TP Influence de l`irradiation aux UV sur une culture de levure

TP Influence de l'irradiation aux UV sur une cult
Extrait B.O.
Nombre de séances : 1
Niveau de difficulté :
Variation génétique
et mutation de l'ADN
(1-A)
Problématique
scientifique
Lors de la réplication de
l'ADN, des erreurs peuvent
subvenir dont la fréquence
peut varier en fonction
d'agents extérieurs. Ces
erreurs peuvent perdurer
pour aboutir à une mutation qui participe au fil du
temps à la variabilité génétique.
Certains facteurs environnementaux (UV, benzène)
ont pour conséquence une
multiplication de ces mutations.
Comment mettre en évidence et analyser l'influence de ces facteurs sur
une culture de levures ?
Mode opératoire
On soumet une population de cette levure
S.cerevisiae ADE2 à un niveau progressif de rayonnement ultraviolet.
On mesure ensuite les effets de cette exposition :
- Par comptage du nombre de colonies viables,
- Par rétablissement d’un phénotype sauvage (vu en
seconde).
La levure S.cerevisiae ADE2 est une levure qui a
subi une mutation sur sa chaîne de biosynthèse
de l’Adénine, qui la rend auxotrophe, c’est-à-dire
qu’elle est incapable de synthétiser ce composé.
En l’absence d’une quantité suffisante d’Adénine
dans le milieu, la levure accumule un produit
intermédiaire de couleur rose.
Pourquoi la levure S.cerevisiae ADE 2 ?
Avec cette souche, on peut visualiser la conséquence
de certaines mutations.
Avant le TP
- Coulage du milieu dans les boîtes de Pétri (selon
le kit)
- Repiquage des levures souches
Avant d’ouvrir la boîte de Pétri contenant les
levures souches, veillez à nettoyer le poste de
travail à la javel, les mains à l’alcool et portez une
blouse. Tout le matériel au contact des levures et
des boîtes de Pétri doit être stérile.
- Préparation de la suspension de levure
➝ Ouvrir la boîte de S.cerevisiae et récuperer 2
colonies de levures à l’aide d’un inoculateur
stérile
➝ Mettre en suspension ces colonies dans un tube
stérile avec 2 mL d’eau stérile. (1 colonie de 1 mm
environ pour suspension dans 1 mL d’eau)
➝ Agiter cette solution au vortex, elle doit être
légèrement trouble
➝ Répéter cette opération pour chaque binôme
Il est conseillé à l’enseignant de réaliser lui-même
cette phase préparatoire.
Pendant le TP
Préparation des boîtes de gélose YPG :
Chaque binôme dispose de 5 boîtes de Pétri, identifier sur le fond à l’aide d’un marqueur comme suit :
t 0 s / t 15 s / t 30 s / t 60 s / t 120 s
À partir de la solution préparée précédemment,
déposer dans chaque boîte 2 gouttes de solution de
levure au centre de la boîte.
Utiliser l’étaleur stérile de façon circulaire afin de
répartir les levures sur toute la surface de la boîte,
jusqu’à ce que celles-ci apparaissent sèches (les
levures doivent bien imprégner l’agar, pour assurer
une répartition homogène), puis refermer.
Exposition des boîtes aux UV :
4 des boîtes vont subir une exposition aux UV
(1 pendant 15 s, 1 pendant 30 s, 1 pendant 60 s,
1 pendant 120 s). La 5e boîte t 0 s servira de témoin.
La lampe doit est réglée sur λ = 254 nm (UV-C). Les
couvercles sont ôtés le temps de l’exposition (car le
rayonnement UV ne traverse pas le polycarbonate).
Ensuite, stocker les boîtes de Pétri dans un incubateur à 28 °C. Les résultats seront visibles dès le 5e
jour.
En l’absence d’incubateur, laisser les boîtes de Pétri
à température ambiante durant 2 jours de plus.
Elimination des boîtes :
Ne pas jeter les boîtes à la poubelle, il faut détruire
les cultures par stérilisation auparavant.
Après l’observation, placer les boîtes dans de l’eau
de javel diluée pendant 48 heures.
Vous pouvez également utiliser un autoclave
(120 °C pendant 20 minutes).
Trucs et astuces
Il est possible en utilisant un
masque cachant trois quarts
de la boîte de Pétri, d'exposer
1 seule boîte à 4 temps différents d'exposition et ainsi de
faire travailler les binômes sur
1 seule boîte.
Irradiation des levures dans l'enceinte UV.
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e culture de levures
Résultats et exploitations
Matériel nécessaire
Réf. 108 022
Réf. 535 050
Réf. 543 005
Réf. 701 435
Réf. 701 441
Réf. 701 548
TP SVT
S. cerivisiae + adénine
+ 500 mL milieu YPG
prêt à couler
Mini-incubateur
Pack de matériel stérile
prêt à l'emploi
Enceinte UV
Agitateur type Vortex
Bec électrique Techni +
Compter le nombre de colonies dans un
logiciel de traitement de photo ou en
comptant le nombre de colonies sur 1 cm2
en utilisant un masque puis extrapolé cette
valeur pour l’ensemble de la culture.
Renouveler l’opération pour chaque boîte
ayant eu des temps d’exposition différents.
En parallèle, un groupe peut compter le nombre de colonies blanches.
En résumé
Le nombre de colonies qui se développe est
directement impacté par le temps d'exposition aux UV, le nombre de colonies diminue
quand le temps d'exposition augmente.
Les UV ont donc un effet létal sur les levures.
Pour aller plus loin
Le pourcentage de colonies blanches
augmente avec le temps d'exposition
aux UV. Les mutations sont favorisées par
l'exposition aux UV.
Certains groupes peuvent :
-
Réaliser l'expérience à une longueur
différente (= 365 nm) afin de comparer
la dangerosité des rayonnements.
-
Faire varier la concentration d'Adenine
dans le milieu.
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