformatics
Impact factor: 4.877
Liste des thèses dirigées ou co-dirigées par le Directeur de thèse de 2007-2011
Direction : Delphine CAPRON, bourse Région Auvergne (thèse soutenue le 14 décembre 2011)
Co-direction : Julie BEDNAREK, bourse MENRT (soutenance prévue en septembre 2012)
Liste des publications issues de la thèse des étudiants mentionnés ci-dessus
- Capron D., Mouzeyar S., Boulaflous A., Girousse C., Rustenholz C., Laugier C., Paux E., Bouzidi
M. F. “Transcriptional profile analysis of E3 ligase and hormone-related genes expressed during wheat
grain development.”
BMC plant biology sous presse
Impact factor: 4.09
- Bednarek J., Boulaflous A., Girousse C., Ravel C., Tassy C., Barret P., Bouzidi M. F., Mouzeyar S.
“Downregulation of the TaGW2 gene by RNA interference results in decreased final grain dimensions
and weight in wheat.”
Soumis à Plant Physiology (en révision)
Impact factor: 7.016
Devenir des anciens étudiants mentionnés ci-dessus
Delphine Capron : retour dans son pays, la Belgique et recherche de Post-doc
Julie Bednarek : ATER en cours à l’Université Blaise Pascal (section 64)
Contrats obtenus pendant la période
- ANR : « investissements d’avenir » « BreedWheat ». Mouzeyar S. est coordinateur du WP2.3:
“Water use efficiency and heat stress tolerance to maintain yield”. Montant : 170 K€.
- Participation au consortium international « WYC : Wheat Yiel Consortium» pour l’augmentation du
rendement en blé coordonné par M. Reynolds (CIMMYT, Mexique).
UMR GDEC 1095 INRA – Université Blaise Pascal (T. Langin)
Directeur de thèse : M. Fouad Bouzidi (PR2 UBP), co-directeur Said Mouzeyar (PR2 UBP)
[email protected]
Analyse fonctionnelle d’une E3 ubiquitine ligase de type RING dans la régulation du
développement du grain de blé
Le développement du grain de blé passe par différents stades où il y a mise en place de différents
tissus qui seront ensuite remplis par des réserves protéiques et amylacés (Nadaud et al., 2010). Ce
processus de développement est régulé par un ensemble de facteurs protéiques tels que les E3
ubiquitine ligases. Ces dernières appartiennent à la voie Ubiquitine-Protéasome 26S qui conduit à
l’ubiquitination spécifique de protéines régulatrices et à leur dégradation. Lors d’une analyse
transcriptomique portant sur 11 stades de développement du grain de blé de 2 à 30 jours après
fécondation, nous avons identifié 174 E3 ubiquitine ligases différentiellement exprimées (Capron et
al., 2011). Un gène codant pour une E3 ligase de type RING a été trouvé différentiellement exprimé
pendant la phase de remplissage du grain. Cette protéine est très conservée chez plusieurs espèces.
Nous réalisons actuellement un criblage d’une banque double-hybride, en l’utilisant comme appât afin
d’identifier des protéines cibles susceptibles d’êtres ubiquitinées puis dégradées par le protéasome.
Afin de poursuivre ce travail, les objectifs de la thèse seront la caractérisation moléculaire et l’analyse
fonctionnelle de cette protéine E3 RING au cours du développement du grain de blé. L’ensemble des
résultats devrait conduire en fin de thèse à proposer un modèle fonctionnel impliquant cette E3 RING
et ses interacteurs.
Capron, et al. (2011). Transcriptional profile analysis of E3 ligase and hormone-related genes
expressed during wheat grain development. BMC plant biology in press.
Nadaud, et al. (2010). Proteomic and morphological analysis of early stages of wheat grain
development. Proteomics 10:2901-10.