HPLC/UV - Master CHIMIE

Johanna BOY; Ingrid TELCHID
Master 2 Professionnel "Chimie Analytique et Instrumentation"
Les différentes bandes d’un spectre d’émission:
PRINCIPE DE LA FLUORESCENCE
- Bande de fluorescence: bande très large
La Fluorescence est une propriété des fluorophores
organiques, qui sont caractérisés par un λ d’ excitation et
un λ d’émission, un rendement quantique de fluorescence Фf
et une durée de vie de l’ordre de la nanoseconde.
L’ irradiation d’ une molécule dans son état fondamental
(So) par une source lumineuse externe telle qu’un laser
ou une lampe UV, apporte de l’énergie (hνEx) qui sera
absorbée par le fluorophore, ce qui permet le passage à un
état excité de la molécule (S1’).
- Diffusion Rayleigh: réémission d’une petite fraction de
lumière excitatrice dans toutes les directions par les
molécules de solvant avec la même longueur d’onde.
Un photon hνEM est réémis, permettant au fluorophore de
retourner à son état fondamental. Du fait de la
dissipation d’énergie pendant l’état d’excitation, l’énergie
du photon réémis est plus basse et donc la longueur d’onde
est plus élevée.
PARAMETRES DE MESURES
Balayage: 200 à 800 nm
Absence de filtres
λ exc = 347 nm
λ em = 450 nm
Fenêtrage:
Excitation = 5 nm
Emission = 5 nm
¾ Vit. de balayage = 1000 nm/min
¾
¾
¾
¾
¾
- Diffusion Raman: elle est 100 à 1000 fois plus faible que la
diffusion Rayleigh. Elle provient d’un transfert d’une partie
de l’énergie de la radiation excitatrice aux molécules de
solvant sous forme d’énergie vibrationnelle.
Sa position dépend du λ d’ excitation (l’écart λ Rayl–λ Ram
est toujours identique pour un même fluorophore.)
RESULTATS
PHENOMENE DE QUENCHING
Limite de linéarité I fluo = f[Cm(Q)](λ=600 nm)
900
800
Zone de linéarité:
I fluo en u.a
700
600
500
0.1 à 1 ppm
Auto-absorption
400
300
200
100
0
0
20
40
60
80
100
120
Cm (Q) en ppm
Courbe d’ étalonnage I fluo= f[Cm(Q)] (λ=600 nm)
La présence d’ ions interférents peut
entraîner le phénomène de quenching c’est
à dire diminution ou extinction de la
fluorescence. Ce phénomène est mis en
évidence par les ions Cl[Cl -] ajouté en
mol/L
I fluo à
λem = 550 nm
Io/I
0
3,03. 10-4
7,56. 10-4
1,51. 10-3
3,03. 10-3
213,8797
202,6445
191,8508
171,3544
143,1775
1
1,0607
1,1148
1,2482
1,4938
N° échantillon
1
2
3
4
N° opérateur
1
1
2
2
Io/I = 1 + Ksv [Cl-]
DOSAGE DE LA QUININE:
N° échantillon
1
2
3
4
I fluo à λem = 600 nm
50,1443
47,7672
49,0919
51,4441
TONIC
N° opérateur
1
1
2
2
I fluo à λem = 600 nm
45,3767
44,6691
44,6913
44,7289
Cm (Q)= 66 ppm
AUTRES SPECTRES
QUININE
Spectre UVvisible de la
quinine dans
H2SO4 avec
Cuve en quartz
300 €
Spectrofluorimètre
30000 €
AVANTAGES ET INCONVENIENTS
La spectrofluorométrie
avantages:
présente
de
nombreux
- sensibilité ( 100 à 1000 fois supérieure qu’en UVvisible)
- peu de préparation de l’échantillon
-acquisition rapide des spectres
- simplicité d’utilisation
Cm (Q) = 10 ppm
Spectre
d’excitation à
La quinine est un alcaloïde fluorescent naturel d’Amérique du Sud extrait de
l’écorce de quinquina, utilisée dans de nombreux médicaments pour la prévention du
paludisme. Ce tonique est également utilisé pour parfumer les boissons.
D’après l’équation
de Stern-Volmer
Cm (Q)= 73 ppm
I fluo = 2,3.Io.ε.l.Фi.[Cm(Q)]
= K.[Cm(Q)] si Abs < 0.04
C20H24N2O2 MM = 324 g/mol
Фf = 54 %
Droite Io/I = f([Cl-])
On obtient :
Ksv = 161,22 L/mol
SCHWEPPES
Spectrofluorimètre Perkin-Elmer LS 55
Promotion 2007
Mais a quelques inconvénients:
λ em = 450 nm
permet de
confirmer le
choix de la
longueur d’onde
d’excitation
- pour les solutions trop concentrées: absence de
linéarité
phénomène d’auto- quenching
PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)
Elle permet la séparation d’un ou plusieurs composés d’un mélange, leur identification et leur quantification. La chromatographie en phase liquide est une méthode physico-chimique basée sur des différences
d’interactions. Les molécules des produits à séparer ( solutés ) sont mises en fonction dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide ( éluant ). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire contenue dans la colonne chromatographique. Ces interactions aboutissent sur la séparation désirée. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression,
parcourt en permanence le système chromatographique, dont fait partie la colonne. Les composés en solution se répartissent suivant leurs affinités entre la phase mobile et la phase stationnaire.
PARAMETRES DE MESURES
¾ Colonne: C8
¾ Phase mobile:
CH3OH/CH3CN/CH3COONH4
( 45:15:40 % v/v/v)
¾ Débit: 1,0 mL/ min
¾ Détecteur UV: λ = 347 nm
RESULTATS
DOSAGE DE LA QUININE PAR HPLC
Droite d’étalonnage Aire = f([Cm(Q)])
SCHWEPPES
TONIC
Aire 1 = 359920 u.a
Aire 1 = 326260 u.a
Aire 2 = 353090 u.a
Aire 2 = 327470 u.a
Moyenne = 356505 u.a
quinine
Cm (Q) = 61 ppm
Cm (Q) = 56 ppm
Chromatogrammme du tonic
Chaîne HPLC Gilson
Moyenne = 326865 u.a
Chaîne HPLC
24000 €
* J. E. O’Reilly, Fluorescence Experiments with Quinine, Journal of Chemical Education, 1975, 52(9), 610-612
* V.F. Samanidou, E.N. Evaggelopoulou, I.N. Papadoyannis, Simple and rapid HPLC method for the determination of Quinine in soft drinks using fluorescence detection, Journal of liquid chromatography & related
technologies, 2004, 27(15), 2397 - 2406