Identification de dosage de composés aromatiques dans des huiles

Transcription

0Sebastiani
Mise au point d’une technique de séparation et de
quantification des composés présents dans une
huile essentielle
Version 1.0
Projet d’Etude INSA de ROUEN, 30/06/2015
Institut National des Sciences Appliquées de Rouen
ACRONIME_Lot 01_V1.0
Mise au point d’une technique de séparation et
quantification des composés présents dans une huile essentielle
de
Département CFI
Avenue de l’Université - BP 08 – 76800 SAINT ETIENNE DU ROUVRAY
Tél : 02 32 95 66 79 - Fax : 02 32 95 66 96
Mail : [email protected]
Web: http://cfi.insa-rouen.fr/
Unité d’analyse chimique /COBRA UMR 6014
Avenue de l’Université – BP 08 – 76800 SAINT ETIENNE DU ROUVRAY
Bâtiment DARWIN
Tél : 02 32 95 65 81
Mail : [email protected]
Lot 01
Mise au point d’une technique de séparation et de quantification
des composés présents dans une huile essentielle
V1.0
Rapport PE huiles essentielles 2015.docx
Page 2 sur 69
de
Page de Service
Historique des évolutions
Identifiant
Date
ACRONYME_Lot01_V1.0 30/06/2015
Auteurs
Description des
modifications
Chapitres et
paragraphes modifiés
CAZZOLA
Charles
DOUBLET
Charline
Création
Tous
Page 3 sur 69
ABREVIATIONS
°C
A
CMR
CPG
EI
GC
FID
HD
HE
ID
LOQ
MS
PPAM
Tébu
Tr
UMR
V
µg/mL
degré Celsius
Ampère
Cancérigène Mutagène Reprotoxique
Chromatographie en Phase Gazeuse
« Electronic Impact » (Impact électronique)
« Gas Chromatography » (Chromatographie Gazeuse)
« Flame Ionization Detector » (Détecteur à Ionisation de flamme)
Hydrodistillation
Huile essentielle
« Internal Diameter » (Diamètre Interne)
« Limit Of Quantification » (Limite de Quantification)
« Mass Spectrometry » (Spectrométrie de masse)
Plantes à Parfums Aromatiques et Médicinales
Température d’ébullition
Temps de rétention
Unité Mixte de Recherche
Volt
Microgramme / millilitre
Page 4 sur 69
de
de
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Illustration des principaux organes végétaux dont sont extraites les huiles essentielles
11
Figure 2. Photographie d’une coupe transversale d’un citron .............................................. 11
Figure 3. Représentation schématique du principe d’hydrodistillation traditionnelle ............ 12
Figure 4. Représentation schématique du principe de la distillation par entrainement à la
vapeur d’eau où le matériel végétal est séparé de l’eau, a) à l’aide d’un panier dans la même
enceinte, b) dans un réservoir différent. ............................................................................. 13
Figure 5. Représentation schématique des différents modules d’un chromatographe
GC/MS ............................................................................................................................. 15
Figure 6. Représentation schématique de l’ionisation par impact électronique .................... 16
Figure 7. Représentation schématique des différents composants d’un détecteur à ionisation
de flamme........................................................................................................................ 17
Figure 8. Synoptique de l’obtention et de l’analyse d’une huile essentielle ........................... 18
Figure 9. Tableau récapitulatif des huiles essentielles testées et de leurs caractéristiques .... 19
Figure 10. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de canelle écorce de Ceylan ........ 21
Figure 11. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de camphrier ............................. 21
Figure 12. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de l’Atlas ..................... 21
Figure 13. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de Virginie ................... 21
Figure 14. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cannelle écorce analysée sur
colonne capillaire polaire .................................................................................................. 22
Figure 15. Traitement des résultats d’une analyse d’une huile essentielle ............................ 23
Figure 16. Identification d’un composé à l’aide de la base spectrale NIST ............................ 23
Figure 17. Table des composés de la méthode GC/MS ........................................................ 24
Figure 18. Spectre de masse du cinnamaldéhyde ............................................................... 25
Figure 19. Recberche automatique des composés du cinnamaldéhyde ................................ 26
Figure 20. Résultats d’identification des composés du cinnamaldéhyde .............................. 26
Page 5 sur 69
de
Figure 21. Optimisation de l’identification d’un composé ................................................... 27
Figure 22. Calibration interne............................................................................................ 31
Figure 23. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de clous de girofle ...................... 54
Figure 24. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de coriandre .............................. 54
Figure 25. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cumin ................................... 55
Figure 26. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus citronné bio ........... 55
Figure 27. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus mentholé bio ......... 56
Figure 28. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus radié bio ................ 56
Figure 29. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de genévrier .............................. 56
Figure 30. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de géranium d’Egypte bio .......... 56
Figure 31. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle du gingembre ............................ 57
Figure 32. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de laurier noble bio .................... 57
Figure 33. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavande aspic ........................ 57
Figure 34. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavandin super ...................... 57
Figure 35. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe poivrée ..................... 58
Figure 36. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe verte ........................ 58
Figure 37. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’origan compact bio ................. 58
Figure 38. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de patchouli .............................. 58
Figure 39. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de romarin à cinéole .................. 59
Figure 40. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de sarriette des montagnes bio .. 59
Figure 41. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’arbre à thé ............................. 59
Figure 42. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de térébenthine ......................... 59
Figure 43. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de thym saturéoïdes bio ............. 60
Figure 44. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’Ylang Ylang complète .............. 60
Page 6 sur 69
de
SYNTHESE
L’objectif du présent projet d’étude est de mettre au point une séparation des composés
par GC/MS dans des huiles essentielles de référence, d’identifier le maximum de composés
présents, de mettre au point une méthode fiable de quantification par GC/FID, et de faire une
étude bibliographique sur les méthodes de sourcing et de contrôle des origines naturelles
(coriandre, patchouli, genévrier, etc.).
La composition chimique de 26 huiles essentielles (HE) telles que le camphrier, le
gingembre, l’eucalyptus citronné ou encore la coriandre, a été étudiée dans ce travail. Ces huiles
essentielles proviennent de XXXX, site d'aromathérapie et de vente en ligne d'huiles
essentielles pures et naturelles, huiles végétales et hydrolats BIO, ingrédients cosmétiques etc.
L'analyse des 24 huiles essentielles a été effectuée au moyen des techniques de CPG,
soit couplée à la spectrométrie de masse pour l'identification des composés, soit couplée à un
détecteur à ionisation de flamme pour leur quantification. Les performances de deux types de
colonnes capillaires, apolaire et polaire, en terme de séparation des composés, largeur de pic,
et temps d’analyse ont été évaluées. Il est ainsi notamment préférable, à cause de problématique
de co-élution, d’utiliser une colonne apolaire pour l’analyse de composés tels que l’eucalyptol
et le β-phellandrène, et une colonne polaire pour l’analyse de composés tels que l’acétate de
terpényle et l’α-terpinéol, et le menthofurane et la menthone.
En terme d’identification, 73 composés ont été identifiés avec la méthode par GC/MS
(colonne apolaire) sur 80 identifiés par XXX dans les huiles essentielles de référence, 71
composés sur 80 identifiés avec la méthode par GC/FID avec actuellement des soucis pour
l'intégration de certains composés présents à l'état de traces (< 1%).
En terme de quantification, les résultats de proportions de composés obtenus par la
méthode par GC/FID sont cohérents avec les données issues du fournisseur des huiles
essentielles testées. Cependant, certaines proportions de composés sont sous-évaluées ou surévaluées.
Les calibrations internes de 9 composés disponibles à l’INSA ont été réalisées et
validées sur la méthode par GC/FID avec une gamme de calibration de 200 à 600 µg/mL.
L’éthylbenzène a été utilisé en tant qu’étalon interne à une concentration de 400 µg/mL.
Page 7 sur 69
de
SOMMAIRE
ABREVIATIONS ............................................................................................................. 4
Liste des figures ................................................................................................................ 5
Synthèse ........................................................................................................................... 5
INTRODUCTION ............................................................................................................ 9
Les huiles essentielles ............................................................................................... 10
I.
I.1
Généralités sur les huiles essentielles ....................................................................................... 10
I. 1. 1.
I. 1. 2.
Définition .................................................................................................................................... 10
Le matériel végétal d’origine ...................................................................................................... 10
I.2 Méthodes d’extraction des huiles essentielles ........................................................................... 11
I. 2. 1.
I. 2. 2.
Expression à froid ....................................................................................................................... 11
Distillation................................................................................................................................... 12
I.3 Toxicité des huiles essentielles .................................................................................................... 13
II.
contrôle analytique des huiles essentielles ................................................................ 15
II.1 Principe de la Chromatographie en Phase Gazeuse .................................................................. 15
II.2 Principe de la spectrométrie de masse ...................................................................................... 15
II.3 Principe du détecteur à ionisation de flamme........................................................................... 17
III. Partie experimentales au cobra ................................................................................ 17
III.1 Huiles essentielles testées ........................................................................................................ 18
III.2 Analyses des huiles essentielles par GC/MS ............................................................................. 19
III. 2. 1.
III. 2. 2.
III. 2. 3.
III. 2.3.1
III. 2.3.2
III. 2. 4.
Analyse avec la colonne apolaire.............................................................................................. 20
Analyse avec la colonne polaire ............................................................................................... 22
Méthode automatique d’identification sur Saturn Varian ....................................................... 22
Identification et enregistrement des composés ................................................................... 22
Optimisation de la recherche automatique ........................................................................... 25
Comparaison des performances des deux colonnes ................................................................ 27
III.3 Analyses des huiles essentielles par GC/FID ............................................................................. 29
III.4 Calibration interne de la méthode par GC/FID ......................................................................... 30
III. 4. 1.
III. 4. 2.
III. 4. 3.
Choix de l’étalon interne .......................................................................................................... 31
Préparation de la gamme de calibration .................................................................................. 31
Résultats de la calibration interne ............................................................................................ 33
Conclusion ....................................................................................................................... 35
Bibliographie ................................................................................................................... 36
ANNEXES ......................................................................................................................... 38
Page 8 sur 69
de
INTRODUCTION
Les huiles essentielles sont devenues, ces dernières années, une matière d’importance
économique considérable, avec un marché en constante croissance dont les domaines
d’application sont directement liés à la consommation humaine. C’est pourquoi, les huiles
essentielles sont de plus en plus contrôlées afin de vérifier d’une part la présence de certains
composés naturels toxiques, leur origine naturelle ou non, leur source (camphrier, cumin etc.)
et la présence de certains composés actifs (géraniol par exemple).
Les huiles essentielles doivent répondre à des caractéristiques imposées par les lois des
pays producteurs et exportateurs et par les pays importateurs. Ces critères sont définis dans des
normes internationales ISO (International Organisation for Standardization) ou françaises
AFNOR (Association Française de Normalisation). Ainsi sont contrôlées les propriétés
organoleptiques et physiques telles que la coloration, l’odeur, la réfraction, la solubilité́ , le point
éclair mais également les propriétés chimiques telles que les indices d’acides et d’esters. Les
huiles essentielles sont des liquides hydrophobes et concentrés dont la composition est
complexe. La meilleure carte d’identité́ qualitative et quantitative d’une huile essentielle reste
cependant son profil chromatographique réalisé́ la plupart du temps en chromatographie en
phase gazeuse.
Dans ce contexte, de nombreuses demandes d’entreprises ou d’universités arrivent au
plateau technique du COBRA à l’INSA de Rouen qui ne peuvent être traitées faute de méthodes
développées. L’objet de ce projet d’étude est de répondre à ce besoin croissant par la mise au
point d’une technique de séparation et de quantification des composés présents dans les huiles
essentielles. Il s’agit donc ici de mettre au point une séparation des composés par GC/MS dans
des huiles essentielles de référence, d’identifier le maximum de produit, de mettre au point une
méthode fiable de quantification par GC/FID, et de faire une étude bibliographique sur les
méthodes de sourcing et de contrôle des origines naturelles (eucalyptus citronné, coriandre,
genévrier, etc.).
Tout d’abord, nous présentons l’étude bibliographique concernant les huiles
essentielles, en particulier leurs compositions physico-chimiques, les principales méthodes
d’extraction et de contrôle analytique des huiles essentielles. Ensuite, l’exposé portera sur la
mise au point de la méthode d’identification par GC/MS et de la méthode d’identification par
GC/FID des composés. Pour finir, la calibration interne de la méthode par GC/FID avec les
composés présents à l’INSA de Rouen sera expliquée.
Page 9 sur 69
de
I. LES HUILES ESSENTIELLES
I.1 Généralités sur les huiles essentielles
I. 1. 1.
Définition
Une huile essentielle ou essence se décrit communément comme un mélange de
composés aromatiques extraits d’une plante. D’un point de vue réglementaire, selon la
pharmacopée européenne, une huile essentielle est « un produit odorant, généralement de
composition complexe, obtenu à partir d’une matière végétale botaniquement définie, soit par
entrainement à la vapeur d’eau, soit par distillation sèche, soit par un procédé́ mécanique
approprié sans chauffage. L’huile essentielle est le plus souvent séparée de la phase aqueuse
par un procédé́ physique n’entraînant pas de changement significatif de sa composition ».
Le règne végétal offre une grande diversité́ permettant d’obtenir, aujourd’hui, 3 000 huiles
essentielles parmi lesquelles environ 300 sont importantes d’un point de vue commercial.
I. 1. 2.
Le matériel végétal d’origine
En pratique, les huiles essentielles sont principalement extraites de deux types de plantes
: les hespéridés ou agrumes (citron, orange, bergamote...) et les plantes à parfums
aromatiques et médicinales (PPAM). À priori, toutes les plantes possèdent la faculté de
produire des composés volatils mais seulement à l’état de traces le plus souvent. La capacité à
accumuler l’huile essentielle est cependant la propriété de certaines familles de plantes réparties
au sein de l’ensemble du règne végétal, aussi bien représentées par la classe des gymnospermes
Cupressaceae (bois de cèdre, genièvre) et Pinacea (pin et sapin) que celle des angiospermes ou
plantes à fleurs. Les familles les plus importantes sont les dicotylédones comme l’Apiacea
(anise verte, coriandre), le Genraniaceae (géranium), la Lamiaceae (menthe, lavande), la
Lauraceae (camphre, cannelle), la Myristicaceae (noix), la Myrtaceae (eucalyptus, girofle), la
Rosacea (rose) et les Rutacea (citron, orange, bergamote). Les monocotylédones sont
principalement représentées par les familles Acoracea (jonc), Poacea (vétiver) et Zingiberaceae
(gingembre et cardamome).
Selon l’espèce considérée, l’huile essentielle sécrétée par la plante est stockée dans
divers organes tels que ceux illustrés dans la Figure 1.
Cannelle (écorce)
Cèdre de l’Atlas (bois)
Coriandre (semences)
Cumin (graines)
Géranium d’Egypte (feuilles)
Gingembre (racines)
Page 10 sur 69
de
Figure 1. Illustration des principaux organes végétaux dont sont extraites les huiles essentielles
Pour certaines plantes, l’huile essentielle peut être extraite de plusieurs organes.
Toutefois, si tous les organes d’une même espèce peuvent renfermer une huile essentielle, sa
composition peut admettre des variations importantes selon sa localisation. De plus, il est
important de souligner que le profil chimique d’une huile essentielle est directement relié à la
procédure d’extraction employée.
I.2 Méthodes d’extraction des huiles essentielles
Parmi les méthodes d’extraction disponibles, seuls deux procédés permettent d’obtenir
des huiles essentielles conformes avec la pharmacopée européenne. Il s’agit de l’expression à
froid et de la distillation. Bien qu’elles n’aboutissent pas à des huiles essentielles au sens
réglementaire, l’extraction sans solvant assistée par micro-ondes et l’extraction en fluide
supercritique sont deux méthodes d’extraction dont l’utilisation se généralise.
Les huiles essentielles subissent généralement des modifications de leur composition
chimique lors du processus d’extraction causées par la chaleur ou bien par leurs interactions
avec l’eau. En fait, seules les huiles essentielles issues de l’expression à froid n’ayant pas eu de
contact avec le jus de fruit et protégées de l’oxydation pourraient correspondre à la véritable
huile essentielle de la plante.
I. 2. 1.
Expression à froid
Appliquée exclusivement à l’extraction des huiles essentielles d’agrumes, l’expression
à froid consiste à rompre ou dilacérer les parois des sacs oléifères contenus dans le mésocarpe
situé juste sous l’écorce du fruit, l’épicarpe (Figure 2).
Figure 2. Photographie d’une coupe transversale d’un citron
L’huile essentielle est également présente dans les cellules du jus de fruit en quantité
beaucoup moins importante et avec une composition qui peut être différente de celle contenue
dans les cellules du mésocarpe. Les huiles essentielles de citrus ont longtemps été extraites
manuellement, la mécanisation et l’industrialisation de la technique d’expression à froid ne
s’étant effectuées qu’au début du XXème siècle afin de diminuer les coûts de production et
d’améliorer les rendements pour faire face à l’augmentation de la demande. Les systèmes
récents comme la Food Machinery Corporation-in-line (FMC) permettent d’extraire le jus de
fruit et l’huile essentielle de citrus de manière quasi-simultanée sans contact des deux.
Le procédé consiste d’abord à amener et fixer le fruit sur une coupe équipée de lames.
Une seconde coupe, équivalente à la première, vient alors se fixer au fruit de manière à
l’enfermer. Au même moment, un couteau circulaire creuse un trou à la base du fruit.
Page 11 sur 69
de
L’application d’une pression sur les parois du fruit entraîne l’extraction du jus qui va être
transporté jusqu’au collecteur pendant que l’huile est extraite de la peau et collectée à l’aide
d’un jet d’eau. L’émulsion eau-huile est ensuite séparée par centrifugation.
Cette technique présente l’avantage de pouvoir être couplée avec la production du jus
de fruit qui constitue le produit commercial le plus important. C’est pourquoi l’expression à
froid est la méthode de choix pour extraire les huiles essentielles de citrus, d’autant que la
distillation n’est pas une technique très appropriée. En effet, la distillation produit des huiles
essentielles de moindre qualité principalement due au fait d’une présence importante
d’aldéhydes, composés sensibles à l’oxydation et à la chaleur. Pour les autres végétaux, la
distillation à l’eau (hydrodistillation) ou par entraînement à la vapeur d’eau reste, sans aucun
doute, la méthode la plus fréquente.
I. 2. 2.
Distillation
La méthode d’extraction des huiles essentielles la plus simple est l’hydrodistillation
(Figure 3).
Figure 3. Représentation schématique du principe d’hydrodistillation traditionnelle
Elle consiste à immerger la matière première végétale dans un bain d’eau mis à
ébullition. Les composés volatils contenus dans les cellules diffusent à travers les parois
cellulaires (hydrodiffusion) sous l’action physique qu’exerce le gonflement de la matière
végétale (phénomènes d’absorption d’eau ou osmotique), via la pression interne et l’action
chimique de l’eau.
Une fois diffusée en dehors des cellules, l’huile forme avec l’eau un système liquidevapeur. La non-miscibilité des deux liquides confère au mélange la propriété d’avoir une
température d’ébullition inférieure aux températures d’ébullition des deux liquides purs. Cette
caractéristique explique la volatilisation des composés des huiles essentielles à une température
d’environ 100°C. Une fois vaporisés, les composés sont transportés par le flux de vapeur d’eau
refroidi plus loin et condensé dans un essencier ou un vase florentin.
Lors de la décantation, la différence de densité entre l’eau et les composés aromatiques
entraîne la formation d’une phase aqueuse et d’une phase organique : l’huile essentielle.
Cependant, le contact direct des constituants de l’huile essentielle avec l’eau occasionne
des réactions chimiques conduisant à des changements dans la composition finale de l’extrait.
Une attention particulière doit, notamment, être portée sur les huiles essentielles riches en esters
Page 12 sur 69
de
(cas de la lavande et du lavandin) dont l’hydrolyse conduit à la formation d’alcools et d’acides.
Pour éviter ce type de réactions, la matière première peut être séparée de l’eau dans la
même enceinte à l’aide d’une grille, d’un panier ou, préférentiellement, dans un réservoir
différent ; c’est la distillation par entraînement à la vapeur d’eau (Figure 4).
Figure 4. Représentation schématique du principe de la distillation par entrainement à la vapeur
d’eau où le matériel végétal est séparé de l’eau, a) à l’aide d’un panier dans la même enceinte, b)
dans un réservoir différent.
Les conditions opératoires et notamment la durée de distillation ont une influence
considérable sur le rendement et la composition de l’huile essentielle. C’est pourquoi sont
développés, aujourd’hui, des modèles mathématiques qui permettent d’optimiser au mieux ces
conditions afin de produire des huiles essentielles de manière reproductible. Une amélioration
significative de la durée de distillation peut être obtenue par une macération du matériel végétal
dans un bain d’ultrasons préalablement à la distillation, ou bien avec l’utilisation assistée de
micro-ondes.
Sun Kim et Sun Lee ont comparé la composition chimique des huiles essentielles de
lavande officinale (Lavandula officinalis) obtenues par différentes méthodes d’extraction. Ils
ont trouvé que l’acétate de linalyle (35,44 %) et le linalol (18,70 %) sont prédominants dans les
huiles essentielles obtenues par distillation à la vapeur tandis que leurs valeurs étaient
respectivement de 2,63 et 4,04 % dans le cas d’extraction par solvants ; 36,80 et 43,47 % dans
le cas d’extraction par microonde.
D’après ces résultats, on remarque que la composition chimique de l’huile essentielle
de l’espèce Lavandula officinalis cultivée à Constantine est différente de celles obtenues dans
de nombreux travaux sur la même espèce, avec une prédominance des composés
monoterpéniques dans la plupart des cas, mais à des proportions différentes. Cette différence
de composition est due probablement à diverses conditions notamment l’environnement, le
génotype, l’origine géographique, la période de récolte, le lieu de séchage, la température et la
durée de séchage, les parasites et la méthode d’extraction.
I.3 Toxicité des huiles essentielles
Les huiles essentielles sont des mélanges complexes de molécules, dont on peut
distinguer 2 groupes : les terpènes et les aromatiques.
Les terpènes et leurs dérivés sont formés d’unités isopréniques (unités pentacarbonnées
ramifiées). Pour cette gamme de composés, seules les molécules de poids faible, entre 10 et 20
atomes de carbones, sont présents dans les huiles essentielles. Par conséquent, elles peuvent
plus facilement pénétrer notre peau et ainsi provoquer des allergies et des inflammations.
Page 13 sur 69
de
Cependant, ces effets sont provoqués majoritairement par d’autres composés comme les
lactones sesquiterpéniques, l’aldéhyde cinnamique et les phénylpropanoïdes.
Les huiles essentielles contenant certains composés aromatiques, notamment les
phénols et dérivés, comme l’eugénol, le thymol et le carvacrol, sont à utiliser avec précautions.
Ces molécules peuvent provoquer de sévères irritations sur les peaux sensibles ou les
muqueuses. De plus, les cellules du foie peuvent se trouver altérées, lorsque les doses prises
sont élevées et que la durée de la cure est longue.
D’autres familles de composés s’avèrent être également toxiques. Ceux sont les cétones,
les aldéhydes et quelques esters. Les conséquences sur notre santé vont de la
photosensibilisation aux risques d’avortement, dans les cas les plus graves.
Tableaux des propriétés et de toxicités des composés en annexes 1 et 2
L’utilisation des huiles essentielles n’est pas à prendre à la légère. Les effets toxiques
sont très variables d’une huile essentielle à l’autre et dépendent beaucoup de la sensibilité des
consommateurs.
Ainsi, il est nécessaire que les fournisseurs d’huiles essentielles identifient et quantifient
les composés potentiellement toxiques, afin d’informer au mieux les utilisateurs. Pour cela, on
utilise la chromatographie en phase gazeuse associée à un spectromètre de masse ou à un
détecteur à ionisation de flamme.
Page 14 sur 69
de
II. CONTROLE ANALYTIQUE DES HUILES
ESSENTIELLES
II.1 Principe de la Chromatographie en Phase Gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) permet de séparer des mélanges de
composés volatiles ou susceptibles d’être vaporises par suite d’équilibres entre une phase
gazeuse mobile et une phase stationnaire. Un chromatographe en phase gazeuse est constitué
de trois principales parties.
- L’injecteur : l’échantillon est introduit avec une micro seringue, à travers un septum en
élastomère, dans la chambre de vaporisation. L’injecteur a une double fonction : il porte
l’échantillon à l’état de vapeur, puis il l’amène dans le flux gazeux en tête de colonne.
- La colonne : elle est placée dans une enceinte à température régulée. Elle se présente sous la
forme d’un tube de silice, enroulée sur lui-même et de longueur allant de 1 à plus de 60 m.
Entraînés par un gaz vecteur inerte, les analytes étudiés sont séparés en fonction de leur capacité́
d’interaction avec la phase stationnaire.
- Le détecteur : il s’agit du module qui va permettre de détecter voire d’identifier les composés
en sortie de colonne.
Figure 5. Représentation schématique des différents modules d’un chromatographe GC/MS
II.2 Principe de la spectrométrie de masse
Le chromatographe Saturn GC/MS utilisé crée le spectre de masse grâce à un analyseur
à trappe à ions.
Ce type d’analyseur diffère des analyseurs de transport de faisceau comme les barres
magnétiques, les quadripôles, et les instruments de temps de vol où les ions sont séparés à
travers une séquence de champs magnétiques fixes. Au contraire, la trappe à ions confine les
ions à l’intérieur d’une région dans laquelle ils sont soumis à des champs magnétiques variables
dans le temps.
Page 15 sur 69
de
L’analyse d’un échantillon avec un analyseur à trappe à ions peut être découpée selon
plusieurs étapes :
Introduction de l’échantillon
En sortie de colonne, les composés sont introduits depuis la ligne de transfert vers
l’analyseur à trappe à ions à travers le couplage direct avec la colonne capillaire.
Ionisation de l’échantillon
Le composé est ionisé par impact électronique (EI) dans le spectromètre de masse par
déstabilisation de sa structure moléculaire, causant l’éjection d’un électron de la molécule. Le
mode d’ionisation est l’impact électronique (EI) (Figure 6).
Figure 6. Représentation schématique de l’ionisation par impact électronique
Fragmentation de l’échantillon
En fonction de la structure initiale du composé et de l’excès déstabilisant l’énergie
interne présente dans cette structure, le composé ionisé (ion moléculaire) se disloque
(fragmentation). Ce procédé forme des fragments d’ions et des fragments neutres.
Stockage des ions
Les ions (moléculaires et les fragments d’ions) produits sont stockés et stabilisés dans
la cavité de la trappe à ions, où ils voyagent selon différentes orbites. Le gaz vecteur d’hélium
est aussi présent dans cette cavité. Il permet de concentrer les ions dans des orbites plus
compactes ce qui produit des pics de masse plus fins lors de leurs analyses. L’hélium est utilisé
car il ne se ionise pas aussi rapidement que les molécules d’analytes. Comme les ions d’hélium
sont les espèces les plus prédominantes dans la trappe, ils ne sont pas stockés et sont éjectés
lors de leur formation.
Analyse des ions
Les ions sont analysés par application d’une tension de radio fréquence 1,1 MHz sur
l’électrode annulaire encerclant la cavité de la trappe. Au fur et à mesure que la tension
augmente sur l’anneau de l’électrode, les ions sont éjectés consécutivement de la trappe en
fonction de leur ratio masse-charge (m/z) croissant.
Détecteur
Le détecteur recueille alors ces ions séparés par l’analyseur en fonction de leur rapport
m/z. Puis, un micro-ordinateur va assurer le traitement des données et fournir un spectre de
masse. L’EI est un procédé́ reproductible qui permet des comparaisons spectrales à l’aide de
bibliothèques de spectres (NIST).
Page 16 sur 69
de
II.3 Principe du détecteur à ionisation de flamme
Le Détecteur à Ionisation de Flamme (FID) est le plus courant des détecteurs en CPG
grâce à sa sensibilité. On le considère comme un détecteur non spécifique car il peut déceler
pratiquement tous les composés combustibles, c’est-à-dire, les composés organiques.
(Figure 7).
Figure 7. Représentation schématique des différents composants d’un détecteur à ionisation de flamme
Principe
Le courant gazeux sortant de la colonne arrive dans une flamme d’hydrogène et d’air (T
= 2100 °C). La plupart des composés organiques sont détruits par combustion et produisent des
ions capables de conduire l’électricité à travers la flamme.
Une différence de potentiel de 100 à 300 V est appliquée entre deux électrodes : une
électrode de polarisation (brûleur) et une électrode collectrice, électrode annulaire disposée au
sommet de la flamme qui collecte le courant ionique très faible (10-12 A). Le signal est
transformé et amplifié en une tension mesurable : il est donc sensible au débit massique de
l’échantillon et non à sa concentration molaire. L’aire du pic reflète donc la masse de composé
élué. Ce détecteur présente également une large gamme de linéarité et détectent des quantités
de substance de l’ordre de 20 à 100 pg.
Comme pour le catharomètre, l’hélium et l’hydrogène peuvent être utilisés comme gaz
vecteur. Il n’est pas sensible aux molécules minérales présentant un potentiel d’ionisation élevé
comme l’eau, CO, CO2, SO2, N2 et les NOx, ce qui présente un avantage lorsque l’on veut
analyser des solutions aqueuses ou des composants de l’atmosphère.
Avantages
Le détecteur à ionisation de flamme présente une sensibilité élevée (≈10-13g de soluté
par ml de gaz vecteur). Cette sensibilité évolue selon les molécules : elle est maximale pour les
molécules possédant des atomes de carbones liés à d’autres atomes de carbone ou : des atomes
d’hydrogène. La sensibilité diminue si le composé possède des groupements fonctionnels tels
que : carbonyles, alcool, halogène et amine. Il présente un domaine étendu de réponse linéaire
(≈ 107). Il est robuste et simple d’utilisation.
Inconvénient
Il détruit l’échantillon lors de sa détection.
III. PARTIE EXPERIMENTALES AU COBRA
Page 17 sur 69
de
Les huiles essentielles doivent répondre à des caractéristiques imposées par les lois des
pays producteurs et exportateurs et par les pays importateurs. Ces critères sont définis dans des
normes internationales ISO (International Organisation for Standardization) ou françaises
AFNOR (Association Française de Normalisation).
Ainsi sont contrôlées les propriétés organoleptiques et physiques telles que la coloration,
l’odeur, la réfraction, la solubilité, le point éclair mais également les propriétés chimiques telles
que les indices d’acides et d’esters.
La meilleure carte d’identité qualitative et quantitative d’une huile essentielle reste
cependant son profil chromatographique réalisé en chromatographie en phase gazeuse, même
si d’autres techniques alternatives sont utilisées. En effet, malgré les importantes innovations
instrumentales réalisées ces dernières années, la détection de tous les constituants d’une huile
essentielle reste une tâche extrêmement difficile qui nécessite souvent l’emploi de plusieurs
techniques analytiques complémentaires.
La synoptique de l’obtention et de l’analyse d’une huile essentielle est présentée cidessous en Figure 8.
Figure 8. Synoptique de l’obtention et de l’analyse d’une huile essentielle
L'identification des constituants volatils des huiles essentielles a été réalisée au sein du
laboratoire COBRA (UMR-6014) au moyen de la CPG couplée à la spectrométrie de masse
(CPG/SM) et la détermination quantitative a été effectuée sur un appareil équipé d'un détecteur
à ionisation de flamme (CPG/FID). La quantification des constituants des huiles essentielles a
ensuite été déterminée par la méthode de calibration interne.
III.1 Huiles essentielles testées
Page 18 sur 69
Figure 9. Tableau récapitulatif des huiles essentielles testées et de leurs caractéristiques
III.2 Analyses des huiles essentielles par GC/MS
Page 19 sur 69
de
de
L’identification des composés a été réalisée sur l’appareil de chromatographie en phase
gazeuse Varian 3900 couplé au spectromètre de masse Varian 2100T (ANA 29), en utilisant le
logiciel Saturn Varian (version 6.9.1).
Deux colonnes capillaires, l’une apolaire (ZB5-MS) et l’autre polaire (Stabilwax), ont
été́ utilisées afin de comparer leurs performances en terme de séparation des composés, largeur
de pic, et temps d’analyse. En effet, des différences notables de performances ont été constatées
par Sebastiani et al. (1983), car sur une phase stationnaire apolaire (de type polyméthylsiloxane)
ont été́ observes des chevauchements partiels ou complets des pics entre l'octanal et l'αphellandrène, le 1,8-cinéole et le limonène, le nérol et le citronellol ; avec les phases polaires
(de type polyéthylèneglycol) une co-élution a été́ remarquée entre certains alcools
monoterpéniques, esters et hydrocarbures sesquiterpéniques.
III. 2. 1.
Analyse avec la colonne apolaire
Dans un premier temps, nous avons utilisé une colonne capillaire apolaire : les composés
sont élués approximativement dans l’ordre de leur point d’ébullition. Les conditions opératoires
furent basées sur les recherches bibliographiques, réalisées au début du projet.
Tableau des méthodes analytiques issues des recherches bibliographiques en annexe 3
Conditions opératoires
- Colonne : Colonne capillaire apolaire
- Modèle : Phenomenex ZEBRON ZB-5MS
- Dimensions : 30 mètres, 0.25 mm (ID), 0.25 µm d’épaisseur de phase stationnaire
- Temps d’analyse : 1 heure
- Débit gaz vecteur : 1 mL/min
- Energie d’ionisation : 70 eV
- Température injecteur : 280°C
- Température du four : 50°C pendant 5 min, puis montée de 5°C/min jusqu’à 300°C (5min)
- Mode Split : 1/20
- Volume injecté : 1 µL
- Scan m/z : 40-600
Préparation des échantillons d’huiles essentielles
Une goutte d’huile essentielle est introduite dans un vial en verre de 20 mL. On ajoute
10 mL d’hexane à l’aide d’une éprouvette graduée. Le vial est ensuite sellé.
Suite au passage des premiers échantillons d’huiles essentielles, nous avons observé la
co-élution de certains pics. Ainsi, nous avons baissé la rampe de température à 3°C/min.
Cependant, aucun changement ne fût observé. La rampe de température a donc été fixée à
5
°C/min. Les chromatogrammes obtenus par GC/MS sur les huiles essentielles de cannelle
écorce de Ceylan, camphrier, cèdre de l’Atlas et cèdre de Virginie sont disponibles ci-dessous.
Les chromatogrammes des 22 autres huiles essentielles sont disponibles en annexe 4.
Chromatogrammes obtenus par GC/MS sur les huiles essentielles en annexe 4
Page 20 sur 69
Figure 10. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de canelle écorce de Ceylan
Figure 11. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de camphrier
Figure 12. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de l’Atlas
Figure 13. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cèdre de Virginie
Page 21 sur 69
de
III. 2. 2.
de
Analyse avec la colonne polaire
Ensuite, cette identification a de nouveau été effectuée sur une colonne capillaire polaire
RESTEK Stabilwax®-MS (30 mètres, 0.25 mm (ID), 0.25 µm d’épaisseur de phase
stationnaire). Afin de respecter la contrainte de température maximale d’utilisation de cette
colonne, la température finale du four de la méthode a été diminuée à 250°C.
Figure 14. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cannelle écorce
analysée sur colonne capillaire polaire
III. 2. 3.
Méthode automatique d’identification sur Saturn Varian
Le logiciel Saturn Varian, version 6.9.1, permet de retrouver automatiquement les
composés préalablement identifiés et enregistrés. Ensuite, une optimisation de cette base de
données est nécessaire afin de minimiser les erreurs.
III. 2.3.1
Identification et enregistrement des composés
Pour chaque chromatogramme d’huile essentielle, nous avons cherché à identifier les
pics correspondant aux molécules données par XXXX XXXX.
Le travail a commencé par l’identification des composés de plus grande proportion
puisque plus la proportion d’une molécule est importante, plus la hauteur de son pic est élevée.
Le spectre de masse, associé à la fraction du pic sélectionné, s’affiche et doit être comparé à la
base de données NIST, afin de trouver la molécule correspondant à ce spectre.
Page 22 sur 69
de
Base NIST
Zone
chromatogramme
Curseur
Zone spectre
de masse
Figure 15. Traitement des résultats d’une analyse d’une huile essentielle
Pour des pics de hauteur conséquente (supérieur à 200 Kcount), il est préférable de
placer le curseur en début de celui-ci (cf. ci-dessus). Ceci permet d’avoir une concordance de
spectre de masse ou « Match », plus importante avec celui proposé par NIST.
Probabilité associée
à chaque molécule
Liste des molécules
proposées
Information sur le
composé sélectionné
Figure 16. Identification d’un composé à l’aide de la base spectrale NIST
Page 23 sur 69
de
Pour les composés présents en maigre proportion, nous avons raisonné par tâtonnement.
Par conséquent, il a fallu être attentif à la formule de la molécule et à ces divers synonymes.
Dès qu’un composé est déterminé, il est enregistré dans la table des composés de la méthode.
1
3
2
Figure 17. Table des composés de la méthode GC/MS
Différents paramètres d’identification ou d’intégration sont disponibles et très utiles lors
de proximité entre les pics ou de ressemblance entre spectres de masse. Pour commencer, nous
avons repositionné précisément le curseur à l’endroit où la recherche NIST a été effectuée. Le
nom de la molécule est ensuite entré dans le cartouche approprié.
Page 24 sur 69
de
Zone
chromatogramme
Zone spectre
de masse
Cartouche
pour le nom
Figure 18. Spectre de masse du cinnamaldéhyde
Dans l’onglet « Identification », il est possible de modifier l’intervalle de temps dans
lequel peut être identifié la molécule. Par défaut, on choisit « Nearest » comme mode de
recherche dans la liste déroulante.
L’ensemble de ces étapes a été réalisé pour chaque composé contenu dans les huiles
essentielles. Au final, la table comprend 73 molécules différentes pour la colonne apolaire.
Nous avons accompli ce même travail pour la colonne polaire, dont la table contient 71
composés.
Afin que cette analyse soit efficace, différents paramètres doivent être modifiés,
optimisant ainsi l’identification.
III. 2.3.2
Optimisation de la recherche automatique
L’analyse automatique se fait grâce à « Process Data » (Cf. image ci-dessous). Par
conséquent, chaque pic est associé à un composé de notre méthode en fonction du temps de
rétention (ici, le plus proche).
Page 25 sur 69
de
Process Data
Sélectionner
une méthode
Ouvrir un
chromatogramme
Réaliser
l’identification
Figure 19. Recberche automatique des composés du cinnamaldéhyde
Cependant, il est probable que deux molécules possèdent un temps de rétention très
proche et donc qu’il y est deux composés pour un seul pic. De plus, certain pic peuvent être
rattaché à un produit par leurs temps de rétention, mais, ils ne concordent pas, pour autant, au
niveau de leurs spectre de masse. Ces imperfections sont visibles en vérifiant une à une les
molécules dans « View Results ».
View Result
Raccourci vers les
paramètres
d’identification du
composé dans la
méthode
Retour vers
« Process Data »
Passage à la
molécule suivante
Accès aux paramètres permettant de modifier
les données affichées dans la fenêtre et ceux de
la liste des composés (RT, Height, Area…)
Figure 20. Résultats d’identification des composés du cinnamaldéhyde
Page 26 sur 69
de
Dans le cas d’une mauvaise identification, on peut diminuer l’intervalle de recherche de
la molécule en question (onglet « Identification »). De plus, il est possible de mettre le mode de
recherche « Spectrum ». Par conséquent, il faut augmenter le « Match Threshold » à 800 au
minimum, soit 80 % de concordance.
Figure 21. Optimisation de l’identification d’un composé
III. 2. 4.
Comparaison des performances des deux colonnes
On retrouve des similitudes au sujet de l’identification des composés dans les méthodes
de la colonne apolaire et polaire. Certaines des molécules données par XXXX XXXX n’ont pas
réussis à être déterminés pour les deux colonnes. La liste de ces produits se situe ci-dessous :
Nom du composé
Colonne apolaire Colonne polaire
(E)-α-atlantone
Non identifié
Non identifié
(E)-γ-atlantone
Non identifié
Non identifié
Acétate de dihydrocarvyle
Identifié
Non identifié
Germacrène-B
Identifié
Non identifié
Pogostol
Non identifié
Non identifié
α-terpinène-7-al
Non identifié
Non identifié
β-copaène
Non identifié
Non identifié
γ-terpinène-7-al
Non identifié
Non identifié
Temps de rétention des composés en annexe 5
Nous avons remarqué plusieurs différences concernant la séparation des composés
d’une huile essentielle. Le tableau suivant regroupe les observations de la colonne apolaire :
Page 27 sur 69
Observations
Composés
concernés
Co-élution
Bêtaphellandrene et
Eucalyptol
Co-élution
Menthofurane et
Menthone
Mauvaise
séparation
Temps
d'analyse plus
court
Huiles essentielles
concernés
Camphrier, Eucalyptus
mentholé, Gimgembre,
Lavandin super, Thym
saturéoïdes
de
Remarques
-
Menthe poivrée
-
p-Cymène,
Limonène et
Eucalyptol
Toutes
Leurs temps de rétention sont
très proches. Respectivement
11,832 min ; 11,974 min ;
12,125 min
-
Ylang-Ylang
Le pic du benzoate de benzyle
sort à 31,642 min
Pour la colonne polaire, des améliorations sont visibles notamment pour les co-élutions
précédentes. Cependant, d’autres composés restent compliqués à bien séparer. De plus, de
nouvelles co-élutions font leur apparition comme nous pouvons le voir ci-dessous :
Observations
Composés
concernés
Huiles essentielles
concernés
Remarques
Co-élution
Alpha-terpineol
et Acetate de
terpenyle
Laurier Noble,
Eucalyptus radié
Les pics sont confondus. On
retrouve 2 spectres de masse
différents dans un pic. Possibilité de
confondre les composés lors du
process de la méthode sur un
spectre.
Co-élution
Bêtaphellandrene et
Eucalyptol
Camphrier, Eucalyptus
mentholé,
Gimgembre, Lavandin
super, Thym
saturéoïdes
-
Co-élution
Pulégone et
Menthol
Menthe poivrée
-
Mauvaise
identification
Gammaterpinene et
Terpinolene
Camphrier, Tea-Tree
Le terpinolène se situe soit à 10,540
min ou soit à 11,644 min
(comparaison SM base NIST).
Problème avec le gamma-terpinene
qui doit être à 10,520.
Meilleure
séparation
Limonène, pCymène et
Eucalyptol
Toutes
Le pic de p-cymène sort plus tard
que les 2 autres (11,325 min)
Temps
d'analyse plus
long
-
Ylang-Ylang
À cause du benzoate de benzyle (pic
à 40,015 min)
Conclusion
Page 28 sur 69
de
On peut déduire qu’il est préférable d’analyser certains composés avec une colonne
apolaire. C’est le cas pour l’acétate de dihydrocarvyle, le germacrène B, l’apha-terpinéol, le
pulégone, le menthol, le γ-terpinène et le terpinolène. Pour d’autres molécules, la situation
s’inverse. Il vaut mieux réaliser une analyse avec une colonne polaire. Les composés concernés
sont le limonène, le p-cymène, l’eucalyptol, le menthofurane et la menthone. En revanche, on
constate qu’une co-élution persiste entre le bêta-phellandrene et l’Eucalyptol.
III.3 Analyses des huiles essentielles par GC/FID
La quantification des composés a été réalisée sur l’appareil de chromatographie en phase
gazeuse Bruker SCION 436 GC (ANA 08) équipé d'un détecteur à ionisation de flamme. Le
logiciel utilisé est Compass CDS.
Les conditions opératoires de la méthode GC/MS ont été transférées pour la méthode
GC/FID ; le débit initial de gaz vecteur à 1 mL/min a été optimisé pour atteindre la valeur finale
de débit à 1,6 mL/min pour minimiser les écarts entre les temps de rétention obtenus sur la
GC/MS et sur la GC/FID et assurer une meilleure correspondance entre les deux méthodes pour
l’identification des composés.
Conditions opératoires
- Colonne : Colonne capillaire
- Modèle : Phenomenex ZEBRON ZB-5MS
- Dimensions : 30 mètres, 0.25 mm (ID), 0.25 µm d’épaisseur de phase stationnaire
- Gaz vecteur : Hélium : 1,6 ml/min
- Température de l’injecteur : 280 °C
- Température de détecteur : 280 °C
- Programmation du four 50°C pendant 5 min, montée 5°C/min de 50 à 300°C (5 minutes)
- Mode Split : 1/20
- Range : 12
Préparation des échantillons d’huiles essentielles pour l’identification des composés en
GC/FID
On utilise le même protocole que celui en GC/MS. Une goutte d’huile essentielle est
insérée dans un vial de 20 mL à laquelle on ajoute 10 mL d’hexane.
Résultats de comparaison avec XXXX-XXXX
Les résultats de proportion de chaque composé dans les différentes huiles essentielles
sont très souvent cohérents avec les fourchettes de proportions annoncées par XXXX-XXXX.
Cependant, certaines proportions de composés ne concordent pas et sont souvent sur-évaluées
voire sous-évaluées par rapport à leur proportion réelle dans l’huile essentielle.
Tableaux de comparaisons des résultats GC/FID et XXXX-XXXX en annexe 6
On procède alors une calibration interne de la méthode GC/FID avec les composés
disponibles en stock à l’INSA de Rouen :
- Cinnamaldéhyde 99% ACROS Organics (lot A0245045)
- Géraniol 99% ACROS Organics (lot A0235119)
Page 29 sur 69
de
- Citronellal 93% ACROS Organics (lot A0250745)
- Citronellol 95% ACROS Organics (lot A0246017)
- P-cymène 99% ACROS Organics (lot A0300974)
- Menthol ACROS Chemica (lot 76306/1)
- Eugénol Janssen Chimica (lot 33930/2)
- Limonène 97% ACROS Organics (lot A009871301)
- Linalol 99% ACROS Organics
III.4 Calibration interne de la méthode par GC/FID
Cette méthode consiste à introduire une quantité précise d’un étalon interne (substance
non présente dans le mélange à doser et dont les grandeurs de rétention sont différentes de la
substance à analyser) dans chaque solution contenant la substance à doser (échantillon et
étalon).
Ce mélange se traduit par deux pics sur le tracé chromatographique : le pic de surface
SA correspondant à la substance à doser A et le pic SEI correspondant à l’étalon interne.
Si la concentration de la solution à doser est CA et celle de l’étalon interne est CEI, la quantité́
de chacun des composés dans le volume V de solution injecté est respectivement :
QA = CA × V
QEI = CEI × V
Il y a proportionnalité́ entre l’aire du pic et les quantités injectées selon :
SA=KA × QA =KA × CA× V
SEI = KEI × QEI = KEI × CEI × V
KA et KEI sont des constantes de proportionnalité́ .
En faisant le rapport de ces deux relations, on obtient :
𝑆𝐴
𝐾𝐴 × 𝑄𝐴
𝐾𝐴 × 𝑄𝐴 × V
=
=
𝑠𝐸𝐼
𝐾𝐸𝐼 × 𝑄𝐸𝐼 𝐾𝐸𝐼 × 𝑄 𝐸𝐼 × V
En posant 𝐾 =
𝐾𝐴
𝐾𝐸𝐼
, on peut en déduire CA :
𝐶𝐴 =
1
𝑆𝐴
× 𝐶𝐸𝐼 ×
𝐾
𝑠𝐸𝐼
Pour déterminer la valeur de K, on effectue un étalonnage en ajoutant une quantité́
constante et précise de l’étalon interne dans chacun des étalons de concentrations croissantes,
la concentration de l’étalon interne restant constante dans tous les échantillons. Chacun des
mélanges est injecté et la mesure du rapport des surfaces SA/SEI est directement proportionnelle
au rapport CA/CEI avec une pente égale à K.
Page 30 sur 69
de
Figure 22. Calibration interne
La même concentration connue d’étalon interne est ensuite ajoutée à la solution à doser
de concentration inconnue CAx. Après analyse chromatographique, la mesure des surfaces des
deux pics donne le rapport SAx/SEI qui à partir de la courbe d’étalonnage ou de l’expression de
CA = f(SA/SEI) permet de déduire la concentration de la solution inconnue.
III. 4. 1.
Choix de l’étalon interne
Le choix de l’étalon interne doit respecter les critères suivants :
- Un comportement chromatographique très semblable à celui du composé à doser : ses
grandeurs de rétention doivent être très proches mais bien distinctes
- Il ne doit pas interférer avec les autres substances éventuellement présentes
Plusieurs possibilités d’étalons internes ont ainsi été choisies en fonction de leur absence
dans les huiles et de leurs températures d’ébullition, pour sortir à des temps de rétention non
interférents :
- Toluène (Téb : 110 °C)
- m-xylène (Téb : 139,1 °C)
- Octane (Téb : 125 °C)
- o-xylène (Téb : 144, 43 °C)
- Éthylbenzène (Téb : 136 °C)
Après analyse des chromatogrammes avec la méthode GC/FID, les temps de rétention
suivants ont été obtenus :
- Toluène (Tr : 4,6 min)
- Octane (Tr : 5,48 min)
- o-xylène (Tr : 8,5 min)
- m-xylène (Tr : 7,96 min)
- Éthylbenzène (Tr : 6,76 min)
L’éthylbenzène est donc choisi car son temps de rétention est suffisamment éloigné du
premier composé dans les huiles essentielles (Tr α-pinène : 8,546 min) et de celui de l’hexane
(Tr hexane : 4,85 min).
III. 4. 2.
Préparation de la gamme de calibration
Page 31 sur 69
de
Préparation d’une solution mère d’éthylbenzène (étalon interne) à 1000 μg/mL
Préparation d’une solution mère à 1000 μg/mL d’éthylbenzène en pesant directement
0,2 g d’étalon interne dans une fiole jaugée de 200 mL. On ajoute ensuite le solvant de dilution
d’hexane en complétant au trait de jauge.
Préparation de la gamme de linéarité pour la gamme de calibration interne d’un composé
Préparation d’une solution mère à 1000 μg/mL du composé (ex : limonène) en pesant
directement 0,1 g du composé dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute ensuite le solvant de
dilution d’hexane en complétant au trait de jauge. On prépare à partir de cette solution mère
une gamme de linéarité de 200 à 600 μg/mL dans des fioles jaugées de 10 mL avec des pipettes
graduées de 1 mL, 2 mL, 5 mL. L’éthylbenzène (étalon interne) est également mis avec le
composé à doser dans cette fiole de 10 mL en concentration de 400 µg/mL à l’aide d’une pipette
graduée de 20 mL.
Concentration (µg/mL)
Vcomposé (mL)
Véthylbenzène (mL)
Vhexane (mL)
Vtotal fiole (mL)
200
2
4
4
10
300
3
4
3
10
400 500 600
4
5
6
4
4
4
2
1
0
10 10 10
Préparation de la gamme de linéarité pour la gamme de calibration interne de plusieurs
composés
Préparation d’une solution mère à 5000 μg/mL de plusieurs composés (ex : limonène)
en pesant directement 0,1 g de chaque composé dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute
ensuite le solvant de dilution d’hexane en complétant au trait de jauge. On prépare à partir de
cette solution mère à 5000 µg/mL une gamme de linéarité de 200 à 600 μg/mL dans des fioles
jaugées de 50 mL avec des pipettes graduées de 1 mL, 2 mL, 5 mL. L’éthylbenzène (étalon
interne) est également mis avec le composé à doser dans cette fiole de 50 mL en concentration
de 400 µg/mL à l’aide d’une pipette graduée de 20 mL.
Concentration (µg/mL)
Vcomposé1 (mL)
Vcomposé2 (mL)
Vcomposé3 (mL)
Véthylbenzène (mL)
Vhexane (mL)
Vtotal fiole (mL)
200
2
2
2
20
24
50
300
3
3
3
20
21
50
400 500 600
4
5
6
4
5
6
4
5
6
20 20 20
18 15 12
50 50 50
Cas du (E)-cinnamaldéhyde
Cette molécule n’est pas soluble dans l’hexane contrairement aux autres. Ainsi, nous
avons dû trouver un nouveau solvant. Notre choix s’est porté sur l’acétate d’éthyle.
Pour réaliser notre gamme d’étalonnage, nous avons donc utilisé notre premier
protocole, utilisant des fioles jaugées de 10 mL. La fiole d’éthylbenzène qui a servie pour cet
étalonnage, a également été complété avec de l’acétate d’éthyle.
Page 32 sur 69
III. 4. 3.
de
Résultats de la calibration interne
La calibration interne a ensuite été réalisée grâce au logiciel Compass CDS, pilotant le
chromatographe GC/FID. Des calculs complémentaires ont été effectués sur Excel avec les
masses de composés et les concentrations exactes en éthylbenzène pour calculer les rapport des
surfaces SA/SEI et rapport CA/CEI et obtenir la droite de calibration.
Tableaux de calculs des calibrations internes en annexe 7
Page 33 sur 69
de
Les huiles essentielles de Géranium Egypte et de Camphrier ont été analysées afin de
tester la calibration.
Protocole de préparation des échantillons et résultats en annexe 8
Conclusion
La calibration interne du linalol, géraniol, cinnamaldéhyde, citronellal, p-cymène,
eugénol, menthol, limonène et citronellol est validée puisque l’on obtient une droite
d’étalonnage du type y = a.x + b avec un coefficient de corrélation R2 supérieur à 0,99. On peut
observer que les composés répondent différemment à l’analyse GC/FID : certains composés
comme le cinnamaldéhyde et le citronellal répondent moins bien à l’analyse, d’autres composés
sont plus sensibles à l’analyse comme le p-cymène et expliquent les sur-évaluations de ses
proportions obtenues précédemment dans les huiles essentielles telles que l’eucalyptus
mentholé bio, tea tree ou encore origan compact bio.
Page 34 sur 69
de
CONCLUSION
Les analyses effectuées en GC/MS ont permis d’identifier un grand nombre de
composés pour les deux colonnes sur lesquelles nous avons travaillé. Au final, 73 composés,
sur les 80 d’XXXX-XXXX, sont répertoriés pour la colonne apolaire. Ils sont au nombre de 71
pour la colonne polaire. Par conséquent, chaque méthode dispose d’une base de données
importante. Ainsi, l’identification de molécules à l’état de trace, non-fournis par XXXXXXXX, est possible pour les huiles essentielles à notre disposition.
De plus, grâce à l’optimisation de ces méthodes, les composés trouvés concordent avec
leur molécule de référence à plus de 80 %.
Plusieurs co-élutions ont été observées sur chaque colonne. Cependant, un même
problème subsiste pour les deux colonnes. Il s’agit de la co-élution de l’Eucalyptol (ou 1,8cinéol) et du β-phellandrene.
La méthode crée en GC/FID, sur la colonne apolaire, peut associer 71 composés, sur les
73 trouvées en GC/MS, aux pics des huiles essentielles analysées. Les deux molécules qui n’ont
pas été déterminées sont le trans-carvéol et le 10-épi-γ-eudesmol (ou γ-eudesmol).
Cependant, les composés, dont la proportion est inférieure à 0,6 %, ne sont pas
identifiés. On remarque surtout ceci pour l’huile essentielle de la menthe verte.
Une calibration interne a été réalisée pour 9 composés disponibles à l’INSA de Rouen.
Ces derniers sont le (E)-cinnamaldéhyde, le citronellal, le citronellal, l’eugénol, le géraniol, le
limonène, le linalol, le menthol et le p-cymène. Le coefficient de corrélation pour chacune des
droites d’étalonnage est supérieur à 0,99.
La méthode d’analyse GC/FID devra être validée selon plusieurs paramètres
(spécificité, linéarité, justesse, LOQ, répétabilité…). D’autres calibrations internes pourront
être faites afin de vérifier la teneur d’autres composés potentiellement toxiques ou allergènes.
L’analyse d’autres huiles essentielles, notamment des agrumes (orange, citron, …)
contenant d’autres composés, non étudiés ici, permettra d’enrichir la base de données
d’identification et d’élargir les prestations possibles du laboratoire pour répondre aux besoins
d’universités ou d’entreprises.
Page 35 sur 69
de
BIBLIOGRAPHIE
Les huiles essentielles
 Publications scientifiques
Yoann Fillatre. Produits phytosanitaires : Développement d’une méthode d’analyse multi- résidus dans
les huiles essentielles par couplage de la chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse en
mode tandem. Analytical chemistry. Université d’Angers, 2011. French. <tel-00675561>
Concise International Chemical Assessment Document 62. COAL TAR CREOSOTE. 2004
Nabil Bousbia. Extraction des huiles essentielles riches en anti-oxydants à partir de produits naturels et
de co-produits agroalimentaires. Other. Université d’Avignon; Institut national agronomique (El
Harrach, Algérie), 2011. French. <NNT : 2011AVIG0243>. <tel-00915117>
Gilles Figueredo. Etude chimique et statistique de la composition d’huiles essentielles d’origans
(Lamiaceae) cultivés issus de graines d’origine méditerranéenne. Organic chemistry. Université Blaise
Pascal - Clermont-Ferrand II, 2007. French. <NNT : 2007CLF21732>. <tel-00717749>
Sun Kim N., Sun Lee D.S. Comparison of different extraction methods for the analysis of fragrances
from Lavandula species by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography,
2002, 982, 31-47.
Svoboda K. P., Hampson J.B. Bioactivity of essential oils of selected temperate aromatic plants:
antibacterial, antioxidant, anti inflammatory and other related pharmacological activities. Plant
Biology Department, SAC Auchincruive, Ayr ,Scotland, UK., KA6 5HW. 1999
Cassel, E.; Vargas, R. M. F.; Martinez, N.; Lorenzo, D.; Dellacassa, E. Industrial Crops & Products
2009, 29, 171-176.
Cerpa, M. G.; Mato, R. B.; Jose Cocero, M. AIChE Journal 2008, 54.
Kowalski, R.; Wawrzykowski, J. Flavour and Fragrance Journal 2009, 24, 69-74.
Chemat, F.; Lucchesi, M. E.; Smadja, J.; Favretto, L.; Colnaghi, G.; Visinoni, F. Analytica Chimica
Acta 2006, 555, 157–160.
Sahraoui, N.; Vian, M. A.; Bornard, I.; Boutekedjiret, C.; Chemat, F. Journal of Chromatography A
2008, 1210, 229–233.
 Sites internets
http://sante-medecine.commentcamarche.net/faq/7597-huiles-essentielles-proprietes-etprecautions-d-usage
http://www.vitakaruna.com/pages/proprietes-therapeutiques-et-toxicite-des-huilesessentielles.html
Page 36 sur 69
de
Contrôle analytique des huiles essentielles
 Documents universitaires
ROUESSAC, Françis et ROUESSAC Annick. (2009). Analyse Chimique : Méthodes et
techniques instrumentales. Paris : DUNOD, 510 p.
Cours de Chromatographie en Phase Gazeuse (L2). (2009). Université Paris Val de Marne,
Faculté de Sciences et Technologie.
 Documents techniques
VARIAN, INC. Operation Manual - Saturn® 2000 GC/MS MS Workstation Version 6.
(2003-2009).
Partie expérimentale au COBRA
 Publications scientifiques
SEBASTIANI E., DUGO G. et COTRONEO A., 1983 : Sulla genuinita delle essenze agrumarie. Nota
V. Valutazione di alcuni tipi di fasi stazionarie per I'analisi della frazione volatile degli olii essenziali
di limone mediante gascromatografia ad alta risoluzione. Essenz. Deriv. Agrum., Vol. 53, pp : 501514.
Nabil Bousbia. Extraction des huiles essentielles riches en anti-oxydants à partir de produits naturels et
de co-produits agroalimentaires. Other. Université d’Avignon; Institut national agronomique (El
Harrach, Algérie), 2011. French. <NNT : 2011AVIG0243>. <tel-00915117>
 Sites internet
Page 37 sur 69
de
ANNEXES
ANNEXE 1 : PROPRIETES DES COMPOSÉS PRÉSENTS DANS LES HUILES
ESSENTIELLES
ANNEXE 2 : TOXICITE DES COMPOSÉS MANIPULÉS
ANNEXE 3 : METHODES ANALYTIQUES ISSUES DES RECHERCHES
BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE 4 : CHROMATOGRAMMES OBTENUS EN GC/MS SUR LES HUILES
ESSENTIELLES
ANNEXE 5 : TEMPS DE RETENTION DES COMPOSES
ANNEXE 6 : COMPRAISONS DES RESULTATS GC/FID COBRA ET XXXX ZONE
ANNEXE 7 : TABLEAUX DE CALCULS DES CALIBRATIONS INTERNES
Page 38 sur 69
ANNEXE 8 : PROTOCOLE DE PRÉPARATION DES ECHANTILLONS ET
RÉSULTATS POUR LE GÉRANIUM EGYPTE ET LE CAMPHRIER
Page 39 sur 69
de
de
ANNEXE 1 : PROPRIETES DES COMPOSÉS PRÉSENTS DANS LES
HUILES ESSENTIELLES
Nom
M (g/mol)
Température
d’ébullition (°C)
(E)-Cinnamaldéhyde
132,16
250-252
(E) β-ocimène
136,23
65-66 (E et Z) à 13
mmHg
(E)-α-atlantone
218,34
321,1
(E)-γ-atlantone
218,34
(Z)-Dihydrocarvone
152,24
221,5 (ou 87-88 à 6
mmHg)
1,8-cinéole
154,25
176-177
10-épi-γ-eudesmol
222,37
-
Acétate d’eugényle
206,24
281-286
Acétate de
cinnamyle
176,21
265
Acétate de ciscarvyle
194,27
300,2
Page 40 sur 69
Formule
Acétate de
dihydrocarvyle
196,29
232-234
Acétate de géranyle
196,29
138 (à 25 mmHg)
Acétate de
lavandulyle
196,29
Acétate de linalyle
196,26
220
Acétate de
menthyle
198,3
228-229
Acétate de
terpényle
196,29
220
Ar-curcumène
202,34
276,3
Benzoate de
benzyle
212,24
323-324
Bornéol
154,25
213
Camphène
136,24
159
Camphre
152,23
204
Carvacrol
150,22
236,85
Page 41 sur 69
de
Carvone
150,22
227-230 (L) et 96-98
(D)
Cédrol
222,37
273
Cis-hydrate de
sabinène
154,25
-
Citronellal
154,25
207
Citronellol
156,27
225
Cuminaldéhyde
148,2
235-236
Cuparène
202,34
275 (+)
Eugénol
164,2
254
Formate de
citronellyle
184,28
235
Géraniol
154,25
229-230
Germacrène-B
204,35
287,2
Germacrène-D
204,35
279,7
Isomenthone
154,25
-
Page 42 sur 69
de
Isopulégol
154,25
212
Isopulégol-iso
154,25
91 à 12 mmHg
Limonène
136,23
170-180
Linalol
154,25
194-197
Longifolène
204,35
254 à 706 mmHg
Menthofurane
150,22
80-82 à 17 hPa soit
13 mmHg
Menthol
156,27
216
Menthone
154,25
207 à 1,013 hPa
Myrcène
136,23
167
Patchoulol
222,36
140
p-Cymène
134,22
176-178
Pipéritone
152,23
233
Page 43 sur 69
de
Pogostol
222,37
304,4
Pulégone
152,23
224
Sabinène
136,23
163-164 à 1,013 hPa
Terpinène-4-ol
154,25
211-213
Terpinolène
136,23
184-185
Thujopsène
204,35
258-260 (-)
Thymol
150,22
232
Trans-carvéol
152,23
226
Zingibérène
204,35
134 à 14 mmHg
α-bulnésène
204,35
274,5
α-cédrène
204,35
262,5
α-farnésène
204,35
279,6
Page 44 sur 69
de
α-guaiène
204,35
281,1
α-himachalène
204,35
268,4
α-patchoulène
204,35
-
α-phellandrène
136,23
171-172
α-pinène
136,23
157,9
α-terpinène-7-al
150,22
235,1
α-terpinène
136,23
173-175
α-terpinéol
154,25
217-218
α-thujène
136,23
151
β-bisabolène
204,35
275,4
β-bourbonnène
204,35
255,9
Page 45 sur 69
de
β-caryophyllène
204,35
268,4 (ou 129-130 à
19hPa)
β-copaène
204,35
255,9
β-funébrène
204,35
-
β-himachalène
204,35
-
β-phellandrène
136,23
175
β-pinène
136,23
166
βsesquiphellandrène
204,35
271,2
γ-himachalène
204,35
-
γ-terpinène-7-al
150,22
-
γ-terpinène
136,23
182
Page 46 sur 69
de
de
ANNEXE 2 : TOXICITE DES COMPOSÉS MANIPULÉS
HAP
CAS #
Acétate d’éthyle
141-78-6
(E)-Cinnamaldéhyde 14371-10-9
Symboles de risque*
Mentions de
danger**
Conseils de
prudence***
H225-H319H336
P210-P261P305+P351+P338
H315-H317H319-H335
P261-P280P305+P351+P338
Citronellal
106-23-0
H315-H317H319-H335H411
P273-P280P333+P313P337+P313-P391
Citronellol
106-22-9
H315-H317H319
P280P305+P351+P338
Ethylbenzene
100-41-4
H225-H304H332-H373H412
P210-P261-P273P301+P310P304+P340+P312P331
Eugénol
97-53-0
H317-H319
P280P305+P351+P338
Géraniol
106-24-1
H315-H317H318
P280P305+P351+P338
Hexane
110-54-3
H225-H304H315-H361fH373-H411
P201-P210-P273P301+P310P308+P313-P331
Limonène
5989-27-5
H226-H304H315-H317H410
P273-P280P301+P310-P331P501
Linalol
78-70-6
H315-H319H335
P261P305+P351+P338
Menthol
2216-51-5
H315-H318H335
P261-P280P305+P351+P338
p-Cymène
99-87-6
H226-H315H319-H335
P261P305+P351+P338
Page 47 sur 69
de
m-Xylene
106-42-3
H351
P281
o-Xylene
95-47-6
H226H312+H332H315
P280
*Pictogrammes de risque :
Corrosif
Inflammable
Toxique, irritant, sensibilisant, narcotique
Sensibilisant, mutagène, cancérogène, reprotoxique
Danger pour l'environnement
**Mentions de danger :
H225
Liquide et vapeur très inflammables
H226
Liquide et vapeurs inflammables
H302
Nocif en cas d'ingestion
H304
Peut être mortel en cas d’ingestion et de pénétration dans les voies respiratoires
H312
Nocif par contact cutané
H315
Provoque une irritation cutanée
H317
Peut provoquer une allergie cutanée
H318
Provoque des lésions oculaires graves
Page 48 sur 69
de
H319
Provoque une sévère irritation des yeux
H332
Nocif par inhalation
H335
Peut irriter les voies respiratoires
H336
Peut provoquer somnolence ou vestiges
H351
Susceptible de provoquer le cancer (indiquer la voie d'exposition s'il est
formellement prouvé qu'aucune autre voie d'exposition ne conduit au même
danger)
H361
Susceptible de nuire à la fertilité ou au fœtus
H361d
Susceptible de nuire au fœtus
H373
Risque présumé d'effets graves pour les organes (indiquer tous les organes
affectés, s'ils sont connus) à la suite d'expositions répétées ou d'une exposition
prolongée (indiquer la voie d'exposition s'il est formellement prouvé qu'aucune
autre voie d'exposition ne conduit au même danger)
H410
Très toxique pour les organismes aquatiques, entraîne des effets à long terme
H411
Toxique pour les organismes aquatiques, entraîne des effets à long terme
H412
Nocif pour les organismes aquatiques, entraine des effets néfastes à long terme
*** Conseils de prudence :
P201
Se procurer les instructions avant utilisation.
P210
Tenir à l’écart de la chaleur/des étincelles/des flammes nues/des surfaces chaudes Ne pas fumer
P261
Éviter de respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosols.
P273
Éviter le rejet dans l’environnement.
P280
Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de
protection des yeux/du visage.
P281
Utiliser l’équipement de protection individuel requis.
P301
EN CAS D’INGESTION :
P304
EN CAS D’INHALATION :
P305
EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX :
P308
EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée :
Page 49 sur 69
de
P310
Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.
P312
Appeler un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin en cas de malaise.
P313
Consulter un médecin.
P331
NE PAS faire vomir.
P338
Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être
facilement enlevées. Continuer à rincer.
P340
Transporter la victime à l’extérieur et la maintenir au repos dans une position où
elle peut confortablement respirer.
P351
Rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs minutes.
P501
Éliminer le contenu/récipient dans ...
****CMR : cancérigène, mutagène, reprotoxique
Classement cancérogène :
Groupe 1A : Cancérogène pour l’Homme / Substances dont le potentiel cancérogène pour
l’Homme est avéré
Groupe 1B : Cancérogène pour l’Homme / Substances dont le potentiel cancérogène pour
l’Homme est supposé (données animales)
Groupe 2A : Cancérogène probable pour l’Homme
Groupe 2B: Cancérogène possible pour l'Homme
Groupe 3: N'est pas classé comme cancérogène pour l'Homme
Groupe 4 : Probablement pas cancérogène pour l’Homme
Classement mutagène :
Groupe 1A : Mutagène pour l’Homme / Substances dont la capacité d'induire des mutations
héréditaires dans les cellules germinales des êtres humains est avérée
Groupe 1B : Mutagène pour l’Homme / Substances dont la capacité d'induire des mutations
héréditaires dans les cellules germinales des êtres humains est supposée
Groupe 2 : Substances préoccupantes car elles pourraient induire des mutations héréditaires
dans les cellules germinales des êtres humains.
Classement reprotoxique :
Catégorie 1A : Substances dont la toxicité pour la reproduction humaine est avérée.
Catégorie 1B : Substances présumées toxiques pour la reproduction humaine.
Catégorie 2 : Substances suspectées d'être toxiques pour la reproduction humaine.
Page 50 sur 69
Mise au point d’une technique de séparation et de quantification des composés présents dans une huile essentielle
ANNEXE 3 : METHODES ANALYTIQUES ISSUES DES RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES
Gaz vecteur et
énergie
d’ionisation
- Hélium :
1ml/min
Températures
Programmation
du four
- Injecteur :
280°C
- Détecteur :
280°C
50°C pendant 5
min, 5°C/min de
50 à 300°C, 5
min à 300°C
Matériel
Type de colonne
Chromatographe
Hewlett-Packard
HP6890 couplé
à un
spectromètre de
masse HP5973
Chromatographe
Hewlett-Packard
HP5890 équipé
d'un FID
Chromatographe
Perkin Elmer,
couplé à un MS
TurboMass
DB5 : 30 m x 0,25
mm, épaisseur de film
0,25μm
Elite 5MS
30mx0.25mmx0.25μ
m (95%diméthyl /
5%phénylpolysiloxan
e)
- Hélium : 1
ml/min
- Énergie
d’ionisation : 70
eV
- Injecteur :
250°C
- Interface :
250°C
Température
initiale : 70°C
Montée en
température :
20°C/min
Température
finale : 250°C
Chromatographe
VARIAN
CHROMPACK
- CP 3800
CP-Chirasil-Dex CB
fusedsilica WCOT :
25 m x 0,25 mm,
épaisseur de PS 0,25
μm
- Hélium : 0,3
ml/min
- Détecteur :
250°C
70ºC pendant
2,50 min, puis
s’élève par
palier de
15ºC/min à
240ºC
pendant 20 min
+ Énergie
d’ionisation : 70
eV pour SM
Durée run =
60 min
Page 51 sur 69
Injecteur
Mode
Split
1/10
Références
Huiles
essentielles
https://tel.archiv
esouvertes.fr/tel00717749/docu
ment
(page 61)
Origans
(Lamiaceae)
cultivés.
Fichier PDF :
Université de
Toulouse 2006
GC-MS.
(Google :
méthode gc
pour les huiles
essentielles)
http://www.revu
e-genieindustriel.info/d
ocannexe.php?i
d=1443
Citron et
Mandarine
Mode
Split
1/20
Mode
Split
1/20
-
Fleur de
lavande :
Lavandula
officinalis
Matériel
Type de colonne
Chromatographe
Perkin Elmer
Autosystem GC,
couplé à 2 FID
Chromatographe
Perkin Elmer
Autosystem XL,
couplé à un SM
Perkin Elmer
TurboMass
60 m x 0,22 mm,
épaisseur du film
: 0,25 μm
-1 polaire : RtxWax,
polyéthylène
Glycol
-1 apolaire : Rtx1, polydiméthylsiloxane
Chromatographe
gaz Helwett
Packard 5890,
équipé d’un FID
Chromatographe
gaz Helwett
Packard 5890,
couplé à un SM
Helwett Packard
5972
DB-5 : 25m x
0,25 mm, 0,25
µm épaisseur de
film
DB-5 : 30 m x
0.25 mm, 0.25
µm épaisseur de
film
Gaz vecteur et
énergie
d’ionisation
- Hélium :
1ml/min
+ Energie
d’ionisation : 70
eV pour SM
Températures
- Injecteur :
250°C
- Détecteur :
280°C
Programmation
du four
Passage de 60 à
230°C, à
2°C/min, puis
palier de 45
mm à 230°C
Durée run =
130 min
- Hélium : 1,2
ml/min
+ Energie
d’ionisation : 70
eV pour SM
- Injecteur :
240°C
- Détecteur :
250°C
50°C pendant 1
min, passage à
280°C (5
minutes) à
raison de
9°C/min
Durée run ~ 32
min
Page 52 sur 69
Injecteur
Références
Huiles
essentielles
Mode Split https://tel.archives1/50
ouvertes.fr/tel00441322/document
(page 298)
Mode Split
ET
1/80
http://popups.ulg.ac.
be/00379565/index.php?id=
1487&file=1&pid=1
465
Cistus
Albidus et
deux
Asteraceae
endémiques de
Corse (fleurs)
ET
Sciure de bois
et Feuilles de
Tetraclinis
articulata
Mode Split http://www.jsac.arn.
dz/Art7%20Vol(16)
N%B02.pdf
Salvia
Officinalis.L
de Tunisie.
(fleur)
Type de
Gaz vecteur et
colonne
énergie d’ionisation
Chromatographe DB35 – MS : - Azote : 1,8
SHIMADZU –
30 m x 0,25
ml/min
GC 17A, équipé mm, épaisseur
d’un FID
PS de 0,25 µm
Matériel
Chromatographe
de type Varain
CP 3800, équipé
d’un SM de
type Varian
Saturn 2000
Températures
- Injecteur :
270°C
- Détecteur :
270°C
- Hélium : 1ml/min - Injecteur :
- Énergie
220°C
d’ionisation : 70 eV
pour le SM
Programmation
du four
60 °C à
220°C à raison
de 5°C /min,
puis palier à
220°C pendant
2min
80°C (1min),
80 à 300°C à
raison de 10°C/
min, puis palier
à 300°C
pendant 30 min
Page 53 sur 69
Injecteur
-
Huiles
essentielles
http://www.afriquesc Ruta
ience.info/docannexe Chalepensis
.php?id=1554
L. de
Tlemcen
(fleur)
Références
NON
RETENUE
de
ANNEXE 4 : CHROMATOGRAMMES GC/MS OBTENUS SUR LES
HUILES ESSENTIELLES
Figure 23. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de clous de girofle
Figure 24. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de coriandre
Page 54 sur 69
Figure 25. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de cumin
Figure 26. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus citronné bio
Page 55 sur 69
de
Figure 27. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus mentholé bio
Figure 28. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’eucalyptus radié bio
Figure 29. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de genévrier
Figure 30. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de géranium d’Egypte bio
Page 56 sur 69
de
Figure 31. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle du gingembre
Figure 32. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de laurier noble bio
Figure 33. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavande aspic
Figure 34. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de lavandin super
Page 57 sur 69
de
Figure 35. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe poivrée
Figure 36. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de menthe verte
Figure 37. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’origan compact bio
Figure 38. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de patchouli
Page 58 sur 69
de
Figure 39. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de romarin à cinéole
Figure 40. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de sarriette des montagnes bio
Figure 41. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’arbre à thé
Figure 42. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de térébenthine
Page 59 sur 69
de
de
Figure 43. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle de thym saturéoïdes bio
Figure 44. Chromatogramme GC/MS de l’huile essentielle d’Ylang Ylang complète
ANNEXE 5 : TEMPS DE RÉTENTION DES COMPOSÉS
Composé
(E) -cinnamaldéhyde
(E) β-ocimène
(E)-α-atlantone
(E)-γ-atlantone
(Z)-dihydrocarvone
1,8-cinéole (= Eucalyptol)
10-épi-γ-eudesmol (= γeudesmol)
acétate d’eugényle
acétate de cinnamyle
acétate de cis-carvyle
acétate de dihydrocarvyle
acétate de géranyle
Colonne apolaire
Tr méthode
Tr méthode
GC/ MS (en min) GC/ FID (en min)
19,647
19,730
12,600
13,130
Non identifié
Non identifié
17,379
17,700
12,125
12,570
Colonne polaire
Tr méthode
GC/ MS (en min)
28,829
10,842
20,386
9,289
28,515
Non identifié
30,932
25,924
24,223
21,918
20,998
22,482
26,220
24,230
22,200
21,300
22,720
33,832
31,951
24,165
Non identifié
23,912
Page 60 sur 69
acétate de lavandulyle
acétate de linalyle
acétate de menthyle
acétate de terpényle
ar-curcumène
Benzoate de benzyle
bornéol
camphène
camphre
carvacrol
carvone
cédrol
cis-hydrate de sabinène (=
4-Tujanol)
19,877
18,906
20,051
21,618
25,106
31,638
16,598
9,121
15,860
20,305
18,799
28,252
citronellal
citronellol
cuminaldéhyde
cuparène
16,097
18,291
18,777
13,327
25,825
eugénol
formate de citronellyle
géraniol
germacrène-B
germacrène-D
iso germacrène D
isomenthone
isopulégol (-)
isopulégol-iso (+)
limonène
linalol
longifolène
menthofurane
menthol
menthone
myrcène
patchoulol
p-cymène
pipéritone
pogostol
pulégone
21,784
19,609
18,943
23,802
25,129
25,129
16,381
15,913
sabinène
20,300
19,380
20,390
21,850
25,150
31,370
16,780
9,690
16,160
20,640
19,090
27,980
trop petit non
intégré menthe
verte (13,78 min)
16,390
18,620
19,050
problème
d'intégration cèdre
de virginie
22,140
19,870
19,340
23,970
25,160
25,120
16,730
16,210
11,974
14,368
23,287
16,134
16,777
16,095
10,575
29,612
11,832
19,062
12,460
14,910
23,270
16,690
17,050
16,440
10,610
29,210
12,400
19,350
Non identifié
18,555
18,910
9,935
10,600
Page 61 sur 69
de
20,461
19,226
19,298
22,448
24,259
40,026
22,588
5,141
18,015
33,124
23,313
31,243
16,799
17,287
24,090
24,439
25,286
32,249
20,767
25,816
Non identifié
22,720
22,720
17,416
19,498
19,306
9,097
18,998
19,304
17,267
21,174
16,705
8,088
32,350
11,318
23,157
21,268 (coélution
menthol)
6,671
terpinène-4-ol
terpinolène
thujopsène
thymol
trans-carvéol
zingibérène
α-bulnésène (= δ-Guaiene)
α-cédrène (-)
α-farnésène
α-guaiène
α-himachalène
α-patchoulène
α-phellandrène
α-pinène
α-terpinène
α-terpinène-7-al (= 1,3-pMenthadien-7-al)
α-terpinéol
α-thujène
β-bisabolène
β-bourbonnène
β-caryophyllène
β-copaène
β-funébrène
β-himachalène
β-phellandrène
β-pinène
β-sesquiphellandrène
γ-himachalène
γ-terpinène
γ-terpinène-7-al
16,879
13,810
24,020
20,055
18,042
25,437
25,623
23,536
25,673
23,940
24,391
24,617
11,147
8,546
11,478
17,140
13,430
23,950
20,360
25,470
25,730
23,490
25,740
24,100
24,400
24,530
11,650
9,200
12,040
de
20,273
11,642
20,700
32,613
25,583
23,044
22,924
19,372
23,748
19,987
21,155
20,904
8,012
4,102
8,481
Non identifié
17,344
8,276
25,786
22,619
23,547
25,580
25,672
12,009
10,108
26,172
25,117
12,907
17,540
8,990
25,760
22,760
23,650
Non identifié
25,600
25,680
Non identifié
10,740
26,130
25,090
13,470
Non identifié
Page 62 sur 69
22,523
4,224
23,213
18,096
20,089
19,449
22,803
9,332
6,249
24,149
22,395
10,512
de
ANNEXE 6 : COMPARAISONS DES RESULTATS GC/FID
COBRA ET XXXX ZONE
Lot PHE0277
Composé
Bêta-phellandrène
E-cinnamaldéhyde
Acétate de cinnamyle
Eugénol
Bêta-caryophyllène
Page 63 sur 69
Cannelle écorce (réf 1602)
Analyse Aroma Zone Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
1,90 - 2,66
66,39 - 67,70
79,59
1,73 - 2,71
2,27
3,75 - 4,28
3,73
3,79 - 4,72
3,86
Cèdre de Virginie (réf 716)
Lot PHE0277 Cèdre de l'Atlas (réf 150)
Composé
Proportion (%)
Proportion (%)
Composé
Proportion (%)
Proportion (%)
Bêta-himachalène
45,64 - 50,56
50,97
alpha-cédrène + bêta-funébrène
23,81
35,36
alpha-himachalène
16,17 - 17,08
18,67
thujopsène
20,29
25,23
Gamma-himachalène
10,45 - 11,83
10,89
cuparène
2,75
(E)-alpha-atlantone
2,58 - 2,59
cédrol
26,32
28,23
(E)-gamma-atlantone
1,12 -Laurier
1,88 noble bio (réf 1602)
-
Lot PHE0277
Lot PHE0225
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Géranium Egypte
Composé
Proportion
(%) bio (réf 796) Proportion (%)
Lot PHE0129
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Béta-pinène
3,92 - 5,46
4,59
Composé
Proportion (%)
Proportion (%)
Sabinène
6,15 - 6,31
7,07
Citronnelol
31,86 - 33,876
40,95
Alpha-pinène
5,78 - 10,81
6,28
Géraniol
14,07 - 15,22
18,55
Alpha-terpinéol
1,68 - 4,60
1,75
Linalol
3,81 - 5,15
5,50
1,8-cinéole
36,94 - 41,99
46,08
Formate de citronnellyle
7,09 - 8,01
8,32
Acétate de terpényle
7,05 - 10,46
7,15
Isomenthone
4,75 - 6,83
5,82
10-épi-gamma-eudesmol
4,30 - 5,16
4,86
Lavandin super (réf 544)
Lot PHE0129
Lot PHE0129
Composé
Germacrène-D
Bêta-caryophyllène
alpha-farnésène
Benzoate de benzyle
Lot PHE0129
Composé
citronnellol
isopulégol
isopulégol-iso
Composé
linalol
bornéol
acétate de linalyle
acétate de lavandulyle
camphre
Analyse Aroma Zone
Proportion (%)
30,60 - 33,64
2,75 - 3,08
36,94 - 42,84
1,22 - 1,70
3,82 - 4,18
Analyse COBRA
Proportion (%)
39,83
2,73
30,26
1,29
4,59
1,8-cinéole + bêta-phellandrène
3,46 - 3,78
2,62
Menthe poivrée (réf 39)
Lot PHE0129
Ylang Ylang complète bio (réf 301) Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Analyse Aroma Zone ComposéAnalyse COBRA Proportion (%)
Proportion (%)
Proportion (%)
menthol Proportion (%) 40,86 - 41,52
41,57
18,04 - 24,50
1,8-cinéole 13,73
4,67 - 5,05
5,82
14,72 - 15,13 menthofurane 18,97
1,13 - 1,55
1,13
9,44 - 10,49
menthone 10,30
25,21 - 25,92
31,91
5,68 - 7,32
8,42
pulégone
1,04 - 1,23
1,27
acétate de menthyle
4,13 - 4,15
3,28
Eucalyptus citronné
(réf 31)
Lotbio
PHE0129
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Composé
Proportion (%)
Proportion (%)
limonène
3,19 - 5,70
6,28
alpha-pinène
myrcène
6,39 - 7,80
8,74
bêta-pinène
3,89 - 4
alpha-terpinène
alpha-terpineol
terpinène-4-ol
linalol
acétate d'alpha-terpényle
1,8-cinéole
Lot PHE0222
Composé
gamma-terpinène
alpha-terpinène
terpinolène
p-cymène
terpinène-4-ol
alpha-terpinéol
Eucalyptus radié bio (réf 1590)
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
5,87 - 5,89
7,31
2,41 - 2,48
1,98
1,26
0,96
0,59
0,57
0,65
9,37 - 10,12
7,82
1,5
1,11
0,42
1,84
1,00
68,26
74,60
Tea tree (réf 192)
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
Sariette des montagnes (réf 86)
Lot OHE046122,33
21,28
9,47
9,76
Composé
Proportion (%)
Proportion (%)
3,38
coélution avec gamma-terpinène
Carvacrol
45,58 - 46,08
46,93
2,60
3,27
Thymol 47,82
5,41 - 5,86
5,69
42,20
Gamma-terpinène
14,12 - 15,92
17,02
2,77
2,95
p-cymène
10,91 - 11,52
13,20
Page 64 sur 69
de
Lot PHE0129
Composé
pipéritone
alpha-phellandrène
p-cymène
alpha-thujène
terpinène-4-ol
Eucalyptus mentholé bio (réf 540)
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
35,61
41,95
17,92 - 15,88
17,46
2,97 - 4,01
3,58
1,79 - 2,32
1,70
4,00 - 4,54
4,88
Lot PHE0222
Composé
alpha-pinène
Bêta-pinène
limonène
bêta-caryophyllène
longifolène
Composé
Linalol
Limonène
1,8-cinéole
Camphre
Composé
alpha-pinène
béta-pinène
Bornéol
1,8-cinéole
Camphre
Romain à cinéole (réf 814)
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
9,37 - 11,86
11,63
4,81 - 7,53
7,32
2,35 - 3,09
2,49
46,62 - 44,63
49,66
11,10 - 14-10
11,69
Térébenthine (réf 542)
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
71,43 - 72,63
75,49
14,57 - 18,65
14,82
2,02 - 4,99
4,90
1,75 - 2,19
1,76
1,03 - 1,25
0,96
Lavande aspic (réf 7)
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
39,92 - 42,54
42,52
0,28 - 1,97
2,75
25,95 - 29,51
28,23
11,61 - 12,29
12,50
Lot PHE0129
Lot OHE0461
de
Lot OHE0461
Composé
gamma-terpinène
p-cymène
Carvacrol
Thymol
Béta-caryophyllène
Lot PHE0277
Composé
linalol
alpha-pinène
gamma-terpinène
limonène
camphre
acétate de géranyle
Page 65 sur 69
Origan compact bio (réf 475)
Analyse Aroma Zone
Analyse COBRA
Proportion (%)
Proportion (%)
17,46
16,78
9,32
9,70
41,63 - 49,89
49,90
16,38 - 19,50
16,37
1,65 - 1,84
1,413
Coriandre (réf )
Proportion (%)
Proportion (%)
63,18
67,31
9,41
9,01
5,98
5,65
4,37
4,46
5,4
5,54
2,33
1,61
de
ANNEXE 7: TABLEAUX DE CALCULS DES CALIBRATIONS
INTERNES
Page 66 sur 69
Page 67 sur 69
de
de
ANNEXE 8 : PROTOCOLE DE PRÉPARATION DES
ÉCHANTILLONS ET RÉSULTATS POUR LE GÉRANIUM ÉGYPTE
ET LE CAMPHRIER
Préparation d’une solution mère d’éthylbenzène (étalon interne) à 1000 μg/mL
Préparation d’une solution mère à 1000 μg/mL d’éthylbenzène en pesant directement
0,2 g d’étalon interne dans une fiole jaugée de 200 mL. On ajoute ensuite le solvant de dilution
d’hexane en complétant au trait de jauge.
Préparation d’une solution mère en huile essentielle
0,25 g d’huile essentielle est pesé précisément dans une fiole jaugée de 50 mL. On
complète ensuite au trait de jauge avec de l’hexane.
Préparation des échantillons d’huile essentielle avec l’étalon interne pour l’analyse en
GC/FID
On prélève 5 ou 10 mL de solution mère d’huile essentielle, à l’aide d’une pipette jaugée
de 5 ou 10 mL, que l’on introduit dans une fiole jaugée de 25 mL. On ajoute ensuite 10 mL de
solution mère d’éthylbenzène, en utilisant une pipette jaugée de 10 mL, pour avoir une
concentration en éthylbenzène à 400 µg/mL. La fiole jaugée est ensuite complétée au trait de
jauge avec de l’hexane.
Résultats obtenus pour le Géranium Egypte avec une prise de 5 mL en solution mère de
l’huile essentielle étudiée (masse de géranium Egypte pesée = 0,2594 g)
Nom du
composé
Céchantillon
en µg/mL
Cmère
en µg/mL
Linalol
Citronnelal
Citronellol
Géraniol
42,70
27,86
288,60
164,84
213,50
139,30
1443,00
824,20
Masse
composé
en µg
10675
6965
72150
41210
Proportion
en %
Proportion
XXXX-Zone
4,12
2,69
27,81
15,89
4,48
32,868
14,645
Ecart
relatif
(en %)
8,14
15,38
-8,48
Résultats obtenus pour le Géranium Egypte avec une prise de 10 mL en solution mère de
l’huile essentielle étudiée (masse de géranium Egypte pesée = 0,2594 g)
Nom du
composé
Céchantillon
en µg/mL
Cmère
en µg/mL
Linalol
Citronnelal
Citronellol
Géraniol
80,59
49,59
638,37
313,71
201,48
123,98
1595,93
784,28
Masse
composé
en µg
10074
6199
79796
39214
Proportion
en %
Proportion
XXXX-Zone
3,88
2,39
30,76
15,12
4,48
32,868
14,645
Page 68 sur 69
Ecart
relatif
(en %)
13,32
6,41
-3,22
de
Résultats obtenus pour le Camphrier avec une prise de 5 mL en solution mère de l’huile
essentielle étudiée (masse de camphrier pesée = 0,2556 g)
Nom du
composé
Céchantillon
en µg/mL
Cmère
en µg/mL
p-Cymène
Limonène
110,78
284,09
553,9
1420,45
Masse
composé
en µg
27695
71022,5
Proportion
en %
Proportion
XXXX-Zone
10,84
27,79
8,22
24,64
Page 69 sur 69
Ecart
relatif
(en %)
-31,82
-12,77

Identification de dosage de composés aromatiques dans des huiles

Transcription

Documents pareils

huile essentielle de géranium rosat bio

GAULTHERIA PROCUMBENS

Formation aroma reflexologie energetique

Formation phytothérapie et aromathérapie en podologie

Les 8 huiles essentielles indispensables Les 5 huiles

tendinite - Pharmacie de la Mairie

compte rendu de la journee de formation aromatherapie et

Fiche produit complète : Huile essentielle de Sapin de siberie

Info-Verte Février 2015 – L`herboristerie vétérinaire au service de