Le modèle animal d`inflammation au Dextran Sodium Sulfate

ARTICLE ORIGINAL
Le modèle animal d'inflammation au Dextran
Sodium Sulfate : études de mécanismes
d'action proinflammatoire et génotoxique
chez le rat
D. TARDIEU, J.P. JAEG et C.R. PETIT
École Nationale Vétérinaire de Toulouse, UMR 1089, 23 Chemin des Capelles, F-31076 Toulouse cedex
RÉSUMÉ
SUMMARY
Le Dextran Sulfate de Sodium (DSS) distribué dans l'eau de boisson peut
provoquer une inflammation du tube digestif et produire des tumeurs colorectales chez le rongeur. Le DSS est très utilisé en tant que modèle animal
des atteintes inflammatoires humaines du tube digestif. Cependant, le mode
d'action de cette molécule est encore peu connu. Nous avons montré précédemment que le traitement par du DSS 3 % et 6 % dans l'eau de boisson
pendant deux jours augmentait les taux de 8-oxo-7,8-dihydro-2'-déoxyguanosine (8-oxodGuo) dans l'ADN de la muqueuse colique chez le rat. Le travail présenté ici nous a permis d'évaluer in vivo l'importance des groupements sulfates du DSS dans l'inflammation produite chez le rat en comparant ses effets au dextran, une molécule identique dépourvue de groupements sulfates. Les paramètres physiopathologiques classiquement mesurés
confirment la capacité inflammatoire du DSS. En revanche, les animaux
traités par le dextran ne manifestent aucune symptomatologie. Par ailleurs,
l'administration de DSS n'a pas eu d'effet mesurable sur la concentration des
principales protéines sanguines du rat.
L'augmentation de 8-oxodGuo semble être la conséquence de l'inflammation provoquée, corollaire de la production connexe d'espèces oxygénées
réactives. Toutefois, nous avons voulu éliminer la possibilité d'une oxydation directe de l'ADN par le DSS. L'incubation d'ADN de thymus de veau
en présence de DSS 10-3 % ne montre aucune augmentation significative
des taux de 8-oxodGuo mesurés par HPLC EC par rapport aux contrôles
négatifs et positifs réalisés.
The Dextran Sodium Sulfate inflammation model : studies about
mechanisms of pro-inflammatory and genotoxic action. By D. TARDIEU, J.P. JAEG and C.R. PETIT.
MOTS-CLÉS : DSS - 8 oxodGuo - inflammation - Dextran.
KEY-WORDS : DSS - 8 oxodGuo - inflammation - Dextran.
1. Introduction
part de l'inflammation et d'un possible rôle direct du DSS.
Nous avons récemment démontré qu'un traitement de 2 jours
par le DSS (3 et 6 % dans l'eau de boisson) doublait le taux
d'une lésion oxydative mutagène, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'déoxyguanosine (8-oxodGuo) dans l'ADN de la muqueuse
colique de rats [4]. L'augmentation de ce marqueur d'oxydation de l'ADN, présent dans d'autres organes dans certaines
situations d'inflammation et de carcinogenèse, a permis de
corréler inflammation colique et dommages oxydatifs dans le
cas du côlon. Ces dommages oxydatifs sont accompagnés
d'une forte augmentation de la production cellulaire de super-
L'inflammation chronique du tube digestif est un facteur de
risque de cancer colorectal chez l'homme et l'animal [1]. La
colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de
Sodium (DSS) chez les rongeurs est un modèle reconnu d'affections inflammatoires chroniques humaines comme la
maladie de Crohn et la colite ulcéreuse [2].
Outre l'inflammation, le DSS induit à terme chez le rat des
tumeurs coliques dont la pathogénie n'est pas entièrement
élucidée [3] : il est notamment difficile de faire à priori la
Revue Méd. Vét., 2001, 152, 11, 811-814
Dextran Sodium Sulfate (DSS) given in drinking water, can induce colonic inflammation and produce colorectal tumors in rodents. DSS is frequentaly used as an animal model for human inflamatory bowel diseases.
However, its mode of action remains poorly elucidated. As we previously
shown, rats fed for two days with water containing 3 % and 6 % DSS had
8-oxo-7,8-dihydro-2'-déoxyguanosine (8-oxodGuo) levels in DNA colonic
mucosa doubled as compared with controls. In this work, we tested the role
of sulfate moieties on the inflammatory ability of DSS. Colonic inflammation was monitored in rats fed with DSS 6 % in drinking water as compared
to animals receiving dextran 6 %, that is the same molecule lacking the sulfate moieties. The physiopathologic parameters confirm the inflammatory
capacity of DSS in rodents, while in rats given dextran no colonic inflammation was detectable. On the other hand, the administration of DSS had no
effect on the main blood proteins of the rat.
8-oxodGuo doubling seems to be a consequence of inflammation, linked
with reactive oxygen species production. However, we wished to check the
possibility of a direct DNA oxidation by DSS. In vitro incubation of calf
thymus DNA with DSS at different concentrations produced no significantly different levels of 8-oxodGuo between DSS-treated, positive and negative controls, as mesured by HPLC EC.
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oxyde : l'un et l'autre sont abolis par un traitement par des
antiinflammatoires non stéroïdiens [5], reconnus protecteurs
contre la cancérogenèse colique.
Le mécanisme d'action du DSS n'est cependant pas totalement connu. L'objectif de ce travail a été d'évaluer in vivo
l'importance des groupements sulfates sur les paramètres
caractéristiques de l'inflammation colique [6].
Par ailleurs, le DSS, malgré un poids moléculaire important, peut pénétrer par pinocytose à l'intérieur des cellules de
la muqueuse [7]. Un rôle direct dans l'oxydation de l'ADN ne
peut donc pas être écarté à priori.
Afin de l'explorer, nous avons eu pour second objectif d'estimer in vitro le pouvoir oxydatif potentiel direct du DSS sur
de l'ADN en solution.
Nous montrons ici que les groupements sulfates sont indispensables à l'établissement de l'inflammation colique, et que
le DSS n'exerce aucun effet oxydatif direct sur l'ADN en l'absence de système de bioactivation.
2.Matériel et méthodes
MATÉRIEL DE L'ÉTUDE IN VIVO
Le Dextran (DEX), et le Dextran Sulfate de Sodium (DSS),
proviennent de ICN Biomedicals, Aurora, USA (9004-54-0
et 9011-18-1).
Le sang fécal a été mis en évidence grâce au kit Hémoccult
II (SKD, Gagny, France), les protéines ont été dosées à l'aide
du kit Biorad (Kit protein bioassay Biorad, Munich,
Allemagne). Les électrophorèses obtenues ont été numérisées par un scanner (XRS12cx, Bioimage, France) et l'analyse quantitative a été réalisée grâce au logiciel Wallband
(version 3.2.2, Bioimage, France).
MÉTHODES D'ÉTUDE IN VIVO
Des rats femelles albinos de souche Fisher 344 (F 344, Iffa
Crédo, Lyon, France), pesant environ 80 grammes à leur arrivée, sont acclimatés pendant cinq jours et répartis en lots de
quatre animaux. Ils sont nourris ad libitum avec de l'aliment
à teneur faible en graisse (AIN 76, UAR, Villemoisson,
France).
Un groupe témoin reçoit de l'eau distillée comme eau de
boisson. Les deux groupes expérimentaux reçoivent respectivement du Dextran (DEX) et du Dextran Sulfate de Sodium
(DSS) à 6 % dans l'eau de boisson pendant 2 jours.
L'évolution pondérale et la consommation de boisson sont
contrôlées. La diarrhée est estimée par le rapport poids frais /
poids sec des fèces. Le sang fécal occulte est mesuré grâce au
kit Hemoccult II.
Après sacrifice de l'animal par élongation cervicale, l'abdomen est ouvert, le sang est prélevé à l'aorte abdominale sur
tube citraté puis centrifugé à 4000 g, 4°C pendant 20 min.
Le plasma est récupéré et congelé à - 80°C jusqu'à l'analyse
des protéines plasmatiques par électrophorèse.
L'électropohorèse est réalisée sur des membranes d'acétate
de cellulose [8].
TARDIEU (D.) ET COLLABORATEURS
Les différentes protéines plasmatiques (albumines ; α1,
α2, β1, β2 et γ globulines) sont ensuite quantifiées par analyse d'image.
MATÉRIEL DE L'ÉTUDE IN VITRO
Les standards de 8-oxo-7,8-dihydro-2'-déoxyguanosine (8oxodGuo) et la 2'-déoxyguanosine (dGuo), ainsi que H2O2,
le Tris et les enzymes utilisées : nucléase P1 (EC 3.1.30.1) et
phosphatase alcaline (EC 3.1.3.1), ont été commandés chez
Sigma, St Louis, USA. L'ADN de thymus de veau est fourni
par Boehringer Mannheim, Meylan, France.
Le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, et l'isopropanol,
viennent de Prolabo, Vitry-sur-Seine, France.
La solution de NaCl à 0,9 % est distribuée par Braun
Médical S.A., Boulogne, France.
CH3COONa, ZnSO4, EDTA, CrCl3-6 H2O, KH2PO4 et
K2HPO4-3 H2O sont fournis par Merck, Darmstadt,
Allemagne.
Le système chromatographique est constitué d'une pompe
M 2200 (Bischoff, Leonberg, Allemagne) reliée à un injecteur automatique M 738 (ICS, Toulouse, France) équipé
d'une colonne Supelcosil C-18, de 3 µm de porosité, et de
taille 150 x 4,6 mm (Supelco, Bellefonte, PA).
La détection coulométrique est assurée par un détecteur
Coulochem II (ESA, Chelmsford, MA). La détection ultraviolette est assurée par un détecteur UV Focus (SpectraPhysics, Les Ulis, France). La quantification est réalisée
grâce au logiciel PIC 3 (ICS, Toulouse, France).
MÉTHODES DE L'ÉTUDE IN VITRO
De l'ADN de thymus de veau (200 µg/ml) est incubé dans
du tampon Tris / HCl pH 7,4 ; 0,1M pendant 1 heure à 37°C.
Un contrôle négatif (DSS 0 %) et un contrôle positif
(100 mM CrCl3 + 0,5 % H2O2) [8] sont réalisés.
L'ADN est incubé en présence de cinq concentrations de
DSS (10-6, 10-3, 10-2, 10-1 et 1 %) .
Après incubation l'ADN est précipité par de l'isopropanol
(75 %), rincé à l'éthanol (70 %), séché puis solubilisé dans
100 µl d'eau distillée stérile.
L'ADN en solution est hydrolysé par 10 unités de nucléase
P1 durant 2h à 37°C dans du tampon acétate (pH 5,3) puis par
2 unités de phosphatase alcaline pendant 1 h à 37°C dans du
tampon Tris / HCl (pH 8,0) comme décrit par FLOYD [9].
Les protéines sont précipitées par du chloroforme. Le surnageant aqueux est récupéré pour le dosage de la 8-oxodGuo.
Le dosage est effectué par Chromatographie Liquide Haute
Performance [4]. Le solvant d'élution est un tampon phosphate 50 mM (pH 5,5) renfermant 10 % de méthanol dont le
débit est de 1 ml/min. Les nucléosides modifiés sont détectés
par coulométrie et les potentiels d'electrodes sont fixés à
+ 200 et + 400 mV. Les nucléosides non modifiés sont détectés par spectrophotométrie et la longueur d'onde utilisée est
de 280 nm. Les dommages oxydatifs sont quantifiés grâce au
logiciel Pic 3 en utilisant des courbes de calibration réalisées
avec des standards.
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LE MODÈLE ANIMAL D’INFLAMMATION AU DEXTRAN SODIUM SULFATE
3. Résultats
RÔLE DES GROUPEMENTS SULFATES DANS L'INFLAMMATION COLIQUE
Selon AXELSSON [10], l'inflammation colique peut être
aisément caractérisée de manière semi-quantitative par l'estimation de la diarrhée, la longueur du colon et la présence
occulte de sang fécal.
Les résultats observés révèlent une augmentation du ratio
fécal poids frais / poids sec d'environ 40 % chez les animaux
traités au DSS par rapport aux animaux témoins recevant de
l'eau distillée (tableau I). Aucune différence statistiquement
significative (avec un risque de 5 %) n'a pu être mise en évidence par le test non paramétrique U de MANN et
WHITNEY en raison de la faiblesse de l'échantillonnage. En
revanche, lors d'une étude précédente, réalisée sur un plus
grand nombre d'animaux (4), la différence observée entre rats
traités et rats témoins était statistiquement significative avec
un risque de 5 %. En revanche, sur les animaux recevant du
DEX 6 % , aucune modification du ratio étudié n'a été observée.
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bulines) n'a été observée sur les animaux traités par le DSS
6 % dans l'eau de boisson par rapport aux animaux témoins
recevant de l'eau distillée, les prélèvements des animaux
recevant du DEX 6 % dans l'eau de boisson n'ont donc pas été
analysés.
POUVOIR OXYDATIF DIRECT DU DSS SUR L'ADN
Le contrôle négatif est représenté par de l'ADN incubé
dans du tampon 0,1M Tris/HCl, pH 7,5 tandis que le contrôle
positif consiste en de l'ADN dissout en présence de CrCl3 et
H2O2.
Les résultats sont exprimés sous la forme de rapport
8-oxodGuo/dGuo dans l'ADN et présentés sur la figure 1.
A la concentration de 10-3 % (5 échantillons), le DSS
induit un taux de lésions oxydatives légèrement supérieur
(8,72 ± 1,42 8-oxodGuo/105 dGuo) à celui de l'ADN témoin
Bien que non significative ici aussi, la mesure du gain
moyen quotidien traduit une perte de poids chez les rats traités au DSS 6 % et confirme des résultats significatifs enregistrés par ailleurs sur un plus grand nombre d'animaux [4].
Aucune perte de poids n'est observée chez les rats traités au
DEX 6 % et chez les animaux témoins.
Aucune différence de longueur du côlon n'a été mise en
évidence entre les différents lots d'animaux (résultats non
présentés). Aucune trace de sang n'est visible à l'œil nu dans
les fèces. Par contre, la présence de sang fécal occulte a été
détectée chez les animaux traités par le DSS 6 % (p < 0,05)
alors qu'elle reste indécelable chez les animaux traités par le
DEX 6 % (tableau I).
Aucune différence significative au niveau des protéines
plasmatiques mesurées (albumines ; α1, α2, β1, β2 et γ glo-
FIGURE 1. — Niveaux de 8-oxodGuo dans l'ADN de thymus de veau incubé
en présence de Dextran Sulfate de Sodium dans du tampon Tris/HCl
0,1M ; pH 7,5 ; 37°C ; 1 heure. Un contrôle négatif (DSS 0 %) et un
contrôle positif (CrCl3 + H2O2) sont réalisés.
Les histogrammes représentent la moyenne ± la déviation standard des
cinq échantillons indépendants réalisés par lot.
Les lots ADN + DSS 10-3 % et ADN + CrCl3+H2O2 sont comparés au
contrôle négatif ADN+DSS 0 % par un test Dunnet.
TABLEAU I. — Effets comparatifs de l'administration de Dextran Sulfate de Sodium et de Dextran via l'eau de
boisson distribuée à des rats F 344 pendant deux jours sur les paramètres physiopathologiques retenus
comme marqueurs d'inflammation.
Les lots d'animaux sont comparés par un test non paramétrique U-Mann-withney.
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(7,91 ± 1,27 8-oxodGuo/105 dGuo). Cette différence n'est
toutefois pas statistiquement significative (p > 0,05, test
Dunnet) et sur l'ensemble des concentrations testées aucune
oxydation significative de l'ADN n'a été mise en évidence.
En revanche, la présence d'un système oxydant (CrCl3 et
H2O2) dans le milieu d'incubation engendre une augmentation très nette (p < 0,001) des taux de lésions oxydatives
(700 ± 60 oxodGuo/105 dGuo) par rapport aux deux autres
lots d'ADN et confirme ainsi les résultats de TSOU et al [8].
4. Discussion
Le modèle animal d'inflammation du côlon par le DSS est
désormais largement validé [11]. Toutefois, le mécanisme
d'action du DSS [12, 13] demeure sujet à controverses.
Bien qu'un mécanisme immunologique impliquant des
cytokines ait été suggéré, l'implication des lymphocytes B ou
T dans la pathogénie semble exclue. En effet, l'inflammation
se développe normalement chez des rats fortement immunodéprimés, déficients en lymphocytes [14] : un rôle toxique
direct initial du DSS est donc très probable. L'importance
potentielle des groupements sulfates a été suggérée par les
travaux de ROEDIGER [15, 16], qui a le premier montré que
des dérivés soufrés étaient capables de provoquer une inflammation colique après transformation en H2S et HS-. Le rôle
des bactéries sulforéductrices du côlon serait alors primordial
car ce sont elles qui libèrent H2S et HS- dans la lumière
colique. L'ion HS- est cytotoxique et peut notamment interférer avec le métabolisme du butyrate qui est la source principale d'énergie des colonocytes [17, 18]. De fait, des lavements au butyrate à 100 mmol/l chez des patients humains
atteints de colite ulcéreuse réduisent notablement l'inflammation et l'hyperprolifération de la muqueuse [19].
Nos résultats comparés avec le dextran et le dextran sulfate
démontrent clairement que les groupements sulfates agissent
en tant que toxophores.
Le DSS induit d'abord une phase d'inflammation aiguë,
indépendante de la migration des polynucléaires mais
accompagnée d'un stress oxydatif [5], puis l'inflammation
évolue sur le mode chronique avec apparition de la phase cellulaire [12]. Pendant la phase précoce, l'analyse électrophorétique des protéines sanguines ne permet de mettre en évidence aucun marqueur pertinent de l'inflammation colique
par le DSS.
Le stress oxydatif induit in vivo par le DSS administré dans
l'eau de boisson entraîne dans les 48 heures des lésions oxydatives génotoxiques à l'ADN des colonocytes [4]. Bien que
ni la configuration de la molécule de DSS ni la nature nucléophile des métabolites soufrés ne soit en faveur d'une action
oxydative directe, il nous a paru important d'exclure cette
possibilité. Nos résultats excluent totalement un rôle direct
significatif du DSS et l'inflammation semble donc majoritairement responsable des dommages produits sur la molécule
d'ADN. Toutefois, nos travaux ne permettent pas à ce stade
d'exclure un rôle éventuel de la flore et/ou des enzymes de
biotransformation dans la génération d'intermédiaires prooxydants putatifs.
TARDIEU (D.) ET COLLABORATEURS
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