Données actuelles sur l`analyse hormonale
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Données actuelles sur l`analyse hormonale
abc revue générale Ann Biol Clin 2009 ; 67 (5) : 493-504 Données actuelles sur l’analyse hormonale salivaire Current status of salivary hormone analysis M. Gröschl Department of Pediatrics, University of Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Germany Résumé. La salive offre une alternative non invasive et non traumatisante à l’utilisation du plasma et du sérum pour les dosages biologiques. Elle est une source largement acceptée d’échantillons pour le dosage des hormones stéroïdes, mais également de certaines amines et de peptides. Ces dernières années, de nombreuses publications ont décrit des dosages salivaires d’hormones dans des domaines cliniques variés ainsi qu’en recherche médicale. Cet article de synthèse fournit une vue d’ensemble des applications courantes du dosage salivaire d’hormones. Une description des différentes origines des hormones présentes dans la salive est suivie d’une revue détaillée des méthodes analytiques et des modes de prélèvement fiables de la salive. Différentes utilisations du dosage biologique des hormones salivaires sont décrites dans des domaines aussi variés que la psychiatrie, l’endocrinologie, la médecine du sport et la médecine vétérinaire. En effet, bien que la salive ne soit pas encore devenue une source usuelle d’échantillons pour les dosages hormonaux, elle s’est avérée être fiable et dans certains cas même supérieure à l’utilisation d’autres fluides biologiques. Néanmoins, des progrès sont encore nécessaires pour que cet échantillon biologique soit accepté par tous, en particulier par les cliniciens. Il convient de développer des outils analytiques spécifiques et standardisés, et d’établir des valeurs de référence pour les principaux biomarqueurs qui seront dosés au niveau salivaire ; l’analyse de transférabilité entre différentes méthodologies d’une part et les autres liquides biologiques d’autre part, est également à réaliser. La non compliance observée chez certains patients implique une stricte standardisation des procédures de recueil et des méthodes analytiques. doi: 10.1684/abc.2009.0357 Mots clés : salive, dosage biologique, hormone Article reçu le 13 octobre 2008, accepté le 18 mai 2009 Abstract. Saliva, which offers a noninvasive and stress-free alternative to plasma and serum, is a widely accepted sample source for analysis of steroids and also of certain amines and peptides. In recent years, numerous publications have described the use of salivary hormone analysis in many fields of clinical and basic research. This review provides an overview of the current applications of salivary hormone analysis. A description of the different of hormone entry into saliva is followed by a detailed description of analytical methods and approaches for reliable collection of saliva, including several interesting applications in diverse fields including psychiatry, stress research, clinical endocrinology, sport medicine, and veterinary medicine. Although saliva has not yet become a mainstream sample source for hormone analysis, Tirés à part : J.-L. Beaudeux Cet article a été traduit par J.-L. Beaudeux et D. Lamiable (Laboratoire de pharmacologietoxicologie, CHU de Reims) avec l’autorisation de l’AACC. L’AACC n’est pas responsable de la qualité de cette traduction. Les opinions exprimées dans ce texte sont celles des auteurs, et n’engagent ni l’AACC, ni le journal. Cet article a été repris de Clinical Chemistry sous la référence : Gröschl M. Current status of salivary hormone analysis. Clin Chem 2008 ; 54 : 1-11 avec l’accord de l’éditeur. Original copyright © 2008 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Pour citer cet article, indiquer la publication originale dans Clinical Chemistry. Pour toute correspondance : <[email protected]> Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 493 revue générale it has proven to be reliable and, in some cases, even superior to other body fluids. Nevertheless much effort will be required for this approach to receive acceptance over the long term, especially by clinicians. Such effort includes the development of specific and standardized analytical tools, the establishment of defined reference intervals, and implementation of round-robin trials. One major problem, the lack of compliance sometimes seen in outpatient saliva donors, requires strict standardization of both collection and analysis methods to achieve better comparability and assessment of published salivary hormone data. Key words: saliva, hormone, biological measurement L’utilisation de la salive comme échantillon biologique pour le dosage d’hormones est devenue de plus en plus intéressante pour les cliniciens et les chercheurs, car il s’agit d’une alternative non invasive et non traumatisante par rapport au prélèvement sanguin, fournissant habituellement le plasma et/ou le sérum qui sont les fluides usuels pour la détermination des biomarqueurs endocriniens tels que les hormones stéroïdes, les amines et les peptides. Durant ces quarante dernières années, les biologistes ont utilisé la salive comme prélèvement biologique annexe et peu courant. Les revues antérieures de Riad-Fahmy en 1982 [1] et de Lewis en 2006 [2] se sont attachées à l’analyse salivaire de nombreuses hormones stéroïdes, mais de nombreuses études ont également démontré que l’échantillon salivaire est une alternative intéressante pour l’analyse d’hormones non stéroïdiennes. Cette revue fournit une vue d’ensemble des méthodologies bien établies et de celles en perspective pour l’analyse salivaire d’hormones, et montre l’application de ces méthodes à des domaines aussi divers que la psychologie, l’endocrinologie, la fertilité, la médecine du sport et la recherche comportementale expérimentale. Principe du passage des hormones dans la salive La salive a des fonctions multiples y compris d’assurer l’humidification de la muqueuse de la sphère digestive supérieure, ce qui est indispensable pour la mastication et la déglutition des aliments. Des enzymes assurant une digestion initiale des nutriments, par exemple l’amylase, sont ainsi présentes au niveau salivaire. La salive participe également à la réaction immunologique locale, par la présence d’immunoglobulines A et de molécules peptidiques antibactériennes, dont l’action est d’inhiber la proliféra494 tion de la flore microbienne orale. Enfin, la salive contient de nombreuses molécules endogènes, notamment hormonales, qui soit proviennent de la circulation sanguine, soit sont synthétisées et sécrétées par les glandes salivaires elles-mêmes (figure 1). La vitesse de transfert des molécules hormonales de la circulation sanguine dans le liquide salivaire est régie par la diffusion à travers les couches lipidiques des capillaires et des cellules épithéliales glandulaires. Des molécules lipophiles telles que les hormones stéroïdes passent ces barrières beaucoup plus rapidement que les molécules hydrophiles telles que des peptides [3]. Il s’agit réellement d’une diffusion passive à travers la paroi capillaire, la membrane basale et les cellules acinaires, selon un gradient de concentration. Ainsi, les concentrations salivaires des hormones stéroïdes liposolubles non conjuguées telles que le cortisol reflètent les concentrations plasmatiques des mêmes formes non liées aux protéines plasmatiques (10 %), alors que les stéroïdes conjugués hydrophiles tels que le sulfate de déhydroépiandrostérone ne sont présents au niveau salivaire qu’à moins de 1 % de sa concentration plasmatique [4]. Les stéroïdes ne sont habituellement pas métabolisés en molécules plus polaires, hydrosolubles, par les glandes salivaires, à l’opposé de molécules excrétées par voie rénale. La salive est donc un milieu biologique préférable à l’urine pour une alternative non invasive de mesures des stéroïdes hormonaux. Une transformation significative de cortisol en cortisone au niveau des glandes salivaires par la 11β-hydroxystéroïde-deshydrogénase-II, entraîne néanmoins la transformation du cortisol en une forme cétonique inactive [5]. Cette transformation enzymatique est souvent sous-estimée lorsque le cortisol salivaire est mesuré, ce qui peut expliquer certaines discordances des concentrations de cortisol rapportées dans la littérature. Selon la réactivité croisée des anticorps utilisés dans les Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 Dosages hormonaux salivaires immunodosages, les résultats peuvent refléter non seulement les concentrations de cortisol mais également celles d’autres glucocorticoïdes aussi présents. Certaines hormones peptidiques telles que l’insuline [6] sont transportées activement dans la salive, alors que d’autres, notamment certaines cytokines [7, 8] sont produites par les glandes salivaires elles-mêmes. Des transporteurs spécifiques pour l’insuline sont présents dans la muqueuse buccale, comme cela a été démontré après application sublinguale de l’hormone chez des rats [9]. La sélectivité de ce transport actif est démontrée par le fait que l’insuline est présente dans la salive à des concentrations similaires aux concentrations plasmatiques après ingestion de glucose, mais le produit de clivage de l’insuline, le peptide C qui est de taille similaire, n’est pas présent dans la salive. Les peptides sécrétés par les glandes salivaires le sont par exocytose directe dans la lumière acinaire. Un transport actif existe également, ce qui pose des problèmes d’interprétation des concentrations salivaires des peptides qui ne sont pas toujours corrélées à leur concentration plasmatique comme c’était le cas pour les hormones stéroïdes. Pour certaines cytokines telles que le TNFα et la leptine, les concentrations salivaires apparaissent plus faibles que les concentrations plasmatiques [10, 11]. En fait, puisque les concentrations fréquentes au niveau salivaire de différents peptides hormonaux ne sont actuellement pas disponibles, l’évaluation de ces peptides au niveau salivaire est plus utilisée qualitativement comme marqueur de la présence de ces molécules dans différentes pathologies intéressant la sphère buccale (ou la sphère digestive haute) plutôt que comme une alternative non invasive au dosage plasmatique [12, 13]. Prélèvement et analyse de la salive Techniques de prélèvement Bien que le prélèvement sélectif de la salive d’une glande salivaire soit possible, soit par aspiration soit par canulation, la salive mélangée des glandes salivaires est en pratique la méthode utilisée en routine à la fois en recherche clinique et pour une activité de soin. Dans de nombreuses études, le prélèvement a été réalisé en demandant aux patients de cracher directement dans le récipient de prélèvement. Conjugué de stéroïdes et de l'amine Non conjugué de stéroïde et de l'amine Après conversion du stéroïde Capillaire Peptide de transport de sérum Peptide produit par les glandes salivaires Acini Tunnel de transport des protéines Enzyme de conversion de stéroïdes Expression et sécrétion Gaine striée Transport actif Difussion passive Ecoulement du sang Flux de salive Figure 1. Mécanismes de transport des hormones dans la salive. Les hormones stéroïdes conjuguées aux protéines de transport spécifiques pénètrent dans les glandes salivaires par diffusion passive (avec éventuellement une conversion enzymatique comme c’est le cas pour le cortisol qui est transformé en cortisone) ou active (insuline par exemple). Une expression par les glandes salivaires ellesmêmes a également été décrite (EGF). Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 495 revue générale La volonté de cracher est considérée comme un stimulus suffisant, produisant plus de 1 mL/min de salive, alors que le simple fait de baver est réputé fournir de la salive sans stimulation des glandes salivaires. Ce mode de prélèvement direct a différents inconvénients, en particulier une réticence culturelle de certains patients à cracher [14], particulièrement chez les patients en milieu gériatrique. De plus, une sécheresse buccale rend souvent très difficile le prélèvement salivaire, en particulier chez les sujets âgés [15]. Pour augmenter le flux salivaire, l’application d’acide citrique sur la langue a été fréquemment utilisée, induisant une sécrétion salivaire de 5 à 10 mL/min. Cependant l’utilisation de l’acide citrique peut induire des interférences avec les immunodosages en diminuant le pH de l’échantillon [16]. Finalement, dans la majorité des études, la salive est recueillie en utilisant un tissu absorbant placé à l’intérieur de la bouche, qui est ensuite centrifugé pour récupération du liquide salivaire. Dispositifs de prélèvement commerciaux Différents dispositifs de prélèvement de la salive ont été commercialisés, qui apparaissent tout à fait utilisables A pour les examens salivaires hormonaux. Bien sûr, il faut veiller à utiliser des matériels qui n’absorbent pas ou ne modifient pas les analytes à doser. Certaines matières telles que le Parafilm® [17] et le coton [18] sont connues pour absorber les molécules d’intérêt, conduisant à des concentrations faussement abaissées. A l’heure actuelle, les systèmes de prélèvement les plus utilisés sont : la Salivette® (Sarstedt, figure 2A), le Quantisal® (Immunalysis, figure 2B), et l’Intercept® (Orasure Technologies, figure 2C). Ces systèmes utilisent un tampon de prélèvement à insérer à l’intérieur de la bouche soit sous la langue, soit contre la joue. Ce tampon absorbant est conservé dans la bouche pendant une période fixe (en général 1 à 2 minutes) pour s’imprégner de la salive, puis il est transféré dans le récipient de stockage. Après centrifugation, la salive est récupérée. Ces systèmes commerciaux ont montré leur intérêt en fournissant des résultats reproductibles pour la majorité des hormones salivaires de nature stéroïdienne et peptidique [19]. Cependant, la version « coton » de la Salivette® doit définitivement être proscrite, en raison d’interférences avec de nombreux immunodosages. À l’opposé des systèmes que nous venons de décrire, le B 2 6 3 1 4 C 5 D 11 12 10 8 7 9 Figure 2. Dispositifs commerciaux de collection de la salive. A : trois versions du Salivette® avec des supports du polyester (1), polyéthylène (2), ou coton (3) et les tubes récipients. B : le Quantisal® se compose d’une garniture de cellulose (4) sur une tige en plastique avec une fenêtre (5) d’indication du volume d’échantillon. Un récipient témoin incluant le conservateur (6) fait partie du système. C : l’Intercept® se compose également d’une garniture de cellulose (7) sur une tige en plastique, le récipient du système ne contient pas de conservateur (8). D : le SCS® se compose d’une solution de rinçage de la bouche (9), d’une solution de collection (10), d’un récipient de collection (11), et d’une unité de conservation contenant le conservateur (poudre lyophilisée (12). 496 Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 Dosages hormonaux salivaires Saliva Collection System® (Greiner BioOne, figure 2D) utilise une procédure plus élaborée comprenant des liquides de rinçage et liquides de prélèvement. Les résultats analytiques obtenus avec ce système de prélèvement sont tout à fait comparables pour la majorité des hormones peptidiques et stéroïdiennes [19]. Méthodes analytiques pour le dosage des hormones dans la salive Aspect préanalytique L’analyse salivaire fiable exige le recueil, le stockage et la préparation des échantillons, ainsi que les procédures pour chacune de ces étapes bien définies, mais pouvant varier selon la molécule d’intérêt à doser. Les stéroïdes, en fonction de leur grande stabilité dans le fluide salivaire, posent le moins de problème. Les androgènes et glucocorticoïdes sont stables pendant plusieurs jours, même dans des échantillons maintenus à température ambiante, mais le stockage pour une période plus longue doit tout de même être proscrit [20]. L’addition d’agents conservateurs prolonge significativement la stabilité des stéroïdes salivaires [21], permettant ainsi l’envoi au laboratoire par voie postale, pour des patients non hospitalisés [22]. Le dosage de peptides salivaires ou d’amines telles que l’insuline [6] et la mélatonine [23] nécessite plus de précautions pour l’étape de prélèvement et l’étape de transfert au laboratoire. Les peptides ont tendance à s’absorber à la surface des tubes de prélèvement (de façon plus importante que les stéroïdes), et cette absorption entraîne une perte significative avant le dosage. De plus, la salive contient des enzymes protéolytiques qui peuvent dégrader rapidement les peptides [24], particulièrement les hormones à demie-vie brève telles que la ghréline [13]. La perte par absorption et/ou dégradation peut être prévenue par l’utilisation de tubes de prélèvement appropriés, de cryotubes à faible fixation des protéines pour le stockage, et par l’addition de conservateurs tels que l’EDTA. Méthodes immunologiques Les immunodosages ont été très largement utilisés pour l’analyse salivaire en raison de leur simplicité, du faible volume d’échantillon nécessaire (≤ 100 μL) et de leur bas niveau de détection analytique. Néanmoins, il convient d’être vigilant sur la spécificité de ces dosages qui ne sont pas forcément à même de différencier les hormones dont on désire le dosage et d’éventuels interférents (crossreactants) que l’on peut retrouver chez certains patients : (nouveau-nés, femmes enceintes) et dans certaines pathologies. Les premiers immunodosages développés pour l’analyse des hormones stéroïdes dans la salive étaient Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 des méthodologies de type « Elisa maison » utilisant des anticorps et des traceurs développés dans des laboratoires de recherche [25, 26] ou des adaptations de trousses commerciales RIA à la matrice salivaire [27]. Dans la majorité des cas, l’adaptation de trousses RIA commerciales incluait l’ajustement de la concentration protéique du tampon de la gamme d’étalonnage et la dilution des échantillons, permettant ainsi une meilleure précision des dosages. Ces méthodes RIA « ajustées » ne pouvaient cependant pas être utilisées pour l’analyse des peptides salivaires. La RIA a maintenant été complètement remplacée par des méthodes de type Elisa non radioactives. Différents fournisseurs de laboratoire (www.salimetrics.com ; www. drg-diagnostics.de ; www.dslabs.com) proposent des immunodosages agréés par la FDA pour des stéroïdes salivaires. Les immunodosages salivaires pour les hormones peptidiques et les facteurs de croissance semblent intéresser beaucoup moins ces fournisseurs de laboratoire. Ils sont pourtant d’importance dans le cadre de certaines pathologies, en particulier des pathologies tumorales de la sphère ORL [28-30]. Il est probable que les nouvelles méthodologies, utilisant des systèmes de type biopuce [31] ou des microbilles pourront très rapidement permettre le développement de dosages des hormones peptidiques salivaires. Méthodes chromatographiques La détection par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide a considérablement amélioré ces dernières années la spécificité et la sensibilité analytique des méthodes chromatographiques. Ces méthodes, basées sur la formation d’ions gazeux de la molécule ou de fragments spécifiques caractérisés et quantifiés par leur ratio masse/charge (m/z) ont été proposées pour deux applications distinctes. La première application, utilisée pour les échantillons salivaires, est la détection de nouveaux peptides ou protéines pouvant être identifiés par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF [32] ou de type SELDI-TOF [33]. Cette approche a été utilisée pour l’exploration du protéome salivaire, mais est essentiellement qualitative et la quantification des hormones détectées est en général très difficile. Une seconde application a été l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem pour la quantification des hormones stéroïdes [34, 35] et de petits peptides et amines ayant une masse moléculaire inférieure à 5 kD, tels que la ghréline [36] et la mélatonine [37]. Il semble que la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS-MS) pourrait pallier les problèmes analytiques et/ou méthodologiques rencontrés avec les immunodosages, et fournir un criblage complet de l’ensemble des composés hormonaux stéroïdiens d’un échantillon salivaire unique. 497 revue générale Applications actuelles de l’analyse hormonale et perspectives Les paragraphes suivants présentent les applications potentielles de l’analyse salivaire hormonale à la fois dans le contexte de recherche fondamentale et de recherche clinique. Certaines de ces analyses sont d’ores et déjà des outils pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique alors que d’autres sont en cours de développement. Applications dans le domaine de la recherche en psychologie et sur le stress Le cortisol, une des molécules les plus fréquemment étudiées dans la salive, est une hormone qui favorise la néoglucogenèse au cours d’un stress. Les effets indésirables liés au prélèvement d’échantillon biologique doivent être minimisés dans les études portant sur l’effet d’évènements générateurs de stress ou de variations d’humeur, tels que la dépression. C’est pourquoi l’utilisation du mode de prélèvement salivaire, non invasif, est particulièrement développée dans les recherches en psychologie [38]. Dans une grande palette d’études concernant le stress et l’endocrinologie, un consensus s’est établi indiquant que le cortisol salivaire augmente de façon très importante lors d’un stress chronique, comme chez des victimes d’un risque vital [39], chez les sujets socialement isolés ou économiquement défavorisés [40] et chez les patients souffrant de dépression [41]. Certaines études n’ont pas retrouvé cette augmentation du cortisol salivaire dans des situations de stress [42] ; ces résultats contradictoires peuvent avoir une explication physiologique ou pathologique. En particulier, la stricte standardisation des méthodes de prélèvement et la comparaison à des valeurs de référence établies apparaissent être beaucoup plus problématique dans les études portant sur des processus psychologiques que dans d’autres domaines médicaux. En particulier, le moment du prélèvement influe énormément sur la concentration salivaire du cortisol, en relation avec le rythme circadien de sécrétion de cette hormone. En outre, les effets des évènements stressants peuvent générer des variations importantes de la concentration salivaire du cortisol. Les études de stress sont souvent basées sur l’auto-évaluation par le patient de son stress, comparé aux dosages hormonaux salivaires. La compliance du patient est donc un problème important affectant la validité des résultats biologiques et de leur interprétation. Il semble que cette compliance du patient, en particulier dans le respect du temps de prélèvement, est fréquemment surestimée, notamment en l’absence d’un suivi objectif par un superviseur de l’étude [43]. L’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien est responsable de la réponse au stress chronique mais les marqueurs de stress aigu tels que les catécholamines sont dif498 ficilement dosables dans la salive en raison de leur faible concentration, de leur dégradation rapide [44], et de la difficulté de bloquer cette dégradation dans l’échantillon avant analyse. Cependant, d’autres substances cosécrétées avec les catécholamines peuvent être utilisées pour l’évaluation de l’activité adrénergique en raison de leur plus grande stabilité au niveau salivaire. En particulier, la chromogranine A (CgA), peptide de nature acide stocké dans la médullaire surrénalienne et colibéré avec les catécholamines est aujourd’hui considérée comme un marqueur d’intérêt de la réponse au stress aigu. La CgA salivaire augmente rapidement en réponse à un bruit prolongé [45] et décroît significativement chez les sujets soumis à un environnement non stressant [46]. Ces données font de la CgA salivaire un marqueur fiable de la mesure du stress aigu dans les études contrôlées. Un autre biomarqueur de l’activité adrénergique est l’α-amylase, qui bien que n’étant pas une hormone, montre un profil d’excrétion similaire à celui des catécholamines [47]. L’avantage de ce marqueur est que sa détermination est particulièrement facile et accessible à de nombreux laboratoires. Le cortisol salivaire, marqueur diagnostique du syndrome de Cushing Le dosage salivaire du cortisol est depuis longtemps une application diagnostique et validée du syndrome de Cushing (pour une revue récente voir [48]). Le syndrome de Cushing est un hypercortisolisme clinique causé par une augmentation pathologique de la sécrétion corticotropique par une tumeur de la glande pituitaire, une sécrétion ectopique de corticotropine ou une sécrétion excessive de cortisol indépendante de l’axe corticotrope. Une caractéristique du syndrome de Cushing, quelle qu’en soit son origine, est la disparition du rythme circadien de la sécrétion du cortisol. Contrairement au sujet sain, pour lequel une diminution de la cortisolémine est observée au cours de la journée [49], les patients atteints de syndrome de Cushing n’ont pas une telle diminution de la sécrétion de cortisol [50]. C’est pourquoi la mesure du cortisol le soir ou au cours de la nuit est un moyen simple de détection de cette pathologie [51]. Le diagnostic de l’hypercortisolisme endogène peut être réalisé sans le stress d’une hospitalisation par simple prélèvement de la salive au coucher du patient à son domicile par exemple, bien sûr dans des conditions standardisées. En 1985, Luthold a décrit pour la première fois l’utilisation du cortisol salivaire pour détecter le syndrome de Cushing [52]. Cette étude a été ultérieurement confirmée comme étant très performante dans le diagnostic de ce syndrome [53-55]. Néanmoins, les différentes présentations cliniques du syndrome de Cushing posent quelques limitations à ce dosage du cortisol salivaire nocturne, le Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 Dosages hormonaux salivaires plaçant plutôt comme un test complémentaire du cortisol urinaire des 24 heures que comme un test de remplacement [56]. Bien que cette maladie soit plus rare chez le sujet jeune que chez l’adulte, disposer d’un prélèvement salivaire non invasif et non traumatisant est particulièrement intéressant dans le domaine de la pédiatrie [57, 58]. Le cortisol salivaire peut également être un marqueur intéressant du syndrome de Cushing intermittent [59]. En raison de la facilité d’obtention de l’échantillon biologique, le sujet suspecté de syndrome de Cushing intermittent peut fournir plusieurs prélèvements, par exemple réalisés plusieurs jours de suite dans la soirée. Le matériel biologique salivaire est également très intéressant dans le cadre du test de freinage à la dexaméthasone [60, 61]. En conditions standardisées, une très grande reproductibilité a été observée pour le dosage du cortisol salivaire nocturne répété dans le cadre de ce test de freinage [62]. Les intervalles de prélèvement courts (15 minutes ou moins) sont particulièrement adaptés au prélèvement salivaire, permettant ainsi une plus grande pertinence du diagnostic de la maladie de Cushing par rapport à d’autres pathologies endocriniennes surrénaliennes [63]. Les stéroïdes salivaires dans le contrôle thérapeutique dans l’hyperplasie surrénalienne congénitale L’appréhension de la ponction veineuse chez les enfants a fait du prélèvement salivaire un échantillon biologique très intéressant en pédiatrie, bien que la salive ne puisse pas complètement remplacer d’autres échantillons biologiques pour l’intégralité des analyses hormonologiques. L’utilisation la plus fréquente de la salive dans ce domaine est l’évaluation de l’efficacité de la thérapeutique substitutive aux glucocorticoïdes chez des patients atteints d’hyperplasie surrénalienne congénitale. Dans cette pathologie, un blocage enzymatique génétique réduit la synthèse surrénalienne à la fois des glucocorticoïdes et des minéralocorticoïdes. Dans sa présentation la plus fréquente, générée par un déficit en 21-hydroxylase, un précurseur du cortisol, la 17 α-hydroxyprogestérone (17OHP) est présent en très fortes concentrations au niveau sanguin et dans la salive. La 17-OHP peut être mesurée de façon fiable dans des échantillons salivaires collectés au cours de la journée habituellement le matin, à mi-journée et le soir [64]. Ce profil salivaire est utilisé au même titre que l’excrétion urinaire des stéroïdes pour évaluer la qualité de la substitution thérapeutique, fournissant une information importante sur l’efficacité des régimes suppresseurs dans le traitement de l’hyperplasie surrénalienne congénitale, qui utilise le cortisol, l’acétate de cortisone, la prednisolone et la dexaméthasone comme thérapeutique de substitution [64]. L’hyperplasie surrénalienne congénitale induit également une augmentation de la sécrétion Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 surrénalienne des androgènes, conduisant à la virilisation des sujets féminins. En complément de la 17-OHP, le dosage salivaire de l’androstènedione est un marqueur de l’efficacité de thérapeutique, bien que son utilisation en pratique clinique soit moins bien répandue [65]. Encore une fois l’intérêt de l’échantillon salivaire est la facilité d’obtention, particulièrement à domicile, et la possibilité de faire des prélèvements répétés. Enfin, une dernière application des dosages salivaires dans ce domaine est le suivi cinétique après l’administration orale de glucocorticoïdes [66] pour l’ajustement thérapeutique. Néanmoins, comme cela a déjà été indiqué précédemment, la limite du dosage salivaire de la 17-OHP tient plus à la faible compliance des enfants et des adolescents qu’à la fiabilité du dosage salivaire. Un recueil approximatif de l’échantillon salivaire, par exemple juste après la prise thérapeutique plutôt que juste avant, et le stockage inapproprié avant l’étape analytique sont des éléments critiques pour une bonne évaluation de l’efficacité thérapeutique. Dosages salivaires des stéroïdes et fertilité Les stéroïdes sexuels (androgènes, œstrogènes mais également gestagènes) sont dosés dans la salive depuis de nombreuses années. Dans le cadre du cycle ovarien, le dosage de l’œstradiol [67] et de la progestérone [68] dans les échantillons salivaires permettent de différencier la phase folliculaire et la phase lutéale. La salive, collectée quotidiennement tout au long du cycle menstruel, montre un profil spécifique avec une augmentation au milieu du cycle et un pic à la phase lutéale précoce. Les concentrations salivaires moyennes de progestérone au cours de la phase folliculaire vont de 20 à 100 pmol/L, alors que le pic de concentration durant la période péri ovulatoire peut atteindre 300 pmol/L. Cette différence significative permet sans ambiguïté d’étudier la fonction ovarienne. La progestérone salivaire, et plus rarement l’œstradiol, sont donc analysés en complément du profil stéroïdien urinaire. Une application des dosages salivaires consiste également en l’analyse de la testostérone dans le cadre du traitement de l’hypogonadisme chez l’homme. Le dosage de la testostérone dans la salive permet de différencier les sujets hypogonadiques des sujets eugonadiques, avec une très bonne corrélation avec la testostérone libre plasmatique. Cette association apparaît tout à fait logique car les protéines porteuses des stéroïdes sexuels n’ont qu’un rôle très mineur dans la salive. Cette corrélation très significative permet d’utiliser la concentration de testostérone salivaire utilisée comme biomarqueur de la déficience androgénique chez l’homme [69], avec une valeur seuil de 0,02 nmol/L, au-dessus de laquelle le contexte d’hypogonadisme peut être exclu. Cependant, l’équipe de Granger [70] a montré des limites à cette évaluation salivaire de la 499 revue générale testostérone. En effet, les dosages peuvent être influencés par les méthodes de recueil de l’échantillon salivaire, et apparaissent très sensibles aux conditions de conservation. De plus, la variabilité des concentrations d’androgènes en relation avec l’âge, particulièrement au cours de la puberté, rend l’interprétation des dosages salivaires difficile, notamment en raison de la quasi-absence de valeurs de référence en fonction de l’âge et du sexe [70]. Un développement des dosages salivaires hormonaux a vu le jour ces dernières années et doit être mentionné ici. Un nombre croissant de laboratoires propose une analyse salivaire directe via Internet. Ces vendeurs proposent un kit de recueil de l’échantillon ; après ce recueil l’échantillon salivaire est envoyé au laboratoire qui fournit les résultats des stéroïdes salivaires (validés, espérons-le !) par courrier. Lorsque les patients présentent ces résultats à leur médecin, ils ont la surprise d’apprendre qu’ils sont en pratique inutilisables pour une interprétation clinique pertinente, en raison de la difficulté de valider la date exacte du prélèvement, et de l’assurance de l’absence d’anomalies préanalytiques et ou analytiques. Si ces dosages avaient pour but de mettre en place une thérapeutique de substitution, la procédure est potentiellement très risquée pour le patient. En conséquence, les cliniciens doivent constamment informer leurs patients de l’inutilité de tels services, tout à fait inappropriés. Hormones salivaires et médecine du sport L’évaluation des modifications hormonales au cours de l’activité sportive peut donner des informations sur l’efficacité de techniques d’entraînement et ainsi aider à la fois les athlètes et les entraîneurs. Les prélèvements sanguins et urinaires avant et après l’entraînement sont habituels. En revanche, ces prélèvements posent problème car ils entraînent une rupture du temps d’entraînement. Les échantillons salivaires peuvent apporter une aide non négligeable durant l’entraînement, comme cela a été montré pour des androgènes et des glucocorticoïdes dans des sports comme le football américain [71], le rugby [72] et les compétitions du judo [73]. Les dosages hormonaux salivaires ne servent pas uniquement à améliorer l’entraînement des sportifs ; une autre utilisation est la recherche de dopage, car certaines des substances utilisées à cet effet sont des hormones telles que les stéroïdes anabolisants, certaines cytokines telles que l’érythropoïétine. Les androgènes sont également des substances interdites chez le sportif. Qu’ils soient synthétiques ou naturels les athlètes y ont recours pour augmenter leur masse musculaire et réduire la douleur durant l’exercice physique intense. Comme cela a été déjà mentionné, les androgènes peuvent être dosés de façon fiable dans la salive, puisque 500 ces stéroïdes franchissent la barrière endo-épithéliale par diffusion passive. La prise à long terme de ces stéroïdes anabolisants conduit à un profil androgénique modifié. Ainsi un critère de suspicion de dopage par la testostérone est le rapport urinaire entre la testostérone et l’épitestostérone. Habituellement, ce rapport est approximativement de 1. Si ce coefficient devient supérieur à 1, c’est-à-dire avec un dosage de testostérone élevé, l’athlète est suspecté d’une prise illégale d’androgènes. Comme les androgènes peuvent être mesurés dans la salive, il peut être intéressant d’utiliser des échantillons salivaires au cours de l’entraînement ou en compétition, plutôt que des dosages urinaires, en raison de la plus grande facilité de leur recueil, le préleveur étant directement face à l’athlète, alors que dans le cadre des échantillons urinaires l’athlète est dans une pièce séparée à l’abri du regard du préleveur. Les androgènes synthétiques tels que la tétrahydrogestrinone franchissent l’épithélium de la même manière que les androgènes endogènes, et la salive peut être utilisée pour un screening des athlètes, au même titre que la recherche de drogues de nature non hormonale. Cependant à ce jour, l’Agence mondiale antidopage ne fournit pas d’information précise sur l’existence de programmes de dosages salivaires pour la détection et le contrôle du dopage chez les athlètes. Les peptides exogènes utilisés dans le dopage sont principalement l’hormone de croissance (GH), qui favorise la croissance musculaire, et l’érythropoïétine, qui stimule l’érythropoïèse. Des travaux ponctuels ont démontré la présence de ces deux peptides dans la salive [74, 75] à de très faibles concentrations (environ 1 000 fois plus faibles que les concentrations plasmatiques. Cette présence ne peut être attribuée qu’à un passage à partir de la circulation systémique, car les glandes salivaires n’expriment pas ces peptides. Dès lors, il est probable que des peptides d’origine exogène, hormone de croissance ou érythropoïétine recombinantes, pourront être détectés également au niveau salivaire. De plus, dans le processus de production de ces peptides recombinants, des molécules cosynthétisées peuvent également servir de marqueur si elles sont retrouvées au niveau salivaire. L’analyse salivaire hormonale constitue donc une méthode prometteuse dans le domaine de la médecine du sport et des contrôles de dopage, mais des études plus fines et plus nombreuses doivent être réalisées avant d’officialiser l’utilisation de tels dosages dans ce domaine. Analyse des stéroïdes salivaires en médecine vétérinaire et recherche comportementale L’exploration endocrinienne à l’aide d’échantillon salivaire est fréquemment utilisée en médecine vétérinaire pour des études de fertilité, de reproduction d’espèces rares ou en voie de disparition. A titre d’exemple, Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 Dosages hormonaux salivaires Brown a montré que l’analyse des stéroïdes salivaires est un outil utile d’évaluation des cycles ovariens chez les rhinocéros indiens des parcs zoologiques [76]. L’étude de la durée normale du cycle ovarien de la femelle rhinocéros a permis d’utiliser le dosage salivaire de la 20αhydroxypreg-4-en-3-1-one comme marqueur de grossesse chez la femelle rhinocéros noire africaine [77]. Le recueil de salive chez le rhinocéros n’est possible que pour les animaux accoutumés en parc ou en zoo, mais selon les auteurs cet échantillon biologique est particulièrement utile lorsqu’il est difficile de recueillir de l’urine ou des matières fécales non contaminées [76]. La salive peut également être utilisée chez l’animal pour évaluer les hormones gluco et minéralocorticoïdes. Le recueil étant moins traumatisant que les prélèvements sanguins, ce milieu a été utilisé chez les cobayes [78], les marmousets [79] et même les dauphins [80] (figure 3). Selon les auteurs de ces études les dosages salivaires permettent d’évaluer les modifications hormonales en recherche comportementale sans avoir le stress induit par le prélèvement sanguin, fournissant ainsi des informations fiables sur le statut endocrinien des animaux, en relation avec leur état gestationnel ou leur position dans la hiérarchie sociale de l’espèce. Il faut néanmoins reconnaître que le prélèvement salivaire chez les animaux peut comporter certaines difficultés et constituer un obstacle aux dosages. Mélatonine salivaire et chronobiologie La mélatonine est une amine produite par la glande pinéale en phase nocturne. Le signal induit par la mélanine est l’un des principaux qui régule le cycle circadien. Dans le rythme biologique normal, des valeurs élevées de mélatonine sont retrouvées au cours de la nuit. En période diurne, les concentrations chutent à des valeurs basales très faibles [81]. La mélatonine franchit les barrières épithéliales de la même façon que les stéroïdes et est donc retrouvée dans la salive au même titre que dans le plasma. De nombreuses études ont décrit l’utilisation de dosages salivaires de mélatonine en recherche chronobiologique. Les domaines d’étude sont bien sûr les décalages horaires induits par les transports internationaux, qui sont attribués à un défaut d’alignement du rythme circadien et de l’heure locale de la destination, et les rythmes circadiens modifiés chez les militaires et en médecine aéronautique [82, 83]. L’évaluation des phases biologiques de sommeil dans ces circonstances particulières (jet lag, maintien éveillé pendant de longues périodes, absence de repère jour-nuit…) peut alors bénéficier du caractère non invasif des prélèvements salivaires par rapport aux prélèvements sanguins. D’autres domaines d’étude portent sur la psychiatrie et la médecine industrielle, et les conséquences de modification de rythme circadien chez des sujets exposés à une lumière artificielle durant de longues périodes [84]. Figure 3. Exemples de collection de salive chez les animaux : dauphin (zoo de Brookfield, Chicago), rhinocéros à l’essai de fertilité (zoo national de Smithsonien, avec l’autorisation de J.-L. Brown), poulet et cobayes (département de physiologie animale, université de Bayreuth, Allemagne). Ann Biol Clin, vol. 67, no 5, septembre-octobre 2009 501 revue générale Conclusion Cet article de synthèse a présenté une vue générale des progrès récents dans le domaine de l’analyse hormonale salivaire, en focalisant sur les applications en recherche et en thérapeutique. Bien qu’il ne s’agisse pas d’un sujet « très généraliste », les dosages hormonaux dans la salive présentent un intérêt croissant. Dans des domaines particuliers tels que la psychiatrie, la recherche sur le stress et la pharmacocinétique, l’analyse salivaire peut donner des résultats équivalents ou meilleurs que l’analyse sanguine. L’avantage essentiel de l’analyse hormonale salivaire est le caractère non traumatisant du prélèvement, permettant donc son utilisation chez des patients craignant la ponction veineuse (enfants, sujets phobiques…) sans stress générant une réponse adrénergique. Comme nous l’avons vu, cette absence de stress rend les dosages de glucorticoïdes au niveau salivaire très fiables par rapport aux valeurs sériques, dans le domaine de la recherche sur le stress en pédiatrie et pour le diagnostic sur le syndrome de Cushing. La répétition aisée des prélèvements salivaires et la présence des hormones non liées aux protéines dans ce domaine biologique sont d’autres avantages importants de l’analyse salivaire. Une fréquence quotidienne des prélèvements (au cours du cycle menstruel, pour l’étude de rythme circadien…) ou pour des intervalles plus courts (étude cinétique) devient possible de façon facile et réalisable au domicile des sujets. L’analyse salivaire peut également être utilisée lorsque les prélèvements sanguins sont impossibles, par exemple au cours de l’entraînement sportif. C’est d’ailleurs le domaine dans lequel l’analyse hormonale salivaire se développera très certainement dans un avenir proche. Avec une expérience de plusieurs années, on peut cependant définir des limites au dosage salivaire. Ces limites sont principalement : une acceptation par les cliniciens, le développement d’outils analytiques spécifiques et standardisés, l’établissement de valeurs de référence en fonction de l’âge, du sexe et du moment de prélèvement. De même, aucune information n’est actuellement disponible sur la transférabilité des résultats entre les différents tests commerciaux actuellement disponibles, même pour des molécules bien connues telles que le cortisol, la testostérone et la mélatonine. Une autre limite, importante pour les coordonnateurs d’étude et les cliniciens, est la faible compliance des patients au prélèvement salivaire. Pour résoudre ce problème, des procédures strictes de prélèvement et d’information du patient pour la réalisation de ces prélèvements sont indispensables. En conclusion, la standardisation des prélèvements salivaires et de leur analyse doit être poursuivie pour une meilleure comparaison des données expérimentales des 502 dosages hormonaux salivaires et pour faire de ce prélèvement un échantillon biologique supplémentaire fiable dans les investigations endocriniennes. Références 1. Riad Fahmy D, Read GF, Walker RF, Griffiths K. Steroids in saliva for assessing endocrine function. Endocr Rev 1982 ; 3 : 367-95. 2. Lewis JG. Steroid analysis in saliva : an overview. Clin Biochem Rev 2006 ; 27 : 139-46. 3. Reiter RJ. Normal patterns of melatonin levels in the pineal gland and body fluids of humans and experimental animals. J Neural Transm Suppl 1986 ; 21 : 35-54. 4. Vining RF, McGinley RA, Symons RG. Hormones in saliva : mode of entry and conséquent implications for clinical interpretation. Clin Chem 1983 ; 29 : 1752-6. 5. Smith RE, Maguire JA, Stein-Oakley AN, Sasano H, Takahashi K, Fukushima K, et al. 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