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Nanogénotoxicologie
Nanogénotoxicologie D. Marzin Institut Pasteur de Lille Université Lille 2 34ème Congrès annuel de la SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris. "Nanotechnologies : Evaluation du risque toxique " Données disponibles • Relativement limitées • Surtout in vitro • Quelques NP largement étudiées – – – – – – Oxyde de titane (usage en cosmétique) Nanotubes et fullerènes Métaux (Co, W, …) Silice, quartz Particules diesel, noir de carbone… Amiante (assimilée) • In vivo surtout au niveau du poumon SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Cibles potentielles ROS Interférence mécanique SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris Gonzalez et al., 2008 - Nanotoxicology sous presse D. Marzin Critères devant être maîtrisés Propres aux NP • Propriétés uniques spécifiques à chaque NP interprétation délicate • Plusieurs mécanismes apparents • Nombreux paramètres à maîtriser – Taille (distribution) – Structure – Composition/pureté – Charges de surface (potentiel zéta) – Surface spécifique – Forme/morphologie (forme cristalline) – Porosité – Capacité de former des agrégats (dans un milieu) – Traitement de surface. SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Critères devant être maîtrisés Propres au système d’essai • Type cellulaire • Environnement cellulaire – Présence de protéines – Présence de mucus (poumon) • • • • Niveau de toxicité cellulaire (méthode/temps) Choix de la dose forte Schéma de traitement In vitro/in vivo. SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Les formes réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS/RNS) jouent un rôle clé dans les effets génotoxiques des nanoparticules SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Origine des formes radicalaires génotoxiques • Génération intrinsèque de ROS par les particules génotoxicité primaire (directe ou indirecte) – Surface associée avec des radicaux libres ou des groupements oxydants (ex: SiO2 sous forme cristalline) – Génération de formes radicalaires par certaines particules en solution aqueuse Ex : Réaction d’Haber-Weiss: O 2• - + H2 O2 → OH• + HO - + O2 , – biotransformation de HAP associés aux particules formant un cycle redox de semiquinones . Schins et Knaapen, Knaapen, (2008) SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Origine des formes radicalaires génotoxiques • Génération de ROS par interaction des particules avec les cibles cellulaires génotoxicité primaire (indirecte) – lésions des mitochondries et interaction avec la chaîne de transport des électrons – Activation de systèmes enzymatiques oxydases NAD(P)H – Perturbation des moyens de défense endogène antioxydants. Schins et Knaapen, Knaapen, (2008) SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Origine des formes radicalaires génotoxiques • Génération de ROS et RNS pendant le phénomène inflammatoire induit par les particules génotoxicité secondaire – Phagocytose macrophages – Polynucléaires neutrophiles (PNN) – oxydase NADPH, nitric oxyde synthétase (NOS), myélopéroxydase (MPO), superoxyde dismutase (SOD). Schins et Knaapen, Knaapen, (2008) SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Réactions enzymatiques produisant ROS/RNS Knappen et al. Mutagenesis (2006) SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Conséquences des lésions oxydatives de l’ADN • ROS et RNS causent de nombreux dommages à l’ADN: – – – – – – Oxydation de bases Nitration de bases Dépurination Méthylation Déamination Induction de fapy (ouverture cycle)… • De toutes les formes radicalaires (ROS / RNS) le radical hydroxy (OH) est le plus réactif. SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Conséquences des lésions oxydatives de l’ADN • 8-hydroxy-2’-déoxyguanosine (8-OH-dG) : • lésion la plus connue • Formation démontrée avec nanoparticules de TiO2, silice cristalline , particules de combustion, particules atmosphériques. SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Conséquences des lésions oxydatives de l’ADN • ROS et RNS peuvent induire – Des éthéno-adduits : radicaux formés pendant la peroxydation lipidique associée à la formation de dérivés électrophiles : malondialdéhyde, 4-hydroxynonénal – Démontré avec silice cristalline et amiante. SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Conséquences des lésions oxydatives de l’ADN • ROS et RNS peuvent induire des cassures simple brin d’ADN: – quartz, particules diesel, noir de carbone, TiO2, silice cristalline et fibres d’amiante • Attaque directe du squelette d’ADN (coupure du cycle du désoxyribose) • Pendant le processus de réparation de l’ADN (BER). SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Nanoparticules et lésions oxydatives de l’ADN • Confirmation des lésions oxydatives in vivo – Chez le rat: incidence élevée de 8-OH-dG au niveau des poumons: (Ichinose et al., 1997; Seiler et al., 2001; Gallagher et al. 2003) • silice, particules diesel, noir de carbone – Chez la souris transgénique (Big Blue® : lacI) : mutations corrélées avec taux 8-OH-dG • particules diesel (Sato et al. 2000) • Mutations transversions G T – Chez la souris transgénique mutations mutations corrélées avec taux 8-OH-dG • crocidolite par voie IP (Unfried et al., 2002) • Mutations transversions G T . D. Marzin Nanoparticules et lésions oxydatives de l’ADN • Confirmation des lésions oxydatives in vivo – Chez le rat: mutations au locus HPRT • Cellules alvéolaires (Driscoll et al., 1997) • Silice cristalline, noir de carbone, TiO2 • Uniquement aux doses induisant une inflammation • Ces particules n’induisent pas de mutations sur ces cellules in vitro – Neutrophiles activés in vivo induisent in vitro sur des cellules épithéliales pulmonaires • Cassures simple brin • 8-OH-dG (Knaapen et al., 1999; 2004) – Cellules de lavage bronchoalvéolaire traitées in vivo par des nanoparticules cellules poumons • 8-OH-dG (Driscoll et al., 1997) rôle de l’inflammation D. Marzin Nanoparticules et lésions oxydatives de l’ADN •MAIS – Chez le rat: mutations au locus HPRT par la Silice cristalline et Silice amorphe • Même inflammation avec les 2 types de silices • Mutations uniquement avec Silice cristalline (Johnson et al. 2000) – Induction de ROS et RNS par inflammation par Silice cristalline • Pas d’ 8-OH-dG poumon du rat (Albrecht et al. 2005) – Serait dû à l’apoptose et à l’induction de réparation ADN (Johnson et al. 2000) Ramener tout à l’inflammation serait trop simpliste SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Nanoparticules et adduits à l’ADN Nanoparticules et adduits à l’ADN • Particules adsorbent des composés organiques : HAP sur particules diesel ou le noir de carbone • Mutagenèse dépend – Capacité de désorption dans un milieu biologique – Des propriétés de surface des particules • Porosité, surface spécifique, charge – Composition des produits organiques adsorbés – Du type cellulaire utilisé. SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Nanoparticules et adduits à l’ADN • Produits adsorbés sur les particules – pénétration dans la cellule – ROS générées par particules impact sur • • • • Métabolisme Apoptose Prolifération cellulaire Réparation de l’ADN. SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Nanoparticules et adduits à l’ADN d’aprè après Schins et Knaapen, Knaapen, (2008) biodisponibilité Métaux, semiquinones ROS/RNS (inflammation) Réparation ADN, arrêt cycle cellulaire Apoptose/nécrose Activation métabolique Adduits ADN SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris mutagenèse D. Marzin Inflammation induite par les NP et mutagenèse Rôle de polynucléaires neutrophiles D. Marzin Polynucléaires neutrophiles (PNN) et ROS/RNS Knappen et al. Mutagenesis (2006) SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Neutrophiles augmentent la formation des adduits à l’ADN Cocultures PNN activés et RLE (poumon de rat) RLE PNN activés B[a]P SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris + + + + + Borm et al, Env. Health. Persp., 1997 D. Marzin Neutrophiles augmentent la formation des adduits à l’ADN PNN PNN SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris Borm et al, Env. Health. Persp., 1997 D. Marzin Effet des PNN sur la réparation de l’ADN Güngör et al, FASEB journal 2007 SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Effet des PNN sur la réparation de l’ADN Expression de gènes de NER Traitement par HOCL 15 mn SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris Güngör et al, FASEB journal 2007 D. Marzin Effet des PNN sur la réparation de l’ADN Expression de gènes de NER Traitement par HOCL 15 mn SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris Güngör et al, FASEB journal 2007 D. Marzin Effet des PNN sur la réparation de l’ADN Expression de gènes de NER Traitement par HOCL 15 mn SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris Güngör et al, FASEB journal 2007 D. Marzin Mutation de la MPO et adduits à l’ADN Génotype sauvage fumeurs Génotype muté SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris Van Schooten et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2004 D. Marzin Nanoparticules et réparation de l’ADN • Crocidolite expression – – – – Fpg AP endonucléase Le nombre de sites AP (in vitro et in vivo) MTH1 prévient la mutagenèse en hydrolysant la 8-oxodGTP en 8-oxo-dGMP • Certains métaux (Ni, Cd, Co, «As»…) inhibent – BER – NER SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Nanoparticules et aneuploïdies Nanoparticules et aneuploïdies 90 * % 80 MN70 * * * 60 CC+ Total 50 40 * 30 20 10 0 témoin MWCNT 10 MWCNT 25 MWCNT 50 WC-Co50 D’après J. Muller et al., Carcinogenesis 2008 MWCNT = multiwall carbon nanotubes WC-Co = carbure de tungstène-cobalt Confirmé avec des NP de silice SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Mécanismes généraux de génotoxicité d’aprè après Knappen et al., 2005) Nucléole Fuseau centromères mitochondries SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Mécanismes généraux de génotoxicité d’aprè après Knappen et al., 2005) Nucléole Fuseau centromères mitochondries SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Mécanismes généraux de génotoxicité d’aprè après Knappen et al., 2005) ROS RNS inflammation O2 O2•- 7 6 1 2 Radicaux liés à la surface 3 Surface réaction 4 ROS RNS Nucléole Fuseau centromères M+ mitochondries Métal soluble SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris 5 Particule + mutagène D. Marzin Nanoparticules et prolifération d’aprè après Knappen et al., 2005) Métaux solubles ROS/RNS Cytokines f. croissance Protéines Matrice Extra cellulaire Récepteurs membranaires i.e. EGF-R Intégrines MAPK kinases liées aux integrines NFκB Facteurs de transcriptions, i.e. NFκB, AP-1 SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Nanoparticules et cancer Exposition aux nanoparticules Interaction Directe Production de ROS/RNS Lésions de l ’ADN d’aprè après Schins et Knaapen, Knaapen, 2007) Génotoxicité Inflammation chronique et libération de ROS/RNS inhibition Réparation ADN PROLIFERATION Apoptose Arrêt cycle cellulaire Réparation ADN SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris Induction de tumeurs D. Marzin Nanoparticules et évaluation du risque génotoxique • Conséquences en termes d’évaluation du risque – si l’inflammation a un rôle nécessité de tests in vivo ou de cultures mixtes (PNN, autres) – Mettre en évidence les lésions oxydatives optimiser les tests ex : utiliser fpg et/ou hOGG1 dans le test des comètes – Prendre en compte les effets sur l’ADN et sur le fuseau mutations géniques, clastogenèse, aneuploïdies – Interpréter la génotoxicité avec les études de toxicité inflammation (Quel organe? Quelle dose?…) – Bien choisir les cellules cibles SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin Conclusions • Besoins – Mieux comprendre les mécanismes de la génotoxicité des NP – Mieux comprendre les paramètres des NP importants dans les effets génotoxiques – Intégrer la mutagenèse dans l’ensemble des effets toxiques SFT 20 - 21 octobre 2008, Paris D. Marzin
